JPH06289016A

JPH06289016A - 生物試料からのｄｎａ抽出試薬、該試薬を用いるｄｎａ抽出方法、並びにｄｎａ抽出キット

Info

Publication number: JPH06289016A
Application number: JP7963093A
Authority: JP
Inventors: Satsuki Kobayashi; 五月小林; Takuya Koshizaka; 卓也越坂
Original assignee: Sumitomo Metal Industries Ltd
Current assignee: Nippon Steel Corp
Priority date: 1993-04-06
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 1994-10-18

Abstract

(57)【要約】【目的】従来から使用されていたＤＮＡ抽出方法より
も短時間で容易に、しかも安全、安価に高純度のＤＮＡ
を得ることのできるＤＮＡ抽出試薬、該試薬を用いたＤ
ＮＡ抽出方法、ならびに該試薬を含むＤＮＡ抽出キット
を提供する。【構成】以下の操作：ａ）生物試料より細胞または核を粗抽出する、ｂ）以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤を加えることにより、細
胞および核とその他の構成成分、混在物を変性、可溶化
する、そしてｃ）有機溶媒によるＤＮＡ抽出を行わずに、そのまま低
級アルコールを加えてアルコール沈殿を行う、からなる
生物試料からのＤＮＡの抽出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡを材料として使
用する遺伝子工学、生化学、臨床検査などのバイオテク
ノロジーの分野に有用な生物試料からのＤＮＡ抽出試
薬、該試薬を用いるＤＮＡ抽出方法、並びに該試薬を用
いるＤＮＡ抽出キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞、組織、細菌、ウイルスなどの生物
試料からＤＮＡを抽出するには、従来次の３段階からな
る操作が最も普及している。

【０００３】１．第１段階：細胞の溶解とＤＮＡの可溶化ＤＮＡの可溶化はイオン性または非イオン性の界面活性
剤を使用して細胞を溶解することに始まる。しかしなが
ら、細胞の溶解はヌクレアーゼなどによる抽出ＤＮＡの
分解を促進することになるので、細胞溶解液にはエチレ
ンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩（ＥＤＴＡ）など
のキレート剤を用いてヌクレアーゼの活性抑制を同時に
行う必要がある。

【０００４】次に、ＤＮＡはＤＮＡ−タンパク質複合体
の形で存在するのでＤＮＡをタンパク質から遊離させる
必要が生じてくる。これには一般的に非特異的タンパク
質分解酵素であるプロテイナーゼＫが使用される。また
同時に界面活性剤がＤＮＡに結合しているタンパク質と
ミセルを作り、ＤＮＡからタンパク質を引きはがすこと
によって、このプロテイナーゼＫの効果が高められると
考えられている。

【０００５】２．第２段階：フェノール処理フェノール処理は試料由来のタンパク質および精製過程
で試料に添加した酵素類（プロテイナーゼＫ、リボヌク
レアーゼなど）を変性、分離除去する目的で行われる。
ここで、ある程度のヌクレアーゼおよびその他のタンパ
ク質は変性され、フェノール層と水層の中間層に沈殿と
して現れる。この処理により、ＤＮＡは上層、すなわち
水層に抽出され、タンパク質成分からの分離が成し遂げ
られる。

【０００６】フェノールの他にもクロロホルム、フェノ
ール−クロロホルム、クロロホルムとその他の有機溶媒
の混合物も使用することができる。

【０００７】核タンパク質を破壊する目的には、グアニ
ジン塩酸、グアニジンチオシアネートなどに代表される
カオトロープ剤も知られている。これらの試薬は高モル
濃度で使用され、タンパク質の破壊がヌクレアーゼの活
性抑制を兼ねていることから広く使用されている。しか
し、カオトロープ剤は一般的にはリボヌクレアーゼの不
活化剤としてＲＮＡの抽出に主に使用されているのが現
状のようである。

