JPH07298877A - 組換えアデノウイルスおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】アデノウイルスゲノムが、外来の目的ポリペプ
チド配列をコードしているヌクレオチド配列、並びにこ
の配列の発現を制御するサイトメガロウイルスエンハン
サー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグ
ロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列
からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）を有することを特徴とする組換えアデノウイルス、
その製造方法、並びにその遺伝子治療への使用。 【効果】本発明により、広範な動物細胞において遺伝子
発現の可能な組換えアデノウイルスを提供することがで
きる。また、本発明はこの組換えアデノウイルスの簡易
な製造方法を提供する。さらに本発明の組換えアデノウ
イルスは遺伝子病の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイトメガロウイルス
エンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウ
サギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポ
リＡ配列とからなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ
プロモーター）と所定のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含む組換えアデノウイルス、その製造方法並び
にこれらの使用、特に遺伝子治療への使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】アデノウイルスベクターは、種々の動物
培養細胞で１００％近い導入効率を示すことから、外来
遺伝子導入実験のベクターとして研究されてきた。また
導入細胞を死滅させずに外来遺伝子の機能を調べること
ができることや、利用できる動物種がマウス・ラットを
含む広い範囲にわたっていることからもその有用性が認
められていた。しかし、真にアデノウイルスベクターの
価値が認められるようになったのは、１９９２年に嚢胞
性繊維症の遺伝子治療の方法として米国で患者への治療
が始められたことや（Nature Genetics,VOL.3.1-2, 199
3)、１９９３年に、神経系への発現法として有用である
ことが示されるなどの報告が相次ぎ（Science,VOL.259,
988-990, 1993, Nature Genet.VOL.3, 219-223, 1993,
ibid,VOL.3, 224-228,1993, ibid,VOL.3, 229-234, 199
3,) 、遺伝子治療への応用の可能性が示されてからであ
る。こうして今日では、アデノウイルス発現ベクター
は、神経系を含む多くの分化、未分化細胞に１００％近
い導入効率を示すだけでなく、動物個体への直接注入・
投与による遺伝子発現が可能であることが示され、遺伝
子治療への応用が期待されるに至っている。

【０００３】これまで、遺伝子導入のためのウイルスベ
クターとしては、レトロウイルスがよく用いられてきた
が、このウイルスは分裂している細胞にしか導入できな
いことや宿主細胞の染色体に組み込まれてしまうことか
ら、特に遺伝子治療においてはその安全性の観点で問題
があると考えられ、その応用範囲は狭いと考えられてい
る。アデノウイルスはレトロウイルスと異なって、積極
的な染色体組み込みの機構を持たず、休止期の細胞でも
遺伝子導入できるという利点もあり、応用範囲は極めて
広く、近い将来は遺伝子治療の主要技術として確立する
であろうと思われる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】アデノウイルスはもと
もとヒトでカゼ症状を引き起こすことが知られている。
そのため大量の投与はそれに起因する炎症等を引き起こ
すことが懸念される。実際、Ｃｒｙｓｔａｌらのグルー
プは、患者への治療の最初の段階で、高濃度で肺へ投与
した患者で肺の炎症が起こり、計画が一時中断したと伝
えられている。培養細胞を用いた実験でも高濃度のウイ
ルスを感染させると、細胞が丸くなり浮き出すなどの、
ウイルス粒子による直接の副反応が観察される。従って
実際の遺伝子治療では高濃度ウイルス液の投与による副
作用が懸念されるので、低濃度のウイルス液で十分な発
現量を確保できるような高発現プロモーターとの組み合
わせが是非とも必要であり、これが遺伝子治療にアデノ
ウイルスを適用する際の問題解決につながると考えられ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】遺伝子組換え技術の進歩
に伴って、遺伝子組換えを利用した有用物質の生産は近
年急速に進歩してきている。遺伝子組換え技術を利用し
て外来遺伝子を発現させる場合には、適当な宿主細胞
と、これに応じた外来遺伝子発現用プロモーターを有す
る発現ベクターが用いられる。これまで知られている動
物細胞を宿主とした発現系としては、多くの動物ウイル
ス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺伝子プロモータ
ーを用いた系が報告されている。前者として、ＳＶ４０
初期遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝
子プロモーター等があり、また、後者の例としては、チ
ミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン
遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモータ
ー等がある。しかしこれらのプロモーター活性の測定
は、分裂の盛んな株化細胞であって、かつリン酸カルシ
ウム法、DEAE-dextran法、electroporation 法等による
遺伝子導入率の高い細胞、例えばマウス由来Ｌ細胞、ハ
ムスター由来ＣＨＯ細胞やアフリカミドリザル由来ＣＯ
Ｓ細胞に限って行われてきた。そのため分化した細胞で
はこのような検討はされていない。遺伝子治療への応用
を考えるとき、分化した細胞、例えば神経細胞や筋肉細
胞、肝臓細胞、血液細胞での発現が重要である。

