JPH06239895A

JPH06239895A - ブタｇｒｆレセプター

Info

Publication number: JPH06239895A
Application number: JP5323834A
Authority: JP
Inventors: Hansen Maxwell Hsiung; ハンセン・マックスウェル・シュン; Dennis Paul Smith; デニス・ポール・スミス; Xing-Yue Zhang; シン−ユー・ツァン
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1994-08-30
Also published as: CA2112018A1; EP0604224A1

Abstract

(57)【要約】【目的】ブタＧＲＦレセプタータンパク質に関する。【構成】ｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮＡ化合
物、該ＤＮＡの配列を含有する組換えＤＮＡクローニン
グ及び発現ベクター、並びに該ベクターを含有する組換
え宿主細胞を提供する。また、ｐＧＲＦレセプターを使
用する検定系を提供する。さらに、該ＤＮＡ配列をプロ
ーブとして用いる、他の種由来のＧＲＦレセプター及び
その対応ＤＮＡ配列を単離し特性化するための方法に関
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ペプチドホルモンは、脳から直接又は間接
的に感知される生理学的条件に応答して標的器官を刺激
する、標的組織に対するメッセンジャーとして機能す
る。内生的に産生されるペプチドホルモンの量、安定性
又は活性の異常が原因である種々の疾患が知られてい
る。これらの疾患の中にはホルモン補充による処置を受
けるべきタイプのものがある。成長ホルモン（ＧＨ）の
循環レベルを人工的に増大させるとＧＨ欠損障害の処置
のみならず、哺乳動物における補給性を増大させる方法
としても有効であることが周知である。天然起源から伝
統的に単離されるペプチドホルモン、及び最近になって
組換えＤＮＡ技法によって生産されるペプチドホルモン
は種々の疾患を処置するものとして商業的に入手可能で
ある。

【０００２】成長ホルモン（ＧＨ）の循環レベルを人工
的に増大させるとＧＨ欠損障害の処置のみならず、哺乳
動物における補給性を増大させる方法としても有効であ
ることが周知である。ペプチドホルモンの作用機序及び
それに対応する可能性ある治療は、その作用を媒介する
複雑なカスケードと分離することができない。合成及び
異化作用間の平衡、活性化及び抑制間の平衡又はエネル
ギー使用及び貯蔵間の平衡、の維持によって生物は環境
ストレスに適応できているが、その維持は一旦刺激が取
り除かれれば基底状態に戻る。

【０００３】循環系における成長ホルモンの制御レベル
を調節することによって、そのＧＨレベルを所望の成績
で増大させることができる。ペプチドホルモンである成
長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）はソマトクリニン、成長
ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、及び成長放出ホル
モン（ＧＲＨ）として当業者に普通に知られているが、
これらはインビボにおいて成長ホルモンの循環レベルを
増大させることが証明されている［Rivier, et al. (l9
82) Nature 300:276］。ＧＨは、ＧＲＦとソマトスタチ
ンとの共同作用によって哺乳動物の下垂体から放出され
る［Devesa, etal. (1992) TEM 3:175-181］。ＧＲＦは
視床下部から血流中に放出され、そこで下垂体に移動す
る。ＧＨは、ＧＲＦがＧＲＦレセプターと呼ばれる細胞
表面のレセプターに結合すると下垂体から放出されると
考えられる。ＧＲＦとＧＲＦレセプターとの結合によっ
て、ＧＨ放出を結果的に導くシグナル伝導カスケードが
活性化される。

【０００４】本発明は、その活性が成長ホルモン作用を
生物にて刺激する事象カスケードに緊密に結び付いてい
るタンパク質であるブタ成長ホルモン放出因子（ｐＧＲ
Ｆ）レセプターを提供する。例えば以下に記載の多くの
Ｇプロテイン−カップリング化レセプターがクローンさ
れている：マウスゴナドトロピン放出ホルモンのレセプ
ター［Tsutsumi, et al., 1991, Molecular Endocrinol
ogy 6:1163-1169］、アデニル酸シクラーゼ活性化ポリ
ペプチドのレセプター［Arimura, A., 1992, TEM 3:288
-294］、ルトロピン−コリオゴナドトロピン(lutropin-
choriogonadotropin)のレセプター［McFarland, et a
l., 1989, Science 245: 494-499］、チロトロピン放出
ホルモン(thyrotropin releasing hormone)のレセプタ
ー［Zhao, et al., 1992, Endocrinology 130:3529-353
6］、ヒト及びラットドーパミンのレセプター［Zhou, e
t al., 1990, Nature 347:76-80］、グルカゴン−イン
クレチンホルモングルカゴン様ペプチド１(glucagon-in
cretin hormone glucagon-likepeptide 1)のレセプター
［Thorens 1992, PNAS 89:8641-8645］、カルシトニン
のレセプター［Lin, et al., 1991, Science 254:1022-
1024］、傍甲状腺ホルモン及び傍甲状腺ホルモン関連ペ
プチドのレセプター［Abou-Samra, et al., 1992, PNAS
89:2732-2736］、エンドセリン１のレセプター［Lin,
et al., 1991 PNAS 88:3185-3189］、セクレチンのレセ
プター［Ishihara, et al., 1991, EMBO J. 10:1635-16
41］、及び血管作用性腸管ペプチド(vasoactive intest
inal peptide)［Ishihara et al., 1992, Neuron 8:811
-819］。

【０００５】当業者はＧＲＦレセプターを精製しようと
してきたが、それらの調製物はＧＲＦレセプターの配列
を決定できるほどには充分な純度ではなかった。本発明
者らは驚くべきことに、実質的に純粋な形態でＧＲＦレ
セプターを入手できない従来技術の難点を克服した。本
発明はＧＲＦレセプター及びそれをコードするＤＮＡ配
列の精製方法、並びに組換えＤＮＡ技術によってそれぞ
れを有用な量で生産する方法をも提供する。

【０００６】詳細には、本発明は種々の態様からなる：
ｐＧＲＦレセプター及びその機能的同族体；ｐＧＲＦレ
セプター又はその断片をシグナルペプチド配列と共に、
又はその配列なしで含有する融合タンパク質；ｐＧＲＦ
レセプターをコードするＤＮＡ配列；ｐＧＲＦレセプタ
ーを組換え的に生産する方法；ｐＧＲＦレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクター；
ｐＧＲＦレセプターの組換え的発現に有用な形質転換宿
主細胞；ｐＧＲＦレセプターの作用を刺激又は阻害する
物質を決定するために有用である、ｐＧＲＦレセプター
を含有するスクリーニング系（方法）；試験化合物に応
答してｐＧＲＦ活性を刺激又は抑制するレベルを定量す
るために有用であるｐＧＲＦレセプターを発現する真核
生物宿主細胞を含有する生物活性検定系；イメージング
又は診断適用に有用である、ｐＧＲＦレセプターに対す
る抗体；及びｐＧＲＦレセプターを発現するトランスジ
ェニック動物。

【０００７】本発明の種々の態様は、ｐＧＲＦレセプタ
ーをコードするｃＤＮＡ配列を同定し、クローニング
し；そのＤＮＡ配列を組換えＤＮＡベクターに導入し；
該ＤＮＡ配列を含有するベクターによって適当な宿主を
形質転換し；その宿主においてｐＧＲＦレセプターを発
現させ；そしてそのようにして産生されたｐＧＲＦレセ
プターを回収する；ことによって実施された。同様に、
本発明は、組換え手法によってｐＧＲＦレセプター及び
その同族体の生産を可能にし、またＧＲＦレセプターに
関連する産物及びその方法を提供するものである。

【０００８】一連の添付図面は本発明の理解の便に供す
るためのものである。添付図面に表した制限部位及び機
能地図は本明細書にて説明する組換えＤＮＡベクターの
概観を表している。制限部位の情報は網羅的なものでな
く、特定のタイプのベクターの制限部位は図面に示した
ものよりも多い場合がある。図１；ｐＧＲＦレセプターの結合特異性を示す放射レ
セプター検定。非標識化セクレチン、ｐＧＲＦ、及び血
管作用腸管ペプチド（ＶＩＰ）を使用し、ｐＧＲＦレセ
プターを発現する細胞２９３／ＧＳ−１２に対して
^[125]Ｉ−ＧＲＦ結合と競合させた。図２；カルシトニン、セクレチン、ＶＩＰ及びｐＧＲ
Ｆ（１−４４）ＯＨに応答して、ＧＲＦレセプターを発
現する２９３細胞である２９３／Ｇ５−１２から産生さ
れるｃＡＭＰレベルを示すグラフである。図３；プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶの制限部位および機
能地図。図４；ＧＲＦレセプターのハイドロホビシティープロ
ット。

【０００９】本発明を導くための研究では種々の研究材
料を使用したが、それらの材料の供給源は便宜上、以下
の項にて説明している。制限エンドヌクレアーゼ及び他
の酵素（リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメ
ラーゼ）はベーリンガー・マンハイム(Boehringer-Man
nheim)［9115 Hague Road,Indianapolis, IN］から市販
されている。ペプチドホルモンであるヒトカルシトニ
ン、ブタセクレチン、ブタ血管作用腸管ポリペプチド
(ＶＩＰ）、ＰＡＣＡＰ、ＧＩＰ、ＰＴＨ、ＰＨＩ、Ｐ
ＨＭはペニンスラ・ラボラトリーズ(Peninsula Laborat
ories)［611 Taylor Way, Belmont, California 94002-
4041］から市販されている。ブタＧＲＦ（１−４４）−
ＯＨ、グルカゴン及びグルカゴン−様ペプチド１は文献
にて知られているアミノ酸配列から常法によって合成し
た。［¹²⁵Ｉ］ヒトＧＲＦ（１−４４）−アミドはアメ
ルシャン・コーポレイション(Amersham Corporation)
［2636 South Clearbrook Drive, Arlington Heights,
IL 60005］からカタログ番号ＩＭ.１８０として市販さ
れている。抗生物質ジェネチシン−４１８(Geneticin G
-418)はビブコ−ＢＲＬ［Gibco-BRL］から市販されてい
る。ＲＮＡ単離に使用した液体窒素凍結したブタ組織は
Pel-Freez,205 N. Arkansas, P.O. Box 68, Rogers Ar
kansas 72757 から入手した。

【００１０】本明細書及び特許請求の範囲に記載してい
る本発明の目的に沿って、以下の用語を次のように定義
する：同族体；別の化合物と構造的に類似している化合物。
ポリペプチドについてこの用語を使用する場合は、一
次、二次又は三次構造を意味する。塩基対（bp）；塩基対とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味
する。略語Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはＤＮＡ分子に存在する場
合、それぞれ（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）シ
チジン、（デオキシ）グアノシン、及び（デオキシ）チ
ミジンの各ヌクレオシドの５'−モノリン酸型に相当し
ている。略語Ｕ、Ｃ、Ｇ及びＴはＲＮＡ分子に存在する
場合、それぞれウリジン、シチジン、グアノシン、及び
チミジンの各ヌクレオシドの５'−モノリン酸型に相当
している。二本鎖ＤＮＡでは、塩基対はＡに対してＴ、
又はＣに対してＧの対関係を意味する場合もある。ＤＮ
Ａ／ＲＮＡのヘテロ二重らせんでは、塩基対はＴに対し
てＵ、又はＣに対してＧの対関係を意味する場合もあ
る。

【００１１】制御領域；制御領域とは、転写又は翻訳
いずれかの制御に関与することのできる真核生物遺伝子
の５'及び３'末端に存在する特定の配列を意味する。実
質的にすべての真核生物遺伝子は、転写が開始する部位
から約２５−３０塩基上流に位置するＡＴ豊富な領域を
有している。多くの遺伝子の転写開始から７０−８０塩
基上流に見いだされる別の配列はＣＸＣＡＡＴ領域［こ
こに、Ｘはあらゆるヌクレオチド］である。殆どの真核
生物遺伝子の３'末端には、転写されるｍＲＮＡの３'末
端にポリＡ⁺テールが付加するためのシグナルであり得
るＡＡＴＡＡＡ配列がある。脱リン酸化(dephosphoryla
tion)；脱リン酸化とは、細菌アルカリホスファター
ゼ（ＢＡＰ）又は子ウシ腸内アルカリホスファターゼ
（ＣＩＡＰ）による処置によってＮ末端リン酸を除去す
ることを意味する。この操作によって、ＤＮＡ断片の２
つの制限開裂末端が「環状化」又は閉じたループを形成
するのを防止でき、それによって別のＤＮＡ断片が制限
断片に挿入するのが妨げられる。脱リン酸化の操作及び
試薬は普通のものである。Maniatis, T. et al., Molec
ular Cloning pp. 133-134(1982)。

【００１２】消化；ＤＮＡの消化とは、ＤＮＡ内の特
定の配列のみで作用する制限酵素によってＤＮＡを触媒
的に開裂することを意味する。本明細書で使用している
種々の制限酵素は市販されており、その反応条件、共同
因子、及び他の要件は当業者に知られているようにして
用いた。具体的な制限酵素に適切な緩衝液及び基質の量
は製造元によって特定されている。充填又は平滑末端化；制限酵素によって開裂された核
酸の粘着末端における１本鎖末端を２本鎖に変換する操
作である。この操作は粘着（接着）末端を排除し、平滑
末端を生成させる。この操作は、平滑的に切断する制限
エンドヌクレアーゼに適合する末端又は他の充填粘着末
端と接着できるように、制限的に切断された末端を変換
するために使用される。通常は、ＤＮＡポリメラーゼI
のクレノー断片を使用し、当業者に周知の手法によって
平滑末端化又は充填を行う。

【００１３】機能的同族体；機能的同族体とは天然に
存在する形態の分子又は化合物に類似した機能特性を有
しているが、それと比較して構造が改変されている分子
を意味する。機能的同族体としては、親分子と類似の機
能特性及び反応性を有している親分子の断片（又はその
付加物）が例示される。連結；連結とは、２つの２本鎖核酸断片間にホスホジ
エステル結合を形成させる反応を意味する［Maniatis,
T. et al., 前掲, p. 146)。特に明記しない限り、連結
はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる既知の緩衝液及び条件
によって行うことができる。Ｍilli−Ｑ^R水；ミリポア・コーポレーション［Milli
pore Corporation, MA01730，ベッドフォード，アシビ
ー・ロード］から市販されているＭilli−Ｑ^R濾過系を
通して精製された水である。オリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドとは、化学
的に合成される場合もある１本鎖ポリデオキシヌクレオ
チド又は２つの相補的ポリデオキシヌクレオチドのスト
ランドのいずれかを意味する。このような合成オリゴヌ
クレオチドは５'リン酸を有しておらず、従ってキナー
ゼの存在下にＡＴＰと共にリン酸を付加しなければ別の
オリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオ
チドは脱リン酸化されていない断片と連結する。

【００１４】プラスミド；染色体外自己複製性遺伝子
要素である。プラスミドは大文字及び／又は数字が先行
及び／又は後続する小文字のｐによって命名される。本
明細書で説明する出発プラスミドは市販されているか、
制限無しに公に入手可能であるか、又は文献記載の手法
に従って入手可能なプラスミドから構築することができ
る。さらに、ここに記載したプラスミドと等価のプラス
ミドが当業界で既知であり、当業者には明らかである。解読枠； tＲＮＡ、リボゾーム及び関連因子の翻訳装
置によって、個々のアミノ酸に相当するそれぞれのトリ
プレットをトリプレットとして「読む」翻訳が起こるヌ
クレオチド配列。各トリプレットは個別的であり同じ長
さを有しているので、そのコード化配列は３つの多重体
でなければならない。塩基対の挿入又は欠失（フレーム
シフト突然変異と呼ばれる）により、同じＤＮＡセグメ
ントによってコードされる２つの別個のタンパク質が生
成され得る。これを回避するためには、所望のポリペプ
チドに相当するトリプレットのコドンは開始コドンから
３つの多重体として配列されていなければならず、即ち
正しい「解読枠」が維持されなければならない。

【００１５】組換えＤＮＡクローニングベクター；１
つ又はそれ以上の付加的なＤＮＡセグメントを付与でき
るか、又はそれが既に付与されているＤＮＡ分子を含有
する自律的に複製する物質であり、プラスミド及びファ
ージが例示されるが、それらに限定されない。組換えＤＮＡ発現ベクター；プロモーターが組み込ま
れている組換えＤＮＡクローニングベクター。レプリコン；プラスミド又は他のベクターの自律的な
複製を制御又は許容するＤＮＡ配列。ＲＰ−ＨＰＬＣ；逆相高速液体クロマトグラフィーの
略称。転写；ＤＮＡのヌクレオチド配列に含有されている情
報を相補的なＲＮＡ配列に転移させる方法。トランスフェクション；トランスフェクションとは、
コード化配列が実際に発現されるか否かを問わず、宿主
細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多くの
トランスフェクション方法が当業者に既知であり、例え
ばＣａＰＯ₄及びエレクトロポレーションなどがある。
トランスフェクションの成功は一般に、このベクターの
操作の指標が宿主細胞内に出現したときに認識される。

【００１６】形質転換；形質転換とは、染色体外要素
として、又は染色体組込みによってＤＮＡを生物に導入
し、そのＤＮＡを複製させることを意味する。形質転換
は、Graham, F. 及び van der Eb, A, (1973) Virology
52:456-7 の方法によって行うことができる。他の方
法、例えば核インジェクション、プロトプラスト融合、
又は Cohen, S. N. et al., (1972) Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 69:21に記載されている塩化カルシウムを
使用するカルシウム処理によっても行うことができる。翻訳；メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を使用するこ
とによってポリペプチド鎖の合成を特定化し、指示する
工程。ベクター；適当なタンパク質分子に相当するポリヌク
レオチド配列を担持する遺伝子操作に使用されるレプリ
コンであって、適当な制御配列と一緒になって、形質転
換される宿主細胞に特定の性質を付与するもの。プラス
ミド、ウイルス、及びバクテリオファージはそれ自身が
レプリコンであるので、適当なベクターである。異なる
起源のＤＮＡ分子を制限酵素及びリガーゼを用いて切断
し結合させれば、人工ベクターが構築される。本明細書
にて使用する「ベクター」なる用語には組換えＤＮＡク
ローニングベクター及び組換えＤＮＡ発現ベクターが包
含される。

