JPH06141853A - 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 鶏に接種することにより鶏伝染性喉頭気管炎
（ＩＬＴ）に対する免疫、及び挿入された外来遺伝子よ
り発現された蛋白に対する免疫反応を惹起させることが
可能な組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）
を提供する。さらには該組換えＩＬＴＶからなる鶏用多
価ワクチン並びにウイルスベクターを提供する。 【構成】 ＩＬＴＶの特定の領域に外来遺伝子、例えば
ウイルスの感染防御抗原または生理活性物質をコードす
る遺伝子等を組み込むことにより、ＩＬＴＶの機能も維
持した外来遺伝子発現組換えＩＬＴＶを構築する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニワトリ細胞またはニ
ワトリ体内において外来遺伝子を発現させることが可能
な新規な組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス（以下、Ｉ
ＬＴＶと略す）に関するものである。さらには、これを
用いたニワトリ用多価ワクチンおよびホルモンを始めと
する生理活性物質の生体内投与のためのウイルスベクタ
ー並びにこれらの調製法に関するものである。

【０００２】

【従来技術】現在の養鶏分野においては、種鶏、採卵鶏
及び肉用鶏の別を問わず、ワクチン接種による疾病予防
は重要な衛生対策の柱である。しかしながら、そのワク
チン接種の実態は実に過密とも言える程頻繁であり、し
たがってこれに要する人件費の大きさは養鶏家にとって
莫大な経済負担となっている。この点の打開策として、
一つには既存の数種のワクチンを単純に混合することが
考えられる。しかしながら、生ワクチンの場合にはウイ
ルス相互の干渉という問題があり、また、不活化ワクチ
ンの場合においても容量的な限界がある。

【０００３】さらにこれらの問題に加えて、生ワクチン
と不活化ワクチンの混合の場合には、使用するアジュバ
ントへの生ワクチン抗原の吸着による力価低下という問
題があり、従来の技術ではまだ多くの問題が残されてい
る。

【０００４】最近ではこのような点を踏まえ、第二の打
開策としてウイルスベクターの使用が試みられている。
すなわち、ある１つのウイルスに他の複数のウイルスの
ワクチン抗原の遺伝子を組み込んだ多価生ワクチンであ
る。この方法によると、前述したようなウイルス相互の
干渉や容量的な問題を生じない多価ワクチンの作出が可
能になると考えられる。

【０００５】これまでに、ウイルスをベクターとして使
用することを目的とした研究は、ワクシニアウイルス、
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイル
ス等で実施されており、いずれもインビトロの系におい
て他のウイルスの糖蛋白抗原の発現に成功している。し
かしながら、これらのウイルスのあるものは腫瘍原性を
有するウイルスに属することから、ヒトまたは動物へ投
与することは安全性の面で問題が多く現実的ではない。
また、ウイルス自体の安全性に問題がなくとも、本発明
が目的とする鳥類へのウイルスベクターという観点から
見た場合、これらは鳥類が本来の宿主ではないことか
ら、仮に鳥類へのウイルスベクターとして使用されても
その効果に多くは期待できない。

【０００６】このような点から、鳥類のポックスウイル
ス（例えばニワトリの鶏痘ウイルス）をベクターとして
使用することが考えられ、既にウイルスベクターとして
確立されている。しかしながら鶏痘ワクチンは穿刺接種
という特殊な方法であり、確実に接種するにはある程度
の熟練を要す。また、鶏痘ワクチンは細胞随伴性の形態
では無いため、少なからず移行抗体の影響を受け、抗体
が上がらない個体も少なくない。

【０００７】鶏伝染性喉頭気管炎は、α−ヘルペスウイ
ルスに属する鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスによって引き
起こされる鶏の呼吸器病の一つである。これまで鶏伝染
性喉頭気管炎に対するワクチンとしては生ワクチンが広
く応用されてきたが、これらは14日齢以上のヒナに点眼
または点鼻接種せねばならず、多大な労力を要するもの
であった。これに対し、先に本発明者らは、ＩＬＴＶ感
染細胞を凍結した生ワクチンが極めて優れていることを
見いだし（特公平3-17807）、該感染細胞からなるワク
チンの開発に成功している。このＩＬＴＶ感染細胞凍結
生ワクチンは従来のものと異なり初生ヒナの筋肉内を始
めとして皮下、点眼といういずれのルートでも接種可能
であり、また感染細胞という形態をとることより親から
の移行抗体の影響を受けることなく初生ヒナでも十分な
抗体応答が期待される画期的なものである。また、本ワ
クチンに用いられる株は、野外から分離された強毒株を
鶏腎臓初代細胞（以下ＣＫ細胞と略）及び鶏胚初代細胞
（以下ＣＥ細胞と略）で継代することにより弱毒化され
ており、かつ、ＣＥ細胞に純化されていることよりＣＥ
細胞で増殖させることが可能である。よって、本ワクチ
ンはＣＫ細胞で製造していた従来のワクチンに比べて格
段に低コスト、短時間での製造が可能となっている。

