JPH06501559A - 増幅不均一化学ルミネッセンスイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、一般に、化学ルミネッセンス化合物を利用したイムノアッセイに関 し、さらに詳しくは、免疫化学的反応の固定化生成物により供される化学ルミネ ッセンスシグナルが増幅され、その結果、一層高感度となった不拘−化学ルミネ ノセンスイムノアンセイに関する。

化学反応の結果としての光の発生は当該技術分野で知られており、ノ；スター（ Ｓ　ｃｈｕｓｔｅｒ）およびシュミット（Ｓ　ｃｈｍｉｄｔ）の「ケミルミネッ センス・オン・オーガニック・コンパウンダ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ ｃｅ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）Ｊ　、ゴールド（Ｖ、　Ｇ ｏｌｆｆｌ）およびベセル（Ｄ、　Ｂｅｔｈｅｌ）編、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ 　ＰｈｙｓｉｃａｌＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：１８７〜２ ３８　アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９８２）に概説されている。

シグナル生成化合物として化学ルミネッセンス標識を用いたイムノアッセイは知 られている。化学ルミネッセンスの生成および検出のイムノアッセイへの応用は 、ザイツ（Ｗ、　Ｒ，５ｅｉｔｚ）の［イムノアッセイ・ラベルズ・ベイスト・ オン・ケミルミネッセンス・アンド・バイオルミネッセンス（Ｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙ　ＬａｂｅｌｓＢａｓｅｄ　ｏｎ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ 　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）Ｊ　、Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃ ａｌＢｉｏｃｈｅ　１７　：　１２０−１２６（１９８４）に概説されている。

たとえば、そのようなアッセイを行うための装置および方法は、チバーコーニン グ・ダイアグノステインクス（Ｃｈｉｂａ−Ｇｏｒｎｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ）のＭａｇｉｃ　−Ｌ　ｉｔｅ”システムで利用でき、この、／ステムは 化学ルミネッセンス標識および磁化できる微細粒子を利用している。褐色の色を した微細粒子は場合により化学ルミネッセンスシグナルを妨害するので、これら 粒子は非常に少量で用いられる。このことが、今度は非常に遅い反応となる。た とえば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のアッセイでは３時間のインキュベーシ ョン時間であることが報告されている。加えて、多くの操作工程が関与し、その ため、このアッセイ態様を自動化するのを困難にしている。

白色マイクロ滴定プレート中での高められた化学ルミネッセンス反応、およびそ の後の可動覆い（ｍｏｖａｂｌｅ　ＩＡａｓｋ）および光電子増倍管を有するル ミノメータ−（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）中での生成したシグナルの読み取りが 、リーゼンビ−（Ｌ　ｅｓｅｎｂｅｅ）らのヨーロッパ特許出願第１９４，１０ ２号に記載されており、アーンヤムによって販売されているＡＭ　Ｅ　ＲＬ　Ｉ 　Ｔ　Ｅ　ＴＭシステム中に導入されている。この後者の反応は酵素的であり、 コーティングしたプレート中でのＥＬＩ　ＳＡアッセイの限界（すなわち反応物 の捕捉相への遅い拡散速度）がある。加えて、このＡＭＥＲＬＩＴＥＴＭ＞ステ ムは、上記ルミノメータ−とは別に標識が誘起される装置を利用している。

固体の多孔質要素（不均一イムノアッセイにおいて分離手段として用いる）上ま たは該要素中に固定化された免疫複合体を発する化学ルミネッセンスシグナルを 直接励起し測定することを含む化学ルミネッセンスアッセイを行う方法およびこ の測定を行うための装置が、米国特許出願第０７／４２５．６４３号およびｏ７ ／２０６．６４５号（本願と同じ発明者であり、参照のため本明細書中に引用す る）に記載されている。

イムノアッセイのための標識としてのアクリジニウム化合物の使用およびこれら 標識からの短命な化学ルミネッセンスシグナルのその後の生成が、ウイークス（ Ｉ　、　Ｗｅｅｋｓ）らの［アクリジニウム・エスターズ・アズ・ハイリー・ス ペシフィック・アクティビティ−・ラベルズ・イン・イムノアッセイズ（Ａｃｒ ｉｄｉｎｉｕｍＥｓｔｅｒｓ　ａｓ　Ｈｉｇｈｌｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｔ ｉｖｉｔｙ　Ｌａｂｅｌｓ　ｉｎ　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）Ｊ、Ｃ１１ｎ 、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９　：　１４７４〜１４７８（１９８４）に記載され ている。安定なアクリジニウムスルホンアミドエステルの使用は、マツチイング リ−（Ｐ、　ＧＭａｔｔｉｎｇｌｙ）らによる特許出願である米国特許出願第９ ２１．．９７１号（本願と同じ発明者であり参照のため本明細書中に引用する、 ヨーロッパ特許出願第０２７３１１５号として公開されている）に記載されてい る。