【０００８】３．第３段階：アルコール沈殿アルコール沈殿は溶液中のＤＮＡの濃縮およびフェノー
ル、塩、ヌクレオチドなどの混在物の除去の目的で行わ
れ、０．１−０．５Ｍの１価の陽イオンの混在下で行わ
れる。アルコールとしては２倍容積のエタノール、もし
くは０．６倍容積のイソプロパノール（２−プロパノー
ル）が使用される。この操作によりＤＮＡは白色沈殿と
して回収される。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の方法は、酵素処理が不可欠であり、またＤＮ
Ａをその他のタンパク質から分離するのが困難なために
カラム処理を行うなど、時間がかかるだけでなく操作も
繁雑であった。また、フェノール、クロロホルムなどの
有機溶媒の使用は危険で人体に有害であるという欠点を
有している。さらにこのような有機溶媒を使用すると、
抽出物を他の容器に移し変えねばならず、使用チューブ
の数が多くなるという問題も含んでいる。

【００１０】そこで、本発明は、６０−１２０分程度
の短時間の簡単な操作で高収率および高純度のＤＮＡを
抽出できる、１本のチューブで実施できるので、臨床
分野で利用する際の汚染（コンタミネーション）を防ぐ
ことができる、使用チューブ数が少なく、使用試薬も
比較的安価なので経済的である、フェノール、クロロ
ホルムまたはその混合物など危険で人体に有害な有機溶
媒を使用しない、タンパク質分解酵素などを用いた酵
素処理を必要としない、新規な生物試料からのＤＮＡ抽
出試薬、該試薬を用いるＤＮＡ抽出方法、並びに該試薬
を含むＤＮＡ抽出キットを提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、細胞、組
織、細菌、ウイルスなどからＤＮＡを抽出する際に、本
発明の試薬の各成分の組成および濃度を工夫することに
より、細胞、核、ウイルス粒子などから簡易にしかも再
現性よくＤＮＡが可能なこと、さらに使用するチューブ
の数を減らしうることを見いだし、本発明を完成するに
至った。

【００１２】本発明は、以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤からなる生物試料からの
ＤＮＡ抽出試薬を提供する。

【００１３】本発明はまた、以下の操作：ａ）生物試料より細胞または核を粗抽出する、ｂ）以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤を加えることにより、細
胞および核とその他の構成成分、混在物を変性、可溶化
する、そしてｃ）有機溶媒によるＤＮＡ抽出を行わずに、そのまま低
級アルコールを加えてアルコール沈殿を行う、からなる
生物試料からのＤＮＡ抽出方法を提供する。

【００１４】本発明はさらに、以下の試薬：ａ）細胞溶解液、ｂ）以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤、およびｃ）キレート剤と緩衝液との混在液からなる抽出したＤ
ＮＡを再溶解するための溶媒、からなる生物試料からＤ
ＮＡを抽出するためのキットを提供する。

【００１５】本発明の試薬を用いるＤＮＡ抽出は以下の
手順で行う。

【００１６】（ａ）生物試料から細胞または核の粗抽出
を公知の方法により行う。生物試料が血液である場合に
は、後述するＲＣＬＢ（ＲｅｄＣｅｌｌＬｙｓｉｓ
Ｂｕｆｆｅｒ）を用いる方法、デキストランを用いる
方法、バッフィーコートを取る方法などを使用すること
ができる。生物試料が培養細胞である場合にもＲＣＬＢ
を用いることができる。また、対象試料が微量、または
混入タンパク質成分などが微量であると考えられる場
合、または血清中のウイルス粒子からＤＮＡを抽出する
場合には、この操作を行わず、次の（ｂ）の操作より行
うことができる。

【００１７】（ｂ）次に単離した細胞もしくは核の変性
可溶化を本発明のＤＮＡ抽出試薬を用いて行う。

【００１８】本発明のＤＮＡ抽出試薬はタンパク質変性
剤を必須成分として含む水溶液である。タンパク質変性
剤としてはカオトロープ剤が好ましく、グアニジン塩
酸、グアニジンチオシアン酸などが特に好ましい。

