JP2008104378A

JP2008104378A - 甲殻類病原性ウイルスの検出方法

Info

Publication number: JP2008104378A
Application number: JP2006288733A
Authority: JP
Inventors: Shin Nagai; 慎永井; Tadashi Yamamoto; 正山元
Original assignee: KANMONKAI KK; Kanmonkai Co Ltd
Current assignee: KANMONKAI KK; Kanmonkai Co Ltd
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2008-05-08

Abstract

【課題】甲殻類の病原性ウイルスを、微量でも短時間で検出できる検出方法、ならびに該検出方法に用いるプライマーセットおよびキットを提供すること。
【解決手段】病原性ウイルスに感染した甲殻類の体を破砕する工程、
前記甲殻類の破砕物、還元剤を含む細胞溶解液、Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズを混合し、該高分子ポリマービーズの表面上に病原性ウイルスのＤＮＡを吸着させる工程、前記高分子ポリマービーズから病原性ウイルスのＤＮＡを分離し、得られた病原性ウイルスのＤＮＡを、少なくとも６種のプライマーを用いるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法により増幅反応させる工程を有する甲殻類病原性ウイルスの検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、甲殻類病原性ウイルスの検出方法、該検出方法に用いるプライマーセット、およびキットに関する。

クルマエビ（Penaeus japonicus）、ウシエビ（Penaeus monodon）などのエビ類に代表される甲殻類は、日本において人気の食材として大きな需要があり、特にクルマエビの養殖は西日本を中心とする沿岸海域で盛んに行われている。このような養殖場内では甲殻類の健康状態を良好に保つことが必要であるが、感染症などの発生がしばしば問題となる。甲殻類における感染症の症状としては、例えば、罹病した個体の体色が変化したり、外骨格に白斑が見られたりして、商品価値が低下したり、最終的には死にいたる場合も知られている。このような養殖場内での感染症の発生を予防することは、海内で養殖を行っている場合、適当な感染予防剤も知られていないため、現実的には困難である。また、感染症が検出された場合、手遅れとなるケースがほとんどで、感染症が検出された養殖場は別の場所に移動して隔離した後、養殖している個体を全て廃棄することで、感染症が発生した養殖場周辺の他の養殖場への感染症の伝播を予防している。

しかしながら、感染から短時間で発症する感染症に対しては、検出後には、感染症が周辺の養殖場に蔓延し、廃棄する養殖場が拡大してしまう場合も少なくない。例えば、養殖しているエビ類の大量死を招く感染症として、クルマエビ類急性ウイルス血症（Penaeid acute viremia（以下、ＰＡＶと略す））が知られている。この感染症は、１９９３年に日本において初めて確認された感染症であるが、ピネイッド桿状ＤＮＡウイルス（Penaeid rod-shaped DNA virus（以下、ＰＲＤＶと略す）、ニマウィルス科ウィスポウィルス属）という病原性ウイルスにより媒介される。また、同様の病原性ウイルスとして、イエローヘッド病を引き起こすイエローヘッドウイルス(Yellowhead virus)が知られている。
これらの感染症の検出法としては、初めの頃は、衰弱エビの胃の上皮細胞を暗視野顕微鏡下で観察し、感染核を検出し確認する方法、血液または胃から調製したウイルス液をネガティブ染色し、電子顕微鏡でウイルス粒子を確認する方法が行われていた（非特許文献１）。しかし、前記の検出法は、発病末期の個体を対象とした診断法であり、感染初期の診断および不顕性感染個体には応用が困難であった。

そこで、病原性ウイルスをより高感度に検出する方法として、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを用いる方法（非特許文献２）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法（非特許文献３）を用いる方法などが検討されている。

ＬＡＭＰ法は、簡易、迅速にＤＮＡなどの核酸を増幅する技術で、例えば、特許文献１などに報告されている。これは１対のインナープライマーと１対のアウタープライマーを併せた計４種のプライマーと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを使って、通常、１０〜６０分程度で鋳型となる核酸を増幅する方法である。この方法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）と異なり、変性工程を含めた全工程を等温、短時間で行うことができる。