【０００６】本発明者等は、従来、遺伝子導入にほとん
ど利用されてこなかったアデノウイルスが広く休止期の
細胞に感染しうることに着目し、アデノウイルスゲノム
に強力なプロモーターを組み込むことにより広範な動物
細胞において遺伝子発現をさせることが可能となるので
はないかと考え、各種の強力なプロモーターを組み込ん
だ組み換えアデノウイルスを調製し、幅広い宿主細胞を
用いて検討したところ、ほとんど全ての細胞において強
力なプロモーター活性を示すアデノウイルスを取得する
ことに成功した。本発明は、かかる事実に基づき更に研
究を進めて完成するに至ったものである。本発明の目的
は、広範な動物細胞において強力な活性を示すプロモー
ターを組み込んだ組換えアデノウイルス、特にかかる組
換えアデノウイルスに外来の目的ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を組み込んだ組換えアデノウイル
ス、中でもヒト欠損遺伝子を組み込んだ遺伝子治療用の
組換えアデノウイルスを提供することにある。本発明の
他の目的は、かかる組換えアデノウイルスの簡易な製造
方法を提供することにある。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１） ア
デノウイルスゲノムが、外来の目的ポリペプチド配列を
コードしているヌクレオチド配列、並びにこの配列の発
現を制御するサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワ
トリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのス
プライシングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハ
イブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）、を有
することを特徴とする組換えアデノウイルス、（２）
アデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含む
１．３％から９．３％断片を欠失していることを特徴と
する（１）記載の組換えアデノウイルス、（３）
Ｅ１Ａ遺伝子領域を含む１．３％から９．３％断片を
欠失している部位に、外来の目的ポリペプチド配列をコ
ードしているヌクレオチド配列およびＣＡＧプロモータ
ーが挿入されていることを特徴とする（２）記載の組換
えアデノウイルス、（４） アデノウイルスゲノ
ムがさらにＥ３遺伝子領域を含む７９．６％から８４．
８％断片を欠失していることを特徴とする（２）又は
（３）記載の組換えアデノウイルス、（５） 外
来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチ
ド配列およびＣＡＧプロモーターが左向きにアデノウイ
ルスゲノムに組み込まれていることを特徴とする（１）
から（４）いずれかに記載の組換えアデノウイルス、
（６） 外来の目的ポリペプチド配列をコードし
ているヌクレオチド配列が天然の宿主細胞内でのＣＡＧ
プロモーターの制御下で発現されたとき、該宿主細胞の
培地中に分泌されるポリペプチドをコードしていること
を特徴とする（１）から（５）いずれかに記載の組換え
アデノウイルス、（７） ＣＡＧプロモーターを
もつ遺伝子治療用の組換えアデノウイルス、（８）
外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌク
レオチド配列およびプロモーターが左向きにアデノウイ
ルスゲノムに組み込まれている組換えアデノウイルス、
（９） アデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領
域の少なくとも１．３％から９．３％断片を欠失してい
ることを特徴とする（８）記載の組換えアデノウイル
ス、（１０） Ｅ１Ａ遺伝子領域の少なくとも１．
３％から９．３％断片を欠失している部位に、外来の目
的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列
およびプロモーターが挿入されていることを特徴とする
（９）記載の組換えアデノウイルス、（１１） ア
デノウイルスゲノムがＥ３遺伝子領域の少なくとも７
９．６％から８４．８％断片を欠失していることを特徴
とする（１０）記載の組換えアデノウイルス、（１２）
アデノウイルスゲノムからＥ１Ａ遺伝子領域の少
なくとも１．３％から９．３％断片を欠失させ欠失部に
発現ユニットを組み込んだ発現コスミドと、アデノウイ
ルスゲノムのＥ１遺伝子領域側の末端を３ヶ所から１０
ヶ所で切断できる制限酵素で切断したアデノウイルスＤ
ＮＡ−末端蛋白複合体とを混合して、Ｅ１Ａ遺伝子を発
現している細胞株へトランスフェクションを行うことを
特徴とする、発現ユニットをゲノム中に組み込んだ組み
換えアデノウイルスの製造方法、（１３） Ｅ１Ａ
遺伝子を発現している細胞株がヒト胎児腎由来細胞株で
ある（１２）記載の方法、（１４） 発現ユニット
が、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−
アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシ
ングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリッ
ドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）、並びに細胞系
内で発現させようとする外来の目的ポリペプチド配列を
コードしているヌクレオチド配列からなり、該ヌクレオ
チド配列を該プロモーターの制御下に発現できる状態で
含有しているものである（１２）記載の方法、（１５）
アデノウイルスゲノムのＥ１遺伝子領域側の末端
を３ヶ所から１０ヶ所で切断できる制限酵素が、Ｅｃｏ
Ｔ２２Ｉまたはこれと認識配列が同一なＮｓｉＩ、Ａｖ
ａIII である（１２）記載の方法、（１６） 発現
ユニットがゲノム中に左向きに組み込まれた（１２）記
載の方法、並びに（１７） 発現コスミド中のアデ
ノウイルスゲノムおよびアデノウイルスＤＮＡ−末端蛋
白複合体中のアデノウイルスゲノムが、Ｅ３遺伝子領域
の少なくとも７９．６％から８４．８％断片を欠失して
いる（１２）記載の方法、に関する。

【０００８】以下に本発明について詳細に説明する。本
発明に使用されるヒトアデノウイルスは、ヒトを自然宿
主とするウイルスである。アデノウイルスゲノムは、約
３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡであって、ＤＮＡ鎖両端
にはおよそ１００ｂｐからなる逆方向反復塩基配列があ
り、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端にはＥ２Ｂ遺伝子産物
が切断加工された５５ｋのタンパク質が共有結合してい
るという特異な構造をしている。この特異なゲノム構造
がアデノウイルスをベクターとして使用する場合に大き
な障害となってきたことについては以下に述べるとおり
であり、本発明の核心は、かかる障害を克服して完成さ
れた新規かつ有用な組換えアデノウイルス並びにその製
造方法を提供する点にある。

【０００９】本発明の組換えアデノウイルスは、アデノ
ウイルスに感染し得る真核生物細胞系、特にヒトまたは
動物の細胞系の形質転換用に好適な一種の組換えベクタ
ーであって、Ｅ１遺伝子領域、特に細胞ガン化に関与す
るＥ１Ａ遺伝子領域を欠失しており、したがってＥ１
Ａ、さらにはＥ１Ｂ遺伝子を持続的に発現している細
胞、たとえばヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）を除
き、宿主細胞内で増殖することができないという特徴を
有する。

【００１０】本発明の組換えアデノウイルス粒子は、上
記の２９３細胞に接種すると野性株同様に１０⁸ 〜１０
⁹ ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌの高力価になるま
で増殖する。しかし、他の細胞や動物組織に接種する
と、このウイルス粒子は細胞内へ高率に侵入し、ウイル
スゲノムが核内へ注入されるものの、Ｅ１Ａ遺伝子領域
が欠失しているため、この遺伝子産物により転写活性化
される他のすべてのアデノウイルスプロモーターは働く
ことができない。一方、このアデノウイルスゲノム中の
目的遺伝子は、ゲノムに組み込まれた外来のプロモータ
ーから転写され発現することができる。従って、本発明
の組換えアデノウイルス粒子を使用すれば、ベクターと
してのアデノウイルスゲノムの影響を最小限に抑えて、
広範な動物細胞中で目的遺伝子を発現させることができ
る。

【００１１】野性株のヒトアデノウイルスが感染後増殖
できる細胞はほとんどヒト細胞に限られているにもかか
わらず、本発明の組換えアデノウイルスで発現可能な細
胞種・組織は、はるかに広い範囲にわたる。これは、本
来のアデノウイルスが増殖できない細胞でも、本発明の
組換えアデノウイルスの場合はウイルス粒子が感染・侵
入さえできれば発現ベクターとして充分に機能し得るか
らである。なお、本発明の組換えアデノウイルスのゲノ
ムは、染色体外の状態では複製しないにもかかわらず、
２週間〜２ヶ月にもわたって核内に存在し、目的遺伝子
の発現がかなり持続する点もベクターとして有利であ
る。

【００１２】本発明の組換えアデノウイルスのゲノム
は、その中にサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワ
トリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのス
プライシングアクセプターおよびウサギβグロビン由来
のポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡ
Ｇプロモーター）が組み込まれているという特徴を有す
る。このハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）は、高発現ベクターとして特開平３−１６８０８７
号公報に開示されており、その調製は同公報に記載され
ているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−１６８０８７、１３頁
２０行〜２０頁１４行および２２頁１行〜２５頁６行）
から制限酵素ＳａｌＩ，ＨｉｎｄIII で切り出すことに
より行うことができ、本発明に利用することができる。
本発明者等は、高発現プロモーターといわれている幾つ
かのプロモーターを組換えアデノウイルス上で用い、ｌ
ａｃＺ遺伝子の発現量を比較したところ上記のハイブリ
ッドプロモーターが優れていることを認め（比較例）、
これを本発明のアデノウイルスに組み込むことにしたも
のである。このハイブリッドプロモーターの組み込みに
より、組換えアデノウイルスを用いる治療において高濃
度ウイルス液を使用した際にみられる感染ヒト細胞に対
する副作用を軽減することが可能となる。発現量が大き
いため、低濃度のウイルス液の使用で充分だからであ
る。

