JPH0638756B2 - ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 - Google Patents
ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬Info
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- JPH0638756B2 JPH0638756B2 JP21366686A JP21366686A JPH0638756B2 JP H0638756 B2 JPH0638756 B2 JP H0638756B2 JP 21366686 A JP21366686 A JP 21366686A JP 21366686 A JP21366686 A JP 21366686A JP H0638756 B2 JPH0638756 B2 JP H0638756B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な熱安定性ピルビン酸オキシダーゼ、す
なわちpH7.0、１０分間処で４５℃まで熱に安定なピル
ビン酸オキシダーゼを用いる分析法、特にピルビン酸の
測定法及びそのための試薬に関するものである。
なわちpH7.0、１０分間処で４５℃まで熱に安定なピル
ビン酸オキシダーゼを用いる分析法、特にピルビン酸の
測定法及びそのための試薬に関するものである。
本発明によれば、ピルビン酸の測定ばかりではなく、特
に基質及びピルビン酸形成反応を触媒する酵素の測定に
も利用することができる。測定の代表例は以下の通りで
ある。
に基質及びピルビン酸形成反応を触媒する酵素の測定に
も利用することができる。測定の代表例は以下の通りで
ある。
グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ又はα
−ケトグルタル酸 ダルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ 乳酸デヒドロゲナーゼ又は乳酸 ピルビン酸キナーゼ又はＡＤＰ （従来の技術） ピルビン酸オキシダーゼは酵素番号ＥＣ1、2、3、３に分
類され、ピルビン酸、リン酸および酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を触媒
する酵素であり、ラクトバチルス・デルブリッチイ（酵
素ハンドブック、丸尾文治、田宮信雄監修、発行所：朝
倉書店）、ラクトバチルス・プランタラム〔J.Bacterio
l.１６０巻２７３〜２７８頁（1984）〕及びペディオコ
ッカス属、ストレプトコッカス属、アエロコッカス属の
微生物（特公昭58-40465号公報）、ロイコノストック属
の微生物（特開昭59-159777号公報）など、各種の微生
物が生産することが知られている。しかしながらいずれ
の菌株の生産するピルビン酸オキシダーゼも耐熱性が十
分ではなく、これら酵素を用いるピルビン酸測定試薬の
安定性に問題があった。
−ケトグルタル酸 ダルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ 乳酸デヒドロゲナーゼ又は乳酸 ピルビン酸キナーゼ又はＡＤＰ （従来の技術） ピルビン酸オキシダーゼは酵素番号ＥＣ1、2、3、３に分
類され、ピルビン酸、リン酸および酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を触媒
する酵素であり、ラクトバチルス・デルブリッチイ（酵
素ハンドブック、丸尾文治、田宮信雄監修、発行所：朝
倉書店）、ラクトバチルス・プランタラム〔J.Bacterio
l.１６０巻２７３〜２７８頁（1984）〕及びペディオコ
ッカス属、ストレプトコッカス属、アエロコッカス属の
微生物（特公昭58-40465号公報）、ロイコノストック属
の微生物（特開昭59-159777号公報）など、各種の微生
物が生産することが知られている。しかしながらいずれ
の菌株の生産するピルビン酸オキシダーゼも耐熱性が十
分ではなく、これら酵素を用いるピルビン酸測定試薬の
安定性に問題があった。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明者は上記の背景を踏まえて、安定性の優れたより
実用的なピルビン酸測定試薬を見い出そうとした。
実用的なピルビン酸測定試薬を見い出そうとした。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、福井県敦賀市内の土壌から分離したラク
トバチルス属に属する微生物と同定されたTE-6103株
が、従来のピルビン酸オキシダーゼよりも熱安定性に優
れたピルビン酸オキシダーゼを産出することを見い出し
既に特許出願した。さらにこの菌株より得られたピルビ
ン酸オキシダーゼが、有効にピルビン酸を測定し得るこ
とを見い出し、加えてピルビン酸を生成する酵素反応系
の酵素活性の測定、ピルビン酸を生成する酵素反応系の
酵素の定量及びピルビン酸を生成する酵素反応系の基質
の定量をなし得ることを見い出し本発明に到達した。さ
らに、上記のピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミ
ンピロフォスフェート、無機リン酸塩及びマグネシウム
イオン、コバルトイオン、マンガンイオン、カルシウム
イオンのうち少なくとも１種の金属イオンからなる反応
系をピルビン酸含有試料系と反応させることにより、良
好な試料系中のピルビン酸を測定することができ、また
この反応系に過酸化水素の検出系を加えることにより、
簡便かつ良好にピルビン酸を測定できることを見出し、
本発明に到達した。すなわち本発明は試料に下記理化学
的性質を有する熱安定性に優れたピルビン酸オキシダー
ゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェート、無機リン酸
塩及びマグネシウムイオン、コバルトイオン、カルシウ
ムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを含有する