【０００８】現在、単純ヘルペスウイルス、牛ヘルペス
ウイルス１型、マレックウイルスなどヘルペスウイルス
をベクターとする研究が世界的に盛んである。近年、マ
レックウイルスをウイルスベクターとする研究が積極的
に行われているが、鶏痘ウイルス同様、マレックウイル
ス中に挿入可能な外来遺伝子の長さ及び数は限られるた
め、３〜４種類以上の多価ワクチンにするためにはそれ
ぞれに異なる外来遺伝子を挿入した数種類の組換えマレ
ックウイルスを混合せねばならないことが予想される。

【０００９】そこで本発明者らは、同じヘルペスウイル
スでありながら腫瘍原性がなく、生ワクチンとしてその
有用性、効果が確立されているＩＬＴＶに着目した。Ｉ
ＬＴＶは他のヘルペス属ウイルスに比べてその遺伝子解
析は大きく遅れており、僅かに２〜３の制限酵素地図が
示されているのみである［Arch. Virol., 119, P181-19
8 (1991)］。また、ＩＬＴＶのウイルスベクターとして
の可能性も全く未知数である。しかしながら、ＩＬＴＶ
としての機能を損なうことなく、ＩＬＴＶにて外来遺伝
子を発現させること可能となれば、優れた鶏用のウイル
スベクターとなり、さらには、該組換えＩＬＴＶを、他
の組換えウイルスベクター等（例えば、組換えマレック
ウイルス）と混合することにより、より多くの疾病に対
応可能な優秀なワクチンとすることができる。

【００１０】

【発明の目的】このような中で、鳥類を宿主とし、免疫
持続時間が長く、初生時に接種可能なウイルスを利用し
た効果的なウイルスベクターの開発としてＩＬＴＶを用
いて鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、ＩＬＴＶ−
ＤＮＡ中に外来遺伝子を非常に効率よくかつ安定的に組
み込むことのできる部位を見い出した。さらにそのよう
にして構築した組換えＩＬＴＶは、挿入した外来遺伝子
をインビトロにおいて安定的に発現し、鳥類用多価ワク
チンに用いられるウイルスベクター及び各種哺乳動物病
原因子の感染防御抗原を発現するウイルスベクターとし
ても極めて有用であることが示された。すなわち、本発
明は、鳥類を始めとして各種哺乳動物用ワクチンとして
利用することが可能な新規な組換えウイルス並びにその
製法を提供するものである。

【００１１】

【発明の構成および効果】一般に、組換えウイルスを調
製する際には下記の(1)〜(4)のステップに従い調製され
る。(1)ウイルスＤＮＡのベクタープラスミドへのクローニ
ング ＩＬＴＶ−ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動により各断片を分離してゲルより回収
し、回収した各断片をベクタープラスミドにクローニン
グする。

【００１２】(2)外来遺伝子のインサーションプラスミ
ドの構築 まずプラスミドにクローニングされた各ウイルス断片を
任意な酵素で一ヶ所切断または一部欠損させる。これに
動物細胞内で機能するプロモーターを発現されるべき構
造遺伝子の上流に持つ形で外来遺伝子を挿入する。

【００１３】(3)インサーションプラスミドのウイルス
感染細胞への形質導入 ウイルスＤＮＡへの外来遺伝子を含むウイルス断片の相
同組換えは、感染性ウイルスＤＮＡとインサーションプ
ラスミドを同時に細胞に形質導入する方法、あるいは培
養細胞にウイルスを感染させた後インサーションプラス
ミドを導入するという方法が用いられる。相同組換え
は、ウイルスＤＮＡが細胞内で複製する過程において、
インサーションプラスミド上のウイルス由来のＤＮＡ断
片と相同部分において組換えを起こし、その結果とし
て、挿入した外来遺伝子がウイルスＤＮＡ上に取り込ま
れるものである。

【００１４】(4)外来遺伝子を保持する組換えウイルス
の選択 組換えウイルスの選択方法に関しては、抗原性あるいは
生理活性などを指標とした方法、また、その活性を容易
に検出可能な酵素等のマーカー遺伝子を組み込まれた組
換えウイルスを予め作出し、そのマーカー遺伝子と同部
位で組換えを行い、マーカー遺伝子が発現していないク
ローンを選抜する方法が有用である。本方法は非常に簡
便でかつ、あらゆるウイルスの組換え体のクローニング
に応用可能な優れた手法である。

【００１５】本発明の組換えＩＬＴＶも基本操作として
は上記の工程に従い調製されるが、さらに下記の様な特
徴を有する操作により調製されるものである。

【００１６】外来遺伝子を組み込む為のＩＬＴＶ親株と
しては、ＩＬＴＶの特定のウイルス株に限定されるもの
ではないが、親株としての好ましい株の一例として、本
発明者らが先に調製したＣＥ株が挙げられる。該ＣＥ株
は、ＣＥ細胞での良好な増殖を示すことなどより、ワク
チン製造等において極めて有用なものである。通常、外
来遺伝子が挿入された組換えウイルスは、その増殖性は
明らかに低下するとされている[Bernard Meignierら、T
he Herpes viruses 4,p26(1985)]。しかしながら今回の
試験で示されるように、本発明に従い調製される組換え
ＩＬＴＶは、ＣＥ細胞での増殖性に関しては、その親株
であるＣＥ株と何ら変わる事無く良好な増殖を示すもの
であった。このことより、ＣＥ株に他のウイルスの感染
防御抗原を組み込んだ組換えＩＬＴＶは、ＣＥ細胞で製
造することが可能となり、従来のワクチンより安価で提
供することが可能となる。