【００１７】内生シグナルペプチド配列を包含してｐＧ
ＲＦレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を
全ブタｍＲＮＡライブラリーから単離したが、それは以
下のＤＮＡ配列を含有していた［配列番号１］。 ATG GACAGCGGGG TGTGGGCTGC CTGCATCTTC TGCCTGCTGA GCTCCCTACC AGTCGCCTTG GGCCACGTGC ACCCGGAATG TGACTTCATC ACCCAGCTGA GAGAAGACGA GCGAACTTGT CTACAAGCAG CAGACCGGAT GGCCAACTCC TCCTCGGGCT GTCCTAGGAC CTGGGATGGG CTGTTGTGCT GgCCGACGGC AGGCCCTGGG GAGTGGGTGA CCCTCCCCTG CCCGGCTTTC TTCTCTCACT TCAGCTCTGA GCCAGGGGCC CTGAAGCGGG ACTGCACCAC CACGGGCTGG TCTGAGCCCT TCCCGCCATA TCCCGAGGCT TGCCCTGTGC CCCTGGAGCT GCTGACTGAT GAGAAATCCT ACTTCTCCAC TGTGAGAATC GTCTACACCA CGGGCCACAG CGTCTCTGCC GTGGCCCTCT TCGTGGCCAT CGCCATCCTG GTTGCTCTCA GGAGGCTCCA CTGCCCCAGG AACTACATCC ACAGCCAGCT GTTCGCCACC TTTATCCTCA AGGCGGGAGC TGTGTTCTTG AAAGACGCCG CCCTCTTTCA CAGCGAGAAC ACGGACCACT GCAGCTTCTC CACGGTTCTG TGCAAGGTCT CTGTGGCCAC CTCCCATTTC GCCACCATGA CCAACTTCAG CTGGCTGCTG GCAGAAGCTG TCTACCTGAC CTGCCTCTTG GCCTCTACGT CACCCAGCAC GAGGAGGGCC TTCTGGTGGC TGGTTCTCGC TGGCTGGGGG CTGCCCCTGC TCTTCACTGG CACGTGGGTG GGTTGCAAGT TGGCCTTTGA GGATGTTGCG TGCTGGGACC TGGACGACAG CTCCCCCTAC TGGTGGATCA TCAAAGGGCC CATCGTCCTC TCCGTGGGGG TGAACTTTGG GCTTTTTCTC AATATTATCC GCATCCTGCT GAGGAAACTG GAGCCAGCTC AGGGCAGCCT CCACACCCAG CCTCAGTACT GGCGTCTCTC CAAGTCAACC CTTCTCCTCA TCCCGCTGTT TGGAATTCAC TACGTCATCT TCAACTTCCT GCCTGACAGT GCTGGCCTGG GCATCCGCCT CCCCCTGGAG CTGGGACTGG GCTCCTTCCA GGGCTTCATT GTTGCCATCC TGTACTGCTT CCTCAACCAA GAGGTGAGGA CTGAGATCTC ACGGAGGTGG CATGGCCATG ACCCTGAACT TCTGCCAGCC TGGAGGACTC ATGCCAAATG GGCAAAGCCT TCCCGCTCAA GGGCGAAGGT CAGTGCGTGT TCACGTGCTG GGTCTTCCCG CCCCCGAGCC CATGGCGACA CATACCCGGG ACTGGAAGTG CCGGGTCAGT GGTTGTGCCT TTTCTTGACG TGA

【００１８】配列番号１のＤＮＡによってコードされて
いるタンパク質の正体を、その配列を真核生物細胞にて
組換え的に発現させ、次いでｐＧＲＦレセプター活性を
証明することによって突き止めた。簡単に説明すれば、
配列番号１の２本鎖対応物を便利な制限部位が導入でき
るよう外部から修飾し、それをｐＲｃ／ＣＭＶベクター
に組込み、次いで２９３細胞にて組換え的に発現させ
る。ｃＤＮＡ転写体には、トランスフェクトした細胞膜
に正しく配向し組み込まれるのに役立つ天然の転写体の
シグナルペプチド領域が含まれていた。配列番号２のタ
ンパク質を細胞表面に発現するトランスフェクト化２９
３細胞を暴露すると、ｐＧＲＦ（１−４４）ＯＨへの暴
露の際のｃＡＭＰレベルの細胞内上昇が証明された。Ｇ
ＲＦと密接な関係を有する２つのペプチド、セクレチン
及び血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）の添加に応じ
た、トランスフェクト細胞の暴露の際のｃＡＭＰレベル
も測定した。配列番号２のタンパク質を発現するトラン
スフェクト細胞のＶＩＰ及びカルシトニンへの暴露によ
って得られるｃＡＭＰレベルは、ｐＧＲＦ（１−４４）
ＯＨへの暴露によって得られるプロフィルとは選択的に
有意に異なっていることが判明したが、このことは上記
レセプターをコードするｃＤＮＡが実際にＧＲＦレセプ
ターを構成していることを示している。以下の表１−４
及び添付の図３のデータを参照のこと。

【００１９】

【表１】２９３／Ｇ５−２３細胞のＧＲＦへの暴露 [GRF]* 細胞内[cAMP]** 10^-10 20 10^-9 60 10^-8 110 10^-7 170 10^-6 270 10^-5 280 *）ホルモン濃度はモル濃度で表している。 **）細胞内ｃＡＭＰは pmoles/１０⁵ 細胞で表してい
る。

【００２０】

【表２】２９３／Ｇ５−１２細胞のカルシトニンへの暴露 [カルシトニン]* 細胞内[ｃＡＭＰ]** 10^-10 <10 10^-9 10 10^-8 16 10^-7 26 10^-6 30 10^-5 32 *）ホルモン濃度はモル濃度で表している。 **）細胞内ｃＡＭＰは pmoles/１０⁵ 細胞で表してい
る。

【００２１】

【表３】２９３／Ｇ５−１２細胞のＶＩＰへの暴露 [ＶＩＰ]* 細胞内[cAMP]** 10^-10 28 10^-9 36 10^-8 50 10^-7 64 10^-6 78 10^-5 92 *）ホルモン濃度はモル濃度で表している。 **）細胞内ｃＡＭＰは pmoles/１０⁵ 細胞で表してい
る。

【００２２】

【表４】２９３／Ｇ５−１２細胞のセクレチンへの暴露 [セクレチン]* 細胞内[cAMP]** 10^-10 <10 10^-9 <10 10^-8 <10 10^-7 10 10^-6 70 10^-5 90 *）ホルモン濃度はモル濃度で表している。 **）細胞内ｃＡＭＰは pmoles/１０⁵ 細胞で表してい
る。

【００２３】本発明はさらにｐＧＲＦレセプター及びそ
の機能的同族体を提供する。機能的同族体は通常、天然
に存在する同族体と同じ定量的生物活性を示すが、ｐＧ
ＲＦレセプターの特性を改変するためにも機能的同族体
は選択される。機能的同族体は普通に操作された変異で
あるが、このような機能的同族体にはｐＧＲＦレセプタ
ーのアミノ酸配列における天然に存在するアレル変異体
又は種間変異体(interspecies variations)が包含され
る。このような天然に存在する変異体としては、ｐＧＲ
ＦレセプターのＧ３イソ型の単離体が例示される。Ｇ３
ｐＧＲＦレセプターはブタ下垂体組織から単離した
が、それは配列番号１１に示すＤＮＡ配列、及び対応す
るアミノ酸配列（配列番号１２）を含有していた。

【００２４】ｐＧＲＦレセプターのＧ３イソ型（配列番
号１２）は、上記の表１と以下の表５との比較によって
分かるように、ＧＲＦ結合性に応じて細胞内ｃＡＭＰの
刺激を増大させることが示されている。

【表５】２９３／Ｇ３−２３細胞のＧＲＦへの暴露 [GRF]* 細胞内[cAMP]** 10^-11 20 10^-10 150 10^-9 250 10^-8 300 10^-7 325 10^-6 350 *）ホルモン濃度はモル濃度で表している。 **）細胞内ｃＡＭＰは pmoles/１０⁵ 細胞で表してい
る。ｐＧＲＦレセプターのＧ３イソ型は、本発明が目的
としているｐＧＲＦレセプターの機能的同族体の例示で
ある。

【００２５】機能的同族体は、ｐＧＲＦレセプターをコ
ードするＤＮＡの改変、及びその後の組換え細胞培養物
におけるそのＤＮＡの発現によって普通に製造される。
既知の配列を有するＤＮＡ内の予め決められた部位にお
ける置換突然変異体を作成する手法は、例えばＭ１３プ
ライマー突然変異誘発として周知である。機能的同族体
ｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮＡ内に作成され得
る突然変異は解読枠を越えた配列に起こってはならず、
二次ｍＲＮＡ構造体を製造しかねない相補的な領域は創
製しないのが好ましい（ＥＰ７５，４４４Ａ）。ｐＧＲ
Ｆレセプターの機能的同族体は特定かつ限定的な方法に
よるタンパク質のアミノ酸配列改変によって一般には創
製される。アミノ酸配列の変異を導入するための部位は
前もって決定しておくが、突然変異体それ自体を前もっ
て決定しておく必要はない。例えば、特定の部位におけ
る突然変異の作業を最適にするため、無作為突然変異誘
発を標的コドン又は標的領域に起こし、発現されたｐＧ
ＲＦレセプターの機能的同族体を所望の活性の最適な組
合わせに関してスクリーニングすればよい。

【００２６】ｐＧＲＦレセプターの機能的同族体は単一
の（又は幾つかの）アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換
によって通常作成される。このような改変は一般には以
下の表６に従って行い、それによりｐＧＲＦレセプター
の機能的同族体を製造する:

【表６】

【００２７】機能又は免疫学的同一性を実質的に変化さ
せるのは、表６に記載したものよりも保存性の低い置換
を選択することによって行われる；即ち、(a) ペプチ
ド骨格の二次又は三次構造、(b) 残基のハイドロフォ
ビシティーの変動、又は(c)側鎖のバルク（かさ）の維
持に対する影響がより有意に異なっている残基を選択す
る。一般にｐＧＲＦレセプターの性質を最も大きく変動
させると期待される置換は、(a) 親水性残基を疎水性
残基と置き換える置換、(b) システイン又はプロリン
を別の残基と置き換える置換、(c) 正に帯電した側鎖
を有する残基を負に帯電した残基と置き換える置換、又
は(d) かさ高い側鎖を有する残基を側鎖を有していな
いものと置き換える置換である。ｐＧＲＦレセプターの
非グリコシル化機能的同族体を与えるＮ−又はＯ−結合
グリコシル化部位を削除するためには、部位特異的突然
変異誘発も使用できる。非グリコシル化ｐＧＲＦレセプ
ターは原核生物細胞培養物にて組換え的に生産すること
ができる。システイン又は他の不安定な残基を欠失する
ことも望ましい場合があり、例えばｐＧＲＦレセプター
の酸化的安定性を増大させる場合である。可能性あるタ
ンパク質分解部位、例えばＡrg−Ａrgの欠失又は置換
も、塩基性残基の１つの欠失、又は１つをグルタミニル
又はヒスチジニル残基と置換することによって行うこと
ができる。

【００２８】配列番号１によってコードされており、内
生シグナルペプチドを含有する好ましいｐＧＲＦレセプ
ターは以下のアミノ酸配列を有している［配列番号
２］： MDSGVWAACI FCLLSSLPVA LGHVHPECDF ITQLREDERT CLQAADRMAN SSSGCPRTWD GLLCWPTAGP GEWVTLPCPA FFSHFSSEPG ALKRDCTTTG WSEPFPPYPE ACPVPLELLT DEKSYFSTVR IVYTTGHSVS AVALFVAIAI LVALRRLHCP RNYIHSQLFA TFILKAGAVF LKDAALFHSE NTDHCSFSTV LCKVSVATSH FATMTNFSWL LAEAVYLTCL LASTSPSTRR AFWWLVLAGW GLPLLFTGTW VGCKLAFEDV ACWDLDDSSP YWWIIKGPIV LSVGVNFGLF LNIIRILLRK LEPAQGSLHT QPQYWRLSKS TLLLIPLFGI HYVIFNFLPD SAGLGIRLPL ELGLGSFQGF IVAILYCFLN QEVRTEISRR WHGHDPELLP AWRTHAKWAK PSRSRAKVSA CSRAGSSRPR AHGDTYPGLE VPGQWLCLFL T

【００２９】このブタＧＲＦレセプターのアミノ酸配列
のハイドロフォビシティープロットは添付の図４に示し
ている。アミノ末端から約２２番目のアミノ酸残基まで
のブタＧＲＦレセプターのアミノ末端部分は推定シグナ
ルペプチド配列を構成している。約２３番目のアミノ酸
残基から約１４０番目のアミノ酸残基までのｐＧＲＦレ
セプター部分は、ＧＲＦレセプターの推定細胞外ドメイ
ンを構成している。約１４１番目から約３８０番目のア
ミノ酸は７つの疎水性トランスメンブランドメインを構
成している。Leftkowitz はβ−アドレナリン作動性レ
セプターを用いて部位特異的突然変異を行ったが、その
成績は第３の細胞内ドメイン（約３１０から３３０番
目）がＧ−プロテインとのカップリングに重要であるこ
とを示していた［Taylor, C.N. (1990) Biochem. J. 27
2:1-13］。ｐＧＲＦレセプターｃＤＮＡの特徴は、タン
パク質の細胞膜内における最終的な配置を指令するのに
役立つシグナル（又はリーダー）ポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列が存在していることである。一般には、
シグナルペプチドは、タンパク質が宿主細胞ペリプラズ
ム又は培養培地中に輸送される分泌工程の一部として残
余タンパク質からタンパク質分解的に開裂される。しか
し、機能的なＧＲＦレセプターはＧＲＦ結合活性を保持
したままで、その一次配列内にシグナルペプチドを包含
することができる。改変シグナルペプチドが導入された
ｐＧＲＦレセプターの同族体も本発明の範囲内に包含さ
れる。

【００３０】シグナルペプチドが原核生物及び真核生物
の両環境下に分泌タンパク質の細胞外排出を行わせるの
は当業者に周知である。異質シグナルペプチドを正常な
細胞内（サイトゾリック）タンパク質に付加すると、正
常な細胞内タンパク質が大腸菌（Ｅ.coli）において細
胞外輸送されることが示されている［MacIntyre, et a
l.,(1987) J.Biol.Chem. 262:8416-8422］。代替のシグ
ナルペプチド配列が異種コード化配列と共に機能できる
ことも当業者に周知である。例えば、セクレチンレセプ
ターなどの別のレセプター由来のシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列をｐＧＲＦレセプターのシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列と置換すると、ｐＧＲＦ
レセプターの特性を保持する異種タンパク質を得ること
ができる。このような融合タンパク質の組換え的生産
は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をタンパ
ク質のコード化配列の５'側かつ解読枠内にて適切に宿
主生物に付加することによって実施することができる。
ｐＧＲＦ構造体に同様に挿入でき、それによってｐＧＲ
Ｆレセプターの他の機能的同族体を作成できるであろう
シグナルペプチドは当業者に周知である。このシグナル
ペプチドは微生物又は哺乳動物であってもよいが、哺乳
動物が好ましい。本発明を実施するうえで好ましいこと
は、シグナルペプチドとして宿主セルラインの分泌タン
パク質にとって本来のシグナルペプチドを使用すること
である。最も好ましく本発明を実施するには、本明細書
にて例示しているように、シグナルペプチドが天然の２
２個アミノ酸のｐＧＲＦレセプタープレ配列であるもの
である。

【００３１】さらに、シグナル配列は全体として合成さ
れたものであってもよい。合成「理想的」シグナルペプ
チドは原核生物及び真核生物の両環境下にて機能するこ
とであることが示されている［von Heijne, G. (1990)
J. Membrane Biol. 115: 195-201］。シグナルペプチド
の原理は原核生物及び真核生物において共に類似してい
る。原核生物及び真核生物は全体として３つのドメイン
構造を有しており、機能を保護するうえで必須の正確な
配列保存性は存在しない［von Heijne，G., 前掲］。一
般には、塩基性及び／又は帯電アミノ酸残基が構造タン
パク質のアミノ末端付近に存在していると分泌が阻害さ
れる［Yamane, K., et al. (1988) J.Biol.Chem. 263:1
9690-19696, Summers, R.G., et al. (1989) J.Biol.Ch
em. 264:20082-20088］。シグナルペプチドが融合タン
パク質構築物から効率的に確かに開裂するためには、シ
グナルペプチドと成熟アートタンパク質のコード化配列
との間の境界に位置するアミノ酸配列の性質を維持させ
るのが望ましい。電荷及びハイドロフォビシティーを保
存し、そしてシグナルペプチドの開裂点の直ぐ下流に位
置する帯電残基を削除することは、効率的なトランスロ
ーケーションにとって一般に重要である。しかし、具体
的な１つのアミノ酸配列を維持させることは重要でな
い。

【００３２】本発明はさらに、ｐＧＲＦをコードする配
列又は、ｐＧＲＦの機能的同族体をコードするＤＮＡ配
列を使用して生産される、ＧＦＲ活性を研究する研究手
段として有用であるトランスジェニック動物を提供す
る。異種の外来タンパク質を発現するトランスジェニッ
ク動物を構築するのは当業者に周知である［Wagner, et
al (１９８９年１０月１０日発行の米国特許第４，８７
３，１９１号), Evans,et al. (１９８９年９月２６日
発行の米国特許第４，８７０，００９号)、これらを引
用によって本明細書に包含させる, Cline, et al. (198
0) Nature 284:422-425, 及び Capecchi M. R. (1980)
Cell 22:479:488を参照のこと］。本発明はさらに、ｐ
ＧＲＦレセプターを作成する方法をも提供する。本発明
の化合物は、組換えＤＮＡ技法又は周知の化学的手法、
例えば溶液又は固相ペプチド合成、又は通常の溶液法に
よってカップリングしたタンパク質断片から始める溶液
中の半合成法のいずれによっても製造することができ
る。