【００１９】本発明のＤＮＡ抽出試薬はさらに、還元
剤、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択さ
れる少なくとも１種を含む。還元剤としては、ジスルフ
ィド結合を切断できるチオール系還元剤が好ましく、２
−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどが特
に好ましい。界面活性剤としては、本発明の試薬組成の
水溶液中で沈殿を起こす恐れのないもの、もしくは沈殿
が生じても何らかの方法により再溶解が可能なものが好
ましく、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ポリオ
キシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエ
チレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＮＰ−４０）
などが特に好ましい。キレート剤としては、二価の金属
イオンをキレートしうる能力を有するものが好ましく、
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩（ＥＤＴ
Ａ）などが特に好ましい。これらのうちのどれを使用す
るかは生物試料の種類や得られるＤＮＡの性質などに依
存する。

【００２０】本発明のＤＮＡ抽出試薬の一例と好ましい
濃度範囲（混合液中での最終濃度）を以下に示す：グアニジン塩酸３−８Ｍ２−メルカプトエタノール０．０５−０．４ＭＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム０．１−２％（Ｗ／Ｖ）エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩１−１００ｍＭ上記試薬はｐＨが弱酸性から弱アルカリ性で使用する。

【００２１】本発明の抽出試薬を用いて細胞もしくは核
の変性可溶化を行うには、上記組成の試薬を（ａ）で得
られる粗抽出物に加えて、ＤＮＡの物理的切断を避ける
ために、穏やかな撹拌を行うことのみでこれを行う。あ
るいは、本発明の抽出試薬にとって必須成分であるタン
パク質変性剤を加え、次いでその他の必要な構成成分を
順次加えてもよい。

【００２２】上記撹拌の後、５５℃前後でインキュベー
トを３０分程度行うと、より一層上記試薬溶液の効能が
上がり、ＤＮＡ遊離能が高められる。

【００２３】（ｃ）次いでイソプロパノール、エタノー
ルなどの低級アルコールを添加してＤＮＡを沈殿させ
る。この操作をアルコール沈殿という。イソプロパノー
ルを用いる場合には等容量以上、エタノールを用いる場
合には、エタノール最終濃度が６５％以上になるように
添加する。操作が容易である点からイソプロパノールが
より好ましい。

【００２４】沈殿したＤＮＡを回収するには、遠心を行
って上清を捨てるか、あるいは液量が多いときにはスポ
イト、または先を切り取ったピペットでＤＮＡを吸い取
り分取する。

【００２５】次いで、アルコール沈殿して得られたＤＮ
Ａを７０％エタノールで洗浄し、５分程度真空乾燥を行
いアルコール分をとばした後、適当な溶液に再溶解して
保存することにより使用可能な状態となる。再溶解に適
した溶液は、例えばキレート剤と緩衝液との混合液であ
り、以下の組成のＴＥ溶液が特に好ましい（濃度は混合
液中での最終濃度）：１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）本発明による上記の方法は、従来の技術と組み合わせて
使用することも可能である。例えば、請求項２に記載の
試薬に溶解した後、フェノールやクロロホルムで抽出
し、アルコール沈殿を行うことにより血液からゲノムＤ
ＮＡを抽出する。またバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ）Ｈ．Ｃ．とドリー（Ｄｏｌｙ）Ｊ．のアルカリ−Ｓ
ＤＳ法（Birnboim H.C. and Doly J. (1979) Nucleic A
cids Res. 7,1513) により、大腸菌のＤＮＡ、高タンパ
ク質を除いた”プラスミド粗出液”に請求項２に記載の
試薬を添加し、アルコール沈殿を行うといった、大腸菌
などからのプラスミドＤＮＡの抽出などにも本発明の方
法は応用できる。

