[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2018216757A1 - 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 - Google Patents

測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018216757A1
WO2018216757A1 PCT/JP2018/019939 JP2018019939W WO2018216757A1 WO 2018216757 A1 WO2018216757 A1 WO 2018216757A1 JP 2018019939 W JP2018019939 W JP 2018019939W WO 2018216757 A1 WO2018216757 A1 WO 2018216757A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substance
measurement
measuring
enzyme
sample
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/019939
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
利明 馬場
西矢　芳昭
Original Assignee
ニプロ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ニプロ株式会社 filed Critical ニプロ株式会社
Priority to JP2019520301A priority Critical patent/JP7234923B2/ja
Publication of WO2018216757A1 publication Critical patent/WO2018216757A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a substance measuring method for measuring a physiologically active substance acting as a coenzyme such as thiamine (vitamin B 1 ) as a substance to be measured.
  • thiamine (vitamin B 1 ) is a water-soluble vitamin that contributes significantly to the metabolism of carbohydrates (carbohydrates) and branched chain amino acids, and regulates the functions of the nervous system, digestive system, heart and vascular system. Also contributes. Deficiency of thiamine is known to cause beriberi or Wernicke encephalopathy. Thus, thiamine testing in biological samples such as blood has clinical significance as an indicator of vitamin B 1 deficiency.
  • Thiamine is phosphorylated in vivo and exists as a phosphate ester.
  • thiamine monophosphate TMP
  • thiamine diphosphate which is a diphosphate ester
  • TTP thiamine triphosphate
  • thiamine diphosphate In vivo, most of thiamine is present as thiamine diphosphate. Since thiamine diphosphate is a coenzyme for ⁇ -carboxylase, it is also called cocarboxylase and is known to function as a coenzyme involved in carbohydrate metabolism or as a coenzyme in various enzymes in vivo. Yes.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • a phosphate ester of thiamine contained in a sample is hydrolyzed to remove phosphate from the phosphate ester.
  • all thiamine in the sample is not phosphorylated.
  • the sample thus pretreated is injected into the HPLC and eluted from the column.
  • the labeling reagent is mixed with the eluate, so that the color development of the eluted thiamine can be detected with a detector.
  • Non-Patent Document 1 a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS) is installed.
  • LC / MS / MS liquid chromatograph-tandem mass spectrometer
  • Non-Patent Document 1 as a problem of the post-column HPLC method, since the labeling reagent is a strong alkaline solution, the analytical instrument is strongly damaged, there is a concern about the environmental load due to the waste liquid, 1 sample (specimen) It is pointed out that it is not efficient because the measurement time per hit takes about 10 minutes. Therefore, Non-Patent Document 1, by using the LC / MS / MS method as the measuring method of the vitamin B 1, and verify that the post-column HPLC method and the measurement results with similar credibility can be obtained. Furthermore, Non-Patent Document 1 describes that the measurement time per sample can be shortened to 4 minutes, and that a strong alkaline reagent is not used, so that damage to analytical instruments is reduced and the burden on the environment is eliminated. Has been.
  • the measurement time per sample can be shortened in thiamine measurement by LC / MS / MS method compared to measurement by post-column HPLC method. (Batch processing) and not continuous processing. For this reason, there is a limit to shortening the measurement time compared to continuous measurement.
  • the present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a substance measuring method capable of efficiently measuring a physiologically active substance such as thiamine (vitamin B 1 ).
  • the substance measuring method comprises adding at least an enzyme having a measurement target substance contained in the sample as a coenzyme and a substrate of the enzyme to the sample, In this configuration, a product generated by a chemical reaction catalyzed by an enzyme is measured, and a measurement target substance contained in the sample is quantified based on a measurement amount of the product.
  • a chemical reaction is performed using an enzyme having the measurement target substance as a coenzyme, and a product generated by the chemical reaction is measured.
  • the substance to be measured which is a coenzyme is indirectly quantified.
  • the measurement target substance is indirectly quantified based on the measured amount of the product, compared with the case where the measurement target substance is directly quantified. Can be measured (quantified) with higher sensitivity. Therefore, by using the substance measurement method according to the present disclosure, it is possible to proceed with establishment of a system for measuring with an automatic analyzer even for a sample having a low concentration of a measurement target substance.
  • the measurement target substance may be a thiamine.
  • the enzyme that catalyzes the chemical reaction is pyruvate oxidase
  • the product is hydrogen peroxide
  • the measurement of the hydrogen peroxide is performed by measuring the hydrogen peroxide and leuco.
  • a configuration may be employed in which the dye is reacted with the catalytic action of peroxidase and the coloration degree of the leuco dye colored by this is measured.
  • the enzyme that catalyzes the chemical reaction is pyruvate oxidase
  • the product is hydrogen peroxide
  • the measurement of the hydrogen peroxide is performed by measuring the hydrogen peroxide and the amino acid.
  • An antipyrine and a Trinder reagent may be reacted by a catalytic action of peroxidase, and a coloration degree by a quinone dye to be generated may be measured.
  • the measurement target substance may be a reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH).
  • NADH nicotinamide adenine dinucleotide
  • the enzyme that catalyzes the chemical reaction is lactate dehydrogenase
  • the product is oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +)
  • NAD + oxidized nicotinamide adenine A configuration in which the measurement of dinucleotide is performed by a change in absorbance may be employed.
  • a cofactor other than the measurement target substance may be added to the sample in addition to the enzyme and the substrate.
  • thiamine can provide material measuring method bioactive substance can be efficiently measured, such as (vitamin B 1), an effect that.
  • Example 2 of the present invention As a result of Example 2 of the present invention, the concentration of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) in the sample and the absorbance change ⁇ Abs. It is a graph which shows the relationship.
  • NADH nicotinamide adenine dinucleotide
  • the substance measurement method according to the present disclosure is generated by a chemical reaction catalyzed by the enzyme by adding at least an enzyme having a measurement target substance contained in the sample as a coenzyme and a substrate of the enzyme to the sample.
  • the product is measured.
  • the measuring object substance contained in a sample is quantified.
  • the substance to be measured in the substance measuring method according to the present disclosure is not specifically limited as long as it is a physiologically active substance that exists in a sample and functions as a coenzyme.