【００３３】ｐＧＲＦレセプター又はそのｐＧＲＦペプ
チド断片の合成は固相ペプチド合成法又は組換え方法に
よって行うことができる。ポリペプチドの固相における
化学的合成の原理は当業者に周知であり、それは当業界
の一般的教科書、例えば Dugas, H. 及び Penney, C.,
Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, NewYo
rk, pgs. 54-92 に見いだすことができる。例えば、ペ
プチドはアプライド・バイオシステムズ(Applied Ｂios
ystems) ４３０Ａペプチド合成装置［AppliedBiosyste
ms, Foster City Californiaから入手可能］及びアプラ
イド・バイオシステムズから供給されている合成サイク
ルを利用する固相方法によって合成することができる。
Ｂocアミノ酸及び他の試薬はアプライド・バイオシステ
ムズ及び他の化学供給会社から市販されている。Ｃ末端
カルボキサミド類の製造のために出発ｐ−メチル・ベン
ズヒドリルアミン樹脂に、二重カップルプロトコールを
使用する連続Ｂoc化学を適用する。Ｃ末端酸の製造のた
めには対応するＰＡＭ樹脂を使用する。アスパラギン、
グルタミン及びアルギニンを実行ヒドロキシベンゾトリ
アゾールエステル類を使用してカップリングする。以下
の側鎖保護を使用することができる：Ａrg, トシルＡsp, シクロヘキシルＧlu, シクロヘキシルＳer, ベンジルＴhr, ベンジルＴyr, ４−ブロモカルボベンゾキシ

【００３４】Ｂocの脱保護は塩化メチレン中、トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて行うことができる。合成を
行った後、得られたペプチドを脱保護し、１０％メタ−
クレゾールを含有する無水フッ化水素によって樹脂から
切断する。側鎖の保護基(群)及び樹脂からのペプチドの
切断は、０℃又はそれ以下、好ましくは−２０℃にて３
０分、次いで０℃にて３０分行う。ＨＦを除去した後、
ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄し、ペプチドを氷酢酸
で抽出し、凍結乾燥する。精製は、１０％ＨＯＡｃ中の
セファデックスＧ−１０［ファルマシア］カラムを用い
るサイズ排除クロマトグラフィーによって行う。

【００３５】ｐＧＲＦレセプターは組換え法によっても
製造できる。高い収量を望む場合にはこの組換え法が好
ましい。ｐＧＲＦレセプターの組換え的生産の基本的な
工程には以下のものがある： (a) ｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮＡの合成又
は半合成物の構築（又は天然起源から単離）、(b) ｐ
ＧＲＦレセプターが単独で、又は融合タンパク質として
発現するのに適した方法により、得られたコード化配列
を発現ベクターに導入すること、(c) その発現ベクタ
ーによって適当な真核生物又は原核生物宿主細胞を形質
転換すること、及び(d) 組換え的に生産したｐＧＲＦ
レセプターを回収し、精製すること。

【００３６】上記のように、コード化配列は全体が合
成、半合成、又は天然ｐＧＲＦレセプターｃＤＮＡの改
変の結果物であってもよい。本明細書に記載の実施例に
実質的に従うことで単離されたｐＧＲＦレセプターのｃ
ＤＮＡは配列番号１に示すＤＮＡ配列を含有している。
ｐＧＲＦレセプターの生産を導くインビトロ又はインビ
ボ転写及び翻訳における合成遺伝子は当業者に周知の手
法によって構築することができる。当業者ならば、遺伝
子コードの天然の縮重に基づいて、ｐＧＲＦレセプター
をコードしているＤＮＡ配列がかなり多くの規定数で構
築できることは理解できよう。本発明を好ましく実施す
るには、ｐＧＲＦレセプターの合成を組換えＤＮＡ技法
によって行う。

【００３７】ｐＧＲＦレセプターをコードする遺伝子は
合成法によって創製することができる。このような合成
遺伝子構築の方法は当業者に周知である［Brown, et a
l. (1979) Methods in Enzymology, Academic Press,
N.Y., Vol. 68, pgs. 109-151］。合成ｐＧＲＦレセプ
ター遺伝子に相当するＤＮＡ配列は通常のＤＮＡ合成装
置、例えばアプライド・バイオシステムズ３８０Ａ又は
３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置［Applied Biosystems, In
c.（850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 9440
4）から市販］を用いて作成することができる。ｐＧＲ
Ｆレセプターのコード化配列は便利なプロテアーゼ感受
性開裂部位が導入されるように天然のタンパク質と比較
して改変するのが幾つかの適用例において望ましい場合
があり、例えばシグナルペプチドと構造タンパク質との
間に導入すれば、シグナルペプチドの融合タンパク質構
築物からの切除を制御することができる。

【００３８】ｐＧＲＦレセプターは直接発現によって、
又はｐＧＲＦレセプターの後に酵素的又は化学的開裂を
含有する融合タンパク質として調製することができる。
ポリペプチドを特定の部位で開裂するペプチダーゼ（例
えば、トリプシン）、又はペプチド鎖のアミノもしくは
カルボキシ末端からペプチドを消化するペプチダーゼ
（例えば、ジアミノペプチダーゼ）が知られている。さ
らに、個々の化学物質（例えば、臭化シアン）は特定の
部位でポリペプチド鎖を開裂する。当業者ならば、部位
特異的な内部開裂部位を導入するためのアミノ酸配列
（及び組換え手段を使用する場合には合成又は半合成コ
ード化配列）に必須の改変は理解されよう。例えば、Ca
rter P. 融合タンパク質の部位特異的なタンパク質分解
(Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins), C
h. 13 in Protein Purification: FromMolecular Mecha
nisms to Large Scale Processes, American Chemical
Soc.,Washington, D.C. (1990)を参照のこと。

【００３９】所望のコード化及び制御配列を含有する適
当なベクターの構築には標準的な連結手法を用いる。単
離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、仕立て、
必要なプラスミドが形成されるに望ましい形態に再連結
する。一般には、本発明に有用であるベクターを構築す
る際はＤＮＡ配列のクローニングに原核生物を使用す
る。例えば、Ｅ.coli Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１
４４６）は特に有用である。使用可能な他の微生物株に
はＥ.coli Ｂ及びＥ.coli Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１
５３７）などがある。これらは限定的なものでなく、例
示である。

【００４０】所望のｐＧＲＦレセプター又はその同族体
を翻訳するには、適当な制限エンドヌクレアーゼを用い
て、操作した合成ＤＮＡ配列を、過剰にある適当な組換
えＤＮＡ発現ベクターに挿入する。ｐＧＲＦレセプター
は比較的大きなタンパク質である。合成ｐＧＲＦレセプ
ターをコードする配列を転写物のいずれかの末端に制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位を有するように設計し、そ
の発現及び増幅及び発現プラスミドからの単離及びそれ
への組込みを可能にする。単離されたｃＤＮＡＧＲＦレ
セプターをコードする配列は合成リンカーを使用するこ
とで容易に改変することができ、それにより当業者に周
知の手法によって所望のクローニングベクターにその配
列を挿入することができる。使用する具体的なエンドヌ
クレアーゼは、使用する親発現ベクターの制限エンドヌ
クレアーゼ開裂パターンによって描かれる。制限部位の
選択は、ｐＧＲＦレセプターをコードする配列と制御配
列とが正しく配向するように選択し、適切な解読枠内と
ｐＧＲＦレセプターの発現を行わせる。

【００４１】一般には、宿主細胞と適合する種から誘導
されるプロモーター及び制御配列を含有するプラスミド
ベクターをその宿主細胞と共に使用する。ベクターは元
来、複製部位及び、形質転換細胞にて表現型の選択性を
与えることのできるマーカー配列を担持している。例え
ば、Ｅ.coli（大腸菌）は通常、Ｅ.coli 種［Bolivar,
et al., Gene 2: 95 [1977]］から誘導されたプラスミ
ドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換する。ｐＢＲ
３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のため
の遺伝子を含有しており、従って形質転換細胞を同定す
るための容易な手段を提供するものである。ｐＢＲ３２
２プラスミド、又は他の微生物プラスミドは組換えＤＮ
Ａ構築に通常使用されるプロモーター及び他の制御因子
をも含有し、又は含有するよう改変できなければならな
い。

【００４２】ｐＧＲＦレセプターのコード化配列は、ｐ
ＧＲＦレセプターが発現される宿主細胞内で共に機能的
である発現ベクターのプロモーター及びリボゾーム結合
部位と正しい解読枠内になるように配置しなければなら
ない。好ましい態様では、プロモーター−オペレーター
がそれが誘導される遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関連し
て占有している場合、配列番号２のタンパク質をコード
するＤＮＡ配列のＡＴＧ開始コドンに関してプロモータ
ー−オペレーター領域を同じ順番方向性で配置させる。
ｔａｃプロモーターなどの合成又は修飾プロモーター−
オペレーター領域は当業者に周知である。このような合
成又は修飾プロモーター−オペレーター領域を使用する
場合は、ｐＧＲＦレセプターをコードする配列のＡＴＧ
開始コドンに関して、そのクリエーターによって指令さ
れるようにその領域を配向させるべきである。

【００４３】ｐＧＲＦレセプター又はその同族体は真核
生物発現系にて組換え的に調製することができる。レセ
プターの組換え的発現に関する一般的原理は Receptor
Biochemistryの１１章: A Practical Approach, E.C. H
ulme編, IRL Press, OxfordUniversity Press, Walton
St. Oxford OX2 6DP, 英国に記載されている。哺乳動物
宿主細胞において転写を制御する好ましいプロモーター
は種々の供給源、例えばポリオーマ、サルウイルス４０
（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス族、Ｂ
型肝炎ウイルスなどのウイルス族のゲノム、最も好まし
くはサイトメガロウイルスのゲノム、又はβ−アクチン
プロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターから入手
することができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プ
ロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有する
ＳＶ４０制限断片として簡便に入手可能である［Fiers,
et al., (1978) Nature, 273:113］。全ＳＶ４０ゲノ
ムはプラスミドｐＢＲＳＶ、ＡＴＣＣ４５０１９から
入手することができる。ヒトサイトメガロウイルスの即
座型プロモーターはプラスミドｐＣＭＢβ（ＡＴＣＣ
７７１７７）から入手することができる。当然ながら、
宿主細胞又はその関連種由来のプロモーターも本発明で
は有用である。

【００４４】ｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮＡの
高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクタ
ーに挿入することによって増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用性要素であり、通常は約１０−３００
bp であり、その転写が増大するようにプロモーターに
働き掛ける。エンハンサーは比較的配向性及び位置独立
的であり、転写単位に対して５'側［Laimins, L. et a
l., [1981] PNAS 78:993］及び３'側［Lusky, M. L., e
t al., [1983] Mol. Cell Bio. 3:1108］に、そしてイ
ントロン内に［Banerji, J. L. et al., [1983] Cell 3
3:729)及びコード化配列自身の内部に［Osborne, T.
F., et al., [1984] Mol. Cell Bio. 4:1293］見いださ
れている。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配
列が現在知られている［グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、
ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテ
イン、及びインスリン］。しかし、真核生物細胞ウイル
ス由来のエンハンサーも通常は使用できる。例として、
ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオ
ーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーな
どがある。

【００４５】真核生物細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、
動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の核形成細胞）に使
用する発現ベクターはｍＲＮＡ発現に影響を与える場合
のある転写終止に必須の配列も含有している。この領域
はｐＧＲＦレセプターをコードするｍＲＮＡの非翻訳部
分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３'
非翻訳領域は転写終止部位も含有している。

【００４６】発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれ
る選択遺伝子を含有できる。哺乳動物細胞にとって適当
な選択マーカーとしてはジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ、これはｐＪＯＤ−１０［ＡＴＣＣ６８８１５］の
ＢglIII／ＨindIII制限断片から誘導することができ
る）、チミジンキナーゼ（単純ヘルペスウイルスのチミ
ジンキナーゼはｖＰ−５クローン［ＡＴＣＣ２０２
８］のＢamＨＩ断片に含有されている）、又はネオマイ
シン（Ｇ４１８）耐性遺伝子［ｐＮＮ４１４酵母人工染
色体ベクター［ＡＴＣＣ３７６８２］から入手でき
る］が例示される。このような選択マーカーが哺乳動物
宿主細胞に成功裏に導入されれば、得られるトランスフ
ェクト哺乳動物宿主細胞は選択圧の下においても生存す
ることができる。選択方法には２つの別個のカテゴリー
のものが広く使用される。第１のカテゴリーは細胞の代
謝に基づくものであり、添加培地の無い状態での発育能
を欠く突然変異セルラインを使用するものである。２つ
が例示される：ＣＨＯＤＨＦＲ~細胞（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ−９０９６）、及びマウスＬＴＫ~細胞（Ｌ−Ｍ(ＴＫ
−)ＡＴＣＣＣＣＬ−２．３）。これらの細胞はチミジ
ン又はヒポキサンチンなどの栄養素が添加されていない
状態での発育能を欠いている。これらの細胞は完全なヌ
クレオチド合成経路に必須の特定の遺伝子を欠いている
ので、欠失したヌクレオチドが添加培地に加えられない
限り生存することはできない。培地の添加に対する代替
方法は、ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を欠く細胞にそれぞれ
無傷のそれらの遺伝子を導入し、発育要求性を変化させ
ることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子によって形質転
換されていない個々の細胞は未添加培地中では生存する
ことができない。

【００４７】第２のカテゴリーは、あらゆる細胞型に使
用される選択法と呼ばれる優勢選択(dominant selectio
n)であり、突然変異セルラインを使用する必要がない。
これらの方法は通常、宿主細胞の発育を抑える薬物を使
用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を運ぶ
タンパク質を発現し、選択性を生存させる。このような
優勢選択では、薬物であるネオマイシン［Southern P.
and Berg, P., (1982)J. Molec. Appl. Genet. 1: 32
7］、ミコフェノール酸［Mulligan, R. C. andBerg, P.
(1980) Science 209:1422］、又はハイグロマイシン(h
ygromycin)［Sugden, B. et al., (1985) Mol Cell. Bi
ol. 5:410-413］を使用する。ここに挙げた３つの例は
真核生物制御下にある細菌遺伝子を使用するものであ
り、適当な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン（ジェネチシ
ン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイ
シンに対する耐性をそれぞれ付与する。

【００４８】ＧＦＲレセプターの真核生物発現にとって
好ましいベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／Ｃ
ＭＶの制限部位および機能地図は添付の図３に示してい
る。ｐＲｃ／ＣＭＶはＩnvitrogen Ｃorporation[3985
Sorrento Valley Blvd., サンジエゴ, CA 92121]から市
販されている。構築されたプラスミドの配列が正しいこ
とを確認するには、連結混合物を使用してＥ.coli Ｋ１
２株ＤＨ５α（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、
そこに適切な抗生物質耐性によって成功した形質転換体
を選択する。得られた形質転換体からプラスミドを調製
し、制限及び／又は配列決定によって分析する［Messin
g, et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9:309］。

【００４９】本発明のベクターによって宿主細胞を形質
転換し、プロモーターの誘発に適合するよう改変した通
常の栄養培地中で培養し、形質転換体を選択し、又は遺
伝子を増幅すればよい。温度、pＨなどの培養条件は発
現のために選択する宿主細胞に用いられているものであ
り、当業者には明らかである。上記のベクターを用いて
細胞を形質転換する手法は当業者に周知であり、Maniat
is, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 又は C
urrent Protocols in Molecular Biology (1989) 及び
補稿などの一般的文献中に見いだすことができる。

【００５０】ｐＧＲＦレセプターをコードする本発明の
ベクターを高等真核生物において発現するのに適した宿
主細胞のうち好ましいものは、ＳＶ４０によって形質転
換されたアフリカミドリザル腎系セルライン（ＣＯＳ−
７，ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）；形質転換されたヒ
ト一次胚腎セルライン２９３［Graham, F. L. et al.(1
977) J. Gen Virol. 36:59-72, Virology 77:319-329,
Virology 86:10-21］；幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ
−２１(Ｃ−１３）, ＡＴＣＣＣＣＬ−１０,Virology
(1962) 16:147］；チャイニーズハムスター卵巣細胞Ｃ
ＨＯ−ＤＨＦＲ~ (ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６)、マウ
スセルトリ細胞(ＴＭ４，ＡＴＣＣＣＲＬ−１７１５,
Biol. Reprod.(1980) 23:243-250); アフリカミドリザ
ル腎細胞(ＶＥＲＯ７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８
７)；ヒト頚管上皮癌細胞(human cervical epitheloid
carcinoma cells)（ＨｅＬａ, ＡＴＣＣＣＣＬ−２)；
イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ−３４)；バッ
ファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣＣＲＬ
−１４４２)；ヒトディプロイド肺細胞（ＷＩ−３８，
ＡＴＣＣＣＣＬ−７５)；ヒト肝細胞性癌細胞（Ｈｅｐ
Ｇ２，ＡＴＣＣＨＢ−８０６５)；及びマウス乳房腫
瘍細胞(ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣＣＣＬ５１)。

【００５１】原核生物に加えて、真核生物微生物、例え
ば酵母培養物も使用できる。サッカロマイセス・セレビ
シアエ(Saccharomyces cerevisiae)、又は通常のパン酵
母が最も普通に使用される真核生物微生物であるが、多
くの他の株も通常は利用可能である。サッカロマイセス
にて発現させるには、例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴ
ＣＣ−４００５３, Stinchcomb, et al., (1979) Natur
e 282:39; Kingsman et al., [1979] Gene 7:141 ; Tsc
hemper et al., [1980] Gene 10:157）を普通は使用す
る。このプラスミドは、トリプトファン中での発育能を
欠いている酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ４４０
７６又はＰＥＰ４−１ (Jones, [1977],Genetics 85:1
2)のための選択マーカーを付与するｔｒｐ遺伝子を既に
含有している。