【００２６】本発明のキットには、上記タンパク質溶解
剤の他に細胞溶解液ならびにキレート剤と緩衝液との混
合液が含まれる。

【００２７】細胞溶解液は血液、組織や培養液中の主に
核成分をその他の混在する細胞構成物質から単離する。
いかなる公知の細胞溶解液でも用いることができるが、
生物試料が血液である場合には、例えばＲＣＬＢ溶液
［最終濃度が０．３２Ｍシュークロース、１％（Ｖ／
Ｖ）ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエ
ーテル、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を組成とする水溶液］をキッ
トに含めることができる。

【００２８】キレート剤と緩衝液との混合液には、例え
ば上記の組成のＴＥ溶液を用いることができる。

【００２９】本発明の作用について、試薬を構成する各
成分の作用および効能から考察する。タンパク質変性剤
の１つであるグアニジン塩酸などのカオトロープ剤はタ
ンパク質変性可溶化作用とともにヌクレアーゼ活性阻害
作用がある。従って、単離された細胞もしくは核などを
膜構造破壊もしくは可溶化して、結果として核中のＤＮ
Ａが試薬溶液中に遊離される。

【００３０】２−メルカプトエタノールに代表される還
元剤はタンパク質中のイオウ原子どうしの結合であるジ
スルフィド結合を還元切断し、タンパク質の高次構造を
破壊し溶解性を高めるともに、この作用によりタンパク
質変性剤の効果を高める役割があると考えられる。

【００３１】Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムなど
の界面活性剤は、ＤＮＡに付着しているタンパク質や脂
質とミセルを形成し、これを可溶化させることによりＤ
ＮＡを遊離させる機能を有している。

【００３２】ＥＤＴＡなどの二価のキレート剤はヌクレ
アーゼの活性発現に必要なＭｇ²⁺などの二価金属イオン
を強力にキレートし、抽出ＤＮＡのヌクレアーゼによる
分解を防止する機能を有している。

【００３３】本発明の方法により抽出されたＤＮＡの検
定は以下の項目により行うことができる。

【００３４】（１）抽出量抽出ＤＮＡの量は、上記ＴＥ溶液に溶解後、分光光度計
（光路長：１ｃｍ）により波長２６０ｎｍにおける吸光
度を測定し、１ＯＤ＝５０μｇ／ｍｌなる換算式より求
めるものとした。通常、健常人血液１ｍｌから２０−５
０μｇ程度のＤＮＡが抽出される。

【００３５】（２）純度の決定［タンパク質の混入］抽出ＤＮＡはＴＥ溶液に溶解
後、分光光度計により核酸のピーク吸収波長である２６
０ｎｍ、タンパク質のピーク吸収波長である２８０ｎｍ
における吸光度を測定し、その比Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀を計算す
ることにより測定した。通常、純度の高いＤＮＡ溶液の
Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀の値は１．８−２．０である。

【００３６】［多糖類の混入］抽出ＤＮＡはＴＥ溶液
に溶解後、分光光度計により核酸のピーク吸収波長であ
る２６０ｎｍ、多糖類のピーク吸収波長である２３４ｎ
ｍにおける吸光度を測定し、その比Ａ₂₃₄／Ａ₂₆₀を計算
することにより測定した。通常、Ａ₂₃₄／Ａ₂₆₀の値が小
さいほど多糖類の混入が少ないと考えられる。

【００３７】［ＲＮＡの混入］抽出ＤＮＡを０．５μ
ｇ使用し、０．６％アガロースゲル電気泳動を行い、エ
チジウムブロマイド染色によりＤＮＡ以外の染色バンド
（ＲＮＡはゲノムＤＮＡより分子量が小さいため、低分
子側にバンドとして検出される）の存在の有無を観察す
ることにより行う。抽出ＤＮＡをリボヌクレアーゼ処理
（ＤＮＡ：リボヌクレアーゼ（重量比）＝２：１で混
合、３７℃、１時間インキュベート）したものとしない
ものを同様にインキュベート後、電気泳動し、染色像に
変化が生ずるかどうかを観察することにより行う。