試薬を作用させ、生成する過酸化水素の量を測定するこ
とを特徴とするピルビン酸の測定法である。
トバチルス属に属する微生物と同定されたTE-6103株
が、従来のピルビン酸オキシダーゼよりも熱安定性に優
れたピルビン酸オキシダーゼを産出することを見い出し
既に特許出願した。さらにこの菌株より得られたピルビ
ン酸オキシダーゼが、有効にピルビン酸を測定し得るこ
とを見い出し、加えてピルビン酸を生成する酵素反応系
の酵素活性の測定、ピルビン酸を生成する酵素反応系の
酵素の定量及びピルビン酸を生成する酵素反応系の基質
の定量をなし得ることを見い出し本発明に到達した。さ
らに、上記のピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミ
ンピロフォスフェート、無機リン酸塩及びマグネシウム
イオン、コバルトイオン、マンガンイオン、カルシウム
イオンのうち少なくとも１種の金属イオンからなる反応
系をピルビン酸含有試料系と反応させることにより、良
好な試料系中のピルビン酸を測定することができ、また
この反応系に過酸化水素の検出系を加えることにより、
簡便かつ良好にピルビン酸を測定できることを見出し、
本発明に到達した。すなわち本発明は試料に下記理化学
的性質を有する熱安定性に優れたピルビン酸オキシダー
ゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェート、無機リン酸
塩及びマグネシウムイオン、コバルトイオン、カルシウ
ムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを含有する
試薬を作用させ、生成する過酸化水素の量を測定するこ
とを特徴とするピルビン酸の測定法である。
作用：ピルビン酸、無機リン酸および酸素からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を
触媒する。
ルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を
触媒する。
基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−
ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的で
ある。
ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的で
ある。
熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０、１０分間処理） 至適ｐＨ：５．７付近 Ｋｍ値：約４×１０−４Ｍ（ピルビン酸） 分子量：約１６０，０００（Sephacryl−Ｓ−３００
でのゲル濾過法） 等電点：約４．４（Carrier ampholyteによる焦点電
気泳動法） コファクター：ＦＡＤおよびチアミンピロフォスフェ
ート また本発明は上記ピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チ
アミンピロフォスフェート、無機リン酸塩及びマグネシ
ウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、カルシ
ウムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを含有す
ることを特徴とするピルビン酸測定用試薬である。
でのゲル濾過法） 等電点：約４．４（Carrier ampholyteによる焦点電
気泳動法） コファクター：ＦＡＤおよびチアミンピロフォスフェ
ート また本発明は上記ピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チ
アミンピロフォスフェート、無機リン酸塩及びマグネシ
ウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、カルシ
ウムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを含有す
ることを特徴とするピルビン酸測定用試薬である。
本発明は試料中の成分、特にピルビン酸を測定するもの
であるが、試料としては人血清、食品などに限られな
い。また本発明ではピルビン酸を直接に測定することに
より、試料中のピルビン酸を形成する物質、例えばα−
ケトグルタル酸、乳酸ＡＤＰなど、またピルビン酸形成
反応を触媒する酵素、例えばＧＰＴ、ＧＯＴ、乳酸デヒ
ドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの測定も包含す
る。
であるが、試料としては人血清、食品などに限られな
い。また本発明ではピルビン酸を直接に測定することに
より、試料中のピルビン酸を形成する物質、例えばα−
ケトグルタル酸、乳酸ＡＤＰなど、またピルビン酸形成
反応を触媒する酵素、例えばＧＰＴ、ＧＯＴ、乳酸デヒ
ドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの測定も包含す
る。
本発明に使用される熱安定性の優れたピルビン酸オキシ
ダーゼとしては、pH7.0、１０分間処理で４５℃まで熱
に安定で、ピルビン酸、無機リン酸及び酸素からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触
媒する酵素であればよく、好ましくはラクトバチルス・
エス・ピ−TE6103の生産するピルビン酸オキシダーゼが
ある。この分離・同定した上記菌株ＴＥ6103株の菌学的
性質を以下に示す。
ダーゼとしては、pH7.0、１０分間処理で４５℃まで熱
に安定で、ピルビン酸、無機リン酸及び酸素からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触
媒する酵素であればよく、好ましくはラクトバチルス・
エス・ピ−TE6103の生産するピルビン酸オキシダーゼが
ある。この分離・同定した上記菌株ＴＥ6103株の菌学的
