JP2862167B2 - 光学活性アミノ酸誘導体の回収方法 - Google Patents
光学活性アミノ酸誘導体の回収方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C269/00—Preparation of derivatives of carbamic acid, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
- C07C269/08—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
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- C07C227/40—Separation; Purification
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド合成反応に用
いた後のアシル成分回収液からの光学活性アミノ酸誘導
体の回収方法に関する。さらに詳しくは、ペプチド合成
反応回収液から、ラセミ化を回避しつつ、未反応の光学
活性アミノ酸誘導体を回収する方法に関する。
いた後のアシル成分回収液からの光学活性アミノ酸誘導
体の回収方法に関する。さらに詳しくは、ペプチド合成
反応回収液から、ラセミ化を回避しつつ、未反応の光学
活性アミノ酸誘導体を回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】通常、ペプチドの合成反応においては高
価なアミノ酸誘導体が大量に使用される。ペプチド鎖の
各伸長反応では、特に固相法では、欠損ペプチドの生成
を防ぎカップリング反応をより完全に行うために、必要
量のアミノ酸誘導体の２〜１０倍の過剰量が用いられ
る。従って、工業的ペプチド合成の場合は、コスト低減
のため、高価な原料であるアミノ酸誘導体の回収が重要
な課題となる。しかし、光学活性アミノ酸誘導体は、温
和なアルカリ処理によっても容易にラセミ化し、生理活
性ペプチドの合成原料としての使用に支障を来す。その
ため、これまでのところペプチド合成反応廃液に残存す
る大量の未反応アミノ酸誘導体を回収して再利用する有
効な方法は知られていない。
価なアミノ酸誘導体が大量に使用される。ペプチド鎖の
各伸長反応では、特に固相法では、欠損ペプチドの生成
を防ぎカップリング反応をより完全に行うために、必要
量のアミノ酸誘導体の２〜１０倍の過剰量が用いられ
る。従って、工業的ペプチド合成の場合は、コスト低減
のため、高価な原料であるアミノ酸誘導体の回収が重要
な課題となる。しかし、光学活性アミノ酸誘導体は、温
和なアルカリ処理によっても容易にラセミ化し、生理活
性ペプチドの合成原料としての使用に支障を来す。その
ため、これまでのところペプチド合成反応廃液に残存す
る大量の未反応アミノ酸誘導体を回収して再利用する有
効な方法は知られていない。
【０００３】本発明者らは、かかるアミノ酸誘導体の回
収を試みたところ、光学活性アミノ酸誘導体のラセミ化
が起こることが分かった。ラセミ化は、例えば９−フル
オレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−ヒスチ
ジンではＤ−アミノ酸の含量が３８．８％と特に顕著で
あり、またＦｍｏｃ−チロシン、Ｆｍｏｃ−アスパラギ
ン酸、Ｆｍｏｃ−アルギニン、Ｆｍｏｃ−フェニルアラ
ニン等においてもそれぞれ２．１％、１．８％、１．５
％、１．１％とＤ−アミノ酸の混在が明瞭に認められ、
従って生物活性ペプチドの合成には再使用できないこと
が明らかとなった（Ｎokihara ら、American Laborator
ies:41-45,August(1994)) 。
収を試みたところ、光学活性アミノ酸誘導体のラセミ化
が起こることが分かった。ラセミ化は、例えば９−フル
オレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−ヒスチ
ジンではＤ−アミノ酸の含量が３８．８％と特に顕著で
あり、またＦｍｏｃ−チロシン、Ｆｍｏｃ−アスパラギ
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従って生物活性ペプチドの合成には再使用できないこと
が明らかとなった（Ｎokihara ら、American Laborator
ies:41-45,August(1994)) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ペプチド合成反応回収液から未反応光学活性アミノ
酸誘導体をラセミ化を防止しながら効率的に回収する方
法を提供することにある。
は、ペプチド合成反応回収液から未反応光学活性アミノ
酸誘導体をラセミ化を防止しながら効率的に回収する方
法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラセミ化
を防止する方法を種々検討したところ、カップリングの
ために活性化されたアミノ酸誘導体のカルボキシル基を
加水分解してフリーのカルボキシル基にする過程で、強
アルカリではもちろん、弱アルカリで処理してもラセミ
化は避けられないが、これを酸性下で第三級アミンの存
在下に行えばアミノ酸誘導体活性エステルの加水分解が
起こり、しかもラセミ化が大幅に抑えられることを発見
した。さらに、回収プロセスにおいて反応終了液の回収
後直ちに大過剰の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ）等を回収液に添加するとラセミ化が殆ど起
こらないことを発見した。本発明はかかる発見に基づき
さらに研究を重ねて完成するに至ったものである。
を防止する方法を種々検討したところ、カップリングの
ために活性化されたアミノ酸誘導体のカルボキシル基を
加水分解してフリーのカルボキシル基にする過程で、強
アルカリではもちろん、弱アルカリで処理してもラセミ
化は避けられないが、これを酸性下で第三級アミンの存
在下に行えばアミノ酸誘導体活性エステルの加水分解が
起こり、しかもラセミ化が大幅に抑えられることを発見
した。さらに、回収プロセスにおいて反応終了液の回収
後直ちに大過剰の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ）等を回収液に添加するとラセミ化が殆ど起
こらないことを発見した。本発明はかかる発見に基づき
さらに研究を重ねて完成するに至ったものである。
【０００６】即ち、本発明の要旨は、ペプチド合成反応
に用いた後のアシル成分回収液に含まれる未反応の光学
活性アミノ酸誘導体に５〜２０倍当量の１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７
−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキ
シ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベン
ゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）またはＮ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮ
Ｂ）を該ペプチド合成反応回収液に添加した後、濃縮
し、残留物を第三級アミンを含むｐＨ２〜４の緩衝液で
処理し、次いで酸性下に抽出して精製することを特徴と
する、ペプチド合成反応に用いた後のアシル成分回収液
から光学活性アミノ酸誘導体を回収する方法に関する。
に用いた後のアシル成分回収液に含まれる未反応の光学
活性アミノ酸誘導体に５〜２０倍当量の１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７
−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキ
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ゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）またはＮ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮ
Ｂ）を該ペプチド合成反応回収液に添加した後、濃縮
し、残留物を第三級アミンを含むｐＨ２〜４の緩衝液で
処理し、次いで酸性下に抽出して精製することを特徴と
する、ペプチド合成反応に用いた後のアシル成分回収液
から光学活性アミノ酸誘導体を回収する方法に関する。
【０００７】以下に本発明について詳細に説明する。本
発明の光学活性アミノ酸誘導体の回収方法は、従来知ら
れているアミノ酸誘導体回収方法においてラセミ化の起
こるプロセスを改良し、回収アミノ酸誘導体の再使用が
可能な回収法として完成させたものである。そして原則
として光学活性アミノ酸誘導体の保護基の種類を問わず
適用が可能である。
発明の光学活性アミノ酸誘導体の回収方法は、従来知ら
れているアミノ酸誘導体回収方法においてラセミ化の起
こるプロセスを改良し、回収アミノ酸誘導体の再使用が
可能な回収法として完成させたものである。そして原則
として光学活性アミノ酸誘導体の保護基の種類を問わず
適用が可能である。
【０００８】本発明に使用される光学活性アミノ酸誘導
体を含む溶液は、工業的なペプチド合成反応におけるカ
ップリング反応の各ステップから得られるペプチド合成
反応回収液（以下、反応廃液と略す。）である。この反
応廃液中には、通常ペプチド合成カップリング反応に消
費された光学活性アミノ酸誘導体の１倍ないし１０倍量
程の光学活性アミノ酸誘導体が未反応のアシル成分とし
て含まれている。この反応廃液は、本発明者らの研究に
よれば、そのまま保存しておくと、室温ではもちろん−
２０℃においても経時的にラセミ化が進行する。従っ
て、本発明の光学活性アミノ酸誘導体の回収方法は、反
応廃液を回収した後遅滞なく行うのが好ましい。
体を含む溶液は、工業的なペプチド合成反応におけるカ
ップリング反応の各ステップから得られるペプチド合成
反応回収液（以下、反応廃液と略す。）である。この反
応廃液中には、通常ペプチド合成カップリング反応に消
費された光学活性アミノ酸誘導体の１倍ないし１０倍量
程の光学活性アミノ酸誘導体が未反応のアシル成分とし
て含まれている。この反応廃液は、本発明者らの研究に
よれば、そのまま保存しておくと、室温ではもちろん−
２０℃においても経時的にラセミ化が進行する。従っ
て、本発明の光学活性アミノ酸誘導体の回収方法は、反
応廃液を回収した後遅滞なく行うのが好ましい。
【０００９】反応廃液は通常メチレンクロライドまたは
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の溶液である。その他
の反応溶媒が使用された場合であっても、本発明のため
の回収原料として用いるのになんら支障はない。
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の溶液である。その他
の反応溶媒が使用された場合であっても、本発明のため
の回収原料として用いるのになんら支障はない。
【００１０】反応廃液の処理に入る前に、まずＨＯＢ
ｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯｂｔ、またはＨＯＮＢを反応廃液
に添加する。これが本発明方法の第１の特徴である。Ｈ
ＯＢｔ等の添加量は、反応廃液中に含まれる光学活性ア
ミノ酸誘導体の５〜２０倍当量である。５倍当量未満で
は、ラセミ化防止の効果が充分でない傾向があり、２０
倍当量を超えてもそれに見合う効果が得られない。ここ
に使用されるＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯｂｔ、および
ＨＯＮＢはいずれも市販品（例えば、カルビオケム−ノ
バビオケム ＡＧ社製、パーセプティブ−ビオサーチ社
製等）を使用することができる。
ｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯｂｔ、またはＨＯＮＢを反応廃液
に添加する。これが本発明方法の第１の特徴である。Ｈ
ＯＢｔ等の添加量は、反応廃液中に含まれる光学活性ア
ミノ酸誘導体の５〜２０倍当量である。５倍当量未満で
は、ラセミ化防止の効果が充分でない傾向があり、２０
倍当量を超えてもそれに見合う効果が得られない。ここ
に使用されるＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯｂｔ、および
ＨＯＮＢはいずれも市販品（例えば、カルビオケム−ノ
バビオケム ＡＧ社製、パーセプティブ−ビオサーチ社
製等）を使用することができる。
【００１１】次に、ＨＯＢｔ等を添加した反応廃液の溶
媒を留去する。ラセミ化を防止するため、溶媒の留去は
減圧下に室温以下、好ましくは４℃以下で行う。得られ
た残留物を酢酸エチル等の水と２層を形成する有機溶媒
で抽出する。
媒を留去する。ラセミ化を防止するため、溶媒の留去は
減圧下に室温以下、好ましくは４℃以下で行う。得られ
た残留物を酢酸エチル等の水と２層を形成する有機溶媒
で抽出する。
【００１２】得られた抽出液を酸性緩衝液中の第三級ア
ミンで処理して、活性化されている光学活性アミノ酸誘
導体のカルボキシル基を加水分解し、遊離のカルボキシ
ル基とする。これが本発明の第２の特徴である。通常の
方法では、ラセミ化を極小に抑えるべく重炭酸ナトリウ
ム水のような弱アルカリで処理して加水分解を行うが、
この場合は強アルカリで処理する場合に比べてラセミ化
は著しく低下するものの、再使用に耐える程の光学純度
のアミノ酸誘導体を回収することはできない。しかし、
本発明の方法、即ち、大過剰のＨＯＢｔ等の添加および
酸性下での第三級アミンによる処理では、活性化された
カルボキシル基が完全に加水分解されて遊離のカルボキ
シル基が得られ、しかもペプチド合成に再使用する場合
の障害となるほどのラセミ化は起こらない。
ミンで処理して、活性化されている光学活性アミノ酸誘
導体のカルボキシル基を加水分解し、遊離のカルボキシ
ル基とする。これが本発明の第２の特徴である。通常の
方法では、ラセミ化を極小に抑えるべく重炭酸ナトリウ
ム水のような弱アルカリで処理して加水分解を行うが、
この場合は強アルカリで処理する場合に比べてラセミ化
は著しく低下するものの、再使用に耐える程の光学純度
のアミノ酸誘導体を回収することはできない。しかし、
本発明の方法、即ち、大過剰のＨＯＢｔ等の添加および
酸性下での第三級アミンによる処理では、活性化された
カルボキシル基が完全に加水分解されて遊離のカルボキ
シル基が得られ、しかもペプチド合成に再使用する場合
の障害となるほどのラセミ化は起こらない。
【００１３】本発明に使用される第三級アミンとして
は、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジイソプロ
ピルエチルアミン等が挙げられる。これらは市販品をそ
のまま使用することができる。かかる第三級アミンは、
通常、ｐＨ２〜４の酸性緩衝液中に０．０５Ｍ〜０．５
Ｍ程度の濃度で溶解し、先に得られた抽出液と混ぜ合わ
せ・攪拌することにより光学活性アミノ酸誘導体のカル
ボキシル基の加水分解を行う。
は、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジイソプロ
ピルエチルアミン等が挙げられる。これらは市販品をそ
のまま使用することができる。かかる第三級アミンは、
通常、ｐＨ２〜４の酸性緩衝液中に０．０５Ｍ〜０．５
Ｍ程度の濃度で溶解し、先に得られた抽出液と混ぜ合わ
せ・攪拌することにより光学活性アミノ酸誘導体のカル
ボキシル基の加水分解を行う。
【００１４】酸性緩衝液としては、特に制限はないが、
リン酸緩衝液等の無機酸緩衝液が特に好ましい。緩衝液
のｐＨは４を超えるとラセミ化が起こりやすく、２未満
では、他の酸に敏感な保護基が切断されるおそれが増え
る。
リン酸緩衝液等の無機酸緩衝液が特に好ましい。緩衝液
のｐＨは４を超えるとラセミ化が起こりやすく、２未満
では、他の酸に敏感な保護基が切断されるおそれが増え
る。
【００１５】処理温度は４〜４０℃、好ましくは１０℃
〜室温である。０℃未満では加水分解反応が遅く、活性
化されたカルボキシル基が加水分解されずに一部残る恐
れがある。４０℃を超えるとラセミ化のみならずその他