【００３８】［ヌクレアーゼの混入］抽出ＤＮＡを数
種の塩濃度のヌクレアーゼ用緩衝液とともに３７℃、４
時間インキュベートし［ＲＮＡの混入］の項に記載した
方法と同様の電気泳動を行い、インキュベートしなかっ
たものを対照として泳動像に変化が生ずるかどうかを観
察することにより行う。

【００３９】（３）抽出ＤＮＡの分子量測定上記［ＲＮＡの混入］の項に記載の電気泳動条件と同様
の条件で抽出ＤＮＡ０．５μｇを泳動し、同一ゲルで電
気泳動した分子量マーカーのバンドと比較して測定す
る。本発明の方法により抽出したＤＮＡは２０Ｋｂ以上
である。

【００４０】本発明の方法によって抽出されたＤＮＡは
純度が高く、これを遺伝子工学の各種分野に応用するこ
とができる。例えば、本発明の方法によって抽出したＤ
ＮＡを遺伝子増幅技術の１つであるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）などに用
いることができる。また、抽出ＤＮＡは各種の制限酵素
により切断可能であるので、市販の制限酵素を購入した
ときに、各種の緩衝液を用いて制限酵素による切断をす
ることができる。またさらには、抽出ＤＮＡを直接また
は電気泳動後、固相化し、抽出ＤＮＡの配列に相補的な
プローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、検出
することが可能である。このように本発明の応用範囲は
極めて広範囲である。

【００４１】以下に記載する実施例によって本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれに何ら限定される
ものではない。

【００４２】

【実施例】

実施例１．生物試料の前処理各種生物試料から細胞、核などを単離するには、以下の
方法を用いることができる。なお、対象試料が微量、ま
たは混入タンパク質成分などが微量である場合や血清か
らのウイルスＤＮＡの抽出の場合にはこの操作を行わ
ず、次の段階に進むことができる。

【００４３】対象が血液でない場合はＲＮＡの混入が考
えられるためリボヌクレアーゼ処理の必要も生じること
がある。

【００４４】（１）ＲＣＬＢを用いる方法ａ．対象が血液である場合前述の組成のＲＣＬＢを用いるが、この操作はＤＮＡの
ヌクレアーゼによる分解を防止するため、氷水中で行う
ことが望ましく。他の方法についてもＲＣＬＢを用いる
場合は同様である。

【００４５】ＲＣＬＢを検体血液に対し、検体血液の２
倍容量添加し穏やかに撹拌する。次に、２０００ｇ、５
分間、４℃で遠心分離し上清を捨て沈渣を回収する。

【００４６】ｂ．対象が培養細胞である場合培養液中の培養細胞を２０００ｇ、５分間、４℃で遠心
分離し、上清を除去し、沈渣として回収する。細胞数と
しては１０⁵−１０⁷が適当である。

【００４７】細胞を０．２ｍｌの生理食塩水に再分散さ
せ、０．４ｍｌのＲＣＬＢを添加し、穏やかに撹拌し、
２０００ｇ、５分間、４℃で遠心分離する。上清を除去
し、沈渣を回収する。この操作をもう一度繰り返し、同
様に沈渣を回収する。

【００４８】ｃ．対象が組織である場合組織切片を液体窒素などで凍結、破砕し、使用組織量に
応じてＲＣＬＢを添加し、穏やかに撹拌した後、２００
０ｇ、５分間、４℃で遠心分離する。上清を除去し、沈
渣を回収する。この操作をもう一度繰り返し、同様に沈
渣を回収する。

