JPH07506240A - コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシンｌｔの免疫原性無毒化変異体，それらの調製，ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシン訂の免疫原性無毒化変異 体、それらの調製、ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用 え匪立公■ 本発明は、Ｖａｌ−５３，５ｅｒ−６３、Ｖａｌ−９７、Ｔｙｒ−１０４、また はＰｒ。

−１０６の１つ以上のアミノ酸の置換を有する、コレラトキシン（ＣＴ）の免疫 原性無毒化タンパク質、あるいは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　（Ｅ、 ｃｏｌｉ）の毒素原性株により産生された非耐熱性トキシン（ＬＴ）の免疫原性 無毒化タンパク質、ならびに、コレラまたは毒素原性）：、ｃｏｌｆの感染の予 防あるいは治療に有用なワクチンでのそれらの使用に関する。これらのタンパク 質は、野生型ト牛シンをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発による組換えＤ ＮＡ技術を用いて、適切に産生され得る。

及豆旦宣１ コレラは、広く世界中、特に第三世界に蔓延する伝染病であり、ある地域では、 それは風土病である。腸系に生じるこの重い病気は、この疾患の記録されている ケースの高い割合で致命的であることが示される。

コレラの病因は、グラム陰性微生物Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　（Ｖ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ）である。これは、汚染された食物あるいは水の摂取を介して 接触した個体の腸管にコロニー化し、そして非常に高密度に繁殖する。基本的な 症状は、激しい下痢であり、その結果被検体は、ふん便によって一日あたり１Ｇ −１５リツトルもの液体を損失し得る。この激しい脱水および電解質の損失の結 果、被検体は、この感染の５０〜６０％のケースにおいて耐えられず、死亡する 。Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅにより起きた下痢は、アデニレートシクラーゼ酵素の 活性化を刺激することにより作用して細胞レベルで障害を引き起こす、コレラト キシンＣＴの分泌による。コレラは、制御された強烈な水分再吸収（ｒｅｈｙｄ ｒａｔ　ｔｏｎ）再水和により効果的に治癒され得るが、この疾患の完全な制御 および将来的な絶滅には、ワクチンの普及が望まれる。

現在、死滅細菌の非経口投与からなる、コレラに対するワクチン接種が存在する 。いくつかの国では、この疾患に対するワクチン接種が要求されているが、現在 の細胞性ワクチンは、感染の５０％のケースにおいてのみ予防し、そしてその予 防はまた６ケ月未満の持続に極度に制限されるので、その真の有用性が非常に疑 わしい。

パングラデシコでは、高度な免疫原性であることが知られる、コレラトキシンの サブユニットＢを付加した死滅細菌からなる経口ワクチンの、実験的な試みが進 行中である（１９９０−９２）。この産物は、特別な副作用も伴わず、永続的な 予防を持続する（Ｈｏｌｓｇｒｅｎ　Ｊ、、　Ｃｌｅｍｅｎｓ　Ｊ、、　５ａｃ ｋ　ＤＡ、、　５ａｎｃｈｅｚ　Ｊ。

およびＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌＩＩＡＭ：　ｒコレラに対する経口免疫処置」Ｃｕ ｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８ｇ）、 　１４６．１９７−２０４）。

コレラトキシンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔの毒素原性株の非耐熱性 トキシンに、アミノ酸配列、構造、および作用様式において、類似する。

Ｅ、　ｃｏｌ　ｉの毒素原性株の感染の結果は、コレラに類似しており（コレラ よりも激しくないが）、激しい下痢および腸の疾患からなる。

ＣＴおよびＬＴ）キシンはすべて、トキシンの酵素活性の原因である１つのＡサ ブユニット（あるいはプロトマーＡ）　（本明細書中ではＣＴ−ＡあるいはＬＴ −Ａ）　、および、トキシンと腸上皮細胞との結合に関連する、５つの同一の（ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）Ｂサブユニット（あるいはプロトマーＢ）　（本明細書で はＣＴ−ＢあるいはＬＴ−Ｂ）を含有する。

このＡサブユニットは、細胞膜を通過して、酵素活性を制御するＧＴＰ結合タン パク質のＮＡＤ依存ＡＤＰリボシル化により、アデニレートシクラーゼの活性化 を引き起こす。これの臨床的な影響は、腸での大量の液体の損失を引き起こすこ とである。

かなりの研究が、コレラトキシンおよびＥ、　ｃｏｌ　ｉ非耐熱性トキシンにつ いて行われてきた。

ＣＴの配列は公知であり、記載されている（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ　Ｊ、Ｊ。

ら％Ｎａｔｕｒｅ　３０６，５５１ページ　（１９８３））。

Ｅ、　ｃａｌ　ｉの毒素原性株由来のＬＴの配列は、掲載されているように、Ｃ Ｔに８０％相同であり、これもまた周知で科学文献に記載されている。５ｐｉｃ ｅｒ　Ｅ、に、ら（Ｂｆｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２５？　ｐ、　５７１６−！ｒ ７２１　（１９８２））には、ブタに認められるＥ、ｃｏｌｉの毒素原性株由来 の非耐熱性トキシンのＡサブユニットのアミノ酸配列が記載されている。

旦、　５１８０−５１８７．　（１９８７））により、同定され、そして配列決 定された。

ヒトに感染することが周知である、ｌ：、　ｃｏｌ　ｉの株由来のＬＴのＡサブ ユニットの配列もまた、配列決定された（　Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２５９．５０３７−５０４４　（１９８４））。

コレラおよび毒素原性細菌に対するワクチンの可能な臨床上の重要性の観点から 、コレラおよび毒素原性細菌に対して免疫し得る、無毒化トキシンを生産する、 継続的かつ偉人な目的が存在する。遺伝子工学の技術は、このトキシンをコード する遺伝子への特定の変異株の導入、ならびに、遺伝子発現およびタンパク質精 製の従来の技術による、変異トキシンの生産を可能にする。

多くのグループが、コードされたタンパク質の毒性特性の損失に関連する、遺伝 子変異の同定を試みてきた。これらの研究は、主としてＥ、ｃｏｌｉ由来のトキ シンＬＴの遺伝子に関して実施されている。

）１ａｒｆｏｒｄ、　Ｓ、ら（Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　１８３． ３１１ページ（１９８９））には、ブタに対して病原性のＥ、　ｃｏｌ　ｉ由来 のＬＴ−Ａ遺伝子のインビトロ変異誘発による、トキソイドの生産が記載されて いる。得られた成功例の変異は、５ｅｔ−６１−Ｐｈｅ置換およびＧＩｙ＝７９ −Ｌｙｓ置換を包含する。前者はより重要と考えられる。Ｈａｒｆｏｒｄらは、 ヒトおよびブタに病原性であるＥ、ｃｏｌｉ中のＬＴ−Ａ遺伝子と、ＣＴ−Ａ遺 伝子との間の類似性、ならびに、このトキシンは共通の機構により作動すると考 えられることから、５ｅｔ−６１−Ｐｈｅ変異をＣＴ−Ａ遺伝子に導入すること により、コレラのハロトキソイドを生産する可能性があり得ることを示唆してい る。

Ｔｓｕｊｉ、　Ｔ、ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．　ｐ、　２２ ５２０　（１９９０））には、変異ＬＴの毒性に影響するが、そのタンパク質の 免疫原性は変化させない、１つの置換Ｇｌｕ−１１２−Ｌｙｓを産生ずるプラス ミドＥＮＤ２９９由来のＬＴ−Ａ遺伝子の変異が記載されている。

Ｇｒａｎｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｒ，ら（第９２回Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ａ＋ａｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙの要旨集８２８９．　１９９２年５月２６−３０日）には、酵素活性を 著しく低下させる、ＬＴ−Ａ中の、４４位および７０位のヒスチジンならびに１ ２７位のトリプトファンの同類置換が記載されている。

い（っかの研究が、ＣＴに対する変異についてなされてきた。

１［ａｓｌｏｖ、　Ｈ，Ｒ，ら（第９２回Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｅｉｎｇ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙの要旨集Ｂ２９１．　１９９２年５月２６−３０日）には、本質的に全ての 活性を排除する、ＣＴ−Ａ中の、Ａｓｐ−９および旧５−４４の変異、ならびに 、アミノ酸１８０位以降の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）が記載されている。Ａ ｒｇ−９変異は著しく活性を弱めると言われている。その他のアミノ酸部位の変 異は、毒性に対してほとんど影響はなかった。

Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｎ、ら（［ｎｆ、　ａｎｄ　Ｉ■ｕｎ、　ｕ■ｕ、　 ４２６６−４２７０゜（１９９１）には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓ ｓｉｓ　トキシンのＡサブユニットの公知の無毒化変異と平行する、Ａｒｇ−７ −Ｌｙｓ変異を産生ずるＣＴ−Ａの部位特異的変異誘発が記載されている。変異 は、検出可能なＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を完全に撤廃させた。

国際特許出願ＮＯ９２／１９２６５　（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｋａｓｌｏｙ　ａ ｎｄ　ＡｍｇｅｎＩｎｃ、　）には、Ａｒｇ−７、Ａｓｐ−９、Ａｒｇ−１１、 Ｈｉｓ−４４、Ｈｉｓ−７０，およヒＧ１ｕ−１１２でのＣＴ−Ａの変異が記載 されている。

Ｇｌｕ−１１０（ＬＴおよびＣＴ）ならびにＡｒｇ−１４６（ＬＴ）での変異も また、文献に記載されている（Ｌｏｂｅｔ、　Ｉｎｆ、　Ｉｍｍｕｎ、、　２８ ７０゜１９９１；　Ｌａｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、 　Ｃｏｍａ、３４１１９Ｂ３；　Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 　２２０８．１９８８）。

ＬＴの結晶構造が、Ｓｉｘｍａら（Ｎａｔｕｒｅ、　３５１．３７１−３７７、 １９９１年５月）により決定され、変異誘発が以前の文献に記載された結果生じ ることが確認された。このことは、Ａサブユニットの活性に、Ｇｌｕ−１１２お よび５ｅｒ−６１の構造的な重要性を説明し、そして、非常にすぐ近位の旧５− ４４．５ｅｒ−１１４、およびＡｒｇ−５４が、触媒作用および認識に重要であ り得ることを示唆する。

及匪旦！１ トキシンの構造のさらなる詳細な分析により、ＣＴ−ＡおよびＬＴ−Ａの配列中 のかなり遠（のアミノ酸が、適切に、個別に、あるいはその他の変異と結合する ように変異した際に、ＣＴおよびＬＴの酵素活性を減少し得る位置に存在するこ とが、発見された。

本発明の目的は、遺伝子的に無毒化された、ＣＴあるいはＬＴ由来のトキソイド である１つの抗原からなる、二次発生産物による、コレラあるいは毒素原性Ｅ、 ｃｏｌｉに対する完全な予防を与えるワクチンの提供である。

ＣＴあるいはＬＴの遺伝子的無毒化は、毒性を著しく低下させ、そして、好まし くはな（するが、トキソイドの免疫原性特性は維持している。

本発明の第一局面に従って、コレラトキシン（ＣＴ−Ａ）のサブユニットＡのア ミノ酸配列またはそのフラグメント、あるいは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏ ｌｉ非耐熱性トキシン（ＬＴ−Ａ）のサブユニットＡのアミノ酸配列あるいはそ のフラグメントを含有する、免疫原性無毒化タンパク質が提供される。ここでｌ ／ａｌ−５３，５ｅｒ−６３、Ｖａｌ−９７、Ｔｒｙ−１０４、またはＰｒｏ− １０６のいずれかの位置またはこれらに対応する位置にある、１つ以上のアミノ 酸が、他のアミノ酸と置換される。

置換されたアミノ酸は、ＣＴ−ＡあるいはＬＴ−Ａの配列中に位置している。こ れはアミノ酸配列中および構造的に保存されており、従って、ＣＴおよび種々の ＬＴ類に共通である。

本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、天然に存在する野生型トキシンと、本質 的に同じ構造のフンフォメーションを有する。これは、免疫学的に活性であり、 野生型トキシンに対する抗体と交差反応する。

本明細書中では、ＣＴおよびＬＴには、種々の天然に存在する変異株、さらに、 構築された毒素の免疫原性に影響しない、本明細書で開示されている配列由来の 変化を包含するその他の変異株が、包含される。

本明細書中では、［Ｖａｌ−９７Ｊのようなアミノ酸等個物とは、成熟コレラト キシンサブユニットＡ　（ＣＴ−Ａ）の配列中のその位置のアミノ酸のことを示 し、これにはシグナル配列がない（図１を参照のこと）。

