JPH06509821A - ペプチドおよびペプチド誘導体の液相合成 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

ペプチドおよびペプチド誘導体の液相合成発明の背景 旧来の液相ペプチド合成には、多くの操作を必要とし、中間体の単離および精製 の際に材料をかなり浪費するというよく知られた問題がつきまとう。 これらの問題のいくつかは、連続液相法を用いることにより回避されてきている 。さらに、固相ペプチド合成においてなされた数多くの進歩が、液相合成方法の 向上を導いている。たとえば、固相合成において開発された保護基は、液相合成 においてもまた有用である。 液相合成における２つの主たる手段としては、（１）非側鎖アミノ官能基をブロ ックするためｔ−ブチロキシカルボニル保護基（ｒＢｏｃＪ）を用いること、お よび（２）同官能基をブロックするために９−フルオロエニルメトキシ力ルボニ ル保護基（ｒＦｍｏ　ｃｌ　）を用いることがある。たとえばチェリイ、ジエイ （Ｔｂｉｅｒｒ７．　Ｊ、）ら、ジャーナル　オブ　メディカル　ケミストリー （＋。 Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、）　３３巻、２１２２頁（１９９０）およびヘーグージエ ンセン、ティー（Ｈ，７Ｃｇ−１ｅｎｓｅｎ、Ｔｌら、テトラヘドロン　レター ズ（Ｔｅｌｒａｈｅｄ＋ｏｎ　Ｌｅｔｔ！ｚ）　３２巻、６３８７頁（１９９１ ＋を参照のこと。 保護基としてＦｍｏ　ｃおよびカップリング剤として置換をうけたカルボジイミ ドを用いる連続液相ペプチド合成方法は、これまでに報告されていない。 発明の概要 本発明は、Ｃ末端で修飾されているまたはされていない、２〜１０のアミノ酸残 基を含むペプチドまたはそのＮ−アシル誘導体を調製するための連続液相合成方 法であって、 （ａ）第１アミノ酸またはその誘導体はその非側鎖カルボキシル官能基および存 在し必要であればその側鎖官能基のいずれをも、塩基に安定な基によってプロ・ ツクし、第２アミノ酸はその非側鎖アミノ官能基をＦｍｏｃによってブロックし 、存在し必要であればその側鎖官能基を塩基に安定な基によってブロックして、 置換をうけたカルボジイミドを含む有機溶媒中で、アミド結合を介して第１アミ ノ酸またはその誘導体を、第２アミノ酸にカップリングさせること； （ｂ）アンモニア、第１級アミン、または第２級アミンを用いて前記Ｆｍｏｃを はずすこと： （Ｃ）追加のアミノ酸はその非側鎖アミノ官能基をＦｍ０Ｃによってブロックし 、存在し必要であればその側鎖官能基を塩基に安定な基によってブロックして、 置換をうけたカルボジイミドを含む有機溶媒中で、アミド結合を介して追加のア ミノ酸をＦｍｏ　ｃをはずした力・ツブリング産物にカップリングさせること： （ｄ）アンモニア、第１級アミン、または第２級アミンを用いてＦｍｏ　ｃをは ずすこと； （ｅ）ペプチドまたはＮ−アシル誘導体の長さに達するまでステップ（Ｃ）およ び（ｄ）をくり返すこと：（ｆ）前のステップよりえられたＦｍｏ　ｃをはずし たカップリング産物の非側鎖アミノ基をアシル化すること；ならびに （ｇ）塩基に安定な基をはずすこと というステップを含んでなる合成方法に関する。 前記の方法において第１アミノ酸またはその誘導体は、ペプチドまたはそのＮ− アシル誘導体における第１残基（すなわち、Ｃ−末端残基）に相当し、第２アミ ノ酸は、ペプチドまたはそのＮ−アシル誘導体において第１残基に隣接する第２ 残基に相当し、追加のアミノ酸は、ペプチドまたはそのＮ−アシル誘導体におい て第２残基に隣接する第３残基に相当する。（換言すれば、合成されるべきペプ チドまたはそのＮ−アシル誘導体の配列に基づいて、アミノ酸を互いに結合させ て、Ｃ末端からＮ末端方向へと連続的なアミドカップリングが行なわれる。）ま た、ペプチドまたはＮ−アシル誘導体が２つのアミノ酸残基を含むときには、（ ｃ）から（ｅ）のステップは省略される。加えて、Ｎ−アシル誘導体でなくペプ チドが合成されるべきときには、ステップ（ｆ）は省略される。 アミド結合の形成に関与するカルボキシル基およびアミノ基を非側鎖官能基と呼 ぶことに注意されたい。他方、このような結合の形成に関係しない官能基をいず れも側鎖官能基と呼ぶ。 Ｃ−末端で修飾されていないペプチドとは、そのＣ−末端にカルボキシル基（す なわち、たいていの天然に生じるペプチドではＣ−末端残基のα−ＣＯＯＨ）を 有するペプチドをいう。他方、Ｃ−末端で修飾されたペプチドとは、前記したよ うにそのＣ−末端にカルボキシル基を有するかわりに、Ｃ−末端アミドまたは置 換をうけたアミド（すなわち、ＣＯＮＨ２まりＩｔ　ＣＯＮ　ＨＲ、式中Ｒはア ルキル、アリールアルキルまたはアリール）、ｃ−末端エステル（すなわち、Ｃ ０ＯＲ，式中Ｒはアルキル、アリールアルキルまたはアリール）、もしくはＣ− 末端アルコール（すなわち、ＣＨ２ｏＨ）を有するペプチドをいう。 「ペプチドのＮ−アシル誘導体」が意味するのは、Ｎ−末端で非側鎖アミノ官能 基の水素が１〜１２の炭素を含むアシル鎖（たとえば、ホルミル、アセチル、ベ ンゾイル、ヘキサノイル、またはナフトイル）により置き換えられたペプチドで ある。 