これらの方法は、ウイルスゲノムＤＮＡの検出限界が１０ｆｇ程度と微量であるため、感染初期の個体でも検出できるという利点がある。しかしながら、検出作業は養殖場から離れた場所で行う必要があり、また、検出結果が出るまで３時間程度必要であったため、検出後には感染症が検出された養殖場だけでなく、周辺の養殖場まで汚染が拡大しているケースが多かった。
特許第３３１３３５８号公報Ｍｏｍｏｙａｍａ，Ｋ．ら，ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌ．，30，263−269(1995) Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．ら，ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌ．，31(2)，93-98(1996) Ｔｏｍｏｙａ，Ｋ．ら，Ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．１１５，５９−６５(２００３)

そこで、本発明者らは、検出限界が低く、かつ短時間でウイルス感染の有無を検出できる方法を開発すれば、前記のように感染症が検出された場合、その影響を最小限に抑えることが可能になると考え、鋭意検討した結果、ＤＮＡの抽出手段としてＤＮＡの抽出に特定の成分を混合した高分子ポリマービーズを用い、次いで検出手段としてLＡＭＰ法を組み合わせて用いることで、検出限界を顕著に低減させ、しかも短時間での検出を可能にできることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の目的は、甲殻類の病原性ウイルスを、微量でも短時間で検出できる検出方法、ならびに該検出方法に用いるプライマーセットおよびキットを提供することにある。

本発明の要旨は、
〔１〕病原性ウイルスに感染した甲殻類の体を破砕する工程、
前記甲殻類の破砕物、還元剤を含む細胞溶解液、Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズを混合し、該高分子ポリマービーズの表面上に病原性ウイルスのＤＮＡを吸着させる工程、
前記高分子ポリマービーズから病原性ウイルスのＤＮＡを分離し、得られた病原性ウイルスのＤＮＡを、少なくとも６種のプライマーを用いるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法により増幅反応させる工程
を有する甲殻類病原性ウイルスの検出方法、
〔２〕前記還元剤がβ−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトール（ＤＤＴ）からなる群より選ばれた１種以上である前記〔１〕記載の検出方法、
〔３〕前記細胞溶解液が細胞膜を溶解させるための酵素および界面活性剤を含有する前記〔１〕又は〔２〕記載の検出方法、
〔４〕細胞溶解液中の界面活性剤の含有量が５〜１８重量％である前記〔３〕記載の検出方法、
〔５〕甲殻類病原性ウイルスがピネイッド桿状ＤＮＡウイルスまたはイエローヘッドウイルスである前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の検出方法、
〔６〕前記ＬＡＭＰ法に用いるプライマーが、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種を有するプライマーセット、または配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種を有するプライマーセットである前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の検出方法、
〔７〕ピネイッド桿状ＤＮＡウイルスに対する甲殻類の感染症発症の可能性を判定するために用いるプライマーセットであって、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット、
〔８〕イエローヘッドウイルスに対する甲殻類の感染症発症の可能性を判定するために用いるプライマーセットであって、配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット、
〔９〕前記〔７〕または〔８〕に記載のプライマーセットを含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用キット
関する。

本発明の検出方法を用いることで、甲殻類の病原性ウイルスを、微量でも短時間で検出できるため、極めて初期の感染段階でも検出可能であり、また、対応する時間を十分に得ることができ、発生する経済的損失を最小限に抑えることができるという効果が奏される。
例えば、本発明の検出方法を用いることで、病原性ウイルスとしてＰＲＤＶがエビ養殖池で検出された場合、対処方法としては、養殖場内のエビを水で洗い、遠隔隔離することで、周辺の養殖場への感染症の伝播を防ぐだけでなく、感染が確認された養殖池内のエビの全廃も防ぐことが可能となる。

本発明の検出方法では、まず、病原性ウイルスに感染した甲殻類の体を破砕する工程を有する。本工程は、甲殻類に感染した病原性ウイルスを甲殻類の体から分離し易くする工程である。

本発明に用いられる甲殻類としては、養殖可能なものであればよく、例えば、クルマエビ（Penaeus japonicus）、ウシエビ（Penaeus monodon）などのエビ類が挙げられる。以降、これらのエビ類に対する検出方法について本発明を詳細に説明するが、他のエビ類やカニ類についても適用可能であることはいうまでもない。