性質を以下に示す。
(a)形 態 大きさ：0.5〜0.7×５〜６μｍ（桿菌） グラム染色：グラム陽性 抗 酸 性：− 運 動 性：− 胞 子：− (b)各培地における生育状態 (1)肉汁寒天板培養 ３０℃、４８時間で小さな円形のコロニーを形成する。
表面は平滑で光沢はない。色は淡黄色であり可溶性色素
は形成しない。
表面は平滑で光沢はない。色は淡黄色であり可溶性色素
は形成しない。
(2)肉汁寒天斜面培養 生育弱い (3)肉汁液体培地 ３０℃、２４時間培養にて生育し、濁化する。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養 穿刺線に沿って生育する。ゼラチンは液化しない。
(5)リトマス・ミルク 変化なし (c)生理学的性質 (1)硝酸塩の還元；陰性 (2)脱窒反応；陰性 (3)インドールの生成；陰性 (4)硫化水素の生成；陰性 (5)デンプンの加水分解；陰性 (6)色素の生成；なし (7)クエン酸の利用；陰性 (8)ウレアーゼ；陰性 (9)カタラーゼ；陰性 (10)オキシダーゼ；陰性 (11)生育の範囲；生育温度２０℃〜４５℃ (12)酸素に対する態度；通性嫌気性 (13)Ｏ−Ｆテスト；発酵 (14)糖からの酸の生成 Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：＋ Ｄ−マンノース：＋ Ｄ−フルクトース；＋ Ｄ−ガラクトース：− 麦 芽 糖：＋ シ ョ 糖：＋ 乳 糖：− トレハロース ：− Ｄ−ソルビット：− Ｄ−マンニット：＋ イノシット：− ラムノース：− メリビオース：＋ (15)その他 β−ガラクトシダーゼ；陰性 アルギニンジヒドラーゼ：陰性 リシンデカルボキシラーゼ：陰性 オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性 トリプトファンデアミナーゼ；陰性 上記菌学的性質の同定のための実験法は主として長谷川
武治編著、「微生物の分類と同定」学会出版センター
（1975年）によって行なった。また分類同定の基準とし
てバージエイズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ
・バクテリオロジ−第８版（1974年）を参考にした。
武治編著、「微生物の分類と同定」学会出版センター
（1975年）によって行なった。また分類同定の基準とし
てバージエイズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ
・バクテリオロジ−第８版（1974年）を参考にした。
以上の菌学的性状における本菌ＴＥ−6103株はグラム陽
性桿菌でカタラーゼ、オキシダーゼ陰性で、グルコース
から発酵的に酸を産生するが、グルコースからガスを産
生しないことなどから、バージエイズ・マニュアル・オ
ブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版（1974
年）により検索するとラクトバチルス属に属するとみな
される。さらにラクトバチルス・デルブリッチイ（Lact
obacilus delbrueckii）に類似するが、Ｄ−マンニット
やメリビオースからの酸の産生において相違が認められ
る。従って本菌株はラクトバチルス・エス・ピーＴＥ61
03株と命名した。本菌は工業技術院微生物工業研究所に
微生物受託番号微工研菌寄第8886号として寄託されてい
る。
性桿菌でカタラーゼ、オキシダーゼ陰性で、グルコース
から発酵的に酸を産生するが、グルコースからガスを産
生しないことなどから、バージエイズ・マニュアル・オ
ブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版（1974
年）により検索するとラクトバチルス属に属するとみな
される。さらにラクトバチルス・デルブリッチイ（Lact
obacilus delbrueckii）に類似するが、Ｄ−マンニット
やメリビオースからの酸の産生において相違が認められ
る。従って本菌株はラクトバチルス・エス・ピーＴＥ61
03株と命名した。本菌は工業技術院微生物工業研究所に
微生物受託番号微工研菌寄第8886号として寄託されてい
る。
本発明に使用する微生物としては、例えば上記のラクト
バチルス・エス・ピーＴＥ6103が挙げられるが、この菌
だけに限らずラクトバチルス属に属し、熱安定性に優れ
たピルビン酸オキシダーゼを生産する菌は、すべて本発
明において使用することができる。熱安定性の優れたピ
ルビン酸オキシダーゼ生産菌は酵素を生産する通常の方
法で培養する。
バチルス・エス・ピーＴＥ6103が挙げられるが、この菌
だけに限らずラクトバチルス属に属し、熱安定性に優れ
たピルビン酸オキシダーゼを生産する菌は、すべて本発
明において使用することができる。熱安定性の優れたピ
ルビン酸オキシダーゼ生産菌は酵素を生産する通常の方
法で培養する。
使用する培地組成としては使用菌株が資化しうる炭素
源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有す
るものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用でき
る。例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、
デキストリン、ピルビン酸、糖蜜などが使用される。窒
素源としては例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、
カゼイン加水分解物などの窒素含有天然物や、塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、グルタミン酸
などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物が使
用される。
源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有す
るものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用でき
