JPH06174711A - 特異的抗体検出のための間接クロマトグラフ抗原サンドイッチ試験およびその装置 - Google Patents
特異的抗体検出のための間接クロマトグラフ抗原サンドイッチ試験およびその装置Info
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- JPH06174711A JPH06174711A JP5221266A JP22126693A JPH06174711A JP H06174711 A JPH06174711 A JP H06174711A JP 5221266 A JP5221266 A JP 5221266A JP 22126693 A JP22126693 A JP 22126693A JP H06174711 A JPH06174711 A JP H06174711A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は試料中の特異的抗体の検出のための
簡単で迅速な単一工程、間接アッセイを提供する。 【構成】 本試験は３ゾーンクロマトグラフ装置を使用
し、ここで３ゾーンとは：ビオチンに結合された抗原を
含むビオチニル化抗原ゾーン；検出粒子に結合された抗
ビオチン抗体を含む検出ゾーン；および、クロマトグラ
フマトリックスに結合された抗原または抗原類似体を含
む捕捉ゾーンである。
簡単で迅速な単一工程、間接アッセイを提供する。 【構成】 本試験は３ゾーンクロマトグラフ装置を使用
し、ここで３ゾーンとは：ビオチンに結合された抗原を
含むビオチニル化抗原ゾーン；検出粒子に結合された抗
ビオチン抗体を含む検出ゾーン；および、クロマトグラ
フマトリックスに結合された抗原または抗原類似体を含
む捕捉ゾーンである。
Description
【０００１】
【従来の技術】イムノアッセイは現在では良く知られた
診断産業の手段である。そのようなアッセイは試験試料
中の被検体の存在を検出するために抗原抗体反応の特異
性を利用している。
診断産業の手段である。そのようなアッセイは試験試料
中の被検体の存在を検出するために抗原抗体反応の特異
性を利用している。
【０００２】標的被検体が抗体である場合、通常、検出
物上に被覆された抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＭのような抗化
学種抗体がアッセイに使用される。この型の検出系はも
し試料中に過剰に非特異的抗体が存在すると特異的また
は非特異的抗体の両方に結合する傾向があるので、単一
工程アッセイに組み込ませることは困難である。一般的
に血清がこのケースにあてはまる。
物上に被覆された抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＭのような抗化
学種抗体がアッセイに使用される。この型の検出系はも
し試料中に過剰に非特異的抗体が存在すると特異的また
は非特異的抗体の両方に結合する傾向があるので、単一
工程アッセイに組み込ませることは困難である。一般的
に血清がこのケースにあてはまる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】感度を改良するため”
サンドイッチ”アッセイにおいて、もし標的抗原が使用
される場合、そのような抗原をアッセイに必要とされる
量まで得るのはしばしば高価および／または困難であ
り、上記の問題を複雑にしている。
サンドイッチ”アッセイにおいて、もし標的抗原が使用
される場合、そのような抗原をアッセイに必要とされる
量まで得るのはしばしば高価および／または困難であ
り、上記の問題を複雑にしている。
【０００４】従って、そのような単一工程アッセイを用
いる別の技術が必要とされている。
いる別の技術が必要とされている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は試料中の特異的
抗体を検出するための簡単で迅速な単一工程アッセイを
提供する。特に、本試験は３ゾーンクロマトグラフ装置
（ここで、３ゾーンとは：ビオチニル化抗原ゾーン；検
出ゾーン；および捕捉ゾーンである）を使用する。
抗体を検出するための簡単で迅速な単一工程アッセイを
提供する。特に、本試験は３ゾーンクロマトグラフ装置
（ここで、３ゾーンとは：ビオチニル化抗原ゾーン；検
出ゾーン；および捕捉ゾーンである）を使用する。
【０００６】ビオチニル化抗原ゾーンはビオチンに結合
された抗原または抗原類似物を含んでいる。このゾーン
は好適には検出粒子に結合された抗ビオチン抗体を含む
検出ゾーンの上流にある。検出ゾーンは順にクロマトグ
ラフマトリックスに結合された抗原または抗原類似物を
含む捕捉ゾーンの上流にある。もしくは、検出ゾーンは
ビオチニル化抗原ゾーンの上流におかれていても良い。