【００４９】（２）デキストランを用いる方法（対象：血液）血液使用容量１に対して生理食塩水（０．９％（Ｗ／
Ｖ）塩化ナトリウム水溶液、要滅菌）を１、さらに６％
（Ｗ／Ｖ）デキストランを含む生理食塩水を０．４添加
し、穏やかに混和し、３０分間室温に放置する。この液
は２層に分離するので、上清を回収し、５００ｇで１０
分間遠心分離し、上清を除去し、沈渣を回収する。

【００５０】この沈渣を使用血液量と等容量の生理食塩
水で洗い、同様に遠心分離して沈渣を回収する。なお、
この段階では生理食塩水の代わりにＲＣＬＢを用いても
さしつかえない。この操作は２回行う。

【００５１】（３）バッフィーコートを取る方法（対象：血液）抗凝固剤入りの血液を５００ｘｇ、５分間遠心分離し、
バッフィーコートを分取する。これにＲＣＬＢを使用血
液量と等容量添加し、穏やかに撹拌し、同様に遠心分離
し、沈渣を回収する。この操作をもう一度行い、同様に
沈渣を回収する。

【００５２】（４）大腸菌からのプラスミドＤＮＡの抽出大腸菌の含まれている培養液を１．５ｍｌチューブに取
り、８０００ｇ、２分間、４℃で遠心分離し、上清を除
去し、大腸菌を沈渣として回収する。これを１００μｌ
の２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍ
Ｍグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡを添加し再懸濁す
る。これに２００μｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム、
１％ＳＤＳを添加し、穏やかに混合後、５分間氷中に放
置する。８０００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、上
清を回収する。次いで、５μｌのリボヌクレアーゼ溶液
（１ｍｇ／ｍｌ）を加え混合し、３７℃で３０分間イン
キュベートする。

【００５３】実施例２．ＤＮＡの遊離（タンパク質成分
などの変性、可溶化）タンパク質溶解剤として以下の組成の水溶液からなる試
薬を調製した：４Ｍグアニジン塩酸０．２Ｍ２−メルカプトエタノール０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩実施例１で単離した細胞、核などに上記タンパク質溶解
剤を添加し、穏やかに撹拌し沈渣を溶かしこむ。プラス
ミドおよび血清中のウイルスの場合には抽出液に上記タ
ンパク質溶解剤を添加して混合する。

【００５４】加えるタンパク質溶解剤の量は、対象が血
液である場合は、単離方法の如何にかかわらず、出発血
液量に依存させる。組織が対象の場合は組織の種類によ
り使用量が異なる。プラスミドＤＮＡの場合は上記の方
法では０．５−１ｍｌを使用する。以下の表１に使用す
るタンパク質溶解剤の使用量を示す。

【００５５】表１次いで５５℃で３０分間インキュベートする。インキュ
ベート後室温になるまで放置し、添加したタンパク質溶
解剤と等容量のイソプロパノールを添加し、穏やかに撹
拌し、ＤＮＡを析出沈殿させる。上清を除去し、析出し
たＤＮＡを１ｍｌの７０％エタノールで２回洗浄し、上
清を除去した後に５分間真空乾燥し、抽出ＤＮＡを得
る。得られたＤＮＡを適当量のＴＥ溶液に再溶解する。

【００５６】実施例３．ヒト血液より抽出したＤＮＡの量および性状健常人の血液（検体Ｎｏ．１−１８）から実施例２の方
法によって抽出したＤＮＡの抽出量を、抽出ＤＮＡの検
定（１）抽出量の項で記載した方法により算出した。ま
た、同じく抽出ＤＮＡの検定（２）純度の決定の項で記
載した方法により、Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀によってタンパク質の
混入を、またＡ₂₃₄／Ａ₂₆₀によって多糖類の混入を測定
して、抽出ＤＮＡの純度を検定した。