  • vitamin B 1 thiamine or its phosphate ester
  • vitamin B 2 riboflavin or its nucleotide conjugate
  • niacin nicotinic acid or nicotinamide or its adenine nucleotide conjugate, vitamin B 3)
  • Vitamin B 6 pyridoxine, pyridoxal, and pyridoxamine or its phosphate ester
  • coenzyme A pantothenic acid
  • coenzyme R biotin
  • coenzyme F folic acid
  • coenzyme B12 cobalamin, vitamin B) 12
  • vitamin coenzymes such as coenzyme Q (ubiquinone); pyrroloquinoline quinone (PQQ), topaquinone (TPQ), tryptophan-tryptophyllquinone
  • vitamin B 1 that is, thiamine or a phosphate ester thereof (hereinafter simply referred to as thiamine) is taken as a representative example to describe a substance measurement method according to the present disclosure (described later). See Example 1).
  • the sample to be measured is not particularly limited, and any sample may be used as long as the measurement target substance is included. If the substance to be measured is thiamine, a sample such as whole blood, food containing thiamine (possibly), and the like can be mentioned.
  • the enzyme using thiamine as a coenzyme is not particularly limited, and a known enzyme can be suitably used. Specifically, for example, pyruvate oxidase, pyruvate dehydrogenase, 3-methyl-2-oxobutanoate dehydrogenase, pyruvate synthase, 2-oxoglutarate synthase, oxalate oxidoreductase, 2-oxoacid oxidoreductase, transketolase Formaldehyde transketolase, acetoin-ribose-5-phosphate transaldolase, 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase, acetolactate synthase, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, 2-succinyl- 5-enolpyrvinyl-6-hydroxy-3-cyclohexene-1-carboxylate synthase, 3-acetyl octanal
  • a product to be measured for quantifying thiamine is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of enzyme selected.
  • the measurement method for the product is not particularly limited, and a known measurement method may be employed depending on the type of the product.
  • the enzyme and its substrate may be added to the sample, but also other components such as cofactors other than the substance to be measured may be added.
  • the substance measurement method according to the present disclosure will be described more specifically by taking as an example the case of selecting pyruvate oxidase as the enzyme.
  • Pyruvate oxidase reacts with pyruvate (CH 3 COCOOH), phosphate (H 3 PO 4 ) and oxygen (O 2 ) to produce acetyl phosphate (CH 3 COH 2 PO 4 ), carbon dioxide (CO 2 ).
  • acetyl phosphate CH 3 COH 2 PO 4
  • CO 2 carbon dioxide
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • flavin adenine dinucleotide (FAD) and magnesium ion (Mg 2+ ) are required in addition to thiamine (thiamine diphosphate) which is a coenzyme.
  • pyruvate may be added as a substrate and FAD and Mg 2+ may be added as cofactors to a sample containing (possibly) thiamine.
  • addition method of cofactors other than an enzyme, a substrate, and a measurement target substance is not particularly limited.
  • a detection reagent containing an enzyme, a substrate, and a cofactor may be prepared and added to the sample.
  • acetyl phosphate, carbon dioxide, and hydrogen peroxide are generated as products, and any of these products can be measured. Good.
  • hydrogen peroxide is selected as a measurement target.
  • the method for measuring hydrogen peroxide as a product is not particularly limited, but representative examples include a measurement method using a leuco dye, a measurement method using a Trinder reagent, and the like.
  • hydrogen peroxide is measured by reacting hydrogen peroxide and a leuco dye by the catalytic action of peroxidase, and measuring the coloration degree of the leuco dye colored by this reaction.
  • a leuco dye is an organic dye that develops or decolors by oxidation and reduction, and reacts with one molecule of hydrogen peroxide.
  • the specific type of leuco dye is not particularly limited, and a known compound can be preferably used. Specifically, for example, 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine salt (DA-67), 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis ( Phenothiazine derivatives such as dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10- (N-methylcarbamoyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (MCDP); N, N, N ′, N ′ , N ′′, N ′′ -hexa- (3-sulfopropyl) -4,4 ′, 4 ′′ -triaminotriphenylmethane (TPM-PS), 4,4′-tetramethyldiaminotriphenylmethane ( Leucomalachi
  • N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine salt (DA-64), 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4- Diphenylamine derivatives such as chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA); benzidine compounds such as diaminobenzidine and tetramethylbenzidine; other compounds such as o-phenylenediamine and hydroxypropionic acid; it can.
  • DA-67, DA-64, TPM-PS, MCDP and the like are particularly preferably used.
  • the method that uses the Trinder reagent is a method that uses the so-called Trinder reaction, where hydrogen peroxide, aminoantipyrine, and the Trinder reagent are reacted by the catalytic action of peroxidase, and the coloration degree by the quinone dye produced is measured. To measure hydrogen peroxide.
  • the Trinder reagent reacts with two molecules of hydrogen peroxide.
  • the specific kind of the Trinder reagent is not particularly limited, and a known compound can be suitably used.
  • a known compound can be suitably used.
  • N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS) N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (TOOS)
  • N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline APS
  • N-Ethyl-N-sulfopropylaniline ALPS
  • the measurement target substance is thiamine, but vitamin coenzymes such as thiamine are present in a very small amount in the living body, so the concentration in the sample is relatively low. Therefore, as a method for measuring a product, by adopting a method for reacting with one molecule of product, it is possible to measure with higher sensitivity.
  • the leuco dye reacts with one molecule of hydrogen peroxide as described above.
  • the tender reagent reacts with two molecules of hydrogen peroxide as described above. It is more preferable to employ a measurement method using a leuco dye.
  • thiamine in a sample is measured in the substance measurement method according to the present disclosure.
  • thiamine exists as phosphate esters of thiamine monophosphate (TMP), 2 thiamine diphosphate (thiamine pyrophosphate, TPP), and thiamine triphosphate (TTP) in the living body. Most of which are thiamine diphosphates (those that are not phosphorylated may also be present). And in the method of embodiment mentioned above, only the thiamine diphosphate which is a coenzyme is measured.