された抗原または抗原類似物を含んでいる。このゾーン
は好適には検出粒子に結合された抗ビオチン抗体を含む
検出ゾーンの上流にある。検出ゾーンは順にクロマトグ
ラフマトリックスに結合された抗原または抗原類似物を
含む捕捉ゾーンの上流にある。もしくは、検出ゾーンは
ビオチニル化抗原ゾーンの上流におかれていても良い。
【０００７】アッセイにおいて、試料はビオチニル化抗
原ゾーンの上流にのせられる。試料は下流の方へ移動し
ビオチニル化抗原に結合するであろうし、それは順に検
出ゾーン中の抗ビオチン／検出粒子に結合するであろ
う、または、別の実施態様においてはこの順序は逆転す
る。これらの複合体は続いて多価特異的抗体が抗原に結
合するであろう捕捉ゾーンへ移動するであろう。このよ
うにして結合された複合体は検出信号により検出でき
る。
原ゾーンの上流にのせられる。試料は下流の方へ移動し
ビオチニル化抗原に結合するであろうし、それは順に検
出ゾーン中の抗ビオチン／検出粒子に結合するであろ
う、または、別の実施態様においてはこの順序は逆転す
る。これらの複合体は続いて多価特異的抗体が抗原に結
合するであろう捕捉ゾーンへ移動するであろう。このよ
うにして結合された複合体は検出信号により検出でき
る。
【０００８】ビオチニル化抗原ゾーンはビオチンと結合
された抗原を含んでいる。結合は本分野では既知の方法
により実施されるが、要求される唯一の基準はそのよう
な方法が抗原またはビオチンが抗体（即ち、抗原に対す
る特異的抗体またはビオチンに対する抗ビオチン抗体）
に結合されないほど抗原またはビオチンの構造に影響を
与えないことである。
された抗原を含んでいる。結合は本分野では既知の方法
により実施されるが、要求される唯一の基準はそのよう
な方法が抗原またはビオチンが抗体（即ち、抗原に対す
る特異的抗体またはビオチンに対する抗ビオチン抗体）
に結合されないほど抗原またはビオチンの構造に影響を
与えないことである。
【０００９】ビオチンに対する抗原の結合の好適な方法
は、抗原上のアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
ビオチンとの反応である。もし、抗原がたった一つのア
ミノ基も含んでいなかったら、アミノ基を導入するよう
に抗原を化学的に処理することが可能であろう。もしく
は、例えば抗原を過ヨウ素酸酸化またはカルボジイミド
処理し、続いてビオチンヒドラジドと反応させる化学的
経路もまた利用できる。
は、抗原上のアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
ビオチンとの反応である。もし、抗原がたった一つのア
ミノ基も含んでいなかったら、アミノ基を導入するよう
に抗原を化学的に処理することが可能であろう。もしく
は、例えば抗原を過ヨウ素酸酸化またはカルボジイミド
処理し、続いてビオチンヒドラジドと反応させる化学的
経路もまた利用できる。
【００１０】ビオチニル化抗原の利用は抗原の検出粒子
への結合の必要性をなくしている。
への結合の必要性をなくしている。
【００１１】好適な実施態様において検出ゾーンは容易
におよび比較的安価に入手できる抗ビオチン抗体で被覆
された検出粒子を含んでいる。真の一工程アッセイの為
には検出は視覚的な読みだしができなければならない
が、他の検出手段（例えば、蛍光、ＵＶ）もまた使用で
き、唯一の基準はその表面に抗原を結合させる能力であ
る。
におよび比較的安価に入手できる抗ビオチン抗体で被覆
された検出粒子を含んでいる。真の一工程アッセイの為
には検出は視覚的な読みだしができなければならない
が、他の検出手段（例えば、蛍光、ＵＶ）もまた使用で
き、唯一の基準はその表面に抗原を結合させる能力であ
る。
【００１２】検出物は粒子状の物質である。有用な粒子
の一つは読みだし物質として色素または他の着色物質を
含むサックである。使用されるサックは天然の赤血球、
赤血球ゴースト、リポソーム（単一膜、しばしば小胞と
称される、または多重膜）、ポリマーマイクロカプセル
（例えば、コアセルベーションまたは表面間重合化で作
製されたもの）などを含む多くの種類のサックを使用で
きるが、それらに制限されるわけではない。着色粒子
（例えば、ラテックスまたは他の重合性粒子）および沈
澱性または不溶性金属、非金属および合金もまた有用で
ある。
の一つは読みだし物質として色素または他の着色物質を
含むサックである。使用されるサックは天然の赤血球、
赤血球ゴースト、リポソーム（単一膜、しばしば小胞と
称される、または多重膜）、ポリマーマイクロカプセル
（例えば、コアセルベーションまたは表面間重合化で作
製されたもの）などを含む多くの種類のサックを使用で
きるが、それらに制限されるわけではない。着色粒子
（例えば、ラテックスまたは他の重合性粒子）および沈
澱性または不溶性金属、非金属および合金もまた有用で
ある。