長命発光シグナルの生成は、アダマンタン構造を有するノオキセクン（ｄｉｏｘ ｅｔａｎｅ）化合物に対する酵素または核試薬の作用の結果として当該技術分野 で記載されている。シャープ（Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ）の公開されたヨーロ ッパ出願第０２５４０５１号；公開すｔＬりＰ、　Ｃ，Ｔ、特許出１ｉ第Ｗ０８ ９０６６５０号；　フロンシュタイン（１、Ｂ　ｒｏｎｓｔｅｉｎ）らの「１． ２−ジオキセタンズ、ノベル・ケミルミネッセント・サブストレイッ、アプリケ ーションズ・トウ・イムノアッセイズ（１，２−Ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ、　Ｎｏ ｖｅｌ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓ、　Ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎ■ ｔｏ　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）Ｊ、Ｊ、　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ ｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕ＋＊１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　４　F　９ ９（１９８８）および５ｔｈ・インターナショナル・コンフェンレンス・オン・ バイオルミネッセンス・アンド・ケミルミネッセンス（５ｔｈ　Ｉ　ｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｂｉｏｌ＋ｕ＊１ｎｅｓｃｅｎｃ ｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、フローレンスーボローニ ャ、イタリア、９月２５〜２９日（１９８８）。

アビジン−ビオチンの使用などのシグナル促進剤の使用もまた知られている。

たとえば、へベイ（Ｈｅｖｅｙ）らの米国特許第４．２２８．２３７号には、ア ビジン標識した酵素も用いた方法において使用したリガンドに対するビオチン標 識特異的結合物質の使用が記載されている。ビオチン−抗ビオチン系の使用は、 １９８４年５月１０日に出願された米国特許出願第６０８．８４９号（本願と同 じ発明者、参照のため本明細書中に引用、１９８５年１１月１３日にヨーロッパ 特許出願第１６０．９００号として公開されている）に記載されている。

イムノアッセイで生成した化学ルミネッセンスシグナルを高め増幅する方法は、 当該技術分野で知られている。それゆえ、米国特許第４．９２７．７６９号には 、界面活性剤を添加することに・よるアクリジニウム−エステル標識結合体から 生成する化学ルミネッセンスシグナルを高める方法が記載されている。また、米 国特許第４．９５９．１８２号には、アルカリホスファターゼ−触媒した１、２ −ジオキセタンから生成する化学ルミネッセンスシグナルの増幅を、界面活性剤 とそれに結合した蛍光化合物を添加することにより行う方法が記載されている。

これら公知方法は、特異性に欠けるという欠点がある。それゆえ、結合した化学 ルミネッセンス標識から生成するシグナルおよび洗浄していない遊離の標識がら 生成するシグナルの両方とも増幅される。このことにより、所望の反応並びにバ ックグラウンドに対応するシグナルが増大することになる。それゆえ、シグナル は増幅されるけれどもアッセイの感度には何等得るところがない。

本発明は、「特異的結合ペア」の相互反応によって体現される特異性を利用した 化学ルミネッセンスシグナル増幅法を提供することにより、公知技術の欠点を克 服するものである。それゆえ、所望の反応シグナルはバックグラウンドシグナル に比べて遥かに著しく増幅され、かくしてアッセイの感度が改善される。本発明 は、さらに種々のアッセイに使用できる普遍的な特異的増幅剤をも提供する。

発明の要約 この発明は、不均一イムノアッセイにおいて生成する化学ルミネッセンスシグナ ルを特異的に増幅することによって試験試料中の分析対象物の存在を決定する方 法を提供するものであり、該方法は、（ａ）分析対象物を含有する試験試料を分 析対象物特異的な結合ペアの成員とともにインキュベートして第一の混合物を形 成し：（ｂ）この第一タ混合物を分析対象物／分析対象物特異的結合成員ペア複 合体を形成するのに充分な時間および条件下でインキュベートし：（Ｃ）該分析 対象物／分析対象物特異的結合成員ペア複合体を、分析対象物特異的結合成員に 結合したエンハンサ−化合物からなるプローブと接触させて第二の混合物を形成 し。

（ｄ）この第二の混合物を分析対象物／分析対象物特異的結合成員ペア／プロー ブ複合体を形成するのに充分な時間および条件下でインキュベー）Ｌ、；（ｅ） 該分析対象物／分析対象物特異的結合成員ペア／プローブ複合体を、エンハンサ −特異的結合成員に結合した化学ルミネッセンスシグナル生成化合物からなる結 合体と接触させて第三の混合物を形成し：（ｆ）この第三の混合物を分析対象物 ／分析対象物特異的結合成員ペア／プローブ／結合体複合体を形成するのに充分 な時間および条件下でインキュベートし、ついで（ｇ）検出可能なシグナルを測 定することによって試験試料中の分析対象物の存在を決定することからなる。上 記エンハンサ−化合物は、ハプテン、蛍光化合物およびジニトロフェノールより なる群から選ばれてよい。好ましいエンハンサ−化合物はビオチンである。上記 化学ルミネッセンスシグナル生成化合物は、アクリジニウムエステル、アクリジ ニウムスルホンアミド、１，２−ジオキセタンおよびルミノールよりなる群から 選ばれてよい。

