JP2005502591A - 核酸粘膜免疫 - Google Patents

Abstract

例えば、複製欠損遺伝子送達ビヒクル（特に、複製欠損アルファウイルスベクターおよび粒子）を使用する抗原の粘膜送達が記載される。粘膜アジュバントおよびＨＩＶ由来の１以上の抗原を含む組成物もまた記載される。粘膜免疫レジメン後に粘膜免疫応答、局所的免疫応答および／または全身免疫応答を誘導する際のこれらの遺伝子送達ビヒクルの使用もまた提供される。本発明は、抗原に対して免疫応答を生成する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、被験体の標的細胞に、少なくとも１つの抗原（またはその改変形態）をコードするポリヌクレオチドを含む複製欠損遺伝子送達ビヒクル（またはベクター）を、粘膜投与する工程を包含し、ここで、この抗原（またはその改変形態）は、その被験体中で免疫応答を刺激し得る。

Description

【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的に、粘膜免疫に関し、例えば、遺伝子送達系を用いた粘膜免疫に関し、特に、複製欠損ベクターおよび／または組換えアルファウイルスのベクターおよび粒子の粘膜送達に関する。さらに、種々の経路の粘膜免疫の後に潜在的な粘膜局所免疫応答および粘膜全身免疫応答を誘導するためのこれらの系の使用もまた、記載される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の病原に対して粘膜免疫を引き起こすワクチンの開発が望ましい。多くの疾患を引き起こす病原が、粘膜表面を介して伝達される。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医療が直面している最も大きな健康の脅威のうちの１つと認識され、そして世界中でのＨＩＶの性的伝達が、ＡＩＤＳの主要な原因である。今までのところ、ＡＩＤＳに対する治療もワクチンも存在しない。
【０００３】
１９８３年〜１９８４年に、３つのグループが、ＡＩＤＳの疑わしい病因因子を独立して同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，Ｅｓｓｅｘ ＆ Ｇｒｏｓｓ，編，１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２を参照のこと。これらの単離物は、リンパ節症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞リンパ親和性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）とさまざまに呼ばれた。これらの単離物全てが、同じウイルスの株であり、そして後に、総称してヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と命名された。関連するＡＩＤＳ原因ウイルスの単離によって、本来ＨＩＶと呼ばれたこれらの株は、現在、ＨＩＶ−１と称され、そして関連するウイルスは、ＨＩＶ−２と称される。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：６９１−６９５を参照のこと。従って、世界中でＨＩＶ感染を処置および／または予防するために適切な組成物および方法に対する必要性が、当該分野に存在する。
【０００４】
ＨＩＶウイルスに関する大量の情報が集められ、そしてワクチン開発のためのいくつかの標的（ＨＩＶによってコードされるｅｎｖ遺伝子産物、Ｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｔａｔ遺伝子産物を含む）が、調べられている。ＨＩＶをコードするネイティブなポリヌクレオチドおよびＨＩＶをコードする合成のポリヌクレオチドを用いた免疫もまた、例えば、共有に係るＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２４５およびその中に引用される参考文献中に記載されるように、記載されている。さらに、ＨＩＶをコードするポリヌクレオチドは、ワクチンを同定するための種々の試みにおいて投与されている。（例えば、Ｂａｇａｒａｚｚｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：１３５１−１３５５；Ｗａｎｇら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５：８２１−８２５を参照のこと）。ＨＩＶのマトリックス／キャプシドドメインを保有する複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスベクターは、動物に皮下投与されて、ＣＴＬ応答を誘発し得た（Ｃａｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０３１−３０３８）。さらに、シンドビスウイルス由来のアルファウイルスベクターもまた、動物においてＨＩＶ ｇａｇ特異的応答を誘発することが示された（Ｇａｒｄｎｅｒら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８４９−１１８５７）。同様に、ＨＩＶペプチドはまた、動物被験体に投与されている（Ｓｔａａｔｓら（１９９７）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １３：９４５−９５２；Ｂｅｌｙａｋｏｖ（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：２０７２）。
【０００５】
組換えアルファウイルスベクターおよびアルファウイルスに基づく層状真核生物ベクター系もまた、記載されている。（例えば、米国特許第６，０１５，６８６号；同第６，０１５，６９４号；同第５，８４３，７２３号を参照のこと）。Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８は、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型の糖タンパク質Ｂを発現するｐＳＩＮベクターを用いた単独の筋内免疫が、広いスペクトルの免疫応答（ウイルス特異的抗体、細胞傷害性Ｔ細胞、および２つの異なるマウスモデルにおける致死的ウイルスチャレンジからの防御）を誘導したことを報告した。Ｐｏｌｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：４５９８−４６０３は、ｐＳＩＮプラスミドベクターではなくＳＩＮレプリコンベクター粒子を用いた免疫後の、ＨＳＶチャレンジモデルにおける類似の防御を報告した。Ｔｓｕｊｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６９０−６９７は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質またはインフルエンザウイルスの核タンパク質の、Ｉ型主要組織適合遺伝子複合体の制限された９マーエピトープを発現する組換えＳＩＮの、マウスでの皮下投与が、大きなエピトープ特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞応答を誘導し、そしてマラリアもしくはインフルエンザＡウイルスでの感染に対する高い程度の防御を提供したことを、報告した。
【０００６】
しかし、これらの研究および他の研究にもかかわらず、粘膜チャレンジに対して防御し得る粘膜免疫ストラテジーのための複製欠損遺伝子送達ビヒクルの有用性は、十分には規定されていない。従って、種々の性的に伝達される病原の処置および予防に対する組成物および方法に対する必要性は残ったままである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本明細書中に開示されるのは、種々の適用（例えば、粘膜免疫を含む）における使用に適した遺伝子送達系（例えば、組換えアルファウイルスベクター）であり、そしてさらに、本明細書中の開示は、他の関連する利点を提供する。簡単に述べると、本発明は、１つ以上の性的に伝達される疾患病原と関連する抗原を発現するベクター構築物および粒子、ならびに、特に、防御粘膜免疫レジメンにおいて、これらを作製および利用する方法を含む。好ましくは、ベクターは、例えば、複製欠損アルファウイルスベクター（例えば、シンドビス由来の複製欠損アルファウイルスベクター）である。本発明者らは、免疫後チャレンジに対する抗原特異的防御が、この抗原を発現する遺伝子送達ビヒクル（例えば、アルファウイルスベクター）の粘膜投与後に誘導され得ることを実証した。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、抗原に対して免疫応答を生成する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、被験体の標的細胞に、少なくとも１つの抗原（またはその改変形態）をコードするポリヌクレオチドを含む複製欠損遺伝子送達ビヒクル（またはベクター）を、粘膜投与する工程を包含し、ここで、この抗原（またはその改変形態）は、その被験体中で免疫応答を刺激し得る。特定の実施形態において、標的細胞は、粘膜局所組織および／または粘膜全身組織中にある。粘膜投与は、例えば、鼻腔内投与、経口投与、直腸内投与、および／または膣内投与であり得る。好ましくは、性的に伝達される病原に対して、粘膜投与は、直腸経路によるかまたは膣内経路による。特定の実施形態において、少なくとも１つの抗原が、例えば、性的に伝達される病原（例えば、細菌病原（例えば、淋病、クラミジア、および梅毒）またはウイルス病原（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶおよびＨＰＶ））に由来する。特定の実施形態において、抗原は、ＨＬＡクラスＩ−制限免疫応答を誘発し、そして任意に、ＨＬＡクラスＩＩ−制限免疫応答もまた誘発する。
【０００９】
他の局面において、この方法は、免疫増強サイトカイン、リンホカイン、ケモカインなどをコードする遺伝子の送達を含む。これらの遺伝子は、目的の抗原を保有する同じ遺伝子送達ビヒクル中（例えば、アルファウイルスレプリコン粒子）に挿入され得るか、または１つ以上の異なる遺伝子送達ビヒクル上に保有され得る。特定の実施形態において、抗原は、ＨＬＡクラスＩ−制限免疫応答を誘発し、そして任意に、ＨＬＡクラスＩＩ−制限免疫応答もまた誘発する。
【００１０】
遺伝子送達ビヒクル（またはベクター）は、例えば、非ウイルスベクター；；微粒子キャリア（例えば、そのポリヌクレオチドでコーティングされ、そして遺伝子銃を用いて送達される、金粒子またはタングステン粒子）；リポソーム調製物；ウイルスベクター；レトロウイルスベクター；またはアルファウイルス由来のベクターであり得る。特定の局面において、例えば、シンドビスウイルス由来のベクター、セムリキ森林ウイルス由来のベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルス由来のベクター、ロス川ウイルス由来のベクターまたは多数の異なるアルファウイルスから誘導されたベクターキメラ（例えば、ＳＩＮ−ＶＥＥキメラ）のような、アルファウイルス由来のベクターが、使用される。本明細書中に記載される任意の遺伝子送達ベクター（例えば、アルファウイルスベクター）は、例えば、樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達され得る。特定の実施形態において、被験体および／または細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）である。本明細書中に記載される任意の方法において、標的細胞は、インビボで感染され得る。さらに、本明細書中に記載される任意の方法において、標的細胞に投与する工程の前または後に、クラスＩ ＭＨＣタンパク質もしくはクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質のいずれか、またはこれらの組み合わせをコードする核酸分子、あるいはＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３またはこれらのアナログからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸分子がまた、標的細胞に投与され得る。さらに、粘膜ワクチン接種のための上記の遺伝子送達ビヒクルは、１つ以上のさらなる免疫原性組成物（遺伝子送達ビヒクル、ポリペプチド、タンパク質、ケモカイン、サイトカインなど）と組合わせて使用され得、ここで、１つ以上のさらなる組成物が、粘膜経路または非粘膜経路によって送達される。
【００１１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してより明確になる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する種々の参考文献が、以下に記載される。これらの参考文献は、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内の従来の化学方法、生化学方法、分子生物学方法、免疫学方法および薬理学方法を利用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）Ｆｉｅｌｄｓら（編）Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。
【００１３】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、（上記であるか下記であるかにかかわらず）本明細書中によって参考としてその全体が援用される。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の参照を含む。従って、例えば、「抗原（単数形）」に対する言及は、２つ以上のこのような因子の混合物を含む。
【００１５】
本発明を示す前に、本明細書の後ろに使用される特定の用語の定義を最初に示すことが、本発明の理解に役立ち得る。
【００１６】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞へ目的のＤＮＡを確実に挿入するための方法または系をいう。このような方法は、組込まれていない移入ＤＮＡの一過性発現、染色体外複製および移入されたレプリコンの発現（例えば、エピソーム）、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された遺伝子材料の組み込みを引き起こし得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、およびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫のために使用する場合、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと称され得る。
【００１７】
用語「複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）」および「複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｒｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」は、標的細胞に投与された後にさらなる感染性のウイルス粒子を作製も増殖もしない遺伝子送達ビヒクル（例えば、ウイルスベクター）をいうために、交換可能に使用される。当業者に明らかであるように、投与されるベクターまたは粒子中に含まれるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）は、増殖または複製し得るが、新しい子孫のベクターまたはウイルス粒子は形成されず、導入後に細胞から細胞へと広がらない。
【００１８】
「アルファウイルスベクター構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。例えば、米国特許第６，０１５，６９５号；米国特許第６，０１５，６８６号；米国特許第５，８４２，７２３号、およびＷＯ９７／３８０８７に記載されるように、ベクター構築物は、アルファウイルスの転写を開始し得る５’配列、ならびに発現された場合に、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列（例えば、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４）、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含むべきである。さらに、ベクター構築物は、ウイルス連結プロモーター領域を含むべきであり、この領域は、特定の実施形態において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を妨害するか、増大するかまたは低下させるために、改変され得る。このベクターはまた、生存可能なウイルスベクター粒子の産生を可能にするのに十分なサイズの核酸分子、インビトロもしくはインビボにおいてｃＤＮＡからウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、ならびに１つ以上の制限部位、複数の抗原を発現するための手段（例えば、ＩＲＥＳエレメント）およびポリアデニル化配列を含み得る。アルファウイルスベクター構築物を構成する任意の配列は、１つ以上のアルファウイルスから誘導され得る。ＲＮＡ分子の場合、アルファウイルスベクター構築物もまた、「ＲＮＡレプリコン」と称され得る。
【００１９】
「構造タンパク質発現カセット」は、アルファウイルスの構造タンパク質を発現し得る、組換え産生される分子をいう。この発現カセットは、プロモーターおよびアルファウイルス構造タンパク質をコードする配列を含む必要がある。必要に応じて、この発現カセットは、転写終結部位、スプライス認識部位、およびポリアデニル化付加部位を含み得る。好ましいプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーターおよびアデノウイルスＶＡ１ＲＮＡプロモーター、ならびにアルファウイルスサブゲノム連結領域プロモーターが挙げられる。さらに、発現カセットは、Ｎｅｏ、ＳＶ２ Ｎｅｏ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノールおよびＤＨＦＲのような選択マーカーを含み得る。
【００２０】
「組換えアルファウイルス粒子」は、アルファウイルスベクター構築物を含むキャプシドをいう。好ましくは、アルファウイルスキャプシドは、ウイルスコードタンパク質（例えば、エンベロープタンパク質）が埋め込まれる脂質二重層（例えば、細胞膜）内に含まれる。本発明のアルファウイルスベクター構築物を含む種々のベクターが、アルファウイルス粒子内に含まれ得る。さらに、組換えアルファウイルス粒子は、多数の異なるアルファウイルス由来のエレメントを含むキメラであり得る（例えば、ＶＥＥ由来のキャプシドタンパク質および／またはエンベロープタンパク質を有する、ＳＩＮ由来のＲＮＡベクター構築物）（共有に係る米国特許第６，３２９，２０１号もまた参照のこと）。
【００２１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして最少の長さの産物に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、この定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義によって含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」は、そのタンパク質が所望の活性を維持する限りは、ネイティブな配列に対する欠失、付加および置換（一般的に、天然において保存的である）などの改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、意図的であり得るか（例えば、部位指向型変異誘発を介して）、または偶発的であり得る（例えば、タンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介して）。
【００２２】