【００１３】本発明のアデノウイルスのゲノムに組み込
まれる外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌ
クレオチド配列としては、上記のハイブリッドプロモー
ター（ＣＡＧプロモーター）により発現することができ
るヌクレオチド配列であれば、特に限定されるものでは
ないが、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応す
る正常遺伝子の配列、インターロイキン類やインターフ
ェロン類等のサイトカイン類をコードするＤＮＡ配列、
ガン抑制遺伝子の配列、ガン遺伝子のアンチセンス配列
等が特に好ましい。またＬａｃＺ遺伝子もβーガラクト
シダーゼを発現するので、ラクトース非消化性疾患に有
用である。このように、本発明の組換えアデノウイルス
に組み込まれた、外来の目的ポリペプチド配列をコード
しているヌクレオチド配列は、天然の宿主細胞内でのＣ
ＡＧプロモーターの制御下に発現され、該宿主細胞の培
地中にそれがコードしているポリペプチドを分泌するこ
とを特徴とする。

【００１４】本発明のアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１
遺伝子領域特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失している。これ
は、アデノウイルスの細胞ガン化活性に関与するＥ１Ａ
遺伝子領域を欠失させることにより、アデノウイルスを
無毒化し、ゲノム中に組み込んだ外来のヌクレオチド配
列のみを発現させるためである。必ずしもＥ１Ａ遺伝子
領域の全てを欠失させる必要はなく、Ｅ１Ａ遺伝子領域
を含む１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的は達
成される。また、本発明のアデノウイルスのゲノムは、
Ｅ３遺伝子領域も欠失されていてもよい。特に、Ｅ３遺
伝子領域を含む７９．６〜８４．８％を欠失させたもの
が好ましい。外来ヌクレオチド配列の複製には不要であ
るからである。

【００１５】本発明のアデノウイルスのゲノムに組み込
まれるニワトリβーアクチンプロモーターは、それ自体
強力なプロモーター活性を発揮するが、そのイントロン
領域の途中から下流のスプライシングアクセプター配列
を除去し、その代わりにウサギβグロビン構造遺伝子に
含まれるスプライシングアクセプター配列を組み込む
と、その活性が顕著に増大する。

【００１６】本発明のアデノウイルスのゲノムに組み込
まれるポリＡ配列としては、ＳＶ４０由来の遺伝子も使
用し得るが、ウサギβグロビン構造遺伝子由来の遺伝子
が好ましい。

【００１７】本発明のアデノウイルスのゲノムには、ニ
ワトリβーアクチンプロモーターのプロモーター活性を
増強するために、サイトメガロウイルスエンハンサー配
列が組み込まれているという特徴がある。

【００１８】このような本発明の組換えアデノウイルス
は、動物細胞に感染させると、アデノウイルスゲノムが
細胞内に注入され、非増殖細胞内であっても染色体外で
半月から２ヶ月もの長期間安定に存続し、ゲノム中に組
み込まれた外来ヌクレオチド配列のコードするポリペプ
チドを発現し続けることができる。その際、ゲノム自体
がコードする蛋白はＥ１遺伝子欠失のため生産されず、
アデノウイルスそれ自体による副作用は最低限に抑えら
れる。したがって、本発明の組換えアデノウイルスは、
遺伝子治療に極めて有用性が高いと考えられる。このよ
うな動物細胞の例としては、ヒトまたは哺乳動物の肺上
皮細胞、胃腸管上皮細胞、神経系細胞、肝臓、および筋
肉（骨格筋、心筋等）等が挙げられる。

【００１９】次に、本発明の組換えアデノウイルスの製
造方法について説明する。本発明の組換えアデノウイル
スの作成は、前述のとおりウイルスゲノムの両端にタン
パク質が共有結合しているため、一般に極めて困難であ
る。

【００２０】そこで本発明においては、以下の方法を用
いる。 まず、アデノウイルスゲノム（３６ｋｂ）の全長の
うち、複製に不要なＥ３遺伝子領域（１．９ｋｂ）とＥ
１Ａ・Ｅ１Ｂ遺伝子領域（２．９ｋｂ）を欠失させた約
３１ｋｂのゲノムＤＮＡをもつコスミドを作成し、その
Ｅ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位に外来プロモーター、細胞系内
で発現させようとする外来の目的ポリペプチド配列をコ
ードしているヌクレオチド配列及びポリＡ配列を含む目
的遺伝子の発現ユニットを組み込む。発現ユニットは好
ましくは左向きに組み込まれる。ここで左向きとは、本
来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂの転写の向きと逆向きをいう。な
お、コスミドは、ラムダ・インビトロ・パッケージング
キットＧｉｇａｐａｃｋＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）を用いて作成する。細胞系内で発現させようとする
外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオ
チド配列としては、例えばインターロイキン−１〜１
２、インターフェロン−α、βもしくはγ、腫瘍壊死因
子−α、もしくはβ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、
成長ホルモン、インシュリンおよびインシュリン様成長
因子のようなサイトカイン類、遺伝性疾患原因遺伝子で
あるアデノシンデアミナーゼ、ジストロフィン、脳由来
神経栄養因子、チミジンキナーゼ、低密度リポ蛋白レセ
プター、α−１アンチトリプシン、血液凝固第８因子、
血液凝固第９因子、ガラクトシダーゼ等、非自己抗原遺
伝子であるアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ７）、ウイルス抗原
等をコードするヌクレオチド配列、ガン抑制遺伝子であ
るｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−１、ＮＭ２３、ＮＦ−１等、ガ
ン遺伝子であるＲａｓアンチセンス配列等が挙げられ
る。

【００２１】 一方、アデノウイルスゲノムは、その
両端にウイルスがコードする末端蛋白がついた形で複製
するので、この末端蛋白のついたゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ
−末端蛋白複合体、ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製し、ゲノム
のＥ１遺伝子領域のみを頻回に切断する制限酵素例えば
ＥｃｏＴ２２Ｉ（宝酒造社製）またはこれと認識配列が
同一なＮｓｉＩ、ＡｖａIII で切断しておき、これを親
ウイルスゲノムとして用いる。 次いで、目的の発現ユニットを含んだコスミドと切
断した親ウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを混合し、２９３細胞
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）へリン酸カルシ
ウム法によりトランスフェクションを行う。２９３細胞
内では、両分子間で２１ｋｂにわたる共通配列の中でま
ず相同的な組換えが起こり、次に右端（Ｅ１領域の反対
側）から複製を開始した分子が右端の配列を用いて左端
のプラスミド由来の配列を切り離して修復を行う。これ
は、前述のように、アデノウイルスゲノムの両端１０２
塩基対が完全に同じ配列（末端逆配列）であることによ
る。この機構により、アデノウイルスは、片側の末端が
エクソヌクレアーゼにより攻撃されても、反対側の配列
で自らを修復すると考えられる。