好ましい化学ルミ不ソセンスノグナル生成化合物はアクリジニウムスルホンアミ ドである。分析対象物特異的結合ペア成員は、固相ペアに結合していてよい。

増幅化学ルミネッセンスアッセイを行うためのキ・ノドもまた提供される３発明 の詳細な記載 アクリジニウム化合物の化学ルミネッセンス的特性および該化合物のイムノアッ セイにおける使用を記載した。アクリジニウムエステルまたはアクリジニウムス ルホンアミド標識を有する免疫化学トレーサーは、アルカリ過酸化物溶液で誘起 して化学ルミネッセンスシグナル（約２秒後に最大となる）を生成させることが できる。約１０秒後には光発生は完全に消失する。アクリンニウムスルホンアミ ド標識化学は、本発明に従い、高量子収量の安定なトレーサーを製造するために 用いることができる。この方法は、米国特許出願第３７１．７６３号体願と同じ 発明者、参照のため本明細書中に引用する）に記載されているのと同じ方法であ る・化学的に触媒した長命の１．２−ジオキセタン化学ルミネッセンスは、種々 の仕方で生成させることができる。それゆえ、ＥＰ０２５４０５１号（上記引用 ）には、テトラブチルアンモニウムクロリド溶液で誘起されて２０分間続く化学 ルミネッセンスシグナルを生成する４　（６−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキ シ−２−ナフチル）−４−メトキンスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２゛ア ダマンタン］がンロキンー置換ノオキセクンとして記載されている。また、アリ ールエステラーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素は、アダマンタン骨格で 安定化さｎたアリールノオキセタン誘導体と反応して同様の長命な化学ルミネ・ ンセンスシグナルを生成する。

また・ＷＯ３８１００６９４（Ｗ０８９０６６．５０、上記引用）（こに、３− （２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ ）−フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）および類似のβ−ガラクト ノダーゼ基質のアルカリホスファターゼで触媒された反応からの長命な発光が記 載されている。

また、これら化合物のイムノアッセイにおける使用も記載されている。それゆえ 、アルカリホスファターゼ標識法は知られており、触媒されたジオキセタン化学 ルミネッセンスを用いて長命なシグナルを生成することができる。

本発明は、特異的結合成員を利用したイムノアッセイを提供する。本明細書にお いて使用する「特異的結合成員」とは、特異的結合ベアの成員をいう。すなわち 、一方の分子が第二の分子に化学的または物理的手段により特異的に結合するよ うな２つの異なる分子をいう。それゆえ、通常のイムノアッセイの抗原と抗体と の特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとしては、ビオチンとアビジン 、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプタ ー分子、補助因子と酵素、酵素インヒビターと酵素などが挙げられる。さらに、 特異的結合ペアとして、もともとの特異的結合成員の類似体、たとえば、分析対 象物類似体も含まれる。免疫反応性の特異的結合成員としては、抗原、抗原断片 、抗体および抗体断片（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）、および その複合体（組換えＤＮＡ分子により形成されるものを含む）が含まれる。本明 細書において使用する「ハプテン」とは、抗体に結合することはできるが担体タ ンパク質に結合しないと抗体を産生できない部分抗原または非タンパク質結合成 員をいう。

本明細書において使用する「分析対象物」とは、試験試料中に存在するかもしれ ない検出すべき物質をいう。分析対象物は、それに対して天然の特異的結合成員 （抗体など）が存在するか、またはそれに対して特異的結合成員を調製すること のできる物質であってよい。それゆえ、分析対象物は、アッセイにおいて１また は２以上の特異的結合成員と結合することができる物質である。「分析対象物」 にはまた、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、およびそれらの組合せが含ま れる。特異的結合ベアの成員として、分析対象物は、ビタミンＢ１□の決定のた めの特異的結合成員としての内因子タンパク質の使用や炭水化物の決定のための 特異的結合ペア成員としてのレクチンの使用などのような天然の特異的結合パー トナ−（ペア）によって検出することができる。分析対象物には、タンパク質、 ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与される ものおよび不法目的で投与されるものを含む薬物、細菌、ウィルス、および上記 物質のいずれかの代謝物または上記物質のいずれかに対する抗体が含まれる。そ のような抗体の調製および特異的結合成員として使用することの適切さについて は当業者によく知られている。

本明細書において使用する「捕捉試薬」とは、サンドイッチアッセイにおけるよ うに分析対象物に特異的な、競合アッセイにおけるように指示試薬または分析対 象物に特異的な、または間接アッセイにおけるように補助特異的結合成員（それ 自体は分析対象物に特異的である）に特異的な、非標識の特異的結合成員をいう 。捕捉試薬は、アッセイを行う前またはアッセイを行っている間に固相物質に直 接または間接に結合させることができ、それによって固定化された複合体を試験 試料から分離することが可能となる。

「試験試料」は、全血または赤血球細胞、白血球細胞、血小板、血清および血漿 を含む全血成分、腹水、尿、脳を髄液；および所定の分析対象物を含有している かもしれない体の他の構成成分などの生物学的流体の試料である。場合により、 試験試料は水、土および草木から得てよい。