の副反応も起こりやすくなる。
〜室温である。０℃未満では加水分解反応が遅く、活性
化されたカルボキシル基が加水分解されずに一部残る恐
れがある。４０℃を超えるとラセミ化のみならずその他
の副反応も起こりやすくなる。
【００１６】こうして得られるカルボキシル基が遊離に
なった光学活性アミノ酸誘導体を単離するには、通常の
抽出・精製法が利用できる。例えば、上記の酸性緩衝液
を水と二層を形成する有機溶媒とよく振り混ぜ、静置し
て有機溶媒層に光学活性アミノ酸誘導体を移行せしめ、
水または食塩水で有機溶媒層をよく洗い、無水硫酸ソー
ダ、硫酸マグネシウム等でよく乾燥した後、有機溶媒を
減圧下に留去し、石油エーテル等を加えて固化あるいは
生成する結晶を濾過して集め、必要があれば適当な溶媒
から再結晶する。また、必要に応じて、クロマトグラフ
ィーで精製する工程を中間に導入してもよい。酸性緩衝
液から光学活性アミノ酸誘導体を抽出するための有機溶
媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチレンクロリ
ド、クロロホルム等の比較的極性が大きくかつ水と二層
を形成する溶媒が好ましい。
なった光学活性アミノ酸誘導体を単離するには、通常の
抽出・精製法が利用できる。例えば、上記の酸性緩衝液
を水と二層を形成する有機溶媒とよく振り混ぜ、静置し
て有機溶媒層に光学活性アミノ酸誘導体を移行せしめ、
水または食塩水で有機溶媒層をよく洗い、無水硫酸ソー
ダ、硫酸マグネシウム等でよく乾燥した後、有機溶媒を
減圧下に留去し、石油エーテル等を加えて固化あるいは
生成する結晶を濾過して集め、必要があれば適当な溶媒
から再結晶する。また、必要に応じて、クロマトグラフ
ィーで精製する工程を中間に導入してもよい。酸性緩衝
液から光学活性アミノ酸誘導体を抽出するための有機溶
媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチレンクロリ
ド、クロロホルム等の比較的極性が大きくかつ水と二層
を形成する溶媒が好ましい。
【００１７】本発明の方法によって得られる結晶状また
は固化した光学活性アミノ酸誘導体の光学純度は高く、
実施例に示すように、最もラセミ化しやすいＦｍｏｃ−
ヒスチジンでさえもＬ−体の混入は粗結晶で１％未満、
再結晶により０．１％未満となり、Ｆｍｏｃ−フェニル
アラニン、Ｆｍｏｃ−チロシン等では粗結晶で０．５％
未満、再結晶で０．０８％未満となる。さらにその他の
よりラセミ化し難いＦｍｏｃ−アミノ酸の場合は粗結晶
で０．１％未満すなわちＤＬ分析の精度の限界以下であ
り、これらはペプチド合成の原料として再使用するのに
充分な光学純度といえる。これら結晶状の光学活性アミ
ノ酸誘導体の回収率は、アミノ酸誘導体の種類にもよる
が、５０〜９０モル％である。本発明の方法により、工
業的ペプチド合成法の経済性が大きく改善される。ま
た、資源保護の観点からも大きな前進となる。
は固化した光学活性アミノ酸誘導体の光学純度は高く、
実施例に示すように、最もラセミ化しやすいＦｍｏｃ−
ヒスチジンでさえもＬ−体の混入は粗結晶で１％未満、
再結晶により０．１％未満となり、Ｆｍｏｃ−フェニル
アラニン、Ｆｍｏｃ−チロシン等では粗結晶で０．５％
未満、再結晶で０．０８％未満となる。さらにその他の
よりラセミ化し難いＦｍｏｃ−アミノ酸の場合は粗結晶
で０．１％未満すなわちＤＬ分析の精度の限界以下であ
り、これらはペプチド合成の原料として再使用するのに
充分な光学純度といえる。これら結晶状の光学活性アミ
ノ酸誘導体の回収率は、アミノ酸誘導体の種類にもよる
が、５０〜９０モル％である。本発明の方法により、工
業的ペプチド合成法の経済性が大きく改善される。ま
た、資源保護の観点からも大きな前進となる。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。
【００１９】実施例１ プロトタイプの連続フローセミラージスケールペプチド
自動合成機を用い、Ｎｏｋｉｈａｒａらの方法（Americ
an Laboratories : 41-45 August(1984)) に従って行わ
れたペプチド合成カップリング反応の回収液を用いて、
本発明の方法による光学活性アミノ酸誘導体の回収を実
施した。即ち、光学活性アミノ酸誘導体としては最もラ
セミ化のし易いヒスチジン誘導体を選び、Ｎα−位の保
護基としてＦｍｏｃ基を、カルボキシル基の活性化にベ
ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリ
ジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロフォスフェート
（ＰｙＢＯＰ）を用いて行なったＬ−ＮαＦｍｏｃ−ト
リチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカップリング反応の回収
液を使用して未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔ
ｒｔ）ヒスチジンの回収を行なった。なお、ＰｙＢＯＰ
やＢＯＰ等のホスホニウム化合物を用いる高効率合成の
回収液は、副生成物であるピリジノ誘導体やヘキサメチ
ルホスホトリアミド等が混在するため、回収は比較的難
しい。
自動合成機を用い、Ｎｏｋｉｈａｒａらの方法（Americ
an Laboratories : 41-45 August(1984)) に従って行わ
れたペプチド合成カップリング反応の回収液を用いて、
本発明の方法による光学活性アミノ酸誘導体の回収を実
施した。即ち、光学活性アミノ酸誘導体としては最もラ
セミ化のし易いヒスチジン誘導体を選び、Ｎα−位の保
護基としてＦｍｏｃ基を、カルボキシル基の活性化にベ
ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリ
ジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロフォスフェート
（ＰｙＢＯＰ）を用いて行なったＬ−ＮαＦｍｏｃ−ト
リチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカップリング反応の回収
液を使用して未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔ
ｒｔ）ヒスチジンの回収を行なった。なお、ＰｙＢＯＰ
やＢＯＰ等のホスホニウム化合物を用いる高効率合成の
回収液は、副生成物であるピリジノ誘導体やヘキサメチ
ルホスホトリアミド等が混在するため、回収は比較的難
しい。
【００２０】Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒ
スチジンの回収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液１７００ｍｌを回収し
た。この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）
ヒスチジンを約３２ｇ（５２．８ｍＭ）（活性エステル
状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢＯＰ
を２７．５ｇ（５２．８ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフォリ
ン（ＮＭＭ）を７９．２．ｍＭ含む。回収後、直ちにＨ
ＯＢｔ８０．９ｇ（５２８ｍＭ）をその反応廃液中に加
え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行な
った。
スチジンの回収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液１７００ｍｌを回収し
た。この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）
ヒスチジンを約３２ｇ（５２．８ｍＭ）（活性エステル
状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢＯＰ
を２７．５ｇ（５２．８ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフォリ
ン（ＮＭＭ）を７９．２．ｍＭ含む。回収後、直ちにＨ
ＯＢｔ８０．９ｇ（５２８ｍＭ）をその反応廃液中に加
え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行な
った。
【００２１】反応廃液をオイルポンプによる減圧下に２
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）１０００ｍｌを加え、生
じた沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つ
いでメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈
殿を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ
−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン２２ｇ
を得た。回収率は約７０％、光学純度は９９．９０％ｅ
ｅであった。
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）１０００ｍｌを加え、生
じた沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つ
いでメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈
殿を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ
−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン２２ｇ
を得た。回収率は約７０％、光学純度は９９．９０％ｅ
ｅであった。
【００２２】回収したＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔ
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、薄層クロマトグラフィーお
よび逆相ＨＰＬＣで単一成分であることを確認した上、
リキッドセカンダリーイオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）法
により行った。逆相ＨＰＬＣは、島津製作所製のＳｙｎ
ＰｒｏＰｅｐカラム（商標名）ＲＰＣ１８（４．６×１
５０ｍｍ）を使用した。流速は１．２ｍｌ／分、検出は
ＵＶ法（２１５ｎｍ）で行った。溶出条件は、Ａ液を
０．０５Ｍトリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．
２５）、Ｂ液をアセトニトリルとするグラディエント法
で溶出した。ＬＳＩＭＳは、クレイトス社製磁場型質量
分析測定装置を用いて測定した。その光学純度は、既に
発表した方法に従い（Nokiharaら、Frontiers and Hori
zones in Amino Acid Research、p391-395、1992) 、島
津ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を用いて測定した。
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、薄層クロマトグラフィーお
よび逆相ＨＰＬＣで単一成分であることを確認した上、
リキッドセカンダリーイオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）法
により行った。逆相ＨＰＬＣは、島津製作所製のＳｙｎ
ＰｒｏＰｅｐカラム（商標名）ＲＰＣ１８（４．６×１
５０ｍｍ）を使用した。流速は１．２ｍｌ／分、検出は
ＵＶ法（２１５ｎｍ）で行った。溶出条件は、Ａ液を
０．０５Ｍトリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．
２５）、Ｂ液をアセトニトリルとするグラディエント法
で溶出した。ＬＳＩＭＳは、クレイトス社製磁場型質量
分析測定装置を用いて測定した。その光学純度は、既に
発表した方法に従い（Nokiharaら、Frontiers and Hori
zones in Amino Acid Research、p391-395、1992) 、島
津ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を用いて測定した。
【００２３】実施例２ Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−ｔブチルチロシンの回収 上記の保護ヒスチジンの回収の場合と同様に、Ｌ−Ｎα
Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチルチロシンのカップリングに使用し
た反応廃液約１０００ｍｌを回収した。この反応廃液
は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、Ｌ−ＮαＦ
ｍｏｃ−ｔ−ブチルチロシン１５．２ｇ（３３．０ｍ
Ｍ）を、ＰｙＢＯＰ１７．２ｇと、Ｎ−メチルモルフォ
リン（ＮＭＭ）３．６３ｍｌとで活性化したものであ
る。回収後、直ちにＨＯＢｔ５０．５ｇ（３３０ｍＭ）
をその反応廃液中に加え、−２０℃で保存した。２日以
内に以下の処理を行なった。
Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチルチロシンのカップリングに使用し
た反応廃液約１０００ｍｌを回収した。この反応廃液
は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、Ｌ−ＮαＦ
ｍｏｃ−ｔ−ブチルチロシン１５．２ｇ（３３．０ｍ
Ｍ）を、ＰｙＢＯＰ１７．２ｇと、Ｎ−メチルモルフォ
リン（ＮＭＭ）３．６３ｍｌとで活性化したものであ
る。回収後、直ちにＨＯＢｔ５０．５ｇ（３３０ｍＭ）
をその反応廃液中に加え、−２０℃で保存した。２日以
内に以下の処理を行なった。
【００２４】反応廃液をオイルポンプによる減圧下に２
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物を酢酸エチル１０００ｍｌに溶解
し、０．０５Ｍトリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ
２．２５）３００ｍｌを加え、５分間振り混ぜ、静置し
たのち水層を除去した。これを３回繰り返したのち酢酸
エチル層を分取し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥させた後減圧濃縮し、石油エーテルを添加
して沈殿させた。再結晶はアセトニトリルから行った。
結晶を濾過・乾燥してＬ−ＮαＦｍｏｃ−ｔ−ブチルチ
ロシン７．６０ｇを得た。回収率は５０％、光学純度は
９９．９０％ｅｅであった。
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物を酢酸エチル１０００ｍｌに溶解
し、０．０５Ｍトリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ
２．２５）３００ｍｌを加え、５分間振り混ぜ、静置し
たのち水層を除去した。これを３回繰り返したのち酢酸
エチル層を分取し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥させた後減圧濃縮し、石油エーテルを添加
して沈殿させた。再結晶はアセトニトリルから行った。
結晶を濾過・乾燥してＬ−ＮαＦｍｏｃ−ｔ−ブチルチ
ロシン７．６０ｇを得た。回収率は５０％、光学純度は
９９．９０％ｅｅであった。
【００２５】回収したＬ−ＮαＦｍｏｃ−ｔ−ブチルチ
ロシンの同定は、逆相ＨＰＬＣで単一成分であることを
確認した上、リキッドセカンダリーイオン質量分析（Ｌ
ＳＩＭＳ）により行った。逆相ＨＰＬＣは、島津製作所
製のＳｙｎＰｒｏＰｅｐカラム（商標名）ＲＰＣ１８
（４．６×１５０ｍｍ）を使用した。流速は１．２ｍｌ
／分、検出はＵＶ法（２１５ｎｍ）で行った。溶出条件