「アミノ酸またはその誘導体」が意味するのは、アミノ酸またはアミノ酸誘導体 である。アミノ酸誘導体とは、そのカルボキシル基（すなわち、α−アミノ酸誘 導体ではα−カルボキシル）が前に定義したような、（すなわち、そのＣ−末端 で修飾されたペプチドにおけるＣ−末端アミドまたは置換をうけたアミド、Ｃ− 末端エステル、もしくはＣ−末端アルコールの定義に参照されたい）アミドまた は置換をうけたアミド、エステル、もしくはアルコールに置き換えられたアミノ 酸をいう。 好ましくは、本合成方法においては、用いられる有機溶媒は塩化メチレン、クロ ロホルム、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テト ラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル、または前記溶媒の組合わせであ り、Ｗ換をうけたカルボジイミドは、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロ へキシルカルボジイミド、またはＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロ ピル）カルボジイミドであり；　Ｆｍｏ　ｃは４−（アミノメチル）ピペリジン 、ピペリジン、またはトリス（２−アミノエチル）アミンを用いてはずされ；は ずされたＦｍｏ　ｃは濾過とそれに続いて酸性水溶液たとえばリン酸緩衝液ｐＨ ５，５を用いて洗浄を行なうことに、より除去される。 とくに好ましい実施態様においては、有機溶媒は塩化メチレンであり、Ｆｍｏｃ は４−アミノメチルピペリジンを用いてはずされる。 本発明の合成方法においてはまた、トリフルオロ酢酸を用いて、塩基に安定な基 をはずすことが好ましい。 さらに、Ｎ−アシル誘導体が合成されるべきであるばあいには、強塩基、たとえ ばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンをステップ（ｆ）で添加 することが好ましい。 「塩基に安定な基」という語は、（１）塩基に安定、すなわち、Ｆ　ｍ、　ｏ　 ｃを除去するために用いられる塩基、たとえば４−アミノメチルピペリジン、ピ ペリジン、またはトリス（２−アミノエチル）アミンによって除去されえない、 さらに（２）酸、たとえばトリフルオロ酢酸により、または他の方法、たとえば 触媒水素化により除去されうる、アミノ酸基礎単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏ ｃｋｓ）の官能基を遮断するために用いられる保護基をいうということに注意さ れたい。本明細書中でおよび添付の請求の範囲において用いられるｒＦｍｏｃＪ の符号は、９−フルオロエニルメトキシカルボニル基をあられすものである。 前記合成方法は、テトラペプチド（たとえば、Ｈ−３ｅｒ−Ａ＋ｐ−Ｌｙ＋−Ｐ ｒｏ−０ＨＩ　またはテトラペプチドのＮ−アシル誘導体（たとえば、アセチル −Ｓｅ＋−Ａ＋ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＱＨ）を調製するのに利用されつる。Ｈ− Ｓｅ＋−Ａｓｐ−ＬＨ−Ｐｒｏ−ＯＨまたはアセチル−３ｅ＋−＾５ｐ−Ｌ７ｓ −Ｐｒｏ−ＯＨを合成すべきときには、Ｓｅ＋　、Ａｓｐ　、　Ｌ７ｓおよびＰ ｔｔｈの側鎖官能基をブロックするために用いられる塩基に安定な保護基は、そ れぞれｔ−ブチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチル−オキシカルボニル、およびｔ−ブ チルが可能である。 弐Ｈ−５ｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙ＋−Ｐｒｏ−ＯＨにおいて、慣例の３文字のアミノ 酸符号（たとえば、Ｓｅ＋　）はそれぞれ、構造残基をあられす。たとえば前記 式中のＳｅ＋の符号は、−ＮＨ−ＣＩ（（ＣＨ２０Ｈ）　−Ｃｏ−をあられす。 アセチルづｅ「−＾５ｐ−ＬＹｌ−Ｐｒｏ−ＯＨの式は、そのアミノ官能基（す なわち、Ｓｅｔのα−アミノ）がアセチル基に置き換えられたＮ−アシルペプチ ド誘導体をあられす。 前記方法は、カップリング剤としてかなり安価である置換をうけたカルボジイミ ドを用いるということが有利であり、よって大規模な連続液相ペプチド合成にも っとも好適である。本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および請 求の範囲より明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 ４、