【００１３】検出粒子の選択の第一の基準は抗ビオチン
抗体と結合できる能力および試験条件下での読みだしが
視覚的に行えることである。
抗体と結合できる能力および試験条件下での読みだしが
視覚的に行えることである。
【００１４】信号発生物質は試験条件下検出可能な信号
を示す任意の物質が可能であるが、好適であるのは目で
見える着色色素またはピグメントである。ＵＶまたは蛍
光発色性の他の色素もまた使用できるが、特別の装置の
使用を必要とするため検出が複雑になる。最も好適な検
出粒子は着色ラテックスである。
を示す任意の物質が可能であるが、好適であるのは目で
見える着色色素またはピグメントである。ＵＶまたは蛍
光発色性の他の色素もまた使用できるが、特別の装置の
使用を必要とするため検出が複雑になる。最も好適な検
出粒子は着色ラテックスである。
【００１５】本分野で良く知られた手段により、抗ビオ
チン抗体は検出粒子の表面に、特異的抗体／ビオチニル
化抗原／抗ビオチン複合体中のビオチンと反応して二次
複合体を形成することを可能とする幾何学的配位で結合
される。着色ラテックスへの抗ビオチン抗体付着の好適
な方法は、ＥＤＣ（１ーエチルー３ー（３ージメチルー
アミノプロピル）ーカルボジイミド）によるカルボキシ
ラテックスの活性化に続いて、活性化ラテックスと抗体
をインキュベーションすることである。それ故、ラテッ
クスへの抗体の結合は抗体リジン残基のラテックス表面
カルボキシル基への共有結合である。
チン抗体は検出粒子の表面に、特異的抗体／ビオチニル
化抗原／抗ビオチン複合体中のビオチンと反応して二次
複合体を形成することを可能とする幾何学的配位で結合
される。着色ラテックスへの抗ビオチン抗体付着の好適
な方法は、ＥＤＣ（１ーエチルー３ー（３ージメチルー
アミノプロピル）ーカルボジイミド）によるカルボキシ
ラテックスの活性化に続いて、活性化ラテックスと抗体
をインキュベーションすることである。それ故、ラテッ
クスへの抗体の結合は抗体リジン残基のラテックス表面
カルボキシル基への共有結合である。
【００１６】この二次複合体は続いてクロマトグラフマ
トリックスを通過し、本分野では良く知られた手段によ
りマトリックス上に固定された抗原（好適には、少量の
抗原含有溶液をマイクロピペッターにより、または例え
ばＣＡＭＡＧリノマット アプリケーターによる噴霧に
より直接添加する：両方の場合とも添加後４５℃で３０
分間乾燥する）を含む捕捉ゾーンへ移動させる。
トリックスを通過し、本分野では良く知られた手段によ
りマトリックス上に固定された抗原（好適には、少量の
抗原含有溶液をマイクロピペッターにより、または例え
ばＣＡＭＡＧリノマット アプリケーターによる噴霧に
より直接添加する：両方の場合とも添加後４５℃で３０
分間乾燥する）を含む捕捉ゾーンへ移動させる。
【００１７】多価特異的抗体もまたこのゾーンで結合抗
原に結合されて標識ビオチニル化抗原／抗ビオチン／特
異的抗体結合抗原”サンドイッチ”を形成し、これが検
出できる。
原に結合されて標識ビオチニル化抗原／抗ビオチン／特
異的抗体結合抗原”サンドイッチ”を形成し、これが検
出できる。
【００１８】本アッセイは非常に特異的である抗原／抗
体複合体の形成に基づいているので特異的抗体に対し非
常に選択的である。
体複合体の形成に基づいているので特異的抗体に対し非
常に選択的である。
【００１９】本発明の装置の好適な具体例ではビオチニ
ル化抗体ゾーンの下流に検出ゾーンを持っているが、特
異的抗体を含む二次複合体のみが捕捉ゾーンに結合され
て検出可能な信号を発するので、悪い影響を与えること
なくこれらの二つのゾーンを逆転できることにさらに注
目されたい。
ル化抗体ゾーンの下流に検出ゾーンを持っているが、特
異的抗体を含む二次複合体のみが捕捉ゾーンに結合され
て検出可能な信号を発するので、悪い影響を与えること
なくこれらの二つのゾーンを逆転できることにさらに注
目されたい。
【００２０】クロマトグラフマトリックスとしては本分
野で既知の任意の種々のマトリックスが使用でき、シリ
カ、ポリアクリルアミド、アルミナおよび好適なものと
してニトロセルロースが挙げられる。さらに、本アッセ
イは好適には薄層クロマトグラフ装置（ＴＬＣ）形式で
実施されるが、カラムクロマトグラフィーのような他の
匹敵するクロマトグラフィー形式でもまた実施できる。
野で既知の任意の種々のマトリックスが使用でき、シリ
カ、ポリアクリルアミド、アルミナおよび好適なものと
してニトロセルロースが挙げられる。さらに、本アッセ
イは好適には薄層クロマトグラフ装置（ＴＬＣ）形式で
実施されるが、カラムクロマトグラフィーのような他の
匹敵するクロマトグラフィー形式でもまた実施できる。
【００２１】好適な実施態様においては、ＴＬＣ装置は
図１に示したように配置される。簡単に説明すると、試
料は検出ゾーン（３）の上流にあるビオチニル化抗原ゾ