本明細書において使用する「プローブ」なる語は、「エンハンサ−化合物」に結 合した特異的結合ペアの成員を意味する。「エンハンサ−化合物」とは、化学ル ミネッセンス化合物により生成したシグナルを高めることのできる、アッセイに 使用したあらゆる化合物をいう。それゆえ、エンハンサ−化合物には、ビオチン などのハプテンが含まれ、またフルオレセイン、ジニトロフェノールなども含［ 化学ルミネッセンス化合物」とは、アクリンニウムエステル、アクリジニウムス ルホンアミド、１．２−ンオキセクン、ルミノール、または化学ルミネッセンス 基質を触媒する酵素などの、化学ルミネッセンスシグナルを生成し得るあらゆる 化合物を意味する。

本明細書において使用する「結合体」とは、エンハンサ−化合物に特異的な化合 物（エンハンサ−の特異的結合成員）が結合した化学ルミネッセンス化合物を意 味する。たとえば、利用するエンハンサ−化合物がビオチンである場合は、抗ビ オチン、またはアビジンをエンハンサ−特異的化合物として用いることができる 。

本発明の方法に従い、固相を用いてもよい。本明細書において使用する「固相」 とは、不溶性であるか、またはその後の反応により不溶性にすることのできるあ らゆる物質をいう。固相の選択は、捕捉試薬を引きっけ固定化する生来の能力に 基づいて行うことができる。別法として、捕捉試薬を引きっけ固定化する能力を 有する別のレセプターを固相に保持させることもできる。この別のレセプターと しては、捕捉試薬自体に関してまたは捕捉試薬に結合した荷電物質に関して反対 の電荷に荷電された物質が含まれる。さらに他の態様として、レセプター分子は 、固相上に固定化され、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定化する能力を有 するあらゆる特異的結合成員であってよい。レセプター分子は、アッセイを行う 前またはアッセイを行っている間に捕捉試薬を固相物質に間接的に結合させるこ とを可能にする。　一 本発明のアッセイ試薬は多くの態様であってよく、その幾っがは固相として選択 した物質に依存する。たとえば、固相にはあらゆる適当な多孔質物質が含まれる 。「多孔質」とは、その中を試験試料が容易に通過することのできる物質である ことを意味し、吸湿性および非吸湿性固相物質の両方を包含する。本発明におい て、固相には、１または２以上のアッセイ試薬を含有する１または２以上の層を 有するポーアンドフロスルー（ｐｏｕｒ　ａｎｄ　ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ） アッセイ装！に使用するためのファイバーグラス、セルロース、またはナイロン バッド；毛管運搬（ｗｉｃｋｉｎｇ）作用法のための試験ストリップ（たとえば 、紙）または薄層クロマトグラフィー作用または毛管作用法のための試験ストリ ップ（たとえば、ニトロセルロース）；または当業者によく知られた他の多孔質 または開孔（ｏｐｅｎ　ｐｏｒｅ）物質（たとえば、ポリエチレンシート物質） が含まれる。しがしながら、固相は多孔質物質に限られるものではない。固相に はまた、ポリマー性またはガラス性のビーズ、微細粒子・チューブ、シート、プ レート、スライド、ウェル、テープ、試験管など、または固有の電荷を有するか または荷電物質を保持し得るいかなる物質であってもよい。

天鉢物質、合成物質、または合成的に修飾した天然物質を固相として用いること もでき、多糖類、たとえば紙やセルロース誘導体（酢酸セルロースおよびニトロ セルロースなど）などのセルロース物質、ノリ力、不活化アルミナ、ケイソウ土 、ＭｇＳＯ４、または細かく分割され多孔質ポリマーマトリックス中に均一に分 散した他の無機物質などの無機物質、その場合、該ポリマーとしては塩化ビニル 、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、および塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマ ーなど、天然の布（たとえば、綿）および合成の布（たとえば、ナイロン）、ノ リ力ゲル、アガロース、デキストラン、およびゼラチンなどの多孔質ゲル、ポリ アクリルアミドなどのポリマー性フィルム、などが含まれる。固相は妥当な強度 を有するか支持体によって強度を補給することができなければならず、また検出 可能なシグナルの生成を妨害するものであってはならない。

フローースルーアーソセイ装置用の好ましい固相物質としては、多孔質ファイバ ーガラス物質や他のファイバーマトリックス物質などの濾紙が含まれる。そのよ うな物質の厚さは重要ではなく、主として試験試料の流動性などのアッセイしよ うとする試料または分析対象物の特性に依存した選択問題であろう。

同相の固有電荷を変化させたり大きくしたりするため、荷電物質を該物質に直接 コーティングしたり、または微細粒子にコーティングした後、該粒子を固相支持 体物質に保持させることができる。別法として、微細粒子をカラム中に保持した り、可溶性試薬と被験物質との混合物中に懸濁することによって固相として動か せることができるし、または該粒子自体を固相支持体物質により保持または固定 化することもできる。「保持および固定化」とは、支持体上または支持体中の該 粒子が該支持体物質内のいずれかの位置に実質的に移動することができないこと を！味する。該粒子は当業者によりあらゆる適当なタイプの微細粒子物質から選 択することができ、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレノ、 ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボ ネート、または類似の物質からなるものが含まれる。該粒子のサイズは重要では ないが、該粒子の平均直径は使用した支持体物質の平均孔径よりも小さいのが好 ましい。