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の好ましい方法にしたがったアセチル−３ｅｔ−＾＋ｐ−Ｌ７＋ −Ｐｒｏ−ＯＨの合成の概略図である。 図２は、図１に示す手順によって調製したアセチル−３ｅ＋−Ａｓｐ−Ｌｙ＋− Ｐｒｏ−ＯＨ（精製産物）の高圧液体クロマトグラフであり、時間に対する２２ ０ｎｍでの吸光度を示す。 図３は、図１に示すと同様の手順によって調製したＨ−３ｅ＋−Ａ＋ｐ−Ｌ７＋ −？ｏ−ＯＨ（粗度物）の高圧液体クロマトグラフであり、時間に対する２２０ ｎｍでの吸光度を示す。 好ましい実施態様の説明 本発明は通例の液相ペプチド合成方法の改良である。 とくに非側鎖アミノ官能基のための保護基としてＦｍ。 Ｃを用いること、Ｆｍｏ　ｃ保護基を除去するためにアンモニア、第１級または 第２級アミン（たとえば、４−アミノメチル−ピペリジン、ピペリジン、または トリス（２−アミノエチル）アミン）を用いること、ならびに適当な有機溶媒中 で、選択された置換をうけたカルボジイミド（たとえば、ジイソプロピルカルボ ジイミド、ジシクロへキシルカルボジイミド、またはＮ−エチル−Ｎ″−（３− ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）をペプチドをＣ末端からＮ末端へ と合成するためのカップリング剤として用いることを教示する。適当な溶媒には 塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、および それらの組合わせが含まれるが、それらに限定されるものではなく、異なる溶媒 を用いる際には方法を若干修正することが必要であるかもしれない。 前記教示により、過剰の試薬やそれらの望まない産物を除去するための酸性水溶 液での洗浄を適用することが可能となる。たとえば、Ｆｍｏ　ｃを除去するため に４〜アミノメチルピペリジンが用いられるばあい、過剰の４−アミノメチルピ ペリジン、９−（４−−アミノメチルピペリジニルメチル）フルオレン（すなわ ち、４−アミノメチルピペリジン／　Ｆ　ｍ　ｏ　ｃの産物）、および４−アミ ノメチルピペリジンに結合したアミノ酸由来の産物は、いずれもリン酸緩衝液ｐ Ｈ５，５によって抽出されうる。 さらに、微量のカップリング剤およびその産物もまた、そのリン酸緩衝液によっ て難なく除去されつる。 本発明によれば、副産物および過剰の試薬は、濾過によっても除去されうる。た とえば、カップリング剤としてジイソプロピルカルボジイミドが用いられるばあ い、それから生成するジイソプロピルウレアは塩化メチレン中で部分的に可溶で あり、よって濾過（たとえば減圧濾過）によって不溶性部分を除去することが可 能となる。 ４−アミノメチルピペリジンとＦｍｏｃ基との反応からの産物もまた塩化メチレ ン中で部分的に可溶であり、その一部を濾過によって同様に除去することができ る。過剰の試薬をさらに抽出するために水溶液を添加する際にエマルジョンを形 成する機会を減じるので、このように部分的に除去することは好ましい。濾過の 前に冷却すると、通常部分的に可溶な物質の溶解性をさらに減少させ、また有機 溶媒の蒸気圧を低減させ、よって引き続く減圧濾過を容易にするので、濾過の前 に冷却することが望ましい。 前記技法、すなわち過剰の試薬および望まない産物を除去するために水溶液で抽 出し濾過することは、かなり簡単である。それを行なうことでクロマトグラフィ ーにより中間体を精製するという退屈で時間を浪費するステップ（このようなス テップが通例の液相ペプチド合成においては適用されている）を削除することが 可能となる。 結果として、サイクル時間が１〜２時間へと大幅に減じられ、１日あたり数サイ クルを実行することが可能となる。 前記したように、Ｆｍｏ　ｃ保護基は、アンモニア、第１級アミンまたは第２級 アミンのような塩基を用いて除去されつる。（Ｆｍｏｃは第３級アミン、たとえ ばトリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンに対して安定であること に注意されたい。）塩基に不安定なＦｍｏｃ基を用いることの利点は、ｔ−ブチ ロキシカルボニル（ｒＢｏｃＪ）保護基を用いるばあいに必要とされるような、 脱保護を行なった非側鎖アミノ基を中和するステップが削除されるということで ある。かくして、つぎのＦｍｏ　ｃで保護したアミノ酸をフリーのアミノ基に添 加することを難なく続行し、ペプチド鎖を構築するためにサイクルをくり返すこ とができる。 本発明に用いられる側鎖保護基は、Ｆｍｏ　ｃを除去する際の条件下で完全なま まであるように、Ｆｍｏ　ｃとは対照的にアンモニア、第１級アミンまたは第２ 級アミンのような塩基に対して安定でなければならない。さらに、保護されたア ミノ酸がすべて互いに結合したのちに、側鎖保護基もまた、酸、たとえばトリフ ルオロ酢酸によって、またはたとえば保護基としてベンジルが用いられるばあい には触媒水素化によってたやすく除去されうろことも必要である。 Ｌ７ｓのε−アミノような側鎖アミノ官能基は、Ｂｏｃ１カルボベンゾキシ、ま たは２−クロロ−カルボベンゾキシにより保護することができる。 八１ｐのβ−カルボキシルのような側鎖カルボキシル官能基は、ｔ−ブチル（エ ステル）、ベンジル（エステル）、またはシクロヘキシル（エステル）によって 保護することができる。Ｃ−末端アミノ酸の非側鎖カルボキシル官能基をブロッ クするためにも同じ保護基を用いることができる。 ＳｅｔまたはＴＮ＋におけるような側鎖ヒドロキシル官能基は、ｔ−ブチル（エ ーテル）またはベンジル（エーテル）により保護することができる。 