【００５７】前処理の違いおよび抽出法の違いによる差
も明らかにするため、以下に記載した各種の方法による
抽出結果を表２に示す。なお、表中の略号は次の意味を
有する：Ｒ：ＲＣＬＢを用いる方法Ｄ：デキストランを用いる方法Ｂ：バッフィーコートを用いる方法（当法ではバッフィ
ーコート部分を厳密に分取している）Ｐ：バッフィーコートを回収した後にフェノール−クロ
ロフルムを用いた従来の方法表２検体使用前処理 A₂₆₀/A₂₈₀ A₂₃₄/A₂₆₀ 抽出量抽出量 No. 血液量抽出法 (μｇ) (μｇ/血液ml) １ 5ml Ｒ 1.865 0.453 124.4 24.9 ２ 5ml Ｒ 1.822 0.472 246.6 49.3 ３ 3ml Ｒ 1.861 0.429 105.8 35.3 ４ 3ml Ｒ 1.838 0.436 84.8 28.3 ５ 1ml Ｒ 1.868 0.439 37.4 37.4 ６ 1ml Ｒ 1.957 0.414 33.3 33.3 ７ 0.5ml Ｒ 1.695 0.429 14.1 28.2 ８ 0.5ml Ｒ 1.702 0.480 12.7 25.5 ９ 0.3ml Ｒ 1.841 0.376 9.72 32.4 １０ 0.3ml Ｒ 1.835 0.369 10.3 34.3 １１ 0.1ml Ｒ 1.908 0.336 3.00 30.0 １２ 0.1ml Ｒ 1.783 0.250 2.59 25.9 １３ 1ml Ｄ 1.913 0.491 23.1 23.1 １４ 1ml Ｄ 1.872 0.617 36.3 36.3 １５ 1ml Ｂ 1.801 -- 6.8 6.8 １６ 1ml Ｂ 1.922 -- 2.6 2.6 １７ 2ml Ｐ 1.887 0.440 80.8 40.4 １８ 6ml Ｐ 1.847 0.445 54.7 9.1 表から明らかなように、本発明によって得られたＤＮＡ
は抽出量、純度ともに従来法と同等か、あるいはそれよ
りも良好な結果を示した。

【００５８】実施例４．抽出ＤＮＡの分子量、各種混入
物の検定および制限酵素処理健常人の血液（２検体）から実施例２の方法で抽出した
ＤＮＡを用いて、各種緩衝液（Ｈ緩衝液、Ｍ緩衝液、Ｌ
緩衝液）とインキュベートし、次いでアガロースゲル電
気泳動に付した。得られた結果を図１に示す。図中、左
レーンは試験群を、右レーンはコントロール群（緩衝液
を加えるが、インキュベートしないもの）を表す。もし
も抽出ＤＮＡ中にヌクレアーゼが混入していれば、ＤＮ
Ａは自己分解し、断片が電気泳動上で出現するはずであ
る。図から明らかなように、試験群とコントロール群と
に差異がみられず（レーンＨ−１、２、レーンＭ−１、
２、レーンＬ−１、２）、本発明の方法で得られたＤＮ
Ａにヌクレアーゼが混入していないことを示す。

【００５９】さらに、同じ実験を制限酵素ＥｃｏＲＩを
加えて行ったところ、図１に示すように、試験群ではＤ
ＮＡが切断されてスメアとなった（レーンＥ−１、
２）。普通、サザンブロッティングを行うときには、制
限酵素で切断するが、もしもＤＮＡの精製が不十分でタ
ンパク質がこれに付着していると、制限酵素が作用しな
くなる。したがって、上記実験は本発明の方法で抽出し
たＤＮＡの精製が完全に行われたことを示す。

【００６０】次に、抽出ＤＮＡ中へのＲＮＡの混入を調
べるために、前記した純度の決定［ＲＮＡの混入］の項
に記載した方法によって、アガロースゲル電気泳動を行
ったところ、図１に示すように、試験群とコントロール
群とに差異が見られなかった（レーンＲ−１、２）。こ
れは本発明の方法による抽出ＤＮＡにＲＮＡが混入して
いないことを示す。