この発明の好ましい態様に従い、分析対象物を含有するかもしれない検出用試験 試料を、該分析対象物に特異的な結合ペア成員を結合させた固相と接触させて混 合物を形成させる。この混合物を、分析対象物／分析対象物特異的結合ペア成員 複合体を形成するのに充分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、 これら複合体を、分析対象物−特異的結合ペア成員に結合したエンハンサ−化合 物からなるプローブと接触させて第二の混合物を形成させる。この第二の混合物 を、分析対象物／分析対象物特異的結合ペア成員／プローブ複合体を形成するの に充分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、この分析対象物／分 析対象物特異的結合ペア成員／プローブ複合体を、エンハンサ−化合物結合成員 に結合させた化学ルミネンセンス生成化合物からなる結合体と接触させて第三の 混合物を形成させる；この第三の混合物を、分析対象物／分析対象物特異的結合 ペア成員／プローブ／結合体複合体を形成するのに充分な時間および条件下でイ ンキュベートする。試験試料中の分析対象物の存在は、化学ルミネッセンス化合 物により生成したシグナルを測定することにより決定される。

また、サンドインチアッセイを行うことも考えられ、その場合にはアニオン性物 質などの荷電物質に結合させた分析対象物特異的結合成員が可溶性捕捉試薬に含 まれていてよい。

本発明はまた、競合アッセイを行うのに用いることもできる。競合態様において は、この場合も可溶性捕捉試薬にはアニオン性ポリマーなどの荷電物質（特異的 結合パートナ−と結合する）に結合した特異的結合成員が含まれていてよい。

本発明を実施例により記載するが、これらは本発明を説明するためのものであっ て本発明の範囲を限定するものではない。

実施例 実施例１ ＨＴＬＶ−Ｂａｔ原を有するポリスチレンラテックス粒子の調製等ｗ／ｗ量の混 合−ベッドイオン−交換（ｍｉｘｅｄ−ｂｅｄ　ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ）樹 脂とともに周囲室温にて３時間撹拌することにより、カルボキシル化ポリスチレ ンラテックス粒子を精製した。これら粒子を単離し、ついで０．０２Ｍ　ＭＥＳ （ｐＨ６，０）中に０５％固形分濃度に希釈し、ついでこの懸濁液に１−エチル −３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを３　：　１（ＥＤＡ Ｃニラテックス）のＷ／Ｗ比率にて加えた。この混合物を周囲室温にて２０分間 撹拌した後、精製ＨＴＬＶ−１抗原溶解液を最終濃度６０μｇ／ｍ＋が得られる 量にて加えた。ついで、この懸濁液を周囲室温にて一夜撹拌し、ついでコーティ ングされた粒子を遠心分離により単離し、０．０１Ｍリン酸と０．１５ＭＮａＣ ］とのｐＨ７，２溶液（０゜１％ツイーン−２じを含有）中で再懸濁−遠心分離 を３サイクル繰り返すことにより精製した。最後の遠心分離工程の後、該固体を 該緩衝液中に０．１％固形分の濃度に希釈した。

実施例２ ビオチン化ＨＴＬＶ−１抗原の調製 ０．１％トリトン−Ｘ−１００”を含有するＯ、１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５ ）中の精９ＨＴＬＶ−１抗原を、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステルの５ｍｇ／ｍｌ　ＤＭＦ溶液で０３〜０．６：１（抗原　エ ステル）の範囲の比率にて処理した。この反応混合物を周囲室温にて３〜４時間 撹拌させ、ついで０１％トリトン−Ｘ−１００’を含有する０、ＯＩＭ）リス、 領１５ＭＮａＣ１のｐＨ７，５溶液中に透析した。

実施例３ フルオレセイン−標識抗原の調製 サミュエル（Ｓａｍｕｅｌ、）らのＪ、　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ 　］　０７　：　２１７〜２２４（１９８８）の手順を用い、ウィルスタンパク 質および組換えウィルスタンパク質をフルオレセインイソチオ／アネートで標識 した。

実施例４ アクリジウム−標識抗−ビオチンまたは抗−フルオレセインの調製１ｍｇの１０ −メチル−９−（Ｎ−１−シル、Ｎ−（２−カルボキシエチル））アクリジンカ ルボキサミドを１００μｍのＤＭＦ中に溶解し、ついでＮ−ヒドロキシ−スクシ ンイミドの５．７５ｍｇ／ｍｌ　ＤＭＦ溶液（５０μｌ）および１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの９．７５ｍｇ／ｍｌＤＭ Ｆ溶液（５０μｌ）で処理した。ついで、この溶液を周囲室温にて一夜撹拌させ た。ついで、活性化アクリジニウム誘導体を抗−ビオチン（または抗−フルオレ セイン）に下記のようにしてカップリングした。該抗体を０．１５ＭＮａＣ＋を 含有する０、１Ｍリン酸（ｐＨ８，０）に対して透析し、ついで該タンパク質を 同緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌの濃度に調節した。ついで、５〜１０モル過剰の活性 化アクリジニウム誘導体を室温にて該抗体溶液に加えた。１０分後、この反応混 合物を遠心分離（１２，ＯＯＯｒｐｍにて２分間）にかけて凝集物を除去し、つ いで上澄み溶液をＴＳＫ−２５０ゲル濾過カラム（０，１５Ｍ　Ｎａ　Ｃｌを含 有する０゜０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，３で前以て平衡化しである）に適 用した。１ｍ１画分ずつ回収し、２８０ｎｍおよび３６９　ｎｍにおける吸光度 をモニターした。ＩｇＧピークを有する両分をプールし、アクリジニウム導入の 程度を以下のようにして計算した：タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度（ この波長でのアクリジニウムによる寄与に関して補正（補正吸光度＝Ａ　２ｍ１ １　［Ａ３６９　Ｘ　Ｏ、２４７］））を用いて決定した。アクリジニウムおよ びＩｇＧのモルは、それぞれ１４゜６５０および２２０．０００Ｍ−１ｃＭ−１ のモル吸光係数を用いて計算した。