本明細書でＬＴ−Ａと言うところは、アミノ酸等価物が、図１に示されるような 、ＣＴ−Ａ中の対応する位置をさしている。

例えば、ＣＴ中のＶａｌ−５３はＬＴＩサブユ＝’ｙトのＶａｌ−５２に対応し 、そして、ＣＴ中のＳ　ｅｔ−６３はＬＴＩの５ｅｔ−６２に対応するので、Ｌ Ｔ１配列の番号をつけたアミノ酸８９位までに１つのアミノ酸の異なりが存在す る。ＣＴ配列中のＶａｔ−９７は、配列中のその位置で４つのアミノ酸の異なり があるので、ＬＴＩ配列中のＶａｌ−９３に対応する。

さらに、本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、例えば、Ａｒｇ−７、Ａｓｐ− ９、Ａｒｇ−’１１、Ｈｉｓ−４４、Ａｒｇ−５４，５ｅｔ−６１、Ｈｉｓ−７ ０、Ｈｉｓ−１０７、Ｇｌｕ−１１０、Ｇｌｕ−１１２，５ｅｔ−１１４、Ｔｒ ｐ−１２７、Ａｒｇ−１４６、あるいはＡｒｇ−１９２での１つ以上の置換のよ うな、その他の変異を含み得る。

野生型アミノ酸に対して置換されたアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり 得る、あるいは、改変または合成アミノ酸であり得る。置換には、アミノ酸全体 の欠損が含まれ得る。ここで、変異は、必要な免疫原性特性を維持し、実質的に 毒性の低下を示す。

できる限り置換されたアミノ酸の立体効果は維持しているが、両電解質性および 親水性を変化させる置換が、一般的には好ましい。

好ましい置換には、Ｖａｌ−５３−Ａｓｐ、　Ｖａｌ−５３−ＧｌｕＳＶａｌ− ５３−Ｔｙｒ。

５ｅｔ−６３−Ｌｙｓ％Ｖａｌ−９７−Ｌｙｓ、　Ｖａｌ−９７−ＴｙｒＳＨｉ ｓ−１０７−Ｇｌｕ、　Ｔｙｒ−１０４−Ｌｙｓ％Ｔｙｒ−１０４−Ａｓｐ、　 Ｔｙｒ−１０４−Ｓｅｒｘ　Ｐｒｏ−１０６−Ｓｅｔ％５ｅｔ−１１４−Ｇｌｕ 、　５ｅｔ−１１４−Ｌｙｓが含まれる。

本明細書中に用いられる用語「無毒化された」とは、免疫原性組成物が、それに 対応の天然に存在するトキシンに比較して、実質的により低い毒性を示すことを 意味する。実質的により低い毒性は、著しい副作用の引き起こしを伴なうワクチ ンとして、免疫学的に有効な量で免疫原性組成物に使用されるタンパク質に関し て、十分に低くあるべきである。例えば、免疫原性無毒化タンパク質は、それに 対応の天然に存在するトキシンに０．０１％未満の毒性を有するべきである。毒 性は、マウスＣ）ＩＱ細胞で、あるいは、好ましくはＹ１細胞に誘導された形態 学的変化の評価により測定され得る。用語「トキソイド」とは、遺伝子的に無毒 化されたトキシンを意味する。

免疫原性タンパク質は、ＣＴあるいはＬＴサブユニットＡトキソイドであり得る が、好ましくは、１つの変異ＣＴ−ＡあるいはＬＴ−ＡサブユニットおよびＣＴ あるいはＬＴの５つのＢサブユニットを含有する、構築された（ａｓｓｅｍｂｌ ｅｄ）　トキシンである。Ｂサブユニットは、天然に存在するサブユニットであ り得るか、あるいはそれ自身変異され得る。

免疫原性タンパク質は、好ましくは、上記のように適切に改変された、天然に存 在するＣＴ−ＡあるいはＬＴ−Ａである。しがし、保守的アミノ酸変化は、免疫 原性タンパク質の免疫原性あるいは毒性には影響せず、好ましくは、Ｂサブユニ ットタンパク質を有する完全なトキシンを形成する免疫原性タンパク質の活性に は影響しないようになされ得る。さらに、免疫原性タンパク質は、ＣＴ−Ａある いはＬＴ−Ａのフラグメントであり得る。ここで、フラグメントは、免疫原性か っ非毒性であり、本発明に従う変異の１つを含有する、少な（とも１つの保存領 域を含有する。

本発明の第二の局面に従って、本発明の第一の局面の免疫原性無毒化タンパク質 および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンとしての使用のための、 免疫原性組成物が提供される。

免疫原性組成物はさらに、１つ以上のアジュバントおよび／または薬学的に受容 可能な希釈剤を含有し得る。

本発明はさらに、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質および薬 学的に受容可能なキャリアを含有するワクチン組成物を提供する。このワクチン 組成物はさらにアジュバントを含有し得る。

本発明の第三の局面に従って、哺乳類に、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅある いはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの毒素原性株に対するワクチン接種の方 法を提供する。この方法には、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパ ク質を免疫学的に有効な量で投与する工程が包含される。

本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、従来のペプチド合成技術を用いて化学的 に合成され得るが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術により生産される。

本発明の第四の局面に従って、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパ ク質をコードするＤＮＡ配列が提供される。

好ましくは、このＤＮＡ配列は、ポリシストロン性ユニット中に、無毒化サブユ ニットＡおよびサブユニットＢの両方をコードするＤＮＡを包含する、完全なＣ ＴまたはＬＴをコードするＤＮＡ配列を含む。あるいは、このＤＮＡは無毒化サ ブユニットＡのみをコードし得る。

本発明の第五の局面に従って、本発明の第四の局面に従うＤＮＡを輸送するベク ターを提供する。

本発明の第六の局面に従って、本発明の第五の局面に従うベクターで形質転換さ れた宿主細胞系を提供する。

宿主細胞は、ＣＴあるいはＬＴを産生じ得る任意の宿主であり得るが、所望する 免疫原性無毒化タンパク質を産生ずるように好適に設計された、好ましくは細菌 、最も好ましくはＥ、　ｃ。

１１あるいはＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅである。

本発明の第六の局面のさらなる実施態様では、宿主細胞はそれ自身、防御柵（ｐ ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　５ｐｅｃｉｅｓ）、例えば、野生型ＬＴあるいはＣＴを欠 き、そして本発明の第一局面の免疫原性無毒化タンパク質を運搬して発現する表 現型に変異されたＥ、　Ｃｏｔ　ｉあるいはＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ株を提供し 得る。

本発明の第六の局面のさらなる実施態様では、宿主細胞は、本発明の第一の局面 に従う染色体ＬＴ−Ａ遺伝子を発現し得る。

本発明の第七の局面に従って、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパ ク質の製造方法を提供する。この方法には、本発明の第六の局面に従う宿主細胞 を培養する工程が包含される。

本発明の第への局面に従って、本発明の第四の局面に従うＤＮＡの製造方法を提 供する。この方法には、ＣＴ−ＡまたはＬＴ−ＡをコードするＤＮＡあるいはそ れらのフラグメントを、部位特異的変異誘発に供する工程を包含する。

本発明の第九の局面に従って、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパ ク質を、薬学的に受容可能なキャリア、および、必要に応じてアジュバントと合 わせる工程を包含する、ワクチンの調製方法を提供する。

：粟五Ａ皿並 本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、コレラ感染あるいはＥ、ｃｏｌｉ）キシ ン原性株による感染の予防および治療に有用なワクチン組成物の活性成分を構成 する。従って、この組成物は製菓業での使用に適用し得る。

の　な！　Ｉ 図１は、以下の野生型サブユニッ）Ａのアミノ酸配列を示すｉ）　コレラトキシ ン（ＣＴ−Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、前掲）ｉｉ）　ヒトに認められるＥ、　ｃｏ ｌｔ株由来の非耐熱性トキシン（ＬＴｊｌ−Ｙａ＋ｅａ＋ｎｏｔｏら、前掲）ｉ ｆｆ）ブタに認められるＥ、ｃｏｌｉ株由来の非耐熱性トキシン（ＬＴＩ　−Ｓ ｐ　１ｃｅｒら、前掲）、およびｉｖ）　染色体源由来の非耐熱性トキシン（Ｌ ＴＩＪ−Ｐｉｃｋｅｔｔら、前掲）シグナル配列は示していない。

図１では、従来の１文字アミノ酸コードが使用される。記号「、」は、アミノ酸 がないことを示し、印刷上のスペースで、比較が容易となるように配列を整列さ せた。記号「−」は、ＣＴ中の対応アミノ酸と一致するＬＴＩおよびＬＴ２配列 中のアミノ酸を示す。各列に対する番号は、その列の最初のアミノ酸のアミノ酸 番号である。

図１では、本発明の変異の位置には、下線を付けて示す。

図２３および２ｂは、ＬＴｌおよびＣＴのＡサブユニットのアミノ酸およびＤＮ Ａ配列の比較である。

図３は、ＬＴ−Ａ遺伝子を有する、プラスミドＥｌ［）２９９　（Ｄａｌｌａｓ ら）の制限マツプである。

Ｈの　の−　なｆ日 本発明の実施は、他に示されていなければ、当該分野内の、分子生物学、微生物 学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、 文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡ ＲＣＬＯＮＩＮＧ；　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９ ８９）：　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　ｌ　オヨヒＩｎ（Ｄ、Ｎ、　Ｇｌｏｖｅ ｒ編１９８５）：　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴ［ＩＥＳＩＳ　 （Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ　Ｉｉ、１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲ ＩＤＩＺＡＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、旧ｇｇｉｎｓ編１ ９８４）；　ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＴＲＡＳＬＡＴＩＯＮ　（ Ｂ、Ｄ、　ＨａｉｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈ４ｇｇｉｎｓ編１９８４）；　ＡＮＩ ＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＬＩＬＴＵＲＥ　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ　ｔｓ１９ ８６）；　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ　（ ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；　Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡ Ｌ　ＧＵＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４）；シ リーズ＋７）　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅ＋ ａｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）；　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲ Ｓ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　（Ｊ、■、　Ｍｉｌｌｅｒおよび Ｍ、　Ｐ。

Ｃａｌｏｓ編１９８７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｔｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１ ５４およびＶｏｌ、　１５５（それぞれ、ＮｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、および Ｎｕ、編）、　ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、編（１９ｇ？）、ＩＭＭＵＮＯ ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬ ＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）、５ｃ ｏｐｅｓ、（１９８７）、ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：　ＰＲ ＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ ｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥ ＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、　Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ、Ｍ、　ＷｅｉｒおよびＣ ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌ１編１９８６）を、参照のこと。

ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略号が、本明細書で使用されている。本 明細書に引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、参考として援用さ れている。

特に、以下のアミノ酸の略号が使用される：アラニン　Ａ　Ａｌａ アルギニン　ＲＡｒｇ アスパラギン　Ｎ　Ａｓｎ アスパラギン酸　Ｄ　Ａｓｐ システィン　ＣＣｙｓ グリシン　Ｇ　Ｇｌｙ グルタミン酸　Ｅ　Ｇｌｕ グルタミン　Ｑ　Ｇｌｎ ヒスチジン　ＨＨｉｓ イソロイシン　ｌ　ｌｉｅ ロイシン　Ｌ　Ｌｅｕ リジン　Ｋ　Ｌｙｓ メチオニン　Ｍ　Ｍｅｔ フェニルアラニン　Ｆ　Ｐｈｅ プロリン　Ｐ　Ｐｒ。

セリン　Ｓ　Ｓｅｒ スレオニン　Ｔ　Ｔｈｒ トリプトファン　Ｗ　Ｔｒｐ チロシン　Ｙ　Ｔｙｒ バリン　Ｖ　Ｍａｌ 本発明に使用され得る免疫原性無毒化タンノくり質の実施例に挙げた例には、特 に掲載した変異の部位以外で、タンノくり質の天然アミノ酸配列から比較的少な いアミノ酸の変異を有するポリペプチドが包含される。

天然源からタンパク質を単離および精製するよりも、組換えＤＮＡ技術により免 疫原性無毒化タンパク質を生産する重大な利点は、天然源からタンパク質を単離 するのに必要とされる量よりも少量の開始物質を使用して、同量のタンパク質が 生産され得ることである。組換え技術によるタンパク質の生産はまた、細胞内に 通常存在するある種の分子の非存在下での、タンパク質の単離を可能にする。事 実、どのようなヒトタンパク質夾雑物（ｃｏｎｔａＩｌｉｎａｎｔｓ）も完全に 含まないタンパク質組成物が、容易に製造され得る。なぜなら、組換え非ヒト宿 主により生産されたヒトタンパク質のみが、問題の組換えタンパク質である。ヒ トに対して病原性の、天然源からの潜在的ウィルス因子およびウィルス成分もま た、排除される。さらに、遺伝子的に無毒化されたトキシンは、従来の化学的に 無毒化されたトキシンはど毒性が戻らないようである。