【００１７】ＣＥ株を用いたワクチンに関しては上市以
来現在まで、非常に優良なワクチンであることが野外に
おいて示されているが、本発明で示した組換えＩＬＴＶ
もＣＥ株と同等な性状を示すことより、ＩＬＴＶ−ＣＥ
株も優良なウイルスベクターになり得るものと思われ
る。

【００１８】本発明に従い他の疾病に対するワクチン抗
原をコードする外来遺伝子をＩＬＴＶに組み込み、これ
を生もしくは不活化した状態で発育鶏卵、初生雛および
成鶏に接種した場合、本来のＩＬＴＶと同様な機序によ
り、本組換えウイルス接種個体内において挿入した該抗
原に対する免疫が誘導されることが期待される。即ち、
本発明に従えば、ニワトリなど鳥類へ１回の接種で鶏伝
染性喉頭気管炎のみならず、他の複数の疾病に対する免
疫を賦与することが可能となる。

【００１９】本発明の、組換えＩＬＴＶの構築に用いら
れる鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺伝子断片とし
ては、ＩＬＴＶ−ＤＮＡを制限酵素XbaＩで処理して得
られる約2.7kbpの遺伝子断片及び／または鶏伝染性喉頭
気管炎ウイルスＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を含む
遺伝子断片もしくはこれらの一部が用いられる。該繰り
返し配列を含む遺伝子断片としては、ＩＬＴＶ−ＤＮＡ
を制限酵素SmaＩで処理して得られる約５kbpの断片を基
本単位とする遺伝子断片がその好ましい例として挙げら
れる。

【００２０】これらのＩＬＴＶ由来遺伝子断片中の単一
制限酵素部位に挿入するか、該遺伝子断片中の一部の遺
伝子と置換することにより、外来遺伝子がプロモーター
の下流に接続された外来遺伝子発現カセットをＩＬＴＶ
由来ＤＮＡ中に組み込む。このようにして得られた組換
え遺伝子断片を用いてＩＬＴＶ親株に形質導入すること
により、ＩＬＴＶゲノム上の上記の領域中に外来遺伝子
カセットが組み込まれた組換えＩＬＴＶを調製すること
ができる。このようにして、ＩＬＴＶとしての機能を損
なうことなく、目的の外来遺伝子を効率よく発現するこ
とが可能な組換えＩＬＴＶを得ることができる。

【００２１】上記の約2.7kbpのXbaＩフラグメント中
に、目的の外来遺伝子発現カセットを挿入する場合に
は、好ましい挿入部位として、例えばSacＩサイトが挙
げられる。また、約６kbpのSmaＩフラグメントを用いる
場合には、例えば、このフラグメント中のXbaＩ〜SnaB
Ｉ領域と目的の外来遺伝子発現カセットを置換すること
により形質導入用組換え遺伝子断片を調製することがで
きる。

【００２２】ＩＬＴＶゲノムに組み込まれる外来遺伝子
としては、各種鶏病疾病のワクチン抗原となり得る蛋白
質をコードする種々の遺伝子が挙げられる。例えば、鶏
を対象とした多価ワクチンの調製においてはその組み込
む外来遺伝子として、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤ
Ｖ）抗原をコードする遺伝子、例えば、ＮＤＶ−Ｆ蛋白
またはＮＤＶ−ＨＮ蛋白をコードする遺伝子、伝染性フ
ァブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のウイルス構造
遺伝子をコードする遺伝子、伝染性気管支炎ウイルス
（ＩＢＶ）のスパイク蛋白をコードする遺伝子並びに伝
染性コリーザの原因菌であるヘモフィルス・パラガリナ
ルム（Haemophilus paragallinarum）のＨＡ蛋白をコー
ドする遺伝子などが挙げられる。この他、クリプトスポ
リジウム、コクシジウム、ロイコチトゾーン、カンピロ
バクター、ブドウ球菌、サルモネラ菌、マイコプラズ
マ、ニワトリ貧血ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス等
の感染防御抗原も挿入され得る外来遺伝子として挙げら
れるが、これらに格段限定されるものではない。