「抗原」は、体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答を生成するように宿主の免疫系を刺激する１つ以上のエピトープ（線状、コンフォメーショナルのいずれか、または両方）を含む分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも５アミノ酸を含むが、これは３〜４アミノ酸ほど小さいものでもあり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７アミノ酸と１５アミノ酸との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５アミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、その抗原が天然で会合する生物全体から、隔離または分離されている抗原）、および殺傷されたか、弱毒化されたかまたは不活性化された、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはそのフラグメント、および合成ペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）（これは、抗原または抗原性決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中に使用されるような抗原の定義の下に捕えられる。同様に、インビボにおいて（例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用において）抗原または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書において抗原の定義内に含まれる。
【００２３】
本発明の目的に関して、抗原は、以下により完全に記載されるように、任意のいくつかの既知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌から誘導され得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図する。好ましくは、抗原は、性的に伝達される病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）から誘導される。さらに、本発明の目的に関して、「抗原」は、本明細書中に規定されるように、そのタンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限りは、ネイティブな配列に対する欠失、付加および置換（一般的に、天然において保存的である）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、意図的であり得るか（例えば、部位指向型変異誘発を介して）、または偶発的であり得る（例えば、抗原を産生する宿主の変異を介して）。
【００２４】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的に関して、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／もしくは他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と関連して提示され、そして細胞の表面上に発現されるペプチド抗原に対して、特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物で感染された細胞の溶解を、誘導および促進するように補助するように作用する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、その表面上にＭＨＣ分子と関連するペプチド抗原を提示する細胞に対して、非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激し、そしてその非特異的なエフェクター細胞の活性に焦点をあわせるように補助する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球によって産生される他のこのような分子の産生をいい、これには、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞由来の分子が挙げられる。さらに、ケモカイン応答は、投与された抗原に応答して種々の白血球または内皮細胞によって誘導され得る。
【００２５】
細胞性免疫応答を惹起する組成物またはワクチンは、その細胞表面でのＭＨＣ分子と会合した抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するために役立ち得る。その細胞媒介性免疫応答は、その表面に抗原を提示する細胞にかまたはその細胞付近に対する。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が、免疫された宿主のさらなる防御を可能にするために生成され得る。
【００２６】
特定の抗原が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力は、多数のアッセイにより決定され得、そのようなアッセイは、例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、または感作された被験体におけるその抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイである。そのようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法としては、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による）、あるいはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）：１３６７−１３７１，１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７により概説される）が、挙げられる。
【００２７】
従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの生成および／またはヘルパーＴ細胞の生成もしくは活性化を、刺激する応答であり得る。ケモカインおよび／またはサイトカインの生成もまた、刺激され得る。目的の抗原は、抗体媒介性免疫応答も惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの１つ以上を包含し得る：Ｂ細胞による抗体の生成；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原に特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、もしくはヘルパーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体−補体依存性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対して防御を提供するように作用し得る。そのような応答は、当該分野で周知である、標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して、決定され得る。
【００２８】
「免疫学的組成物」は、被験体へのその組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発生を被験体において生じる、抗原性分子を含む組成物である。その免疫原性組成物は、レシピエント被験体中に直接（例えば、注射によって、吸入によって、経口投与経路によって、鼻内投与経路によって、または他の任意の粘膜（例えば、直腸内もしくは膣内）投与経路によって）導入され得る。
【００２９】
「サブユニットワクチン」によって、目的の病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌）に由来する抗原に由来するかまたはその抗原と相同である、選択された１つ以上の抗原（しかし、すべての抗原ではない）を含む、ワクチン組成物が意味される。そのような組成物は、インタクトな病原性細胞も病原性粒子も、またはそのような細胞もしくは粒子の溶解物も実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、その病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそのアナログから調製され得る。従って、そのサブユニットワクチン中に含まれる抗原を得る方法としては、標準的精製技術、組換え生成、または合成生成が挙げられ得る。
【００３０】
「免疫調節因子」とは、免疫応答を調節可能な分子（例えば、タンパク質）をさす。免疫調節因子の非限定的例としては、リンホカイン（サイトカインとしても公知）（例えば、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３など）；およびケモカイン（例えば、分泌タンパク質（例えば、マクロファージ阻害因子））が、挙げられる。特定のサイトカイン（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３Ｌ、および分泌形態のＣＤ４０Ｌ）は、ＡＰＣの免疫刺激能力を増強可能である。本発明の実施において単独でかまたは組み合わせて使用され得るサイトカインの非限定的例としては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１γ、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導性サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびｆｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）が、挙げられる。サイトカインは、いくつかの供給業者（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＩｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ））から市販されている。これらの分子の多くの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。通常は明示的に記載されないが、野生型サイトカインまたは精製サイトカイン（例えば、組換え生成されたサイトカインまたはその変異体）と類似する生物学的活性を有する分子、およびこれらの分子をコードする核酸が、本発明の趣旨および範囲内で使用されることが意図される。
【００３１】
「被験体」によって、脊椎動物門の任意のメンバーが意味され、そのメンバーとしては、限定はしないが、以下が挙げられる：ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種））；農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）；家庭動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験室動物（齧歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモットを含む）；鳥類（家禽、野生鳥類、および猟鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他のキジ類鳥類、ガンカモ科など））。この用語は、特定の齢を示さない。従って、成体個体および新生個体の両方が包含されることが、意図される。上記の系は、上記の任意の脊椎動物種における使用について意図される。なぜなら、これらの脊椎動物のすべての免疫系は、同様に作動するからである。
【００３２】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」によって、生物学的にも他のいかなる様式にも望ましくないのではない物質が意味され、すなわち、その物質は、処方物または組成物中にて、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、その物質が含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく、個体に投与され得る。
【００３３】
（Ａ．遺伝子送達系）
（１．アルファウイルスベクターおよび粒子）
上記のように、本発明は、アルファウイルスベクター構築物、そのような構築物を含むアルファウイルス粒子、ならびにそのようなベクター構築物および粒子を生成する方法および粘膜免疫においてそのようなベクター構築物および粒子を利用する方法を提供する。アルファウイルスベースの複製欠損レプリコン粒子を、粘膜ワクチン送達系として使用することは、多数の利点を提供する。おそらく、複製欠損ウイルスベクターで免疫する最も重要な局面は、免疫部位での遺伝子産物の制御である。複製ベクター（報告されている、生きた弱毒化アルファウイルスベネズエラウマ脳炎ベース（ＶＥＥ）ベクター（Ｃａｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０３１−３０３８；Ｄａｖｉｓら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３７８１−３７８７）を含む）での免疫は、その宿主全体にわたるそのベクターの播種を生じる。対照的に、複製欠損ベクターでの免疫は、局所発現を生じ、新たに増殖した子孫ベクターの拡散を伴わない。さらに、複製の欠損は、免疫部位での望ましくない炎症応答の危険を減少させる（Ｖｉｌｌａｃｒｅｓ（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７０：５４）。
【００３４】
本発明における使用に適したアルファウイルスベクターは、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号；同第６，０１５，６９４号；同第５，７８９，２４５号；および同第５，８４２，７２３号に記載されるような、任意の手段によって構築され得る。簡単に述べると、上記のベクター構築物および粒子を調製する際に使用するために適切なアルファウイルスをコードする配列が、天然に存在する供給源または寄託機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から、本明細書中に提供される開示を考慮して容易に入手され得る。適切なアルファウイルスの代表的例としては、アウラウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６００；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）、カバソ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６５，ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）、ンヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４８）、トネート（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）、トリニティウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）、ユナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６９）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１；ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）、ワタロワウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）が、挙げられる。１つ以上のアルファウイルスから得られる配列が、同じベクターおよび／または粒子中で使用され得る。本発明の１つの好ましい局面において、野生型アルファウイルスをコードする配列が、シンドビスウイルスから得られる。
【００３５】
このアルファウイルスベクター成分は、代表的には、そのウイルスの構造タンパク質遺伝子のうちの１つ以上が１つ以上の目的遺伝子（例えば、抗原）により置換されている、自己複製ＲＮＡ（レプリコン）を含む。ＲＮＡベースのベクター（アルファウイルスベクターを含む）はまた、「レプリコン」としても公知である。なぜなら、それらのベクターは、ＲＮＡ自己増幅および高レベル発現に必要なレプリカーゼ機能を保持し、かつプラスミドＤＮＡでのトランスフェクション後（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９）またはウイルス様粒子の感染後に、インビボで放出され得るからである。アルファウイルス構築物はまた、代表的には、不活化したか、タンデムであるか、または改変された、ウイルス接合部領域を含む。適切なアルファウイルスベクターを構築するための他の改変および方法は、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号およびＷＯ ９７／３８０８７に記載される。
【００３６】
アルファウイルスベクター構築物のレプリコンＲＮＡは、物理的手段によって標的細胞に直接送達され得るか、または最初に粒子へとパッケージングされ得る。一般的に、パッケージングに必要な構造タンパク質は、ヘルパー構築物によってかまたはパッケージング細胞株によって、トランスで供給される。その構造タンパク質は、同種（例えば、そのベクター構築物と同じアルファウイルス由来）であり得；異種（例えば、そのベクター構築物と異なるアルファウイルス由来）であり得；そしてハイブリッド（例えば、複数のアルファウイルスのエレメントを含む）であり得る。重要なことに、そのレプリコンＲＮＡのみが、その粒子中にパッケージされる。なぜなら、ヘルパーＲＮＡは、代表的には、キャプシド化に必要なｃｉｓ作動性パッケージング配列を欠くからである。従って、培養中でかまたはインビボで標的細胞に感染する、アルファウイルス粒子が生成され得、そしてそのアルファウイルス粒子は、高レベルに目的遺伝子を発現し得る。しかし、それらのアルファウイルス粒子は、他の細胞への拡散し得るウイルス粒子を生成するのに必要なアルファウイルスゲノムの重要な部分を欠くという点で、欠損性である。このようにして、そのレプリコンＲＮＡが適切な宿主細胞中に導入される場合、そのレプリコンＲＮＡは、自己増幅し、そして目的遺伝子が、サブゲノムｍＲＮＡから発現される。しかし、新規なビリオン粒子は、構造タンパク質遺伝子が存在しないので、インビボではアセンブルされない。
【００３７】
種々のアルファウイルスレプリコンの間での直接的な比較研究は何ら実施されていないが、天然の細胞親和性の差異が存在することが、公知である。例えば、リンパ親和性ＶＥＥは、マウスＤＣを形質導入することが最近示された（ＭａｃＤｏｎａｌｄら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９１４−９２２）一方で、ＳＩＮおよびＳＦＶは、リンパ親和性ではない。ヒトＤＣの感染が、アルファウイルスまたはそれに由来するベクターについて最近示された（Ｇａｒｄｎｅｒら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８４９−１１８５７；ＷＯ ００／６１７７２）。Ｇａｒｄｎｅｒは、未成熟ヒトＤＣにおける増殖のために非常に効率が良いＳＩＮ改変体を同定した。そのＳＩＮ改変体についてのヒトＤＣ親和性の遺伝的決定要因が、糖タンパク質Ｅ２における単一アミノ酸置換にマッピングされており、この情報を使用して、ヒトＤＣを標的とするために使用され得るアルファウイルスレプリコン粒子が、生成され得る。インビトロおよびインビボの両方でレプリコンに感染したＤＣの詳細な特徴付けによって、そのレプリコン感染細胞が、その発生能力および抗原提示能力を維持することが示された。このことは、感染性疾患および悪性疾患に対するワクチン適用のためのＤＣ標的化ＳＩＮレプリコンの潜在的有用性を示した。
【００３８】
（２．さらなる遺伝子送達ビヒクル）