本発明において病原性ウイルスとは甲殻類に感染して疾患を引き起こすウイルスをいい、例えば、甲殻類がエビ類の場合、その代表例としてピネイッド桿状（Penaeid rod-shaped）ＤＮＡウイルス（ＰＲＤＶ）（ニマウィルス科ウィスポウィルス属）、イエローヘッドウイルス（Yellowhead Virus）などが挙げられる。

本工程では、例えば、前記病原性ウイルスへの感染が疑われる甲殻類を養殖場などから採取して、この甲殻類の体を破砕する。なお、定期的に検査する場合には、養殖場内の甲殻類を適当に選択すればよい。破砕方法としては、例えば、頭と胴体の部分を手で切断し、頭や心臓の部分をホモジナイザー等で物理的に粉砕する方法などが挙げられるが特に限定はない。また、破砕条件としては、例えば、生理食塩水などの溶媒中で常温下で破砕すればよい。

続いて、本発明では、前記のようにして得られた甲殻類の破砕物を、還元剤を含む細胞溶解液、Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズと混合し、該高分子ポリマービーズの表面上に病原性ウイルスのＤＮＡを吸着（付着）させる工程を有する。本工程は、破砕物中の病原性ウイルスのＤＮＡを前記高分子ポリマービーズの表面に吸着させることで病原性ウイルスのＤＮＡを分離抽出する工程である。

本発明においては、前記還元剤を含む細胞溶解液、Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズを併用することに一つの大きな特徴があり、かかる特徴を有することで甲殻類の病原性ウイルスのＤＮＡの損傷を防ぎながら、前記高分子ポリマービーズ表面への吸着率を顕著に高めることができる。

当該分野では、甲殻類の病原性ウイルスの検出にはフェノール法が一般的に用いられている。しかしながら、本発明者らが鋭意検討したところ、前記フェノール法では甲殻類の病原性ウイルスのＤＮＡは損傷し易く、結果としてその検出限界を高める原因の一つになっていることを初めて見出した。そこで、かかる問題を解決する手段として、本発明では、上記の成分を用いた方法（以下、ビーズ法ともいう）を用いることで、前記病原性ウイルスのＤＮＡの損傷を防ぎながら該ＤＮＡの抽出を効率よく行うことを可能にしている。
ここで、甲殻類の病原性ウイルスのＤＮＡがフェノール法で損傷し易い理由については、明確ではないが、前記病原性ウイルスのＤＮＡは、他の生物由来のＤＮＡに比べて、フェノールにより物理的に切断され易いことが考えられる。そのため、フェノール法を用いると、実質的に標的となる病原性ウイルスのＤＮＡの含有量が低くなるため、ＰＣＲなどで処理しても増幅し難いことが考えられる。これに対して、本発明で用いるビーズ法ではフェノールを用いていないため、ＤＮＡの損傷を抑えることができると考えられる。したがって、本発明ではサンプリングするエビなどの甲殻類の量が少なくても病原性ウイルスの検出が可能になる。

前記還元剤としては、β−メルカプトエタノールおよび／またはジチオスレイトール（ＤＤＴ）が好ましい。

また、前記細胞溶解液としては、細胞膜を溶解させるための酵素および界面活性剤を含有する溶液が好ましい。

細胞膜を溶解させるための酵素としては、プロテインキナーゼＫなどが挙げられる。前記界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ１０、Ｔｗｅｅｎ２０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、が挙げられ、中でもＤＮＡの回収率が向上する観点から、Ｔｗｅｅｎ１０、ＳＤＳが好ましい。

病原性ウイルスのＤＮＡの損傷を防ぎながら細胞膜を溶解し易い観点から、細胞溶解液中の前記界面活性剤の含有量としては、５〜１８重量％であることが好ましい。また、細胞溶解液中の前記酵素の量としては、特に限定はないが、例えば、プロテインキナーゼＫの場合では３５０〜６００ｕｎｉｔ／ｍＬが好ましい。

また、前記細胞溶解液は、病原性ウイルスのＤＮＡの回収率が向上する観点から、尿素を含有することが好ましい。細胞溶解液中の尿素の量としては、５〜８Ｍであることがより好ましい。