Ｃｙ＋におけるような側鎖チオール官能基は、トリチル（すなわち、トリフェニ ルメチル）によって保護することができる。 本発明のその他の局面は当該技術においてよく知られるところであり、以下に簡 単に論じる。 Ｃ−末端で修飾されたペプチドの調製 Ｃ−末端で修飾されたペプチドを調製するばあい、第１のカップリング反応にお いてアミノ酸誘導体を用いなければならない。アミノ酸誘導体の非側鎖官能基は 、保護されてまたはされないでカップリング反応に付されることができる。 たとえば、Ｃ−末端残基がアミドまたは置換をうけたアミドであるとき、アミド または置換をうけたアミドであるアミノ酸誘導体を合成の初めに導入することが できる。これは、アミドまたは置換をうけたアミド官能基が合成試薬に対して安 定であるためである。 Ｃ−末端エステルを有するペプチドに関しては、ベンジルエステルを切断するた めに用いられる触媒水素化の条件を引き続く脱保護のステップのいずれにおいて も用いないのであれば、酸および塩基に安定なアミンエステル（すなわち、ベン ジルエステル）を合成の初めに導入することもできる。他方、酸または塩基に不 安定なアミノエステルは、引き続くステップにおける官能基の脱保護のために用 いられる試薬に対してそれらが安定であるばあいに限って、合成の初めに導入す ることができる。 また、ペプチド配列内にさらに酸性官能基が存在するのであれば、対応する保護 基は直交性（ｏＮｈｏｇｏｎａｌ）であるべきである。 アミノアルコールは合成試薬に対して安定であって、ペプチドアルコールの合成 の初めに導入することができる。所望のばあい、安定性または溶解性を向上させ るためにエーテル結合もまた使用することができる。 スカベンジャー スカベンジャーは、ペプチドから保護基を除去する際に形成しうるカルボニウム イオンと反応する。芳香環を含むアミノ酸はカルボニウムイオンによりたやすく アルキル化またはアシル化をうける。よって、脱保護のステップでスカベンジャ ーを用いることが好ましい。切断反応において存在するカルボニウムイオンは、 １または複数のスカベンジャーと反応することができる。 用いるべきスカベンジャーのタイプは、ペプチド内のアミノ酸に依存する。もっ とも一般的なスカベンジャーはアニソール、インドール、フェノール、水、メル カプトエタノール、エタンジチオール、チオフェノール、およびジチオスレイト ールである。 中和 合成すべきペプチドのＣ−末端アミノ酸（その側鎖官能基、およびその非側鎖カ ルボキシル基は、もし存在すれば保護されている）の塩酸塩が用いられるばあい 、まず強塩基、たとえばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンが 、カップリング反応の前に非側鎖アミノ基を中和するために用いられる。さらに 詳しくは、強塩基は用いられる有機溶媒中で一部不溶性の塩酸塩を形成し、減圧 濾過および水性抽出によって除去することができる。 同様に、Ｎ−アシル化ペプチドを調製すべきばあいには、アシル化反応より産生 じたいずれの酸とも反応し、それによってその酸とＮ−末端アミノ酸のアミノ基 とのあいだで塩を形成することを妨げるように、強塩基を用いることが好ましい 。 アシル化 ペプチドのアミノ基のアシル化は、側鎖においてまたは非側鎖において酸無水物 により成し遂げることができる。たとえば無水酢酸Ａ　Ｃ２０はアセチル化に用 いることができる。同様にホルミル化には混合無水物（たとえば、Ｈ−Ｃｏ−０ −Ｃｏ−Ｒ，式中ＲはＨＳＣＨ３またはＣＦ３）のような活性化ギ酸を用いるこ とができる。 他の例としては、ナフトエ酸または無水物をペプチドのＮ−末端にナフトイル基 を導入するために用いることができる。 カップリングおよび脱保護の反応は薄層クロマトグラフィー（ｒＴ、Ｌ、Ｃ，ｊ ）によってたやすくモニターすることができる。他方、粗ペプチドの純度は、Ｔ 、Ｌ。 Ｃ８または高圧液体クロマトグラフィー（ｒＨ，Ｐ、Ｌ。 Ｃ０」）のいずれによっても確認することができる。粗ペプチドはさらにＨ，Ｐ 、Ｌ、Ｃ０によって精製し、凍結乾燥して、ペプチドを粉末としてえることがで きる。 前記した連続Ｆｍｏ　ｃ溶液法は、規模の拡大に好適な、固相合成の実用的な変 法であって、商業的に魅力あるものである。 さらに詳細に述べなくとも、当業者はこれまでの記載を用いて、本発明を完全な までに利用することができると信じる。それゆえ、下記に示す２つの特定の実験 実施例は単なる例示として解釈されるべきであり、いかようにも決して開示の残 余を限定するものではない。たとえば、両方の実施例においてα−アミノ酸が基 礎単位であるが、β−またはγ−アミノ酸もまた類似の方法で他のペプチドまた はその誘導体を調製するのに用いることができる。同じように、Ｃ−末端カルボ キシル基を有するペプチド／ペプチド誘導体をっぎの実験実施例で調製したが、 Ｃ−末端アミド、エステルまたはアルコールを有するペプチドを当該技術におい てよく知られた修正（たとえば、「Ｃ−末端で修飾されたペプチドの調製」の見 出しのちとに前記した議論を参照のこと）を行なって同様の方法で調製すること ができる。 