る。例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、
デキストリン、ピルビン酸、糖蜜などが使用される。窒
素源としては例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、
カゼイン加水分解物などの窒素含有天然物や、塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、グルタミン酸
などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物が使
用される。
培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行う。培養
温度は２０〜４０℃の範囲、好ましくは３０℃付近、培
養pHは５〜８の範囲、好ましくはpH６〜７に制御するの
が良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育す
れば実施できる。
温度は２０〜４０℃の範囲、好ましくは３０℃付近、培
養pHは５〜８の範囲、好ましくはpH６〜７に制御するの
が良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育す
れば実施できる。
培養期間は通常１〜４日間で生育し、菌体内にピルビン
酸オキシダーゼが生成蓄積される。
酸オキシダーゼが生成蓄積される。
本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば、抽出法には、超音波破砕、ガラスビーズを
用いる機械的な破砕、フレンチブレス、界面活性剤など
いずれを用いてもよい。
い。例えば、抽出法には、超音波破砕、ガラスビーズを
用いる機械的な破砕、フレンチブレス、界面活性剤など
いずれを用いてもよい。
さらに抽出液については公知の硫安や芒硝などの塩析
法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集
法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さ
らにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セファロー
ス、ＣＭ（カルボキシメチル）セファロースなどのイオ
ン交換体クロマト法などにより精製することができる。
ピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通りであ
る。
法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集
法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さ
らにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セファロー
ス、ＣＭ（カルボキシメチル）セファロースなどのイオ
ン交換体クロマト法などにより精製することができる。
ピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通りであ
る。
上記反応混液を調製した後、2.5mlを試験管に分取し、
0.3Ｍピルビン酸カリウムを0.5ml加えて３７℃で５分間
予備加温する。酵素溶液0.05mlを添加し、ゆるやかに混
和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で500n
mの吸光度変化を記録し、その初期直線部分から１分間
当りの吸光度変化を求める（△ODtest）。
0.3Ｍピルビン酸カリウムを0.5ml加えて３７℃で５分間
予備加温する。酵素溶液0.05mlを添加し、ゆるやかに混
和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で500n
mの吸光度変化を記録し、その初期直線部分から１分間
当りの吸光度変化を求める（△ODtest）。
盲検は酵素溶液の代りに50mMK−リン酸緩衝液pH7.0を0.
05ml加え、上記同様に操作を行なって１分間当りの吸光
度変化を求める（△ODblank）。
05ml加え、上記同様に操作を行なって１分間当りの吸光
度変化を求める（△ODblank）。
ピルビン酸オキシダーゼ活性の表示は、上記条件下で１
マイクロモルの過酸化水素を生じる活性を１単位(U)と
した。
マイクロモルの過酸化水素を生じる活性を１単位(U)と
した。
本発明で使用したピルビン酸オキシダーゼは次の方法で
単離した。
単離した。
1.培 養 肉エキス0.2％、ポリペプトン１％、酵母エキス0.4％Tw
een800.1％(v/v)、K2HPO4・3H2O0.25％、Na−アセテー
ト・3H2O0.5％、クエン酸ジアンモニウム２％、MgSO4・
7H2O0.02％、MnSO4・7H2O0.02％を含む培地（pH7.0）９
０mlを５００ml容坂口フラスコに移し、121℃１５分間
オートクレーブを行なった。放冷した後、濾過除菌した
５％ピルビン酸ナトリウム水溶液を無菌的に１０ml添加
した。種菌としてラクトバチルス・エス・ピーＴＥ6103
株を同培地に一白金耳接種し、３０℃で２４時間振盪培
養し種培養液とした。次に同培地5.4ｌを１０ｌジャー
ファメンターに移し、121℃１５分間オートクレーブを
行ない、放冷後、濾過除菌した５％ピルビン酸ナトリウ
ム水溶液を無菌的に600ml添加した。これに種培養液100
mlを移し、300rpm、通気量２ｌ／mm、３０℃で２４時間
培養した。pHは6.5以上に１０Ｎ NaOHで制御した。培
養時のピルビン酸オキシダーゼ活性は２３mU／ml−brot
hであった。
een800.1％(v/v)、K2HPO4・3H2O0.25％、Na−アセテー
ト・3H2O0.5％、クエン酸ジアンモニウム２％、MgSO4・
7H2O0.02％、MnSO4・7H2O0.02％を含む培地（pH7.0）９