【００５２】酵母とともに使用するのに適したプロモー
ト配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモ
ーター［プラスミドｐＡＰ１２ＢＤＡＴＣＣ５３２３
１にて見いだされ、米国特許第４，９３５，３５０号、
１９９０年６月１９日に記載されている］又は他の解糖
系酵素、例えばエノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１ＡＴ
ＣＣ３９５３２に見いだされる）、グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（プラスミドｐＨｃＧ
ＡＰＣ１ＡＴＣＣ５７０９０、５７０９１）、ザイモ
モナス・モビリス(zymomonas mobilis)（１９９１年３
月１９日発行の米国特許第５，０００，０００号）、ヘ
キソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホスホ
グルコース・イソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロ
モーターなどがある。

【００５３】発育条件によって制御される転写の付加的
な利点を有している誘導プロモーターである他の酵母プ
ロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連す
る分解性酵素、メタロチオネイン（プラスミドベクター
ｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶＡＴＣＣ３９４７５、米
国特許第４，８４０，８９６号）、グリセルアルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラ
クトース利用に関与する酵素（プラスミドｐＲＹ１２１
ＡＴＣＣ３７６５８に見いだされるＧＡＬ１）などが
ある。酵母発現の使用に適したベクター及びプロモータ
ーはさらにHitzeman et al., 欧州特許公開第73,657Aに
記載されている。サッカロマイセス・セレビシアエ由来
のＵＡＳＧalなどの酵母エンハンサー（プラスミドＹ
Ｅｐｅｃ−−ｈＩ１ｂｅｔａＡＴＣＣ６７０２４のＣ
ＹＣ１プロモーターとのコンジュゲート体として見いだ
される）も酵母プロモーターと一緒に使用すると便利で
ある。

【００５４】原核生物も発現のために使用できる。上記
の株に加え、Ｅ.coli Ｗ３１１０（始原型、ＡＴＣＣ
２７３２５）、バシラス・ズブチリスなどのバシルス
属、及びサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typh
imurium)又はセラチア・マルセスカンス(Serratia marc
escans)、及び種々のシュードモナス種が使用できる。
原核生物宿主に使用するのに適したプロモーターは、β
−ラクタマーゼ（ベクターｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ
３９３４４］はレプリコン及びβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有している）、及びラクトースプロモーター系（Ch
ang et al., [1978] Nature, 275:615; 及び Goeddel e
t al., [1979] Nature 281:544）、アルカリホスファタ
ーゼ、トリプトファン (trp) プロモーター系 (ベクタ
ーｐＡＴＨ１ [ＡＴＣＣ３７６９５]をｔｒｐＥ融合タ
ンパク質としてオープン解読枠の発現が行えるよう設計
する）、及びｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５
４０ＡＴＣＣ−３７２８２）などの雑種プロモーターな
どである。しかし、当業者ならば、リンカー又は必要
な制限部位を供給するアダプターの使用によってヌクレ
オチド配列が一般に知られている他の機能的細菌プロモ
ーターをｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮＡに連結
することができる。細菌系に使用するためのプロモータ
ーはまた、ｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮＡに作
動可能に連結されているシャイン−ダルガーノ配列を含
有している。

【００５５】ｐＧＲＦレセプターにはアミノ酸配列突然
変異、グリコシル化変異体及び、他の化学部分との共有
結合又は凝集性コンジュゲート体が包含される。これら
のＧＲＦレセプター、機能的誘導体、及びグリコシル化
変異体及び他の化学部分との共有結合又は凝集性コンジ
ュゲート体は、これらの分子に対する抗体を構築し単離
するための通常の手法に従って使用することができる。
例えば、Kohler 及びMilstein (1975) Nature 256:497
を参照のこと。ｐＧＲＦレセプターは、ｐＧＲＦレセプ
ターアミノ酸側鎖又はそのＮ又はＣ末端に見いだされる
基に当業者に既知の手段により官能基を連結することに
よって製造される共有結合誘導体を包含している。これ
らの誘導体は例えば、カルボキシ末端又はカルボキシ側
鎖を含有する残基の脂肪族エステル又はアミド、ヒドロ
キシ基含有残基のＯ−アシル誘導体、及びアミノ末端ア
ミノ酸もしくはアミノ基含有残基、例えばリジン又はア
ルギニンのＮ−アシル誘導体などが包含され得る。アシ
ル基はアルキル部分（Ｃ３−Ｃ１８直鎖アルキルなど）
の基から選択されるので、アルカロイルアロイル種が形
成される。

【００５６】誘導体の主要なグループはｐＧＲＦレセプ
ター又はその断片と他のタンパク質もしくはポリペプチ
ドとの共有結合コンジュゲート体である。これらの誘導
体の合成は、Ｎ又はＣ−末端融合体として組換え培養物
において、又はそれ自体は反応性側鎖を介してタンパク
質を不溶性マトリックスに架橋連結するのに使用される
ことで知られる二機能性物質を使用して行われる。架橋
連結物質にとって好ましいＧＲＦレセプター誘導部位は
システイン及びリジン残基である。好ましい物質はＮ−
マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステル及びＮ−
ヒドロキシスクシンイミドである。

【００５７】共有結合又は凝集性誘導体は免疫検定、又
はｐＧＲＦもしくは他の結合リガンドのアフィニティー
精製操作のための試薬である免疫原として有用である。
例えば、ｐＧＲＦレセプターは既知の方法による臭化シ
アン活性化セファロースとの共有結合、又は（グルタル
アルデヒド架橋連結を伴う又は伴わない）ポリオレフィ
ン表面への吸着によって不溶性になり、抗−ｐＧＲＦレ
セプター抗体又はｐＧＲＦの検定又は精製に使用され
る。ｐＧＲＦレセプターはまた、検出基によって標識
し、例えばクロラミンＴ操作により放射性ヨウ素化し、
希土類キレートとの共有結合、他の蛍光性部分とのコン
ジュゲートによって標識し、診断検定に使用する。

【００５８】ＧＲＦがＧＲＦレセプターと結合できる能
力は成長ホルモンの放出を許容するカスケードに必須で
ある。従って、ＧＨの放出を阻害又は行わせるいずれか
の物質を開発するには、［ＧＲＦ／ｐＧＲＦレセプタ
ー］複合体の生成を妨害する物質を決定するのが望まし
いであろう。本発明は、ｐＧＲＦレセプターの結合性に
関してｐＧＲＦと競合する物質を発見するのに有用であ
るスクリーニング系（スクリーニング方法）であって、
(a) ｐＧＲＦレセプターを組換え的に製造し、(b) 該
ｐＧＲＦレセプターを［ｐＧＲＦ−ｐＧＲＦレセプタ
ー］複合体の可能性ある（潜在的）インヒビターに暴露
し、(c) ＧＲＦを導入し、(d) 非特異的に結合した分
子を除去し、そして(e) 結合した潜在的インヒビター
及び／又はｐＧＲＦの濃度を定量することを特徴とする
方法を提供する。この方法によって、［ＧＲＦ／ｐＧＲ
Ｆレセプター］複合体の生成のインヒビターを迅速にス
クリーニングすることができる。上記のスクリーニング
系を利用すれば、［ＧＲＦ／ＧＲＦレセプター］の生成
を妨害する化合物を決定する感度の高い迅速な手段が提
供される。このスクリーニング系は、可能性ある治療物
質を効率良く大容量にスクリーニングできるパンデック
ス^R(Pandex^R)［Baxter-DadeDiagnostics］などの自動操
作に適合させることもできる。

【００５９】このようなスクリーニングプロトコールの
操作は以下のようにして行う。ｐＧＲＦレセプターを、
好ましくは組換えＤＮＡ技法を用いて本明細書の別項で
説明しているようにして調製する。試験化合物の試料
を、ｐＧＲＦレセプターを入れた反応容器に入れ、次い
でＧＲＦを加える。非結合分子は洗い流し、ＧＲＦ又は
試験化合物について溶出液を調査する。例えば、本発明
の好ましい方法では、放射活性又は蛍光的に標識したＧ
ＲＦを使用することができる。次いで、溶出液を蛍光又
は放射活性についてスコアー化する。蛍光又は放射活性
の不存在又は減少はＧＲＦ／ｐＧＲＦレセプター複合体
の形成を意味している。これは、試験化合物がＧＲＦ／
ｐＧＲＦレセプター複合体の形成を粉砕しないことを示
している。蛍光又は放射活性の存在は、試験化合物がＧ
ＲＦ／ｐＧＲＦレセプター複合体の形成を粉砕したこと
を示している。同様に、放射活性又は蛍光的標識化試験
化合物は上記と同じ工程で使用することができるが、こ
の場合、得られた結果の解釈は放射活性又は蛍光的標識
化ＧＲＦを使用した場合の逆になる。

【００６０】ｐＧＲＦレセプターは溶液中で遊離の状態
であってもよく、又は固相支持体に結合することができ
る。本発明を好ましく実施するには、ｐＧＲＦレセプタ
ーは固相支持体に結合させる。このような固相支持体の
例としては不溶性の天然又は合成ポリマー、例えば多孔
質膜、ビーズ、微粒子、クロマトグラフィー用樹脂、マ
イクロタイター平板、雲母などが挙げられる。リジン残
基の側鎖を利用し又は他の種々の化学的手段を利用する
など種々の架橋結合方法が当業者に周知であり、それら
をｐＧＲＦレセプターの固相支持体への固定化に使用す
ることができる。

【００６１】上記のスクリーニング方法はｐＧＲＦレセ
プターに競合して結合する化合物を同定するものであ
る。このような化合物がｐＧＲＦレセプターの作用を刺
激し又は阻害する能力を測定するのは、このような化合
物を治療適用のためにさらに開発するうえで必須であ
る。化合物に対するｐＧＲＦレセプターの応答を測定す
る生物活性検定方法が必要であることは明白である。本
発明はこのような生物活性検定であって、(a) ｐＧＲ
Ｆレセプター及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターによって哺乳動物宿主細胞をト
ランスフェクトし、(b) ｐＧＲＦレセプター及びシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡを発現させる条件下で
該宿主細胞を培養し、(c) そのようにしてトランスフ
ェクトした該宿主細胞を試験化合物に暴露し、そして
(d) 該試験化合物に応答する細胞内ｃＡＭＰレベルを
定量することを特徴とする検定を提供する。

【００６２】本発明を好ましく実施するため、本明細書
にて例示しているように、ｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５を含有
する安定な２９３セルライン（本明細書に記載の実施例
に従って製造）を２４ウエル平板内にて全面成長するま
で発育させた。次いで、得られた細胞を、種々の濃度の
試験化合物（１０^-5−１０^-10Ｍ）を含有する溶液中に
て３７℃で約４５分間インキュベートした。溶液を除去
した後、６０％エタノール０．５ml を加え、各ウエル
中の細胞を細胞溶解した。試料を取り出し、減圧下に乾
燥し、ｃＡＭＰレベルを測定した。細胞内ｃＡＭＰレベ
ルの測定は、Ishihara et al., (1991) に記載されてい
る操作によって、Amersham Corporation［2636 South C
learbrook Drive, Arlington Heights, IL 60005］から
市販されているサイクリックＡＭＰ検定キット（カタロ
グ番号ＴＲＫ.４３２)を使用して行った。

【００６３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲の限定を意図するも
のでない。実施例１ブタ下垂体組織からの全ＲＮＡの単離 Sambrook, J., Fritch, E.F.及び Maniatis, T. (1989)
Molecular Cloning,vol 1, p. 7.19 - 7.22 に記載さ
れている操作を以下のように改作した。簡単に説明すれ
ば、４Ｍグアニジン・イソチオシアネート緩衝液２５m
l（１６．７mＭクエン酸ナトリウム、０．５％ラウリル
・サルコシンナトリウム、０．１７％消泡剤Ａ及び０．
７％β−メルカプトエタノール、pＨ７．０）を、５０m
l 滅菌ファルコン(Falcon)チューブ内に入れたブタ下垂
体［Pel-Freez Inc., ARから市販］３．５ｇに加えた。
この組織をティッシュマイザー(tissuemizer)を用いて
高速度で１−２分間ホモジナイズした。得られたホモジ
ナイズ組織を室温にて５分間、５０００×Ｇで遠心し
た。

【００６４】ＳＷ２８ローター用のベックマン遠心管中
に入れた５．７ＭＣsＣl、１６．６Ｍ酢酸ナトリウム
のクッション９．５ml 上に上清を重層した。その材料
を２５，０００rpmで２５時間、２５℃にて遠心した。
上清を除去した後、液体を排出し、チューブの底を切断
した。得られたペレットを室温にて７０％エタノールで
すすぎ、室温で乾燥した。ＲＮＡのペレットを滅菌Ｍil
li-Ｑ^R水に再度溶解した。そのＲＮＡをフェノール抽出
によって精製し、次いでエタノールを加えて沈澱させ
た。得られたペレットを７０％エタノールですすぎ、減
圧下に乾燥した。ブタ下垂体組織３．５ｇから全ＲＮＡ
約４．９mｇが単離された。

【００６５】実施例２全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成ＢＲＬキット（カタログ番号８０２５５Ａ／ＳＢ）をそ
の製造元の教示に従って使用し、以下の操作を行った。
簡単に説明すれば、ブタ下垂体の全ＲＮＡ（１mｇ/ml、
上記の実施例１にて製造したもの１μl）を、１．５ml
容量エッペンドルフチューブ中、５０μＭ無作為ヘキ
サマープライマー（ＧeneＡmp^R ＰＣＲキット番号８０
８−００１７の一部としてPerkin Elmer-Cetusから市販
されている）１μl、及びＭilli-Ｑ^R水１０μl と共に
混合した。得られた混合物を７０℃に１０分間加熱し、
氷上で２分間冷却し、微小遠心器にて１秒間スピンダウ
ンさせた。次いで、５×反応緩衝液（２５０mＭトリス
-ＨＣl pＨ８．３、３７５mＭＫＣl、１５mＭＭgＣ
l₂）４μl、０．１ＭＤＴＴ２μl、ｄＮＴＰ貯蔵液
（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ
１０mＭ、pＨ７．０）１μlを試料に加え、得られた混
合物を３７℃で２分間インキュベートした。Ｍ−ＭＬＶ
逆転写酵素（２００Ｕ／μl、ＢＲＬ）１μl を加え、
反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。得ら
れた混合物を９５℃に５分間加熱し、５分間氷冷し、１
秒間スピンさせた。次いで、実施例３の教示に従い、こ
の無作為プライムｃＤＮＡ反応混合物をＰＣＲ増幅に使
用した。

【００６６】実施例３ＰＣＲ増幅ペルキン・エルマー−セタスＧene Ａmp ＰＣＲ試薬キ
ット［Perkin Elmer-Cetus Corporatin, 761 Main Aven
ue, Norwalk CT 06859-0156から市販されている］を使
用し、そこからの教示に実質的に従って以下の操作を行
った。簡単に説明すれば、滅菌した０．５ml チューブ
中にて、１０×反応緩衝液１０μl、ｄＮＴＰ混合物
（各１．２５mＭ）１６μl、上流プライマー２５pmol、
下流プライマー２５pmol、ｃＤＮＡ反応混合物１μl又
はｃＤＮＡ反応混合物の１：１０希釈物１μl を加え
た。滅菌Ｍilli−Ｑ^R水を加えて最終容量９９μl とし
た。次いで、希釈（１：２又は１：３）したＡmpliＴＡ
ＱＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μl、Perkin Elmer-Cet
usから市販）１μl を加えた。反応混合物を混合し、鉱
油（シグマ・ケミカル,カンパニーから市販）１滴（約
５０μl）を加えた。ＰＣＲは以下の３工程で３０サイ
クル行った： (a) 変性工程、９５℃で３０秒； (b) アニーリング工程、プライマーのＴｍ以下の５℃
−１０℃で１分； (c) ポリマー化工程、７２℃で１分。

【００６７】ＰＣＲ反応混合物１０μl を反応の完了後
に回収し、分析用の６％アクリルアミドゲル又は０．７
％アガロースゲルの電気泳動にかけた。分析したＰＣＲ
産物は以下のオリゴヌクレオチド対が７００bp ｃＤＮ
Ａ断片を与えることを示していた。縮重オリゴヌクレオチドプライマー：５４４０（下流）（配列番号９） 5'-CTGCACCTCACCATTGAGGAAGCAGTA-3'５４４１（上流）（配列番号１０） 5'-TTCCGGAGGCTGCAYTGCACYCGMAACTACAT-3' （ここに、ＹはＣ又はＴであり、ＭはＡ又はＣである）

【００６８】実施例４ＰＣＲ産物のクローニング実施例４.ａ. ７００bp 断片のＰＣＲによる増幅上記の７００bp ｃＤＮＡ断片を先の６％ポリアクリル
アミドゲルで精製した。約７００塩基対のゲルバンドを
切除し、滅菌Ｍilli−Ｑ^R水（約５００μl）中に約５時
間又は室温で一晩浸漬した。鋳型としての浸漬溶液３μ
l、プライマーとしての上記と同じオリゴヌクレオチド
（５４４０及び５４４１）を使用し、別個にＰＣＲ増幅
を上記のＰＣＲ条件と同じ条件によって行った。第２の
ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドゲル上にて電気泳
動した。約７００塩基対に相当するＤＮＡバンドをその
ゲルから切除した。得られたＤＮＡをそのゲルから電気
溶離した（１×ＴＢＥ、５０ボルト／一晩、Ｅpigeneか
ら市販されている装置を使用）。ＤＮＡを沈澱させた
後、そのＤＮＡペレットをＭilli−Ｑ^R水５０μl 中に
再懸濁した。