ーン（２）上流のクロマトグラフ媒質（１）に導入され
る。試料はこれらの二つのゾーンを移動した後、次に捕
捉ゾーン（４）を移動し、そこで二次複合体は結合さ
れ、検出される。
図１に示したように配置される。簡単に説明すると、試
料は検出ゾーン（３）の上流にあるビオチニル化抗原ゾ
ーン（２）上流のクロマトグラフ媒質（１）に導入され
る。試料はこれらの二つのゾーンを移動した後、次に捕
捉ゾーン（４）を移動し、そこで二次複合体は結合さ
れ、検出される。
【００２２】
【実施例】以下の実施例は本発明のある好適な実施態様
の例示であるが、全ての実施態様の例示を意味するもの
ではない。
の例示であるが、全ての実施態様の例示を意味するもの
ではない。
【００２３】実施例１ ヘモシアニンとビオチンの結合 ビオチンへのヘモシアニンの結合は以下に示す方法によ
り行われた：Ｎーヒドロキシスクシンイミドビオチン
（４ｍｇ／ｍｌ ジメチルスルホキシド溶液）を抗原
（キーホールリムペットヘモシアニン １ｍｇ／ｍｌ
０．１ＭＮａＨＣＯ3，ｐＨ８．２）に滴加した。特
に、Ｎーヒドロキシスクシンイミドビオチン溶液は抗原
溶液に１：２０（ｖ／ｖ）の比で加えられ、混合物は室
温で４時間撹拌された。４時間後、０．１容量のグリシ
ンエチルエステル、ｐＨ７．５、の添加により反応を停
止させた。得られた混合物は次に０．１ＭＮａＨＣＯ3
に対して徹底的に透析して非結合ビオチンを除去し、そ
して、生成物を残した。
り行われた：Ｎーヒドロキシスクシンイミドビオチン
（４ｍｇ／ｍｌ ジメチルスルホキシド溶液）を抗原
（キーホールリムペットヘモシアニン １ｍｇ／ｍｌ
０．１ＭＮａＨＣＯ3，ｐＨ８．２）に滴加した。特
に、Ｎーヒドロキシスクシンイミドビオチン溶液は抗原
溶液に１：２０（ｖ／ｖ）の比で加えられ、混合物は室
温で４時間撹拌された。４時間後、０．１容量のグリシ
ンエチルエステル、ｐＨ７．５、の添加により反応を停
止させた。得られた混合物は次に０．１ＭＮａＨＣＯ3
に対して徹底的に透析して非結合ビオチンを除去し、そ
して、生成物を残した。
【００２４】実施例２ ラテックスへの抗ビオチンの結
合 ラテックスへの抗ビオチンの結合は以下に示す方法によ
り行われた： １． １ｍｌの水中の１０％（ｗ／ｖ）青色着色ラテッ
クス粒子（名目上０．５μｍの直径）を遠心分離（１
２，０００ｇ、１０分間）によりペレット化し、１．２
５ｍｌの４ｍＭＫＨ2ＰＯ4水溶液に再懸濁させた。 ２． ラテックスは次に２ｍｌの２％ＥＤＣ（１ーエチ
ルー３ー（３ージメチルアミノプロピル）ーカルボジイ
ミド）を添加して活性化させた。混合物のｐＨを２Ｎ
ＨＣｌの添加により５．０に調整し、混合物は室温で９
０分間撹拌した。 ３． ９０分後、混合物は遠心分離により（１２，００
０ｇ／１０分）ペレット化し、１０ｍｌの０．１７Ｍ
ＮａＣｌ水溶液に再懸濁した。ラテックスを再び遠心分
離し、ペレットは１．２５ｍｌの０．２Ｍ ホウ酸ナト
リウム水溶液、ｐＨ８．５、に再懸濁した。 ４． ホウ酸中の活性化ラテックスの懸濁液は続いて
１．２５ｍｌのウサギ抗ビオチン抗体（２ｍｇ／ｍｌ
０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）と混合し、
９０分間室温で撹拌した。 ５． 反応は０．０１ｍｌの１Ｍ エタノールアミンの
添加により直ちに停止させ、続いて３０分間室温でイン
キュベートした。３０分後、０．１ｍｌの５％のＢＳＡ
を含む０．２Ｍホウ酸ナトリウム水溶液、ｐＨ８．５、
を添加し、インキュベーションを更に３０分間続けた。 ６． 混合物は次に上記のごとく遠心分離してペレット
化し、１０ｍｌの再懸濁溶液（０．２％ ＢＳＡ、０．
１Ｍ グリシン、０．１７Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ア
ジ化ナトリウム、ｐＨ８．２）に再懸濁した。ラテック
スを再びペレット化し、１５ｍｌの再懸濁溶液に十分に
再懸濁させた。抗ビオチン被覆ラテックスの最終懸濁液
はそのまま冷蔵して保存した。
合 ラテックスへの抗ビオチンの結合は以下に示す方法によ
り行われた： １． １ｍｌの水中の１０％（ｗ／ｖ）青色着色ラテッ
クス粒子（名目上０．５μｍの直径）を遠心分離（１
２，０００ｇ、１０分間）によりペレット化し、１．２
５ｍｌの４ｍＭＫＨ2ＰＯ4水溶液に再懸濁させた。 ２． ラテックスは次に２ｍｌの２％ＥＤＣ（１ーエチ
ルー３ー（３ージメチルアミノプロピル）ーカルボジイ
ミド）を添加して活性化させた。混合物のｐＨを２Ｎ
ＨＣｌの添加により５．０に調整し、混合物は室温で９
０分間撹拌した。 ３． ９０分後、混合物は遠心分離により（１２，００
０ｇ／１０分）ペレット化し、１０ｍｌの０．１７Ｍ
ＮａＣｌ水溶液に再懸濁した。ラテックスを再び遠心分
離し、ペレットは１．２５ｍｌの０．２Ｍ ホウ酸ナト