実施例５ ＨＴＬＶ−１アツセイ １０％ショ糖（Ｗ／Ｗ％）、領１％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、０．１ ％ツイーン−２０”、０．１Ｍリン酸および０．１％アジ化ナトリウムのｐＨ７ ，５溶液中のポリスチレンラテックス粒子（実施例１に記載のようにしてＨＴＬ Ｖ−１抗原で前以てコーティングしである）の０１％固形分懸濁液（５０μｍ） を反応ウェル中の試料（１００μｍ）に加えた。ついで、この懸濁液を４０℃に て約１０分間インキュベートシ、ついで０１％アン化ナトリウムを含有するｐＨ ７，２，００１Ｍリン酸、０．１５ＭＮａＣ１の２回連続３００μｌ洗浄により 捕捉メンブレンに移した。

ついて洗浄した懸濁液を４０℃にて約１０分間インキュベートし、ついでＯＩＭ Ｉ−リス（ｐＨ８，５）、５０％ウシ血清、およびＯ，ＬＭ　ＮａＣ］（０，１ ％アジ化ナトリウムを含有）中のビオチン化ＨＴＬＶ−１抗原（実施例２の・よ うにして調製）の１６７　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ溶液（３０μｍ）で処理した。ついで 、捕捉メンブレンを２０分間インキュベートし、ｐＨ８，５の洗浄溶液（０１％ アン化ナトリウムを含有する１１．Ｍｌ−リス、０．１５ＭＮａＣ１、および０ １％トリトン８からなる）の１００μｍ部分て３回洗浄した。ついで、洗浄した 捕捉メンブレンを化学ルミネッセンスアクリジニウムスルホンアミド残基を結合 した（実施例４のようにして）抗−ビオチンのＯ，ＯＬＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６，３ ）、０．１５ＭＮａＣ１，２％ＢＳＡ、および０．５％トリトン１中の１６７　 ｎ　ｇ／ｍ　ｌ溶液（３０μｌ）で処理した１、４０°Ｃでさちに１０分間イン キュベートした後、捕捉メンブレンをＯＩＭＭＥｓおよび０．１５Ｍ　ＮａＣＩ （０，１％アノ化ナトリウムを含有）のｐＨ５５溶液の１００μｍ部分で３回洗 浄した。ついで、洗浄した捕捉メンブレンをアルカリ過酸化物溶液（０３％過酸 化物を含有する領２５Ｎ　Ｎａ０Ｈ）で処理する前に４０°Ｃて１０分間インキ ュベートした。化学ルミネッセンスを６秒間読み取り、抗−ＨＴＬＶ−１の存在 または不存在を決定した。

実施例６ ＨＣＶ抗原をコーティングしたポリスチレンラテックス粒子の調製２０　ｔｌｇ のＨＣＶ抗原を２０ｍ１のｐＨ７，０，０，１Ｍリン酸緩衝液中で２６６ミクロ ン直径ポリスチレンラテックス粒子（１００ｍｇ）と混合し、室温にて一夜撹拌 した。ついで、固形分を遠心分離（１７，０００ｒｐｍにて２５分間）により単 離し、ついで０．００５％ツイーン−２０Ｒを含有するｐＨ７，０，０１Ｎ１リ ン酸緩ｉｔｉ液（２０ｍ　ｌ　）中での再懸濁−遠心分離を３サイクル行うこと により精製した。

実施例７ ビオチン化ＨＣＶ抗原の調製 ０．１％ツイーン−２ＯＲを含有する領０５　ｐＨ８，５ホウ酸（２，５ｍ１） 中のＨＣＶ抗原（５００Ｍｇ）に１ｍｇのビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロ キシスクシンアミドエステルを加えた。室温にて２時間撹拌した後、５０ｍｇの ＢＳＡを加え、この溶液を、Ｏ，ＯＯ２Ｍジチオトレイトールおよび０．１％ツ イーン−２０Ｒを含有する０　０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，５）の２つの５０ ０ｍ１交換に対して周囲室温にて一夜透析した。