薬学的に受容可能なキャリアには、それ自身、その組成物が与えられる個体に有 害な抗体の産生を誘導しない、任意のキャリアが包含される。適切なキャリアは 、典型的には大きく、徐々に代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、ポ リ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸フポリマー、脂質凝 集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性化ウィルス粒子である。

このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免 疫刺激物質（アジュバント）として機能し得る。

組成物の有効性を増強する好ましいアジュバントには、以下が包含されるが、限 定はされない：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムな どのようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成 分のような他の特定の免疫刺激物質を伴うかまたは伴わない、オイルエマルジョ ン調製物、例えば、（１）　ＭＦ５９　（公開国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９０７ １４８３７号、５％スクアレン、０．５％Ｔｖｅｅρ８０．０．５％５ｐａｎ” ８５を含有する（必要ではないが、場合に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ　（ 以下を参照のこと）を含有する）；ここでＭＦ５９は、Ｍｏｄｅｌ　ｌｌ０Ｙマ イクロフルイダイザ−（ｍ１ｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）　（Ｍｉｃｒｏｆｌｕ ｉｄｉｃｓ、　Ｎｅｗｔｏｎ、　ＭＡ　０２１６４）のようなマイクロフルイダ イザーを用いて、サブミクロン粒子に調製されている、（２）　ＳＡＰ、すなわ ち１０％スクアレン、０．４％Ｔｖｅｅｎ　８０．５％プルロニックブロックポ リマーＬ１２１（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌ１２１ ）、およびｔｈｒ−ＭＤＰ　（以下を参照のこと）を含有する；ここでＳＡＦは 、マイクロフルイダイザーでサブミクロンエマルジョンにするか、または、ポル テックスにかけてより大きな粒子サイズのエマルジョンにする、および、（３） 　ＲＩＢＩＴ＋１アジュバント系（ＲＡＳ）　（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍ、　Ｈａｏ＋１ｌｔｏｎ、　ＭＴ）；２％スクアレン、０．２％Ｔｖｅｅｎ＠ 　８０、および、以下からなる群の１つ以上の細胞壁成分を含有する：モノホス ホリルリビドＡ　（ＭＰＬ）、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、および 細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ　（Ｄｅｔｏｘ”）、ムラミ ルペプチド（例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−し−スレオニル−Ｄ−イソグル タミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）　、　Ｎ−アセチル−ノルウラミル−Ｌ−アラニル− Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル ーＤ−イソグルタミニルーし一アラニンー２−（１−２−’；バルミトイルー５ ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスポリルオ牛シ）−ｘｆルアミン（ＭＴＰ−Ｐ Ｅ）など）、およびサイトカイン（インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）な ど）。さらに、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ”（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ ｅ、　Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、　ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され 得るか、または、それからｌＳＣ０Ｍ５　（免疫刺激複合体）のような粒子がつ くられ得る。さらに、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロ インドアシュパン）　（’ＩＦＡ）が、使用され得る。ＡｌｕｍおよびＭＦ５９ が好ましい。

免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバン ト）は、典型的には、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの希釈剤 を含有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、 このような賦形剤に存在し得る。

典型的には、免疫原性組成物は、注射し得るように、溶液または懸濁液のいずれ かに調製される；それはまた、注射の前に液体賦形剤中で、溶液あるいは懸濁液 とするのに適した固形として、調製され得る。調製物もまた、上記のように、薬 学的に受容可能なキャリア中で、アジュバント効果を増強するために、乳化され るか、あるいはリポソームにカプセル化され得る。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペ プチドに加えて、必要に応じて、他の上記した成分を含有し得る。「免疫学的に 有効な量」により、個体への投与量が、単回投与において、または一連の一部と して、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療されるべき 個体の健康状態または生理的状態、治療されるべき個体の分類群（例えば、ヒト 以外の霊長類、霊長類など）、抗体合成に対する個体の免疫系の許容量、所望の 予防の程度、ワクチン調製物、医学上の治療医の見解、およびその他の関連因子 に依存して変化する。その量は、日常試験により決定され得るが、比較的広範囲 であることが予測される。

免疫原性組成物は、非経口的に、例えば、皮下注射または筋肉内注射のいずれか で、従来より投与されている。その他の投与形態に適した調製物には、経口およ び肺用の調製物、坐薬および経皮塗布が包含される。投与治療は、単回投与スケ ジュールあるいは複数回投与スケジュールであり得る。ワクチンは、その他の免 疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

本明細書に使用されている用語「組換えポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａｓ半合成、または合成起源の、以下の起源または操作による、ポリヌ クレオチドのことを意味する：（１）天然に結合されているポリヌクレオチドの 全体または部分に結合しない、（２）天然に連結されているその他のポリヌクレ オチドに結合する、あるいは（３）天然に存在しない。

本明細書に使用されている用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドま たはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー型のヌクレ オチドのことである。

この用語は、分子の一次構造のみを呼ぶ。従って、この用語には、二本鎖および 一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。さらに、この用語には、周知の改変型 、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌ クレオチドのアナログとの１つ以上の置換、ヌクレオチド内の改変（例えば、非 帯電結合（例えば、メチルホスフェート、トリエステルホスフェート、ホスホア ミデート、カルバメートなど）および帯電結合（例えば、ホスホロチオエート、 ホスポロジチオエートなど）での改変（この場合、ペンダント部分として、例え ば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリーＬ −リジンなどを包含する）を有する）、挿入剤（例えば、アクリジン、ンラレン など）での改変、牛レータ−（例えば、金属、放射活性金属、ボロン、酸化金属 など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例えば、α−ア／マー 核酸など）での改変）、および、ポリヌクレオチドの非改変型が、包含される。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして挙動す る、すなわち、それ自身の制御下で複製し得る、遺伝要素（例えば、プラスミド 、染色体、ウィルス、コスミドなど）である。これには、選択可能なマーカーが 含まれる。

「ベクター」は、接続されたセグメントの複製および／または発現をもたらすよ うに、他のポリヌクレオチドセグメントが接続されたレプリコンである。

「制御配列」とは、連結されるコード配列の発現をもたらすのに必要なポリヌク レオチドのことである。このような制御配列の特性は、宿主生物に依存して異な る；原核生物では、このような制御配列は一般的に、プロモーター、リポソーム 結合部位、および転写終結配列を含む；原核生物において、このような制御配列 は一般に、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最少 限で、発現に必要な全ての成分を含み、さらに、例えば、リーダー配列および融 合パートナ−配列のような、存在すれば好都合である成分も含む。

「作動可能に連結された」とは、記載の成分が意図した様式で機能し得る関係に ある並置のことである。コード配列に「作動可能に結合された」制御配列は、制 御配列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結される。

「オープンリーディングフレームＪ　（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードする ポリヌクレオチド配列の領域である；この領域は、コード配列の一部分または全 コード配列を表し得る。

「コード配列」は、適切な調節配列の制御の下におかれると、通常ｍＲＮＡを介 してポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチド配列である。コード配列の境 界は、５°−末端の翻訳開始コドンおよび３−末端の終止コドンにより決定され る。コード配列には、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれ得る が、限定はされない。

ｒＰｃＲＪとは、５ａｉｋｉら、Ｎａｔｕｙｅ　３２４：１６３　（１９８６） ；および５ｃｈａｒｆら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）　２３３：１０７６− １０７８；および米国特許第４、６８３．１９５号；および米国特許第４．６８ ３．２０２号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応の技術のことである。

本明細書に使用されているように、Ｘが本質的に同一様式でｙと関連しない場合 、Ｘはｙに関して「異種」である；すなわち、Ｘが事実上ｙに関連しないか、あ るいはＸが実際に認められるのと同じ様式でｙに関連しない場合である。

「相同」とは、Ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。

１つの型とその他の型との配列間の相関は、当該分野に公知の方法により決定さ れる。例えば、これらは、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定さ れ得る。あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下で、ポリヌクレ オチドをハイブリダイズさせ（例えば、ハイブリダイゼーシコンはＳ１消化に先 だって用いられる）、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより消化し、次に、 消化フラグメントのサイズを測定することにより、相同が決定され得る。

本明細書に使用されている用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸ポリマーのこと であり、特定の長さの産物のことではない；従って、ポリペプチドの定義には、 ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が包含される。この用語はまた、 ポリペプチドの発現後の改変、例えば、グリコリル化、アセチル化、リン酸化な どを意味するのではなく、すなわち除外する。定義に含まれるものは、例えば、 １つ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然のアミノ酸を含む）を有するポリ ペプチド、置換連結（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｌｉｎｋａｇｅｓ）、および、 当該分野に公知の他の天然に存在ならびに天然に非存在の両方の、改変を有する ポリペプチドである。

指定の核酸配列「由来の」ポリペプチドあるいはアミノ酸配列は、その配列中に コードされたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプ チド、あるいはその部分のことであり、ここでその部分は、少なくとも３−５の アミノ酸からなり、さらに好ましくは、少なくとも８−１０のアミノ酸、さらに 好ましくは少なくとも１１−１５のアミノ酸からなるか、または、そのペプチド は配列中にコードされたポリペプチドと免疫学的に同一であると見なし得る。こ の用語にはまた、指定の核酸配列から発現されるポリペプチドが包含される。

タンパク質は、そのタンパク質に特異的な、モノクローナルあるいはポリクロー ナルのいずれかの抗体を産生ずるのに使用され得る。これらの抗体を産生ずる方 法は、当該分野に公知である。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」および、その他 のこのような用語は、例えば、組換えベクターあるいはその他のトランスファー ＤＮＡ用の受容体として使用され得るか、または使用された微生物、昆虫細胞、 および哺乳類細胞を意味し、そして、形質転換された初代細胞の子孫を包含する 。単一の親細胞の子孫は、０然的、偶発的あるいは意図的変異により、形態学あ るいはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡ相補鎖において、初代の親のようには必ずし も完全に同一であり得ないことは理解される。哺乳類宿主細胞の例としては、チ ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびサル腎（ＣＯＳ）細胞が挙げら れる。

特に、本明細書に使用されている「細胞系」は、インビトロにおいて増殖および 分化を継続あるいは延長し得る細胞群のことである。しばしば、細胞系は、単一 の先祖細胞に由来するクローン群である。このようなりローン群の貯蔵あるいは 移動の間に、自発変化あるいは誘発変化が核型において生じ得ることがさらに当 該分野では知られている。従って、引用の細胞系由来の細胞は、先祖細胞あるい は培養物と正確には同一であり得ず、そして引用の細胞系は、そのような変種を 含む。用語「細胞系」はまた、不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞系は、 非ハイブリッド細胞系あるいはハイブリドーマの２つの細胞型のみを含む。

本明細書に使用されている用語「微生物」には、細菌および細菌のような原核お よび真核の微生物種が包含され、細菌には、酵母および糸状菌が包含される。

本明細書に使用されている「形質転換」とは、例えば、直接取り込み（ｄｉｒｅ ｃｔ　ｕｐｔａｋｅ）、トランスダクション、ｆ−メーティング、あるいはエレ クトロポレーションのような、挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への 外因性ポリヌクレオチドの挿入のことである。外因性ポリヌクレオチドは、プラ スミドのような非組込みベクターとして維持され得るか、あるいは宿主ゲノムに 組込まれ得る。

「ゲノムの」により、ベクターにクローニングされた制限フラグメントに由来す るＤＮＡ分子のコレクシ田ンあるいはライブラリーを意味する。これは、生物の 遺伝子物質の全であるいは部分を包含し得る。

ｒｃＤＮＡＪにより、ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする、相補ＤＮＡ鎖を意 味する。

「精製された」および「単離された」により、ポリペプチドあるいはヌクレオチ ド配列に関する場合には、指示される分子が、それと同じタイプの生物学的高分 子が他に実質的に存在していない状態で、存在することを意味する。本明細書に 使用されている用語「精製された」は、同じタイプの生物学的高分子が、少なく とも７５重量％、好ましくは、少なくとも８５重量％、さらに好ましくは、少な くとも９５重量％、そして最も好ましくは９８重量％存在することを意味する（ しかし、水、緩衝液、およびその他の低分子、特に、分子量が１０００未満の分 子は、存在し得る）。