リウム水溶液、ｐＨ８．５、に再懸濁した。 ４． ホウ酸中の活性化ラテックスの懸濁液は続いて
１．２５ｍｌのウサギ抗ビオチン抗体（２ｍｇ／ｍｌ
０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）と混合し、
９０分間室温で撹拌した。 ５． 反応は０．０１ｍｌの１Ｍ エタノールアミンの
添加により直ちに停止させ、続いて３０分間室温でイン
キュベートした。３０分後、０．１ｍｌの５％のＢＳＡ
を含む０．２Ｍホウ酸ナトリウム水溶液、ｐＨ８．５、
を添加し、インキュベーションを更に３０分間続けた。 ６． 混合物は次に上記のごとく遠心分離してペレット
化し、１０ｍｌの再懸濁溶液（０．２％ ＢＳＡ、０．
１Ｍ グリシン、０．１７Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ア
ジ化ナトリウム、ｐＨ８．２）に再懸濁した。ラテック
スを再びペレット化し、１５ｍｌの再懸濁溶液に十分に
再懸濁させた。抗ビオチン被覆ラテックスの最終懸濁液
はそのまま冷蔵して保存した。
【００２５】実施例３ ウサギ抗ヘモシアニン抗体の検
出、検出ゾーン上流のビオチニル化抗原 薄層クロマトグラフ装置は以下のように準備された： １． ニトロセルロース（１２μｍ孔径）は約６ｃｍ長
で０．８ｃｍの幅の小片に切断された。キーホールリム
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（３．９０ｍｇ／ｍｌ
３μｌ）を各々の小片の上流末端から約３．５ｃｍの所
にマイクロピペッターで点状にのせて捕捉ゾーンを形成
させた。 ２． 抗ビオチン抗体で被覆した青色ラテックス検出粒
子（実施例２）を希釈溶液（１０％ ＢＳＡ、１０％
ラクトース、０．２％ トリトンＸ−１００を１０ｍＭ
リン酸ナトリウム、１５ｍＭ 塩化ナトリウムに溶解
した溶液、ｐＨ７．７）で４倍に希釈し、各々の小片の
上流末端から２．５ｃｍの所へマイクロピペッターによ
りゾーン状にのせた（小片当たり６μｌの希釈ラテック
ス）。 ３． ビオチニル化キーホールリムペットヘモシアニン
（実施例１）を希釈溶液で０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度
に希釈した。ビオチニル化ＫＬＨの希釈溶液は各々のニ
トロセルロース小片の上流末端から１．５ｃｍの所へマ
イクロピペッターによりゾーン状にのせた（小片あたり
６μｌ）。 ４． 小片は４５℃で３０分間乾燥させた。
出、検出ゾーン上流のビオチニル化抗原 薄層クロマトグラフ装置は以下のように準備された： １． ニトロセルロース（１２μｍ孔径）は約６ｃｍ長
で０．８ｃｍの幅の小片に切断された。キーホールリム
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（３．９０ｍｇ／ｍｌ
３μｌ）を各々の小片の上流末端から約３．５ｃｍの所
にマイクロピペッターで点状にのせて捕捉ゾーンを形成
させた。 ２． 抗ビオチン抗体で被覆した青色ラテックス検出粒
子（実施例２）を希釈溶液（１０％ ＢＳＡ、１０％
ラクトース、０．２％ トリトンＸ−１００を１０ｍＭ
リン酸ナトリウム、１５ｍＭ 塩化ナトリウムに溶解
した溶液、ｐＨ７．７）で４倍に希釈し、各々の小片の
上流末端から２．５ｃｍの所へマイクロピペッターによ
りゾーン状にのせた（小片当たり６μｌの希釈ラテック
ス）。 ３． ビオチニル化キーホールリムペットヘモシアニン
（実施例１）を希釈溶液で０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度
に希釈した。ビオチニル化ＫＬＨの希釈溶液は各々のニ
トロセルロース小片の上流末端から１．５ｃｍの所へマ
イクロピペッターによりゾーン状にのせた（小片あたり
６μｌ）。 ４． 小片は４５℃で３０分間乾燥させた。
【００２６】乾燥小片はアッセイに使用された。簡単に
説明すると、試験血清（１％トリトンＸ−１００を含ん
でいる）は各々の小片の上流末端にのせられた。血清に
依存して以下にように結果が異なった： ａ． ウサギ抗ヘモシアニン血清（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｌｕｓ Ｉｎｃ．）は非修飾ＫＬＨがスポットされた
領域に（即ち、上流末端から３．５ｃｍ）強い青色を生
じた。 ｂ． 非免疫化ウサギ血清ではＫＬＨ捕捉ゾーンに色は
捕捉されなかった。 ｃ． ウサギ抗ヘモシアニン血清を小片にのせる前に血
清にヘモシアニンを添加すると（ＫＬＨの最終濃度は
０．６ｍｇ／ｍｌであった）信号を著しく減少させた
（非阻害免疫化血清で観察された信号に比較して）。
説明すると、試験血清（１％トリトンＸ−１００を含ん
でいる）は各々の小片の上流末端にのせられた。血清に