０mlを５００ml容坂口フラスコに移し、121℃１５分間
オートクレーブを行なった。放冷した後、濾過除菌した
５％ピルビン酸ナトリウム水溶液を無菌的に１０ml添加
した。種菌としてラクトバチルス・エス・ピーＴＥ6103
株を同培地に一白金耳接種し、３０℃で２４時間振盪培
養し種培養液とした。次に同培地5.4ｌを１０ｌジャー
ファメンターに移し、121℃１５分間オートクレーブを
行ない、放冷後、濾過除菌した５％ピルビン酸ナトリウ
ム水溶液を無菌的に600ml添加した。これに種培養液100
mlを移し、300rpm、通気量２ｌ／mm、３０℃で２４時間
培養した。pHは6.5以上に１０Ｎ NaOHで制御した。培
養時のピルビン酸オキシダーゼ活性は２３mU／ml−brot
hであった。
2.単 離 培養液６ｌを遠心分離機にて集菌し、５０ｍＭＫ−リン
酸緩衝液pH7.0100mlにて懸濁した。超音波破砕機（海上
電気製、１９KHz）にて１５分間処理し、遠心分離して
上清液を得た。上清液を５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液pH7.
0にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＧＬ−６Ｂ
（ファルマシア製）カラムクロマトグラフィーに供し、
０〜0.5ＭNaCl溶出画分にピルビン酸オキシダーゼ活性
を得た。溶出液を限外濾過機にて濃縮した後、50mMK−
リン酸緩衝液pH7.0にて平衡化したセファデックスＧ−2
00（ファルマシア製）にてゲル濾過を行った。その結果
５４Ｕのピルビン酸オキシダーゼが得られた。得られた
酵素のpH活性を第１図に、熱安定性を第２図に示す。pH
活性の測定はpH５〜6.5の範囲では５０mM酢酸緩衝液、p
H６〜８の範囲では５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液を用いて
行なった。熱安定性の測定は、pH7.0、１０分間処理し
た後の残存活性で示した。
酸緩衝液pH7.0100mlにて懸濁した。超音波破砕機（海上
電気製、１９KHz）にて１５分間処理し、遠心分離して
上清液を得た。上清液を５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液pH7.
0にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＧＬ−６Ｂ
（ファルマシア製）カラムクロマトグラフィーに供し、
０〜0.5ＭNaCl溶出画分にピルビン酸オキシダーゼ活性
を得た。溶出液を限外濾過機にて濃縮した後、50mMK−
リン酸緩衝液pH7.0にて平衡化したセファデックスＧ−2
00（ファルマシア製）にてゲル濾過を行った。その結果
５４Ｕのピルビン酸オキシダーゼが得られた。得られた
酵素のpH活性を第１図に、熱安定性を第２図に示す。pH
活性の測定はpH５〜6.5の範囲では５０mM酢酸緩衝液、p
H６〜８の範囲では５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液を用いて
行なった。熱安定性の測定は、pH7.0、１０分間処理し
た後の残存活性で示した。
本発明に用いた酵素の理化学的性質を次に示す。
作用：ピルビン酸、無機リン酸及び酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒す
る。
ン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒す
る。
ＣＨ３ＣＯＣＯＯＨ＋ＨＯＰＯ３ ２−＋Ｏ２→ＣＨ３Ｃ
ＯＯＰＯ３ ２−＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ２ 至適pH：5.7付近 熱安定性：４５℃以下（pH7.0、１０分間処理） Km値：約４×１０−４Ｍ（ピルビン酸） 分子量：約160,000（Sephacryl Ｓ−300でのゲル濾過
法） 等電点：約4.4（Carrier ampholyteによる焦点電気泳動
法） 基質特性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−ケト
グルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的であ
る。
ＯＯＰＯ３ ２−＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ２ 至適pH：5.7付近 熱安定性：４５℃以下（pH7.0、１０分間処理） Km値：約４×１０−４Ｍ（ピルビン酸） 分子量：約160,000（Sephacryl Ｓ−300でのゲル濾過
法） 等電点：約4.4（Carrier ampholyteによる焦点電気泳動
法） 基質特性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−ケト
グルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的であ
る。
コファクター：ＦＡＤおよびチアミンピロフォスフェー
ト 本発明では試料に、上記ピルビン酸オキシダーゼ、無機
リン酸塩を含有する試薬を添加して、生成する過酸化水
素、二酸化炭素又はアセチルリン酸の生成量を測定する
か、又は酸素又は無機リン酸の消費量を測定することに
より、試料中のピルビン酸の量を知ることができる。特
に本発明の熱安定性に優れたピルビン酸オキシダーゼを
含有する反応系においては、ピルビン酸との酵素反応を
良好に行なわせるため、ピルビン酸オキシダーゼと共に
ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェート、リン酸塩及びマ
グネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、
カルシウムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを
用いればよく、さらにまたこの反応による生成物である