【００２３】本発明者等は、マーカー遺伝子として大腸
菌由来のＬａｃＺ遺伝子を用いて組換えＩＬＴＶを調製
した。その結果、本発明の組換えＩＬＴＶが多価ワクチ
ンとして有用であることを見い出した。このようにして
調製されたＬａｃＺ（＋）ＩＬＴＶは、さらにウイルス
抗原等をコードする遺伝子発現用の遺伝子カセットをＬ
ａｃＺ遺伝子中に組み込んだ組換え遺伝子断片を用い
て、さらに遺伝子の相同組換えを行うことにより、Ｌａ
ｃＺ遺伝子が目的のウイルス抗原等発現遺伝子に置換さ
れた組換えＩＬＴＶを容易に調製することが可能にな
る。また、この他、発現されるべくウイルスに組み込ま
れた外来遺伝子及び発現される抗原に応じた測定法も使
用可能である。例えば、ニューカッスル病との多価ワク
チンを目的としＮＤＶ−Ｆ抗原を発現する組換えＩＬＴ
Ｖを調整する場合にはＮＤＶ−Ｆ抗原の検出をその感染
細胞において行うことにより、目的とするニューカッス
ル病ワクチンとなり得る組換えＩＬＴＶを選択できる。

【００２４】このようにして得られる本発明の組換えＩ
ＬＴＶは、鳥類、特にニワトリ用の多価生及び不活化ワ
クチンとして非常に有効となり得る。すなわち、ニワト
リの他の感染症に対するワクチン抗原をコードする遺伝
子を発現可能な形で組み込まれた組換えＩＬＴＶは、Ｉ
ＬＴＶが本来持つ性状に従って、非常に優れた免疫効果
を有する極めて利用価値の高い多価ワクチンとなる。以
下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明するが、本
発明は何らこれらに限定されるものではない。

【００２５】

【実施例】実施例１ ：組換えＩＬＴＶ−ＬａｃＺの作出(1)ウイルスＤＮＡの精製 本発明には、現在、鶏伝染性喉頭気管炎生ワクチンの製
造に用いているＩＬＴＶ−ＣＥ株を供試した。

【００２６】まず、ＩＬＴＶ−ＣＥ株［農林水産省家畜
衛生試験場より分与された強毒ＩＬＴＶ NS-175株（以
下、NS-175株と略）を鶏腎初代細胞（以下、ＣＫ細胞と
略）で38代継代、さらに鶏胚初代細胞（以下、ＣＥ細胞
と略）で15代継代した株。尚、本株は、鶏伝染性喉頭気
管炎生ワクチン製造用株として、昭和56年４月16日付で
農林水産省指令56畜Ａ第1083号で承認された］をＣＥ細
胞に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を強く呈した時点
で感染細胞を回収し平井等の方法［J.gen.Virol.,45,p1
19 (1979)］に従ってＩＬＴＶ−ＤＮＡを精製した。即
ち、まずＣＰＥを強く呈した感染細胞に２倍量の 1%-NP
40溶液 (0.01M-Tris-HCl, pH7.4, 0.01M-NaCl, 0.015M-
MgCl2)を加えて３０分間氷冷した後ピペッティングし
た。この溶液を2500回転で10分間遠心し、その上清を40
%-60%(w/w)のショ糖溶液 (0.02M-Tris-HCl, pH7.4, 0.1
5M-NaCl)に重層、175KGで２時間遠心後、40%ショ糖溶液
と60%ショ糖溶液の中間に形成されたＩＬＴウイルスに
由来するカプシド層を分取した。さらに、この中間層を
再度トリス緩衝溶液 (0.02M-Tris-HCl, pH7.4, 0.15M-N
aCl)に懸濁し、160KGで１時間遠心して沈殿させた。こ
の沈殿物をプロテイネースＫ（ベーリンガーマンハイム
山之内）を0.1%に含む1%-SDS溶液 (0.1%-Tris-HCl, pH
7.4, 0.01N-EDTA, 1%-Sarcocinate;半井化学)に浮遊さ
せ、37℃で一晩放置した。その後、フェノール処理、エ
タノール沈殿によりＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝溶液 (10
mM-Tris-HCl,pH8.0,1mM-EDTA) に溶解し、10%-30%のグ
リセロールグラディエント溶液に重層後、175KGで４時
間遠心した。次に管底より溶液を分画し、ウイルスＤＮ
Ａを含む画分をとり、10%-トリクロル酢酸を加えてＤＮ
Ａを沈澱させ、回収した。

【００２７】(2)ウイルスＤＮＡのクローニング及びイ
ンサーションプラスミドの構築 精製ＤＮＡ 1μg を制限酵素 XbaＩで切断し、0.8%−ア
ガロースゲル電気泳動で各断片に分離したところ、約80
0bpにモル比の高い断片が認められ、繰り返し配列の存
在が示唆された。泳動により分離されたそれぞれの断片
をゲルより切り出して透析膜に入れ、エレクトロエリュ
ーション法によりＤＮＡをゲルから抽出し、フェノール
・エーテル処理、エタノール沈殿により精製した。精製
した各断片は、予め XbaＩで切断後アルカリフォスファ
ターゼ処理したベクタープラスミド（pUC119のマルチク
ローニングサイトにおいてEcoRＩからBamHＩまでを除い
たもの：ΔpEB）とＴ４リガーゼにより接着した。次
に、構築した各プラスミド中の ＩＬＴＶ−ＤＮＡ部分
で１ヵ所だけ切断する制限酵素で処理し、大腸菌由来の
ＬａｃＺ遺伝子にＳＶ４０初期プロモーター遺伝子を連
結したＤＮＡ（4.2kbp）をその部位にＴ４リガーゼによ
り挿入した (pXKSL,図１）。こうして構築されたプラス
ミドはその後、適当なコンピテントセル（例えばJM10
9）に形質転換し、ＬＢ培地で増殖後、アルカリ法によ
り大腸菌菌体内より回収した。