上記のように、粘膜遺伝子免疫は、局所免疫応答および全身免疫応答の両方を惹起することが示されている。しかし、復帰変異体および潜在的感染の危険に関連する安全性の問題によって、これらの系の有用性が制限される。さらに、複製ウイルスベースのベクターは、投与部位から宿主全体に迅速に拡散し得、そして他の部位で望ましくない炎症応答を引き起こし得る。従って、本発明は、その宿主において複製欠損性であり、従って、感染性状態に戻る可能性を持たない、ウイルスベース遺伝子送達系および非ウイルスベース遺伝子送達系を記載する。従って、本発明は、任意の複製欠損遺伝子移入ビヒクルを使用する、粘膜免疫のための組成物および方法を包含する。
【００３９】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な基本骨格を提供する。選択された配列が、当該分野で公知の技術を使用して、ベクター中に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。その後、その組換えウイルスは、単離され得、そして被験体の細胞へと、インビボまたはエキソビボのいずれかで送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。
【００４０】
多数のアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノム中に組み込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に維持され、それにより、挿入変異に関連する危険が最小になる（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０：Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４；４６１−４７６）。
【００４１】
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４４１号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００４２】
ポリヌクレオチドを粘膜によってか他の様式で送達するために有用な別のベクター系は、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら（１９９７年１０月１４日発行の米国特許第５，６７６，９５０号（本明細書中に参考として援用される））により記載される腸内投与される組換えポックスウイルスワクチン、ならびにワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスである。例として、本願遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築され得る。特定の合成Ｇａｇ／抗原コード配列をコードするＤＮＡが、まず、その配列がワクシニアプロモーター配列および隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）と隣接するように、適切なベクター中に挿入される。その後、このベクターが、細胞をトランスフェクトするために使用され、この細胞が、ワクシニアに同時感染される。そのワクシニアプロモーター＋目的のコード配列をコードする遺伝子をそのウイルスゲノム中に挿入するように、相同組換えが作用する。生じるＴＫ組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でその細胞を培養し、そしてその５−ブロモデオキシウリジンに対して耐性であるウイルスプラークを選ぶことによって、選択され得る。
【００４３】
あるいは、鳥類ポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルス）もまた、本願遺伝子を送達するために使用され得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換え鳥類ポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に防御免疫を付与することが公知である。鳥類ポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、その鳥類ポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的複製をし得、従って、哺乳動物細胞において感染しないからである。組換え鳥類ポックスウイルスを生成するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの生成に関して上記したような、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照のこと。ピコルナウイルス由来ベクターもまた、使用され得る（例えば、米国特許第５，６１４,４１３号および同第６，０６３，３８４号を参照のこと）。
【００４４】
分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されるアデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用され得る。
【００４５】
ワクシニアベースの感染系／トランスフェクション系は、宿主細胞において目的のコード配列（例えば、合成Ｇａｇ／ＨＣＶコア発現カセット）の誘導性一過性発現を提供するために使用され得る。この系において、細胞は、まず、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体で、インビトロ感染される。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを保有するテンプレートのみを転写する点で、精巧な特異性を示す。感染後、細胞は、Ｔ７プロモーターにより駆動される目的ポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。そのワクシニアウイルス組換え体から細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡへと転写し、その後、そのＲＮＡが、宿主の翻訳機構によってタンパク質へと翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルで一過性の細胞質生成を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【００４６】
（３．増幅系）
ワクシニアウイルス組換え体もしくは鳥類ポックスウイルス組換え体での感染、または他のウイルスベクターを使用する遺伝子送達のための別のアプローチとして、宿主細胞への導入後に高レベル発現をもたらす、増幅系が使用され得る。詳細には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのコード領域の前に存在するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、操作され得る。このテンプレートに由来するＲＮＡの翻訳は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを生成し、このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、その後、より多くのテンプレートを転写する。同時に、発現がこのＴ７プロモーターの制御下にあるｃＤＮＡが、存在する。従って、この増幅テンプレートＲＮＡの翻訳から生成されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいくらかは、所望の遺伝子の転写をもたらす。いくらかのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが、その増幅を開始するために必要であるので、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、そのテンプレートとともに、その転写反応を開始するために細胞中に導入され得る。このポリメラーゼは、タンパク質としてか、またはそのＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上で、導入され得る。Ｔ７系および細胞を形質転換するためのその細胞についてのさらなる考察に関して、例えば、国際公開ＷＯ９４／２６９１１；ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５−２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１−１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７−２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４−２１２０；ならびに米国特許第５，１３５，８５５号を参照のこと。
【００４７】
（４．リポソーム送達ビヒクル／脂質送達ビヒクル）
目的のポリヌクレオチドはまた、ウイルスベクターを用いずに送達され得る。例えば、被験体または被験体由来の細胞へ送達する前に、リポソーム中にＤＮＡまたはＲＮＡとしてパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的には、核酸に安定に結合するかまたは核酸を安定に捕捉し、そして保持することができるリポソームを使用して達成される。濃縮ＤＮＡ対脂質調製物の比は、変動し得るが、ほぼ１：１（ｍｇＤＮＡ：μｍｏｌ脂質）以上の脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説に関して、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。
【００４８】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが、特に好ましい。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）、および精製転写因子（Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の機能的形態での細胞内送達を媒介することが示された。
【００４９】
カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと）。他の市販の脂質としては、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥおよびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を用いて、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明に関して、Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１１０９２を参照のこと。カチオン性微粒子が、当該分野で公知の技術を使用して、容易に利用可能な材料から調製され得る。例えば、共有に係るＷＯ０１／１３６５９９を参照のこと。
【００５０】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、（例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から）容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な材料を用いて容易に調製され得る。このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、ＤＯＴＭＡ出発材料およびＤＯＴＡＰ出発材料と適切な比で混合され得る。これらの材料を用いてリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。
【００５１】
リポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）、または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）を包含し得る。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），第１０１巻，５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【００５２】
このＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１により記載されるものと類似する渦巻形脂質組生物中で送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号を参照のこと。
【００５３】
（５．粒子状キャリア）
この組成物はまた、粒子状キャリアにカプセル化され得るか、吸着され得るか、または粒子状キャリアと結合し得る。このようなキャリアは、免疫系に対し選択された抗原の多数のコピーを提示し、局所的なリンパ節での抗原の移動、捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージおよび樹状細胞のような専門的（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ）抗原提示細胞により取り込まれ得るか、ならびに／またはサイトカイン放出の刺激のような他の機構を通して抗原提示を増強し得る。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもの、ならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。
【００５４】
さらに、他の粒子状システムおよびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボでの送達のために使用され得る。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンならびにこれらの分子の複合体のようなポリマーは、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿または他の不溶性の無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム）を使用する沈殿、ベントナイトおよびカオリンを含む珪酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどは、本発明の方法での使用が見出される。例えば、遺伝子移入に有用な送達システムの概説としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、米国特許第５，８３１，００５号，１９９８年１１月３日発行）はまた、本発明の構築物の送達のために有用であり得る。
【００５５】
さらに、金またはタングステンのような粒子状キャリアを使用する微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達システムは、本発明の合成発現カセットの送達のために特に有用である。この粒子は、送達されるべき合成発現カセットで覆われ、そして一般に、減圧雰囲気下で、「遺伝子銃」から黒色火薬発射を使用して高速に加速される。例えば、このような技術およびそのために有用な装置について記載は、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。さらに、針のない注入システムも使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【００５６】
（Ｂ．抗原）
本明細書中に記載される任意の遺伝子送達ビヒクルは、１つ以上の異種遺伝子産物、特にポリペプチド抗原をコードする１つ以上の異種配列を含み得る。実質的に任意の異種遺伝子産物またはポリペプチドが、使用され得る。本発明の実施において特に有用な抗原として、性感染病原体あるいは粘膜表面を介して感染または伝達される他のウイルスに由来するポリペプチド抗原が挙げられる。性感染病原体およびそれに由来する抗原の非限定的な代表例として、細菌性病原体（例えば、クラミジア、淋病および梅毒）およびウイルス性病原体（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ「ＨＢＶ」および「ＨＣＶ」）、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）など）に由来する抗原が挙げられる。粘膜表面を介して伝達され得る他のウイルスの非限定的な例としては、ライノウイルス、インフルエンザ、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）などが挙げられる。本発明の文脈の中で使用される場合、「免疫原性部分」とは、適切な条件の下で、免疫応答（すなわち、細胞媒介型または体液性）を引き起こすことが可能な、それぞれの抗原部分のことをいう。「部分」とは、大きさが可変のものであり得るか、好ましくは、少なくとも９アミノ酸長であり、そして抗原全体を含み得る。細胞仲介型免疫応答は、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩ提示、ＭＨＣクラスＩＩ提示またはその両方を介して媒介され得る。
【００５７】
ＨＩＶの遺伝子は、プロウイルスＤＮＡの中央領域に位置し、そして少なくとも９つのタンパク質をコードし、これらのタンパク質は３つの主要なクラスに分けられる：（１）主要な構造タンパク質、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ；（２）調節タンパク質、ＴａｔおよびＲｅｖならびに（３）補助タンパク質、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ。ＨＩＶ_ＳＦ２から得られる抗原と関連して本明細書中で例示されるが、他のＨＩＶ改変体から得られる配列は、本明細書の教示に従って類似の様式で操作され得る。このような他の改変体として、限定しないが、単離体ＨＩＶ_ＩＩＩｂ、ＨＩＶ_ＳＦ２、ＨＩＶ−１_{ＳＦ１６２}、ＨＩＶ−１_{ＳＦ１７０}、ＨＩＶ_ＬＡＶ、ＨＩＶ_ＬＡＩ、ＨＩＶ_ＭＮ、ＨＩＶ−１_{ＣＭ２３５}、ＨＩＶ−１_ＵＳ４、多様なサブタイプに由来する他のＨＩＶ−１株（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）、ＨＩＶ−２株および多様なサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２_ＵＣ１およびＨＩＶ−２_ＵＣ２）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から得られるＧａｐタンパク質コード配列が挙げられる。（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編 １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編 １９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（これらおよび他の関連するウイルスの記載に関してＦｉｅｌｄｓ，ＢＮ，ＤＭ Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ Ｈｏｗｌｅｙ編，１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと。
【００５８】
当業者には明白なように、上記の抗原の種々の免疫原性部分が、本明細書中に記載されるように投与される場合、免疫応答を誘導するために組み合わされ得る。さらに、抗原をコードする遺伝子送達ビヒクルはまた、１つ以上のさらなる遺伝子送達ビヒクルおよび／またはポリペプチドと組み合わせて使用され得る。
【００５９】