前記細胞溶解液は、前記各成分を混合することで調製することができる。例えば、キアゲン社製品の「Ｄｎｅａｓｙｔｉｓｓｕｅｋｉｔ」などの市販の細胞溶解液に還元剤、所望により界面活性剤、尿素などを添加することで調製してもよい。

前記Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズとは、高分子ポリマーからなるビーズであって、Ｍｇ（マグネシウム）を表面またはビーズ中に存在させたものである。高分子ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、シリカゲルポリマーなどが挙げられる。前記高分子ポリマービーズの形態としては、球状、楕円状など、ビーズとして使用できるものであればよい。また、大きさとしてもＤＮＡを吸着したり、後述のように溶出できれるものであればよく、特に限定はない。好適に用いられる前記高分子ポリマービーズとしては、「MagaZorb」（Cortex Biochem社製）などが挙げられる。

本工程において混合される甲殻類の破砕物、還元剤を含む細胞溶解液、Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズとの比率については、破砕物１００重量部に対して、還元剤１２５０〜３７５０重量部、細胞溶解液２５０〜３４０重量部が好ましい。また、破砕物と細胞溶解液とを混合した後は、約５５℃で10分間程度静置することで病原性ウイルスのＤＮＡを抽出し易くなる。

また、本工程において前記破砕物を前記細胞溶解液や高分子ポリマービーズと混合する順番としては特に限定はないが、効率よくＤＮＡの吸着を行うことができる観点から、前記破砕物を、還元剤を含む細胞溶解液と混合した後、その上清１００重量部に対してＭｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズを１０〜１７．５重量部の比率で混合することが好ましい。

なお、吸着させるＤＮＡとして、病原性ウイルス以外にも破砕した甲殻類や他のウイルスさらには破砕時に混入する他の生物由来のタンパク質、糖質も吸着する可能性がある。
本発明ではこのような病原性ウイルスに由来しないタンパク質、糖質の吸着量を低減する観点から、前記混合物中にエタノールなどの他の成分を添加することが好ましい。エタノールなどの添加量としては、前記混合物１００重量部に対して６５〜８０重量部が好ましい。

次いで、本発明の検出方法は、前記高分子ポリマービーズから病原性ウイルスのＤＮＡを分離し、得られた病原性ウイルスのＤＮＡを、少なくとも６種のプライマーを用いるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法により増幅反応させる工程を有する。本工程により、病原性ウイルスのＤＮＡを効率的に増幅することができる。本発明では、前記のビーズ法を用いた病原性ウイルスのＤＮＡの抽出工程と本工程とを組み合わせることで、従来法に比べて検出限界を顕著に低減することが可能となる。

前記高分子ポリマービーズから吸着したＤＮＡを分離する方法について、前記混合物中から高分子ポリマービーズを遠心分離、または、磁石にて回収した後に、高分子ポリマービーズをエタノ−ルを含んだ溶液などにより洗浄し、これを滅菌水、エタノールを含んだ溶液などのＤＮＡ分離用溶液に浸漬することで該溶液中にＤＮＡを分離することができる。

前記のようにして得られたＤＮＡをＬＡＭＰ法に供することにより、指標となる甲殻類の病原性ウイルスのＤＮＡを増幅させることができる。ＬＡＭＰ法は、ＤＮＡ増幅法の一種であり、等温、短時間で所望のＤＮＡ断片の増幅が可能であるという利点がある。ＬＡＭＰ法を用いた判定では、増幅処理されたＤＮＡを電気泳動し、ラダー状のバンドが見られた場合に病原性ウイルスが存在すると判定することができる。

また、ＬＡＭＰ法では標的核酸について、３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側でＢ１、Ｂ２、Ｂ３という領域を規定し、この６領域に対し、次の通り設計した４種類のプライマーを用いるのが一般的である。
（１）ＦＩＰ：標的核酸のＦ2ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計したプライマー
（２）Ｆ３プライマー：標的核酸のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域を持つように設計したプライマー
（３）ＢＩＰ：標的核酸のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計したプライマー
（４）Ｂ３プライマー：標的核酸のＢ3ｃ領域と相補的なＢ３領域を持つように設計したプライマー