依存して以下にように結果が異なった： ａ． ウサギ抗ヘモシアニン血清（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｌｕｓ Ｉｎｃ．）は非修飾ＫＬＨがスポットされた
領域に（即ち、上流末端から３．５ｃｍ）強い青色を生
じた。 ｂ． 非免疫化ウサギ血清ではＫＬＨ捕捉ゾーンに色は
捕捉されなかった。 ｃ． ウサギ抗ヘモシアニン血清を小片にのせる前に血
清にヘモシアニンを添加すると（ＫＬＨの最終濃度は
０．６ｍｇ／ｍｌであった）信号を著しく減少させた
（非阻害免疫化血清で観察された信号に比較して）。
【００２７】従って、本アッセイは抗ヘモシアニン抗体
の存在を明らかに示すことができる。
の存在を明らかに示すことができる。
【００２８】実施例４ ウサギ抗ヘモシアニン抗体の検
出、検出ゾーン下流のビオチニル化抗原 実施例３の方法が繰り返された、ただし、ＫＬＨ（捕捉
ゾーン）は小片の上流末端から３ｃｍ、ビオチニル化Ｋ
ＬＨは上流末端から２ｃｍ、およびラテックス抗体は上
流末端から１ｃｍの所にスポットされた。
出、検出ゾーン下流のビオチニル化抗原 実施例３の方法が繰り返された、ただし、ＫＬＨ（捕捉
ゾーン）は小片の上流末端から３ｃｍ、ビオチニル化Ｋ
ＬＨは上流末端から２ｃｍ、およびラテックス抗体は上
流末端から１ｃｍの所にスポットされた。
【００２９】このアッセイにおいては、その結果は実施
例３と本質的に等価であった、即ち、抗体を含む非阻害
血清は捕捉ゾーン中に強い青色を示し、非免疫化血清は
捕捉ゾーンに色を示さず、抗体を含む阻害血清は捕捉ゾ
ーンでの色の著しい減少を示した。
例３と本質的に等価であった、即ち、抗体を含む非阻害
血清は捕捉ゾーン中に強い青色を示し、非免疫化血清は
捕捉ゾーンに色を示さず、抗体を含む阻害血清は捕捉ゾ
ーンでの色の著しい減少を示した。
【００３０】上に示した本発明の多くの変更および変形
が本発明の精神および範囲から離れることなくできるで
あろうことは明かである。記載されてきた特定の実施態
様はただ例示として与えられたものであり、本発明は付
随する特許請求の範囲の項によってのみ制限される。
が本発明の精神および範囲から離れることなくできるで
あろうことは明かである。記載されてきた特定の実施態
様はただ例示として与えられたものであり、本発明は付
随する特許請求の範囲の項によってのみ制限される。
【図１】図１は本発明のクロマトグラフ装置を表してお
り、クロマトグラフマトリックス（１）、ビオチニル化
抗原ゾーン（２）、検出ゾーン（３）および捕捉ゾーン
（４）が示されている。
り、クロマトグラフマトリックス（１）、ビオチニル化
抗原ゾーン（２）、検出ゾーン（３）および捕捉ゾーン
（４）が示されている。
【図２】図２は捕捉ゾーン中で形成される複合体を表し
ており、抗ビオチン検出粒子（１）、ビオチニル化抗原
（２）、クロマトグラフマトリックスに結合された抗原
（３）および特異的抗体（４）が示されている。
ており、抗ビオチン検出粒子（１）、ビオチニル化抗原
（２）、クロマトグラフマトリックスに結合された抗原
（３）および特異的抗体（４）が示されている。
Claims (10)
- 【請求項１】 ビオチニル化抗原ゾーン、検出ゾーンお
よび前記ビオチニル化抗原および検出ゾーンの下流の捕
捉ゾーンを含むクロマトグラフマトリックスからなる
が、その際、前記ビオチニル化抗原ゾーンはビオチンに
結合された抗原を含んでおり、前記検出ゾーンは抗ビオ
チン抗体で被覆された検出粒子を含み、および前記捕捉
ゾーンはクロマトグラフマトリックスに結合された抗原
または抗原類似体を含んでいる、抗原に対して特異的な
抗体のための単一工程イムノアッセイを実施するための
装置。 - 【請求項２】 クロマトグラフマトリックスがシリカ、
ナイロン、グラスファイバー、ポリアクリルアミド、ア
ルミナ、およびニトロセルロースから成る群より選択さ
れる請求項１に記載の装置。 - 【請求項３】 検出粒子が視覚的に読み取り可能な請求
項１に記載の装置。 - 【請求項４】 検出粒子が沈澱性または不溶性の金属、
沈澱性または不溶性の非金属、色素または着色物質を含
むサック、および沈澱性または不溶性の合金から成る群
より選択される請求項１に記載の装置。 - 【請求項５】 （ｉ）ビオチニル化抗原ゾーン、検出ゾ
ーンおよび捕捉ゾーンを含む装置のクロマトグラフマト
リックスへ試料をのせるが、その際、前記試料は三つの
ゾーンの上流にのせられる； （ｉｉ）前記試料は最初に抗原ー抗体複合体が形成され
るようにビオチンに結合された抗原を含む前記ビオチニ
ル化抗原ゾーン、および抗ビオチン抗体で被覆された検
出粒子を含む検出ゾーンを、次に形成された抗原ー抗体
複合体が前記抗原または抗原類似体に結合するように前
記クロマトグラフマトリックスへ結合されている抗原ま
たは抗原類似体を含む前記捕捉ゾーンを移動させ；そし
て （ｉｉｉ）粒子の存在を捕捉ゾーンで観察するが、その