さらに、ＨＩＶのオープンリーディングフレームについて異なる地理的地域（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に見出される大きな免疫学的可変性に起因して抗原の特定の組み合わせは、特定の地理的地域において投与するために好まれ得る。簡単に言うと、ＨＩＶの少なくとも８つの異なるサブタイプが同定されとおり、そしてそのうちサブタイプＢウイルスは、北アメリカ、ラテンアメリカおよびカリブ海、ヨーロッパ、日本ならびにオーストラリアでより流行している。ほぼ全てのサブタイプが、サハラ以南のアフリカに存在し、サブタイプＡおよびＤは中央アフリカおよび東アフリカで優勢であり、そしてサブタイプＣは、南アフリカで優勢である。サブタイプＣはまた、インドで流行しており、そして最近、南ブラジルで同定された。サブタイプＥは、はじめにタイで同定され、そしてまた、中央アフリカ共和国にも存在する。サブタイプＦは、はじめにブラジルおよびルーマニアで記載された。最も最近記載されたサブタイプは、Ｇであり、ロシアおよびガボンで見出され、そしてサブタイプＨは、ザイールおよびカメルーンで見出された。グループＯウイルスは、また、カメルーンおよびガボンにおいても見出された。従って、当業者には明らかなように、投与する地理的地域において流行している、特定のＨＩＶサブタイプに適切な投与のためのベクターを構築することが、一般的に好ましい。特定の地域のサブタイプは、２次元２重免疫拡散法、またはその地域の中の個体から単離されたＨＩＶゲノム（またはそのフラグメント）の配列決定によって決定され得る。
【００６０】
上記のように、種々のＧａｇ抗原およびＥｎｖ抗原もまた、ＨＩＶによって提示される。ＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質は、会合、粒子の放出後のビリオンの成熟およびウイルス複製における侵入後早期段階（ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔ−ｅｎｔｒｙ ｓｔｅｐ）を含むウイルスの生活環の多くの段階に関与する。ＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質の役割は、多様かつ複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：１−１５）。
【００６１】
本発明のＥｎｖコード配列は、ＨＩＶにコードされる以下のポリペプチドのポリヌクレオチド配列を含むが、それらに限定されない：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０（例えば、ＨＩＶ−１_ＳＦ２（「ＳＦ２」）Ｅｎｖポリペプチドについての記載に関して米国特許第５,７９２，４５９号を参照のこと）。ＨＩＶ−１の外膜タンパク質は、約１６０ｋＤの糖タンパク質である（ｇｐ１６０）。宿主細胞へのウイルス感染の間に、ｇｐ１６０は、宿主細胞プロテアーゼによって切断され、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質、ｇｐ４１を形成する。このｇｐ４１部分は、ビリオンの２重膜に固着される（そして２重膜にまたがる）が、ｇｐ１２０セグメントは、周囲の環境中に突き出る。ｇｐ１２０とｇｐ４１との間に共有結合による付着は存在しないので、遊離型ｇｐ１２０は、ビリオンおよび感染した細胞の表面から放出される。従って、ｇｐ１６０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１についてコードする配列を含む。このポリペプチドｇｐ４１は、オリゴマー形成ドメイン（ＯＤ）および膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含むいくつかのドメインを含む。ネイティブのエンベロープにおいて、オリゴマー形成ドメインは、３つのｇｐ４１ポリペプチドが、３量体構造を形成するための非共有結合性会合のために必要とされる：ｇｐ４１三量体（およびそれ自体）との非共有結合性相互作用を介して、ｇｐ１２０ポリペプチドはまた、３量体構造に組織化される。切断部位は、ｇｐ１２０についてのポリペプチド配列とｇｐ４１に対応するポリペプチド配列との間にほぼ存在する。この切断部位は、この部位での切断を予防するために変異され得る。得られるｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１の膜貫通ドメインが欠失した、ｇｐ１６０の短縮型形態に対応する。このｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１部分のオリゴマー形成ドメインの存在によって、単量体形態およびオリゴマー形態（すなわち３量体）の両方で存在し得る。切断部位が切断を予防するために変異され、そしてｇｐ４１の膜貫通部分が欠失している状況では、得られるポリペプチド産物は、「変異した」ｇｐ１４０と呼ばれ得る。当業者に明らかなように、切断部位は、種々の方法によって変異され得る（例えば、ＷＯ００／３９３０２もまた参照のこと）。
【００６２】
上記のように、ＨＩＶ抗原の少なくとも１つの免疫原性部分が、遺伝子送達ビヒクルの中に取り込まれ得、そして粘膜免疫のために使用され得る。ビヒクル（例えば、アルファウイルスベクター構築物）の中に取り込まれた免疫原性部分は、様々な長さのものであり得るが、概して好ましくは、この部分は少なくとも９アミノ酸長であり、そして抗原全体を含み得る。特定の配列の免疫原性は、しばしば予想することが困難であるが、Ｔ細胞エピトープは、可能性のあるＴ−ヘルパー部位およびＣＴＬ部位についてコード領域を走査するために、ＴＳＩＴＥＳ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のようなコンピュータアルゴリズムを利用して、予測され得る。この分析から、ペプチドが合成され、インビトロ細胞傷害性アッセイでの標的として使用される。しかし、他のアッセイもまた、利用され得、例えば、ＥＬＩＳＡ（これは、新たに導入されたベクターに対する抗体の存在を検出する）、ならびに、Ｔヘルパー細胞について試験するアッセイ（例えば、γ−インターフェロンアッセイ、ＩＬ−２産生アッセイおよび増殖アッセイ）が挙げられる。
【００６３】
免疫原性部分はまた、他の方法によって選択され得る。例えば、ＨＬＡ Ａ２．１トランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のためのモデルとして有用であることが示されてきた。簡単に言うと、インフルエンザウイルスシステムおよびＢ型肝炎ウイルスシステムにおいて、マウスＴ細胞レセプターレパートリーは、ヒトＴ細胞によって認識される同一の抗原決定基を認識する。両方のシステムにおいて、ＨＬＡ Ａ２．１トランスジェニックマウスにおいて生じるＣＴＬ応答は、ＨＬＡ Ａ２．１ハプロタイプのヒトＣＴＬによって認識されるエピトープと事実上同一のエピトープに関する（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９２）Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｙｍｐｏｓｉａ）。
【００６４】
ＨＩＶのさらなる免疫原性部分は、コード配列を種々の位置にて（例えば、ＨＩＶゲノムの種々のドメイン由来の１つ以上のエピトープを含むように）短縮することによって得られ得る。上記のように、このようなドメインは、Ｇａｇ、Ｇａｇ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｇａｇ−ｐｒｏｔｅａｓｅ、ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）、ｉｎｔｅｇｒａｓｅ（ＩＮ）およびＥｎｖのような構造的ドメインを含む。これらの構造的ドメインは、しばしばさらにポリペプチド（例えば、ｐ５５、ｐ２４、ｐ６（Ｇａｇ）；ｐ１６０、ｐ１０、ｐ１５、ｐ３１、ｐ６５（ｐｏｌ、ｐｒｏｔ、ＲＴおよびＩＮ）；ならびにｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１（Ｅｎｖ））に再分割される。ＨＩＶのさらなるエピトープおよび他の性感染疾患は既知であるか、または当該分野で公知の方法を使用して容易に決定され得る。さらに本発明には、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２４５；ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７３およびＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７２に記載されるようなポリペプチドの分子改変体が含まれる。
【００６５】
他の性感染性または粘膜感染性の、ウイルス性および細菌性の両方の疾患はまた、本明細書中に記載の組成物および方法を使用して扱われ得る。例えば、ＨＳＶの場合、ＨＳＶ抗原（例えば、ｇＢ、ｇＤ）を発現するベクターによる膣の免疫は、膣に対して保護を提供し得るようである。従って、ＨＳＶに由来する１つ以上の抗原は、ＨＳＶ感染の処置および予防のために本明細書中に記載されるように使用され得る。
【００６６】
（１．異種遺伝子産物を運ぶベクターの調製）
ある実施形態において、１つ以上の抗原をコードする配列は、ウイルスベクターまたは粒子のような、遺伝子送達ビヒクルの中に組み込まれる。本明細書中に提供される開示を考慮した当業者に明らかなように、種々のウイルスベクターのパッケージングの効率、それゆえ種々のウイルスベクターのウイルスの力価、ーは、パッケージングされる配列のサイズにある程度に依存する。従って、パッケージングの効率および生存可能なベクター粒子（例えば、アルファウイルスベクター粒子）の生成を増加させるために、さらなる非コード配列は、ベクター構築物に付加され得る。
【００６７】
本明細書中に記載されるベクターまたは得られた粒子の特定の適用において、１より多くの異種遺伝子の発現が、望まれる。例えば、ＨＩＶのような性感染疾患を処置するために、ベクターまたは粒子の複数回の投与が、あるいは１より多くの遺伝子産物を発現するベクターまたは粒子の投与が、必要とされ得る。さらに、免疫原性は、抗原および免疫調節物質（例えば、サイトカイン、リンホカイン、ケモカインなど）の両方をコードすることによって、さらに増強され得る。従って、本発明の１つの実施形態において、ウイルスベクター（例えば、アルファウイルスベクター）は、適切なシグナル（例えば、リボソーム読み過し、またはシストロン間の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ））を配置することによって構築され得る。あるいは、複数のサブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）連結領域プロモーター（例えば、アルファウイルスに由来する）が、利用され得る。さらに、ベクター構築物は、種々の粘膜感染（例えば、性感染）病原体の全てまたは免疫原性部分を（別々に、または１つの構築物として）発現し得る。
【００６８】
本発明の１つの局面の範囲内において、ＨＩＶ抗原の免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物（例えば、アルファウイルスベクターおよび粒子）が、提供される。プロウイルスとしても既知のＨＩＶ−１の完全な形態は、約９．８キロベースの長さである。（例えば、Ｍｕｅｓｉｎｇら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：４５０−４８を参照のこと）。プロウイルスの両方の末端は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）として既知の反復配列に隣接する。
【００６９】
上記のタンパク質（例えば抗原）をコードする配列は、種々の供給源から容易に得られ得、このような供給源として、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような寄託機関、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的な供給源が挙げられる。Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子的にクローン化されたゲノムの代表的な例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような供給源から入手され得る。例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４５０２０は、ｐＢＲ３２２（Ｍｏｒｉａｒｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２６０６−２６１０，１９８１）のＢａｍ ＨＩ部位におけるＢ型肝炎の総ゲノムＤＮＡ（純粋なＤａｎｅ粒子から抽出される）（Ｂｌｕｍら、ＴＩＧ ５（５）：１５４−１５８，１９８９の図３を参照のこと）を含む。
【００７０】
あるいは、目的のポリペプチドをコードする配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成され得る。Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら（編）Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９４））．この技術は、ＤＮＡの所望の領域を複製するために、ＤＮＡポリメラーゼ（通常、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）を使用する。複製されるべきＤＮＡ領域は、複製反応を開始するための所望のＤＮＡの反対の末端および反対の鎖に相補的な具体的配列オリゴヌクレオチドによって同定される。繰り返される連続的な複製のサイクルは、使用されるプライマー対によって定められたＤＮＡフラグメントの増幅を生じる。多数のパラメータが、反応の成功に影響する。これらのパラメータの中には、アニーリング温度およびアニーリング時間、伸長時間、Ｍｇ^２＋およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマーと、テンプレートとデオキシリボヌクレオチドとの相対濃度がある。
【００７１】
一旦、所望のタンパク質についてのコード配列が、調製されるかまたは単離されると、そのような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコンの中にクローン化され得る。多数のクローニングベクターが、当業者に既知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。他の配列に対する連結は、当該分野で公知の標準的な手順を使用して実施される。
【００７２】
（２．ポリペプチド調製）
同様に、選択されたコード配列は、発現のための任意の適切な発現ベクターの中にクローン化され得る。この発現産物は、必要に応じて、粘膜投与に先立ち精製され得る。簡単に言うと、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現系の中で発現され得る発現ベクターの中に導入され得る。種々の細菌、酵母、哺乳動物、昆虫および植物の発現系が、当該分野で利用可能であり、そして任意のそのような発現系が、使用され得る。必要に応じて、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、無細胞翻訳系において翻訳され得る。このような方法は、当該分野で周知である。タンパク質はまた、固相タンパク質合成によって構築され得る。所望の場合、ポリペプチドはまた、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列ならびにタンパク質の精製に有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびブドウ球菌プロテイン質Ａ）のような他のアミノ酸配列を含み得る。あるいは、目的の抗原は、商業的な供給源から購入され得る。
【００７３】
（Ｃ．送達）
本明細書中に記載される組成物（例えば、遺伝子送達ビヒクルおよび任意のポリペプチド抗原）は、任意の適切な手段（例えば、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、経口的に、直腸に、眼内に、鼻腔内に）または種々の物理的な方法（例えば、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７）、直接的なＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８）；微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：２７２６−２７３０）；いくつかの型リポソーム（例えば、Ｗａｎｇら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：７８５１−７８５５を参照のこと）；ＣａＰＯ_４（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：７５２９−７５３３）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら（１９８９）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７）；ポリペプチドのみの投与；核酸のみの投与（ＷＯ９０／１１０９２）；または死滅したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４）；ポリリジンのようなポリカチオン化合物を介して、レセプター特異的リガンドを利用して；ならびにセンダイウイルスまたはアデノウイルスのようなソラレン不活性化ウイルス）を使用して送達され得る。さらに、真核生物層状ベクター開始系（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）は、直接的に（すなわち、インビボに）投与されてもよく、または取り出された細胞に投与され（エキソビボ）、そして続いて戻されてもよい。
【００７４】
好ましい実施形態において、遺伝子送達ビヒクルおよび任意のポリペプチド含有組成物は、粘膜に投与される通りである。粘膜送達の方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（上記）に記載される通りである。直腸および膣への組成物の送達は、性感染病原体の場合に特に好ましい。なぜなら、この様式では、最初に病原体に曝された細胞への接近を提供するからである。同様に、鼻腔内への投与は、例えば、鼻腔の粘膜を介して感染するライノウイルスのような、疾患において好まれ得る。いくつかの場合、鼻腔内への投与は、膣の粘膜に免疫を誘導し得、そして経口の免疫は、直腸粘膜への免疫を誘導し得る。さらに、種々の経路の粘膜投与の組み合わせおよび／または種々の経路による全身的な投与は、最適な防御および保護を誘導するために使用され得る（病原体が侵入する部位ならびに粘膜性の病原体が分散した全身の部位の両方において）。さらに、粘膜への投与は、シリンジまたは他の投与デバイスの必要性をなくする。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。
【００７５】
ある実施形態において、複製欠損ベクターは、核酸免疫などによって標準的遺伝子送達プロトコルを使用して投与される。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号，同第５，５８０，８５９号，同第５，５８９，４６６号を参照のこと。アルファウイルス組成物は、脊椎動物被験体に直接的にか、あるいは被験体由来の細胞にエキソビボで送達され、そして細胞を被験体に再移植するかのいずれかにより送達され得る。好ましい実施形態において、この組成物は、インビボで送達される。インビボでの複製欠損組成物の送達は、概して、当該分野で公知の任意の手段（例えば、従来のシリンジ、Ｂｉｏｊｅｃｔ（登録商標）のような針なしの（ｎｅｅｄｌｅｓｓ）デバイスまたはＡｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような遺伝子銃のいずれかを使用する注入によって）を使用して成し遂げられ得る。この構築物は、皮下に、上皮に、皮内に、筋肉内に、静脈内に、粘膜に（例えば、鼻に、直腸に、および腟に）、腹腔内に、経口的に、またはそれらの組み合わせのいずれかによって送達（例えば、注射）され得る。
【００７６】