これに対して、本発明では、上記のように少なくとも６種のプライマーを用いることで、より迅速に高感度でウィルスの存在を検出できるという利点がある。例えば、プライマーが4種類の場合、６種類のプライマーを用いた場合に比べて、検出時間が長くなり、かつＤＮＡの検出限界も数十ｆ（フェムト：１０^-15）ｇ程度である。

本発明で用いるプライマーは、１対のインナープライマー、１対のアウタープライマー、および１対のループプライマーを加えた少なくとも計６種のプライマーからなるものであればよい。

インナープライマーとはＦＩＰ（forward inner primer）とＢＩＰ（back inner primer）とを示す。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示す。ループプライマーはＬＦ（loop forward）プライマーとＬＢ（loop back）プライマーを示し、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅反応を促進する。ＬＦプライマーはＦ２領域に相補的なＦ２ｃ領域とＦ１ｃ領域の間の配列に相補的な配列、ＬＢプライマーはＢ２領域に相補的なＢ2ｃ領域とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。

なお、前記Ｆ１ｃ、Ｆ２、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｆ２ｃ、Ｂ２ｃなどの配列は、ＬＡＭＰ法におけるプライマーを設計するための任意配列であり、標的配列に基づいて適宜設定される。

前記インナープライマー、アウタープライマー、およびループプライマーの設計方法は、前記特許文献１などに記載され、またＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトウェア（栄研化学株式会社、富士通株式会社、株式会社富士通システムソリューションズ提供の「ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ２、Ｖ３」など）を用いてもよい。特記のない限り、プライマーセットには栄研化学株式会社より推奨されているＴｍ値（ＧＣ含量：４０〜６５％）より候補を絞り、さらに二次構造をとらないおよびプライマーダイマーを形成しないプライマーを選択した後、その候補の中からプライマー領域の末端安定性が高いものを選択することが好ましい。また、プライマーの調製は、例えば、公知の化学合成方によって行うことができる。

本発明において、ＬＡＭＰ法に用いる６種のプライマーは、病原性ウイルスに応じて適宜選択すればよい。例えば、ＰＲＤＶについては、前記ＬＡＭＰ法に用いる６種の塩基配列が、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセットを用いることで、効率的に病原性ウイルスのＤＮＡを検出することができる。また、イエローヘッドウイルスについては、配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセットを用いることで効率的に病原性ウイルスのＤＮＡを検出することができる。

前記ＰＲＤＶ用のプライマーセットの詳細は以下のとおり。
（インナープライマー）ＦＩＰ配列番号：５〜８、ＢＩＰ配列番号：９〜１２
（アウタープライマー）Ｆ３プライマー配列番号：１、Ｂ３プライマー配列番号：２
（ループプライマー）ＬＦプライマー配列番号：３、ＬＢプライマー配列番号：４
標的核酸配列：ＡＦ３６９０２９遺伝子の特定領域（1333-1543, 210ｂｐ）

また、前記イエローヘッドウイルス用のプライマーセットの詳細は以下のとおり。
（インナープライマー）ＦＩＰ配列番号：１７〜２０、ＢＩＰ配列番号：２１〜２４
（アウタープライマー）Ｆ３プライマー配列番号：1３、Ｂ３プライマー配列番号：１４
（ループプライマー）ＬＦプライマー配列番号：１５、ＬＢプライマー配列番号：１６
標的核酸配列：ＡＦ５４０６４４遺伝子の特定領域（712-929, 217ｂｐ）

なお、上記の方法により病原性ウイルスのＤＮＡが検出されると、サンプルとなった甲殻類の個体は感染症を発症しており、かつ該個体が養殖されている養殖池中の他の個体も感染症を発症する可能性があると判定される。

したがって、本発明は、
ピネイッド桿状ＤＮＡウイルス（ＰＲＤＶ）に対する甲殻類の感染症発症の可能性を判定するために用いるプライマーセットであって、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット；
イエローヘッドウイルスに対する甲殻類の感染症発症の可能性を判定するために用いるプライマーセットであって、配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット
に関する。