は、Ａ液を０．０５Ｍトリエチルアミン−リン酸緩衝液
（ｐＨ２．２５）、Ｂ液をアセトニトリルとするグラデ
ィエント法で溶出した。ＬＳＩＭＳは、クレイトス社製
磁場型質量分析測定装置を用いて測定した。その光学純
度は、Nokiharaらの方法（Frontiers and Horizones in
Amino Acid Research、p391-395、1992) に従い、島津
ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を用いて測定した。
ロシンの同定は、逆相ＨＰＬＣで単一成分であることを
確認した上、リキッドセカンダリーイオン質量分析（Ｌ
ＳＩＭＳ）により行った。逆相ＨＰＬＣは、島津製作所
製のＳｙｎＰｒｏＰｅｐカラム（商標名）ＲＰＣ１８
（４．６×１５０ｍｍ）を使用した。流速は１．２ｍｌ
／分、検出はＵＶ法（２１５ｎｍ）で行った。溶出条件
は、Ａ液を０．０５Ｍトリエチルアミン−リン酸緩衝液
（ｐＨ２．２５）、Ｂ液をアセトニトリルとするグラデ
ィエント法で溶出した。ＬＳＩＭＳは、クレイトス社製
磁場型質量分析測定装置を用いて測定した。その光学純
度は、Nokiharaらの方法（Frontiers and Horizones in
Amino Acid Research、p391-395、1992) に従い、島津
ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を用いて測定した。
【００２６】実施例３ Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−フェニルアラニンの回収 上記の保護ヒスチジンの回収の場合と同様に、Ｌ−Ｎα
Ｆｍｏｃ−フェニルアラニンのカップリングに使用した
反応廃液約９００ｍｌを回収した。この反応廃液は、ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、Ｌ−ＮαＦｍｏｃ
−フェニルアラニンを１０．２ｇ（２６．４ｍＭ）、Ｐ
ｙＢＯＰを１３．７ｇ、Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭ
Ｍ）を２．９０ｍｌとで活性化したものである。
Ｆｍｏｃ−フェニルアラニンのカップリングに使用した
反応廃液約９００ｍｌを回収した。この反応廃液は、ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、Ｌ−ＮαＦｍｏｃ
−フェニルアラニンを１０．２ｇ（２６．４ｍＭ）、Ｐ
ｙＢＯＰを１３．７ｇ、Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭ
Ｍ）を２．９０ｍｌとで活性化したものである。
【００２７】回収後、直ちにＨＯＢｔ４０．４ｇ（２６
４ｍＭ）をその反応廃液中に加え、−２０℃で保存し
た。２日以内に以下の処理を行なった。反応廃液をオイ
ルポンプによる減圧下に２５℃の水浴中にてロータリエ
バポレータでＤＭＦを留去した。得られた残留物を酢酸
エチル１０００ｍｌに溶解し、０．０５Ｍトリエチルア
ミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）３００ｍｌと５分
間振り混ぜ、約３０分間静置して２層に分離させ酢酸エ
チル層を分取した。この操作を３回繰り返した後、酢酸
エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥させた後減圧濃縮し、石油エーテルを添加して沈殿
させ、さらに再結晶を酢酸エチル−石油エーテルより行
った。結晶を濾過・乾燥してＬ−ＮαＦｍｏｃ−フェニ
ルアラニン７．１４ｇを得た。回収率は７２％、光学純
度は９９．９０％ｅｅであった。
４ｍＭ）をその反応廃液中に加え、−２０℃で保存し
た。２日以内に以下の処理を行なった。反応廃液をオイ
ルポンプによる減圧下に２５℃の水浴中にてロータリエ
バポレータでＤＭＦを留去した。得られた残留物を酢酸
エチル１０００ｍｌに溶解し、０．０５Ｍトリエチルア
ミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）３００ｍｌと５分
間振り混ぜ、約３０分間静置して２層に分離させ酢酸エ
チル層を分取した。この操作を３回繰り返した後、酢酸
エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥させた後減圧濃縮し、石油エーテルを添加して沈殿
させ、さらに再結晶を酢酸エチル−石油エーテルより行
った。結晶を濾過・乾燥してＬ−ＮαＦｍｏｃ−フェニ
ルアラニン７．１４ｇを得た。回収率は７２％、光学純
度は９９．９０％ｅｅであった。
【００２８】回収したＬ−ＮαＦｍｏｃ−フェニルアラ
ニンの同定は、薄層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰ
ＬＣで単一成分であることを確認した上、リキッドセカ
ンダリーイオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）により行った。
逆相ＨＰＬＣは、島津製作所製のＳｙｎＰｒｏＰｅｐカ
ラム（商標名）ＲＰＣ１８（４．６×１５０ｍｍ）を使
用した。流速は１．２ｍｌ／分、検出はＵＶ法（２１５
ｎｍ）で行った。溶出条件は、Ａ液を０．０５Ｍトリエ
チルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）、Ｂ液をア
セトニトリルとするグラディエント法で溶出した。ＬＳ
ＩＭＳは、クレイトス社製磁場型質量分析測定装置を用
いて測定した。その光学純度は、Nokiharaらの方法（Fr
ontiers and Horizones in Amino Acid Research、p391
-395、1992) に従い、島津ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を
用いて測定した。
ニンの同定は、薄層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰ
ＬＣで単一成分であることを確認した上、リキッドセカ
ンダリーイオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）により行った。
逆相ＨＰＬＣは、島津製作所製のＳｙｎＰｒｏＰｅｐカ
ラム（商標名）ＲＰＣ１８（４．６×１５０ｍｍ）を使
用した。流速は１．２ｍｌ／分、検出はＵＶ法（２１５
ｎｍ）で行った。溶出条件は、Ａ液を０．０５Ｍトリエ
チルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）、Ｂ液をア
セトニトリルとするグラディエント法で溶出した。ＬＳ
ＩＭＳは、クレイトス社製磁場型質量分析測定装置を用
いて測定した。その光学純度は、Nokiharaらの方法（Fr
ontiers and Horizones in Amino Acid Research、p391
-395、1992) に従い、島津ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を
用いて測定した。
【００２９】実施例４ Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンの回
収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液６００ｍｌを回収した。
この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中
に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒ
スチジンを約８．０ｇ（１３．２ｍＭ）（活性エステル
状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢＯＰ
を６．９ｇ（１３．２ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフォリン
（ＮＭＭ）を１４．５．ｍｌ含む。回収後、直ちにＨＯ
Ａｔ１８．０ｇ（１３２ｍＭ）をその反応廃液中に加