過酸化水素の検出系を用いる場合は、必要により色原体
を適宜選択使用すればよい。過酸化水素測定系として
は、例えば次のような系が考えられる。
ト 本発明では試料に、上記ピルビン酸オキシダーゼ、無機
リン酸塩を含有する試薬を添加して、生成する過酸化水
素、二酸化炭素又はアセチルリン酸の生成量を測定する
か、又は酸素又は無機リン酸の消費量を測定することに
より、試料中のピルビン酸の量を知ることができる。特
に本発明の熱安定性に優れたピルビン酸オキシダーゼを
含有する反応系においては、ピルビン酸との酵素反応を
良好に行なわせるため、ピルビン酸オキシダーゼと共に
ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェート、リン酸塩及びマ
グネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、
カルシウムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを
用いればよく、さらにまたこの反応による生成物である
過酸化水素の検出系を用いる場合は、必要により色原体
を適宜選択使用すればよい。過酸化水素測定系として
は、例えば次のような系が考えられる。
(1)ペルオキシダーゼと発色剤 ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびフ
エノール ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニン ｏペルオキシダーゼ、メチルベンゾチアゾリンヒドラゾ
ン（MBTH）およびＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ
−アニシジン（ESPAS） ｏペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびＮ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジン（EHSPT） (2)過酸化水素電極法 本発明では酵素の使用量としては、酵素反応が充分に進
行する量であればよく、また試料系中のピルビン酸の含
量、酵素反応の温度、時間などにより適宜変更されるも
のであるが、例えば本発明試薬は熱安定性に優れたピル
ビン酸オキシダーゼ0.1〜２０Ｕ／ml程度、無機リン酸
塩５〜５０mM程度、ＦＡＤ１〜２０μＭ程度、チアミン
ピロフォスフェート100〜500μＭ程度、金属イオン１〜
５０ｍＭ程度、緩衝剤pH６〜7.5並びに過酸化水素検出
系として４−アミノアンチピリン0.005〜0.05％程度、
フエノール0.01〜0.1％程度及びペルオキシダーゼ１〜
１０Ｕ／ml程度を含有する。ピルビン酸を形成する物質
又はピルビン酸形成反応を触媒する酵素を測定するに
は、本発明の試薬は従来公知のピルビン酸へ誘導する試
薬を組合せて使用する。
エノール ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニン ｏペルオキシダーゼ、メチルベンゾチアゾリンヒドラゾ
ン（MBTH）およびＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ
−アニシジン（ESPAS） ｏペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびＮ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジン（EHSPT） (2)過酸化水素電極法 本発明では酵素の使用量としては、酵素反応が充分に進
行する量であればよく、また試料系中のピルビン酸の含
量、酵素反応の温度、時間などにより適宜変更されるも
のであるが、例えば本発明試薬は熱安定性に優れたピル
ビン酸オキシダーゼ0.1〜２０Ｕ／ml程度、無機リン酸
塩５〜５０mM程度、ＦＡＤ１〜２０μＭ程度、チアミン
ピロフォスフェート100〜500μＭ程度、金属イオン１〜
５０ｍＭ程度、緩衝剤pH６〜7.5並びに過酸化水素検出
系として４−アミノアンチピリン0.005〜0.05％程度、
フエノール0.01〜0.1％程度及びペルオキシダーゼ１〜
１０Ｕ／ml程度を含有する。ピルビン酸を形成する物質
又はピルビン酸形成反応を触媒する酵素を測定するに
は、本発明の試薬は従来公知のピルビン酸へ誘導する試
薬を組合せて使用する。
（実施例） 以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何ら
これらによって限定されるものではない。
これらによって限定されるものではない。
実施例１ ＰＩＰＥＳ緩衝液pH7.0 50mM ＦＡＤ・Na2 10μＭ チアミンピロフォスフェート 0.2ｍＭ MgSO4 10ｍＭ KH2PO4 ５ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.01％ フエノール 0.02％ ペルオキシダーゼ ５Ｕ／ml ピルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ml 上記の組成よりなる反応液３mlを分取し、３７℃で約５
分間予備加温し、これにピルビン酸カリウム水溶液（３
〜１５ｍＭ）２０μｌを添加した後３７℃、１０分間反
応させ、反応後500nmにおける吸光度を測定した。その
結果は第３図に示す通り良好な直線性が得られた。
分間予備加温し、これにピルビン酸カリウム水溶液（３
〜１５ｍＭ）２０μｌを添加した後３７℃、１０分間反
応させ、反応後500nmにおける吸光度を測定した。その
結果は第３図に示す通り良好な直線性が得られた。
実施例２ ＰＩＰＥＳ緩衝液、pH7.0 50mM ＦＡＤ・Na2 10μＭ チアミンピロフォスフェート 0.2mM MgSO4 10mM KH2PO4 ５mM ホスホエノールピルビン酸 0.5mM ピルビン酸キナーゼ 10Ｕ／ml ４−アミノアンチピリン 0.01％ フエノール 0.02％ ペルオキシダーゼ ５Ｕ／ml ピルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ml 上記の組成よりなる反応液３mlを分取し、３７℃で約５