【００２２】 以上の操作により、２９３細胞中で増
殖したアデノウイルスの中から、目的の組換えアデノウ
イルスを得ることができる。本発明の方法では、組換え
アデノウイルスの出現頻度が高いため、選択マーカーを
使用する必要もなく、以下に述べるような簡易な方法で
精製することができる。上記のようにして、目的の発現
ユニットを含んだコスミドと切断した親ウイルスＤＮＡ
−ＴＰＣとで同時トランスフェクションさせた２９３細
胞を３７℃で約１日間培養し、９６穴ディッシュ３枚を
用い、原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液にまきなお
す。この方法で、単一ウイルスを含むウエルから得た増
殖ウイルスの中から、目的の組換えアデノウイルスを選
択する。

【００２３】選択方法は、各ウイルス液を２９３細胞に
感染させ、ウイルスの増殖により死滅した細胞を含む培
養液からＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩによる切断
により得られる断片を電気泳動にかけ、パターンを調べ
る。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノム
の左端までのバンドが正確に出現しているものを選択す
る。この溶液は、目的の組換えアデノウイルス溶液とし
て使用することができる。なお、この溶液中に欠失ウイ
ルスまたは親ウイルスが混在していないことを確認する
ため、この溶液の一部を２９３細胞に感染させ、増殖し
たウイルスからＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩによ
る切断パターンを調べる。欠失ウイルスまたは親ウイル
スの混在が疑われた場合はこの溶液を廃棄する。

【００２４】本発明の特徴を明確にするために、従来の
方法（Melissa A. Rosenfeld et al., Cell, vol.68,14
3-155(1992) ）と比較すると以下のようになる。本発明
の方法では、アデノウイルスＤＮＡのほぼ全長を含むコ
スミドを使用するが、従来の方法ではＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ遺
伝子領域の近辺の５ｋｂ程度のカセットが使用されてい
た。従って本発明の方法では相同組換えの効率が著しく
向上した。また、本発明の方法では、親ウイルスＤＮＡ
として末端蛋白の結合したゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰ
Ｃ）を使用するが、従来の方法では末端蛋白を除去した
ＤＮＡを使用していた。このため、本発明の方法では数
十倍の効率化が達成された。さらに、従来の方法では得
られるウイルス株のほとんどが親ウイルスであったが、
本発明の方法では、ＤＮＡ−ＴＰＣのＥ１遺伝子領域
（左側）を頻回に（３〜１０か所で）切断する制限酵素
を使用することにより、得られるウイルス株の約半数が
目的の組換えウイルスとなり、選択マーカーを用いる必
要もなくなった。このような制限酵素としては、例えば
ＥｃｏＴ２２Ｉまたはこれと認識配列が同一なＮｓｉ
Ｉ、ＡｖａIII が好適に使用できる。

【００２５】本発明の方法により上記のようにして得ら
れる高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入（中
枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投与、
経気道投与、経皮投与等の投与方法により、遺伝病を含
む各種疾患の治療に用いることができる。本発明の方法
で得られた組換えアデノウイルスは、種々の細胞培養系
を用いた外来遺伝子の発現やヒトや動物へのワクチン化
の手段としてもまた有効に使用される。

【００２６】

【実施例】以下、実施例、参考例、実験例、および比較
例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこ
れらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種
酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作は、特に
断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual. T. Maniatis ら編、第２版（１９８9 ）、Cold S
pring Harbor Laboratory 」に記載の方法に準じて行っ
た。

【００２７】実施例１ ＜組換えアデノウイルスの作製＞組換えアデノウイルス
の作製は、大別して３つのステップに別れる。即ち、コ
スミドへの発現ユニットの挿入のステップ、親ウイルス
ＤＮＡ−ＴＰＣの作成のステップ、そしてコスミドとＤ
ＮＡ−ＴＰＣによる２９３細胞への同時トランスフェク
ション・分離精製のステップである。以下に各ステップ
について説明する。

【００２８】（１）コスミドへの発現ユニットの挿入 まず、両端を平滑化した発現ユニット断片の０．２
μｇとＳｗａＩで切断したｐＡｄｅｘ１ｗ ＤＮＡの１
μｇを混合した。この際、発現ユニットとしては、サイ
トメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチン
プロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアク
セプターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモ
ーター（ＣＡＧプロモーター）およびＬａｃＺ遺伝子の
セットを用いた。平滑化にはＫｌｅｎｏｗ酵素を用い、
処理後、フェノール抽出１回、クロロホルム抽出２回を
行い、その後エタノールで沈澱させ、完全に純化した。
発現ユニットをコスミド（４４ｋｂ）の２〜３倍のモル
比で加えた。一般に発現ユニット内にＳｗａＩ部位があ
るとクローン化できないがＳｗａＩは８塩基認識なので
発現ユニットに存在することはまれである。この発現ユ
ニットについては、問題はなかった。アデノウイルスゲ
ノム断片としては、ｐＡｄｅｘ１ｗを用いた。その１０
μｇをＳｗａＩで切断し、フェノール抽出１回、後述の
遠心ゲル濾過後１μｇずつ用いた。なおコスミドとして
はクローン化部位が、ここに挙げたＳｗａＩのもの（ｐ
Ａｄｅｘ１ｗ）以外に、ＣｌａＩのもの（ｐＡｄｅｘ１
ｃ）があり、いずれも対応する制限酵素を用いることに
より使用できる。

【００２９】 次に、混合液にエタノールを加えてコ
スミドを沈澱させる。沈澱物を遠心分離により取得し、
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴ
Ａを添加した溶液（ＴＥ）の５倍希釈液に溶解した。 得られたコスミドをリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中で
ＡＴＰ，Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅを加え、最終容量７
μｌで一晩結合させた。ついで滅菌水、Ｓｗａｌ反応ｂ
ｕｆｆｅｒを加えて４８μｌとしてから７０℃１０分で
リガーゼを熱失活させた。この際、プラズミドと異な
り、コスミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合
した巨大分子が効率よくパッケージされる。

【００３０】 ２μｌのＳｗａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ社製）を加え、２５℃で１時間切断した。ＳｗａＩ
切断を行う意味は、コスミドが発現ユニットをくわえ込
むことなく再結合するとＳｗａＩ認識配列が再生される
ため、このステップで発現ユニットの組み込まれていな
いコスミドを再切断し、コロニーをつくらなくするため
である。この方法はインサートをもつコスミドだけを選
択する強力な方法である。 常法（Molecular Cloning vol.3 E.34）に従い、コ
スミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲル濾過を
行った。 再度、ＳｗａＩ切断を行った。即ち、ＳｗａＩ反応
ｂｕｆｆｅｒ中、５μｌのＳｗａＩを加え、２５℃で２
時間切断した。その理由は上記の通りである。