え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行な
った。
収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液６００ｍｌを回収した。
この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中
に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒ
スチジンを約８．０ｇ（１３．２ｍＭ）（活性エステル
状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢＯＰ
を６．９ｇ（１３．２ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフォリン
（ＮＭＭ）を１４．５．ｍｌ含む。回収後、直ちにＨＯ
Ａｔ１８．０ｇ（１３２ｍＭ）をその反応廃液中に加
え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行な
った。
【００３０】反応廃液をオイルポンプによる減圧下に２
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）３００ｍｌを加え、生じ
た沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つい
でメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈殿
を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ−
ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン５．７ｇ
を得た。回収率は約７２％、光学純度は９９．９３％ｅ
ｅであった。
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）３００ｍｌを加え、生じ
た沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つい
でメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈殿
を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ−
ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン５．７ｇ
を得た。回収率は約７２％、光学純度は９９．９３％ｅ
ｅであった。
【００３１】回収したＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔ
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、実施例１と同様にして、薄
層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣで単一成分で
あることを確認した上、リキッドセカンダリーイオン質
量分析（ＬＳＩＭＳ）法により行った。
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、実施例１と同様にして、薄
層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣで単一成分で
あることを確認した上、リキッドセカンダリーイオン質
量分析（ＬＳＩＭＳ）法により行った。
【００３２】実施例５ Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンの回
収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液１７００ｍｌを回収し
た。この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）
ヒスチジンを約６．０６ｇ（１０．０ｍＭ）（活性エス
テル状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢ
ＯＰを５．２１ｇ（１０．０ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフ
ォリン（ＮＭＭ）を１．１０ｍｌ含む。回収後、直ちに
ＨＯＯｂｔ１２．１ｇ（８０ｍＭ）をその反応廃液中に
加え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行
なった。
収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液１７００ｍｌを回収し
た。この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）
ヒスチジンを約６．０６ｇ（１０．０ｍＭ）（活性エス
テル状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢ
ＯＰを５．２１ｇ（１０．０ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフ
ォリン（ＮＭＭ）を１．１０ｍｌ含む。回収後、直ちに
ＨＯＯｂｔ１２．１ｇ（８０ｍＭ）をその反応廃液中に
加え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行
なった。
【００３３】反応廃液をオイルポンプによる減圧下に２
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）４００ｍｌを加え、生じ
た沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つい
でメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈殿
を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ−
ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン４．３ｇ
を得た。回収率は約７１％、光学純度は９９．９２％ｅ
ｅであった。
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）４００ｍｌを加え、生じ
た沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つい
でメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈殿
を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ−
ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン４．３ｇ
を得た。回収率は約７１％、光学純度は９９．９２％ｅ
ｅであった。
【００３４】回収したＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔ
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、実施例１と同様にして、薄
層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣで単一成分で
あることを確認した上、リキッドセカンダリーイオン質
量分析（ＬＳＩＭＳ）法により行った。
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、実施例１と同様にして、薄
層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣで単一成分で
あることを確認した上、リキッドセカンダリーイオン質
量分析（ＬＳＩＭＳ）法により行った。
【００３５】実施例６ Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンの回