分間予備加温し、これにＡＤＰ水溶液（３〜１５ｍＭ）
20μｌを添加した後３７℃、１０分間反応させ、反応後
500nmにおける吸光度を測定した。その結果、第４図に
示す通り良好な直線性が得られた。
分間予備加温し、これにＡＤＰ水溶液（３〜１５ｍＭ）
20μｌを添加した後３７℃、１０分間反応させ、反応後
500nmにおける吸光度を測定した。その結果、第４図に
示す通り良好な直線性が得られた。
実施例３ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ ５０ ｍＭ ＦＡＤ・Ｎａ２ １０ μＭ チアミンピロフォスフェート 0.2ｍＭ ＭｇＳＯ４ １０ ｎＭ ＫＨ２ＰＯ４ ５ ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.01％ フェノール 0.02％ ペルオキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ ピルビン酸オキシダーゼ ３Ｕ／ｍｌ 上記の組成よりなる反応液３．０ｍｌを分取し、３７℃
で約５分間予備加温した。これに管理血清（Ｑ−ｐａｋ
Ｉ）０．２ｍｌ〜１．０ｍｌを１．０ｍｌにfillupし
たサンプルを０．１ｍｌ添加した後、３７℃、１０分間
反応させ、反応後５００nmにおける吸光度を測定した。
その結果は第５図に示す通り良好な直線性を示し、実施
例１のピルビン酸の検量線より血清中のピルビン酸濃度
は１４７μＭと計算された。
で約５分間予備加温した。これに管理血清（Ｑ−ｐａｋ
Ｉ）０．２ｍｌ〜１．０ｍｌを１．０ｍｌにfillupし
たサンプルを０．１ｍｌ添加した後、３７℃、１０分間
反応させ、反応後５００nmにおける吸光度を測定した。
その結果は第５図に示す通り良好な直線性を示し、実施
例１のピルビン酸の検量線より血清中のピルビン酸濃度
は１４７μＭと計算された。
実施例４ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ ５０ ｍＭ ＦＡＤ・Ｎａ２ １０ μＭ チアミンピロフォスフェート 0.2ｍＭ ＭｇＳＯ４ １０ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ５ ｍＭ ４−アミノアンチピリン ０．０１％ フェノール ０．０２％ ペルオキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ ピルビン酸オキシダーゼ ３Ｕ／ｍｌ 上記の組成よりなる反応液３．０ｍｌを分取し、３７℃
で約５分間予備加温した。これにピルビン酸水溶液（０
〜３ｍＭ）０．１ｍｌを添加した後、３７℃で１０分間
反応させ、反応後５００ｎｍで比色定量した。また同一
のサンプルを市販品（協和メディクス製デタミナーＰ
Ａ）を用いて測定し、その相関を求めた。その結果第６
図に示す相関図が得られ、その相関はｒ＝０．９７９
（Ｎ＝３０） Ｙ＝０．９５Ｘ＋０．０３ であり、極めて良好なものであった。
で約５分間予備加温した。これにピルビン酸水溶液（０
〜３ｍＭ）０．１ｍｌを添加した後、３７℃で１０分間
反応させ、反応後５００ｎｍで比色定量した。また同一
のサンプルを市販品（協和メディクス製デタミナーＰ
Ａ）を用いて測定し、その相関を求めた。その結果第６
図に示す相関図が得られ、その相関はｒ＝０．９７９
（Ｎ＝３０） Ｙ＝０．９５Ｘ＋０．０３ であり、極めて良好なものであった。
（発明の効果） 本発明では、従来のピルビン酸オキシダーゼより熱安定
性に優れたピルビン酸オキシダーゼを使用することによ
り、優れた溶液安定性を有する分析用試薬、例えばピル
ビン酸測定用試薬を製造することができる。
性に優れたピルビン酸オキシダーゼを使用することによ
り、優れた溶液安定性を有する分析用試薬、例えばピル
ビン酸測定用試薬を製造することができる。
また固定化酸素、例えば電極用膜、ビーズ等として用い
ることにより、広範囲の測定系が可能となる。
ることにより、広範囲の測定系が可能となる。
第１図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの至適pHを示
す。 第２図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの熱安定性を
示す。 第３図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いたピル
ビン酸の検量線を示す。 第４図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いたＡＤ
Ｐの検量線を示す。 第５図は管理血清の希釈度と吸光度の関係を示す。 第６図は市販の測定試薬を用いた場合と本発明の測定試
薬を用いた場合のピルビン酸濃度を示す。
す。 第２図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの熱安定性を
示す。 第３図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いたピル
ビン酸の検量線を示す。 第４図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いたＡＤ
Ｐの検量線を示す。 第５図は管理血清の希釈度と吸光度の関係を示す。 第６図は市販の測定試薬を用いた場合と本発明の測定試
薬を用いた場合のピルビン酸濃度を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】試料に下記理化学的性質を有する熱安定性
に優れたピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミンピ
ロフォスフェート、無機リン酸塩及びマグネシウムイオ
ン、コバルトイオン、カルシウムイオンのうち少なくと
も１種の金属イオンを含有する試薬を作用させ、生成す
る過酸化水素の量を測定することを特徴とするピルビン