本発明の他の局面の範囲内において、本明細書中に記載される遺伝子送達システム（組換えアルファウイルスベクターまたは組換えアルファウイルス粒子を含む）の投与のための方法が、提供される。簡単に言うと、ウイルスベクター投与の最終形態は、通常、特定の治療適用に依存し、ベクター効力を増加させる最良の形態、および最も簡便な投与経路である。概して、この実施形態は、例えば、以下によって送達されるように、設計され得る組成物を含む：（１）血流への直接的な注入；（２）特定の組織または腫瘍への直接的な注入；（３）経口投与；（４）経鼻吸入；（５）粘膜組織への直接的な適用（例えば、鼻腔内に、直腸内に、および／または膣内に）；および／または（６）形質導入された自己細胞の動物へのエキソビボ投与。従って、治療用のアルファウイルスベクターは、このベクターが以下となるような様式によって投与され得る：（ａ）正常で健康な細胞に形質導入し得、そして細胞を、治療用のタンパク質または因子（これは、全身にまたは局所的に分泌される）の生産株へと形質転換にする、（ｂ）異常細胞または欠損細胞を形質転換して、この細胞を、正常に機能する表現型へと形質転換する、（ｃ）異常細胞が破壊されるようにこの異常細胞を形質転換する、および／または（ｄ）免疫応答を操作するために、細胞を形質導入する。
【００７７】
本明細書中に開示された組成物は、単独で投与され得るか、あるいは１つ以上のさらなる遺伝子送達ビヒクルおよび／または１つ以上のタンパク質とともに投与され得る。このような実施形態において、複数の組成物が、任意の順序で、例えば、遺伝子送達ビヒクルの後にタンパク質で；複数遺伝子送達ビヒクルの後に複数タンパク質の投与によって；タンパク質投与の後に単一のまたは複数の遺伝子送達ビヒクルの投与によって；同時投与によって；などで投与され得る。従って、タンパク質および核酸の混合物は、同一のまたは異なるビヒクル、および、同一のまたは異なる投与の形態を使用して、投与され得る。
【００７８】
ある実施形態において、直接的な送達は、一般的に、上記のように、従来のシリンジまたは遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））を使用する注入によって、ウイルス性ベクターを用いてかまたは用いずになされる。
【００７９】
従って、注入は、皮下に、上皮に、皮内に、粘膜内に（例えば、鼻に、直腸に、口におよび膣に）、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかに投与され得る。他の投与形態として、肺への投与、坐剤、針なしの注入、経皮的な（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕ）適用および経皮性の（ｔｒａｎｓｄｅｒｍｉｃ）適用が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。上記のように、核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と組み合わされ得る。
【００８０】
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明はまた、複製欠損ベクター（例えば、組換えアルファウイルス構築物または組換えアルファウイルス粒子）を薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、またはレシピエントと組み合わせて含む薬学的組成物を含む。さらに、アジュバントのような他の成分もまた、存在し得る。米国特許第６，０１５，６９４号に、より十分に記載されるように、安定性でかつ容易に投与可能な免疫原性化合物は、特に、冷蔵および／または従来の投与手段（シリンジなど）が、簡単に利用できない第三世界の国々において、必要とされる。
【００８１】
ある実施形態において、ポリペプチドもまた、含有され得る。活性成分として免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性化合物の調製は、当業者に公知である。代表的には、このような免疫原性化合物は、液体中に溶液または懸濁液のいずれかとして注入可能物として調製され；注入の前に液体中に溶解または懸濁液するに適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、乳化され得るか、またはリポソーム中にタンパク質がカプセル化され得る。
【００８２】
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアを含む。このキャリアは、それ自体が宿主に有害な抗体の産生を誘導するべきでない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。適切なキャリアは、代表的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子のような、巨大で、ゆっくりと代謝される高分子である。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリルレートポリマーに由来するもの、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧとして知られる）に由来する巨大粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら（１９９７）Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０；Ｏ’Ｈａｇａｎら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激因子（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、細菌のトキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来するトキソイド）ならびにＥ．ｃｏｌｉに由来するトキシンと結合され得る。
【００８３】
薬学的に受容可能な塩（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩）、および有機酸の塩（例えば、アセテート、プロピオネート、マロネートまたはベンゾエート））はまた、本発明の組成物に使用され得る。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキシドおよび当業者に周知の他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなど）を単独でかまたは組合わせて、ならびに基質（例えば、保湿剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤）を含み得る。リポソームはまた、本発明の組成物に対するキャリアとして使用され得、このようなリポソームは、上記されている。
【００８４】
簡単には、ウイルス粒子に関して、複製欠損ベクター（上記で粒子ともいわれる）は粗製形態または精製形態のいずれかで貯蔵され得る。貯蔵の方法および条件は、米国特許第６，０１５，６９４号に記載されている。
【００８５】
さらに、本明細書中に記載される組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。好ましくは、組成物は、免疫学的応答をマウントするに十分な抗原量を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、比較的広範であり、慣用的試験を介して決定され得、そして一般に、抗原当たり、約０．１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは、約１μｇ〜約３００μｇの粒子のオーダーの量である。
【００８６】
このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油エマルジョン処方物（他の特定の免疫賦活剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌性細胞壁成分）ありまたはなし）（例えば、（ａ）微小流動化剤（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、モデル１１０Ｙ微小流動化剤（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ））を使用してミクロン以下の粒子中に処方されるＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含有する）、（ｂ）ミクロン以下のエマルジョンに微小流動化されているかまたはより大きいサイズのエマルジョンを生成するようにボルテックスされているかのいずれかであるＳＡＦ（１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有する）、および（ｃ）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌性細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含有する）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））が使用され得るか、またはそれから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体））；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α Ｒａｎｔｅｓ、１−β Ｒａｎｔｅｓなど）；（６）細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ）の解毒された変異体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここで、野生型アミノ酸６３位がリジンに置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、野生型アミノ酸７２位がアルギニンに置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここで、野生型アミノ酸１０９位がセリンに置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここで、野生型アミノ酸９位がリジンに、そして１２９位がグリシンに置換されている）（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２；ＷＯ９２／１９２６５；ＷＯ９５／１７２１１；ＷＯ９８／１８９２８およびＷＯ０１／２２９９３）；および（７）この組成物の有効性を増強するように免疫賦活剤として作用する他の物質。
【００８７】
ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙ）ホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【００８８】
本明細書中に記載される薬学的組成物の投与は、任意の適切な経路によってであり得る（例えば、項Ｃを参照のこと）。特に好ましくは、粘膜（例えば、直腸および／または膣）投与である。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の初期経過が１〜１０回の別々の用量で、続いて、免疫応答を維持および／または強化するために選択されるその後の時間間隔（例えば、第２の用量について１〜４ヶ月）を開けて与えられる他の用量、そして必要ならば、続いて数ヵ月後の用量、である。投薬レジメンはまた、少なくとも一部は、モダリティーの有効性、使用されるワクチン送達、被験体の必要性および開業医の判断への依存によって決定される。
【００８９】
なお他の実施形態において、複数の投与（例えば、プライム−ブースト型投与）は、有利に使用される。例えば、目的の抗原を発現する組換えアルファウイルス粒子が投与される（例えば、ＩＶＡＧまたはＩＲ）。続いて、抗原が、例えば、ポリペプチド抗原および適切なアジュバントを含む組成物中で投与される。あるいは、抗原は、遺伝子送達ビヒクルの前に投与される。複数のポリペプチドおよび複数の遺伝子の送達ビヒクル投与（任意の順番で）もまた、使用され得る。
【００９０】
（Ｅ．複製欠損粒子および抗原性ポリペプチドを利用する方法）
本発明の特定の局面において、組成物および方法が、性感染疾患を予防、抑制、安定化または逆転し得る組成物（例えば、アルファウイルスベクター構築物）を粘膜投与するために提供される。このような疾患の代表的な例としては、細菌感染、ウイルス感染、特に、性感染疾患（以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ Ｉ、ＨＴＬＶ ＩＩ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、クラミジア、淋病および／または梅毒）が挙げられる。
【００９１】
より具体的には、本発明の１つの局面において、組成物および方法が、性感染病原性因子に対する免疫応答（体液性または細胞媒介性のいずれか）を刺激するために提供される。その結果、この病原性因子は、殺傷されるかまたは阻害される。病原性因子の代表的な例としては、細菌及びウイルスが挙げられる。
【００９２】
本発明の１つの実施形態において、病原性因子は、ウイルスであり、そして方法が、特定の免疫応答を刺激するため、およびウイルス伝播を阻害するために提供される。この方法は、抗原またはその改変形態の発現を、（１）ウイルス抗原に対する免疫応答を開始させるか、または（２）ウイルス相互作用に必要とされる細胞レセプターを占有することによりウイルス伝播を予防するかのいずれかを行い得る感受性標的細胞を指向するベクター構築物を送達するように設計された組換えアルファウイルス粒子を使用することによる。タンパク質をコードするベクター核酸の発現は、一過性でも時間とともに安定でもよい。免疫応答が病原性抗原に対して刺激される場合、組換えアルファウイルスは、好ましくは、抗原の改変形態を発現するように設計される。この抗原は、免疫応答を刺激し、そしてネイティブな抗原と比較して低減した病原性を有する。この免疫応答は、細胞が正確な様式で抗原を提示する場合（すなわち、アクセサリー分子（例えば、ＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１またはそのアナログ（例えば、Ａｌｔｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５１２，１９８９））を伴うＭＨＣクラスＩ分子および／またはクラスＩＩ分子に関して）に達成される。アルファウイルスベクターで感染された細胞は、免疫応答を効率的にすることが予期される。なぜなら、アルファウイルスベクターは、本当のウイルス感染を密に模倣するからであり、そしてアルファウイルスベクターは、（ａ）複製しない細胞を感染し得、（ｂ）宿主細胞ゲノムに組み込まれず、（ｃ）生命を脅かすいずれの疾患にも関連せず、そして（ｄ）高レベルの異種タンパク質を発現する、からである。これらの差異のために、アルファウイルスベクターは、健康な個体に対するワクチン用途に使用され得る安全なウイルスベクターであると、容易に考えられ得る。
【００９３】
本発明のこの局面はさらに、同様の様式で機能することが予期され得る他の系を超える利点を有する。ここで、提示（ｐｒｅｓｅｎｔｅｒ）細胞は、完全に生存可能かつ健常であり、そして異種遺伝子と比較して低レベルのウイルス抗原が発現される。これは、異なる利点を示す。なぜなら、発現される抗原性エピトープは、抗原についての遺伝子のサブフラグメントを組換えアルファウイルスに選択的にクローニングすることによって変更され、免疫優性エピトープより重要でない免疫原性エピトープに対する応答を導き得る。このようなアプローチは、複数のエピトープを有するペプチドの発現に拡張され得、ここで、１つ以上のエピトープが異なるタンパク質由来である。さらに、本発明のこの局面は、これらのペプチドフラグメントの細胞内合成およびＭＨＣクラスＩ分子との結合を介して、抗原性エピトープ、および遺伝子のサブフラグメントによってコードされる抗原のペプチドフラグメントに対して指向される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の効果的な刺激を可能にする。このアプローチは、ＣＴＬ誘導に対する主要な免疫優性エピトープをマッピングするのに利用され得る。
【００９４】
本明細書中に記載される粘膜投与に適切な組成物（例えば、アルファウイルス構築物および粒子）は、１つ以上の阻害緩和剤（例えば、アンチセンスなどを発現するウイルス性阻害遺伝子または細菌性阻害遺伝子）を含み得る。阻害緩和剤についての議論は、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号に記載され、これは、抗原および阻害緩和剤（例えば、アンチセンスｔａｔなどを発現する）がどのように同時発現および／または設計されて、感染に必要とされるタンパク質（例えば、ＣＤ４）を過剰発現し得るのかを記載する。この方法において、比較的少数のベクター感染ＨＩＶ耐性細胞は、遊離ウイルスまたはウイルス性感染細胞との、複数の非生産性融合事象に対して「シンク（ｓｉｎｋ）」または「磁石（ｍａｇｎｅｔ）」として作用する。ＨＩＶの場合、相互作用の２つの因子は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１エンべロープタンパク質およびＣＤ４レセプター分子である。よって、適切なブロッカーは、病原性効果を生じることなくＨＩＶ侵入をブロックするＨＩＶ ｅｎｖアナログ、またはＣＤ４レセプターアナログのいずれかを発現するベクター構築物である。ＣＤ４アナログは、分泌され、そして近隣の細胞を保護するように機能するが、ｇｐ１２０／ｇｐ４１は、ベクター含有細胞のみを保護するように細胞内にのみ分泌または産生される。安定性または補体溶解を増強するためにヒト免疫グロブリン重鎖または他の成分をＣＤ４に付加することが、有利であり得る。このようなハイブリッド可溶性ＣＤ４をコードするアルファウイルスベクターを宿主へ送達することによって、安定なハイブリッド分子の連続的な供給を生じる。処置の効率は、疾患進行の通常の指標（抗体レベル、ウイルス抗原産生、感染性ＨＩＶレベル、または非特異的感染のレベルを含む）を測定することによりアッセイされ得る。
【００９５】
このような転写サプレッサータンパク質は、ウイルス特異的トランス活性化タンパク質（上記のような）によって発現が刺激される任意のウイルス特異的転写プロモーターを使用して、組織培養物中において選択され得る。ＨＩＶの特定の場合において、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質、およびＨＩＶプロモーターによって駆動されるＨＳＶＴＫ遺伝子を発現する細胞株は、ＡＣＶの存在下で死滅する。しかし、一連の変異ｔａｔ遺伝子がこの系に導入される場合、適切な特性を用いる（すなわち、野生型ｔａｔの存在下でのＨＩＶプロモーターからの転写を抑制する）変異体は、増殖し、そして選択される。次いで、変異遺伝子は、これらの細胞から再度単離され得る。複数コピーの条件付き致死的ベクター／ｔａｔ系を含有する細胞株を使用して、生存細胞クローンがこれらの遺伝子における内因性変異によって生じないことを保証し得る。次いで、無作為に変異誘発されたｔａｔ遺伝子の一群が、「回収可能な（ｒｅｓｃｕａｂｌｅ）」アルファウイルスベクター（すなわち、変異体ｔａｔタンパク質を発現し、そして細菌性複製起点、ならびに増殖および細菌における選択についての薬物耐性マーカーを含むベクター）を使用してこれらの細胞に導入される。このことは、評価されるべき多くの無作為な変異を可能にし、そして引き続く所望の変異体細胞株の分子クローニングを容易にする。この手順を使用して、潜在的抗ウイルス治療のための種々のウイルス性転写アクチベーター／ウイルス性プロモーター系における変異を同定および利用し得る。
【００９６】
本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルに使用され得るさらなる阻害緩和剤としては、所望の細胞中で異種導入遺伝子の発現が低減（抑制）され得る系が挙げられ、これは、例えば、ベクター中にＴＯＰ結合リガンドおよびパッケージングエレメントを含むことによるビリオンパッケージングプロセスの間を含む。例えば、共有に係る米国出願番号０９／６０８，７３０号に記載されるように、これらの方法は、他の細胞型全てにおける導入遺伝子の高レベル発現および翻訳の能力を維持しながら、ビリオン産生細胞における導入遺伝子翻訳の抑制を可能にする。これらの系はまた、種々のウイルスベクターに適用可能であり、そしてさらに、他のビリオン産生系（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘ系におけるアデノウイルスビリオン構築物を含む）と合わせられ得る。
【００９７】
以下の実施例は、例示の目的で提示され、限定の目的で提示されるのではない。
【実施例】