【００６９】実施例４.ｂ. 平滑末端ＤＮＡ断片の調製１０×キナーゼ緩衝液（５００mＭトリス-ＨＣl pＨ
７．５、１００mＭＭgＣl₂、１００mＭＤＴＴ）５μ
l、１０mＭＡＴＰ５μl、２．５mＭｄＮＴＰ５μl、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μl、ファルマシアか
ら市販）１０μl、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ（１０Ｕ／μ
l、ファルマシア）１μl、及び滅菌水４μl、そして精
製ｃＤＮＡ断片（７００bp）２０μl を１．５ml 容量
エッペンドルフチューブ中で一緒にした。反応混合物を
３７℃で１時間インキュベートした。次いで、６８℃で
１０分間インキュベートすることにより酵素を失活させ
た。

【００７０】実施例４.ｃ. 連結；形質転換１０×キナーゼ緩衝液３μl、１０mＭＡＴＰ１．５μ
l、滅菌水３μl、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）
１μl の存在下、１４℃で一晩、終容量２０μlにて、
ｐＵＣ１８ＤＮＡ（ＳmaＩで線状化した０．１μg）を
平滑末端化ＰＣＲ断片（０．０６μg、７００塩基対）
に連結した。連結混合物をＴＥ緩衝液（pＨ７．４）で
１：５に希釈した。希釈した連結混合物５μl を使用
し、ＤＨ５αコンピーテントな細胞（ＢＲＬから市販）
８０μl を形質転換した。氷上で１時間インキュベート
した後、得られた細胞に４２℃で４５秒間熱ショックを
与え、次いで氷上で１０分間冷却した。Ｓ.Ｏ.Ｃ.培地
（ＢＲＬから市販）８００μl を加え、反応混合物を３
７℃でさらに１時間インキュベートした。２％Ｘガル、
５０μＭＩＰＴＧ及び１００μｇ/ml アンピシリン
（Ａｐ）を含有するＴＹ寒天上に細胞をプレートし、次
いで３７℃で一晩インキュベートした。

【００７１】実施例４.ｄ. ＰＣＲによる形質転換体の
スクリーニングこの平板から１２個の白色コロニーを取り上げ、それを
１００μｇ/ml Ａｐを含有するＴＹ培地３ml に接種
し、３７℃で４時間培養した。１０×ＰＣＲ緩衝液５μ
l、１．２５mＭｄＮＴＰ８μl、１％ゼラチン０．５μ
l、１０％トリトンＸ−１００（０．５μl）、ＤＮＡ配
列： 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' （配列番号３）を有する１５μＭユニバーサル前方向プライマー番号
２９７７（Ｔｍ＝５０℃）１μl、ＤＮＡ配列： 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' （配列番号４）を有する１５μＭユニバーサル逆方向プライマー（番
号２９７６、Ｔｍ＝５０℃）、及び滅菌水２８μl を含
有する溶液に、培養物５μl を加えた。得られた混合物
を９５℃に１５分間加熱し、氷上で素早く冷却した。Ｔ
ＡＱＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μl）（Perkin E
lmer Cetusから市販）１μl 及び鉱油５０μl をその反
応混合物に加えた。ＰＣＲを３０サイクルで行った：９
５℃、１／２分；４０℃、１分；７２℃、１分。得られ
た反応混合物１０μl を６％ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動した。約７００bp サイズのバンドを示すコ
ロニーを候補物質として選択し、それを配列決定分析に
かけた。他のＧプロテインカップリング化レセプターと
の配列相同性に基づき、２つのコロニーがＧ及びＳと同
定された。

【００７２】実施例５ＰＣＲを使用する３２Ｐ−ＤＮＡプローブの調製ＰＣＲを使用し、ブタ下垂体ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするための７００bp ｃＤＮＡハイブリダ
イゼーションプローブを調製し、ｐＧＲＦレセプターｃ
ＤＮＡを単離した。［３２Ｐ］−ｃＤＮＡプローブは以
下のようにして調製した。１０×ＰＣＲ緩衝液４μl、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各０．２mＭ）の混
合物３μl、鋳型プラスミドＤＮＡ（５nｇ／μl）２μ
l、各プライマー４０pmol、^[32P]−α−ｄＣＴＰ（３０
００Ｃi／mmol）、ＴＡＱＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／
μl）１μl、及び滅菌水を含有する反応混合物を加え、
総容量４０μl に調節した。ＰＣＲ増幅を行った後、Ｑ
uick-spinカラム（Ｇ−５０セファデックス^R，ベーリン
ガー・マンハイムから市販）を使用して精製^[32P]ＤＮ
Ａプローブを単離し、遊離の［３２Ｐ］−α−ｄＣＴＰ
を排除した。

【００７３】実施例６ポリＡ＋ＲＮＡの単離ブタ下垂体全ＲＮＡを上記の実施例１の教示に実質的に
従って単離した。Ｑuick Ｐrep^TM ｍＲＮＡ精製キット
(ファルマシア, ニュージャージー, ピスカッタウェイ
から市販)をその製造元の教示Ａ及びＢ操作に実質的に
従って、ポリアデニル化ｍＲＮＡを単離した。得られた
沈降ＲＮＡを２５μl 容量滅菌水中に再度溶解した。１
Ａ₂₆₀吸光単位＝４０μｇ/ml のＲＮＡに関連し、溶出
液中に存在するＲＮＡの濃度は次式に従って計算した：［ＲＮＡ］＝Ａ₂₆₀ × Ｄ × ４０ μg/ml ［ここに、Ｄは最終希釈倍率である］。溶出液のＡ₂₆₀
は、希釈倍率１００で０．４５７８であることが見いだ
されたが、これはＲＮＡ濃度が１８３１μｇ/ml、又は
約１．８μg／μl であることを示している。

【００７４】実施例７ｃＤＮＡの合成及びＬＡＭＢＤＡ（ラムダ）クローニン
グスーパースクリプト^TMラムダシステム［ＧＩＢＣＯ−Ｂ
ＲＬ、ガイセルスバーグＭＤから市販］を使用し、ｃ
ＤＮＡの合成と、使用する単離ポリＡ＋ＲＮＡのクロー
ニングを行った。ポリＡ＋ＲＮＡ１０μgをｃＤＮＡの
合成に使用した。このｃＤＮＡ合成はスーパースクリプ
ト^TMラムダシステムについてのＧＩＢＣＯ−ＢＲＬの指
示書に記載されたプロトコールに実質的に従って行っ
た。ｃＤＮＡのパッケージングは、λパッキングシステ
ム［ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ガイセルスバーグＭＤ、カ
タログ番号８２９４ＳＡ］を用いてその販売元の教示に
実質的に従って行った。

【００７５】実施例８ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングパッケージングｃＤＮＡを含有するファージを、培養Ｙ
１０９０（ｒ~）細胞４ml と混合する。感染したＹ１０
９０（ｒ~）細胞２００μl を、１０mＭＭgＣl₂を含有
する軟ＴＹ寒天８ml に加え、ＴＹ寒天を含む１５０mm
平板上に重層し、３７℃で一晩インキュベートした。２
０個の平板（又は約１，０００，０００ファージ）をス
クリーニングした。平板を４℃で２時間冷蔵した後、Ｈ
ybond−Ｎ^Rナイロン膜に対して持ち上げ、トップ寒天
（上層寒天）が膜に固着しないようにした。ファージを
２分間Ｈybond−Ｎ^Rナイロン膜に移し、次いで持ち上
げ、寒天を介し方向性についてマークした。２回行う場
合は、２番目のフィルターの移動を約７分間行った。持
ち上げた後、変性溶液（１．５ＭＮaＣl、０．５ＭＮ
aＯＨ）中に２分間浸漬することにより、フィルターを
変性した。そのフィルターを中和溶液（１．５ＭＮaＣ
l、０．５Ｍトリス-Ｃl pＨ８．０）に浸漬し、５分間
中和した。得られたフィルターを約３０秒間だけすす
ぎ、次いで０．２Ｍトリス-ＨＣl pＨ７．５、２×Ｓ
ＳＣ中に浸漬した。フィルターをワットマン３ＭＭペー
パー上で風乾し、減圧下に２時間８０℃で焼き固めた。

【００７６】実施例９フィルターのハイブリダイゼーション Hamilton, et al. Nucleic Acids.Research 19:1951-19
52 (1991)に教示に実質的に従って、フィルターハイブ
リダイゼーションを行った。簡単に説明すれば、４０個
のフィルターを、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０
％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハーツ溶液(D
enhardts solution)、１％ＳＤＳ、１００mｇ/ml サケ
精液ＤＮＡ）１００ml を入れたＳeal-a-Ｍeal^Rバッグ
に入れ、４２℃で１時間、前ハイブリダイズした。この
前ハイブリダイズしたフィルターに、上記の実施例５に
記載のようにしてＰＣＲによって製造した³²Ｐ−プロー
ブ（全放射活性１×１０⁹cpm）１００μl を加え、次い
で４２℃で一晩ハイブリダイズした。０．１×ＳＳＰＥ
／０．３％ＳＤＳを用い、振盪下に環境温度にてそのフ
ィルターを３回洗浄した（１回洗浄２０分）。振盪下
に、４７℃にて０．１×ＳＳＰＥ／０．３％ＳＤＳで３
回洗浄した（１回洗浄２０分）。プラスチックフィルム
上にフィルターを載せ、−８０℃にて一晩、強化スクリ
ーンを用いてオートラジオグラフを取った。

【００７７】実施例１０液状細胞溶解物の作成宿主細菌（Ｙ１０９０(ｒ~)）を対数増殖期まで一晩成
育させ、１０⁵−１０⁸ファージ／ml で感染させた。フ
ァージが吸着した後、感染Ｅ.coli 培養物をリッチ・メ
ディウム(豊富培地)中で希釈し、細胞が細胞溶解するま
で激しく振盪した。残っている生存細胞をクロロホルム
で細胞溶解した。細胞残骸を低速度遠心によって除去し
た。Ｅ.coli のλ感受性株の一晩培養物をＬＢ培地中、
３７℃で発育させた。λ感受性株は細胞溶解の成長を支
持する。これは、λ細胞溶解物１０μl を細菌の芝にス
ポットすることによって試験することができる。菌株が
λ感受性であれば、ファージがスポットされた場所でプ
ラーク（溶菌斑）が形成される。滅菌したつま楊枝又は
毛細チューブ（キャピラリーチューブ）を用い、単一の
プラークを取り上げ、λ希釈緩衝液０．４ml を含有す
るチューブ中に撒き、４℃で２時間放置してファージを
溶離できるようにした。あるいは、液状細胞溶解物又は
平板ストックから得られる１０⁵−１０⁸ファージを使用
してもよい。

【００７８】溶離したファージ１００μl を飽和培養物
１００μl 及び１０mＭＭgＣl₂／１０mＭＣaＣl₂溶液
１００μl と混合し、水浴中、３７℃で１５分間インキ
ュベートした。Ｍｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺と共にインキュベート
し、ファージが細菌に吸着できるようにした。この溶液
をＮＺＣ培地５０ml に移し、細胞溶解が起こるまで３
７℃で激しく振盪した（約６−８時間）。高い収量のた
めには良好な通気が重要である。この培養物は、６時間
後に頻繁にチェックすべきであり、清澄化すると即座に
収穫する。クロロホルムを数滴加え、残りの細胞を細胞
溶解し、得られた溶液をＣorex^R又はＮalgene^R遠心管に
注意して移し（クロロホルムがあとに残るように注意す
る）、ベックマンＪＡ−２０ローターにて１０，０００
rpmで１０分間スピンさせ、細胞残骸をペレット化し
た。要求されるだけ多くの細胞溶解物を貯蔵しておく。
得られた溶液をねじ巻き栓チューブに移し、それにクロ
ロホルムを数滴加え、得られた溶液を手短に旋回させ、
４℃で保存した。ファージの力価は CurrentProtocols
in Molecular Biology, 及び補稿, Ausubel, et al 編,
(1989 及び補稿) John Wiley and Sons, NY. Unit 1.11
に記載されているようにして測定すべきである。

【００７９】実施例１１ファージＤＮＡの単離及びｃＤＮＡのプラスミドｐＳＰ
ＯＲＴ１へのクローン以下のプロトコールを使用し、制限分析に使用するため
の少量のＤＮＡを作成した。ファージを遠心によって濃
縮し、そのキャプシドをフェノールで破壊する。次い
で、ＤＮＡをエタノール沈澱する。以下の追加材料を本
実施例及び以後の実施例にて使用した：・５mｇ/ml ＤＮアーゼ（Current Protocols in Molecu
lar Biology, 及び補稿, Ausubel, et al 編,(1989 及
び補稿) John Wiley and Sons, NY. Unit 3.12に記載さ
れている）・１０mｇ/ml ＤＮアーゼ不含ＲＮアーゼ（Current Pro
tocols in MolecularBiology, 前掲 Unit 3.13に記載さ
れている）・０．０５Ｍトリス-Ｃl pＨ８．０・３Ｍ酢酸ナトリウム、pＨ４．８になるまで酢酸を加
えている。

【００８０】液状ファージ溶解物［Current Protocols
in Molecular Biology, 前掲 Unit1.12］約５０ml に５
mｇ/ml ＤＮアーゼ１０ml 及び１０mｇ/ml ＤＮアーゼ
不含ＲＮアーゼ２５ml を加え、得られた反応混合物を
３７℃で１時間インキュベートし、細胞溶解の際に放出
される細菌ＤＮＡ及びＲＮＡを分解した。この混合物の
粘度は減少するはずである。得られた反応混合物をＳＷ
−２８ローター（１３２，０００×Ｇ）にて２７，００
０rpmで１．５時間遠心した（４℃）。あるいは、ＪＡ
−２０ローターにおける２０，０００rpm（４８，００
０×Ｇ）の４℃、２時間１５分のスピンによってファー
ジをペレット化することもできる。

【００８１】０．０５Ｍトリス-Ｃl pＨ８．０（２０
０μl）にファージペレットを再懸濁する。そのチュー
ブを反転させると、小さな半透明のペレットは視覚化さ
れた。その溶液を微小遠心管に移し、緩衝化フェノール
２００μl を加え、２０分間旋回、又は微小遠心管振盪
器によって２０分間振盪させる。そのチューブを微小遠
心器で２分間スピンさせ、水性（トップ）層を保存して
おく。フェノール抽出を繰り返した。フェノールはファ
ージキャプシドを変性し、ＤＮＡを放出させる。この変
性キャプシドのタンパク質はフェノール／水の境界にお
いて厚い白色沈澱物のようであった。そのペレットを懸
濁するには激しい撹拌が必要であった。２回目のフェノ
ール抽出後では、白色沈澱物は少なくなるはずである。
依然として境界に大量にある場合は、３回目の抽出を行
う。

【００８２】クロロホルム２００μl を加え、得られた
混合物を充分に振盪させ、微小遠心器にて手短にスピン
させた。水性（トップ）層を保存し、この工程を繰り返
した。３Ｍ酢酸ナトリウム、pＨ４．８（２０μl）を
加え、２容量の１００％エタノールを室温で用いてＤＮ
Ａを沈澱させた。この混合物を微小遠心器で１０分間ス
ピンさせ、上清を廃棄した。得られたペレットを７０％
エタノール１ml で洗浄した。ペレットを減圧下に乾燥
し、得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液pＨ８．０（２５μl）
中に再懸濁した。ファージＤＮＡをＴＥ緩衝液２５μ
l、１０×高塩緩衝液（ベーリンガー・マンハイム）５
μl、水１６μl、ＮotＩ（１０Ｕ／μl ベーリンガー・
マンハイム）２μl、及びＳalＩ（１０Ｕ／μl ベーリ
ンガー・マンハイム）２μl 中に再懸濁した。得られた
消化混合物を３７℃で２時間インキュベートした。消化
混合物５０μl を１％低融点アガロースゲルにかけた。
１．６kb ｃＤＮＡ断片を切除し、６５℃で融解した。
次いで、以下の操作に従い、このｃＤＮＡ断片を線状化
プラスミドｐＳＰＯＲＴ１に連結した。

【００８３】プラスミドｐＳＰＯＲＴ１は、方向づけさ
れたｃＤＮＡのクローニング、インビトロ転写及びジデ
オキシ配列決定のための多機能性発現ベクターである。
このベクターはＧibco ＢＲＬ，ガイセルスバーブＭＤ
から市販されている。ＮotＩ−ＳalＩ線状化ｐＳＰＯＲ
Ｔ１（２０μl、１μg）に１．６kb ｃＤＮＡ断片３０
μl、１０×キナーゼ緩衝液６μl、１０mＭＡＴＰ pＨ
７．０及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１μl／μl ＢＲＬ）
２μl を加えた。得られた混合物を１４℃で一晩インキ
ュベートした。連結混合物を６５℃で１０分間融解し
た。融解した連結混合物５０μl を氷上のコンピーテン
トなＤＨ５α細胞２００μl に加え、氷上で３０分イン
キュベートした。ＴＹブロス１ml を加え、振盪しなが
ら３７℃で１時間インキュベートした。ＴＹブロス中の
形質転換細胞をＴＹ−Ａｐ（１００μｇ/ml Ａｐ）寒天
上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。

【００８４】実施例１２大規模なプラスミドの調製実施例１１にて調製した平板から３つのコロニーを取り
上げ、それを使用し、ｃＤＮＡ断片を含有するプラスミ
ドｐＳＰＯＲＴ１を大量に調製した。この大規模なプラ
スミドは、Sambrook, J., Fritch, E.F.及び Maniatis,
T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l, コールド・スプリング・ハーバー(1989)の教示に実
質的に従って調製した。プラスミドｐＳＰＯＲＴ１にク
ローンしたｃＤＮＡの配列分析により、このｃＤＮＡは
４５１アミノ酸の推定ＧＲＦレセプターをコードしてい
ることが示された。このプラスミドをｐＳＰＯＲＴ−Ｇ
５と命名した。