なお、配列番号：５〜８で示される塩基配列のうちいずれを選ぶかは処理する甲殻類の種類に応じて検出し易いものを適宜選択すればよい。配列番号：９〜１２で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列からそれぞれ１種づつ選択する場合も同様である。

また、前記プライマーセットは、該プライマーセットを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用キット、好ましくはＬＡＭＰ法によってＰＲＤＶまたはイエローヘッドウイルスの同定を行うためのキットとして用いてもよい。該キットは、前記プライマーセットを含むのであれば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄATP、dCTP、dTTP、dGTPの各溶液、バッファーなどの他の成分を含有してもよく、キットの形態としても特に限定はない。

前記ＬＡＭＰ法において増幅反応時の温度条件としては６０〜６５℃が好ましく、６４℃付近がより好ましい。増幅時間については特に限定はないが、例えば１５〜６０分間程度であればよい。

また、ＬＡＭＰには栄研化学株式会社製「Loopamp DNA増幅キット」などを用い、添付のマニュアルに従い、前記プライマーを使用することで病原性ウイルスの指標となるＤＮＡ断片を増幅させることができる。

増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動法、蛍光ラベル法などを用いて前記病原性ウイルスに特有の指標と比較することで、病原性ウイルスの存在の有無を確認することができる。なお、前記指標や確認に用いる各手法については、特に限定はないが、船上で確認する場合には、電気泳動法が好ましい。

以上のようにして病原性ウイルスを甲殻類から検出することができる。
また、本発明の検出方法は、微量の病原性ウイルスのＤＮＡでも検出できるため、検出に用いる被検体は少量でよく、養殖現場付近の船上で検出作業を行うことも可能である。
例えば、前記還元剤を含む細胞溶解液を予め入れておいた容器（エッペンドルフチューブなど）に、前記のようにして破砕したエビなどの被検体の一部を入れ、所定の時間静置したのち、遠心分離などして上清を取り出し、次いでＭｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズと混合してＤＮＡをビーズ表面に吸着させる。洗浄後、ＤＮＡ分離液などを添加してＤＮＡを溶出する。ついで、その分離液を取り出し、前記の少なくとも６種のプライマーを用いたLAMP法にてＤＮＡの増幅を行い、蛍光ラベルにてウィルスの存在の有無を確認することができる。また、ウイルスの存在の確認は、マーカーと共に前記分離液を電気泳動して確認することもできる。

また、本発明の検出方法を用いることで、クルマエビ類急性ウイルス血症又はイエローヘッド病を検出するためのシステムを構築することもできる。
このシステムは、例えば、
還元剤を含む細胞溶解液およびＭｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズ
を含むＤＮＡ抽出キットを用いてクルマエビの体の破砕物からピネイッド桿状ＤＮＡまたはイエローヘッドウイルス由来のDNAを抽出する工程、
次いで、得られた前記ピネイッド桿状ＤＮＡウイルスまたはイエローヘッドウイルス由来のＤＮＡを、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット、または配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法により増幅させる工程を含む。なお、各工程に用いる薬剤、プライマーなどは前記と同じものであればよい。

本発明の検出方法は、従来法の検出限界が数十ｆ（フェムト：１０^-15）ｇ程度であったのに比べて、さらに２オーダー程度低い、数百ａ（アト：１０^-18）ｇ程度のＤＮＡの検出が可能になる。また簡便に検出できるため、養殖場において感染が疑わしい個体を定時的にサンプリングして検査をすることで、病原性ウイルスへの感染を早期発見することが可能になる。したがって、早期発見に伴ない処置時間が従来に比べて格段に長くなることで、感染の拡散を最小限で防ぎ、感染した個体に対しては隔離したのち処置を施すことで感染症からの回復も行うことができるなど、効率的な感染対策を行うことができ、感染症による養殖業者の経済的損失を顕著に軽減することが可能となる。

（感染エビの作製方法）
ＰＲＤＶに感染したクルマエビ（１０ｇ）は、養殖場から購入したクルマエビをＰＲＤＶを含む感染液に２時間ほど浸漬させることで得た。なお、感染液は、これまでにＰＲＤＶに感染したクルマエビをすり潰し、水を２０倍容入れたものとした。また、イエローヘッドウイルスに感染したクルマエビ（１０ｇ）も上記同様の処理方法にて得た。