【００９８】
（実施例１：材料および方法）
（マウスおよび細胞株）
雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、このマウスは、研究の開始時に６〜８週齢であった。繊維芽細胞株ＳｖＢａｌｂ（Ｈ−２^ｄ）を、標的細胞として使用した。この細胞株は、クラスＩＭＨＣ分子を発現するが、クラスＩＩＭＨＣ分子を発現せず、よってＣＤ８^＋細胞に対して指向されるが、ＣＤ４^＋細胞に対しては指向されない。
【００９９】
（材料）
ｐ７ｇは、Ｈ−２Ｋ^ｄで拘束されたＨＩＶ−１_ＳＦ２ｐ２４ｇａｇ ＣＴＬエピトープであり、そして９マーの合成ペプチドである：（ａａ、１９９−ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ−２０７）（２１）。このエピトープを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ）によるＦｍｏｃ固相法（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：４１０−４１４を参照のこと）を使用して遊離アミンＮ末端および遊離酸Ｃ末端で合成した。
【０１００】
（免疫）
５匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスの群を、各ワクチン経路または免疫経路に使用し、そして屠殺の際に、組織をプールした。データは、同様または同一の結果を有する代表的な２〜４個のこのようなデータ点として示される。全ての免疫を、２〜３週の間隔で３〜４回行った。ＩＮ免疫を、ＰＢＳ中で懸濁された２５μｌ容量中に２．５Ｅ１０^６のＳＩＮ粒子を用いて行った。ＩＮ免疫を、麻酔なしで行った。１２．５μｌ容量中に２．５Ｅ１０^６を用いて、ＩＶＡＧ免疫およびＩＲ免疫を、麻酔したマウスにて行い、このマウスを、横臥で２０分間維持した。ＩＭ免疫を、５０μｌ容量中に２．５Ｅ１０^６のＳＩＮ粒子を用いて大腿部筋肉にて行った。このマウスを、最終免疫１週間後に屠殺した。
【０１０１】
（血清および組織の収集）
後部眼窩叢（ｒｅｔｒｏ ｏｒｂｉｔａｌ ｐｌｅｘｕｓ）を介して、屠殺の１日前にマウスから採血し、そしてＥＬＩＳＡアッセイのために血清を分離した。頸部リンパ節（ＣＬＮ）、腸骨リンパ節（ＩＬＮ）、膣／子宮粘膜組織（ＶＵＭ）および脾臓（ＳＰ）を群当たり５匹のマウスから回収およびプールし、そして単一の細胞懸濁物を、標準的^５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイ（ＶＵＭ以外）、ＩＦＮ−γ−分泌細胞（ＩＦＮＳＣ）を検出するためのｇａｇエピトープ特異的ＥＬＩＳＰＯＴ、または抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を検出するためのｇａｇ−ｐ５５特異的ＥＬＩＳＰＯＴに使用した。
【０１０２】
（単一細胞懸濁物の調製）
５匹のマウスの群を、上記のように、ＩＮ経路、ＩＭ経路、ＩＲ経路またはＩＶＡＧ経路を介して２〜３週間の間隔で３回免疫した。最終免疫の１週間後、５匹の免疫したマウスの群由来のＳＰ、ＣＬＮおよびＩＬＮの各々を、回収およびプールした。ＳＰ組織、ＣＬＮ組織およびＩＬＮ組織を、２５０μｍのポアー直径を有するナイロンメッシュを通して裂き、そして培地（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ培地：１０％ＦＣＳ、抗生物質、ＨｅｐｅｓおよびＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ）；^５１Ｃｒ放出アッセイ培地）中で３回洗浄し、計数し、そしてＥＬＩＳＰＯＴアッセイまたは^５１Ｃｒ放出アッセイについてのウェル中に播種した。群当たり５匹のマウスのプールから膣、子宮および子宮角全体を取り出すことによる改変を伴う、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ（例えば、ＬｙｃｋｅおよびＨｏｌｍｇｒｅｎ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５９：３０１−３０８を参照のこと）によって記載される方法に基づいて、ＶＵＭ由来の単一の細胞懸濁物を調製した。子宮角を縦に切断し、そして膣組織および子宮組織を一緒に、５ｍｍ片に刻んだ。次いで、組織片を、１０％ＦＣＳおよび５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含みＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＨＢＳＳ（完全ＨＢＳＳ）で３回洗浄した。次いで、この小片を、３７℃で連続的に攪拌しながら、完全ＨＢＳＳ中１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼ／ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）＋０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅで３０分間１回、そして完全ＲＰＭＩ中コラゲナーゼ＋０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅで４５分間２回酵素処理した。各酵素処理に続いて、放出された細胞を回収し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄した。各酵素処理から回収した細胞懸濁物を、プールおよび計数した。この方法は、慣用的に５匹のマウス当たり最少でも１０^７個の生存単核細胞（ＭＮＣ）の回収を生じた。
【０１０３】
（^５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイ）
組織由来の単一細胞懸濁物を、上記のように調製し、そしてウェル当たり５×１０^６細胞で２４ウェルディッシュにて培養した。これらの細胞のうち、１×１０^６個を、１０ｍＭの濃度の合成ｐ７ｇペプチド（アミノ酸１９４〜２１３）で、３７℃で１時間感作させ、次いで洗浄し、そして残りの４×１０^６個の未処理細胞とともに同時培養した。これらの細胞を、以下の脾細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）培養培地２ｍｌ中でのバルク培養として刺激した：１０％熱非働化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００ｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１０ｍｌ／Ｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０Ｍ ２−メルカプトエタノールを補充した、１００ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）／α−Ｍｅｍ（Ｌ−グルタミン、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドを含む最少必須培地α培地）（１：１）。さらに、５％ Ｒａｔ Ｔ−Ｓｔｉｍ ＩＬ２（Ｒａｔ Ｔ−Ｓｔｉｍ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を、ＩＬ２の供給源として使用し、そして細胞を培養する直前に培養培地に添加した。
【０１０４】
６〜７日の刺激期間後に、細胞を回収し、そして^５１クロム放出アッセイにおけるエフェクターとして使用した。約１０^６個のＳＶ／Ｂａｌｂ標的細胞を、５０Ｃｉの^５１Ｃｒを含有する２００μｌの培地中で、１Ｍの濃度での正確なペプチドｐ７ｇまたはミスマッチ細胞標的対（ネガティブコントロールとして）とともに、６０分間インキュベートし、そして洗浄した。エフェクター細胞を、５×１０^３個の標的細胞とともに、９６ウェル組織培養プレート（丸底またはＶ底）中２００μｌの培養培地にて種々のエフェクター対標的比で４時間培養した。２連のウェルからの平均ｃｐｍを使用して、本明細書中に示されるような特異的放出パーセントを計算した。
【０１０５】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
群当たり５匹のマウス由来のプールしたＣＬＮおよびＳＰからの単一の細胞懸濁物を、モノクローナルラット抗マウス抗ＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびｐ５５で予めコートし、そして１０％ウシ胎仔血清、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび抗生物質を含有する完全ＲＰＭＩ培地（ｐＨ７．２）でブロックしたニトロセルロースまたはｐｖｄｆプレート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）上に添加した。ｐ５５特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）全体を検出するために、細胞を３７℃で一晩インキュベートした後、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｐ／Ｔ）で洗浄した。ビオチン化ヤギ抗ＩｇＨ＋Ｌ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）を、ＰＢＳ／１％正常ヤギ血清に１：７０００希釈で添加し、そして室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを、Ｐ／Ｔで洗浄し、そして１：１０００希釈でのアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、Ｐ／Ｔで洗浄し、そしてスポットを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液にＤＡＢを３０分間添加することにより可視化した。プレートを、脱イオン水で洗浄し、風乾した。スポットを、群当たりおよび組織当たり２連のウェルから手動で低倍率下で計数した。この結果は、１０，０００，０００個の細胞当たりのＡＳＣとして示され、そして同様の結果を有する少なくとも２つの実験の代表例である。
【０１０６】
ｇａｇ由来のｐ７ｇペプチド、またはポリクローナルＴ細胞活性化についてのポジティブコントロールとしての抗ＣＤ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、またはネガティブコントロールとしての培地のみの存在下で、細胞を一晩インキュベートした後のＩＦＮ−γ分泌細胞の検出について、プレートを洗浄し、そしてビオチン化抗ＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎに添加し、Ｒ／Ｔで２時間インキュベートした。プレートをＰ／Ｔで洗浄し、そして１：１０００希釈でのアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰ／Ｔで洗浄し、そしてスポットを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液にＤＡＢを３０分間添加することにより可視化した。プレートを、脱イオン水（Ｈ２Ｏ）で洗浄し、風乾した。スポットを、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）からのソフトウェアを使用する自家製自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを用いて計数した。
【０１０７】
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＨＩＶ−１ ｐ５５ｇａｇ特異的血清ＩｇＧ力価を、標準的ＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。簡単には、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐによる９６ウェルＵ底）を、５μｇ／ウェルのｐ５５タンパク質でコートした。１×ＰＢＳ＋０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）で洗浄した後、ウェルをブロックし、そしてサンプルを、連続希釈で、アッセイ希釈剤（１×ＰＢＳ＋５％ヤギ血清（Ｇｉｂｃｏ Ｂｒｌ）＋０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）で作製した）に添加した。標準血清を、定量化目的で、各アッセイに含ませた。サンプルおよび標準血清を、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０３％ Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次いで、サンプルを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ）の１：４００００希釈とともにインキュベートし、そしてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ−Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）で１５分間発色させ、次いで、２Ｎ ＨＣｌで停止した。各ウェルの最適密度を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０１０８】
（実施例２：ワクシニアウイルス（ＶＶ）−ｇａｇでのチャレンジの前のＳＩＮ−ｇａｇでの粘膜免疫対全身性免疫後のＣＴＬ応答）
粘膜免疫または全身性免疫の種々の経路を介して、局所的ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答および全身性ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を誘導するＳＩＮ−ｇａｇ粒子の能力を、評価した。マウスを、２．５Ｅ１０^６のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いて鼻内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）で、および１０^７のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いて膣内（ＩＶＡＧ）または直腸内（ＩＲ）で免疫し、そして最終免疫の７日後に屠殺した。全身性のｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を決定するために、ＣＬＮ、ＩＬＮ、ＶＵＭおよびＳＰ由来の単一細胞懸濁物を調製し、そしてｇａｇ特異的ＩＦＮ−γ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。ＩＮ免疫後のＣＬＮでの局所的なｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を観察した。逆に、ＩＶＡＧ免疫およびＩＲ免疫後の、ＩＬＮまたはＶＵＭでの局所的なＣＴＬ応答は、観察されなかった（図１）。さらに、ＩＮ免疫およびＩＭ免疫後のＳＰにおける全身性ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答が見られたが、ＩＶＡＧ免疫およびＩＲ免疫後では見られなかった（図２）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＩＦＮ−γ分泌細胞の数として検出されるＣＴＬ応答の溶解性活性を評価するために、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子でのＩＮ免疫後のＣＬＮ細胞およびＳＰ細胞に対して、標準^５１Ｃｒ放出アッセイを行った。ＳＩＮ−ｇａｇでのＩＮ免疫後のＣＬＮおよびＳＰにおける局所的および全身性の溶解性ＣＴＬ活性を、観察した（図３）。よって、ＳＩＮ−ｇａｇでのＩＮまたはＩＭでの免疫は、局所的および全身性ＣＴＬ応答を誘導したが、ＩＶＡＧまたはＩＲでの免疫では誘導しなかった。
【０１０９】
（実施例３：ＶＶ−ｇａｇでのチャレンジ後のＳＩＮ−ｇａｇでの粘膜免疫対全身性免疫後のＣＴＬ応答）
粘膜免疫および全身性免疫ならびに局所チャレンジの後の局所的ＣＴＬ応答および全身性ＣＴＬ応答を、決定した（また、Ｖａｊｄｙら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １８４：１６１３を参照のこと）。マウスを、２．５Ｅ１０^６のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＮまたはＩＭで免疫し、そして最終免疫の１〜３週間後に、ＨＩＶ−１ ｐ５５−ｇａｇを発現する１０^７〜１０^８ｐｆｕのワクシニアウイルス（ＶＶ）を用いてＩＲまたはＩＶＡＧでチャレンジし、そして最終免疫の５日後に屠殺した。以下のコントロールを使用した：ナイーブなマウスの群を、ＩＶＡＧでチャレンジした、ナイーブなマウスの群を、ＩＲでチャレンジした、マウスの群を、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＭ、ＩＮ、ＩＲまたはＩＶＡＧで免疫し、そしてＨＩＶ−１エンべロープｇｐ１６０（ＶＶ−ｅｎｖ）を発現するワクシニアウイルスを用いてＩＶＡＧでチャレンジした。
【０１１０】
ＳＩＮ−ｇａｇでのＩＭ免疫またはＩＮ免疫、およびＶＶ−ｇａｇでの膣内チャレンジの後、局所的、ＣＬＮ、および全身性、ＳＰ、リンパ組織における強力なｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を検出した。重要なことに、強力なＣＴＬ応答をまた、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定されるように、離れた粘膜エフェクター部位（ＶＵＭ）、および離れた誘導性部位（ＩＬＮ）で検出した（図４）。コントロール群は、局所的ＣＴＬ応答も全身性ＣＴＬ応答も示さなかった（図５）。よって、ＳＩＮ−ｇａｇを用いる大腿部筋肉での全身性注射および鼻粘膜への粘膜投与、その後のＶＶ−ｇａｇでの膣内チャレンジは、鼻粘膜の局所的な誘導性部位（ＣＬＮ）のみならず膣内粘膜の離れた誘導性部位（ＩＬＮ）およびエフェクター部位（ＶＵＭ）でもまた強力なＣＴＬ応答を誘導した。さらに、ＳＩＮ−ｇａｇでのＩＮ免疫およびＩＭ免疫の後のＶＶ−ｇａｇでの膣内チャレンジは、強力な全身性ＣＴＬ応答を誘導した。
【０１１１】
局所免疫および局所チャレンジの後の局所的ＣＴＬ応答および全身性ＣＴＬ応答を決定するために、マウスを、１０^７のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＶＡＧまたはＩＲで免疫し、そして１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧでチャレンジした。ＳＩＮ−ｇａｇでのＩＲ免疫およびＶＶ−ｇａｇでのＩＶＡＧチャレンジの後、ＩＬＮおよびＳＰのそれぞれにおける局所的ＣＴＬ応答および全身性ＣＴＬ応答を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定されるように、検出した（図５）。逆に、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧで免疫し、ＶＶ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧでチャレンジしたマウスは、ＩＬＮおよびＶＵＭで局所的に強力なＣＴＬ応答を示したが、ＳＰでは低い全身性ＣＴＬ応答を示した（図５）。コントロール群は、局所的ＣＴＬ応答も全身性ＣＴＬ応答も示さなかった。ＥＬＩＳＰＯＴ技術によって検出されたＣＴＬ応答の溶解活性を確認するために、標準的Ｃｒ放出アッセイを、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＲまたはＩＶＡＧで免疫し、ＶＶ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧでチャレンジしたマウスから単離したＩＬＮおよびＳＰを用いて行い、同様の結果を得た。よって、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子での膣内免疫および直腸免疫は、粘膜エフェクター部位および誘導性部位にて局所的ＣＴＬ応答を誘導する。さらに、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子での直腸（膣ではない）免疫後のＶＶ−ｇａｇでのＩＶＡＧチャレンジは、全身性リンパ組織で強力なＣＴＬ応答を引き起こした。