【００３１】 得られたコスミドの１μｌについてイ
ン・ビトロ・パッケージングを行った。即ち、ラムダ・
イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバック
ＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を１／４スケールで
用い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４
２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでイン
サートが入って大きくなったコスミドをある程度選択す
ることができる。本実験では、１０個のコロニーを拾え
ば大半はインサートを含んでおり、目的の向き（左向
き）のクローンを容易に得ることができた。コスミドの
扱い方については、常法（斎藤 泉他、実験医学 : 7:
183-187, 1989 ）に従って行った。

【００３２】 パッケージングされたコスミドをＤＨ
１（ＡＴＣＣ３３８４９）に感染させた。即ち、３枚の
Ａｐ⁺ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌのＡ
ｐ⁺ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／２
０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。ｐ
ｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、全酵
素切断によりインサートが入ったものの割合を調べた。
コロニーを丸ごと取り１．５ｍｌのＡｐ⁺ ＬＢで、一晩
培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製した。 次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと
構造を確認した。なお、ＮｒｕＩとリガーゼを用いて、
発現単位を含むが大部分のアデノウイルスＤＮＡを欠失
したプラスミドを作製し、ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡ
クローン化の最終確認を行うとともに、ＣＯＳ細胞での
一時的発現により、目的遺伝子であるＬａｃＺ遺伝子の
発現を確認した。（組換えウイルスの作製にはこのプラ
スミドではなく、コスミドの方を用いる。）

【００３３】（２）アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複合体
（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.of Virology, vol.54, 711-719
(1985) ）を用いた。Ａｄ５ ｄｌＸをＨｅＬａ細胞
（Ｒｏｕｘ １０本分）に感染させ、培養を行った。即
ち、Ａｄ５−ｄｌＸのウイルス液（〜１０⁹ ＰＦＵ／ｍ
ｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はが
れた細胞を１５００ｒｐｍ、５分にて遠心分離して集め
た。アデノウイルス粒子のほとんどはメディウム中では
なく細胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製
できる利点がある。（以下の操作は非無菌的に行っ
た。）

【００３４】 得られた細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の２０ｍｌに懸濁し、密封型ソニ
ケーターを用い、２００Ｗ、２分（３０秒×４）で細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。ウイルス
を細胞内から放出させるには５ｍｌ以下なら凍結融解５
回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利
である。ただし、必ず密封型（専用カップのあるもの）
を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネッ
トの中でも危険性がある。

【００３５】 得られた破砕物を遠心分離（１０ｋｒ
ｐｍ、１０分）により沈澱を除いた後、超遠心機 ＳＷ
２８チューブに１５ｍｌの塩化セシウム溶液（比重１．
４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心
（２５ｋｒｐｍ、１時間、４℃）による濃縮を行った。 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移
した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス
層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時に
もう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たし
た。これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけ
た。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配
ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐ
ｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。

【００３６】 白いウイルスのバンドを分取し、等量
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を
受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。エチジウ
ムプロミドは後で除く方法が確立されていないため利用
できなかった。

【００３７】 上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認した。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
た。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−
ＴＰＣの量をＯＤ₂₆₀ から通常のＤＮＡと同様に算出し
た。 得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ス
テップの組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＥ
ｃｏＴ２２１で２時間切断した後、−８０℃に保存し
た。なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切断、透
析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処理・エ
タノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシウム平
衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。１０Ｒ
ｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ−ＴＰ
Ｃを得ることができた。 一部を分取し、泳動用ＢＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０
μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白
を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル
電気泳動で分離し、完全切断を確認した。ＥｃｏＴ２２
１切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠
心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存し
た。

【００３８】（３）組換えウイルスの分離と高力価ウイ
ルス液の作製 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｐＡｄｅｘ１ｗ ＤＮＡ
の８μｇ（３〜９μｇが適当である）とＥｃｏＴ２２Ｉ
で切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混
合し、セルフェクト（ファルマシア社製）キットを用い
て、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトラン
スフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウム
の上から混合液を滴下し、培養を続けた。一晩培養（約
１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラー
ゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希
釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり
０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく
違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２
９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。

【００３９】 ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエ
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９
３細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れた。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存した。 １５〜１８日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、凍結融解６回後、５ｋｒｐｍ１０分遠心して得られ
た上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃
に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエルは複
数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。

【００４０】 ２４穴プレートに２９３細胞を用意
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に６回の凍結融解と遠心で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。２次ウイルス液の力価は１０⁷ 〜１０⁸
ＰＦＵ／ｍｌ程度であった。他の１ウエルの死滅した細
胞を５ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞塊だ
けを−８０℃に保存した。１０種類のウイルス株の細胞
塊が集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮＡを抽出
した。細胞塊には、４００μｌのcell DNA用TNE (50mM
Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)、４μｌのpr
oteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10%SDSを加えた。

【００４１】 ５０℃で１時間処理した後、フェノー
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸を５０μｌのＴ
Ｅ（２０μｇＲＮａｓｅ／ｍｌを含む）に溶かした。そ
の１５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配
列にＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コス
ミドのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガロ
ースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較した。
発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノムの左
端までのバンドが正確に出現しているものを選択した。
また、説明できないバンドが薄く見えるクローンは、欠
失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃棄し
た。アデノウイルスＤＮＡは細胞あたり１０，０００コ
ピーに増殖するので、細胞ＤＮＡと一緒に全ＤＮＡを抽
出し制限酵素切断によりウイルスＤＮＡのバンドをみる
ことができる。Ｘｈｏｌなどのように認識配列にＣＧを
含む酵素は、細胞ＤＮＡを切断しないので、パターンが
見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染２９
３細胞ＤＮＡをコントロールにおくことが必要であっ
た。（ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現した）。

【００４２】 Ｘｈｏｌ切断で同定された目的のウイ
ルス株の２次ウイルス液の０．１ｍｌを、コラーゲンコ
ートした１５０ｃｍ² ボトル（培地は２５ｍｌ）の２９
３細胞へ感染させた。３日後に細胞が死滅したら、死細
胞ごと２５ｍｌの培地を無菌的に密閉型ソニケーター２
００ｗ最高出力２分（３０秒×４回）で破砕してウイル
スを遊離させた。３ｋｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して
沈澱を除去し、５ｍｌ凍結用チューブに２ｍｌずつ１３
本に分注し、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存
し、３次ウイルス液を調製した。３次ウイルス液は本発
明の組換えアデノウイルスを含む液であり、１０⁹ ＰＦ
Ｕ／ｍｌ程度の高力価のものであった。なお、３次ウイ
ルス液５μｌを２４穴プレートの２９３細胞１ウエルに
感染し、増殖したウイルスＤＮＡの酵素切断パターンを
上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親
ウイルスとの混合物であることが疑われたら、２次ウイ
ルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルス
が増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての
３次シードを廃棄して、別の２次ウイルス液から改めて
やり直すか、その１次ウイルス液から限界希釈法によ
り、目的のウイルスを純化した。