【００８５】実施例１３Ｇ５ｃＤＮＡ断片のｐＲＣ／ＣＭＶベクターへのクロー
ニング実施例１３.a. ＨindIII及びＮotＩによるプラスミド
ＰＲＣ／ＣＭＶの消化プラスミドＰＲＣ／ＣＭＶ［インビトロゲン(inbitorog
en)］２２μl（２６μg）を、１０×Ｍ緩衝液（ベーリ
ンガー・マンハイム）３μl中、３７℃で１．５時間Ｈi
ndIII（１０Ｕ／μl）５μl によって消化した。次い
で、１Ｍトリス-ＨＣl pＨ７．５（１．３μl）、１．
５ＭＮaＣl １μl、１０×Ｍ緩衝液０．５μl、及びＮ
otＩ（１０Ｕ／μl）５μl を加えた。得られた混合物
を３７℃で１．５時間インキュベートした。この反応混
合物を０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、１つの
バンド（５．４kb）を観察した。５．４kb バンドを切
断し、スピン−バンドＤＮＡ抽出ユニット（ＦＭＣ）を
用いてベクターＤＮＡの精製を行った。

【００８６】実施例１３.b. Ｇ５ｃＤＮＡ断片の調製出発プラスミドｐＳＰＯＲＴ−Ｇ５（ＧＲＦレセプター
ｃＤＮＡのためのプラスミド）３０μgをＳalＩ緩衝液
５０μl 中にて、３７℃で２時間、ＳalＩ酵素５０単位
で消化した。７０℃に１０分間加熱し、その酵素を失活
させた。１０×ニックトランスレーション緩衝液２０μ
l、２．５mＭｄＮＴＰ１．６μl、滅菌水１０４μl、
クレノー酵素（２Ｕ／μl、ベーリンガー・マンハイ
ム）１０μlを加え、得られた混合物を室温にて３０分
間インキュベートした。この反応混合物を７０℃に１０
分間加熱し、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽
出した。エタノールでＤＮＡを沈澱させ、滅菌水３５μ
l 中に再懸濁した。

【００８７】このＤＮＡ溶液３５μl に、１０×キナー
ゼ緩衝液５μl、１０mＭＡＴＰ２．５μl、ＨindIIIリ
ンカー（１μg／μl、ニュー・イングランド・バイオラ
ブス）５μl、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μl、
Ｇibco−ＢＲＬ）２μl を加え、１６℃にて一晩インキ
ュベートした。得られた反応混合物をフェノール：クロ
ロホルム（１：１）で再び抽出し、エタノールでＤＮＡ
を沈澱させた。ＤＮＡペレットを滅菌水６０μl に再度
溶解した。上記のＤＮＡ溶液６０μl を１０×Ｍ緩衝液
１０μl 及びＨindIII（１０Ｕ／μl、ベーリンガー・
マンハイム）３０μl に加え、得られた混合物を３７℃
で２時間インキュベートした。次いで、トリス-ＨＣl p
Ｈ７．５（４μl）、３ＭＮaＣl １．６μl、１０×Ｈ
緩衝液１μl、及びＮotＩ（１０Ｕ／μl、ベーリンガー
・マンハイム）５μl を加え、得られた反応混合物を３
７℃にてさらに２時間インキュベートした。この反応混
合物を７０℃に１０分間加熱し、酵素を失活させた。次
いで、ＤＮＡを０．７％アガロースゲルで電気泳動し
た。得られたゲルから１．６kb ｃＤＮＡバンドを切除
し、それをスピン・バンドＤＮＡ抽出ユニット（ＦＭＣ
コーポレーション）を用いて精製した。

【００８８】実施例１３.c. 連結及び形質転換ＮotＩ−ＨindIII線状化ｐＲＣ／ＣＭＶベクターＤＮＡ
（実施例１３.a.）及び１．６kb ｃＤＮＡ断片（実施例
１３.b.）を、１×キナーゼ緩衝液、０．５mＭＡＴ
Ｐ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇibco−ＢＲＬ）の存
在下、１６℃にて一晩連結した。次いで、得られた連結
混合物をＤＨ５αコンピーテントな細胞（ＢＲＬ）に導
入した。

【００８９】実施例１３.d. ＰＣＲを使用する形質転
換体のスクリーニングＴＹ／Ａｐ平板（１００μｇ/ml Ａｐ）から得られる９
個の形質転換体を取り上げ、それをＴＹ／Ａｐ培地２ml
に移し、３７℃で３時間インキュベートした。各細胞
培養物２μl を鋳型として使用した。以下のＤＮＡ配
列： 5'-CCCACTGCTTAACTGGCTTA-3' （配列番号５）を有するオリゴヌクレオチド番号６１１０をユニバーサ
ル上流プライマーとして、また以下の配列： 5'-AGAAGGGTTGACTTGGAGAG-3' （配列番号６）を有するオリゴヌクレオチド番号５６０１をＧ５の内部
下流プライマーとして使用した。６％ＰＡＧＥを行い、
ＰＣＲ産物のチェックを行った。１．２kb のバンドは
ＰＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５の陽性候補物を示している。９個
の形質転換体のうち６個がｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５の陽性
候補物であった。

【００９０】実施例１４ｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５の特性化実施例４.a. 消化ｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５はＧ５挿入断片中に唯一のＢstＸ
Ｉ部位を含有している。２つのｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５陽
性候補物を５５℃にて２時間ＢstＸＩ（Ｂiolabs）で消
化し、７kb の単一のバンドをアガロースゲル上に観察
した。次いで、これら２つのＰＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５候補
物をＨindIII／ＮotＩ酵素（ベーリンガー・マンハイ
ム）を用いて消化した。ＰＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５候補物は
共に、ベクターＤＮＡの５．３kb 断片及び挿入ＤＮＡ
の１．６kb 断片を産生した。実施例４.b. 挿入体及びベクター間の境界領域の配列
決定ｐＲＣ／ＣＭＶベクタープラスミドのユニバーサルプラ
イマーを使用し、２つのｐＲＣ／ＣＭＶ−５候補物の挿
入体及びベクター間の境界領域の配列決定を行った［Ｕ
ＳＢシークエナーゼバージョン２．０ＤＮＡ配列決定キ
ット］。配列決定データはこれら２つのｐＲＣ／ＣＭＶ
−Ｇ５が正しいｐＧＲＦレセプター配列を有しているこ
とを示した。

【００９１】実施例１５ＣＯＳＩ細胞におけるＧ５の一時的発現３つのプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５及びｐＲＣ／
ＣＭＶをＣＯＳＩ細胞のトランスフェクトに使用した。
Ｔ７５フラスコ内の１０％子牛胎仔血清及び１×ペニシ
リン−ストレプトマイシンを含有するＥＦ１０培地［Ｄ
ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグルの必須培地(Dulbecco
modified Eagle's essential medium)、ＢＲＬ）］２０
ml 中、ＣＯＳＩ細胞（ＳＶ４０形質転換アフリカミド
リザル腎）を３７℃、５％ＣＯ₂にて発育させ、細胞が
フラスコ表面の４０％を覆うようにした。５つのフラス
コ細胞をトリプシン処理した。これらを一緒にし、細胞
を１２個の滅菌皿（１０cm）に写した（１皿当たり１−
２×１０⁶細胞）。各皿には、ＥＦ１０培地１０ml を入
れておいた。３７℃、５％ＣＯ₂にて一晩、細胞をイン
キュベートした。

【００９２】５ml 透明チューブ（Ｆalcon ２０５４）
中にて、プラスミドＤＮＡ（ｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐＲＣ／
ＣＭＶ−Ｇ５）２５μgを、２×ＨＢＳ緩衝液（２８０m
ＭＮaＣl、１０mＭＫＣl、１．５mＭＮa₂ＨＰＯ₄・２
Ｈ₂Ｏ、１２mＭデキストロース、５０mＭＨＥＰＥ
Ｓ、pＨ７．０５）５００μl を含有する滅菌水４５０
μl 中で混合した。次いで、このＤＮＡ溶液に２．５Ｍ
ＣaＣl₂５０μl を滴加した。チューブを数回軽くたた
いた。得られた混合物を室温にて２０分間インキュベー
トすると、その混合物は濁ってきた（ミルク状）。ＤＮ
Ａが沈澱する間、２×ペニシリン−ストレプトマイシン
を含有するＰＢＳ７ml で細胞を洗浄した。細胞にＥＦ
１０５ml を再度補給した。そのＤＮＡ溶液に細胞をゆ
っくりと加え（滴加）、得られた平板を穏やかに渦巻か
せ、ＤＮＡを分散した。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂にて
５時間インキュベートした。培地を除去し、２×ペニシ
リン−ストレプトマイシン溶液を含有するＰＢＳ１０ml
で１回細胞を洗浄した。２０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液
１ml を加えた。細胞の温度を室温に４５−６０秒間保
ち、次いで可能な限り素早くＤＭＳＯ／ＰＢＳ尾ゆえ基
を除去する。２×ペニシリン−ストレプトマイシンを含
有するＰＢＳ１０ml で速やかに細胞を洗浄した。その
細胞にＥＦ１０培地１２ml を再度補給した。得られた
細胞を３７℃、５％ＣＯ₂にて４８時間インキュベート
した。

【００９３】実施例１６トランスフェクトＣＯＳＩ細胞からの全ＲＮＡの単離プロメガ［Promega］から入手されるＲＮＡ単離キット
をそこに含まれているPromega Technical Bulletin に
実質的に従って使用し、トランスフェクトＣＯＳＩ細胞
から全ＲＮＡを単離した。３つの細胞平板を使用して全
ＲＮＡを単離した。細胞培養培地を除去した。氷冷滅菌
ＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した。前もって冷却した変性
溶液（ＣＢＳ(クエン酸塩／サルコシン／β−メルカプ
トエタノール)緩衝液３３ml に溶解したグアナジウム・
チオシアネート２５ｇ）８ml を使用し、３つの平板細
胞を細胞溶解した。得られた細胞溶解物を５０ml 容量
プラスチック製遠心管に移した。この細胞培養物に２Ｍ
ＮaＯＡc（pＨ４．０）０．８ml を加え、反転によっ
て充分に混合した。次いで、フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール８ml を加え、得られた懸濁
液を反転によって混合し、１０秒間旋回させ、次いで氷
上にて１５分間冷却した。この懸濁液を４℃で２０分間
遠心した（７０００rpm）。ＲＮＡを含有する上層の水
層を新しい５０ml容量チューブに移した。同量のイソア
ミルアルコールをそのＲＮＡ溶液に加えた。−２０℃で
一晩沈澱させ、ＲＮＡをペレット化した。得られたペレ
ットを氷冷７５％エタノールで洗浄し、減圧下に乾燥
し、滅菌水１００μl に溶解した。

【００９４】実施例１７ノーザンブロット分析１７％ホルムアルデヒド及び１×ＭＯＰＳを含有する
１．１％アガロースゲルを調製した。ＲＮＡ試料は全Ｒ
ＮＡ２５μg、５０％ホルムアミド、１７％ホルムアル
デヒド、１×ＭＯＰＳ、１×色素及び臭化エチジウム
（ＥｔＢｒ）１μgを含有している。試料を６５℃で１
５分間加熱した。氷上で２分間冷却した。１×ＭＯＰＳ
緩衝液中のＲＮＡゲルに１００ボルトを３時間かけた。
そのゲルの写真をＵＶ下にとった後、蒸留水で１回その
ゲルをすすいだ。得られたゲルを室温にて１０分間２
回、２０×ＳＳＣ中に浸漬した。変性ＲＮＡをナイロン
膜（Ｈybond−Ｎ）に一晩移した。ブロッティングした
後、フィルター上のゲル溝の位置に印を付けた。そのフ
ィルターを室温にて６×ＳＳＣ中に５分間浸漬した。ス
トラタリンカー^R(Stratalinker^R)ＵＶクロスリンカー
［Stratagene, 11099 NorthTorrey Pines Road, LaJol
la CA 92037］を使用し、ＲＮＡをナイロン膜に固定化
し、そのフィルターを風乾し、それをハイブリダイゼー
ション緩衝液（１mＭＥＤＴＡ, ０．５ＭＮaＨ₂ＰＯ₄,
pＨ７．２, ７％ＳＤＳ）を含むプラスチック製バッ
クに入れ、振盪下に６５℃で２時間、前ハイブリダイズ
した。溶液を除去し、ハイブリダイゼーション緩衝液１
５ml 及び１−２×１０⁸cpmの^[32P]−ＤＮＡプローブ
（ＰＣＲ）を新たに加え、振盪下に６５℃でハイブリダ
イズした。得られたフィルターを６５℃にて、１mＭＥ
ＤＴＡ、４０ mＭＮaＨ₂ＰＯ₄（pＨ７．２）、１％Ｓ
ＤＳを含有する溶液２００ml 中で１時間２回洗浄し
た。強化スクリーンを適当な時間用いて−７０℃で、又
は室温にて、得られたフィルターをＸ線フィルム（Ｋod
ak ＸＡＲ５)に暴露した。

【００９５】実施例１８２９３細胞におけるＰＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５の一時的発現指数関数的に成育させた２９３細胞をトリプシン処理
し、１×１０⁶細胞／平板で２９３細胞を含有する１０c
m平板に接種し、平板１個当たりＥＦ１０培地１０ml に
て３７℃／５％ＣＯ₂で２時間、その平板をインキュベ
ートした。プラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５及びｐＲＣ
／ＣＭＶをトランスフェクションに使用した。ＤＮＡ２
０μgを滅菌Ｍilli−Ｑ水で４５０μl にまで希釈し
た。２．５ＭＣaＣl₂５０μl、２×ＢＢＳ緩衝液
（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）２−アミノ−
エタンスルホン酸及び緩衝化食塩水、pＨ６．９５）５
００μl を加え、穏やかに混合した。この混合物を室温
にて２０分間インキュベートした。得られたミルク状沈
澱物を穏やかに混合し、その沈澱物１ml を培地にゆっ
くりと加え、得られた平板を穏やかに渦巻かせ、ＤＮＡ
沈澱物を均一に分散させた。その平板を３７℃／５％Ｃ
Ｏ₂にて４２時間インキュベートした。これらの細胞を
２つの６ウエル平板に分けた。各ウエルには約１０⁶個
の細胞が含有されている。この細胞培養物を３７℃／５
％ＣＯ₂にて２４時間インキュベートした。

【００９６】実施例１９安定にトランスフェクトされた２９３細胞におけるｐＧ
ＲＦレセプターの発現ＳalＩ及びＮotＩ末端を含有する完全長のＧＨＲＨレセ
プターｃＤＮＡ（Ｇ５）の５'末端（ＳalＩ末端）をＨi
ndIIIリンカー（実施例１３.b.）の添加によって改変し
た。次いで、ｃＤＮＡを唯一のＨindIII及びＮotＩ部位
でｐＲＣ／ＣＭＶベクターに連結し、レセプター発現ベ
クターであるｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５（実施例１３.c.）
を作成した。次に、ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５をリ
ン酸カルシウム同時沈降法（実施例１８）によって２９
３細胞にトランスフェクトした。得られた細胞を３−４
日間発育させ、次いでGeneticin（Ｇ−４１８）を濃度
３００μｇ/ml で培地に加え、永続的にトランスフェク
トされたクローンを選択した。２−３週後、４８個のク
ローンを選択し、増殖させ、細胞質ドットハイブリダイ
ゼーション操作(cytoplasmic dot hybridization proce
dure)［White及びBancroft 1982］によってレセプター
発現に関して検定した。レセプターを発現する１０個の
クローンを細胞内ｃＡＭＰ蓄積の分析によって選択し
た。ＧＨＲＨのチャレンジに対応する最も高いｃＡＭＰ
の蓄積を示すクローン（２９３／Ｇ５−１２）を樹立さ
せ、それをクローン化レセプターの機能及び結合特性の
試験に使用した。

【００９７】実施例２０ｃＡＭＰ検定 Ishiharaら(1991)に記載されている操作に実質的に従
い、サイクリックＡＭＰ検定キット（カタログ番号ＴＲ
Ｋ４３２）［Amersham Corporation 2636 SouthClearkb
rook Drive, Arlington Heights, IL 60005 から入手］
を用いて細胞内ｃＡＭＰレベルを検定した。簡単に説明
すれば、ｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇ５を含有する安定な２９３
セルラインを２４ウエル平板中にて全面成長するまで発
育させる。細胞をインキュベーション緩衝液［０．５m
Ｍ１−メチル−３−イソブチルキサンチン及び１mｇ/m
l ＢＳＡを含有するDulbecco's 改変 Eagle's 培地］で
２回洗浄した。次いで、その細胞を、種々の濃度のペプ
チド（１０^-5−１０^-10Ｍ）を含有する緩衝液（０．５m
l）中にて３７℃で４５分間インキュベートした。緩衝
液を除去した後、６０％エタノール０．５ml を加え、
各ウエル中の細胞を細胞溶解した。試料１０μl を取
り、減圧乾燥し、サイクリックＡＭＰ検定キット［Amer
sham カタログ番号ＴＲＫ４３２］を用いてｃＡＭＰの
レベルを測定した。

【００９８】実施例２１ ¹²⁵Ｉ−ＧＲＦと２９３／Ｇ５−１２細胞との結合性４８ウエル平板の２９３／Ｇ５−１２の単層培養物にて
結合検定を行った。ウエルはポリ−Ｄ−リジンで前もっ
て被覆しておき、表面への細胞結合性を増大させてお
く。３００μｇ/ml ジェンチシン（Ｇ４１８）を含有す
るＥＦ１０培養培地中において、ＧＲＦレセプターを発
現する２９３／Ｇ５−１２細胞を全面成長させた。次い
で、全面成長した細胞（約１０⁵細胞／ウエル）をコー
ルドレセプター検定緩衝液（０．１％プロテアーゼ不含
ＢＳＡを含有するＨepes緩衝化食塩水）を用いて２回洗
浄した。次いで、インキュベーション緩衝液中、０．１
２５nＭ ^[125]Ｉ−ＧＲＦを使用し、また３つの非標識
化ホルモン競合物質（ブタＧＲＦ、ＶＩＰ及びセクレチ
ン）を種々の濃度で用い、放射レセプター検定を３回行
った。４℃にてインキュベーションを４５−６０分行
い、細胞をハンクスのバランス塩溶液(Hank's Balanced
Salt solution)によって３回洗浄した。次いで、各ウ
エルについて０．５ＮＮaＯＨ０．５ml を用いて細胞
を細胞溶解した後、細胞に結合した^[125]Ｉ−ＧＲＦを
ガンマカウンターによって測定した。