【０１１２】
（実施例４）
（ＶＶ−ＧＡＧを使用した粘膜チャレンジからの防御）
局所性および全身性のＣＴＬ応答の存在が種々のチャレンジからの粘膜防御と相関があった否かを決定するために、ｇａｇ発現ワクシニアウイルスチャレンジモデルを使用した。ワクシニアは、直腸内、および種々の非経口経路においける接種に続いて卵巣に感染し、そして複製することがこれまで示されてきた。ＳＩＮ−ｇａｇを用いる、ＩＲ、ＩＶＡＧ、ＩＮ，またはＩＭでの免疫の二週間後または三週間後に、全ての群のマウスを、ＩＶＡＧで１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いてチャレンジした。ＶＶ−ｇａｇでのＩＶＡＧチャレンジの５日後、これらのマウスを、屠殺し、そして、ｐｆｕアッセイを、これらの卵巣について実施した。以下のコントロールを使用した：ＩＶＡＧにてチャレンジしたナイーブマウス、ＩＲにてチャレンジしたナイーブマウス、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＭ、ＩＮ、ＩＲ、またはＩＶＡＧで免疫し、そしてＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１６０（ＶＶ−ｅｎｖ）を発現したワクシニアウイルスでＩＶＡＦチャレンジしたマウスの群。
【０１１３】
ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧまたはＩＲで免疫したマウスは、これらの卵巣においてｐｆｕが検出されなかった点で、ＶＶ−ｇａｇを用いるそれぞれＩＶＡＧおよびＩＲでのチャレンジに対して防御された（図６）。さらに、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＮで免疫したマウスおよびＶＶ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧでチャレンジしたマウスは、部分的にのみ防御されていた（図６）。重要なことに、ＩＭで免疫したマウスおよびＩＶＡＧでチャレンジしたマウスは、防御されていなかった（図ＶＩ）。ＶＶ−ｇａｇを用いてＩＲまたはＩＶＡＧでチャレンジしたナイーブマウスは、それらの卵巣において、高い数値のｐｆｕを有した（図６）。さらに、ＳＩＮ−ｇａｇを用いて、ＩＭ、ＩＮ、ＩＲ、またはＩＶＡＧで免疫したマウス、およびＶＶ−ｅｎｖを用いてＩＶＡＧでチャレンジされたマウスはまた、それらの卵巣において高いｐｆｕ力価を有し、そして、この防御が抗原特異的であることを実証した（図ＶＩ）。重要なことに、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＭで免疫したマウスおよびＶＶ−ｇａｇを用いて腹膜でチャレンジしたマウスは、部分的に防御され、そして、ＩＭ免疫によって、粘膜チャレンジに対する防御行われないが、全身性のチャレンジに対していくらかの防御を与えることを実証した（データは示さず）。従って、局所／粘膜性であるが、遠位／粘膜性または全身性ではない免疫によって、このマウスを局所／粘膜性のチャレンジに対して防御した。
【０１１４】
（実施例５）
（シンドビスウイルスに基づくレプリコン粒子で局所免疫した後の、腟粘膜におけるＨＩＶ−１ ＧＡＧ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答および膣ウイルスチャレンジからの防御）
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、各々のワクチンまたは免疫経路について使用し、そして、この組織を、屠殺時にプールした。マウスを、２週間の間隔で種々の経路によって３回免疫し、２〜３週間休止して、１０^７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＶＶ−ｇａｇまたはＶＶ−ｇｐ１６０を使用して、膣内（ＩＶＡＧ）または直腸内（ＩＲ）にてチャレンジした（Ｇａｒｄｎｅｒら （２０００） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４： １１８４９−５７）。 Ｇａｒｄｎｅｒ ら （２０００）， 前出に記載されるように、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子を調製した。鼻腔内（ＩＮ）免疫を、ＰＢＳ中に懸濁される、２５μｌの容量の２．５×１０^６のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を使用して、麻酔なしで実施した。その ＳＩＮ−ｇａｇ粒子およびＶＶ−ｇａｇウイルスを、麻酔したマウスにＩＶＡＧまたはＩＲで、１２．５μｌの容量にて適用し、その後、これらのマウスを、２０分間、背面横臥姿勢（ｄｏｒｓａｌ ｒｅｃｕｍｂｅｎｃｙ）で維持した。筋内（ＩＭ）免疫を、５０μｌの容量の中の２．５ｘ１０^６のＳＩＮ粒子を用いて、大腿筋において実施した。これらのマウスを、組織採取のために、ＶＶチャレンジの５日後に、屠殺した。
【０１１５】
頸部リンパ節（ＣＬＮ）、ＩＬＮ、膣／子宮の粘膜組織（ＶＵＭ）および脾臓（ＳＰ）を、１群当たり５匹のマウスから採取し、そして、プールした。単一細胞懸濁物を、ＨＩＶ−１ ｇａｇ由来のｐ７ｇペプチドに特異的なＩＦＮ−γ−分泌細胞（ＩＦＮＳＣ）を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用した。ＶＶ−ｇａｇを使用して、膣または直腸でのチャレンジの５日後、５匹の免疫したマウスの群の各々に由来する、ＳＰ、ＣＬＮおよびＩＬＮを回収、そしてプールした。ＳＰ、ＣＬＮ、およびＩＬＮの組織を、ポア直径２５０μｍのナイロンメッシュを介して細かく裂き、そして、以下の培地中で３回洗浄した：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ培地：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、計数して、ウェルに播種した１０％ ＦＣＳ、抗生物質、ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン を含有するＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ）。単一細胞懸濁物を、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９８） Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ ６６： ５１４−５２０に記載の方法に基づいてＶＵＭから調製した。この方法によって、慣用的に、５匹のマウス当たり最小１０^７個、最小９０％ 生存の単核細胞（ＭＮＣ）の回収を得た。
【０１１６】
ＨＩＶ−１ ｇａｇ由来のｐ７ｇペプチドは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって認識されることが示されてきた（ＤｏｅおよびＷａｌｋｅｒ（１９９６）ＡＩＤＳ １０： ７９３−９４）。また、ＤＮＡ免疫の後の、ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞のｐ７ｇ特異的ＩＦＮ−γ細胞内サイトカイン染色の後に、ペプチドは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によってのみ認識され、かつ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によっては認識されなかったことが実証された。群毎の５マウスからの、プールされたＶＵＭ、ＩＬＮ、ＣＬＮまたはＳＰに由来する単一細胞懸濁液を調製し、そして、１ｍｌ当たり１０^７〜３×１０^７の濃度に調整した。各細胞調製物からの１００μｌを、９６ウェルニトロセルロースプレートまたはｐｖｄｆプレート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）の第１の列に、二連で添加し、２倍の連続希釈を実行した。３７℃で一晩インキュベートした後に、これらのプレートを、洗浄し、そしてビオチン化した抗ＩＦＮ−γ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を添加した。次いで、これらのプレートを、室温で２時間インキュベートし、そして、洗浄した。次いで、このプレートに、アビジン−ペルオキシダーゼ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を添加し、そして、３７℃で３０分間インキュベートし、そして、洗浄した。これらのプレートを、３０分間、アミノエチルカルバゾール溶液（Ｓｉｇｍａ）で、発色させた。３つの独立した実験の結果を、二連で、１群につき５匹のマウスのプールから最低で４ウェルに由来する１０００万の単核細胞（ＭＮＣ）当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞の平均（±ＳＤ）として提供する。
【０１１７】
（Ａ．ＳＩＮ−ｇａｇを用いた粘膜または全身の免疫の後の、粘膜性および全身性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答、その後の、ワクシニアウイルスｇａｇを用いた膣チャレンジ）
免疫後のウイルスチャレンジは、免疫応答を増強するだけではなく、免疫応答と防御との間の相関関係を得ることを可能にする。従って、マウスを、ＩＮ経路、ＩＭ経路、ＩＲ経路、またはＩＶＡＧ経路を介してＳＩＮ−ｇａｇで初回抗原刺激し、その後、ＶＶ−ｇａｇを使用してチャレンジした。この粘膜および全身のＣＴＬ応答ならびに卵巣におけるＶＶ−ｇａｇ複製からの防御を測定した。ＩＮ、ＩＭ、そして、ＩＶＡＧで免疫したマウスを、ＩＶＡＧでチャレンジしたが、その一方で、ＩＲで免疫したマウスを、ＩＲまたはＩＶＡＧでチャレンジした。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定したときに、ＩＮまたはＩＭで免疫してＩＶＡＧでチャレンジしたマウスのＶＵＭ、ＩＬＮおよびＳＰにおける粘膜および全身のＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の結果を、それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を、いずれの群のＣＬＮにおいても検出し得なかった。これらの応答は、ｇａｇ特異的であった。なぜならば、ＶＶ−ｇａｇを用いた、ナイーブマウスのＩＶＡＧチャレンジまたはＩＲチャレンジ、あるいは、ＶＶ−ｇｐ１６０を使用したＳＩＮ−ｇａｇ免疫したマウスのＩＶＡＧチャレンジまたはＩＲチャレンジは、ＣＤ８^＋細胞応答を誘導しなかったからであるからである。これらのデータによって、ＩＮまたはＩＭで免疫したマウスの膣ＶＶチャレンジによって、ＶＵＭおよびＩＬＮにおけるＣＤ^８＋Ｔ細胞応答が誘導されたことが示される。
【０１１８】
ＳＩＮ−ｇａｇでのＩＲ免疫、その後のＶＶ−ｇａｇを用いるＩＶＡＧチャレンジの後に、最も高いＣＤ８^＋Ｔ細胞応答が、ＩＬＮおよびＳＰにおいて見出され、そして、比較的低い応答がＶＵＭにおいて見出された（図１１Ｃ）。同様に、ＳＩＮ−ｇａｇを使用するＩＶＡＧ免疫、その後のＶ−ｇａｇを用いたＩＶＡＧチャレンジの後に、最も高いＣＤ８^＋Ｔ細胞応答がＩＬＮおよびＳＰにおいて見出され、そして、相対的に低い応答が、ＶＵＭにおいて見出された（図１１Ｄ）。ＩＶＡＧまたはＩＲでの免疫およびチャレンジの後で観察したＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、ＩＮ免疫およびＩＭ免疫の後にＩＶＡＧチャレンジした後で観察されるＣＤ８^＋Ｔ細胞応答と比較して、一般的に１０分の１である。
【０１１９】
（Ｂ．ＳＩＮ−ｇａｇを用いた、粘膜免疫、その後のワクシニアウイルス−ｇａｇを用いた膣チャレンジの後の局所性のウイルス複製からの防御）
ＩＶＡＧまたはＩＲでのウイルスチャレンジ後の、種々の経路を介して初回抗原刺激した、マウスの卵巣におけるワクシニアウイルス複製からの防御をまた、標準的なＰＦＵアッセイを使用して試験した。図１２において示されるように、ＳＩＮ−ｇａｇを使用してＩＭで初回抗原刺激したマウスは、ＶＶ−ｇａｇを使用したＩＶＡＧでのチャレンジから防御されなかった。さらに、ＩＮで初回抗原刺激した１９匹のマウスのうちの５匹は、それらの卵巣においてＶＶ複製の徴候を示さなかった。対照的に、ＶＶ−ｇａｇを用いるＩＶＡＧまたはＩＲのチャレンジの後に、ＳＩＮ−ｇａｇを用いてＩＶＡＧまたはＩＲで免疫したマウスは、ワクシニアウイルス複製がそれらの卵巣において検出されなかったという点で、ＶＶ−ｇａｇを使用したＩＶＡＧ（図１２）およびＩＲでのチャレンジに対して完全に防御された。このコントロールの、ナイーブマウスは、ＶＶ−ｇａｇを用いたＩＲまたはＩＶＡＧでのチャレンジ後に、それらの卵巣において高いレベルのＶＶを有した（図１２）。また、ＳＩＮ−ｇａｇを使用して、ＩＮ、ＩＭ、ＩＶＡＧおよびＩＲで免疫し、そしてＶＶ−ｇｐ１６０を用いてＩＶＡＧでチャレンジしたコントロールマウスは、それらの卵巣において高いレベルのＶＶを有していた（図１２）。これは、この防御がｇａｇ特異的であったことを実証する。従って、ＳＩＮ−ｇａｇレプリコン粒子を使用した、遠位粘膜または全身の免疫ではなく、ＳＩＮ−ｇａｇレプリコン粒子を使用した、局所的粘膜免疫が、膣でのウイルスチャレンジに対する最大の防御を与えた。
【０１２０】
従って、粘膜性のＩＶＡＧまたはＩＲでの免疫は、膣でのウイルスチャレンジに対する防御を与えた。さらに、このデータによって、アルファウイルスに基づくレプリコンが、このような局所性の防御を誘導するために有効な機構を提供することが示される。ＳＩＮ−ｇａｇレプリコン粒子を使用する免疫、ＶＶ−ｇａｇを用いるその後の局所粘膜チャレンジの、遠位粘膜（ＩＮ）経路、局所粘膜（ＩＶＡＧおよびＩＲ）経路および全身（ＩＭ）経路の比較によって、ＩＮおよびＩＭでの免疫経路は、膣粘膜（ＶＵＭ）、排出（ｄｒａｉｎｇ）リンパ節（ＩＬＮ）、およびＳＰにおけるより高いｇａｇ特異的粘膜ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性応答を誘導することが実証された。しかし、ＩＶＡＧおよびＩＲの免疫は、ＶＶ−ｇａｇを用いる、膣でのウイルスチャレンジに対して最大防御を与えた。さらに、これらの応答は、ｇａｇ特異的であった。なぜならば、ＳＩＮ−ｇａｇを用いる免疫、その後のＶＶ−ｇｐ１６０を用いる膣のチャレンジは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を分泌するｇａｇ特異的ＩＦＮ−γのいずれも誘導せず、卵巣におけるＶＶ複製においても何ら影響を与えなかったからである。ＶＶ−ｇａｇを用いる、ナイーブマウスのＩＶＡＧチャレンジはまた、検出可能なｇａｇ特異的ＩＦＮ−γＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答のいずれも誘導しなかった。従って、ＩＦＮ−γＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答の誘導は、ｇａｇ特異的であり、そして、ＳＩＮ−ｇａｇ免疫に続く、適応性特異的応答、その後のの結果として存在した。ＶＶ−ｇａｇチャレンジはまた、以下の事実に示されるように、体液性応答によって媒介されなかった：（ＳＩＮ−ｇａｇレプリコンを使用する、粘膜免疫の２週間後、ＥＬＩＳＡによって測定されるような）ｇａｇ特異的血清力価は、検出不能な抗ｇａｇ血清であった。従って、この観察された防御は、ｇａｇ特異的Ｔ細胞媒介性応答の結果であった。
【０１２１】
要約すると、これらの結果によって、このＳＩＮレプリコン送達システムを、ＨＩＶに対する、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答および防御免疫を誘導するために粘膜的に適用し得ることが実証される。これらの結果は、一般的に性交感染症病原体についての重要な理解、ならびに、子宮頸部癌、結腸癌、および肺癌に対する治療遺伝子療法についての重要な理解を有する。
【０１２２】
（実施例６）
（局所性および全身性のリンパ組織におけるＨＩＶ−１ ＧＡＧを発現する細胞の同定）
粘膜免疫の後に、局所性リンパ組織および全身性リンパ組織においてＳＩＮ−ｇａｇ粒子の取り込みおよび発現に関連する細胞を、単回用量のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を使用して、マウスをＩＮで免疫することにより同定した。鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、ＣＬＮおよびＳＰ由来の凍結切片を、ｇａｇに対する抗体を使用して染色した。免疫後第１日目で、ＮＡＬＴ（図９）およびＣＬＮ（図１０）にて局所的に、ならびに、ＳＰ（図１１）において全身的にの両方で、ｇａｇを発現する多くの細胞を見出したが、圧倒的に殆どの細胞が、ＳＰに局在しているようであった。ｇａｇを発現する細胞を同定するために、細胞は、ＡＰＣ活性を有する単球系統細胞に対するマーカーとしてのＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｃと、Ｂ細胞についてのマーカーとしてのＢ２２０とを用いて、二重に染色した。大部分のｇａｇ発現細胞は、ＣＤ１１ｂを同時発現したが、その一方、僅かなgag発現細胞のみが、CD１１ｃを同時発現した。重要なことには、B２２０^＋細胞は、ｇａｇと同時発現せず、そして、このＣＤ１１ｂ^＋またはＣＤ１１ｃ^＋のｇａｇ発現細胞は、濾胞外（ｅｘｔｒａ−ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）Ｔ細胞領域に存在した。従って、免疫おける、それに続く、初期時点において、ＣＤ１１ｂ^＋細胞は、局所リンパ組織および全身性リンパ組織の両方でｇａｇを発現するＡＰＣ能力を有する主要な細胞である。
【０１２３】
（実施例７）
（鼻腔内免疫後の血清中の体液性応答）
ＳＩＮレプリコンが抗体産生を誘導する能力がまた、決定された。
【０１２４】
（Ａ．ＨＩＶ由来抗原）
ｇａｇを発現するＳＩＮレプリコンを使用した、３回のＩＮ免疫の２週間後に、血清力価を、ＥＬＩＳＡによって測定した（図１２）。さらに、初回抗原刺激−追加免疫実験を実施した。第１に、ＳＩＮ−ｇａｇを使用する３回のＩＮ免疫の後に、マウスを、ＩＮで、４週間の間隔にて３回、ｐ２４＋ＬＴＫ６３を使用して追加免疫した。さらに、動物を、ＨＩＶエンベロープｇｐ１４０を発現するＳＩＮを使用して初回抗原刺激し、そして、Ｏｇｐ１４０＋粘膜アジュバントＬＴＲ７２およびＣｐＧを使用して追加免疫する実験を実施した。これらの特定の場合において、低レベルまたはのゼロレベルの抗体力価が観察され（図１０）、これは、ｇａｇを使用する膣または直腸での免疫の後に観察された防御が抗体媒介性でないことを示した。
【０１２５】
（Ｂ．インフルエンザ由来抗原）
インフルエンザポリペプチド（ＨＡ）を発現するＳＩＮレプリコンを使用する、１以上の粘膜（例えば、ＩＮ、ＩＶＡＧ、ＩＲ）免疫の２週間後に、血清力価を、ＥＬＩＳＡによって測定する。さらに、初回抗原刺激−追加免疫実験を実施する。第１に、ＳＩＮ−ＨＡマウスを用いた、粘膜免疫の後に、マウスを、ＨＡ＋ＬＴＫ６３を使用して１回以上粘膜で追加免疫する。さらに、動物を、ＨＡ抗原を発現するＳＩＮを使用して初回抗原刺激し、そして、ＨＡポリペプチド＋粘膜アジュバントＬＴＲ７２およびＣｐＧを使用して追加免疫する実験を実施する。粘膜に投与されたときに、ＳＩＮ−ＨＡレプリコンが、抗体産生を誘導する。
【０１２６】
（実施例８）
（アルファウイルスレプリコン粒子キメラの粘膜送達の後の免疫応答の誘導）
粘膜送達後の抗原特異的な免疫応答を誘導するためのアルファウイルスレプリコン粒子キメラの能力を実証するために、上記の実験と類似の鼻腔内免疫実験を実施した。具体的には、ＳＩＮとＶＥＥとの間のレプリコン粒子キメラを、米国特許出願第６０／２９５，４５１号に記述されたように、構築し、その結果、ＳＩＮレプリコンＲＮＡを、ＶＥＥエンベロープ糖タンパク質中に、組み込むか（ＳＩＮ／ＶＥＥ）、または、ＶＥＥレプリコンＲＮＡを、ＳＩＮエンベロープ糖タンパク質に組み込む（ＶＥＥ／ＳＩＮ）ことをした。ＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇ抗原をコードするこれらのレプリコン粒子、ならびに、また同じＨＩＶ ｇａｇ抗原をコードするＳＩＮレプリコン粒子およびＶＥＥレプリコン粒子はまた、鼻腔内でマウスを免疫するのに使用した。