【００４３】参考例１ ＜本発明の組換えアデノウイルスの簡便力価測定法＞本
発明の組換えアデノウイルスは、以下の方法により、簡
便に測定することができる。 ２９３細胞を１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。組
換えアデノウイルス液（３次ウイルス液）を５％ＦＣＳ
添加ＤＭＥを用いて１０^-1〜１０^-4まで段階希釈する。
例えば０．９ｍｌＤＭＥ＋０．１ｍｌウイルス液。チッ
プをすべて替える。 コラーゲンコート９６穴各１枚のすべてのウエルに
５０μｌずつ５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを入れる。第１列目
に、１０^-4に希釈した組換えウイルスを２５μｌずつ加
える。８ウエル用マルチチャンネルピペットを用いて２
５μｌを２列目のウエルに移す。以下同じ操作を１１列
目まで繰り返し最後の２５μｌを捨てる。結果として３
ⁿ の段階希釈列を３¹¹×１０^-4まで作製することができ
る。１２列目は非感染細胞のコントロールとする。この
時用いるチップはその度に替える。

【００４４】 １０ｃｍシャーレの２９３細胞をＰＢ
Ｓ−ＥＤＴＡではがし、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥ溶液６ｍ
ｌに再懸濁する。この細胞溶液を５０μｌずつ９６ウエ
ルに加える。３〜４日後と６〜７日後に各ウエルに５０
μｌの（１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥ）をセルセイバー用滅
菌チップを用いてそっと加える。１２日後に細胞変性の
終末点を顕微鏡で判定する。１４日まで細胞が維持でき
れば判定は誰の目にも明らかであるが、細胞が痛むと判
定が難しくなる。下記ケルバーの式（１）を用いて統計
学的に５０％細胞変性終末点（ＴＣＩＤ₅₀）を計算す
る。 ケルバーの式：求めるＴＣＩＤ₅₀を１０^X とすると、 Ｘ＝ｌｏｇ ａ−（各希釈段階における変性ウエル数／
各希釈段階における検体数の総和−０．５）×ｌｏｇ
（希釈率） 但しａ：１列目の希釈度（このプロトコールでは１０^-4
×３^-1）

【００４５】実験例 １２日後に細胞変性の終末点を顕微鏡で判定して表１の
結果が得られた。この場合の力価は次のようになる。希
釈ウイルス液量は５０μｌであるから、この濃度５０μ
ｌで１ＰＦＵと考えるとウイルス原液の力価は、１ｍｌ
÷５０μｌ÷１０^-7.817＝２０×１０^7.817＝１０
^9.118 ＝１．３×１０ ⁹（ＰＦＵ／ｍｌ）となる。つま
り８列目が半分変性したら１．３×１０ ⁹ＰＦＵ／ｍｌ
であり、７列目の半分までならその１／３の４．４×１
０⁸ ＰＦＵ／ｍｌとなる。

【００４６】

【表１】

【００４７】参考例２ ＜ｐＡｄｅｘ１ｃとｐＡｄｅｘ１ｗの構築＞ （１）Ｅ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム
左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７
Ｄ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＳ１処理して平滑末端と
し、フェノール抽出、エタノール沈殿で回収した。平滑
末端にＢａｍＨリンカーを結合させ、その後ＨｉｎｄII
I 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。目的の
フラグメント（２．８ｋｂ、アデノウイルスゲノムの左
側末端の８％に当たる）はゲルから電気的に抽出、回収
し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 消化したｐＵＣ１９のＢ
ａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 部位へ挿入した。得られた目的
のプラスミドをｐＵＡＦ０−８と名づけた。

【００４８】アデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄIII 消化
し、アガロースゲル電気泳動で分離した。目的の３．４
ｋｂのフラグメント（アデノウイルスゲノムの左側末端
の８−１７％に当たる）はゲルから回収し、ｐＵＣ１９
のＨｉｎｄIII 部位へ挿入した（ｐＵＡＦ８−１７と命
名）。ｐＵＡＦ０−８の塩基番号（ここでいう塩基番号
はアデノウイルスＤＮＡ由来）４５４番目のＰｖｕII部
位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換し
た。そして、このプラスミドをＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ消
化し、４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメント
をアガロースゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ８−１
７の塩基番号３３２８番目のＢｇｌII部位をＣｌａＩリ
ンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そしてこのプ
ラスミドをＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ消化し、２．９ｋｂ
のＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ０−８由来の４５４ｂ
ｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡＦ８
−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラ
グメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ
III 部位へ挿入した。得られたプラスミドはｐＵＡＦ０
−１７Ｄと命名した。このプラスミドはＥ１遺伝子領域
を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％を含
む。

【００４９】（２）アデノウイルスゲノムのＢｓｔ１１
０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目
的の２１．６ｋｂのフラグメントを回収した。

【００５０】（３）アデノウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ
−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）の調製 ｐＸ２Ｓ（I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 5
4, p711-719, 1985)のＳａｌＩ部位をＳｗａＩリンカー
を用いてＳｗａＩ部位へ変換しｐＸ２Ｗを得た。ｐＸ２
ＷをＥｃｏＲＩとＳｗａＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動で分離した後、目的の６．５ｋｂのフラグメント
を回収した。

【００５１】（４）シャロミド（ｃｈｄＲＢＲ７−１
１）の調製 charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のＫ
ｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを除くため、charomid９
−１１をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Klenowフ
ラグメントで平滑化後、セルフライゲーションした。こ
れを用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、ch
aromid６−１１と名づけた。charomid６−１１のＥｃｏ
ＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、得られたシャ
ロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１と名づけた。

【００５２】（５）ｐＡｄｅｘ１ｃの調製 ｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−Ｂｓｔ１１０７フラ
グメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓ
ｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）
とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．
５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄ
ＲＢＲ７−１１とライゲーションした。その後、in vit
roパッケージングし、ＤＨ５αへ感染させた。形質転換
株から目的のフラグメントをもつものを単離し、ｐＡｄ
ｅｘ１ｃと名づけた。

【００５３】（６）ｐＡｄｅｘ１ｗの調製 ｐＡｄｅｘ１ｃのＣｌａＩ部位をＳｗａＩリンカーを用
いてＳｗａＩ部位へ変換し、ｐＡｄｅｘ１ｗを得た。

【００５４】比較例１ ＜組換えアデノウイルスによる各種株化細胞に対するＬ
ａｃＺ遺伝子の発現に及ぼす各種プロモーターの影響＞
本発明の組換えアデノウイルスのプロモーター（ＣＡＧ
プロモーター）をＳＲαプロモーター（ＳＶ４０初期プ
ロモーター＋ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ）、ＥＦ−１αプロ
モーター（ヒト・ポリペプチド伸長因子遺伝子由来）に
代えた組換えアデノウイルスを調製し、本発明の組換え
アデノウイルスとＬａｃＺ遺伝子の発現に対する活性を
調べた。