下記は、カップリング反応および保護しているＦｍ。 Ｃ基を除去する反応をモニターするため、つぎの実験実施例中に用いた２つのＴ 、Ｌ、Ｃ，システムである；Ｔ、Ｌ、Ｃ，システム１：　塩化メチレン：アセト ンＴ、Ｌ、Ｃ，システム２：　ｎ−ブタノール：酢酸：水実施例１ アセチルづｅｒ−Ａｌｐ−Ｌ７＋−Ｐ、ｒｏ−ＯＨの合成図１は、アセチル−３ ｅｒ−Ａｌｐ−Ｌｙｅ−Ｐｒｏ−ＯＨを調製する手順の概略図を示す。 磁気撹拌子をそなえた４リツトルのエーシンマイヤーフラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅ ７ｅ＋　ｆｌａｎｋ）に４５．９グラム（０，２２１モル）のし−プロリン−ｔ −ブチルエステル・塩酸、１１３．Ｍ７’ラム（０，２４３モル）のＦｍｏ　ｃ −（ＢＯＣ−Ｌ−リジン）および１２リツトルの塩化メチレンを加えた。懸濁液 を撹拌し、３０．７グラム（０，２４３モル）のジイソプロピルカルボジイミド および２２４グラム（０，２２１モル）のトリエチルアミンを添加した。このス テップでプロリン−１−ブチルエステル塩酸のアミノ基は、添加したトリエチル アミンにより中和された（図１には示さない）。混合物を２時間撹拌した。Ｔ、 Ｌ、Ｃ，（システム１）により反応が完了したことが示された。 懸濁液を撹拌しながら、４４１ミリリツトル（３，６６１モル）の４−アミノメ チルピペリジンを添加し、１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、沈殿を少量の塩化 メチレンで洗浄し、濾液は塩化メチレンで１６１Ｊツトルの容量に希釈した。つ いでこの溶液を３Ｘ８．０　リットル（合計２４１Ｊツトル）の１０％（ｗ／ｖ ）リン酸緩衝液、ｐＨ５，５を用いて洗浄した。塩化メチレン溶液は、３００グ ラムの硫酸ナトリウム上で乾燥し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム２）で反応が完了し たことが示された。溶液を減圧濾過し、０．９リツトルの容量にまで濃縮した。 混合物を減圧濾過し、固形物は３×０１　リットルの塩化メチレンで洗浄した。 この溶液の容量は１．２　リットルであった。 この溶液を撹拌し、１０００グラム（０２４３モル）のＦｍｏｃ−β−（ｔ−ブ チル）−Ｌ−アスパラギン酸および３０．７グラム（０，２４３モル）のジイソ プロピルカルボジイミドを加えた。混合物を１時間撹拌した。Ｔ、Ｌ、Ｃ。 （システム１）で反応が完了していることが示された。 懸濁液を撹拌しながら、４４１ミリリツトル（３，６６１モル）の４−アミノメ チルピペリジンを添加し、１時間撹拌した。懸濁液を減圧濾過し、沈殿を少量の 塩化メチレンで洗浄し、濾液は塩化メチレンで１６リツトルの容量に希釈した。 この溶液を３×８０リツトル（合計２４リツトル）の１０％（Ｗ／Ｖ）リン酸緩 衝液　ｐＨ５，５を用いて洗浄した。塩化メチレン溶液は、３００グラムの硫酸 ナトリウム上で乾燥し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム２）で反応が完了したことが示 された。溶液を減圧濾過し、０．９　リットルの容量にまで濃縮した。混合物を 減圧濾過し、固形物は３　Ｘ　Ｏ，１リットルの塩化メチレンで洗浄した。この 溶液の容量は１．２　リットルであった。 この溶液を撹拌し、９３．２グラム（０，２４３モル）のＦｍｏｃ−０−（Ｔ− ブチル）−Ｌ−セリンおよび３０７グラム（０，２４３モル）のジイソプロピル カルボジイミドを加えた。混合物を１時間撹拌し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム１） により反応が完了していることが示された。 懸濁液を撹拌しながら、４４１ミリリツトル（３，６６１モル）の４−アミノメ チルピペリジンを添加し、１時間撹拌した。懸濁液を減圧濾過し、沈殿を少量の 塩化メチレンで洗浄し、濾液は塩化メチレンで１６リツトルの容量に希釈した。 この溶液を３Ｘ８．０　リットル（合計２４リツトル）の１０％（Ｗ／　Ｖ　） リン酸緩衝液　ｐＨ５，５を用いて洗浄した。塩化メチレン溶液は、３００グラ ムの硫酸ナトリウム上で乾燥し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム２）で反応が完了した ことが示された。溶液を減圧濾過し、乾燥するまで濃縮した。 残渣を０．３　リットルの塩化メチレンに溶解し、減圧濾過して固形物は２ＸＯ ，１７リツトルの塩化メチレンを用いて洗浄した。 濾液は撹拌し、０．１６リツトル（１，６９５モル）の無水酢酸および２２．４ グラム（０，２２１モル）のトリエチルアミンを添加した。溶液を１時間撹拌し た。Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム２）により反応が完了したことが示された。溶液は 油状残渣になるまで濃縮した。残渣を３Ｘ０．５　リットルのジイソプロピルエ ーテルを用いて粉体とした（ｔｒｉｌｕ＋ｘｌｅｄ）。固形物を減圧濾過し、白 色固形物を乾燥して、１１９．３グラム（Ｑ、１５７モル）の白色固形物をえた 。 