  • the ratio of thiamine diphosphate out of all thiamines in a living body can be confirmed in advance by a post-column HPLC method or an LC / MS / MS method, which is a conventional measurement method. Therefore, it is possible to calibrate the total amount of thiamine using the ratio of thiamine diphosphate in the total thiamine from the quantitative result of thiamine diphosphate by the substance measurement method according to the present disclosure.
  • the measurement target substance contained in the sample is not directly measured, but a chemical reaction is performed using an enzyme having the measurement target substance as a coenzyme, and the chemical reaction is generated.
  • the substance to be measured which is a coenzyme is indirectly quantified.
  • vitamin coenzymes such as thiamine have a low concentration in the sample, but when the concentration of the substance to be measured is low in this way, there is a possibility that sufficient sensitivity cannot be realized even if it is attempted to measure directly.
  • the measurement target substance can be measured (quantified) with higher sensitivity. .
  • the concentration of the substance to be measured in the sample is too low, there is a possibility that the sensitivity that can be applied to the measurement by the automatic analyzer cannot be obtained.
  • the substance measuring method according to the present disclosure even a measurement target substance such as thiamine can be measured with higher sensitivity as described above. Therefore, it is possible to realize measurement with sensitivity applicable to the automatic analyzer.
  • the post-column HPLC method or the LC / MS / MS method which is a conventional measurement method, measures by batch processing, but the substance measurement method according to the present disclosure allows measurement by continuous processing. It becomes.
  • the substance measurement method according to the present disclosure in order to measure the total amount of thiamine in the sample (sample), the thiamine phosphate is hydrolyzed to remove the phosphate.
  • the substance measurement method according to the present disclosure it is possible to determine the total amount of thiamine simply by determining the amount of thiamine diphosphate occupying most of the total thiamine. Therefore, the pretreatment can be as simple as deproteinization. Therefore, by using the substance measurement method according to the present disclosure, it is possible to easily establish a measurement system for pre-processing a sample such as whole blood and measuring it with an automatic analyzer.
  • NADH nicotinamide adenine dinucleotide
  • a product to be measured for quantifying NADH (measurement target substance) is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of enzyme selected.
  • lactate dehydrogenase is used as an enzyme. This lactate dehydrogenase changes pyruvate, which is a substrate, into lactic acid, and NADH, which is a coenzyme, is converted to oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +).
  • NAD + oxidized nicotinamide adenine dinucleotide
  • the enzyme using NADH as a coenzyme is not limited to lactate dehydrogenase, and may be other known enzymes.
  • pyruvic acid may be added as a substrate to a sample containing (possibly) NADH.
  • lactic acid and NAD + are generated as products, and any of these may be used as a measurement target product.
  • NAD + is a measurement target. Since the absorption peak at 340 nm of NADH decreases due to the generation of NAD + , NADH in the sample can be quantified by measuring the absorbance with a spectrophotometer.
  • Example 1 [Preparation of thiamine diphosphate solution] 10 mg of cocarboxylase (thiamine diphosphate, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number: 031-03833) is weighed, and 40 mL of 500 mM phosphate buffer (pH) is dispensed, and the volume is adjusted to 100 mL with purified water. Thus, a phosphate buffer solution (pH 6.7) of 100 mg / L-thiamine pyrophosphate was prepared.
  • cocarboxylase thiamine diphosphate, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number: 031-03833
  • Blank 200 mM-phosphate buffer, standard solution, and specimen were dispensed in predetermined amounts, and each was pretreated for deproteinization.
  • a predetermined amount of trichloroacetic acid was added to each for acid treatment, and the supernatant was neutralized with a sodium acetate solution.
  • a calibration curve was prepared from the results of the change in absorbance of the standard solution and the relationship between the concentrations. Further, the amount of thiamine diphosphate contained in the specimen was quantified using this calibration curve. As a result, a calibration curve similar to the LC / MS / MS method could be created, and the amount of thiamine diphosphate in the sample could be quantified as in the LC / MS / MS method.
  • NADH (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd., product number: 24335-61) was prepared in a plurality of concentrations (31.25 ⁇ M, 62.5 ⁇ M, 125 ⁇ M, 250 ⁇ M, 500 ⁇ M, 1000 ⁇ M) as a Tris-HCl buffer.
  • concentrations 31.25 ⁇ M, 62.5 ⁇ M, 125 ⁇ M, 250 ⁇ M, 500 ⁇ M, 1000 ⁇ M
  • a Tris-HCl buffer solution (NADH was 0 ⁇ M) not containing NADH was used for a blank for absorbance measurement.
  • a pyruvic acid solution as a first reagent was prepared by mixing with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5) so that the concentration of pyruvic acid was 2 mM.
  • lactate dehydrogenase solution It is a second reagent by mixing with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) so that the concentration of lactate dehydrogenase (product name: LCD-209, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is 30 units / mL. A lactate dehydrogenase solution was prepared.