（実施例１）
ＰＲＤＶに感染したクルマエビの心臓を摘出し、生理食塩水を用いて磨り潰して粉砕液とした。
還元剤（ジチオスレイトール）2.5ｍｇを加えた細胞溶解液（組成：プロテインキナーゼＫ４００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ１０１０重量％、１ＭＮａＣｌ）５００μｌに粉砕液の上清２００μＬを入れ、５５℃に１０分間加温した。Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズ（Cortex Biochem社製「MagaZorb」）２０μＬを容器（容量：１．５ｍＬ）に中で混合した。

次いで、前記容器を磁石にて高分子ポリマービーズを沈殿させ、これを取り出して、別の容器（容量1.5ｍＬ）に入れた。次いで、ビ−スをエタノールを含む溶液にて洗浄し、抽出液（超純水）にてDNAを抽出した。得られた上清液を取り出し、抽出液を用いて倍倍希釈し2μL中に1ng、100fg、10fg、1fg、100ag、10agの濃度を有する各希釈液を得てそれぞれＬＡＭＰ用試薬（栄研化学株式会社製「Loopamp DNA増幅キット」）に供した。プライマーとしては配列番号：１〜４、５、１０からなる６種のプライマーセットを用いて、各プライマーを希釈液中にそれぞれ添加した。ついで、添付のマニュアルに従い、反応温度約６４℃でＬＡＭＰを開始し、２０分経過した時点で反応を終了した。なお、前記ＤＮＡの量は, リアルタイムPCRにて定量した。このときの標準試料は、ＰＲＤＶの特異的な遺伝子をベクタ−に導入したものとし、吸光度とリアルタイムＰＣＲより、定量した。

得られた電気泳動用のゲル（ゲル組成：1％アガロースゲル、展開液：ＴＡＥ）上に乗せ、マーカー（ニッポンジーン製、商品名:「DNA NW Marker5」）とともに３０分間電気泳動した。得られたゲルを染色液（エチジウムブロマイド溶液）に浸漬し、発色させたバンドの位置をマーカーのものと比較して、病原性ウイルスの検出限界を調べた。その結果を図１(ａ)に示す。また、栄研化学株式会社等から発売されているＤＮＡ増幅時に発光する蛍光色素を入れることで瞬時にウイルスの検出が可能となる。

（比較例１）
抽出方法としてビーズ法のかわりにフェノール法を用いた。具体的には、フェノール50％、チオシアン酸ナトリウム5％を含む溶出液中に磨り潰した個体の一部を入れる以外は、実施例１と同じ操作を行い、電気泳動により病原性ウイルスの検出限界を調べた。その結果を図１（ｂ）に示す。

図１（ａ）の結果から、実施例１で行われた方法では１００ａｇのＤＮＡ濃度を示す第５レーンまでバンドが見られるのに対し、図１（ｂ）の結果では１０ｆｇ程度のＤＮＡ濃度を示す第５レーンしかバンドが見られない。したがって、実施例１の検出方法は比較例１の方法に比べて、１００倍程度、検出限界値が低いことがわかる。

（実施例２）
被検体として、イエローヘッドウイルスに感染したクルマエビを用い、ＬＡＭＰ法のプライマーとして配列番号：１３〜１６、１７、２２に示される６種のプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にして病原性ウイルスの検出限界を調べた。その結果を図２に示す。

（比較例２）
被検体として、イエローヘッドウイルスに感染したクルマエビを用い、ＬＡＭＰ法のプライマーとして配列番号：１３〜１６、１７、２２に示される６種のプライマーセットを用いた以外は比較例１と同様にして病原性ウイルスの検出限界を調べた。

図２の結果から、実施例２で行われた方法では１００ａｇのＤＮＡ濃度を示す第2レーンまでバンドが見られるのに対し、フェノール抽出法の結果では１０ｆｇ程度のＤＮＡ濃度を示す第９レーン以降のバンドが見られない。したがって、実施例２の方法は比較例２の方法に比べて、１００倍程度、検出限界値が低いことがわかる。