際、粒子の存在は特異的抗体の存在を示している；工程
から成る試料中の抗原に対して特異的な抗体の存在を決
定する方法。 - 【請求項６】 クロマトグラフマトリックスがシリカ、
ナイロン、グラスファイバー、ポリアクリルアミド、ア
ルミナ、およびニトロセルロースから成る群より選択さ
れる請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 検出粒子が視覚的に読み取り可能な請求
項５に記載の方法。 - 【請求項８】 検出粒子が沈澱性または不溶性の金属、
沈澱性または不溶性の非金属、色素または着色物質を含
むサック、および沈澱性または不溶性の合金から成る群
より選択される請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 前記試料が検出ゾーンを移動する前に前
記ビオチニル化抗原ゾーンを移動する請求項５に記載の
方法。 - 【請求項１０】 前記試料が前記検出ゾーンの後に前記
ビオチニル化抗原ゾーンを移動する請求項５に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94059892A | 1992-09-04 | 1992-09-04 | |
| US940598 | 1992-09-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06174711A true JPH06174711A (ja) | 1994-06-24 |
Family
ID=25475125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5221266A Pending JPH06174711A (ja) | 1992-09-04 | 1993-09-06 | 特異的抗体検出のための間接クロマトグラフ抗原サンドイッチ試験およびその装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0585912B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06174711A (ja) |
| AU (1) | AU660837B2 (ja) |
| CA (1) | CA2105438A1 (ja) |
| DE (1) | DE69312185T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010512537A (ja) * | 2006-12-11 | 2010-04-22 | ジェンザイム・コーポレーション | 間接側方流動サンドイッチアッセイ |
| US7771928B2 (en) | 1995-09-08 | 2010-08-10 | Fujirebio Inc. | Immunoassay device and immunoassay method using the same |
| JP2023518742A (ja) * | 2020-06-29 | 2023-05-08 | マヒドン ユニバーシティ | 抗インターフェロンγ抗体を検出するための免疫クロマトグラフィーによる方法及びキット |
Families Citing this family (9)
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|---|---|---|---|---|
| AU659754B2 (en) * | 1992-09-04 | 1995-05-25 | Becton Dickinson & Company | Chromatographic antigen sandwich test for detection of specific antibody and device therefor |
| AU662235B2 (en) * | 1992-09-04 | 1995-08-24 | Becton Dickinson & Company | Intrinsic factor - horseradish peroxidase conjugates |
| US6653066B1 (en) * | 1994-06-17 | 2003-11-25 | Trinity Biotech | Device and method for detecting polyvalent substances |
| FR2725023B1 (fr) * | 1994-09-28 | 1997-01-31 | Gks Technologies | Diagnostic direct d'haptenes |
| DE19609838A1 (de) | 1996-03-13 | 1997-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten |
| DE19927783A1 (de) * | 1999-06-18 | 2000-12-21 | Roche Diagnostics Gmbh | Element zur Bestimmung eines Analyts in einer Flüssigkeit, entsprechendes Bestimmungsverfahren unter Verwendung des Elementes sowie Kit zur Bestimmugn eines Analyts |
| US8507295B2 (en) | 2007-11-14 | 2013-08-13 | Nigel Robert Caterer | Methods of quantification for lateral flow devices |
| CN102539790A (zh) * | 2011-12-31 | 2012-07-04 | 南开大学 | 一种生物素的酶联免疫检测试剂盒 |
| CN107085111B (zh) * | 2017-04-14 | 2019-02-01 | 江苏福隆生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒前s1抗原的板式化学发光法检测试剂盒及制备方法 |
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| US5141850A (en) * | 1990-02-07 | 1992-08-25 | Hygeia Sciences, Inc. | Porous strip form assay device method |
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| US5350674A (en) * | 1992-09-04 | 1994-09-27 | Becton, Dickinson And Company | Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof |
| AU659754B2 (en) * | 1992-09-04 | 1995-05-25 | Becton Dickinson & Company | Chromatographic antigen sandwich test for detection of specific antibody and device therefor |
| AU662235B2 (en) * | 1992-09-04 | 1995-08-24 | Becton Dickinson & Company | Intrinsic factor - horseradish peroxidase conjugates |
-
1993
- 1993-08-19 AU AU44766/93A patent/AU660837B2/en not_active Ceased
- 1993-09-02 DE DE69312185T patent/DE69312185T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-02 CA CA002105438A patent/CA2105438A1/en not_active Abandoned
- 1993-09-02 EP EP93114023A patent/EP0585912B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-06 JP JP5221266A patent/JPH06174711A/ja active Pending
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| JPH01113662A (ja) * | 1987-09-11 | 1989-05-02 | Abbott Lab | 特異的結合アッセイ装置および方法 |
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|---|---|
| CA2105438A1 (en) | 1994-03-05 |
| EP0585912A1 (en) | 1994-03-09 |
| EP0585912B1 (en) | 1997-07-16 |
| DE69312185T2 (de) | 1997-12-04 |
| AU660837B2 (en) | 1995-07-06 |
| AU4476693A (en) | 1994-03-10 |
| DE69312185D1 (de) | 1997-08-21 |
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