  • the present invention can be widely and suitably used in the field of measuring a substance that functions as a coenzyme contained in a sample.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

試料に対して、当該試料に含まれる測定対象物質を補酵素とする酵素と当該酵素の基質とを少なくとも添加して、当該酵素が触媒する化学反応により生成した生成物を測定し、当該生成物の測定量に基づいて、試料に含まれる測定対象物質を定量する。測定対象物質がチアミンであれば、酵素として例えばピルビン酸オキシダーゼを用い、基質としてピルビン酸を添加し、必要に応じて測定対象物質以外の補因子を添加して化学反応させる。生成物のうち過酸化水素を公知の方法で測定することにより、チアミンを定量することができる。

Description

測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法
　本発明は、例えば、チアミン（ビタミンＢ1 ）等のように補酵素として作用する生理活性物質を測定対象物質として測定する物質測定方法に関する。
　例えば、チアミン（ビタミンＢ1 ）は、水溶性ビタミンの１種であり、糖質（炭水化物）および分岐鎖アミノ酸の代謝に大きく寄与するとともに、神経系、消化器系、心臓・血管系の機能調整にも寄与する。チアミンが欠乏すれば、脚気またはウェルニッケ脳症を引き起こすことが知られている。そのため、血液等の生体試料におけるチアミンの検査は、ビタミンＢ1 欠乏症の指標等として臨床的意義を有する。
　チアミンは、生体内ではリン酸化されてリン酸エステルとして存在しており、このリン酸エステルとしては、１リン酸エステルであるチアミン一リン酸（ＴＭＰ）、２リン酸エステルであるチアミン二リン酸（チアミンピロリン酸、ＴＰＰ）、３リン酸エステルであるチアミン三リン酸（ＴＴＰ）が挙げられる。
　生体内では、チアミンの大部分がチアミン二リン酸で存在している。チアミン二リン酸は、α－カルボキシラーゼの補酵素であることから、コカルボキシラーゼとも称し、糖質の代謝に関与する補酵素、あるいは、生体内の種々酵素における補酵素として機能することが知られている。
　従来、チアミンの測定方法としては、主として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられてきた。代表的なポストカラム（ポストラベル）ＨＰＬＣ法では、まず、前処理として、試料に含まれるチアミンのリン酸エステルを加水分解し、リン酸エステルからリン酸を脱離させる。この前処理により、試料中の全てのチアミンはリン酸化されていないものとなる。このように前処理した試料はＨＰＬＣに注入されてカラムから溶出される。溶出時には溶出液にラベル化試薬を混合することで、溶出するチアミンの発色を検出器で検出することができる。
　また、最近では、ポストカラムＨＰＬＣ法で想定される課題に対応するために、例えば、非特許文献１に開示されるように、液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いたビタミンＢ1 （チアミン）測定方法（便宜上、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法とする。）が提案されている。
　非特許文献１には、ポストカラムＨＰＬＣ法の課題として、ラベル化試薬が強アルカリ性溶液であるため分析機器へのダメージが強いこと、廃液による環境負荷が懸念されていること、１試料（検体）当たりの測定時間が約１０分を要するため効率的でないこと等が指摘されている。そこで、非特許文献１では、ビタミンＢ1 の測定方法としてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いることにより、ポストカラムＨＰＬＣ法と同様の信憑性を有する測定結果が得られることを検証している。さらに、非特許文献１には、１試料当たりの測定時間を４分に短縮できること、強アルカリ性試薬を使用しないため分析機器へのダメージが軽減されるとともに環境への負荷も払拭されることが記載されている。
宮川　秀則、権藤　一美、中浦　秀章、加藤　雅子、橋詰　直孝、「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる全血中総ビタミンＢ1 の測定方法」生物試料分析、第３６巻第４号（２０１３年９月３０日発行）、ｐｐ．３２７～３３０
　しかしながら、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法であってもポストカラムＨＰＬＣ法であっても、前処理としてリン酸を脱離させる加水分解が必要である。非特許文献１に記載されている通り、この前処理には例えば１時間もの長時間を要するため、チアミンの測定の効率化を妨げている。
　また、非特許文献１によれば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によるチアミンの測定では、ポストカラムＨＰＬＣ法の測定に比べて１試料当たりの測定時間を短縮化できているが、この測定はバッチ処理（回分処理）であり連続処理ではない。そのため、連続処理の測定に比べて測定時間の短縮に限界がある。
　本発明はこのような課題を解決するためになされたものであって、例えばチアミン（ビタミンＢ1 ）のような生理活性物質を効率的に測定することができる物質測定方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る物質測定方法は、前記の課題を解決するために、試料に対して、当該試料に含まれる測定対象物質を補酵素とする酵素と当該酵素の基質とを少なくとも添加して、当該酵素が触媒する化学反応により生成した生成物を測定し、当該生成物の測定量に基づいて、前記試料に含まれる測定対象物質を定量する構成である。
　前記構成によれば、試料に含まれる測定対象物質を直接測定するのではなく、当該測定対象物質を補酵素とする酵素を用いて化学反応させ、この化学反応により生成した生成物を測定することにより、補酵素である測定対象物質を間接的に定量する。これにより、測定対象物質の直接測定する方法に比較して、当該測定対象物質の前処理を簡素化または省略することができる。そのため、測定対象物質を容易に測定することが可能となる。
　しかも、測定対象物質の濃度が相対的に低いとしても、生成物の測定量に基づいて測定対象物質を間接的に定量することで、直接的に定量する場合に比較して、当該測定対象物質をより高い感度で測定（定量）することが可能となる。それゆえ、本開示に係る物質測定方法を用いることにより、測定対象物質の濃度が低い試料であっても自動分析装置で測定する系の確立を進めることが可能となる。
　前記構成の物質測定方法においては、前記測定対象物質がチアミンである構成であってもよい。
　また、前記構成の物質測定方法においては、前記化学反応を触媒する酵素がピルビン酸オキシダーゼであり、前記生成物が過酸化水素であるとともに、当該過酸化水素の測定は、当該過酸化水素とロイコ色素とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、これにより発色した当該ロイコ色素の呈色度を測定することにより行われる構成であってもよい。
　また、前記構成の物質測定方法においては、前記化学反応を触媒する酵素がピルビン酸オキシダーゼであり、前記生成物が過酸化水素であるとともに、当該過酸化水素の測定は、当該過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定することにより行われる構成であってもよい。
　また、前記構成の物質測定方法においては、前記測定対象物質が還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である構成であってもよい。
　また、前記構成の物質測定方法においては、前記化学反応を触媒する酵素が乳酸デヒドロゲナーゼであり、前記生成物が酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）であるとともに、当該酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの測定は、吸光度変化により行われる構成であってもよい。
　また、前記構成の物質測定方法においては、前記試料には、前記酵素および前記基質に加えて、前記測定対象物質以外の補因子を添加する構成であってもよい。
　本発明では、以上の構成により、例えばチアミン（ビタミンＢ1 ）のような生理活性物質を効率的に測定することができる物質測定方法を提供することができる、という効果を奏する。
本発明の実施例２の結果である、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の試料中の濃度と各試料の吸光度変化ΔＡｂｓ．との関係を示すグラフである。