一旦、適切なコード配列が単離されると、それは種々の異なった発現系において 発現され得る；例えば、それは、哺乳類細胞、バキュロウィルス、細菌、および 酵母と共に使用される。

１、哺乳類系 哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポ リメラーゼを結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの 下流（３°）転写を開始し得るあらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは、コ ード配列の５゛末端近傍に通常位置する転写開始領域、および転写開始部位の２ ５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴ Ａボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向づけ、正しい部位でＲＮＡ合成を 開始すると考えられている。哺乳類プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１ ００から２００ｂｐ上流内に通常位置する上流プロモーター要素も含む。上流プ ロモーター要素は、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用し得 る［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕａｌ、第２版中のＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）　ｒ哺乳類細胞における クローン化遺伝子の発現」］。

哺乳類ウィルス遺伝子は、しばしば、非常高度に発現され、そして広い宿主の範 囲を有する。従って、哺乳類ウィルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプ ロモーター配列を提供する。その例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス 乳ガンウィルスＬＴＲプロモーター、アデノウィルス主後期（ｍａｊｏｒｌａｔ ｅ）プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）および単純性庖疹ウィルスプロモーターが挙 げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウィルス遺伝子由来 の配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、プロモーターがホ ルモン応答性細胞内のグルココルチコイドで誘導され得るか否かによって、構成 的であり得るか、または調節され得る（誘導可能）。

エンハンサ−要素（エンハンサ−）が存在すると、これは上記のプロモーター要 素と組合わさって、通常、発現レベルを増加させる。エンハンサ−は、相同また は異種のプロモーターと連結すると、正常なＲＮＡ開始部位での合成開始と共に 転写を１０００倍にまで増加し得る調節ＤＮＡ配列である。エンハンサ−はまた 、転写開始部位から上流または下流に位置しても、正常な方向もしくは逆方向の いずれの方向でも、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドより遠く離れ た位置にあっても機能する。［Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９ｇ？）　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３６＋１２３？；　Ａｌｂｅｒｔｓら、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕ　 ａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１１．第２版］。ウィルス由来のエンハ ンサ−要素は特に有用であり得る。なぜなら、これらは通常、より広い宿主の範 囲を有するため、である。その例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサ−［ １）ｉｊｋｅ＋ｉａら、（１９＋１５）　ＥＭＢＯＪ、　４ニア６１］、ならび にラウス肉層ウィルスの長末端反復（ＬＴＲ）　ｒＧｏｒｍａｎら、（１９８２ ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　７９：６７７７］および ヒトサイトメガロウィルス［Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）　ｊ、１ＬＬ４ｉ ：５２１１由来のエンハンサ−／プロモーターが挙げられる。さらに、エンハン サ−の中には調節可能で、ホルモンまたは金属イオンなどの誘導物質の存在下で のみ活性となるものがある［５ａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ 、　（１９８６）　′ＬＬＵｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、２：２１５；　Ｍａｎｆａｔｉ ｓら、（１９８？）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７］。

哺乳類細胞中では、ＤＮＡ分子は細胞内で発現し得る。プロモーター配列はＤＮ Ａ分子と直接連結し得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の第１アミノ酸は 、常にＡＴＧ開始コドンによってフードされるメチオニンである。所望なら、臭 化シアンを用いてインビトロでインキュベートすることによって、Ｎ末端はタン パク質から切断され得る。

あるいは、哺乳類細胞内で異種タンパク質の分泌を促すリーダー配列フラグメン トから構成され、そして融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を形成す ることによって、異種タンパク質もまた、細胞から増殖培地へ分泌され得る。リ ーダーフラグメントと異種遺伝子との間でコードされ、そしてインビボまたはイ ンビトロで切断され得るプロセシング部位があることが好ましい。リーダー配列 フラグメントは、通常、細胞からタンパク質を分泌させる疎水性アミノ酸で構成 されるシグナルペプチドをコードする。アデノウィルス３分節系（ｔｒｉｐａｒ ｉｔｅ）　リーダーは、哺乳類細胞内で異種タンパク質を分泌するリーダー配列 の一例である。

通常、哺乳類細胞で認められる翻訳終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳 終止コドンから３°側に位置する調節領域であるため、プロモーター要素と共に コード配列に隣接する。成熟ｖｎＲＮＡの３゛末端は、部位特異的転写後切断お よびポリアデニル化によって形成される［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５） 　Ｃｅ上Ｌ４１：３４９；　Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ■虹那（ Ｂ、Ｄ、　Ｈａｒｏｅｓおよびり。

Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、１ｍ）中のＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｖ、　 （１９８８）　ｒ真核生物のＲＮＡの終結および３゛末端プロセシングＪ　；　 Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　（１９８９）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃ ｉ、　１４：１０５］。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプ チドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写をもたらす。転写ターミネータ−／ポリアデ ニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる［Ｍｏ１ｅμ住 扛以し且Ｄ１上］−しゆｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕ旧２中のＳａｍｂｒｏｏｋら、 Ｃ１９８９）　ｒ培養哺乳類細胞におけるクローン化遺伝子の発現」］。

イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在すると、いくらかの遺伝子はより効 率的に発現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシングシグナル （スプライス供与およびスプライス受容部位とも呼ばれる）を欠失するベクター から効率的に発現された［例えば、ＧｏｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ　（ １９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９３＋６２０を参照のこと］。イントロンは、ス プライス供与部位およびスプライス受容部位を含むコード配列内の介在非コード 配列である。これらは、−次転写産物のポリアデニル化に続く「スプライシング 」と呼ばれる過程によって除去される。［Ｎｅｖｉｎｓ　（１９８３）　Ａ　ｎ ｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃ　ｅｍ、　５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ　（１９８６） 　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、２０：　６７１；　Ｐａｄｇｅｔｔら（１ ９８６）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５５：１１１９；　Ｔ　 ａ　ｓｃｒ’　ｔｉｏｎ　ａ　ｄ　ｓ　１’１■（Ｂ、Ｄ、　ｎａｍｅｓおよび り、Ｍ、　、Ｇｌｏｖｅｒ編）中のＩ［ｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ　 （１９８８）によるｒＲＮＡスプライシング」］。

通常、上記構成要素は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終 結配列を包含し、共に発現構築物を形成する。エンハンサ−１機能的スプライス 供与部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所望 であれば、発現構築物中に含まれ得る。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞ま たは細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミ ド）のようなレプリコン中に維持され得る。哺乳類の複製系は、複製にトランス 作用因子を必要とする動物ウィルス由来の複製系を含む。

例えば、ＳＶ４０　［Ｇｌｕｚ＋＊ａｎ　（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　２３：１７ ５］またはポリオーマウィルスのようなバポーバウィルスの複製系を有するプラ スミドは、適切なウィルス性Ｔ抗原の存在下で、極端に多いコピー数に至るまで 複製する。哺乳類のレプリコンのさらなる例として、ウシパピローマウィルスお よびエプスタイン−パールウィルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、こ のレプリコンは、２種の複製系を有し得るため、レプリコンは、例えば、哺乳類 細胞中には発現のために、モして原核宿主中にはクローニングおよび増幅のため に維持され得る。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例として、ｐＭ Ｔ２　［Ｋａｕｆ＋ｉａｎら、　（１９８９）　ｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、　９：９４６コおよびｐＨＥＢ。

［Ｓｈｉｍｉｚｕら、　（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６ ：１０７４］が挙げられる。

使用する形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種ポリヌクレオ チドを哺乳類細胞中へ導入するための方法は、当業者に周知であり、デキストラ ン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン介在トラン スフエフシコン、プロトプラスト融合、エレクトロボレー７ヨン、リポソーム中 へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核中へのＤＮＡの直接的なマイクロ インジェクションを包含する。

発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は、当業者に周知であり、そしてア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多（ の不死化細胞系を含み、これらとして、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞、ヒーラ細胞、シリアンハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、コス細胞（ＣＯＳ） 、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ　Ｇ２）、および他ノ多くの細胞系を挙げ ることができるが、それらに限定されない。

ｆ　ｔ、バキュロウィルス系 タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、適切な昆虫発現ベクター中に 挿入され得、そしてそのベクター内の制御要素に、作動可能に連結される。ベク ター構築は、当業者に周知の技術を用いる。

一般に、発現系の構成要素は、バキュロウィルスゲノムの７ラグメントと異種遺 伝子または発現されるべき遺伝子の挿入に都合のよい制限部位との両方を含み、 そして通常は細菌のプラスミドである転移ベクター；転移ベクター中のバキュロ ウィルスに特異的なフラグメントと相同の配列を有する野生型バキュロウィルス （これは、異種遺伝子のバキュロウィルスゲノム中への相同的組換えを考慮に入 れる）：および適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を有する。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、転移ベクター中に挿入した後、そのベク ターとウィルスゲノムとが再結合することが可能な昆虫宿主細胞中に、そのベク ターおよび野生型ウィルスゲノムをトランスフェクトする。パッケージされた組 換えウィルスを発現し、組換えプラークを同定し、そして精製する。バキュロウ ィルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、キットの形状で、特に、　Ｉｎｖ ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ　（［マックスバック（ＭａｘＢａ ｃ）　Ｊキ・ノド）から、市販されている。これらの技術は、一般に当業者に周 知であり、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈＳＴｅｘａｓ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕ ｒａｌ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅ■Ｌ■芸号（１９ ８？）　（以後、ｒ　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈＪと記載）中に完全に記 載されている。

バキュロウィルスゲノム中にタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入する前に 、プロモーター、　（所望ならば）リーダー、目的とするコード配列、および転 写終結配列を含む上記構成要素を、通常、中間転位（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅ ｎｔ）構築物（転移ベクターンに組み立てる。この構築物は、単一の遺伝子、お よび作動可能な連結された調節要素；それぞれが作動可能に連結された一連の調 節要素を有する同義遺伝子；または、それと同じ一連の調節要素により調節され る同義遺伝子を含み得る。中間転位構築物は、しばしば、細菌のような宿主中で 安定に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中 に維持される。このレプリコンは、複製系を有するため、レプリコンが、クロー ニングおよび増幅のために適切な宿主中に維持され得る。

現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶ中に導入するために、最も一般的に使用される転 移ベクターはｐＡｃ３７３である。当業者に周知の多くの他のベクターもまた、 設計された。これらには、例えば、　（ポリヘトリン開始コドンをＡＴＧからＡ ＴＴに変換し、そのＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍ旧クローニング部位を導 入する）ｐＶＬ９８５が包含される；　ＬｕｅｋｏｖおよびＳｔ＋ｍｍｅｒｓｓ ■胆Ｌ■（１９８９）し１７：３１を参照のこと。

通常、このプラスミドはまた、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌ ｅｒら、　（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｒｖ、　Ｍ’ｃｒｏｂｉｏ１．、■：１７ ７）、および、Ｌ　韻、中の選択および増殖のための原核生物のアンピリジン耐 性（ｕＬ＋２）遺伝子および複製起点をも含有する。

バキュロウィルス転移ベクターは、通常バキュロウィルスプロモーターを含有す る。バキュロウィルスプロモーターは、バキュロウィルスＲＮＡポリメラーゼを 結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５°か ら３°）転写を開始し得る、あらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは、コー ド配列の５゛末端の付近に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領 域は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を通常含有する。バキュ ロウィルス転写ベクターはまた、エンハンサ−と呼ばれる第２ドメインを有し得 、これが存在する場合、通常、このエンハンサ−は構造遺伝子に対して遠位にあ る。発現は、調節されるかあるいは構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）である 。

ウィルス感染サイクルの終期に大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロ モーター配列を提供する。例として、ウィルスポリヘドロンタンパク質をコード する遺伝子がら得られる配列、］Ｌ氷山狙ｌ五」山江圧り可」■ヨ旦」１□ｅｓ 　（Ｗａｌｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）中のＦｒ１ｅｓｅｎら、　（１９８６ ）　ｒバキュロウィルス遺伝子発現の調節」；欧州特許公開第１２７８３９号お よび第１５５４７６号；およびｐｌＯタンパク質をコードする遺伝子、Ｖｌａｋ ら、（１９８８）、Ｊ、　Ｇ　ｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９ニア６５が挙げられる 。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、バ牛ユロウィルスボリヘドリン遺伝 子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）　Ｇｅｎｅ、７３：４０９）のような、 分泌された昆虫あるいはバキュロウィルスタンパク質の遺伝子から得られ得る。