【００２８】(3)組換えＩＬＴＶ（ＩＬＴＶ−ＸＫＬ
株）の構築 37℃で一晩培養した初代ＣＥ細胞を ＥＤＴＡ−トリプ
シン溶液でハーベストし、5%牛胎児血清（ＦＢＳ）添加
イーグル−ＭＥＭ（Ｅ．ＭＥＭ；日水）培地に20万個／
mlの細胞濃度で浮遊しその40mlをファルコン社製組織培
養フラスコに入れ、これにＣＥ株感染ＣＥ細胞を約670
万個接種し、37℃で７時間培養した。その後再びＥＤＴ
Ａ−トリプシン溶液で細胞をハーベスト、ＰＢＳ(−)で
２回洗浄し、この内500万個の細胞をバイオラッド社製
ジーンパルサー(cat.No.165-2075)のキュベットに移
し、インサーションプラスミド５クローン（各５μg）
をプールして加え、添付のプロトコールに従ってパルス
を加えウイルス感染細胞にインサーションプラスミドの
導入を行った。尚、インサーションプラスミドは予め適
当な制限酵素により線状化したものを用いた。次に、こ
の細胞を５％ＦＢＳ添加Ｅ．ＭＥＭ15mlに浮遊させ、径
10cmシャーレに移し、37℃で一晩培養した。翌日、生着
していない死亡細胞を培養液とともに除去し、新たに前
日培養した初代ＣＥ細胞をハーベスト、５％ＦＢＳ添加
Ｅ．ＭＥＭに５０万個／mlの濃度で浮遊し、その15mlを
シャーレに添加、37℃で一晩培養した。

【００２９】翌日、培養液を除去し、１％牛血清（Ｂ
Ｓ）添加Ｅ．ＭＥＭ を2%寒天（SEA PLAQUE;FMC社） と
等量混合した溶液を細胞に重層、37℃で５〜７日間培養
した。37℃で５〜７日間培養後、フェノールレッド（和
光純薬工業）を5%含む１％ＢＳ添加Ｅ．ＭＥＭ 寒天を
重層してプラークを染色した。その後、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘ−Ｇａｌ；和光純薬工業）を300ng/ml の濃度で
含む１％ＢＳ添加Ｅ．ＭＥＭ 寒天を重層した。重層
後、１０分〜２時間以内に出現したＸ−ｇａｌ活性を示
す青色プラーク５クローンをプラーククローニングして
次代に継代した。この操作を数代繰り返し、安定的な組
換えウイルス５クローン（ＸＫＬ株 No1〜5）を得た。

【００３０】次に、組換えウイルス（ＸＫＬ株）各クロ
ーンのＤＮＡ抽出を行った。ＸＫＬ株を接種したＣＥ細
胞が全面にＣＰＥを呈した時点で培養上清を吸引除去
し、プロテイネースＫ溶液（プロテイネースＫ 1mg/ml,
0.1M-Tris・Cl, 0.1M-NaCl, 0.001M-EDTA, 1%SDS)２ml
注ぎ、37℃で１時間処理、コニカルチューブ（ファルコ
ン社、cat.No.2099)に移し更に一晩37℃で処理した。そ
の後、飽和フェノールにより精製、エタノール沈殿後、
100μl のトリス緩衝液（10mM-Tris・Cl. pH8.0, 1mM-ED
TA:TE緩衝液) に溶解した。抽出したＸＫＬ株ＤＮＡを
用いて、サザンブロットを実施した。サザンブロットに
は、DIG-DNA labeling Kit （ベーリンガーマンハイム
山之内社）を用い、添付のプロトコールに従いプローブ
の作製並びにサザンブロットを行った。即ち、大腸由来
ＬａｃＺ遺伝子 100ngを１０分間加熱して熱変性させた
ものにランダムプライマーを用いてジゴキシゲニンラベ
ル化 dUTPsを含む dNTPs を基質としてプローブを作製
した。サンプルには抽出したＸＫＬ株各クローンとその
原株であるＣＥ株を XbaＩで各断片に切断したものを用
い、各々のサンプルは、0.8%−アガーロースゲル電気泳
動後、ハイボンドN+ （アマシャムジャパン）に トラン
スファーした。

【００３１】ＤＮＡをトランスファーされたフィルター
と作製したプローブをハイブリダイズさせ、添付のプロ
トコールに従い抗ジゴキシゲニン−アルカリ性フォスフ
ァターゼ標識抗体及び５−ブロモ−３−インドリルリン
酸（Ｘ−リン酸）とニトロブルー・テトラゾリウム塩
（ＮＢＴ）を用いた発色反応によりプローブとハイブリ
ダイズする断片を検出した。