【００９９】実施例２２Ｇ３ｐＧＲＦレセプターイソ型の単離配列番号１２及び配列番号１１にそれぞれ示しているア
ミノ酸及びＤＮＡ配列であるＧ３と命名したｐＧＲＦを
実施例１から実施例１９までの記載に実質的に従って単
離した。Ｇ３レセプターが安定に形質転換された２９３
細胞（２９３／Ｇ３−１２と命名）に発現されるか否か
を、実施例１９の教示に実質的に従って決定した。表５
に示しているようなアデニル酸シクラーゼの活性化に対
するＧ３レセプターの応答性を、実施例２０に記載して
いる検定操作によって測定した。

【０１００】

【配列表】

【０１０１】配列番号：1 配列の長さ：1356 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1356 配列 ATG GAC AGC GGG GTG TGG GCT GCC TGC ATC TTC TGC CTG CTG AGC TCC 48 Met Asp Ser Gly Val Trp Ala Ala Cys Ile Phe Cys Leu Leu Ser Ser 1 5 10 15 CTA CCA GTC GCC TTG GGC CAC GTG CAC CCG GAA TGT GAC TTC ATC ACC 96 Leu Pro Val Ala Leu Gly His Val His Pro Glu Cys Asp Phe Ile Thr 20 25 30 CAG CTG AGA GAA GAC GAG CGA ACT TGT CTA CAA GCA GCA GAC CGG ATG 144 Gln Leu Arg Glu Asp Glu Arg Thr Cys Leu Gln Ala Ala Asp Arg Met 35 40 45 GCC AAC TCC TCC TCG GGC TGT CCT AGG ACC TGG GAT GGG CTG TTG TGC 192 Ala Asn Ser Ser Ser Gly Cys Pro Arg Thr Trp Asp Gly Leu Leu Cys 50 55 60 TGG CCG ACG GCA GGC CCT GGG GAG TGG GTG ACC CTC CCC TGC CCG GCT 240 Trp Pro Thr Ala Gly Pro Gly Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Pro Ala 65 70 75 80 TTC TTC TCT CAC TTC AGC TCT GAG CCA GGG GCC CTG AAG CGG GAC TGC 288 Phe Phe Ser His Phe Ser Ser Glu Pro Gly Ala Leu Lys Arg Asp Cys 85 90 95 ACC ACC ACG GGC TGG TCT GAG CCC TTC CCG CCA TAT CCC GAG GCT TGC 336 Thr Thr Thr Gly Trp Ser Glu Pro Phe Pro Pro Tyr Pro Glu Ala Cys 100 105 110 CCT GTG CCC CTG GAG CTG CTG ACT GAT GAG AAA TCC TAC TTC TCC ACT 384 Pro Val Pro Leu Glu Leu Leu Thr Asp Glu Lys Ser Tyr Phe Ser Thr 115 120 125 GTG AGA ATC GTC TAC ACC ACG GGC CAC AGC GTC TCT GCC GTG GCC CTC 432 Val Arg Ile Val Tyr Thr Thr Gly His Ser Val Ser Ala Val Ala Leu 130 135 140 TTC GTG GCC ATC GCC ATC CTG GTT GCT CTC AGG AGG CTC CAC TGC CCC 480 Phe Val Ala Ile Ala Ile Leu Val Ala Leu Arg Arg Leu His Cys Pro 145 150 155 160 AGG AAC TAC ATC CAC AGC CAG CTG TTC GCC ACC TTT ATC CTC AAG GCG 528 Arg Asn Tyr Ile His Ser Gln Leu Phe Ala Thr Phe Ile Leu Lys Ala 165 170 175 GGA GCT GTG TTC TTG AAA GAC GCC GCC CTC TTT CAC AGC GAG AAC ACG 576 Gly Ala Val Phe Leu Lys Asp Ala Ala Leu Phe His Ser Glu Asn Thr 180 185 190 GAC CAC TGC AGC TTC TCC ACG GTT CTG TGC AAG GTC TCT GTG GCC ACC 624 Asp His Cys Ser Phe Ser Thr Val Leu Cys Lys Val Ser Val Ala Thr 195 200 205 TCC CAT TTC GCC ACC ATG ACC AAC TTC AGC TGG CTG CTG GCA GAA GCT 672 Ser His Phe Ala Thr Met Thr Asn Phe Ser Trp Leu Leu Ala Glu Ala 210 215 220 GTC TAC CTG ACC TGC CTC TTG GCC TCT ACG TCA CCC AGC ACG AGG AGG 720 Val Tyr Leu Thr Cys Leu Leu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Thr Arg Arg 225 230 235 240 GCC TTC TGG TGG CTG GTT CTC GCT GGC TGG GGG CTG CCC CTG CTC TTC 768 Ala Phe Trp Trp Leu Val Leu Ala Gly Trp Gly Leu Pro Leu Leu Phe 245 250 255 ACT GGC ACG TGG GTG GGT TGC AAG TTG GCC TTT GAG GAT GTT GCG TGC 816 Thr Gly Thr Trp Val Gly Cys Lys Leu Ala Phe Glu Asp Val Ala Cys 260 265 270 TGG GAC CTG GAC GAC AGC TCC CCC TAC TGG TGG ATC ATC AAA GGG CCC 864 Trp Asp Leu Asp Asp Ser Ser Pro Tyr Trp Trp Ile Ile Lys Gly Pro 275 280 285 ATC GTC CTC TCC GTG GGG GTG AAC TTT GGG CTT TTT CTC AAT ATT ATC 912 Ile Val Leu Ser Val Gly Val Asn Phe Gly Leu Phe Leu Asn Ile Ile 290 295 300 CGC ATC CTG CTG AGG AAA CTG GAG CCA GCT CAG GGC AGC CTC CAC ACC 960 Arg Ile Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro Ala Gln Gly Ser Leu His Thr 305 310 315 320 CAG CCT CAG TAC TGG CGT CTC TCC AAG TCA ACC CTT CTC CTC ATC CCG 1008 Gln Pro Gln Tyr Trp Arg Leu Ser Lys Ser Thr Leu Leu Leu Ile Pro 325 330 335 CTG TTT GGA ATT CAC TAC GTC ATC TTC AAC TTC CTG CCT GAC AGT GCT 1056 Leu Phe Gly Ile His Tyr Val Ile Phe Asn Phe Leu Pro Asp Ser Ala 340 345 350 GGC CTG GGC ATC CGC CTC CCC CTG GAG CTG GGA CTG GGC TCC TTC CAG 1104 Gly Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln 355 360 365 GGC TTC ATT GTT GCC ATC CTG TAC TGC TTC CTC AAC CAA GAG GTG AGG 1152 Gly Phe Ile Val Ala Ile Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Gln Glu Val Arg 370 375 380 ACT GAG ATC TCA CGG AGG TGG CAT GGC CAT GAC CCT GAA CTT CTG CCA 1200 Thr Glu Ile Ser Arg Arg Trp His Gly His Asp Pro Glu Leu Leu Pro 385 390 395 400 GCC TGG AGG ACT CAT GCC AAA TGG GCA AAG CCT TCC CGC TCA AGG GCG 1248 Ala Trp Arg Thr His Ala Lys Trp Ala Lys Pro Ser Arg Ser Arg Ala 405 410 415 AAG GTC AGT GCG TGT TCA CGT GCT GGG TCT TCC CGC CCC CGA GCC CAT 1296 Lys Val Ser Ala Cys Ser Arg Ala Gly Ser Ser Arg Pro Arg Ala His 420 425 430 GGC GAC ACA TAC CCG GGA CTG GAA GTG CCG GGT CAG TGG TTG TGC CTT 1344 Gly Asp Thr Tyr Pro Gly Leu Glu Val Pro Gly Gln Trp Leu Cys Leu 435 440 445 TTC TTG ACG TAG 1356 Phe Leu Thr 450

【０１０２】配列番号：2 配列の長さ：451 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asp Ser Gly Val Trp Ala Ala Cys Ile Phe Cys Leu Leu Ser Ser 1 5 10 15 Leu Pro Val Ala Leu Gly His Val His Pro Glu Cys Asp Phe Ile Thr 20 25 30 Gln Leu Arg Glu Asp Glu Arg Thr Cys Leu Gln Ala Ala Asp Arg Met 35 40 45 Ala Asn Ser Ser Ser Gly Cys Pro Arg Thr Trp Asp Gly Leu Leu Cys 50 55 60 Trp Pro Thr Ala Gly Pro Gly Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Pro Ala 65 70 75 80 Phe Phe Ser His Phe Ser Ser Glu Pro Gly Ala Leu Lys Arg Asp Cys 85 90 95 Thr Thr Thr Gly Trp Ser Glu Pro Phe Pro Pro Tyr Pro Glu Ala Cys 100 105 110 Pro Val Pro Leu Glu Leu Leu Thr Asp Glu Lys Ser Tyr Phe Ser Thr 115 120 125 Val Arg Ile Val Tyr Thr Thr Gly His Ser Val Ser Ala Val Ala Leu 130 135 140 Phe Val Ala Ile Ala Ile Leu Val Ala Leu Arg Arg Leu His Cys Pro 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Ile His Ser Gln Leu Phe Ala Thr Phe Ile Leu Lys Ala 165 170 175 Gly Ala Val Phe Leu Lys Asp Ala Ala Leu Phe His Ser Glu Asn Thr 180 185 190 Asp His Cys Ser Phe Ser Thr Val Leu Cys Lys Val Ser Val Ala Thr 195 200 205 Ser His Phe Ala Thr Met Thr Asn Phe Ser Trp Leu Leu Ala Glu Ala 210 215 220 Val Tyr Leu Thr Cys Leu Leu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Thr Arg Arg 225 230 235 240 Ala Phe Trp Trp Leu Val Leu Ala Gly Trp Gly Leu Pro Leu Leu Phe 245 250 255 Thr Gly Thr Trp Val Gly Cys Lys Leu Ala Phe Glu Asp Val Ala Cys 260 265 270 Trp Asp Leu Asp Asp Ser Ser Pro Tyr Trp Trp Ile Ile Lys Gly Pro 275 280 285 Ile Val Leu Ser Val Gly Val Asn Phe Gly Leu Phe Leu Asn Ile Ile 290 295 300 Arg Ile Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro Ala Gln Gly Ser Leu His Thr 305 310 315 320 Gln Pro Gln Tyr Trp Arg Leu Ser Lys Ser Thr Leu Leu Leu Ile Pro 325 330 335 Leu Phe Gly Ile His Tyr Val Ile Phe Asn Phe Leu Pro Asp Ser Ala 340 345 350 Gly Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln 355 360 365 Gly Phe Ile Val Ala Ile Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Gln Glu Val Arg 370 375 380 Thr Glu Ile Ser Arg Arg Trp His Gly His Asp Pro Glu Leu Leu Pro 385 390 395 400 Ala Trp Arg Thr His Ala Lys Trp Ala Lys Pro Ser Arg Ser Arg Ala 405 410 415 Lys Val Ser Ala Cys Ser Arg Ala Gly Ser Ser Arg Pro Arg Ala His 420 425 430 Gly Asp Thr Tyr Pro Gly Leu Glu Val Pro Gly Gln Trp Leu Cys Leu 435 440 445 Phe Leu Thr 450

【０１０３】配列番号：3 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
１７

【０１０４】配列番号：４配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17

【０１０５】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列 CCCACTGCTT AACTGGCTTA 20

【０１０６】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列 AGAAGGGTTG ACTTGGAGAG 20

【０１０７】配列番号：７配列の長さ：１２９０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1290 配列 CAC GTG CAC CCG GAA TGT GAC TTC ATC ACC CAG CTG AGA GAA GAC GAG 48 His Val His Pro Glu Cys Asp Phe Ile Thr Gln Leu Arg Glu Asp Glu 1 5 10 15 CGA ACT TGT CTA CAA GCA GCA GAC CGG ATG GCC AAC TCC TCC TCG GGC 96 Arg Thr Cys Leu Gln Ala Ala Asp Arg Met Ala Asn Ser Ser Ser Gly 20 25 30 TGT CCT AGG ACC TGG GAT GGG CTG TTG TGC TGG CCG ACG GCA GGC CCT 144 Cys Pro Arg Thr Trp Asp Gly Leu Leu Cys Trp Pro Thr Ala Gly Pro 35 40 45 GGG GAG TGG GTG ACC CTC CCC TGC CCG GCT TTC TTC TCT CAC TTC AGC 192 Gly Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Pro Ala Phe Phe Ser His Phe Ser 50 55 60 TCT GAG CCA GGG GCC CTG AAG CGG GAC TGC ACC ACC ACG GGC TGG TCT 240 Ser Glu Pro Gly Ala Leu Lys Arg Asp Cys Thr Thr Thr Gly Trp Ser 65 70 75 80 GAG CCC TTC CCG CCA TAT CCC GAG GCT TGC CCT GTG CCC CTG GAG CTG 288 Glu Pro Phe Pro Pro Tyr Pro Glu Ala Cys Pro Val Pro Leu Glu Leu 85 90 95 CTG ACT GAT GAG AAA TCC TAC TTC TCC ACT GTG AGA ATC GTC TAC ACC 336 Leu Thr Asp Glu Lys Ser Tyr Phe Ser Thr Val Arg Ile Val Tyr Thr 100 105 110 ACG GGC CAC AGC GTC TCT GCC GTG GCC CTC TTC GTG GCC ATC GCC ATC 384 Thr Gly His Ser Val Ser Ala Val Ala Leu Phe Val Ala Ile Ala Ile 115 120 125 CTG GTT GCT CTC AGG AGG CTC CAC TGC CCC AGG AAC TAC ATC CAC AGC 432 Leu Val Ala Leu Arg Arg Leu His Cys Pro Arg Asn Tyr Ile His Ser 130 135 140 CAG CTG TTC GCC ACC TTT ATC CTC AAG GCG GGA GCT GTG TTC TTG AAA 480 Gln Leu Phe Ala Thr Phe Ile Leu Lys Ala Gly Ala Val Phe Leu Lys 145 150 155 160 GAC GCC GCC CTC TTT CAC AGC GAG AAC ACG GAC CAC TGC AGC TTC TCC 528 Asp Ala Ala Leu Phe His Ser Glu Asn Thr Asp His Cys Ser Phe Ser 165 170 175 ACG GTT CTG TGC AAG GTC TCT GTG GCC ACC TCC CAT TTC GCC ACC ATG 576 Thr Val Leu Cys Lys Val Ser Val Ala Thr Ser His Phe Ala Thr Met 180 185 190 ACC AAC TTC AGC TGG CTG CTG GCA GAA GCT GTC TAC CTG ACC TGC CTC 624 Thr Asn Phe Ser Trp Leu Leu Ala Glu Ala Val Tyr Leu Thr Cys Leu 195 200 205 TTG GCC TCT ACG TCA CCC AGC ACG AGG AGG GCC TTC TGG TGG CTG GTT 672 Leu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Thr Arg Arg Ala Phe Trp Trp Leu Val 210 215 220 CTC GCT GGC TGG GGG CTG CCC CTG CTC TTC ACT GGC ACG TGG GTG GGT 720 Leu Ala Gly Trp Gly Leu Pro Leu Leu Phe Thr Gly Thr Trp Val Gly 225 230 235 240 TGC AAG TTG GCC TTT GAG GAT GTT GCG TGC TGG GAC CTG GAC GAC AGC 768 Cys Lys Leu Ala Phe Glu Asp Val Ala Cys Trp Asp Leu Asp Asp Ser 245 250 255 TCC CCC TAC TGG TGG ATC ATC AAA GGG CCC ATC GTC CTC TCC GTG GGG 816 Ser Pro Tyr Trp Trp Ile Ile Lys Gly Pro Ile Val Leu Ser Val Gly 260 265 270 GTG AAC TTT GGG CTT TTT CTC AAT ATT ATC CGC ATC CTG CTG AGG AAA 864 Val Asn Phe Gly Leu Phe Leu Asn Ile Ile Arg Ile Leu Leu Arg Lys 275 280 285 CTG GAG CCA GCT CAG GGC AGC CTC CAC ACC CAG CCT CAG TAC TGG CGT 912 Leu Glu Pro Ala Gln Gly Ser Leu His Thr Gln Pro Gln Tyr Trp Arg 290 295 300 CTC TCC AAG TCA ACC CTT CTC CTC ATC CCG CTG TTT GGA ATT CAC TAC 960 Leu Ser Lys Ser Thr Leu Leu Leu Ile Pro Leu Phe Gly Ile His Tyr 305 310 315 320 GTC ATC TTC AAC TTC CTG CCT GAC AGT GCT GGC CTG GGC ATC CGC CTC 1008 Val Ile Phe Asn Phe Leu Pro Asp Ser Ala Gly Leu Gly Ile Arg Leu 325 330 335 CCC CTG GAG CTG GGA CTG GGC TCC TTC CAG GGC TTC ATT GTT GCC ATC 1056 Pro Leu Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln Gly Phe Ile Val Ala Ile 340 345 350 CTG TAC TGC TTC CTC AAC CAA GAG GTG AGG ACT GAG ATC TCA CGG AGG 1104 Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Gln Glu Val Arg Thr Glu Ile Ser Arg Arg 355 360 365 TGG CAT GGC CAT GAC CCT GAA CTT CTG CCA GCC TGG AGG ACT CAT GCC 1152 Trp His Gly His Asp Pro Glu Leu Leu Pro Ala Trp Arg Thr His Ala 370 375 380 AAA TGG GCA AAG CCT TCC CGC TCA AGG GCG AAG GTC AGT GCG TGT TCA 1200 Lys Trp Ala Lys Pro Ser Arg Ser Arg Ala Lys Val Ser Ala Cys Ser 385 390 395 400 CGT GCT GGG TCT TCC CGC CCC CGA GCC CAT GGC GAC ACA TAC CCG GGA 1248 Arg Ala Gly Ser Ser Arg Pro Arg Ala His Gly Asp Thr Tyr Pro Gly 405 410 415 CTG GAA GTG CCG GGT CAG TGG TTG TGC CTT TTC TTG ACG TAG 1290 Leu Glu Val Pro Gly Gln Trp Leu Cys Leu Phe Leu Thr 420 425