磁気撹拌子をそなえたエーシンマイヤーフラスコに１７．９グラム（０，０２３ モル）の白色固形物および塩化メチレン中９５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸溶 液０．１７９　リットルを加えた。溶液を２時間撹拌し、Ｈ，Ｐ、Ｌ、Ｃ。 （９５１５０川％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル２２０ｎｍにてイソクラテ ィック、１．０　ミリリットル７分、５ミクロン、ＣＩ８カラム）により、反応 が完了していることが示された。 溶液を濃縮し、残渣は２ＸＯ，１リットルのジイソプロピルエーテルを用いて粉 体とした。固形物を減圧濾過し、乾燥して、１０．４６グラムの産物をえた（収 率６５％）。 このようにしてえられた粗産物を、さらに分離用Ｈ８Ｐ、Ｌ、Ｃ，により精製し た。精製した産物のクロマトグラム（対応するピークに星印をつけている）を図 ２に示す。 実施例２ Ｈ−３ｅｒ−＾５ｐ−Ｌ７＋−Ｐ「ｏ−ＯＨの合成磁気撹拌子をそなえた２５０ 　ミリリットルのエーシンマイヤーフラスコに１．４４グラム（０，００６９モ ル）のし−プロリン−ｔ−ブチルエステル・塩酸、３．５６グラム（０，００７ ６モル）のＦｍｏｃ−（ε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン）および３７．６ミリリツトル の塩化メチレンを加えた。懸濁液を撹拌し、０．９６グラム（０，００７６モル ）のジイソプロピルカルボジイミドおよび０．７０グラム（０，００６９モル） のトリエチルアミンを添加した。混合物を１時間撹拌した。Ｔ、Ｌ。 Ｃ，（システム１）により反応が完了したことが示された。 懸濁液を撹拌しながら、１３．８ミリリツトル（１１１４６モル）の４−アミノ メチルピペリジンを添加し、１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、沈殿を少量の塩 化メチレンで洗浄し、濾液は塩化メチレンで５ｏｏミリリツトルの容量に希釈し た。この溶液を３Ｘ２５０　ミリリットル（合計７５０　ミリリットル）の１０ ％（Ｗ　／　Ｖ　）リン酸緩衝液（ｐＨ５，５）を用いて洗浄した。塩化メチレ ン溶液は、９．４グラムの硫酸ナトリウム上で乾燥し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム ２）で反応が完了したことが示された。溶液を減圧濾過し、油状残渣となるまで 濃縮した。残渣を１８．８ミリリツトルの塩化メチレン中に溶解し、減圧濾過し て固形物は３Ｘ６．３　ミリリットルの塩化メチレンで洗浄した。 この溶液の容量は３７６ミリリツトルであった。 この溶液を撹拌し、３．１３グラム（ｏ、００７６モル）ノＦｍ０ｃ−β−（ｔ −ブチル）−Ｌ−アスパラギン酸および０、９６０グラム（０，００７６モル） のジイソプロピルカルボジイミドを加えた。混合物を１時間撹拌して、Ｔ、Ｌ、 Ｃ１（システム１）で反応が完了していることが示された。 懸濁液を撹拌して、１３８ミリリツトル（０，１１４６モル）の４−アミノメチ ルピペリジンを添加し、１時間撹拌した。 懸濁液を減圧濾過し、沈殿を少量の塩化メチレンで洗浄し、濾液は塩化メチレン で５００ミリリツトルの容量に希釈した。この溶液を３Ｘ２５０　ミリリットル （合計７５０　ミリリットル）の１０％（Ｗ／Ｖ）リン酸緩衝液（ｐＨ５，５） を用いて洗浄した。塩化メチレン溶液は、９．４グラムの硫酸ナトリウム上で乾 燥し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム２）で反応が完了したことが示された。溶液を減 圧濾過し、半分に分けて片方を油状残渣にまで濃縮した。（溶液の残り半分は他 の実験に用いた。）残渣は９４　ミリリットルの塩化メチレン中に溶解し、減圧 濾過して固形物を３Ｘ３．１３ミリリツトルの塩化メチレンで洗浄した。この溶 液の容量は１８８ミリリツトルであった。 この溶液を撹拌し、１４６グラム（０，００３８モル）のＦｍｏｃ−０−（ｔ− ブチル）−Ｌ−セリンおよび０．４８グラム（０，０Ｑ３８モル）のジイソプロ ピルカルボジイミドを加えた。混合物を１時間撹拌し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム １）により反応が完了していることが示された。 懸濁液を撹拌し、６９　ミリリットル（０，０５７３モル）の４−アミノメチル ピペリジンを添加し、１時間撹拌した。 懸濁液を減圧濾過し、沈殿は少量の塩化メチレンで洗浄し、濾液は塩化メチレン で２５０ミリリツトルの容量に希釈した。この溶液を３Ｘ１２５　ミリリットル （合計３７５ミリリツトル）の１０％（Ｗ／Ｖ）　リン酸緩衝液（ｐＨ５，５） を用いて洗浄した。塩化メチレン溶液は、４７グラムの硫酸ナトリウム上で乾燥 し、Ｔ、Ｌ、Ｃ，（システム２）で反応が完了したことが示された。溶液を減圧 濾過し、油状残渣にまで濃縮した。 その油状物を１ミリリツトルの塩化メチレンに溶解し、１７．８ミリリツトル（ ０，２３１モル）のトリフルオロ酢酸を添加し、混合物を２時間撹拌した。 