　以下、本開示の代表的な実施の形態を具体的に説明する。本開示に係る物質測定方法は、試料に対して、当該試料に含まれる測定対象物質を補酵素とする酵素と当該酵素の基質とを少なくとも添加して、当該酵素が触媒する化学反応により生成した生成物を測定する。そして、生成物の測定量に基づいて、試料に含まれる測定対象物質を定量する。
　本開示に係る物質測定方法における測定対象物質は具体的に限定されず、試料中に存在し補酵素として機能する生理活性物質であれば良い。具体的には、例えば、ビタミンＢ1 （チアミンまたはそのリン酸エステル）、ビタミンＢ2 （リボフラビンまたはそのヌクレオチド結合体）、ナイアシン（ニコチン酸またはニコチン酸アミドもしくはそのアデニンヌクレオチド結合体、ビタミンＢ3 とも称する）、ビタミンＢ6 （ピリドキシン、ピリドキサール、およびピリドキサミンまたはそのリン酸エステル）、補酵素Ａ（パントテン酸）、補酵素Ｒ（ビオチン）、補酵素Ｆ（葉酸）、補酵素Ｂ１２（コバラミン、ビタミンＢ12とも称する）、補酵素Ｑ（ユビキノン）等のビタミン補酵素；ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、トパキノン（ＴＰＱ）、トリプトファン－トリプトフィルキノン（ＴＴＱ）、：メチルアミン酸化還元、リシンチロシルキノン（ＬＴＱ）、システニル－トリプトファンキノン（ＣＴＱ）等のキノン補酵素；アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋）等のヌクレオチド系補酵素（ビタミン補酵素のうちヌクレオチド結合体をヌクレオチド系補酵素に分類してもよい）；α－リポ酸；等が挙げられる。
　本実施の形態では、測定対象物質として、ビタミンＢ1 すなわちチアミンまたはそのリン酸エステル（以下、単にチアミンとする。）を代表例に挙げて、本開示に係る物質測定方法を説明する（後述する実施例１参照）。
　測定対象となる試料は特に限定されず、測定対象物質が含まれるものであればどのようなものであってもよい。測定対象物質がチアミンであれば、全血等の検体、チアミンを含む（可能性のある）食品等を挙げることができる。
　チアミンを補酵素とする酵素は特に限定されず、公知のものを好適に用いることができる。具体的には、例えば、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、３－メチル－２－オキソブタン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸シンターゼ、２－オキソグルタル酸シンターゼ、シュウ酸オキシドレダクターゼ、２－オキソ酸オキシドレダクターゼ、トランスケトラーゼ、ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ、アセトイン－リボース－５－リン酸トランスアルドラーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソアジピン酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ、２－スクシニル－５－エノールピルビニル－６－ヒドロキシ－３－シクロヘキセン－１－カルボン酸シンターゼ、３－アセチルオクタナルシンターゼ、アセトインデヒドロゲナーゼ、スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ2 －（２－カルボキシエチル）アルギニンシンターゼ、ビオチンシンターゼ、シクロヘキサン－１，２－ジオンヒドロラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ、オキサリル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、タルトロン酸－セミアルデヒドシンターゼ、アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、２－オキソグルタレートデカルボキシラーゼ、分岐鎖－２－オキソ酸デカルボキシラーゼ、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、５－グアニジノ－２－オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、スルホピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホケトラーゼ、フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ、プロピオンシンターゼ、ベンゾインアルドラーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ｏ－スクシニル安息香酸シンターゼ等が挙げられるが、特に限定されない。
　また、チアミン（測定対象物質）を定量するために測定する生成物も特に限定されず、選択される酵素の種類に応じて適宜選択すればよい。同様に、生成物の測定方法も特に限定されず、生成物の種類に応じて公知の測定方法を採用すればよい。さらに、試料に対しては、酵素およびその基質を添加するだけでなく、他の成分、例えば測定対象物質以外の補因子を添加してもよい。
　本実施の形態では、酵素としてピルビン酸オキシダーゼを選択する場合を例に挙げて、本開示に係る物質測定方法をより具体的に説明する。ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸（ＣＨ3ＣＯＣＯＯＨ ）、リン酸（Ｈ3ＰＯ4）および酸素（Ｏ2 ）を反応させて、アセチルリン酸（ＣＨ3 ＣＯＨ2ＰＯ4 ）、二酸化炭素（ＣＯ2 ）および過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を生成する化学反応を可逆的に触媒する。したがって、ピルビン酸オキシダーゼにおいては、ピルビン酸、リン酸、および酸素が基質であり、アセチルリン酸、二酸化炭素、および過酸化水素が生成物である。また、ピルビン酸オキシダーゼの補因子としては、補酵素であるチアミン（チアミン二リン酸）に加えて、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ2+ ）が必要である。
　それゆえ、本開示に係る物質測定方法では、チアミンが含まれる（可能性のある）試料に対して、基質としてピルビン酸を添加するとともに、補因子として、ＦＡＤおよびＭｇ2+ を添加すればよい。また、酵素、基質、測定対象物質以外の補因子の添加方法も特に限定されない。例えば、試料が後述する実施例のように全血の検体であれば、酵素、基質、補因子を含む検出試薬を調製しておき、この検出試薬を試料に添加すればよい。
　ピルビン酸オキシダーゼにより触媒される前記化学反応では、生成物として、前記の通り、アセチルリン酸、二酸化炭素、および過酸化水素が生成するが、測定対象となる生成物はこれらのいずれであってもよい。本実施の形態では、過酸化水素を測定対象として選択するものとする。
　生成物である過酸化水素を測定する方法は特に限定されないが、代表的には、ロイコ色素を用いる測定方法、あるいは、トリンダー試薬を用いる測定方法等が挙げられる。
　ロイコ色素を用いる測定方法では、過酸化水素とロイコ色素とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、これにより発色したロイコ色素の呈色度を測定することにより、過酸化水素を測定する。ロイコ色素は、酸化還元により発色したり消色したりする有機色素であり、過酸化水素１分子に対して反応する。
　ロイコ色素の具体的な種類は特に限定されず、公知の化合物を好適に用いることができる。具体的には、例えば、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン塩（ＤＡ－６７）、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－（Ｎ－メチルカルバモイル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）等のフェノチアジン誘導体；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）、４，４’－テトラメチルジアミノトリフェニルメタン（ロイコマラカイトグリーン）、トリス（４－ジメチルアミノフェニル）メタン（ロイコクリスタルバイオレット）等のトリフェニルメタン誘導体；Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）等のジフェニルアミン誘導体；ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等のベンジジン系化合物；ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸等のその他の化合物；等を挙げることができる。これらの中でも、特に、ＤＡ－６７，ＤＡ－６４，ＴＰＭ－ＰＳ，ＭＣＤＰ等が好適に用いられる。