実施例８ ＨＣＶアッセイ ０、０　Ｏ５％フッイー：−２０Ｒヲ含有ｔル０．　Ｉ　ＭｐＨ７，０’Ｊ　ン 酸ｊｌ／を衝Ｈ中ノポリスチレンラテックス粒子（実施例６に記載のようにして 組換えＨＣＶ抗原で前以てコーティングしである）の０．５％固形分懸濁液（５ ０μｌ）を、１％ツイーン−２０”、０．０２３％セルクアソト（ｃｅｌｌｑｕ ａｔ）、０．０１％セチルピリジニウムクロリド、０．０５Ｍ　ＥＤＴＡ、０． ０３Ｍ　ＮａＣｌおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する０、　０２Ｍホウ 酸緩衝液のｐＨ８，５溶液（５０μｍ）に加え、ついで反応ウェル中の試料（１ ００μｌ）に加えた。ついで、０．１％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７，５ ，０，０１Ｍリン酸緩衝液および０．１５ＭＮａＣ１の２回連続３００μｌ洗浄 により反応捕捉メンブレンに移す前に、この懸濁液を４０℃にて約２０分間イン キュベートした。

ついで、上記洗浄した懸濁液を、０．０２Ｍホウ酸（ｐｆ４８．５）、５％ＢＳ Ａ。

および５，０％トリトンＸ−１００”（０，１％アジ化ナトリウムを含有）中の ビオチン化組換えＨＣＶ抗原（実施例７のようにして調製）の６６０ｎｇ／ｍｌ 溶液（３０μｍ）で処理する前１５４０℃にて約１０分間インキュベートした。

ついで、捕捉メンブレンを、０．１Ｍホウ酸、０．１５ＭＮａＣ］、および０． ０５％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ８０．１％アジ化ナトリウムを含有）から なるｐＨ８，０洗浄溶液の３つの１００μｍ部分で洗浄する前に２０分間インキ ュベートした。ついで、この洗浄した捕捉メンブレンを、０．０１Ｍリン酸（ｐ Ｈ６，３）、０．１５ＭＮａＣ１，５％ウシ血清、および０１％トリトンＲ（０ １％アジ化ナトリウムを含有）中の抗−ビオチン（化学ルミネッセンスのアクリ ジニウムスルホンアミド残基を結合しである）（実施例４のようにして調製）の １６５ｎｇ／ｍｌ溶液（３０μｍ）で処理した。４０℃にてさらに］０分間イン キュベートした後、捕捉メンブレンを０．１Ｍホウ酸、０．１５ＭＮａＣ１およ び０．０２％５ＤＳ（０，１％アジ化ナトリウムを含有）のｐＨ８，５溶液の３ つの１００μｍ部分で洗浄した。

ついで、この洗浄した捕捉メンブレンをアルカリ過酸化物溶液（０，３％過酸化 物を含有する０、２５Ｎ　Ｎａ０Ｈ）で処理する前に４０℃にて１０分間インキ ユベートシた。化学ルミネッセンスを６秒間読み取り、抗−ＨＣＶの存在または 不存在を決定した。

実施例９ ＨＩＶ抗原をコーティングしたポリスチレンラテックス粒子の調製０．５Ｍホウ 酸緩衝液（＋）Ｈ８，５８３４，２８ｍ１）中のＨＩＶ抗原（１０ｍｇ）をポリ スチレンラテックス粒子の０．５％固形分懸濁液（１，０ｍ１）と混合し、つい で脱イオン水（５５，７２ｍ１）を加えた。ついで、この懸濁液を室温にて一夜 撹拌した。ついで、固形分を遠心分離（１７，ＯＯＯｒｐｍにて３０分間）によ り単離し、ついで０．１％ツイーン３を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７ ，０）中で再懸濁−遠心分離のサイクルを３回繰り返すことにより精製した。つ いで、これらコーティングした粒子を再懸濁し、５６°Ｃにて１日間穏やかに撹 拌し、ついで使用する前に室温にて貯蔵した。

実施例１０ ビオチン化ＨＩＶ抗原の調製 ２５０ｍｍ　ＮａＣ］および０．１％アン化ナトリウムを含有する０、１Ｍホウ 酸緩衝液（ｐＨ８，５８２，２７８ｍ１）中のＨＩＶ抗原（１，９ｍｇ）を１０ ％トリトン’（０，１２５ｍ１）て３０分間処理した。ついで、ＤＭＦ中に溶解 した５ｍｇ／ｍｌのビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエ ステル（９７μｍ）を加えた。この反応混合物を室温にて約２時間撹拌した。こ の混合物を２５０ｍｍ　ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、および領１％アジ化ナトリ ウムを含有する０、１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）に対して充分に透析した。

実施例１１ ＨＩＶアッセイ １１％ノヨ糖（ｗ／ｗ％）、Ｏ，ＯＩＭ　ＥＧＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ’、０ ．１Ｍリン酸および０．１％アジ化ナトリウムのｐＨ７，０溶液中のポリスチレ ンラテックス粒子（実施例９に記載のようにしてＨＩＶ抗原で前辺てコーティン グしである）の約０．２％固形分懸濁液（５０μｌ）を反応ウェル中の試料（１ ００μｍ）に加えた。ついで、この懸濁液を、ｐＨ８，５，０，１Ｍホウ酸緩衝 液、０１５ＭＮａＣ１、および領０１％０１％ドブノルチウム（ＬＤＳＸｏ、１ ％アジ化ナトリウムを含有）の２つの連続３００μｍ洗浄により捕捉メンプラン に移す前に４０℃にて約２０分間インキュベートした。