溶液を油状物にまで濃縮した。油状物はＩＯミリリットルのジイソプロピルエー テルを用いて２回粉体とし、固形物を乾燥した。固形物は１０ミリリツトルの脱 イオン水中に懸濁し、１５ミリリツトルのＩＮ酢酸水溶液を添加して溶液を凍結 乾燥し、１５２グラムの粗産物をえた。粗産物のサンプルは、ＨｏＰ、Ｌ、Ｃ， （９５１５０，１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル２２０ｎ　ｍにてイソク ラティック　１．Ｑミリリットル／分、５ミクロン　０１８カラム）に付した。 結果を図３に、ペプチド産物に対応するピークに星印をつけて示す。 粗産物の全体としての収率は、８２％であると見積もられた。粗産物はさらに分 離用Ｈ，Ｐ、Ｌ、Ｃ，により精製し、最終的な収率は５３％となった。 前記した実施例は、一般的にまたは特別に記載されている、これらの実施例にお いて用いられている本発明の反応物および／または操作条件を置換することによ り成功裡に反復することができる。たとえば、２〜ＩＯのアミノ酸を含むいかな るペプチドまたはそのアシル誘導体も、連続的に適切なアミノ酸をカップリング し、必要であれば引き続き適切なアシル化剤を用いてアシル化することによって 、同様の方法で調製することができる。Ｃ７ｓが合成すべきペプチドまたはその アシル誘導体の基礎単位であるばあい、塩基に安定な保護基、たとえばトリフエ ニルメチルを用いることができる。 本合成方法において用いられる反応物は、市販されているかまたはペプチド合成 の技術においてはよく知られている方法にしたがってたやすく調製することがで きることにも注意されたい。 これまでの記載から、当業者は本発明の必須の特徴を難なくつきとめ、その意図 と範囲から逸脱することなく種々の用途および条件に適応させるべく、発明に種 々の変化および修正をもたらすことができる。よって、他の実施態様もまた請求 の範囲内にある。 ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ フロントページの続き （７２）発明者　アイノン、ジョン　ニスアメリカ合衆国、０２０１９　マサチ ューセッツ州、ベーリンハム、モニーク　ドライブ

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ−末端で修飾されているまたはされていない、２〜１０のアミノ酸残基を 含むペプチドまたはそのＮ−アシル誘導体を調製するための連続液相合成方法で あって、 （ａ）第１アミノ酸またはその誘導体はその非側鎖カルボキシル官能基および存 在し必要であればその側鎖官能基のいずれをも、塩基に安定な基によってブロッ クし、第２アミノ酸はその非側鎖アミノ官能基をＦｍｏｃによってブロックし、 存在し必要であればその側鎖官能基を塩基に安定な基によってブロックして、置 換をうけたカルボジイミドを含む有機溶媒中で、アミド結合を介して第１アミノ 酸またはその誘導体を、第２アミノ酸にカップリングさせること；（ｂ）アンモ ニア、第１級アミン、または第２級アミンを用いて前記Ｆｍｏｃをはずすこと； （ｃ）追加のアミノ酸はその非側鎖アミノ官能基をＦｍｏｃによってブロックし 、存在し必要であればその側鎖官能基を塩基に安定な基によってブロックして、 置換をうけたカルボジイミドを含む有機溶媒中で、アミド結合を介して追加のア ミノ酸をＦｍｏｃをはずしたカップリング産物にカップリングさせること；（ｄ ）アンモニア、第１級アミン、または第２級アミンを用いて前記Ｆｍｏｃをはず すこと；（ｅ）前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体の長さに達するまでス テップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すこと； （ｆ）前のステップよりえられたＦｍｏｃをはずしたカップリング産物の非側鎖 アミノ基をアシル化すること；ならびに （ｇ）前記の塩基に安定な基をはずすこと；（前記第１アミノ酸またはその誘導 体は、前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体における第１番目の残基すなわ ちＣ−末端残基に相当し、前記第２アミノ酸は前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシ ル誘導体における第１番目の残基に隣接する第２番目の残基に相当し、前記追加 のアミノ酸は前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体における第２番目の残基 に隣接する第３番目の残基に相当する； ただし、前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体が２つのアミノ酸残基を含む ばあいであれば、ステップ（ｃ）から（ｅ）までは省略される；さらに前記Ｎ− アシル誘導体でなく前記ペプチドを合成すべきばあいであれば、ステップ（ｆ） が省略される） というステップを含んでなる合成方法。