あるいは、哺乳類細胞の翻訳後の（シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切 断、およびリン酸化のような）改変に対するシグナルが昆虫細胞に認識されるら しく、また分泌および核蓄積に必要なシグナルも、無を椎動物細胞とを椎動物細 胞との間で保存されるらしいので、ヒトα−インターフ、ｏン、Ｍａｅｄａら、 　（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ３１５：５９２　；ヒトガストリン放出ペプチド 、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、　（１９８８）　、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ １ｌ：　Ｂｉｏ　、８：３１２９；　ヒトＩＬ−２、Ｓｍ１ｔｈら、　（１９８ ５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８２：８４ ０４；　？ウスＩＬ−３、（Ｍｉ　ｙａｊ　ｉｍａら、　（１９８７）　Ｇｅｎ ｅ　５８：２７３；およびヒトグルコセレブロシダーゼ、Ｍａｒｔｊｎら、　（ １９８８）　ＤＮＡ、ヱ：９９をコードする遺伝子から得られるリーダーのよう な非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を促すために用い得る。

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内テ発現され得るか、または 適当な調節配列により発現される場合に分泌され得る。非融合外来タンパク質の 良好な細胞内発現は、通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に、適切な翻訳開始シグナ ルを含有する短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。所望 であれば、Ｎ末端のメチオニンを、成熟したタンパク質から、臭化シアンを用い るインビトロのインキュベーションで切断し得る。

あるいは、天然には分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆 虫内で、外来タンパク質の分泌を可能にするリーダー配列フラグメントを含む融 合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することで、昆虫細胞から分 泌され得る。このリーダー配列フラグメントは、通常、タンパク質を小胞体中に 輸送する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。

タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿 入の後、昆虫細胞宿主を、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウィ ルスのゲノムＤＮＡを用いて、同時形質転換するｍ−通常は、同時トランスフェ クションによる。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウ ィルスゲノムの２〜５ｋｂのセグメントを含む。異種ＤＮＡをバキュロウィルス 中の所望の部位に導入する方法は、当業者に周知である。（ＳｕＩｌｌＩＩＩｅ ｒＳおよびＳｍ１ｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；　Ｓａ＋ｉｔｈら、Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８３）　ｉ：２１５６；およびＬｕｃｋｏｖ およびＳｕｍｍｅｒｓ　（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同的 二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ　 ｒｅｅ。

ｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリヘトリン遺伝子のような遺伝子中に行われ得 る；挿入は、所望のバキュロウィルス遺伝子中に設計される制限酵素部位中にも 行われ得る。ＭＨｌｅｒら、（１９８９）、肚田」且４：９１ａ　このＤＮＡ配 夛１ｊは、発現ベクター中のポリヘトリン遺伝子の場所にクローニングされた場 合、５°および３゜の両方がポリヘトリン特異的配列により隣接され、ポリへド リンプロモーターの下流に位置する。

新しく形成されたバキュロウィルス発現ベクターを、続いて、感染性の組換えバ キュロウィルス中にパッケージする。

相同的組換えは、低い頻度（約１％と約５％との間）で発生する；そのため、同 時トランスフェクションの後に生産されるウィルスの大半は、まだ野生型ウィル スである。従って、組換えウィルスを同定する方法が必要である。この発現系の 利点は、組換えウィルスの識別を可能にする視覚スクリーンである。天然のウィ ルスにより生産されるポリヘトリン遺伝子は、感染細胞の植生で、ウィルス感染 の後遅い時期に、非常に高いレベルで生産される。蓄積されたポリヘトワンタン パク質は、包埋された粒子もまた含有する閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄ ｆｅｓ）を形成する。これらの閉塞体は、サイズが１５μｍまでであり、屈折率 が高いので、光学顕微鏡下で容易に可視化される、明るい光沢のある外観を与え られる。組換えウィルスに感染された細胞は、閉塞体を欠（。野生型ウィルスか ら組換えウィルスを識別するために、トランスフェクション上清液を、当業者に 周知の技術を用いて、昆虫細胞の単層上にプラークを形成させる。すなわち、プ ラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野生型ウィルスを示す）または非存在 （組換えウィルスを示す）についてスクリーニングする。ｒ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　 Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪ第２巻（Ａｕ５ｕｂｅ ｌら編）の１６．８　（１０，１９９０増補）　；　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｎ ＋ｉｔｈ、上記ＨＭｉｌｌｅｒら（１９８９）。

組換えバキュロウィルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞中へ感染させるた めに開発されている。例えば、組換えバキュロウィルスが、とりわけ以下の種の ために開発されてよびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ　ｎｉ　（ＰＣＴ公開Ｎｏ　８ ９１０４６６９９号ＨＣａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、　５６：１５３；　Ｗｒｉｇｈｔ　（１９８６）　■皿旦３２１ニア１８；Ｓ ｍ１ｔｈら、　（１９ｇ３）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｆｉ：２１ ５６；および一般的にはＦｒａｓｅｒら（１９８９）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ １１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　２５：２２５を参照のこと）。

細胞および細胞培地は、バキュロウィルスフ発現系での、異種ポリペプチドの直 接発現および融合発現の両方のために、市販され入手可能である；細胞培養技術 は、通常、当業者に周知である。匠人互、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｎ＋ｉｔｈ、 上記を釡＆次いで、改変された昆虫細胞を、適切な栄養培地中で増殖させ得、改 変された昆虫宿主中に存在するプラスミドを安定して維持させる。発現産物の遺 伝子が、誘導可能な制御下におかれている場合、宿主は高密度に増殖し得、そし て発現を誘導し得る。または、発現が構成性である場合、生産物は培地中に継続 的に発現させ、そして、目的の生産物を除去して消耗した栄養分を増加させる間 、栄養培地は継続して一部取り換えなければならない。産物は、クロマトグラフ ィー、例えば、）ＩＰＬＣ，アフィニイティークロマトグラフィー、イオン交換 クロマトグラフィーなど；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような 技術により精製され得る。好適には、この生産物は、必要であれば、培地中に分 泌されるか、または昆虫細胞の溶解から生じるいかなる昆虫タンパク質をも実質 的に除去するために、宿主のデブリ（例えば、タンパク質、脂質および多糖類） を少な（とも実質的に含まない産物を提供するために、さらに精製され得る。

タンパク質発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞を、組換え タンパク質コード配列を発現させる条件下でインキュベートする。これらの条件 は、選択される宿主に依存して変化し得る。しかしながら、この条件は、当該分 野で周知の技術に基づいて、当業者が容易に確定し得る。

１ｉｉ、細菌系 細菌発現技術は、当該分野で周知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリ メラーゼを結合し得、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｌＲＮＡへの順方向 （３１）転写を開始させ得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、 通常コード配列の５゛末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開 始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌 プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２のドメインもまた含み、これはＲ ＮＡ合成が始まる、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重複し得る。遺伝子 リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特定の遺伝子の 転写を阻害するので、オペレーターは、負ｌ、−調節された（誘導可能）転写を 可能にする。構成性発現は、オペレーターのような負の調節要素の非存在下で起 こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列によ り達成され得る。この遺伝子アクチベータータンパク質結合配列は、存在する場 合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５″）にある。遺伝子アクチペ ータータンパク質の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｒａ　ｃｏｌＩ　（Ｅ、　ｃｏ Ｈ）のｌａｃオペロンの転写の開始を助けるカタボライト活性化タンパク質（Ｃ ＡＰ）　［Ｒａ１ｂａｕｄら（１９８４）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ 、　ｌｆｉ：１７３］がある。従って、調節発現は、正または負のいずれかであ り得、それにより、転写を増大または低下させる。

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例 には、ガラクトース、ラクトース（ｌｊｌｃ）　［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎ ａｔｕｒｅ　１９８：１０５６］およびマルトースのような糖類を代謝する酵素 に由来するプロモーター配列が包含される。さらに、例として、トリプトファン （ｔ　ｒｐ）　ＣＧｏｅｄｄｅｌら（１９８０）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、ｉ＋４０５７；　Ｙｅｌｖ、ｅｒｔｏｎら　（１９８１）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｉ＋７３１；米国特許第４．７３８．９２１号；欧州特許公開 第０３６７７６号および第１２１７７５号］のような生合成酵素に由来するプロ モーター配列が挙げられる。ｇ−ラオタマーゼ（■）プロモーター系［Ｉｎｔｅ ｒｆｅｒｏｎ　３　（１，Ｇｒｅｓｓｅｒ編）中のＷｅｉｓｓ＋ａａｎｎ（１９ ８１）　ｒインターフェロンおよび他の誤り（ｍｉｓｔａｋａＳ）のクローニン グ」］、バクテリオファージラムダＰＬ　［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１） 　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８］およびＴ５　［米国特許第４、６８９．４０ ６号］プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。

さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして 機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性 化配列を、他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連 結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成する［米国特許第４．５５１．４ ３３号コ。例えば、ｔａｃプロモーターは、Ｉａｅリプレッサーにより調節され る当プロモーターおよびｌａｃオペロン配列の両方を含むハイブリッド！ＪＩＪ ２−１　ａ　ｅプロモーターである［　Ａｒｘａｎｎら（１９８３）　Ｇｅｎｅ 　２５：１６７；　ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０：２１］。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡ ポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在 するプロモーターを含み得る・非細胞起源の天然に存在するプロモーターはまた 、適合するＲＮＡポリメラーゼと結合し得、原核細胞において、いくつかの遺伝 子の高い発現レベルを生じさせる。バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラー ゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の例である［５ｔｕｄｉｅｒ ら（ｔ９８６）　Ｊ、ｏｌ　Ｂ’ｏ　、　１Ｊｌｉ：１１３；　Ｔａｂｏｒら　 （１９８５）　Ｐｒｏｅ　Ｎａｔ　、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、８２：１０７４コ。さ らに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよ びＬ　ｃｏｌｔオペレーターから構成され得る（欧州特許公開第２６７８５１号 ）。

機能しているプロモーター配列に加えて、効果的なリポソーム結合部位もまた、 原核細胞での外来遺伝子の発現に有用である。旦、！ｉｕでは、リポソーム結合 部位は、シャインーダルガルノ配列（ＳＤ）と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）お よび開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の 配列を含む［５ｈｉｎｅら（１９７５）　■組■２５４：３４］。ＳＤ配列は、 ＳＤ配列とＦ、、　皿１６Ｓ　ｒＲＮＡの３°末端との間の塩基の対合により、 リポソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる［Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ 　Ｒｅ　ｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ：　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ 　ｒｅｓｓｉｏｎ　（Ｒ，Ｆ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒｉり中の５ｔｅｉｔｚら （１９７９）　ｒメツセンジャーＲＮＡ中の遺伝シグナルおよびヌクレオチド配 列」］。弱いリポソーム結合部位で真核遺伝子および原核遺伝子を発現させるこ と［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ　Ｍ　ｕａ 中のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）　ｒＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ、 中でのクローニングされた遺伝子の発現」コ。

ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列ハ、ＤＮＡ分子と直接 連結され得、この場合Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常にメチオニンでありこのメ チオニンは、ＡＴＧ開始コト７でコードされる。所望であれば、Ｎ−末端のメチ オニンは、臭化シアンを用いるインビトロのインキュベーションにより、または 、細！！ＩＮ末端ペプチダーゼを用いるインビボまたはインビトロでのいずれか のインキュベーションによりタンパク質から切断し得る（欧州特許公開第２１９ ２３７）。

融合タンパク質は、直接発現の代わりに用い得る。通常、内在性細菌タンパク質 のＮ末端部分または他の安定なタンパク質ををコードするＤＮＡ配列を、異種コ ード配列の５°末端に融合する。発現の際に、この構築物は、２種のアミノ酸配 列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージラムダ細胞遺伝子は、外来遺 伝子の５°末端に連結され、細菌中で発現され得る。

得られる融合タンパク質は、好適には、プロセシング酵素（因子Ｘａ）に対する 部位を保持し、外来遺伝子からのバタテリオファージタンパク質を切断する［Ｎ ａｇａｉら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ３０９：８１０１゜融合タンパク質はま た、１３５Ｚ［Ｊｆａら（１９１１？）　Ｇｅｎｅ　６０：１９７］　、扛■［ Ａ１１ｅｎら（１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５：９３；　Ｍａｋ ｏｆｆら（１９８９）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３５：１１ ］、および血［欧州特許公開第３２４６４７号コの遺伝子由来の配列を用いても 作製され得る。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ配列は、切断部位をコード しても、しな（でもよい。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このよ うな融合タンパク質は、好適には、外来タンパク質からユビキチンを切断するプ ロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）に対す る部位を保持するユビキチン領域で作られる。