　トリンダー試薬を用いる方法は、いわゆるトリンダー（Trinder）反応を利用する方法であり、過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定することにより、過酸化水素を測定する。トリンダー試薬は過酸化水素２分子に対して反応する。
　トリンダー試薬の具体的な種類は特に限定されず、公知の化合物を好適に用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル-3-メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－-スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）等のアニリン誘導体；フェノール、４－クロロフェノール、２，４－ジクロロフェノール、２，６－ジクロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２，４－ジブロモフェノール、２，４，６－トリクロロフェノール、２，４，６－トリブロモフェノール、３，５－ジクロロ－２－ヒドロキシベンゼンスルホン酸、または３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨードベンゾイル酸等のフェノール誘導体；トルイジン誘導体；等を挙げることができる。これらの中でも、特にＴＯＯＳが好適に用いられる。
　本実施の形態では、測定対象物質がチアミンであるが、チアミンのようなビタミン補酵素は、生体中で非常に微量に存在するものであるため、試料中の濃度も相対的に低くなる。そのため、生成物の測定方法としては、生成物１分子に対して反応する方法を採用することで、より高感度の測定が可能である。ロイコ色素を用いる測定方法では、前記の通り過酸化水素１分子にロイコ色素が反応するが、トリンダー試薬を用いる測定方法では、前記の通り過酸化水素２分子に対してトリンダー試薬が反応するので、ロイコ色素を用いる測定方法を採用することがより好ましい。
　本実施の形態では、本開示に係る物質測定方法において、試料中のチアミン（ビタミンＢ1 ）を測定する例を説明している。ここで、前述したように、チアミンは、生体内ではチアミン一リン酸（ＴＭＰ）、２チアミン二リン酸（チアミンピロリン酸、ＴＰＰ）、およびチアミン三リン酸（ＴＴＰ）というリン酸エステルとして存在しており、その大部分がチアミン二リン酸である（リン酸化されていないチアミンも存在し得る）。そして、前述した実施の形態の方法では、補酵素であるチアミン二リン酸のみを測定していることになる。
　ここで、生体内における全チアミンのうちのチアミン二リン酸の比率については、従来の測定方法であるポストカラムＨＰＬＣ法またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によりを予め確認することができる。それゆえ、本開示に係る物質測定方法によるチアミン二リン酸の定量結果から、全チアミン中のチアミン二リン酸の比率を利用して、全チアミン量を検量することが可能になる。
　このように、本開示に係る物質測定方法では、試料に含まれる測定対象物質を直接測定するのではなく、当該測定対象物質を補酵素とする酵素を用いて化学反応させ、この化学反応により生成した生成物を測定することにより、補酵素である測定対象物質を間接的に定量する。これにより、測定対象物質の直接測定する方法に比較して、当該測定対象物質の前処理を簡素化または省略することができる。そのため、測定対象物質を容易に測定することが可能となる。
　しかも、チアミン等のようなビタミン補酵素は、試料中の濃度が低いが、このように測定対象物質の濃度が低い場合には、直接測定しようとしても十分な感度を実現できない可能性がある。これに対して、本開示によれば、生成物の測定量に基づいて測定対象物質を間接的に定量することで、当該測定対象物質をより高い感度で測定（定量）することが可能となる。
　また、一般に、試料中における測定対象物質の濃度が低すぎると、自動分析装置による測定に適用できる程度の感度を得ることができないおそれがある。しかしながら、本開示に係る物質測定方法によれば、チアミン等のような測定対象物質であっても、前記の通り、より高い感度での測定が可能になる。それゆえ、自動分析装置に適用可能な感度での測定を実現することができる。
　また、チアミン測定の場合では、従来の測定方法であるポストカラムＨＰＬＣ法またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法では、バッチ処理による測定であるが、本開示に係る物質測定方法では、連続処理による測定が可能となる。加えて、ポストカラムＨＰＬＣ法およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法のいずれであっても、検体（試料）中の全チアミン量を測定するために、チアミンリン酸エステルを加水分解してリン酸を脱離する前処理が必要になるが、本開示に係る物質測定方法では、全チアミンの大部分を占めるチアミン二リン酸を定量するだけで全チアミン量も定量することが可能になる。そのため、前処理としては、除タンパク程度の簡単な処理で済むことになる。それゆえ、本開示に係る物質測定方法を用いることにより、全血等の試料を簡単に前処理して自動分析装置で測定する測定系の確立を進めることが可能となる。
　なお、本開示における他の実施の形態としては、測定対象物質が還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である形態を挙げることができる。ＮＡＤＨ（測定対象物質）を定量するために測定する生成物も特に限定されず、選択される酵素の種類に応じて適宜選択すればよい。後述する実施例２では、酵素として乳酸デヒドロゲナーゼを用いており、この乳酸デヒドロゲナーゼは、基質であるピルビン酸を乳酸に変化させるとともに、補酵素であるＮＡＤＨを酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変化させる。なお、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼに限定されず、公知の他の酵素であってもよい。
　したがって、本開示に係る物質測定方法では、ＮＡＤＨが含まれる（可能性のある）試料に対して、基質としてピルビン酸を添加すればよい。この場合、生成物として、前記の通り、乳酸およびＮＡＤ＋が生成するが、測定対象となる生成物はこれらのいずれであってもよい。後述する実施例２ではＮＡＤ＋を測定対象としている。ＮＡＤ＋が生成することでＮＡＤＨが有する３４０ｎｍの吸収ピークが減少するので、分光光度計で吸光度を測定することにより、試料中のＮＡＤＨを定量することができる。
　本発明について、実施例、比較例および参考例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
　（実施例１）
　［チアミン二リン酸溶液の調製］
　コカルボキシラーゼ（チアミン二リン酸、和光純薬工業株式会社、製品番号：０３１－０３８３３）を１０ｍｇ秤量するとともに５００ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ）を４０ｍＬ分注して精製水で１００ｍＬに定容することで、１００ｍｇ／Ｌ－チアミンピロリン酸のリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）溶液を調製した。
　［ＤＡ－６７発色チアミンピロリン酸検出試薬の調製］
　ピルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社、製品番号：Ｔ－４５）を１０ユニット、ペルオキシダーゼ（東洋紡株式会社、製品番号：ＰＥＯ－３０１）を６０ユニット、ピルビン酸カリウムを１８９ｍｇ、塩化マグネシウムを４０ｍｇ、Triton X-100を２０ｍｇそれぞれ秤量するとともに、５００ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を４ｍＬ分注して精製水で１０ｍＬに定容することで、ＤＡ－６７発色チアミンピロリン酸検出試薬の第一試薬（Ｒ１）を調製した。
　また、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、和光純薬工業株式会社、製品番号：０６２－００１６４）を３１１ｍｇ、ＤＡ－６７（和光純薬株式会社、製品番号：０４６－２２３４１）を０．３ｍｇ、Triton X-100を１０ｍｇそれぞれ秤量するとともに、５００ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を２ｍＬ分注し、精製水で５ｍＬに定容することで、ＤＡ－６７発色チアミンピロリン酸検出試薬の第二試薬（Ｒ２）を調製した。
　［標準液の調製および吸光度測定のブランク］