【００３２】その結果、大腸菌由来ＬａｃＺ遺伝子をプ
ローブとしたサザンブロットにおいて、ＣＥ株でのハイ
ブリダイズは認められず、ＸＫＬ株ではいずれのクロー
ンにおいても、6.9kbpの断片のみとのハイブリダイズが
認められた（図２）。即ち、得られたクローンはいずれ
も XbaＩで切断したときの 2.7kbp断片にＬａｃＺ遺伝
子を挿入したインサーションプラスミドより変異化され
た組換えウイルスであることが推定された。この点を確
認するために、XbaＩで切断したときの2.7kbp断片をプ
ローブとするサザンブロットを実施した。プローブの作
製及びサザンブロットは、ＬａｃＺ遺伝子をプローブと
したときと同様の方法で行った。その結果、ＣＥ株では
2.7kbp断片と、またＸＫＬ株ではいずれのクローンも
6.9kbp断片とハイブリダイズした（図３）。以上のこと
より、この組換えは相同（ホモロガス）であることが確
認された。

【００３３】(4)ＸＫＬ株のＣＥ細胞における増殖性試
験 作出したＸＫＬ株とＣＥ株についてＣＥ細胞における増
殖性を比較した。単層培養したＣＥ細胞にＸＫＬ株とＣ
Ｅ株をそれぞれ１００ＰＦＵ吸着させ、Ｅ．ＭＥＭによ
り３７℃、炭酸ガスフラン器で培養した。その後６日
間、毎日培養液をサンプリングしてＣＫ細胞に接種し、
そのウイルス量を測定した。その結果、ＸＫＬ株は、そ
の親株であるＣＥ株と同等の良好な増殖性を保持してい
ることが確認された。

【００３４】実施例２：組換えＩＬＴＶ−ＮＤＶ／Ｆの
作出(1)インサーションプラスミドの構築 次にＩＬＴＶにニューカッスル病ウイルスＦ蛋白（ＮＤ
Ｖ−Ｆ）遺伝子を挿入するためのベクタープラスミドの
構築を行った。ベクターには ΔpEBを用い、これにクロ
ーニングされた XbaＩ-2.7kbp断片の SacＩ部位に SV40
後期プロモーター遺伝子を有するＮＤＶ−Ｆ遺伝子（3.
5kbp）を挿入してインサーションプラスミド（pXKNF、
図３）を構築した。

【００３５】(2)組換えＩＬＴＶ（ＩＬＴＶ−ＮＦ株）
の構築 組換えウイルス作出のために、「組換えＩＬＴＶ（ＩＬ
ＴＶ−ＸＫＬ株）の構築」と同様の方法によりＸＫＬ株
を培養し、インサーションプラスミド（pHKNF）の導入
を行い、５〜７日間培養した。その培養上清を希釈して
ＣＥ細胞に接種、１％バクト寒天を重層して４〜６日間
培養した。その後、ＸＫＬ株作出の際と同様の方法、即
ちフェノールレッドとＸ−ｇａｌによりプラーク染色を
行った。今回のクローニングは、β−ｇａｌ活性を示し
ていないプラーク５クローンをプラーククローニングす
ることで次代に継代して行った。この操作を４回繰り返
し、組換えウイルスを純化した。その後、純化したウイ
ルスをＣＥ細胞で培養し、蛍光抗体法により組換えウイ
ルス５クローン中４クローンのプラークがニューカッス
ル病Ｆ蛋白を発現していることを確認した（ＮＦ株 N
o.１〜４）。

【００３６】次に、各ＮＦ株のＤＮＡ抽出を行った。Ｎ
Ｆ株を接種したＣＥ細胞が全面にＣＰＥを呈した時点で
培養上清を吸引除去し、プロテイネースＫ溶液を2ml注
ぎ、37℃で１時間処理し、コニカルチューブに移し更に
37℃で一晩処理した。その後、飽和フェノールにより精
製、エタノール沈殿後、100μlのトリス緩衝液に溶解し
た。抽出したＮＦ株ＤＮＡを用い、サザンブロットによ
りリコンビネーションを確認した。サザンブロットおよ
びプローブの作製は「組換えＩＬＴＶ（ＩＬＴＶ−ＸＫ
Ｌ株）の構築」と同様の方法で行い、プローブにはＮＤ
Ｖ−Ｆ遺伝子 100ng および XbaＩ-2.7kbp断片 100ngを
用いた 。サンプルには抽出したＮＦ株４クローンのＤ
ＮＡとＣＥ株ＤＮＡを XbaＩで切断したものを用いた。
その結果、ニューカッスル病Ｆ蛋白遺伝子をプローブと
したサザンブロットにおいて、ＣＥ株でのハイブリダイ
ズは認められず、ＮＦ株ではいずれクローンも 2.2kbp
と 4.0kbpの断片とのハイブリダイズが認められた（図
４）。これにより、本発明により作出したＮＦ株には、
本来のＣＥ株には存在しないニューカッスル病Ｆ蛋白遺
伝子が挿入されていることが確認された。また、XbaＩ-
2.7kbp断片をプローブとしたサザンブロットにおいてＣ
Ｅ株では2.7kbp、ＮＦ株では2.2kb と4.0kbpの断片との
ハイブリダイズが認められた（図４）。ここで、検出さ
れた両断片のサイズの差である3.5kbpは挿入したニュー
カッスル病Ｆ蛋白遺伝子のサイズと一致している。以上
の結果より、相同組換えによりニューカッスル病Ｆ蛋白
を発現するＩＬＴＶの作出が確認された。