この方法により、天然の外来タンパク質が単離され得る［Ｍｉｌｌｅｒら　（１ ９８９）　Ｗム〃ゴ孟旦１ルＪ３υ１　ヱ：６９８］　。

あるいは、外来タンパク質を、細菌中で外来タンパク質を分泌させるシグナルペ プチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を 作製することにより細胞から分泌させ得る［米国特許第４．３３６．３３６号］ 。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を支配する 疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。

タンパク質は、増殖培地（ダラム陽性菌）中、または細胞の内膜と外膜との間に 位置する細胞周辺腔（グラム陰性菌）中のいずれかに分泌される。好適には、シ グナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間でコードされた、インビボまた はインビトロで切断され得るプロセシング部位がある。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、旦、並且外膜タンパク質遺伝子（幻 ｕ）［ｎ匹丘肚旺紅」Ｌ江吐■包りば」■ｅ　Ｅｘ　ｅｓｓｉｏ中のＭａｓｕｉ ら（１９８３）　ＨＧｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＦｉＭｗＪ、　３：２４３７ ］およびＥ、　刈■アルカリホスファターゼシグナル配列（劇）　［Ｏｋａら（ １９８５）　Ｐ　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　８２ニア２１２］の ような、分泌された細菌タンパク質に対する遺伝子に由来する。追加の例として 、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列を、旦 、匹■■ｎ由来の異種タンハク質を分泌するために使用し得る［Ｐａ１ｖａら（ １９８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：５ ５８２；欧州特許公開第２４４０４２号］。

通常、細菌により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの３°に位置する 調節領域であり、そのため、プロモーターと共に、コード配列の側面に位置する 。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲ ＮＡの転写を支配する。転写終結配列は、しばしば、転写の終了を助けるステム ループ構造（ｓｔｅｍ　１ｏｏｐ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を形成し得る約５０ ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、　Ｆ、、　ｃｏｌｉのｍ遺伝子 および他の生合成遺伝子のような、強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転 写終結配列が挙げられる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望の場合）、目的のコード配列、および 転写終結配列を包含する上記構成要素を組立てて、発現構築物を生成する。発現 構築物は、しばしば、細菌のような宿主中に安定して維持され得る染色体外要素 （例えばプラスミド）のようなレプリコン中に維持される。

レプリコンは複製系を有し、そのため、発現またはクローニングおよび増幅のい ずれかのために、原核生物宿主中で維持されることが可能になる。さらに、レプ リコンは、高コピー数または低コピー数のいずれのプラスミドでもあり得る。高 コピー数のプラスミドは、一般的に約５〜約２００、通常は約１０〜約１５０に 及ぶコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好適には、少な くとも約１０、より好適には少なくとも約２０のプラスミドを含有する。高コピ ー数または低コピー数のいずれかのベクターを、宿主におけるベクターおよび外 来タンパク質の効果に依存して、選択し得る。

あるいは、発現構築物を、組込みベクターを用いて、細菌ゲノム中に組込み得る 。組込みベクターは、通常、ベクターへの組込みを可能にする細菌染色体に相同 である少なくとも１つの配列を含む。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌 染色体との間の組換えの結果束じると思われる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕ ｓ株由来のＤＮＡを用いて構築される組込みベクターは、Ｂａｃｉｌ　ｌｕｓ染 色体中に組込む（欧州特許公開第１２７３２８号）。組込みベクターはまた、バ クテリオファージまたはトランスポゾン配列を含み得る。

通常、染色体外の組込み発現構築物は、選択可能なマーカーを含み得、形質転換 された細菌株の選別を可能にする。選択可能なマーカーは、細菌宿主中で発現さ れ得、アンピリジン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン （ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬剤に対する抵抗性を細菌 に与える遺伝子を含み得る［　Ｄａｙ　ｉｅｓら（１９７８）　Ａｎｎｕ、　Ｒ ｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３２：４６９］。選択可能なマーカーはまた、ヒ スチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における遺伝子のよう な、生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上記構成要素のいくつかを、形質転換ベクター中に組み立て得る。形 質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコン中で維持されるか、または 組込みベクターに発展サレル選択可能なマーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａ ｒｋｅｔ）を含む。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターの発現および形質転換ベクターが、多 数の細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターが、とり わけ以下の細菌用に開発されている：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ１１ｉｓ　 ［Ｐａ１ｖａら（１９１１２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　７９：５５８２；欧州特許公開第０３６２５９号および第０６３９５３ 号；　ＰＣＴ公開Ｎｏ　８４１０４５４１号コ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｔ　［Ｓｂｉｍａｔａｋｅら（１９８１）　し１」１２９２：１２８；　Ａｍ ａｎｎら　（１９８５）　江肚４ｊ；ｊ：１８３Ｈ５ｔｕｄｉｅｒら　（１９８ ６）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、月１：１１３；欧州特許公開第０３６７７６号 、第１３６８２９号および第１３６９０７号］、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ｃｒｅ＋ａｏｒｉｓ　［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８ｇ）　５狙り−Ｅ　ｖ　ｒｏｎ 、’ｃｒｏｂ’ｏ　、　５４：６５５］　；　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ ｉｖｉｄａｎｓ　［Ｐｏｖｅｌ　ｌら（１９８８）　Ａ　、Ｅｎｖｉｒｏ　、　 Ｍｉｃ　ｏｂｉｏ　、５４：６５５］、５ｔｒｅｐｔｏｓｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄ ａｎｓ　［米国特許第４．７４５．０５６号］。

細菌宿主に外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、通常、Ｃａ Ｃｌ２処理した細菌の形質転換、または二価のカチオンおよびＤＭＳＯのような 他の薬剤のいずれかを包含する。

ＤＮＡはまた、細菌細胞中にエレクトロポーレーションによっても導入され得る 。形質転換手順は、通常、形質転換される細菌の種により異なる。例えば、以下 を参照のこと：　［Ｍａｓｓｏｎら　（１９８９）　Ｆ　ＭＳ　Ｍ’ｃｒｏｂ’ ｏ１．　Ｌｅｔｔ、６０：２７３；　Ｐａ１ｙａら　（１９８２）Ｐｒｏｃ、　 Ｎ　ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ　７９：５５８２；欧州特許公開第０ ３６２５９号および第０６３９５３号；ＰＣＴ公開Ｎｏ　８４１０４５４１号、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｅｔ、８５：８５６；　Ｗａｎｇう（１９９０）ムＢａｃｔｅｒｉｏ １．　１？２：９４９、Ｃａ５ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、　［Ｃｏｈｅｎら　（ １９７３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、６９：２１１０；　Ｄｏ ｗｅｒら（１９８ｇ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：６１２ ７；　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒ’、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃＥｎｉｎｅｅｒｉｎ（ＬＷ、　ＢｏｙｅｒおよびＳ、　Ｎｉｃｏｓｉａｍ） 中のＩ［ｕｓｈｎｅｒ　（１９７８）　ｒｃｏｌＥｌ−誘導プラスミドを用いる Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｉの形質転換の改良法Ｊ　ＨＭａｎｄｅｌら（ １９７０）　Ｊ、　Ｍｏ　、　Ｂｌｏｌ、　５３：１５９；　Ｔａｋｅｔｏ　（ １９８８）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ’ｏ　ｈ　ｓ、ｅｔａ　９４９：３１８；　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、　［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）　ＦＥＭＳ　Ｍｉ ｃ　ｏｂ’ｏ　、Ｌｅｔｔ。

４４：１７３　Ｌａｃｔｏｔｉａｃｉｌｌｕｓコ　；　［Ｆｉｅｄｌｅｒら　（ １９８８）　八］３」１−」ＬＬ９免九ｅｍ　１７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ］　；　［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）　■呈り見上り旦に１ｑ１１ −ｌ旦ｔｔ、６６：２０３、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓコ　、［Ｂａｒａｎ ｙら　（１９８０）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４４：６９８；　５ｔｒ ｅ　ｔｏｃｏｃｃａ　Ｇｅｎｅｔ’ｃｓ　（Ｊ。

ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ，Ｃｕｒｔｉｓｓ　１１１編）中のＨａｒｌａｎｄｅ ｒ　（１９８７）「エレクトロボーレージ菅ンによる５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　１ａｃｔｉｓの形質転換Ｊ　ＨＰｅｒｒｙら（１９８１）　Ｉｎｆｅｃ、　 Ｉｍｍｕｎ、　３２：１２９５；　Ｐａｖｅｌｌら（１９８ｇ）　１．　Ｅｎｖ ｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５５；　Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８ ７）　Ｐｒｏｃ、ｔｈ　ｖｒ、ｏｎ　、　Ｂｉｏｔｅｃ　ｎｏｌ虫１：４１２． ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］　。

（以下余白） ｉｖ、酵母発現 酵母発現系はまた、当業者には公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポ リメラーゼを結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの 下流（３°）の転写を開始し得るあらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは、 通常、コード配列の５°末端の近くに位置する転写開始領域を有する。この転写 開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボックス」）およ び転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（Ｕ ＡＳ）と呼ばれる第２ドメインを有し得、この上流アクチベーター配列は、もし 存在するならば、構造遺伝子の遠方にある。ＵＡＳは、調節された（誘導可能な ）発現が可能である。構成性発現は、ＵＡＳが存在しない場合に起こる。調節さ れた発現は正または負のいずれかであり得、それにより転写を促進するか、また は減退するかのいずれかであり得る。

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物であり、従って、代謝経路中の酵素を コードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、アル コールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）　（欧州特許公開第２８４０４４号）、エノ ラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアル デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナ ーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピル ビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）　（欧州特許公開第３２９２０３号）が挙げられる。

酵母ＰＩ（０５遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有用なプロモー ター配列を提供する（　Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 　、ｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８０：１　）。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた酵母プロモーターとして作用 する。例えば、ある酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの 転写活性化領域と連結して、合成ハイブリッドプロモーターを創り得る。このよ うなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結した ＡＤＨｇ節配列が挙げられる（米国特許第４．８７６、１９７号および第４．８ ８０．７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、皿、１４、Ｇ ＡＩ、■またはｍ遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられ 、これらは、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と結 合している（欧州特許公開第１６４５５６号）。さらに、酵母プロモーターは、 酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する、非酵母起源の 天然に存在するプロモーターを包含し得る。このようなプロモーターの例として は、特に、（Ｃｏｈｅｎら（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　？７：１０７８；　Ｈｅｎｊｋｏｆｆら（１９８１）　Ｎａｔｕ ｒｅ　２８３＋８３５；■ｏｆ　Ｉｅｎｂｅｒｇら（１９８１）廁■、Ｔｏ　ｉ ｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、９６：１１９ＨＨｏｌｌｅｎｂｅ ｒｇら（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｖｉｒｏ ｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏ　ｍｅｒｃ’ａ　１ｍ践区且匹（ＫＩＮ＞　Ｔｉ ＋ｇｍｉｓおよびＡ、　Ｐｕｈｌｅｒ編）の「酵母５ａｃｃｈａｒｏＢｃｅｓ　 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での細菌抗生物質耐性遺伝子の発現」；Ｍｅｒｃｅｒａ ｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１：１６３ＨＰａｎｔｈｆ ｅｒら（１９８０）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　′Ａ＋１０９；　）が挙げら れる。

ＤＮＡ分子は、酵母の細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子 と直接連結し得、その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は 常にメチオニンであり、そのメチオニンは、ＡＴＧ開始コドンによりコードされ る。所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロで臭化シアンとインキュベ ーシヨンすることによりタンパク質から切り放され得る。

融合タンパク質は、酵母発現系に対して、および哺乳動物、バキュロウィルスお よび細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内在性酵母タンパク質、 または他の安定タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード 配列の５°末端に融合する。発現すると、この構築物は２つのアミノ酸配列の融 合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ Ｄ）遺伝子は、外来遺伝子の５°末端で連結され得、そして酵母中で発現し得る 。２つのアミノ酸配列との連結部でのＤＮＡ配列は、切断可能な部位をコードし 得るか、またはし得ない。例えば、欧州特許公開第１９６０５６号を参照のこと 。別の例はユビキチン融合タンパク質である。

そのような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビ牛チンを切断するための プロセシング酵素（例えば、ユヒ牛チン特異的プロセシングブロテアーゼ）に対 する部位を好ましくは保持するユビキチン領域を用いて作られる。従って、この 方法により、天然外来タンパク質が単離され得る（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ３８１０２４０６６号を参照のこと）。