（実施例３）
細胞溶解液中の界面活性剤の含有量を１〜３０重量％の間で変化させた以外は実施例１と同様に病原性ウイルスの検出を行った。界面活性剤の含有量が５重量％未満の場合、細胞が粉砕されにくく、ＤＮＡの抽出が困難であった。また、界面活性剤の含有量は１８重量％を越えると酵素活性阻害を起こすため、ＤＮＡ抽出効果が低減した。したがって、界面活性剤の含有量は５〜１８重量％とすることでＤＮＡの抽出を好適に行うことができることがわかる。

（比較例３）
ＬＡＭＰ法のプライマーとして配列番号：１、２、７、１１からなる４種のプライマーセットを用いた以外は実施例1と同様にして病原性ウイルスの検出を行ったところ、その検出限界は約１０ｆｇであった。したがって、６種のプライマーを用いた方が４種のプライマーを用いた場合に比べて、１００倍程度検出限界が低いことがわかる。

図１（ａ）は実施例１および図１（ｂ）は比較例１で得られた電気泳動の結果をそれぞれ示す概略図である。図の上の数字はレーン番号を示す。図１（ａ）において、第１レーン：マーカー、第２レーン：空白，第３レーン：１０ｆｇ、第４レーン：１ｆｇ、第５レーン：１００ａｇ、第６レーン：１０ａｇを示す。また、図１（ｂ）において第１レーン：マーカー、第２レーン：空白、第３レーン：１００ａｇ、第４レーン：１ｆｇ、第５レーン：１０ｆｇ、第６レーン：１００ｆｇの結果を示す。図２は実施例２および比較例２で得られた電気泳動の結果を示す概略図である。第２〜４レーンはビーズ法、第７〜１０レーンはフェノール法を用いた結果を示す。第１レーン：マーカー、第２レーン：１００ａｇ、第３レーン：１ｆｇ、第４レーン：１０ｆｇ、第５レーン：空白、第６レーン：マーカー、第７レーン：１００ａｇ、第８レーン：１ｆｇ、第９レーン：１０ｆｇ、第１０レーン：１００ｆｇの結果を示す。

Claims

病原性ウイルスに感染した甲殻類の体を破砕する工程、
前記甲殻類の破砕物、還元剤を含む細胞溶解液、Ｍｇ原子が表面上に存在する高分子ポリマービーズを混合し、該高分子ポリマービーズの表面上に病原性ウイルスのＤＮＡを吸着させる工程、
前記高分子ポリマービーズから病原性ウイルスのＤＮＡを分離し、得られた病原性ウイルスのＤＮＡを、少なくとも６種のプライマーを用いるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法により増幅反応させる工程
を有する甲殻類病原性ウイルスの検出方法。
前記還元剤がβ−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトール（ＤＤＴ）からなる群より選ばれた１種以上である請求項１記載の検出方法。
前記細胞溶解液が細胞膜を溶解させるための酵素および界面活性剤を含有する請求項１又は２記載の検出方法。
細胞溶解液中の界面活性剤の含有量が５〜１８重量％である請求項３記載の検出方法。
甲殻類病原性ウイルスがピネイッド桿状ＤＮＡウイルスまたはイエローヘッドウイルスである請求項１〜４いずれか記載の検出方法。
前記ＬＡＭＰ法に用いるプライマーが、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種を有するプライマーセット、または配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種を有するプライマーセットである請求項１〜５いずれか記載の検出方法。
ピネイッド桿状ＤＮＡウイルスに対する甲殻類の感染症発症の可能性を判定するために用いるプライマーセットであって、配列番号：１〜４で示される塩基配列、配列番号：５〜８で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：９〜１２で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット。
イエローヘッドウイルスに対する甲殻類の感染症発症の可能性を判定するために用いるプライマーセットであって、配列番号：１３〜１６で示される塩基配列、配列番号：１７〜２０で示される塩基配列のいずれか１種、および配列番号：２１〜２４で示される塩基配列のいずれか１種からなるプライマーセット。
請求項７または８に記載のプライマーセットを含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用キット。