2. ２．前記有機溶媒が塩化メチレン、クロロホルム、またはジクロロエタンである 請求項１記載の合成方法。
3. ３．前記有機溶媒が塩化メチレンである請求項２記載の合成方法。
4. ４．前記の置換をうけたカルボジイミドがジイソプロピルカルボジイミド、ジシ クロヘキシルカルボジイミド、またはＮ−エチル−Ｎ−−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミドである請求項１記載の合成方法。
5. ５．前記の置換をうけたカルボジイミドがジイソプロピルカルボジイミドである 請求項４記載の合成方法。
6. ６．前記Ｆｍｏｃを、４−アミノメチルピペリジン、ピペリジン、またはトリス （２−アミノエチル）アミンを用いてはずす請求項１記載の合成方法。
7. ７．前記Ｆｍｏｃを、４−アミノメチルピペリジンを用いてはずす請求項６記載 の合成方法。
8. ８．前記のはずされたＦｍｏｃを、濾過と引き続いて酸性水溶液を用いて洗浄す ることにより除去する請求項１記載の合成方法。
9. ９．前記酸性水溶液がリン酸緩衝液である請求項８記載の合成方法。
10. １０．前記有機溶媒が塩化メチレンであり、前記Ｆｍｏｃを４−アミノメチルピ ペリジンを用いてはずす請求項８記載の合成方法。
11. １１．前記の塩基に安定な基を、トリフルオロ酢酸を用いてはずす請求項１記載 の合成方法。
12. １２．前記の塩基に安定な基を、トリフルオロ酢酸を用いてはずす請求項１０記 載の合成方法。
13. １３．前記Ｎ−アシル誘媒体を合成し、ステップ（ｆ）において強塩基を添加す る請求項１記載の合成方法。
14. １４．前記強塩基がトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンである 請求項１３記載の合成方法。
15. １５．前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体が３〜７のアミノ酸残基を含む 請求項１記載の合成方法。
16. １６．前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体が４アミノ酸残基を含む請求項 １５記載の合成方法。
17. １７．前記ペプチドまたは前記Ｎ−アシル誘導体がＮ−アセチル誘導体である請 求項１６記載の合成方法。
18. １８．前記ペプチドまたは前記Ｎ−アセチル誘導体がＨ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙ ｓ−Ｐｒｏ−ＯＨまたはアセチル−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨであ る請求項１６記載の合成方法。
19. １９．Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＬｙｓおよびＰｒｏに対する前記塩基に安定な保護基が それぞれｔ−ブチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチロキシカルボニル、およびｔ−ブチ ルである請求項１８記載の合成方法。
20. ２０．前記有機溶媒が塩化メチレン、クロロホルム、またはジクロロエタンであ る請求項１８記載の合成方法。
21. ２１．前記有機溶媒が塩化メチレンである請求項２０記載の合成方法。
22. ２２．前記の置換をうけたカルボジイミドがジイソプロピルカルボジイミド、ジ シクロヘキシルカルボジイミド、またはＮ−エチル−Ｎ−−（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミドである請求項１８記載の合成方法。
23. ２３．前記の置換をうけたカルボジイミドがジイソプロピルカルボジイミドであ る請求項２２記載の合成方法。
24. ２４．前記Ｆｍｏｃを、４−アミノメチルピペリジン、ピペリジン、またはトリ ス（２−アミノエチル）アミンを用いてはずす請求項１８記載の合成方法。
25. ２５．前記Ｆｍｏｃを、４−アミノメチルピペリジンを用いてはずす請求項２４ 記載の合成方法。
26. ２６．前記のはずされたＦｍｏｃを濾過と引き続いて酸性水溶液を用いて洗浄す ることにより除去する請求項１８記載の合成方法。
27. ２７．前記酸性水溶液がリン酸緩衝液である請求項２６記載の合成方法。
28. ２８．前記有機溶媒が塩化メチレンであり、前記Ｆｍｏｃを、４−アミノメチル ピペリジンを用いてはずす請求項２６記載の合成方法。
29. ２９．前記の塩基に安定な基を、トリフルオロ酢酸を用いてはずす請求項１８記 載の合成方法。
30. ３０．前記の塩基に安定な基を、トリフルオロ酢酸を用いてはずす請求項２９記 載の合成方法。
31. ３１．アセチル−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨを合成し、ステップ（ ｆ）において強塩基を添加する請求項１８記載の合成方法。
32. ３２．前記強塩基がトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンである 請求項３１記載の合成方法。