ついで、この洗浄すた懸濁液を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）、１％大腸 菌溶解液、５００μｇ／ｍｌ　ＣＫＳ、１２．５％ウシ血清、および１．０％コ ール酸（０，１％アジ化ナトリウムを含有）中のビオチン化ＨＩＶ抗原（実施例 １０に記載のようにして調製）の７５０　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ溶液（３０μｍ）で処 理する前に、４０℃にて約１０分間インキュベートした。ついで、捕捉メンプラ ンを０．１Ｍホウ酸、０．１５ＭＮａＣ１，および０．０３％ＬＤＳ（Ｑ、１％ アジ化ナトリウムを含有）からなるｐＨ８，５洗浄溶液の１００μｍ部分で３回 洗浄する前に２０分間インキュベートした。ついで、この洗浄した捕捉メンブレ ンを、００１Ｍリン酸（ｐＨ６，３）、０．１５ＭＮａＣ＋、５％ウシ血清、お よび１．０％トリトン３（０１％アジ化ナトリウムを含有）中の抗−ビオチン抗 体（化学ルミネッセンスのアクリンニウムスルホンアミド残基を結合しである） （実施例４のようにして調製）の１６７ｎｇ／ｍｌ溶液（３０μｌ）で処理した 。４０℃にてさらに１０分間インキュベートした後、捕捉メンブレンを０．１Ｍ ホウ酸、０．１５Ｍ　ＮａＣ］および０．０１％ＬＤＳ（０，１％アジ化ナトリ ウムを含有）のｐＨ８，５溶液の５つ（３）の１００μｍ部分で洗浄した。つい で、この洗浄した捕捉メンブレンをアルカリ過酸化物溶液（０３％過酸化物を含 有する０、２５Ｎ　Ｎａ０Ｈ）で処理する前に４０℃にて１０分間インキュベー トした。化学ルミネッセンスを６秒間読み取り、抗−ＨＩＶの存在または不存在 を決定した。

本明細書中に開示した本発明の特別の態様の他の修飾および変更は当業者には明 らかであろう。従って、本発明は添付の請求の範囲に従って限定されることを意 図するものである。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．不均一イムノアッセイにより生成される化学ルミネッセンスシグナルの特異 的増幅により試験試料中の分析対象物の存在を決定する方法であって、ａ．分析 対象物を含有する試験試料を分析対象物特異的結合ペア成員とともにインキュベ ートして第一の混合物を形成させ；ｂ．この第一の混合物を分析対象物／分析対 象物特異的結合成員ペア複合体を形成するに充分な時間および条件下でインキュ ベートし；ｃ．この分析対象物／分析対象物特異的結合成員ペア複合体を、分析 対象物特異的結合成員に結合したエンハンサー化合物からなるプローブと接触さ せて第二の混合物を形成させ； ｄ．この第二の混合物を分析対象物／分析対象物特異的結合ペア成員ペア／プロ ーブ複合体を形成するに充分な時間および条件下でインキュベートし；ｅ．この 分析対象物／分析対象物特異的結合成員ペア／プローブ複合体を、エンハンサー 特異的結合成員に結合した化学ルミネッセンスシグナル生成化合物からなる結合 体と接触させて第三の混合物を形成させ；ｆ．この第三の混合物を分析対象物／ 分析対象物特異的結合成員ペア／プローブ／結合体複合体を形成するに充分な時 間および条件下でインキュベートし；ついで ｇ．検出可能なシグナルを測定することにより試験試料中の分析対象物の存在を 決定する ことを特徴とする方法。
2. ２．該分析対象物が抗体または抗原である請求項１に記載の方法。
3. ３．該エンハンサー化合物がハプテン、蛍光化合物およびジニトロフェノールよ りなる群から選ばれたものである請求項１に記載の方法。
4. ４．該エンハンサー化合物がビオチンである請求項１に記載の方法。
5. ５．該化学ルミネッセンスシグナル生成化合物が、アクリジニウムエステル、ア クリジニウムスルホンアミド、１，２−ジオキセタンおよびルミノールよりなる 群から選ばれたものである請求項１に記載の方法。
6. ６．該化学ルミネッセンスシグナル生成化合物がアクリジニウムスルホンアミド である請求項１に記載の方法。
7. ７．該分析対象物特異的結合成員を工程（ａ）の前に固相に結合させる請求項１ に記載の方法。
8. ８．増幅化学ルミネッセンスアッセイを行うためのキットであって、エンハンサ ー化合物を含有するプローブ試薬；化学ルミネッセンスシグナル生成化合物を含 有する結合体からなることを特徴とするキット。
9. ９．該エンハンサー化合物がハプテン、蛍光化合物およびジニトロフェノールよ りなる群から選ばれたものである請求項８に記載のキット。
10. １０．該化学ルミネッセンスシグナル生成化合物がアクリジニウムエステル、ア クリジニウムスルホンアミド、１，２−ジオキセタンおよびルミノールよりなる 群から選ばれたものである請求項８に記載のキット。