あるいは、外来タンパク質はまた、外来タンパク質を酵母中で分泌するリーダー 配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を創 り出すことにより細胞から増殖培地内へ分泌され得る。好ましくは、インビボま たはインビトロのいずれかで切り離され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝 子との間でコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメン トは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を命令する疎水性アミノ酸を含有する シグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された酵母タンパク質の遺伝子 、例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開第０１２８７３号；　ＪＰ Ｏ公告公報第６２．０９６，０８６号）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４．５ ８８．６８４号）から誘導され得る。あるいは、酵母中でも分泌する、インター フェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーが存在する（欧州特許公開第０ ６００５７号）。

好ましいクラスの分泌リーダーは、「プレ」シグナル配列および「プロ」領域の 両方を含む、酵母アルファ因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダーである。

用いられ得るアルファ因子フラグメントのタイプは、全長のプレープロアルファ 因子リーダー（約８３個のアミノ酸残基）、および切形型アルファ因子リーダー （通常、約２５〜約５０個のアミノ酸残基）を包含する（米国特許第４，５４６ ，０８３号および４．８７０．００８号；欧州特許公開第３２４２７４号）。分 泌を行うアルファ因子リーダーフラグメントを用いる付加的リーダーは、２番目 の酵母アルファ因子からのプロ領域ではな（て、１番目の酵母のプレ配列で作ら れるハイブリッドアルファ因子リーダーを含有する（例えば、ＰＣＴ公開公報Ｗ ０８９７０２４６３号を参照のこと）。

通常、酵母により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの３゛側に位置す る調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列の側面に位置する。

これらの配列は、ＤＮＡによりコードされる、ポリペプチドへ翻訳され得るｍＲ ＮＡの転写を命令する。転写終結配列、および酵母に認識される他の終結配列の 例としては、解糖酵素をコードする配列などかある。

通常、上記の成分は、プロモーター、リーダー（所望ならば）、関連したコード 配列、および転写終結配列を含み、発現構築物へ共に入れられる。発現構築物は 、しばしば、レプリコン、　（例えば、酵母または細菌のような宿主内で安定し た維持が可能な染色体外要素（例えば、プラスミド）内に維持される。レプリコ ンは、２つの複製系を有し得ることにより、例えば、発現のための酵母内で、そ してクローニングおよび増幅のための原核生物宿主内で維持され得る。そのよう な酵母−細菌シャトルベクターの例としては、ＹＥｐ２４　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ら（１９７９）　Ｇｅｎｅ　８：１７−２４）　、ｐｃ１／１　（Ｂｒａｋｅら （１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８１：４ ６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７　（Ｓｔｉｎｃｈｃ。

ｍｂら（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。１５８：１５７）が挙げられ る。さらに、レプリコンは、高または低コピー数のプラスミドのいずれで００、 そして通常は約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数のプラス ミドを含有する宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、そしてさらに好ましく は少なくとも約２０を有する。高または低コピー数のベクターを入れることが、 宿主上のベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択され得る。例え ば、Ｂｒａｋｅら上述を参照のこと。

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて酵母ゲノム内へ組み込まれ 得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込ませる酵母染色体と相同な 、少なくとも１つの配列を含有し、そして好ましくは、発現構築物の側面に位置 する２つの相同な配列を含有する。ベクター内の相同ＤＮＡと酵母染色体との間 の組換えにより、組み込みが生じると考えられる（　０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（ １９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、ＬＬＩ：２２８〜２４５） 。組み込みベクターは、ベクター内に含有される適切な相同配列を選択すること により、酵母内の特異的遺伝子座へ導かれ得る。０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら上述を 参照のこと。１つまたはそれ以上の発現構築物が組み込み得、あるいは産生ずる 組換えタンパク質のレベルに影響する（　Ｒｉｎｅら（１９８３）のＰｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：６７５０）。ベクター内 に含有される染色体配列は、ベクター内の１つのセグメント（ベクター全体の組 み込みが生じる）として存在し得るか、または染色体内の隣接するセグメントと 相同であり、ベクター内の発現構築物の側面に位置する２つのセグメント（発現 構築物のみの安定な組み込みが生じ得る）として存在し得るかのいずれかである 。

通常、染色体外および組み込み発現構造物は、形質転換された酵母の菌株の選択 を可能にする選択可能なマーカーを含有し得る。選択可能なマーカーは、酵母宿 主内で、例えば、酵母細胞内でツニカマイシンおよびＧ４１８に対して耐性をそ れぞれ与える、口、肋、［、■■、および１１ならびにＧ４１８耐性遺伝子）内 で発現され得る生合成遺伝子を含有し得る。さらに、適切な選択可能なマーカー はまた、金属のような毒性化合物が存在しても増殖する能力を有する酵母を提供 し得る。例えば、ＣＵＰＩが存在すると、酵母は銅イオンが存在しても増殖し得 る（Ｂｕｔｔら（１９ｇ？）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　、　Ｒｅｖ、５１：３５１） 。

あるいは、上記成分のあるものは、形質転換ベクター内に共に入れられ得る。形 質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコン内で維持されるか、または 組込みベクターへと開発される、選択可能なマーカーを含有し得る。

発現および形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターの いずれかであり、多くの酵母への形質転換に対して開発された。例えば、発現ベ クターは、特に以下の酵母に対して開発された：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ ａｎｓ　（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）　Ｍ　１．　Ｃｅｌ　、　Ｂ’ｏ１．旦： １４２）、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔａｓｅ　（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ 、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　、　２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ 　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏ　、１３２：３４５９：　Ｒ。

ｇｇ６ｎｋａ＋ｅｐら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２： ３０２）、Ｋ　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　（Ｄａｓら（１ ９８４）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ ｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）　ム 」■お旦１１工ｌｊｌニア３７；　Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）　 ＦＪＪｇ工鯨励」且■ＪＪ　：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏ ｎｄｉｉ　（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、ａｓｉｃ　ｅ　ｏｂｉｏｌ、２５ ：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）　 Ｍｏ上、５ｄ１、　Ｂｉｏｌ、　５：３３７６；米国特許第４．８３７．１４８ 号および第４．９２９．５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ　（旧ｎｎｅｎら（１９７８）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：１９２９ＨＩｔｏら（１９８３） ムー６＝　１５３：１６３）、５ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ＋ｅｙｃｅｓ　ｐ ｏ＋ｘｂｅ　（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９１１１）　Ｎａｔｕｒｅ　３ ００ゴ０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　（Ｄａｖｉｄ ｏｗら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、ｌｊ；ｊ：３８０４７１；　Ｇａ １ｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）　色匡ムーシ狙克し１０：４９）　。

外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野では周知であり、そして通 常は、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理した無傷の酵母細胞の形 質変換のいずれかを含有する。形質転換の手法は、通常、形質転換される酵母の 種によりさまざまである。例えば、（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１、Ｂｉｏｌ、ｉ：１４２；　Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａｓ’ｃ 　Ｍ　ｃｒｏｂ’ｏ　、２５：１４１；　Ｃａｎｄｉｄａ）　：　（Ｇｌｅｅｓ ｏｎら（１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、１ｃｒｏｂｉｏｌ　１３２：３４５９：　Ｒ ｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）’　Ｍｏ１．　Ｇｅ　、Ｇ　ｎｅ　、ハ■： ３０２；　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）　；　（Ｄａｓら（１９８４）　Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅ　’ｏ１．１ｊＪｌ：１１６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｅｏｕｒｔら（１９ ８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｌｉ４：１１６５；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒ ｇら（１９９０）Ｂｉｏ　Ｔｅｅｈ　ｏｌｏ　８：１３５：　Ｋｌｕｙｖｅｒｏ ｍｙｃｅｓ）　；　（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、　ｉ：３３７６：　Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、ＢａｓｉｃＭｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　２５：１４１；米国特許第４．８３７．１４８号および４．９２ ９．５５５号；　Ｐｊｃｈｉａ）　；　（Ｈ４ｎｎｅｎら（１９７８）　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

出７５：１９２９；　Ｉｔｏら（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３ ：１６３；　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　；　（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓ ｅ（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０６；　５ｃｈｊｚｏｓａｃｃｈａ ｒｏｉｙｃｅｓ）　；　（Ｄａｖｉｄｏｖら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅ ｔ、ｌｉ：３９；　Ｇａ１ｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）　Ｃｕｔ　、Ｇｅｎｅ ｔ、１０：４９；　Ｙａｒｒｏｗｉａ）を参照のこと。

実施例１−無毒化ＬＴ 制限酵素ＳｍａｌおよびＥｃｏ旧で消化することにより、ＬＴの遺伝子のフラグ メントをプラスミドＩＪＤ２９９　（Ｄａｌｌａｓ　Ｗ、Ｓ、、Ｇ１１ｌＤ、Ｍ 、およびＰａｌｋｏｗ　Ｓ、、　１９７９．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　 ｕ！、　８５０−８５８）から抽出し、そしてＤＮＡの一本鎖を生成するのに適 切なベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ内で再クローン化した（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、のｒＭｏ ｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ） 　ａ このようにして得られたクローンによりＢＷ３１３細胞を形質転換し、そして１ μｇ／＋　１のウリジンを添加したルリアブロス（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）か らなる培養培地中で、その細胞を１４時間増殖させた。

一連の合成オリゴヌクレオチド（下記の表１に示す）は、突然変異、または天然 塩基の代わりに所望の塩基、および、天然塩基と同一である、同様の突然変異の １０塩基上流および１０塩基下流の配列を含有し、まず最初に化学的に合成され 、次いでその１．５ｐｍｏｌを３７℃で、キナーゼ５単位を用いてリン酸化した 。

１００ｄのＥＤＴＡ溶液で反応を停止させた後、７０℃で５分間加熱し、そして 水中で約１時間ゆっくりと冷却することにより、そのオリゴヌクレオチドをＬＴ 遺伝子を含有する一本鎖にアニールした。

その段階で、この冷溶液（２５μｌ）に遊離ヌクレオチド、酵素ＤＮＡリガーゼ および酵素ＤＮＡポリメラーゼからなる溶液を加えて、最終容量が１００μｌに なるようにした。

このようにして得られた溶液を、水中で５分間、周囲温度で５分間、そして３７ ℃で２時間保った。

通常の技術に従って、適切なＥ、　ｃｏｌｔの細胞を反応混合物で形質転換しく 　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、およびＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ 、のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ）、そして得られたクローンの配列決定により部位特異的変異誘発を検 討した。

種々の突然変異体を含有するＳ＋＊ａｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、プラスミ ドＥＷＤ２９９中の元のＳ＋５ａｌ−ＥｃｏＲＩ挿入片に対して置換した。

次いで、突然変異したトキシンをコードする株を３７°Ｃで１２時間、１０ｍ１ のルリアブロス中で増殖さセタ。

培養物を遠心分離し、そして細胞を含有する沈澱物を、２５％シコ糖およびｐＨ ８の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液を含有する溶液３００ａ＋１中に再懸濁させ、そ してこの混合物を周囲温度で１時間、ｌｍｇ／ｍｌのポリミキシン（ｐｏ　ｌｙ ｍ　ｉｘ　ｉｎ　）Ｂ溶液で処理した。

周辺細胞質の上清液中にトキソイドが存在することが、ウェスタンプロットより 実証され、そしてその毒性を、Ｙ１細胞内の形態変化の誘発、または誘発の欠如 により評価した（表１を参照のこと）。

Ｙ１細胞は、ＣＴまたはＬＴを含有する溶液で処理すると、さらに著しく丸くな る副腎腫瘍上皮細胞である（　Ｙａｓａｍｕｒｅ　Ｙ、、Ｂｕｏｎａｓｓｉｓｉ 　Ｖ、および５ａｔｏ　Ｇ、の［動物細胞培養における分化機能のクローン解析 Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　１９６６、ｌｊ、　５２９−５３５）。ＣＴお よびＬＴの毒性は、この形態トランジシヨンと相関している。

周辺細胞質の上清液を、ＦＩＯ培地、ウマ血清１．５％、できるだけ低濃度のグ ルタミンおよびゲンタマイシンの溶液で希釈し、そしてＹ１細胞（２５００００ 個細胞／ｍｌ）を、ＣＯ２雰囲気下３７℃テ４８時間、上記で得られた溶液でイ ンキュベートする。細胞の形態を評価する。

すべての場合において、完全トキソイドの正確な集合体により、およびトキソイ ドと野生型ＬＴに対する抗体との交差反応により、免疫原性が示された。

結果を以下の表Ｉに示す。

この表（および以下の表■）では、毒性の記号は以下を意味する： ＋＋＋　１　：　２０００に希釈後の毒性あり（野生型の毒性）＋＋　１：２５ ０に希釈までは毒性あり＋　１：６４に希釈までは毒性あり 希釈しなくても毒性なし 表Ｉ セリンの２種の突然変異体（５ｅｔ−１１４−Ｇｌｕ：　４７７−ＧＧＡＧＧＴ ＧＡＡＧＣＧＴＴＡＧＧ−４９４および５ｅｔ−１１４−Ｌｙｓ：４７７−ＧＧ ＡＧＧＴＴＡＡＡＧＣＧＴＴＡＧＧ−４９４）もまた実質的に毒性の減少を示し た。