収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液１７００ｍｌを回収し
た。この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）
ヒスチジンを約３２ｇ（５２．８ｍＭ）（活性エステル
状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢＯＰ
を２７．５ｇ（５２．８ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフォリ
ン（ＮＭＭ）を７９．２．ｍＭ含む。回収後、直ちにＨ
ＯＮＢ９４．６ｇ（５２８ｍＭ）をその反応廃液中に加
え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行な
った。
収 Ｌ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジンのカ
ップリングに使用した反応廃液１７００ｍｌを回収し
た。この反応廃液は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中に、未反応のＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）
ヒスチジンを約３２ｇ（５２．８ｍＭ）（活性エステル
状で含まれるがヒスチジン換算したもの）、ＰｙＢＯＰ
を２７．５ｇ（５２．８ｍＭ）、Ｎ−メチルモルフォリ
ン（ＮＭＭ）を７９．２．ｍＭ含む。回収後、直ちにＨ
ＯＮＢ９４．６ｇ（５２８ｍＭ）をその反応廃液中に加
え、−２０℃で保存した。２日以内に以下の処理を行な
った。
【００３６】反応廃液をオイルポンプによる減圧下に２
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）１０００ｍｌを加え、生
じた沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つ
いでメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈
殿を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ
−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン２３ｇ
を得た。回収率は約７３％、光学純度は９９．９２％ｅ
ｅであった。
５℃の水浴中にてロータリエバポレータでＤＭＦを留去
した。得られた残留物に０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）１０００ｍｌを加え、生
じた沈殿を濾取し、水で５回洗浄した後乾燥させた。つ
いでメタノールに溶解し、水を添加して沈殿させた。沈
殿を集め、乾燥したのち、トルエンから再結晶して、Ｌ
−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔｒｔ）ヒスチジン２３ｇ
を得た。回収率は約７３％、光学純度は９９．９２％ｅ
ｅであった。
【００３７】回収したＬ−ＮαＦｍｏｃ−トリチル（Ｔ
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、実施例１と同様にして、薄
層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣで単一成分で
あることを確認した上、リキッドセカンダリーイオン質
量分析（ＬＳＩＭＳ）法により行った。
ｒｔ）ヒスチジンの同定は、実施例１と同様にして、薄
層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣで単一成分で
あることを確認した上、リキッドセカンダリーイオン質
量分析（ＬＳＩＭＳ）法により行った。
【００３８】実施例７ Ｌ−Ｎα−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏ
ｃ）−フェニルアラニンの回収 前記の保護フェニルアラニンの回収の場合と同様に、Ｌ
−ＮαＢｏｃ−フェニルアラニンのカップリングに使用
した反応廃液約９００ｍｌを回収した。この反応廃液
は、メチレンクロライド中で、Ｌ−ＮαＢｏｃ−フェニ
ルアラニン２．６５ｇ（１０．０ｍＭ）を、ＰｙＢＯＰ
４．６６ｇおよびＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）
１．１０ｍｌで活性化したものである。
ｃ）−フェニルアラニンの回収 前記の保護フェニルアラニンの回収の場合と同様に、Ｌ
−ＮαＢｏｃ−フェニルアラニンのカップリングに使用
した反応廃液約９００ｍｌを回収した。この反応廃液
は、メチレンクロライド中で、Ｌ−ＮαＢｏｃ−フェニ
ルアラニン２．６５ｇ（１０．０ｍＭ）を、ＰｙＢＯＰ
４．６６ｇおよびＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）
１．１０ｍｌで活性化したものである。
【００３９】回収後、直ちにＨＯＢｔ６．７５ｇ（５０
ｍＭ）をその反応廃液中に加え、−２０℃で保存した。
２日以内に以下の処理を行なった。反応廃液をオイルポ
ンプによる減圧下に２５℃の水浴中にてロータリエバポ
レータでＤＭＦを留去した。得られた残留物を酢酸エチ
ル５００ｍｌに溶解し、０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）２００ｍｌと５分間振り
混ぜ、約３０分間静置して２層に分離させ酢酸エチル層
を分取した。この操作を３回繰り返した後、酢酸エチル
層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せた後減圧濃縮し、石油エーテルを添加して沈殿させ、
さらに再結晶を酢酸エチル−石油エーテルより行った。
結晶を濾過・乾燥してＬ−ＮαＢｏｃ−フェニルアラニ
ン７．５０ｇを得た。回収率は７５％、光学純度は９
９．９２％ｅｅであった。
ｍＭ）をその反応廃液中に加え、−２０℃で保存した。
２日以内に以下の処理を行なった。反応廃液をオイルポ
ンプによる減圧下に２５℃の水浴中にてロータリエバポ
レータでＤＭＦを留去した。得られた残留物を酢酸エチ
ル５００ｍｌに溶解し、０．０５Ｍトリエチルアミン−
リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）２００ｍｌと５分間振り
混ぜ、約３０分間静置して２層に分離させ酢酸エチル層
を分取した。この操作を３回繰り返した後、酢酸エチル
層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せた後減圧濃縮し、石油エーテルを添加して沈殿させ、
さらに再結晶を酢酸エチル−石油エーテルより行った。
結晶を濾過・乾燥してＬ−ＮαＢｏｃ−フェニルアラニ
ン７．５０ｇを得た。回収率は７５％、光学純度は９
９．９２％ｅｅであった。
【００４０】回収したＬ−ＮαＢｏｃ−フェニルアラニ
ンの同定は、薄層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬ
Ｃで単一成分であることを確認した上、リキッドセカン
ダリーイオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）により行った。逆
相ＨＰＬＣは、島津製作所製のＳｙｎＰｒｏＰｅｐカラ
ム（商標名）ＲＰＣ１８（４．６×１５０ｍｍ）を使用
した。流速は１．２ｍｌ／分、検出はＵＶ法（２１５ｎ
ｍ）で行った。溶出条件は、Ａ液を０．０５Ｍトリエチ
ルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）、Ｂ液をアセ
トニトリルとするグラディエント法で溶出した。ＬＳＩ
ＭＳは、クレイトス社製磁場型質量分析測定装置を用い
て測定した。その光学純度は、Nokiharaらの方法（Fron
tiers and Horizones in Amino Acid Research、p391-3
95、1992) に従い、島津ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を用