【００６１】実施例５．抽出ＤＮＡの増幅（ＰＣＲ法への応用）健常人の血液から実施例２の方法で抽出したＤＮＡを用
いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスII抗原ＤＲＢ１
をコードしているＤＮＡに特異的なプライマーを用いて
増幅、タイピングした（住友金属社製：スマイテストＨ
ＬＡ−ＤＲグループ判定キット使用）。アクリルアミド
電気泳動による結果を図２に示す。β−グロビンの増幅
バンドより下に観察されるバンドが、本タイピングによ
り増幅されたバンドである。

【００６２】ＰＣＲによるＤＮＡの増幅には通常厳密な
条件を必要とするが、図２から明らかなように、本発明
の方法によって抽出されたＤＮＡはＰＣＲの増幅にも使
用できる高純度のものである。これによって、移植の際
のＨＬＡの型の判定や診断への応用が可能である。

【００６３】実施例６．抽出ＤＮＡを用いたジェノミッ
クサザンハイブリダイゼーションへの応用本発明の方法により得たヒトゲノムからのＤＮＡを用い
てサザンハイブリダイゼーションを行った。抽出ＤＮＡ
を制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動し、
メンブランにブロッティング後ハイブリダイゼーション
を行ったた結果を図３に示す。このように本発明による
と、ジェノミックサザンハイブリダイゼーションに応用
できる長いＤＮＡを安定して得ることができる。

【００６４】

【発明の効果】本発明によって、フェノール−クロロホ
ルムを用いた方法、アルカリ変性を用いた方法、煮沸に
よる方法、タンパク質分解酵素を用いた方法などの従来
から使用されていたＤＮＡ抽出方法よりも短時間で容易
に、しかも安全、安価に高純度のＤＮＡを得ることがで
きる。また、本発明の方法によって抽出、精製されたＤ
ＮＡは、各種遺伝子工学の材料として十分に使用可能な
ものであり、その応用分野は極めて広い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法により抽出したＤＮＡの分子量、
各種混入物の検定および制限酵素処理の結果を示すアガ
ロースゲル電気泳動の図である。

【図２】本発明の方法により抽出したＤＮＡを用いてＰ
ＣＲ法により増幅した結果を示すアクリルアミド電気泳
動の図である。

【図３】本発明の方法により抽出したＤＮＡを用いてジ
ェノミックサザンハイブリダイゼーションを行った結果
を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤からなる生物試料からの
ＤＮＡ抽出試薬。
【請求項２】タンパク質変性剤がカオトロープ剤であ
り、還元剤がチオール系還元剤であり、界面活性剤が当
組成の水溶液中で沈殿を起こす恐れのないもの、もしく
は沈殿が生じても何らかの手段により再溶解が可能なも
のであり、キレート剤が二価の金属イオンをキレートし
うる能力を有するものである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】カオトロープ剤がグアニジン塩酸または
グアニジンチオシアン酸であり、チオール系還元剤が２
−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールであ
り、界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム
であり、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム二水塩である、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】以下の操作：ａ）生物試料より細胞または核を粗抽出する、ｂ）以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤を加えることにより、細
胞および核とその他の構成成分、混在物を変性、可溶化
する、そしてｃ）有機溶媒によるＤＮＡ抽出を行わず
に、そのまま低級アルコールを加えてアルコール沈殿を
行う、からなる生物試料からのＤＮＡの抽出方法。
【請求項５】上記タンパク質溶解剤を加えて撹拌した
後、５５℃前後で３０分間程度インキュベートを行う、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】以下の試薬：ａ）細胞溶解液、ｂ）以下の組成：（１）タンパク質変性剤および（２）還元剤、界面活性
剤およびキレート剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アル
カリ性であるタンパク質溶解剤、およびｃ）キレート剤と緩衝液との混在液からなる抽出したＤ
ＮＡを再溶解するための溶媒、を含む生物試料からＤＮ
Ａを抽出するためのキット。