酸の測定法。 作用：ピルビン酸、無機リン酸および酸素からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を
触媒する。 基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−
ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的で
ある。 熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０、１０分間処理） 至適ｐＨ：５．７付近 Ｋｍ値：約４×１０−４Ｍ（ピルビン酸） 分子量：約１６０，０００（Sephacryl−Ｓ−３００
でのゲル濾過法） 等電点：約４．４（Carrier ampholyteによる焦点電
気泳動法） コファクター：ＦＡＤおよびチアミンピロフォスフェ
ート - 【請求項２】下記理化学的性質を有する熱安定性に優れ
たピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォ
スフェート、無機リン酸塩及びマグネシウムイオン、コ
バルトイオン、カルシウムイオンのうち少なくとも１種
の金属イオンを含有することを特徴とするピルビン酸測
定用試薬。 作用：ピルビン酸、無機リン酸および酸素からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を
触媒する。 基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−
ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的で
ある。 熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０、１０分間処理） 至適ｐＨ：５．７付近 Ｋｍ値：約４×１０−４Ｍ（ピルビン酸） 分子量：約１６０，０００（Sephacryl−Ｓ−３００
でのゲル濾過法） 等電点：約４．４（Carrier ampholyteによる焦点電
気泳動法） ：コファクター：ＦＡＤおよびチアミンピロフォスフ
ェート
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21366686A JPH0638756B2 (ja) | 1986-09-10 | 1986-09-10 | ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 |
| US07/087,086 US4965194A (en) | 1986-08-21 | 1987-08-19 | Pyruvate oxidase and an analytical method using the same |
| DE87307367T DE3787776T2 (de) | 1986-08-21 | 1987-08-20 | Pyruvat-Oxidase mit hoher thermischer Stabilität, diese verwendendes analytisches Verfahren und diese enthaltende analytische Reagenzien. |
| EP87307367A EP0257986B1 (en) | 1986-08-21 | 1987-08-20 | Pyruvate oxidase having high thermal stability, analytical methods using it and analytical reagents containing it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21366686A JPH0638756B2 (ja) | 1986-09-10 | 1986-09-10 | ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6368099A JPS6368099A (ja) | 1988-03-26 |
| JPH0638756B2 true JPH0638756B2 (ja) | 1994-05-25 |
Family
ID=16642947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21366686A Expired - Lifetime JPH0638756B2 (ja) | 1986-08-21 | 1986-09-10 | ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0638756B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006081481A (ja) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Kikkoman Corp | 非対称ジメチルアルギニン測定法及び非対称ジメチルアルギニン測定キット |
| JP6295408B2 (ja) * | 2013-08-26 | 2018-03-20 | 国立大学法人北海道大学 | 血液検体のａｔｐ測定方法及びキット |
| WO2018216757A1 (ja) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | ニプロ株式会社 | 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 |
-
1986
- 1986-09-10 JP JP21366686A patent/JPH0638756B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6368099A (ja) | 1988-03-26 |
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