いて測定した。
ンの同定は、薄層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬ
Ｃで単一成分であることを確認した上、リキッドセカン
ダリーイオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）により行った。逆
相ＨＰＬＣは、島津製作所製のＳｙｎＰｒｏＰｅｐカラ
ム（商標名）ＲＰＣ１８（４．６×１５０ｍｍ）を使用
した。流速は１．２ｍｌ／分、検出はＵＶ法（２１５ｎ
ｍ）で行った。溶出条件は、Ａ液を０．０５Ｍトリエチ
ルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２５）、Ｂ液をアセ
トニトリルとするグラディエント法で溶出した。ＬＳＩ
ＭＳは、クレイトス社製磁場型質量分析測定装置を用い
て測定した。その光学純度は、Nokiharaらの方法（Fron
tiers and Horizones in Amino Acid Research、p391-3
95、1992) に従い、島津ＣＡＴモデルＤＬＡＡ−１を用
いて測定した。
【００４１】
【発明の効果】本発明の方法を用いることにより、従来
廃棄されていた工業的ペプチド合成の際に生成するペプ
チド合成反応に用いた後のアシル成分回収液から光学活
性アミノ酸誘導体を光学活性を保持したまま回収し、工
業的ペプチド合成に再使用することが可能となる。
廃棄されていた工業的ペプチド合成の際に生成するペプ
チド合成反応に用いた後のアシル成分回収液から光学活
性アミノ酸誘導体を光学活性を保持したまま回収し、工
業的ペプチド合成に再使用することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 207/16 Ｃ０７Ｄ 207/16 209/20 209/20 233/64 １０１ 233/64 １０１ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07C 227/30 C07B 57/00 370 C07C 227/40 C07C 229/24 C07C 229/36 C07D 207/16 C07D 209/20 C07D 233/64 101 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】 ペプチド合成反応に用いた後のアシル成
分回収液に含まれる未反応の光学活性アミノ酸誘導体に
５〜２０倍当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリア
ゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−
３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｈ
ＯＯｂｔ）またはＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）を該ペプチド
合成反応回収液に添加した後、濃縮し、残留物を第三級
アミンを含むｐＨ２〜４の緩衝液で処理し、次いで酸性
下に抽出して精製することを特徴とする、ペプチド合成
反応に用いた後のアシル成分回収液から光学活性アミノ
酸誘導体を回収する方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7070787A JP2862167B2 (ja) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | 光学活性アミノ酸誘導体の回収方法 |
| EP96103088A EP0729942B1 (en) | 1995-03-02 | 1996-02-29 | Method for recovering optically pure amino acid derivatives |
| DE69602475T DE69602475T2 (de) | 1995-03-02 | 1996-02-29 | Verfahren zur Gewinnung von optisch reinen Aminosäure-Derivaten |
| US08/609,400 US5670647A (en) | 1995-03-02 | 1996-03-01 | Method for recovering optically pure amino acid derivatives |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7070787A JP2862167B2 (ja) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | 光学活性アミノ酸誘導体の回収方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08239350A JPH08239350A (ja) | 1996-09-17 |
| JP2862167B2 true JP2862167B2 (ja) | 1999-02-24 |
Family
ID=13441596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7070787A Expired - Lifetime JP2862167B2 (ja) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | 光学活性アミノ酸誘導体の回収方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5670647A (ja) |
| EP (1) | EP0729942B1 (ja) |
| JP (1) | JP2862167B2 (ja) |
| DE (1) | DE69602475T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016121119A (ja) * | 2014-12-25 | 2016-07-07 | 武輝 山田 | アミノ酸の分離法 |
| TW202138382A (zh) * | 2019-12-27 | 2021-10-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 胜肽化合物的合成法 |
| CA3167047A1 (en) * | 2020-02-05 | 2021-08-12 | Martin D. Johnson | Three resin reactors in series peptide synthesizer |
-
1995
- 1995-03-02 JP JP7070787A patent/JP2862167B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-29 DE DE69602475T patent/DE69602475T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-29 EP EP96103088A patent/EP0729942B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-01 US US08/609,400 patent/US5670647A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5670647A (en) | 1997-09-23 |
| EP0729942B1 (en) | 1999-05-19 |
| DE69602475D1 (de) | 1999-06-24 |
| EP0729942A3 (ja) | 1996-09-25 |
| DE69602475T2 (de) | 2000-01-27 |
| JPH08239350A (ja) | 1996-09-17 |
| EP0729942A2 (en) | 1996-09-04 |
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