（以下余白） 比」【匹 （ＮＡとは、「集合しない」ことを意味し、すなわち、ホロトキシン（ｈｏｌｏ ｔｏｘｉｎ）ＡＢｓは全く形成されない。）２−　ＣＴ トキシンＣＴの遺伝子の場合における手法は、上記と同様である。

ＣＴの遺伝子を含有するフラグメントを、プラスミドｐＣＴ３２２からポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により増幅させた。ＣＴ遺伝子の代わりとなり、か つ同等の遺伝子源（ｓｏｕｒｃｅ）はブラスミ　ドｐＪＭ１７である　（Ｐｅａ ｒｓｏｎら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、７９．　（１９８２）、２９７６−２９８０） 。

以下の２種の合成プライマーを用いた：１）ＧＧＣＡＧＡｅ鈷ＣＣＴＣＣＴＧＡ ＴＧ思Ｔ思２　）　ＴＧＡＡＧＴＴＴｃｃｃＧ品区＝ＣＴｒＡＡＴＴ’ｒＧＣＣ ＡＴＡｃＴＭＴＴＧｃＧＧＣＡＡＴＣｃＣＡＴそれぞれ、Ｘｂａ　１部位および 人工的に作った旧ｎｄｌ１１部位（下線で示す）を含有する。

得られた増幅フラグメント、Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄｌｌ＋は１０７４塩基対の長さ を有し、２つのサブユニットであるＡおよびＢのコドンを含有するが、Ａサブユ ニットのリーダーペプチドをコードする配列を含有しない。このフラグメントを Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉｓベクター内で再クローン化させ、そしてＬＴに対し て上記の手法ζこ従って処理することにより、部位特異的変異誘発を起こす。

表■ 之絞且 以下の突然変異体もまた、毒性をなくすことが証明された：　１０７−Ａｓｎ（ ＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡ）、Ｇｌｕ−１１０−Ｓｅｔ（Ｔ ＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴ）、Ｇｌｕ−１１２−Ａｌａ（ＣＡ ＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧ）および５ｅｔ−１１４−Ｇｌ　ｕ　 （ＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＧＧＴ）。

本発明は実施例のみによって上記のよう１こ説明され、そして詳細な改変が、本 発明の範囲および意図内で行われ得ることが理解される。

Ｌ−−−１−−−一−５Ｆ−Ａ−ＥＧＧＭＱ−−−Ｄ−−ＧＤＬＦ−Ｇ−ＴＶ− −Ｎ−−１５８−−Ｑ−−−−−５ＮＦＰ−−−−Ｍ−−５ＴＦ−−ＥＱ−ＶＰ ＮＮＫＥＦＫ−ＧＶ−工　１９８Ｆｉｇｕｒｅ　１ ＬＴ　ＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＴＡＴＡＣＣＧＴＯＣＴＧＡαｒＣＴＡＧＡ ＣＣＣＣＨＡＧＡＴＧｋＡＡ’Ｘ入り五〇〇ＴＴ’ｒＣＣＧf Ｎ　Ｇ　Ｄ　ＲＬ　Ｙ　ＲＡ　Ｄ　Ｓ　ＲＰ　Ｐ　Ｄ　Ｅ　Ｘ　Ｋ　ＲＦ　Ｒ２ ＯＮ　Ｄ　Ｄ　Ｋ　Ｌ　Ｙ　ＲＡ　Ｄ　Ｓ　ＲＰ　Ｐ　Ｄ　Ｅ　Ｉ　Ｋ　Ｑ　Ｓ 　Ｇ　２０Ｌ　Ｙ　Ｄ　ＨＡ　ＲＧ　Ｔ　Ｑ　Ｔ　Ｇ　Ｆ　Ｖ　ＲＹ　Ｄ　Ｄ　 Ｇ　Ｙ　Ｖ　５９＄　？　Ｓ　Ｌ　Ｓ　Ｌ　ＲＳ　Ａ　１１　Ｌ　Ａ　Ｇ　Ｑ　 Ｙ　Ｘ　Ｌ　Ｓ　ＯＹ　７９８　Ｔ　Ｓ　Ｘ　８　Ｌ　ＲＩＩ　Ａ　ＨＬ　Ｖ　 Ｇ　Ｑ　Ｔ　！　Ｌ　Ｓ　Ｇ　Ｈ１１０Ｃ？　ＴＣ（ＪＣＣＴＣＡＡ？ＴＡＯＴ ＴＴＧＡＧＡＡＯＴＯＣ（：ＣＡ−ＡＯＴＯＧＧＴａμＡＣ’ｆＡＴＡＴＩＦＧ ＴＣＴＧＯＴＣＡＴＬＴ　ＴＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴ入ＴＣＧ？’ｒＡＴ ＡＧ口し１０．１．９０．入Ａ？Ａ？０ｆｆｌＡＡτＧτＴ入ＡτＧＡＴＧＴＡ Ｓ　Ｌ　Ｔ　Ｘ　Ｙ　Ｘ　Ｖ　Ｘ　Ａ　Ｎ　Ｍ　Ｆ　Ｎ　Ｖ　Ｎ　Ｄ　Ｖ　９６ Ｓ　？　Ｙ　Ｙ　Ｘ　Ｙ　Ｖ　Ｘ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｐ　Ｎ　Ｍ　Ｆ　Ｎ　Ｖ　Ｎ　 Ｄ　Ｖ　Ｚｏ。

Ｘ　Ｓ　Ｖ　Ｙ　Ｓ　Ｐ　Ｂ　Ｐ　Ｙ　ｌ！　Ｑ　Ｅ　Ｖ　Ｓ　Ａ　Ｌ　Ｇ　Ｇ 　Ｘ　Ｐ　１１６Ｘ、Ｇ　Ａ　Ｙ　Ｓ　Ｐ　１１　Ｐ　Ｄ　Ｅ　Ｑ　Ｅ　Ｖ　Ｓ 　Ａ　Ｌ　Ｇ　ＯＸ　Ｐ　１２０ＣＴ　ＴＴＡＧＯＧＧＣＡＴＡＣＡＧＴＣＣＴ ＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＩＣＴＧＣＴＴＴＡＧＧＺＧＧＧ ＡＴｒＣＣＡＦｉｇｕｒｅ　２ａ Ｙ　５　Ｑ　Ｘ　Ｙ　Ｇ　Ｗ　Ｙ　ＲＶ　Ｎ　Ｆ　Ｇ　Ｖ　Ｘ　Ｄ　ｌ！　ＲＬ 　Ｍ　！３６ＹＳＱ！ＹＧ　％４　Ｙ　ＲＶ　ＩＩ　Ｆ　Ｇ　Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｅ　 Ｑ　Ｌ　ＩＩ　１４０ＲＮ　ＲＥ　Ｙ　ＲＤ　ＲＹ　Ｙ　ＲＮ　Ｌ　Ｎ　Ｘ　Ａ 　Ｐ　Ａ　冨　Ｄ　１５６ＲＮ　ＲＧ　Ｙ　ＲＤ　ＲＹ　Ｙ　ＩＩ　Ｎ　Ｌ　Ｄ 　Ｘ　ｋ　Ｐ　Ａ　Ａ　Ｄ　１６０ＧＹＲＬＡＧＦＰＰＤＩＩＱＪＬ　賀　Ｒｌ ＥＰ　賀　ＩＩ〕６Ｇ　Ｙ　Ｇ　Ｌ　Ａ　Ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｐ　Ｅ　ＨＲＡ　Ｉｆ　 Ｒ！　Ｅ　Ｐ　！ｆ　Ｘ　１８０ＨＢ　Ａ　Ｐ　Ｑ　Ｇ　ＣＧ　Ｄ　Ｓ　Ｓ　Ｒ ？　！　Ｔ　Ｇ　Ｄ　Ｔ　ＣＮ　１９６１１ｍ１ＡＰＰＧｌ：ＧＷ　＾　ＰＲｌ ｉＢＸＳＮ　！　ＣＤ　２００ＥＥＴＱＮＬＳ　丁　Ｘ　Ｙ　Ｌ　ＲＥ　Ｙ　Ｑ 　！ｌ　Ｋ　Ｖ　Ｋ　Ｒ２１６Ｅ　Ｋ　？　Ｑ　Ｓ　Ｌ　Ｇ　Ｖ　Ｋ　Ｆ　Ｌ　 Ｄ　Ｅ　Ｙ　Ｑ　Ｓ　Ｋ　Ｖ　Ｋ　Ｒ２２０ＱＸＦＳＤＹＱＳＥＶＤＸＹＮＲＸ ＲＤＥＬ　脅Ｑ！ＦＳＯＹＱＳＤＩＤＴＨＮＲＸＫＤＥＬ　脅Ｆｉｇｕｒａ　２ ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　３ １ｓｌ、、、１１ｗｍ１．１ｃｍ５ｅＮｏ　ＰＣＴＩＥＰ９２１０３”６フロン トページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２ 　Ｃ９２８２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＳ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。

、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳＩ （７２）発明者　ホル、ウィム アメリカ合衆国　ワシントン　９８１５５．シアトル、フィフティーセブンス　 アベニュー　エヌイー　１８３３２

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．コレラトキシン（ＣＴ−Ａ）のサブユニットＡまたはそのフラグメントのア ミノ酸配列、あるいは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ非耐熱性トキシン（ ＬＴ−Ａ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含有する免疫原性無毒化タ ンパク質であって、Ｖａｌ−５３、Ｓｅｒ−６３、Ｖａｌ−９７、Ｔｙｒ−１０ ４、またはＰｒｏ−１０６のいずれかの位置またはこれらに対応する位置にある 、１つまたはそれより多いアミノ酸が他のアミノ酸と置換されている、免疫原性 無毒化タンパク質。
2. ２．請求項１に記載の免疫原性無毒化タンパク質であって、Ａｒｇ−７、Ａｓｐ −９、Ａｒｇ−１１、Ｈｉｓ−４４、Ａｒｇ−５４、Ｓｅｒ−６１、Ｈｉｓ−７ ０、Ｈｉｓ−１０７、Ｇｌｕ−１１０、Ｇｌｕ−１１２、Ｓｅｒ−１１４、Ｔｒ ｐ−１２７、Ａｒｇ−１４６、またはＡｒｇ−１９２のいずれかの位置またはこ れらに対応する位置にある、１つまたはそれより多いアミノ酸がさらに置換され ている、免疫原性無毒化タンパク質。
3. ３．１つまたはそれより多い、次のアミノ酸置換：Ｖａｌ−５３−Ａｓｐ、Ｖａ １−５３−Ｇｌｕ、Ｖａ１−５３−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ｖａ１−９ ７−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−９７−Ｔｙｒ、Ｈｉｓ−１０７−ＧＩｕ、Ｔｙｒ−１０４ −Ｌｙｓ、Ｔｙｒ−１０４−Ａｓｐ、Ｔｙｒ−１０４−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−１０６ −Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−１１４−Ｇｌｕ、Ｓｅｒ−１１４−Ｌｙｓを含有する、請求 項１または２に記載の免疫原性無毒化タンパク質。
4. ４．前記請求項のいずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク質および薬学的 に受容可能なキャリアを含有するワクチンに用いられる、免疫原性組成物。
5. ５．請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク質および薬 学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチン組成物。
6. ６．アジュバントをさらに含有する、請求項５に記載のワクチン組成物。
7. ７．請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク質をコード する、ＤＮＡ配列。
8. ８．請求項７に記載のＤＮＡを輸送する、ベクター。
9. ９．請求項８に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞系。
10. １０．請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、請求項１から３の いずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク質の製造方法。
11. １１．ＣＴ−ＡまたはＬＴ−ＡをコードするＤＮＡあるいはそれらのフラグメン トを部位特異的突然変異誘発に供する工程を包含する、請求項７に記載のＤＮＡ の製造方法。
12. １２．免疫学的に有効な量の請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性無 毒化タンパク質を投与する工程を包含する、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅま たはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの毒素原性株に対するワクチン接種を哺 乳類にする方法。
13. １３．請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク質を薬学 的に受容可能なキャリアと合わせる工程を包含する、請求項５に記載のワクチン の調製方法。
14. １４．請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク質をアジ ュバントと合わせる工程を包含する、請求項６に記載のワクチンの調製方法。