【００３７】実施例３：組換えＩＬＴＶ−ＮＤＶ／ＨＮ
の作出 ＩＬＴＶ−ＮＦ株の作出に準じ、ニューカッスル病ＨＮ
（ＮＤＶ−ＨＮ）遺伝子を発現する組換えＩＬＴＶ（Ｉ
ＬＴＶ−ＮＨＮ株）の作出を行った。インサーションプ
ラスミドは、ΔpEBにクローニングした XbaＩ-2.7kbp断
片のSacＩ部位に SV40後期プロモーター遺伝子を有する
ＮＤＶ−ＨＮ遺伝子（1.9kbp）を挿入して構築した（図
５）。ＮＦ株作出の際と同様の方法で純化したウイルス
は、ＣＥ細胞で培養後、蛍光抗体法により５クローン中
４クローンがＨＮ蛋白を発現していることを確認した
（ＩＬＴＶ−ＮＨＮ株 No.1 〜4）。

【００３８】得られた４クローンをＣＥ細胞に接種後、
ＮＦ株と同様の方法でＤＮＡを抽出した。抽出した各Ｎ
ＨＮ株ＤＮＡを XbaＩで切断したものをサンプルとして
サザンブロットを行った。プローブの作製およびサザン
ブロットは、ＸＫＬ株作出の際と同様の方法で行った。

【００３９】その結果、ＮＤＶ−ＨＮ遺伝子をプローブ
としたサザンブロットにおいて、ＣＥ株でのハイブリダ
イズは認められず、ＮＨＮ株ではいずれも 3.7kbpと0.9
kbpの二つの断片とのハイブリダイズが確認された（図
６）。これにより、組換えにより作出したＮＨＮ株 No.
1〜4のいずれのクローンにも、その親株であるＣＥ株に
は存在しないＮＤＶ−ＨＮ遺伝子が挿入されていること
が確認された。また、XbaＩ-2.7kbp断片をプローブとし
たサザンブロットにおいてはＣＥ株では 2.7kbp,ＮＨＮ
株では 3.7kbpと 0.9kbpの二つの断片とのハイブリダイ
ズが確認された（図６）。以上より、相同組換えの結
果、ニューカッスル病ＨＮ蛋白を発現するＩＬＴＶの作
出が確認された。

【００４０】実施例４：組換えＩＬＴＶ−ＬａｃＺ（Ｓ
ＲＮＬ株）の構築(1) ウイルスＤＮＡのクローニング及びインサーション
プラスミドの構築 ウイルスＤＮＡ１μlを制限酵素SmaＩまたはKpnＩで切
断し、0.8％アガロースゲル電気泳動で各断片に分離し
たところ、繰り返し配列の存在を示唆するパターンが認
められた。これを実施例１と同様の方法によりＩＬＴＶ
−ＣＥ株をXbaＩで切断したときに得られる約880bp断片
をプローブとしたサザンブロットを実施した。その結
果、各サンプルにおいて繰り返し配列が認められた。こ
の中で、SmaＩで切断したサンプルにおいては5〜13kbp
の範囲で約880bpの間隔の断片が認められた（図７）。
泳動により分離された断片から、約6kbpのものを切りだ
して透析膜に入れ、エレクトロエリューション法により
ゲルから抽出し、フェノール処理、エーテル処理、エタ
ノール沈澱により精製した。精製した断片は予めSmaＩ
で切断後アルカリフォスファターゼ処理したベクタープ
ラスミド（pUC119のBamHＩからHindIIIまでを除いたも
の）とT4リガーゼにより接着した。次に、このプラスミ
ドをXbaＩ及びSnaBＩで処理し、7.5kbpの断片をゲルか
ら切り出し、フェノール処理、エーテル処理、エタノー
ル沈澱により精製後、アルカリフォスファターゼ処理し
た。ここに大腸菌由来LacＺ遺伝子にSV40初期プロモー
ター遺伝子を連結したＤＮＡ（4.2kbp）とをT4リガーゼ
により接続した（ｐＳＲＮＬ、図８）。こうして構築さ
れたプラスミドはその後、適当なコンピテントセルに形
質転換し、ＬＢ培地で増殖後、アルカリ法により大腸菌
体内より回収した。