【００５５】ＳＲαプロモーターは、Ｔａｋｅｂｅらに
より開示されている（Molecular and Cellular Biolog
y, vol.8,466-472,1991）。また、ＥＦ−１αプロモー
ターはＫｉｍらにより開示されている（Gene, vol.91,
217-223, 1990)。組換えアデノウイルスゲノムへの発現
ユニットの導入は、以下のようにして行った。

【００５６】 アデノウイルスゲノムへのＣＡＧプロ
モーターおよびＬａｃＺ遺伝子の組み込みのために、ま
ず、ｐＣＡＧＧＳにＬａｃＺ遺伝子を導入した。即ち、
ｐＣＡＧＧＳをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ断片で平
滑化し、この部分にＳｗａＩリンカーを挿入した。一
方、ＬａｃＺ遺伝子の材料としてｐＭＣ１８７１（Shap
iro et al., Gene, vol.25, 71-82,1983) を用いた。ｐ
ＭＣ１８７１のＬａｃＺは、酵素活性に不要なＮ末７ア
ミノ酸の塩基配列がポリリンカー配列となっている。こ
のＮ末部でＳｍａＩで切断し、ＮｏｔＩリンカーを結合
した後、開始コドンを含む合成ＤＮＡ、すなわち（Ｐｓ
ｔＩ端）−ＣＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡ−（Ｎ
ｏｔＩ端）と結合した。終始コドン後のＰｓｔＩで切断
し、平滑化して上記のＳｗａＩ部位へ導入した。これで
ＣＡＧプロモーターの下流にＬａｃＺ遺伝子の導入され
たプラスミドが得られた。ついで、このプラスミドをＳ
ａｌＩとＨｉｎｄIII で切り出し、両端を平滑化した。
これを、ＳｗａＩで切断したｐＡｄｅｘ１ｗと結合させ
て発現コスミドを作成した。

【００５７】 アデノウイルスゲノムへのＳＲαプロ
モーターおよびＬａｃＺ遺伝子の組み込みには、ＣＡＧ
プロモーターの場合と同様に、まずＬａｃＺ遺伝子の材
料としてｐＭＣ１８７１を用いた。このＮ末部でＳｍａ
Ｉで切断し、ＮｏｔＩリンカーを結合した後、終始コド
ン後のＰｓｔＩで切断し、平滑化してＫｐｎＩリンカー
を結合した。このＬａｃＺ断片を、開始コドンを含む上
記の合成ＤＮＡと結合し、ＳＲαプロモーターをもつ発
現ベクターｐＣＤ−ＳＲα−２９６のＰｓｔＩ部位とＫ
ｐｎＩ部位の間にクローン化した（ｐＳＲＬａｃＺ）。
ＳＲαプロモーターからＬａｃＺを発現する組換えアデ
ノウイルス（Ａｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺ）を作成するに
は、ｐＳＲＬａｃＺからＨｉｎｄIII とＴｔｈ１１１Ｉ
を用いてＳＲα−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡの発現ユニット
を切り出して平滑端とし、Ａｄｅｘ作成カセットｐＡｄ
ｅｘ１ｗのＳｗａＩ部位に挿入し、組換えウイルスの作
成に用いた。

【００５８】 ＥＦ１αプロモーターからＬａｃＺを
発現する組換えウイルスは、発現ベクターｐＥＦ３２１
−Ｔ（kim et al., Gene, vol.91, 217-223, 1990 ）の
ＳＶ４０Ｔ抗原部分をＨｉｎｄIII とＨｐａＩによって
抜き出し、ＳｗａＩ合成リンカーにて結合したｐＥＦ３
２１ｗを先ず作成し、そのＳｗａＩ部位にｐＳＲＬａｃ
Ｚの開始コドンを含むコード領域をＰｓｔＩとＫｐｎＩ
で切り出し、平滑端にした後、ｐＥＦ３２１ｗのＳｗａ
Ｉ部位に挿入し、ｐＥＦＬａｃＺを作成した。ここから
ＥＦ１α−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡの発現ユニットを、Ｎ
ｈｅＩとＫｐｎＩにより切り出し、ｐＡｄｅｘ１ｗのＳ
ｗａＩ部位に挿入し、組換えウイルス作成に用いた。

【００５９】組換えアデノウイルスを感染させた株化細
胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＲ−３２細
胞、ＥＢ形質転換Ｂｃｅｌｌ−クローン１、ＥＢ形質転
換Ｂｃｅｌｌ−クローン２、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＶ−
１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＹＡ−１細胞、ＳＨＯＫ細
胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＬＴＫ^- 細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞
である。発現したβガラクトシダーゼの活性は、次のよ
うにして測定した。３×１０⁵ 細胞を２４穴プレートの
各ウエルに培養し、これに、作成した組換えアデノウイ
ルスをｍ．ｏ. ｉ. （感染多重度）１０で感染させ、２
日間インキュベートした。その後、細胞をエッペンチュ
ーブに集め、ＰＢＳで２回洗浄した。これに、抽出緩衝
液０．５ｍｌを加え、３０秒間隔で計９０秒超音波破砕
した後、８０％グリセロールを０．５ｍｌ加え、１５０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を細胞
抽出液とした。０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）１．０ｍｌ、０．５Ｍβ−メルカプタノール
１．０ｍｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂ １．０ｍｌおよび蒸
留水５．５ｍｌからなる反応混合液の８５０μｌに、細
胞抽出液、抽出緩衝液（ブランク測定用）またはβガラ
クトシダーゼ溶液（コントロール用）５０μｌを加え、
５分間プリインキュベーションし、その後に基質溶液を
加えた。基質としては、ｏ−ニトロフェニールβガラク
トシドを用いた。３０分間インキュベートした後反応停
止液４００μｌを加え、４２０ｎｍにおける吸光度を測
定し、下記の計算式より活性を算出した。その結果を図
１に示す。この結果から、本発明のＣＡＧプロモーター
がＳＲαプロモーターおよびＥＦ−１αプロモーターに
比べて、試験された全ての細胞において、はるかに強い
発現活性を示すことが分かる。