【０１０８】配列番号：8 配列の長さ：429 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 His Val His Pro Glu Cys Asp Phe Ile Thr Gln Leu Arg Glu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Thr Cys Leu Gln Ala Ala Asp Arg Met Ala Asn Ser Ser Ser Gly 20 25 30 Cys Pro Arg Thr Trp Asp Gly Leu Leu Cys Trp Pro Thr Ala Gly Pro 35 40 45 Gly Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Pro Ala Phe Phe Ser His Phe Ser 50 55 60 Ser Glu Pro Gly Ala Leu Lys Arg Asp Cys Thr Thr Thr Gly Trp Ser 65 70 75 80 Glu Pro Phe Pro Pro Tyr Pro Glu Ala Cys Pro Val Pro Leu Glu Leu 85 90 95 Leu Thr Asp Glu Lys Ser Tyr Phe Ser Thr Val Arg Ile Val Tyr Thr 100 105 110 Thr Gly His Ser Val Ser Ala Val Ala Leu Phe Val Ala Ile Ala Ile 115 120 125 Leu Val Ala Leu Arg Arg Leu His Cys Pro Arg Asn Tyr Ile His Ser 130 135 140 Gln Leu Phe Ala Thr Phe Ile Leu Lys Ala Gly Ala Val Phe Leu Lys 145 150 155 160 Asp Ala Ala Leu Phe His Ser Glu Asn Thr Asp His Cys Ser Phe Ser 165 170 175 Thr Val Leu Cys Lys Val Ser Val Ala Thr Ser His Phe Ala Thr Met 180 185 190 Thr Asn Phe Ser Trp Leu Leu Ala Glu Ala Val Tyr Leu Thr Cys Leu 195 200 205 Leu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Thr Arg Arg Ala Phe Trp Trp Leu Val 210 215 220 Leu Ala Gly Trp Gly Leu Pro Leu Leu Phe Thr Gly Thr Trp Val Gly 225 230 235 240 Cys Lys Leu Ala Phe Glu Asp Val Ala Cys Trp Asp Leu Asp Asp Ser 245 250 255 Ser Pro Tyr Trp Trp Ile Ile Lys Gly Pro Ile Val Leu Ser Val Gly 260 265 270 Val Asn Phe Gly Leu Phe Leu Asn Ile Ile Arg Ile Leu Leu Arg Lys 275 280 285 Leu Glu Pro Ala Gln Gly Ser Leu His Thr Gln Pro Gln Tyr Trp Arg 290 295 300 Leu Ser Lys Ser Thr Leu Leu Leu Ile Pro Leu Phe Gly Ile His Tyr 305 310 315 320 Val Ile Phe Asn Phe Leu Pro Asp Ser Ala Gly Leu Gly Ile Arg Leu 325 330 335 Pro Leu Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln Gly Phe Ile Val Ala Ile 340 345 350 Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Gln Glu Val Arg Thr Glu Ile Ser Arg Arg 355 360 365 Trp His Gly His Asp Pro Glu Leu Leu Pro Ala Trp Arg Thr His Ala 370 375 380 Lys Trp Ala Lys Pro Ser Arg Ser Arg Ala Lys Val Ser Ala Cys Ser 385 390 395 400 Arg Ala Gly Ser Ser Arg Pro Arg Ala His Gly Asp Thr Tyr Pro Gly 405 410 415 Leu Glu Val Pro Gly Gln Trp Leu Cys Leu Phe Leu Thr 420 425

【０１０９】配列番号：9 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列 CTGCACCTCA CCATTGAGGA AGCAGTA 27

【０１１０】配列番号：10 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列 TTCCGGAGGC TGCAYTGCAC YCGMAACTAC AT 32

【０１１１】配列番号：11 配列の長さ：1272 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA (genomic) 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1272 配列ＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣ
ＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣ４８ＭｅｔＡｓｐＳｅｒＧｌｙＶａｌＴｒｐＡｌａＡｌａＣｙｓ
ＩｌｅＰｈｅＣｙｓＬｅｕＬｅｕＳｅｒＳｅｒ１５
１０１５ＣＴＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣ
ＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣ９６ＬｅｕＰｒｏＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｙＨｉｓＶａｌＨｉｓ
ＰｒｏＧｌｕＣｙｓＡｓｐＰｈｅＩｌｅＴｈｒ２０２５
３０ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＡＡＣＴＴＧＴ
ＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＧＡＴＧ１４４ＧｌｎＬｅｕＡｒｇＧｌｕＡｓｐＧｌｕＡｒｇＴｈｒＣｙｓ
ＬｅｕＧｌｎＡｌａＡｌａＡｓｐＡｒｇＭｅｔ３５４０
４５ＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧ
ＡＣＣＴＧＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣ１９２ＡｌａＡｓｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＧｌｙＣｙｓＰｒｏＡｒｇ
ＴｈｒＴｒｐＡｓｐＧｌｙＬｅｕＬｅｕＣｙｓ５０５５
６０ＴＧＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧ
ＧＴＧＡＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴ２４０ＴｒｐＰｒｏＴｈｒＡｌａＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｕＴｒｐ
ＶａｌＴｈｒＬｅｕＰｒｏＣｙｓＰｒｏＡｌａ６５７０
７５８０ＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡ
ＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣ２８８ＰｈｅＰｈｅＳｅｒＨｉｓＰｈｅＳｅｒＳｅｒＧｌｕＰｒｏ
ＧｌｙＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｒｇＡｓｐＣｙｓ８５
９０９５ＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣ
ＣＣＧＣＣＡＴＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＧＣ３３６ＴｈｒＴｈｒＴｈｒＧｌｙＴｒｐＳｅｒＧｌｕＰｒｏＰｈｅ
ＰｒｏＰｒｏＴｙｒＰｒｏＧｌｕＡｌａＣｙｓ１００１０５
１１０ＣＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＴ
ＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴ３８４ＰｒｏＶａｌＰｒｏＬｅｕＧｌｕＬｅｕＬｅｕＴｈｒＡｓｐ
ＧｌｕＬｙｓＳｅｒＴｙｒＰｈｅＳｅｒＴｈｒ１１５１２０
１２５ＧＴＧＡＧＡＡＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＧＧＣＣＡＣ
ＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＣ４３２ＶａｌＡｒｇＩｌｅＶａｌＴｙｒＴｈｒＴｈｒＧｌｙＨｉｓ
ＳｅｒＶａｌＳｅｒＡｌａＶａｌＡｌａＬｅｕ１３０１３５
１４０ＴＴＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴ
ＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣ４８０ＰｈｅＶａｌＡｌａＩｌｅＡｌａＩｌｅＬｅｕＶａｌＡｌａ
ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＨｉｓＣｙｓＰｒｏ１４５１５０
１５５１６０ＡＧＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣ
ＧＣＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＧ５２８ＡｒｇＡｓｎＴｙｒＩｌｅＨｉｓＳｅｒＧｌｎＬｅｕＰｈｅ
ＡｌａＴｈｒＰｈｅＩｌｅＬｅｕＬｙｓＡｌａ１６５
１７０１７５ＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＣＣ
ＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＧ５７６ＧｌｙＡｌａＶａｌＰｈｅＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｌａＡｌａ
ＬｅｕＰｈｅＨｉｓＳｅｒＧｌｕＡｓｎＴｈｒ１８０１８５
１９０ＧＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＧＴＴＣＴＧ
ＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣ６２４ＡｓｐＨｉｓＣｙｓＳｅｒＰｈｅＳｅｒＴｈｒＶａｌＬｅｕ
ＣｙｓＬｙｓＶａｌＳｅｒＶａｌＡｌａＴｈｒ１９５２００
２０５ＴＣＣＣＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣ
ＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴ６７２ＳｅｒＨｉｓＰｈｅＡｌａＴｈｒＭｅｔＴｈｒＡｓｎＰｈｅ
ＳｅｒＴｒｐＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａ２１０２１５
２２０ＧＴＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＴ
ＡＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧ７２０ＶａｌＴｙｒＬｅｕＴｈｒＣｙｓＬｅｕＬｅｕＡｌａＳｅｒ
ＴｈｒＳｅｒＰｒｏＳｅｒＴｈｒＡｒｇＡｒｇ２２５２３０
２３５２４０ＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣ
ＴＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣ７６８ＡｌａＰｈｅＴｒｐＴｒｐＬｅｕＶａｌＬｅｕＡｌａＧｌｙ
ＴｒｐＧｌｙＬｅｕＰｒｏＬｅｕＬｅｕＰｈｅ２４５
２５０２５５ＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＧＴＴＧ
ＧＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＴＧＣ８１６ＴｈｒＧｌｙＴｈｒＴｒｐＶａｌＧｌｙＣｙｓＬｙｓＬｅｕ
ＡｌａＰｈｅＧｌｕＡｓｐＶａｌＡｌａＣｙｓ２６０２６５
２７０ＴＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＣＴＡＣ
ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＧＧＣＣＣ８６４ＴｒｐＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｓｐＳｅｒＳｅｒＰｒｏＴｙｒ
ＴｒｐＴｒｐＩｌｅＩｌｅＬｙｓＧｌｙＰｒｏ２７５２８０
２８５ＡＴＣＧＴＣＣＴＣＴＣＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＡＣＴＴＴ
ＧＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＣ９１２ＩｌｅＶａｌＬｅｕＳｅｒＶａｌＧｌｙＶａｌＡｓｎＰｈｅ
ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＬｅｕＡｓｎＩｌｅＩｌｅ２９０２９５
３００ＣＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡ
ＧＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣ９６０ＡｒｇＩｌｅＬｅｕＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏ
ＡｌａＧｌｎＧｌｙＳｅｒＬｅｕＨｉｓＴｈｒ３０５３１０
３１５３２０ＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＡＡＧ
ＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＡ１００８ＧｌｎＰｒｏＧｌｎＴｙｒＴｒｐＡｒｇＬｅｕＳｅｒＬｙｓ
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ＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴ１０５６ＬｅｕＰｈｅＧｌｙＩｌｅＨｉｓＴｙｒＶａｌＩｌｅＰｈｅ
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ＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧ１１０４ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｒｇＬｅｕＰｒｏＬｅｕＧｌｕ
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ＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧ１１５２ＧｌｙＰｈｅＩｌｅＶａｌＡｌａＩｌｅＬｅｕＴｙｒＣｙｓ
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ＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡ１２００ＴｈｒＧｌｕＩｌｅＳｅｒＡｒｇＡｒｇＴｒｐＨｉｓＧｌｙ
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ＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧ１２４８ＡｌａＴｒｐＡｒｇＴｈｒＨｉｓＡｌａＬｙｓＴｒｐＡｌａ
ＬｙｓＰｒｏＳｅｒＡｒｇＳｅｒＡｒｇＡｌａ４０５
４１０４１５ＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＡＡ
１２７２ＬｙｓＶａｌＬｅｕＴｈｒＴｈｒＶａｌＣｙｓ４２０

【０１１２】配列番号：１２配列の長さ：423 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asp Ser Gly Val Trp Ala Ala Cys Ile Phe Cys Leu Leu Ser Ser 1 5 10 15 Leu Pro Val Ala Leu Gly His Val His Pro Glu Cys Asp Phe Ile Thr 20 25 30 Gln Leu Arg Glu Asp Glu Arg Thr Cys Leu Gln Ala Ala Asp Arg Met 35 40 45 Ala Asn Ser Ser Ser Gly Cys Pro Arg Thr Trp Asp Gly Leu Leu Cys 50 55 60 Trp Pro Thr Ala Gly Pro Gly Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Pro Ala 65 70 75 80 Phe Phe Ser His Phe Ser Ser Glu Pro Gly Ala Leu Lys Arg Asp Cys 85 90 95 Thr Thr Thr Gly Trp Ser Glu Pro Phe Pro Pro Tyr Pro Glu Ala Cys 100 105 110 Pro Val Pro Leu Glu Leu Leu Thr Asp Glu Lys Ser Tyr Phe Ser Thr 115 120 125 Val Arg Ile Val Tyr Thr Thr Gly His Ser Val Ser Ala Val Ala Leu 130 135 140 Phe Val Ala Ile Ala Ile Leu Val Ala Leu Arg Arg Leu His Cys Pro 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Ile His Ser Gln Leu Phe Ala Thr Phe Ile Leu Lys Ala 165 170 175 Gly Ala Val Phe Leu Lys Asp Ala Ala Leu Phe His Ser Glu Asn Thr 180 185 190 Asp His Cys Ser Phe Ser Thr Val Leu Cys Lys Val Ser Val Ala Thr 195 200 205 Ser His Phe Ala Thr Met Thr Asn Phe Ser Trp Leu Leu Ala Glu Ala 210 215 220 Val Tyr Leu Thr Cys Leu Leu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Thr Arg Arg 225 230 235 240 Ala Phe Trp Trp Leu Val Leu Ala Gly Trp Gly Leu Pro Leu Leu Phe 245 250 255 Thr Gly Thr Trp Val Gly Cys Lys Leu Ala Phe Glu Asp Val Ala Cys 260 265 270 Trp Asp Leu Asp Asp Ser Ser Pro Tyr Trp Trp Ile Ile Lys Gly Pro 275 280 285 Ile Val Leu Ser Val Gly Val Asn Phe Gly Leu Phe Leu Asn Ile Ile 290 295 300 Arg Ile Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro Ala Gln Gly Ser Leu His Thr 305 310 315 320 Gln Pro Gln Tyr Trp Arg Leu Ser Lys Ser Thr Leu Leu Leu Ile Pro 325 330 335 Leu Phe Gly Ile His Tyr Val Ile Phe Asn Phe Leu Pro Asp Ser Ala 340 345 350 Gly Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln 355 360 365 Gly Phe Ile Val Ala Ile Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Gln Glu Val Arg 370 375 380 Thr Glu Ile Ser Arg Arg Trp His Gly His Asp Pro Glu Leu Leu Pro 385 390 395 400 Ala Trp Arg Thr His Ala Lys Trp Ala Lys Pro Ser Arg Ser Arg Ala 405 410 415 Lys Val Leu Thr Thr Val Cys 420

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＧＲＦレセプターの結合特異性を示す放射
レセプター検定のグラフである。

【図２】カルシトニン、セクレチン、ＶＩＰ及びｐＧ
ＲＦ（１−４４）ＯＨに応答して２９３／Ｇ５−１２か
ら産生されるｃＡＭＰレベルを示すグラフである。

【図３】プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶの制限部位および
機能地図である。

【図４】ＧＲＦレセプターのハイドロホビシティープ
ロットである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 7823−4Ｂ (72)発明者デニス・ポール・スミスアメリカ合衆国46254インディアナ州インディアナポリス、エデン・コート4622番 (72)発明者シン−ユー・ツァンアメリカ合衆国46227インディアナ州インディアナポリス、カムデン・ストリート 6450番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｐＧＲＦレセプター。
【請求項２】配列番号８のアミノ酸配列を含有する請
求項１に記載のｐＧＲＦレセプター。
【請求項３】配列番号１２のアミノ酸配列を含有する
請求項２に記載のブタＧＲＦレセプター。
【請求項４】請求項１に記載のｐＧＲＦレセプターを
コードするＤＮＡ。
【請求項５】配列番号７の配列を含有する請求項４に
記載のＤＮＡ。
【請求項６】 (a) ｐＧＲＦレセプターをコードする
ＤＮＡを作成し、 (b) ｐＧＲＦレセプターが単独で、又は融合タンパク
質として発現されるに適した手法によってそのＤＮＡを
発現ベクター中に入れ、 (c) その発現ベクターによって適当な宿主細胞を形質
転換し、 (d) 該ＤＮＡが発現される条件下にて該宿主細胞を培
養し、そして(e) 組換え的に生産されたｐＧＲＦレセ
プターを回収することを特徴とするｐＧＲＦレセプター
の組換え的生産方法。
【請求項７】請求項３に記載のＤＮＡを含有する組換
えＤＮＡベクター。
【請求項８】請求項７に記載のベクターによって形質
転換された組換え宿主細胞。
【請求項９】ｐＧＲＦレセプターに結合する物質を発
見するためのスクリーニング方法であって、 (a) 請求項６に記載の方法に従ってｐＧＲＦレセプタ
ーを生産し、 (b) ［ｐＧＲＦ−ｐＧＲＦレセプター］複合体の潜在
的インヒビターに該ｐＧＲＦレセプターを暴露させ、 (c) ｐＧＲＦを導入し、 (d) 非特異的に結合した分子を除去し、そして(e) 潜
在的な結合インヒビター及び／又はｐＧＲＦの濃度を定
量することを特徴とする方法。
【請求項１０】 (a) ｐＧＲＦレセプター及びシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター
によって哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトし、 (b) ｐＧＲＦレセプター及びシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡが発現する条件下にて該宿主細胞を培養
し、 (c) そのようにしてトランスフェクトされた該宿主細
胞を試験化合物に暴露し、そして(d) 該試験化合物に
応答する細胞内ｃＡＭＰレベルを定量することを特徴と
するｐＧＲＦレセプターの生物活性アッセイ方法。
【請求項１１】ｐＧＲＦレセプターをコードするＤＮ
Ａを含有するトランスジェニック動物。