　前述した１００ｍｇ／Ｌ－チアミン二リン酸溶液を１ｍＬ，５００ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を４００ｍＬ分注して精製水で１０００ｍＬ（１Ｌ）に定容することで、検量線作成用の標準液（Ｔｓｔｄ）を調製した。また、吸光度測定のブランク（空試験値、Ｂｌｋ）は、２００ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を用いた。
　ブランク用の２００ｍＭ－リン酸緩衝液、標準液、および検体（全血、Ｔｓａｍ）を所定量分注し、それぞれ除タンパクのための前処理を行った。前処理では、それぞれに所定量のトリクロロ酢酸を添加して酸処理して上清を酢酸ナトリウム溶液で中和した。
　［吸光度変化の測定］
　分光光度計として、株式会社日立ハイテクサイエンス社製、製品番号：Ｕ－３３１０を用い、ブランク（Ｂｌｋ）、標準液（Ｔｓｔｄ）または検体（Ｔｓａｍ）と第一試薬（Ｒ１）と第二試薬（Ｒ２）とをそれぞれ１：６：２の比率で混合し（Ｂｌｋ／Ｔｓｔｄ／Ｔｓａｍ：Ｒ１：Ｒ２＝１：６：２）、波長７００ｎｍ、温度３７℃、タイムスキャン測定の測定条件で吸光度変化を測定した。
　標準液の吸光度変化の結果および濃度の関係から検量線を作成した。また、この検量線を用いて検体に含まれるチアミン二リン酸の量を定量した。その結果、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法と同様の検量線が作成できるとともに、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法と同様に検体中のチアミン二リン酸の量を定量することができた。
　（実施例２）
　［ＮＡＤＨ溶液の調製］
　ＮＡＤＨ（ナカライテスク株式会社製、製品番号：２４３３５－６１）は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液として複数種類の濃度（３１．２５μＭ，６２．５μＭ，１２５μＭ，２５０μＭ，５００μＭ，１０００μＭ）のものを調製した。また、吸光度測定のブランク用に、ＮＡＤＨを含有しないＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液のみ（ＮＡＤＨが０μＭ）を用いた。
　［ピルビン酸溶液の調製］
　１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）に、ピルビン酸の濃度が２ｍＭとなるように混合することで、第一試薬であるピルビン酸溶液を調製した。
　［乳酸デヒドロゲナーゼ溶液の調製］
　２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に、乳酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡株式会社製、製品名：ＬＣＤ－２０９）の濃度が３０ユニット／ｍＬとなるように混合することで、第二試薬である乳酸デヒドロゲナーゼ溶液を調製した。
　［吸光度変化の測定］
　測定対象の試料（サンプル）であるＮＡＤＨ溶液２５μＬと第一試薬４５０μＬとを混合して吸光度測定用のＡ液を調製し、３７℃で５分間加温した後に、Ａ液の吸光度を測定した。その後、Ａ液に対してさらに第二試薬を１５０μＬ混合して吸光度測定用のＢ液を調製し、３７℃で５分間加温した後に、Ｂ液の吸光度を測定した。Ａ液の吸光度をＡｂｓ．Ａとし、Ｂ液の吸光度をＡｂｓ．Ｂとしたときに、吸光度変化ΔＡｂｓ．は、Ａｂｓ．ＡとＡｂｓ．Ｂとの差分となる（ΔＡｂｓ．＝Ａｂｓ．Ａ－Ａｂｓ．Ｂ）。
　濃度の異なるＮＡＤＨ溶液について、それぞれ吸光度変化ΔＡｂｓ．を測定し、ＮＡＤＨ溶液の濃度と対比させたところ、図１に示すように、ＮＡＤＨ濃度に対する吸光度変化ΔＡｂｓ．の変化が実質的に直線となっており、試料中のＮＡＤＨを定量できることが明らかとなった。
　なお、本発明は前記実施の形態の記載に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態や複数の変形例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らかである。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造及び／又は機能の詳細を実質的に変更できる。
　本発明は、試料中に含まれる補酵素として機能する物質を測定する分野に広く好適に用いることができる。

Claims (7)

  1. 　試料に対して、当該試料に含まれる測定対象物質を補酵素とする酵素と当該酵素の基質とを少なくとも添加して、当該酵素が触媒する化学反応により生成した生成物を測定し、
    　当該生成物の測定量に基づいて、前記試料に含まれる測定対象物質を定量することを特徴とする、
    物質測定方法。
  2. 　前記測定対象物質がチアミンであることを特徴とする、
    請求項１に記載の物質測定方法。
  3. 　前記化学反応を触媒する酵素がピルビン酸オキシダーゼであり、前記生成物が過酸化水素であるとともに、
    　当該過酸化水素の測定は、当該過酸化水素とロイコ色素とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、これにより発色した当該ロイコ色素の呈色度を測定することにより行われることを特徴とする、
    請求項２に記載の物質測定方法。
  4. 　前記化学反応を触媒する酵素がピルビン酸オキシダーゼであり、前記生成物が過酸化水素であるとともに、
    　当該過酸化水素の測定は、当該過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定することにより行われることを特徴とする、
    請求項２に記載の物質測定方法。
  5. 　前記測定対象物質が還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）であることを特徴とする、
    請求項１に記載の物質測定方法。
  6. 　前記化学反応を触媒する酵素が乳酸デヒドロゲナーゼであり、前記生成物が酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）であるとともに、
    　当該酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの測定は、吸光度変化により行われることを特徴とする、
    請求項５に記載の物質測定方法。
  7. 　前記試料には、前記酵素および前記基質に加えて、前記測定対象物質以外の補因子を添加することを特徴とする、
    請求項１から６のいずれか１項に記載の物質測定方法。
     
     
PCT/JP2018/019939 2017-05-24 2018-05-24 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 WO2018216757A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019520301A JP7234923B2 (ja) 2017-05-24 2018-05-24 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017102944 2017-05-24
JP2017-102944 2017-05-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018216757A1 true WO2018216757A1 (ja) 2018-11-29

Family

ID=64395561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/019939 WO2018216757A1 (ja) 2017-05-24 2018-05-24 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7234923B2 (ja)
WO (1) WO2018216757A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6368099A (ja) * 1986-09-10 1988-03-26 Toyobo Co Ltd ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬
JPH02200200A (ja) * 1988-10-07 1990-08-08 Internatl Reagents Corp Ｎａｄｈの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定量法
JPH08168397A (ja) * 1994-12-19 1996-07-02 Tokuyama Corp ピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬
JPH1189594A (ja) * 1997-09-17 1999-04-06 Fuji Photo Film Co Ltd ピルビン酸定量用乾式分析素子
JP2003057235A (ja) * 2001-08-10 2003-02-26 Internatl Reagents Corp 物質の安定化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6368099A (ja) * 1986-09-10 1988-03-26 Toyobo Co Ltd ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬
JPH02200200A (ja) * 1988-10-07 1990-08-08 Internatl Reagents Corp Ｎａｄｈの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定量法
JPH08168397A (ja) * 1994-12-19 1996-07-02 Tokuyama Corp ピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬
JPH1189594A (ja) * 1997-09-17 1999-04-06 Fuji Photo Film Co Ltd ピルビン酸定量用乾式分析素子
JP2003057235A (ja) * 2001-08-10 2003-02-26 Internatl Reagents Corp 物質の安定化方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKYILMAZ, EROL ET AL.: "A novel biosensor based on activation effect of thiamine on the activity of pyruvate oxidase", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 23, no. 12, 14 March 2008 (2008-03-14), pages 1874 - 1877, XP022666056 *
ASANUMA, KAZUKO ET AL.: "Simultaneous quantification method by automatic analysis of lactic acid and pyruvic acid in blood plasma using oxidase system", ANALYSIS OF CLINICAL SPECIMEN, vol. 8, no. 3, 1985, pages 16 - 24 *
EDWARDS, KATIE A. ET AL.: "Thiamine Assays- Advances, Challenges, and Caveats", CHEMISTRYOPEN, vol. 6, no. 2, 8 March 2017 (2017-03-08), pages 178 - 191, XP055472007 *
MIZOGUCHI, MAKOTO ET AL.: "The development of new type oxidative and reductive chromogenic reagents in clinical analysis", BUNSEKI KAGAKU, vol. 45, no. 2, 1996, pages 111 - 124, XP055563676 *
SAKAKIBARA, KANAKO ET AL.: "A Sensitive Enzymatic Cycling Method for Determination of Lactate and Pyruvate in Blood", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL CHEMISTRY, vol. 29, no. 2, 2000, pages 69 - 73, XP055563680 *
SCHUBERT, FLORIAN ET AL.: "Lactate-Dehydrogenase- Based Biosensors for Glyoxylate and NADH Determination: A Novel Principle of Analyte Recycling", ELECTROANALYSIS, vol. 2, no. 5, July 1990 (1990-07-01), pages 347 - 351, XP055563671 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018216757A1 (ja) 2020-03-26
JP7234923B2 (ja) 2023-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Seefeldt et al. A continuous, spectrophotometric activity assay for nitrogenase using the reductant titanium (III) citrate
JPWO2018056431A1 (ja) Ｌ−キヌレニンの測定方法及び測定キット
JP6703721B1 (ja) アミノ酸の測定方法、及びそのためのキット
JP4807920B2 (ja) 総ホモシステイン測定方法
WO2018216757A1 (ja) 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法
GB2213261A (en) Assay of salicylates or reduced pyridine nucleatides
JP5017614B2 (ja) 試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、非特異的発色を抑制する方法、並びに非特異的発色抑制剤
AU2002366025B2 (en) ATP measurement method allowing visual judgement and reagent therefore
JPS5935599B2 (ja) コリンエステラ−ゼ活性測定法
US4695539A (en) Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase
JP2804079B2 (ja) Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法
WO2012050536A1 (en) Method of the adenosine diphosphate quantitative determination
US5436133A (en) Enzyme assay of biochemical substances
EP0386237B1 (en) Enzyme assay of biological substances
Sarfraz et al. Enzyme assay techniques and protocols
JPH0231697A (ja) 被分析物の存在を測定する分析方法及び試験組成物
US5447847A (en) Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination
JP7330516B2 (ja) ２－アミノフェノール類の測定方法
CN111575339A (zh) 1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂
JP2001252095A (ja) 微量成分の測定法及びそれに用いる組成物
JP2618456B2 (ja) ジヌクレオチドの定量法
Sümegi et al. Substrate-induced structural changes of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex
JP3586737B2 (ja) 生体物質の測定方法
EP0138530A2 (en) Method for the estimation of salicylates or reduced Pyridine nucleotides
JPH047200B2 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18805582

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019520301

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18805582

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1