【００６０】１ユニットは、上記の条件下で１分間に１
μｍｏｌのο−ニトロフェニールβガラクトシドをο−
ニトロフェノールとＤ−ガラクトースに加水分解する触
媒量と定義する。吸光度が１を越える時はｅｘｔｒａｃ
ｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞抽出液を希釈し再
度測定することが望ましい。 Units/ml=(sampleの吸光度-blankの吸光度)/4.51^a)x1.4
ml^b)x1/30min^c)x1.0ml/0.05ml ^d) ここで、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）はそれぞれ次の意味を
表わす。 ａ）ｏ−Nitrophenol の吸光係数、すなわち１ｍＭ水溶
液の吸光度で割ることで酵素反応生成物の濃度μｍｏｌ
／ｍｌを求める。 ｂ）反応停止後のｖｏｌ．をかけることで反応生成物の
量μｍｏｌを求める。 ｃ）反応時間で割ることにより１分間当たりの反応量を
求める。 ｄ）反応に供した酵素液のｖｏｌ．は０．０５ｍｌ、１
ｍｌ当たりの反応量に換算するため。

【００６１】比較例２ ＜ＬａｃＺ遺伝子又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝
子発現ユニットの挿入方向とウイルス産生量の比較＞異
なるプロモーターと遺伝子を用いて、その挿入方向が逆
になる組換えアデノウイルスを調製し、そのウイルス産
生量を比較検討した。

【００６２】（１）ＨＣＶ発現組換えアデノウイルスの
構築 ＨＣＶの３０７〜２５５４塩基番号にあたる２．２ｋｂ
のフラグメントをＰＣＲ法で調製し、ＬａｃＺの場合と
同様にｐｃＤＬ−ＳＲαのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ部位へ挿
入した。組換えアデノウイルスは比較例１と同様に調製
した。

【００６３】（２）ＬａｃＺ発現組換えアデノウイルス
の構築 比較例１と同様に調製した。２９３細胞での組換えウイ
ルスの産生量を表２に示した。表２より、４例中３例で
は左向きの方が右向きに比べ、約１０倍前後高いウイル
ス産生量を示し、１例では同程度であった。この傾向は
プロモーター、遺伝子によらないことも判った。この結
果より本組換えアデノウイルスでは、その挿入方向が左
向きの方がはるかに高いウイルス産生を示すことが分か
った。

【００６４】

【表２】

【００６５】

【発明の効果】本発明により、広範な動物細胞において
遺伝子発現の可能な組換えアデノウイルスを提供するこ
とができる。また、本発明はこの組換えアデノウイルス
の簡易な製造方法を提供する。さらに本発明の組換えア
デノウイルスは遺伝子病の治療に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各種のプロモーターを組み込んだ組換
えアデノウイルスによる各種株化細胞におけるＬａｃＺ
遺伝子の発現に対し、これらプロモーターが及ぼす効果
を示す図である。

【図２】図２は、ｐＡｄｅｘ１ｗの構造を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アデノウイルスゲノムが、外来の目的ポ
   リペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列、並
   びにこの配列の発現を制御するサイトメガロウイルスエ
   ンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサ
   ギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリ
   Ａ配列からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロ
   モーター）、を有することを特徴とする組換えアデノウ
   イルス。
2. 【請求項２】 アデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領
   域を含む１．３％から９．３％断片を欠失していること
   を特徴とする請求項１記載の組換えアデノウイルス。
3. 【請求項３】 Ｅ１Ａ遺伝子領域を含む１．３％から
   ９．３％断片を欠失している部位に、外来の目的ポリペ
   プチド配列をコードしているヌクレオチド配列およびＣ
   ＡＧプロモーターが挿入されていることを特徴とする請
   求項２記載の組換えアデノウイルス。
4. 【請求項４】 アデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺伝
   子領域を含む７９．６％から８４．８％断片を欠失して
   いることを特徴とする請求項２又は請求項３記載の組換
   えアデノウイルス。
5. 【請求項５】 外来の目的ポリペプチド配列をコードし
   ているヌクレオチド配列およびＣＡＧプロモーターが左
   向きにアデノウイルスゲノムに組み込まれていることを
   特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載
   の組換えアデノウイルス。
6. 【請求項６】 外来の目的ポリペプチド配列をコードし
   ているヌクレオチド配列が天然の宿主細胞内でのＣＡＧ
   プロモーターの制御下で発現されたとき、該宿主細胞の
   培地中に分泌されるポリペプチドをコードしていること
   を特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記
   載の組換えアデノウイルス。
7. 【請求項７】 ＣＡＧプロモーターをもつ遺伝子治療用
   の組換えアデノウイルス。
8. 【請求項８】 外来の目的ポリペプチド配列をコードし
   ているヌクレオチド配列およびプロモーターが左向きに
   アデノウイルスゲノムに組み込まれている組換えアデノ
   ウイルス。
9. 【請求項９】 アデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領
   域の少なくとも１．３％から９．３％断片を欠失してい
   ることを特徴とする請求項８記載の組換えアデノウイル
   ス。
10. 【請求項１０】 Ｅ１Ａ遺伝子領域の少なくとも１．３
    ％から９．３％断片を欠失している部位に、外来の目的
    ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列お
    よびプロモーターが挿入されていることを特徴とする請
    求項９記載の組換えアデノウイルス。
11. 【請求項１１】 アデノウイルスゲノムがＥ３遺伝子領
    域の少なくとも７９．６％から８４．８％断片を欠失し
    ていることを特徴とする請求項１０記載の組換えアデノ
    ウイルス。
12. 【請求項１２】 アデノウイルスゲノムからＥ１Ａ遺伝
    子領域の少なくとも１．３％から９．３％断片を欠失さ
    せ欠失部に発現ユニットを組み込んだ発現コスミドと、
    アデノウイルスゲノムのＥ１遺伝子領域側の末端を３ヶ
    所から１０ヶ所で切断できる制限酵素で切断したアデノ
    ウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体とを混合して、Ｅ１Ａ
    遺伝子を発現している細胞株へトランスフェクションを
    行うことを特徴とする、発現ユニットをゲノム中に組み
    込んだ組み換えアデノウイルスの製造方法。
13. 【請求項１３】 Ｅ１Ａ遺伝子を発現している細胞株が
    ヒト胎児腎由来細胞株である請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 発現ユニットが、サイトメガロウイル
    スエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、
    ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよび
    ポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ
    プロモーター）、並びに細胞系内で発現させようとする
    外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオ
    チド配列からなり、該ヌクレオチド配列を該プロモータ
    ーの制御下に発現できる状態で含有しているものである
    請求項１２記載の方法。
15. 【請求項１５】 アデノウイルスゲノムのＥ１遺伝子領
    域側の末端を３ヶ所から１０ヶ所で切断できる制限酵素
    が、ＥｃｏＴ２２Ｉまたはこれと認識配列が同一なＮｓ
    ｉＩ、ＡｖａIII である請求項１２記載の方法。
16. 【請求項１６】 発現ユニットがゲノム中に左向きに組
    み込まれた請求項１２記載の方法。
17. 【請求項１７】 発現コスミド中のアデノウイルスゲノ
    ムおよびアデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体中のア
    デノウイルスゲノムが、Ｅ３遺伝子領域の少なくとも７
    ９．６％から８４．８％断片を欠失している請求項１２
    記載の方法。