【０１２７】
これらのレプリコン粒子を、第０日、第１４日、および第２８日の免疫スケジュールで、２５μｌ中の２．５×１０^６粒子の用量にて３回投与した。最終免疫の後の第２週間目において、脾臓を取出し、ｇａｇ特異的細胞応答を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。図１３において示されているように、これらのレプリコン粒子調製物の各々は、免疫原性においていくつかの変更を有する、ｇａｇ特異的応答を誘導した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定した、ｇａｇ発現ＳＩＮレプリコン粒子を用いて鼻腔内免疫した後の頸部リンパ節における局所性ＨＩＶ−１ ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を示すグラフである。「−−◆−−」は、ＳＩＮ ＤＣ＋動物の第１の群を示し；
【化１】

は、ＳＩＮ ＤＣ＋動物の第２の群を示し；「−−□−−」は、ＳＩＮ ＤＣ−を示し；そして「−−◆−−」は、筋内送達されたコントロールプラスミド（ＣＭＶプロモーターを用いて）を示す。
【図２】図２は、^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定した、ＳＩＮレプリコン粒子を用いて鼻腔内免疫した後の脾臓における全身性ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を示すグラフである。「−−◆−−」は、ＳＩＮ ＤＣ＋動物の第１の群を示し；
【化２】

は、ＳＩＮ ＤＣ＋動物の第２の群を示し；「−−□−−」は、ＳＩＮ ＤＣ−動物を示し；そして「−−●−−」は、筋内送達されたコントロールプラスミド（ＣＭＶプロモーターを用いて）を示す。
【図３】図３は、ＳＩＮ粒子を用いた鼻腔免疫後の局所性リンパ組織および末梢リンパ組織における、ＩＮＦ−γ分泌細胞の数を示すグラフである。
【図４】図４は、^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定した、ＳＩＮレプリコン粒子の直腸内（ＩＲ）投与または膣内（ＩＶＡＧ）投与後の直腸粘膜および膣粘膜に流れる腸骨リンパ節における、局所性ＨＩＶ−１ ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を示すグラフである。「−−◆−−」は、ＳＩＮの直腸内投与、続くワクシニアウイルス（ＶＶ）での直腸内（ＩＲ）チャレンジ後の、第１群における応答を示し；
【化３】

は、ＳＩＮの膣内投与、続くＶＶでの膣内チャレンジを示し；「−▲−」は、ＳＩＮのＩＲ投与、続くＶＶでのチャレンジ後の、第２の群における応答を示し；そして「−Ｘ−」は、筋内送達されたコントロールプラスミド（ＣＭＶプロモーターを用いて）を示す。
【図５】図５は、^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定した、ＳＩＮレプリコン粒子の直腸内（ＩＲ）投与または膣内（ＩＶＡＧ）投与後の脾臓における、全身性ＨＩＶ−１ ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答を示すグラフである。「−−◆−−」は、ＳＩＮレプリコンの直腸内投与、続くワクシニアウイルス（ＶＶ）での直腸内チャレンジ後の、第１の動物群における応答を示し；
【化４】

は、ＳＩＮの膣内投与、続くＶＶでの膣内チャレンジを示し；
【化５】

は、免疫なしでＶＶで膣内チャレンジした動物を示し；
【化６】

は、ＳＩＮレプリコンの直腸内投与、続くＳＩＮレプリコンの直腸内投与後の、動物における応答を示し；「−●−」は、ＳＩＮレプリコンの膣内投与、続くＳＩＮレプリコンの膣内投与後の、動物における応答を示し；
【化７】

は、ＳＩＮレプリコンの鼻腔投与、続くＳＩＮレプリコンの膣内投与後の、動物における応答を示す。
【図６】図６は、ＳＩＮ粒子を用いた直腸内（ＩＲ）免疫および膣内（ＩＶＡＧ）免疫、ならびにワクシニアウイルス（ＶＶ）でのＩＲチャレンジおよびＩＶＡＧチャレンジ後の、脾臓組織におけるＩＦＮ−γ分泌細胞を示すグラフである。
【図７】図７は、ＳＩＮ粒子を用いた直腸内（ＩＲ）免疫および膣内（ＩＶＡＧ）免疫、ならびにワクシニアウイルス（ＶＶ）でのＩＲチャレンジおよびＩＶＡＧチャレンジ後の、腸骨リンパ節におけるＩＦＮ−γ分泌細胞を示すグラフである。
【図８】図８は、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子の膣送達および直腸送達後の、ワクシニアウイルス（ＶＶ）力価を示すグラフである。
【図９】図９は、ｇａｇ特異的血清力価を示すグラフである。左から右に、バーは、動物の力価を示す：ＳＩＮ−ｇａｇで初回免疫、および追加免疫なし；ＳＩＮ−ｇａｇで初回免疫、ならびにｐ２４ポリペプチドおよびＬＴＫ６３アジュバントを用いて追加免疫；ナイーブな動物；ならびに、初回免疫なしだが、ｐ２４およびＬＴＫ６３アジュバントを用いて引続く追加免疫。
【図１０】図１０は、ｇｐ１２０特異的血清力価を示すグラフである。左から右に、バーは、動物の力価を示す：ＳＩＮ−ｇｐ１４０で初回免疫、および追加免疫なし；ＳＩＮ−ｇａｇで初回免疫、ならびにｇｐ１４０ポリペプチドおよびＬＴＫ７２アジュバントおよびＣｐＧを用いて追加免疫；ナイーブな動物；ならびに、初回免疫なしだが、ｇｐ１４０ポリペプチドおよびＬＴＫ７２アジュバントおよびＣｐＧを用いて引続く追加免疫。
【図１１Ａ】図１１（パネルＡ〜Ｄ）は、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いたＩＮ（Ａ）免疫、ＩＭ（Ｂ）免疫、ＩＲ（Ｃ）免疫およびＩＶＡＧ（Ｄ）免疫、続くＶＶ−ｇａｇを用いたＩＶＡＧチャレンジ後の、局所性細胞性免疫応答および全身性細胞性免疫応答の誘導を示すグラフである。ＩＮ免疫およびＩＭ免疫は、ＩＲ免疫およびＩＶＡＧ免疫と比較して、ＶＵＭおよびＩＬＮにおいて、数倍高いｇａｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞を誘導した。マウスを、２．５×１０^６個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＮまたはＩＭで、ならびに１０^７個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＲまたはＩＶＡＧで３回免疫し、３週間後、これらを、１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いて膣内チャレンジし、５日後に屠殺した。結果を、３回の独立した実験の１０００万個の単核細胞（ＭＮＣ）当たりのｐ７ｇ特異的ＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数 ± ＳＤとして示す。
【図１１Ｂ】図１１（パネルＡ〜Ｄ）は、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いたＩＮ（Ａ）免疫、ＩＭ（Ｂ）免疫、ＩＲ（Ｃ）免疫およびＩＶＡＧ（Ｄ）免疫、続くＶＶ−ｇａｇを用いたＩＶＡＧチャレンジ後の、局所性細胞性免疫応答および全身性細胞性免疫応答の誘導を示すグラフである。ＩＮ免疫およびＩＭ免疫は、ＩＲ免疫およびＩＶＡＧ免疫と比較して、ＶＵＭおよびＩＬＮにおいて、数倍高いｇａｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞を誘導した。マウスを、２．５×１０^６個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＮまたはＩＭで、ならびに１０^７個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＲまたはＩＶＡＧで３回免疫し、３週間後、これらを、１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いて膣内チャレンジし、５日後に屠殺した。結果を、３回の独立した実験の１０００万個の単核細胞（ＭＮＣ）当たりのｐ７ｇ特異的ＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数 ± ＳＤとして示す。
【図１１Ｃ】図１１（パネルＡ〜Ｄ）は、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いたＩＮ（Ａ）免疫、ＩＭ（Ｂ）免疫、ＩＲ（Ｃ）免疫およびＩＶＡＧ（Ｄ）免疫、続くＶＶ−ｇａｇを用いたＩＶＡＧチャレンジ後の、局所性細胞性免疫応答および全身性細胞性免疫応答の誘導を示すグラフである。ＩＮ免疫およびＩＭ免疫は、ＩＲ免疫およびＩＶＡＧ免疫と比較して、ＶＵＭおよびＩＬＮにおいて、数倍高いｇａｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞を誘導した。マウスを、２．５×１０^６個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＮまたはＩＭで、ならびに１０^７個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＲまたはＩＶＡＧで３回免疫し、３週間後、これらを、１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いて膣内チャレンジし、５日後に屠殺した。結果を、３回の独立した実験の１０００万個の単核細胞（ＭＮＣ）当たりのｐ７ｇ特異的ＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数 ± ＳＤとして示す。
【図１１Ｄ】図１１（パネルＡ〜Ｄ）は、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いたＩＮ（Ａ）免疫、ＩＭ（Ｂ）免疫、ＩＲ（Ｃ）免疫およびＩＶＡＧ（Ｄ）免疫、続くＶＶ−ｇａｇを用いたＩＶＡＧチャレンジ後の、局所性細胞性免疫応答および全身性細胞性免疫応答の誘導を示すグラフである。ＩＮ免疫およびＩＭ免疫は、ＩＲ免疫およびＩＶＡＧ免疫と比較して、ＶＵＭおよびＩＬＮにおいて、数倍高いｇａｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞を誘導した。マウスを、２．５×１０^６個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＮまたはＩＭで、ならびに１０^７個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＲまたはＩＶＡＧで３回免疫し、３週間後、これらを、１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いて膣内チャレンジし、５日後に屠殺した。結果を、３回の独立した実験の１０００万個の単核細胞（ＭＮＣ）当たりのｐ７ｇ特異的ＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数 ± ＳＤとして示す。
【図１２】図１２は、ＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いた膣免疫または直腸免疫後の、ＶＶ−ｇａｇを用いた膣チャレンジからの卵巣の保護を示す。マウスを、２．５×１０^６個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＮまたはＩＭで、ならびに１０^７個のＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いてＩＲまたはＩＶＡＧで３回免疫し、３週間後、１０^７ｐｆｕのＶＶ−ｇａｇを用いて膣内チャレンジし、５日後に屠殺した。卵巣を収集し、そしてＶＶ力価の決定のための標準的なｐｆｕアッセイを実行した。各点は、プラーク形成単位の数／卵巣／各動物を示す。コントロールとしてのナイーブマウスを、ＶＶ−ｇａｇを用いてチャレンジし、そしてＳＩＮ−ｇａｇ粒子を用いて免疫したマウスを、ＶＶ−ｇｐ１６０を用いてチャレンジし、そして両方の場合において、高いｐｆｕ力価が卵巣において明らかであった。
【図１３】図１３は、アルファウイルスベクター粒子を用いた鼻腔免疫後の免疫学的応答（ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定）の誘導を示すグラフである。棒グラフによって示される実際の数は、以下の通りである：ＳＩＮ−ｇａｇレプリコン粒子は、１１５４（±４９９）を与えた；ＶＥＥ−ｇａｇレプリコン粒子は、１５３０（±４２５）を与えた；ＳＩＮ／ＶＥＥ−ｇａｇは１４０（±１４０）を与え；そしてＶＥＥ／ＳＩＮ−ｇａｇは２５８６（±７６２）を与えた。

Claims (40)

1. 被験体における免疫応答を生成する方法であって、該方法は、少なくとも１つの第１の抗原またはその改変形態をコードするポリヌクレオチドを含む第１の複製欠損遺伝子送達ビヒクルを標的細胞に粘膜投与する工程を包含し、該第１の抗原またはその改変形態が、粘膜に投与されたとき、該被験体における免疫応答を刺激し得る、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記粘膜投与が鼻腔内投与である、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、前記粘膜投与が直腸内投与である、方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、前記粘膜投与が腟内投与である、方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの抗原が、性感染病原体に由来する、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記性感染病原体が細菌である、方法。
7. 請求項６に記載の方法であって、前記細菌が、淋病菌、クラミジアおよび梅毒からなる群より選択される、方法。
8. 請求項５に記載の方法であって、前記性感染病原体がウイルスである、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、およびＨＰＶからなる群より選択される、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記ウイルスがＨＩＶ−１である、方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子送達ビヒクルが、非ウイルスベクターである、方法。
12. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、特定のキャリアを使用して送達される、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、金粒子またはタングステン粒子でコーティングされ、該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用して前記被験体に送達される、方法。
14. 請求項１２に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、リポソーム調製物中にカプセル化される、方法。
15. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子送達ビヒクルが、ウイルスベクターである、方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、方法。
17. 請求項１５に記載の方法であって、前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、方法。
18. 請求項１５に記載の方法であって、前記ウイルスベクターがポックスウイルスベクターである、方法。
19. 請求項１５に記載の方法であって、前記ウイルスベクターがピコルナウイルスベクターである、方法。
20. 請求項１５に記載の方法であって、前記ウイルスベクターがアルファウイルスベクターである、方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、前記アルファウイルスベクターが、シンドビスベクターである、方法。
22. 請求項２０に記載の方法であって、前記アルファウイルスベクターが、セムリキ森林ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、およびロスリバーウイルスベクターからなる群より選択される、方法。
23. 請求項２０に記載の方法であって、前記アルファウイルスベクターが、２以上のアルファウイルス由来の配列を含む、方法。
24. 請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、前記被験体が哺乳動物である、方法。
25. 請求項２４に記載の方法であって、前記哺乳動物がヒトである、方法。
26. 請求項２０に記載の方法であって、前記アルファウイルスベクターが、抗原提示細胞に送達される、方法。
27. 請求項２６に記載の方法であって、前記抗原提示細胞が樹状細胞である、方法。
28. 請求項２７に記載の方法であって、前記樹状細胞がヒト樹状細胞である、方法。
29. 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、前記標的細胞が、インビボでの感染細胞である、方法。
30. 請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＬＡクラスＩ拘束免疫応答を誘発する、方法。
31. 請求項３０に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＬＡクラスＩＩ拘束免疫応答をさらに誘発する、方法。
32. 請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、標的細胞に投与する工程の前または後に、クラスＩ ＭＨＣタンパク質もしくはクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質、またはこれらの組み合わせ、またはＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、またはそれらのアナログからなる群より選択されるタンパク質のいずれかをコードする核酸分子を、標的細胞に導入する工程を包含する、方法。
33. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも１つの第２の遺伝子送達ビヒクルを投与する工程をさらに包含し、該第２の遺伝子送達ビヒクルが、少なくとも１つの第２の抗原もしくはその改変形態または免疫調節因子をコードするポリヌクレオチドを含む、方法。
34. 請求項３３に記載の方法であって、前記第２の遺伝子送達ビヒクルが、粘膜投与される、方法。
35. 請求項３３に記載の方法であって、前記第２の遺伝子送達ビヒクルが、非粘膜的に投与される、方法。
36. 請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法であって、１以上のポリペプチドを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、方法。
37. 請求項３６に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つの第２の抗原またはその改変形態を含む、方法。
38. 請求項３６に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、免疫調節因子を含む、方法。
39. 請求項３６に記載の方法であって、前記少なくとも１つのポリペプチドが、粘膜投与される、方法。
40. 請求項３６に記載の方法であって、前記少なくとも１つのポリペプチドが、非粘膜的に投与される、方法。

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