【００４１】(2) 組換えＩＬＴＶ（ＩＬＴＶ−ＳＲＮ
Ｌ）の構築 組換えウイルス作出のために、実施例１−(3)と同様の
方法にによりＣＥ株を培養し、インサーションプラスミ
ド（pSRNL）の導入を行い、５〜７日間培養した。その
培養上清を希釈してＣＥ細胞に接種、１％バクト寒天を
重層して、４〜６日間培養した。その後、実施例１−
(3)と同様の方法、すなわち、フェノールレッド、Ｘ-ga
lによるクローニングを数代繰り返し、安定的な組換え
ウイルス５クローン（ＳＲＮＬ株 No.１〜５）を得た。
これら５クローンについてはＤＮＡ抽出後、サザンブロ
ットによりLacＺ遺伝子の存在を確認した。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＸＫＬ株作出に用いたインサーションプラスミ
ドｐＸＫＳＬの構成を示す。

【図２】ＣＥ株及びＸＫＬ株を XbaＩで切断後、LacＺ
遺伝子及び2.7kbp断片のプローブとして行ったサザンブ
ロットの結果を示す。

【図３】ＮＦ株作出に用いたインサーションプラスミド
ｐＸＫＮＦの構成を示す。

【図４】ＣＥ株及びＮＦ株をXbaＩで切断後、ＮＤＶ−
Ｆ蛋白遺伝子及び2.7kbp断片をプローブとして行ったサ
ザンブロットの結果を示す。

【図５】ＮＨＮ株作出に用いたインサーションプラスミ
ドｐＸＫＨＮの構成を示す。

【図６】ＣＥ株及びＮＨＮ株をXbaＩで切断後、ＮＤＶ
−ＨＮ蛋白遺伝子および2.7kbp断片をプローブとして行
ったサザンブロットの結果を示す。

【図７】ＣＥ株をSmaＩ及びSmaＩ、XbaＩで切断後、Ｃ
Ｅ株の遺伝子の一部をプローブとしたサザンブロットの
結果を示す。

【図８】ＳＲＮＬ株作出に用いたインサーションプラス
ミドｐＳＲＮＬの構築を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/86

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスの遺伝子断
   片を有し、動物細胞もしくは動物ウイルス由来のプロモ
   ーター下流に外来遺伝子を接続された外来遺伝子発現カ
   セットが該遺伝子断片中に組み込まれたプラスミドによ
   り変異されたことを特徴とする組換え鶏伝染性喉頭気管
   炎ウイルス。
2. 【請求項２】 鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺伝
   子断片が、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡを XbaＩ
   で処理したときに得られる約2.7kbpの遺伝子断片もしく
   はその一部である請求項１に記載の組換え鶏伝染性喉頭
   気管炎ウイルス。
3. 【請求項３】 鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺伝
   子断片が、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡ中に存在
   する繰り返し配列を含む遺伝子断片もしくはその一部で
   ある請求項１に記載の組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイル
   ス。
4. 【請求項４】 外来遺伝子が、鶏病病原体の感染防御抗
   原をコードする遺伝子である請求項１の組換え鶏伝染性
   喉頭気管炎ウイルス。
5. 【請求項５】 外来遺伝子が、ニューカッスル病ウイル
   スＦ蛋白遺伝子である請求項４に記載の組換え鶏伝染性
   喉頭気管炎ウイルス。
6. 【請求項６】 外来遺伝子が、ニューカッスル病ウイル
   スＨＮ蛋白遺伝子である請求項４に記載の組換え鶏伝染
   性喉頭気管炎ウイルス。
7. 【請求項７】 ニューカッスル病ウイルス遺伝子が弱毒
   株由来の遺伝子である請求項５または６の組換え鶏伝染
   性喉頭気管炎ウイルス。
8. 【請求項８】 動物細胞もしくは動物ウイルス由来のプ
   ロモーター下流に外来遺伝子が接続された外来遺伝子発
   現カセットを鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺伝子
   断片中に組み込み、得られる組換え遺伝子断片を用いて
   鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムに外来遺伝子発現カ
   セットを組み込むことを特徴とする組換え鶏伝染性喉頭
   気管炎ウイルスの調整法。
9. 【請求項９】 鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺伝
   子断片が、XbaＩで処理したときに得られる 約2.7kbpの
   遺伝子断片である請求項８に記載の組換え鶏伝染性喉頭
   気管炎ウイルスの調整法。
10. 【請求項１０】 鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺
    伝子断片が、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡ中に存
    在する繰り返し配列を含む遺伝子断片もしくはその一部
    である請求項８に記載の組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイ
    ルスの調整法。
11. 【請求項１１】 外来遺伝子発現カセットを鶏伝染性喉
    頭気管炎ウイルス由来の遺伝子断片中に組み込む際に、
    単一の制限酵素部位に挿入して組換え遺伝子断片を調製
    する請求項８の組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスの調
    製法。
12. 【請求項１２】 外来遺伝子発現カセットを鶏伝染性喉
    頭気管炎ウイルス由来の遺伝子断片中に組み込む際に、
    鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の遺伝子の一部と置換
    することにより組換え遺伝子断片が調製する請求項８の
    組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスの調製法。
13. 【請求項１３】 組換え遺伝子断片を調製する請求項８
    の組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスの調製法
14. 【請求項１４】 外来遺伝子が生理活性物質をコードす
    る遺伝子である請求項１に記載の組換え鶏伝染性喉頭気
    管炎ウイルスからなる鳥類への生理活性物質投与ベクタ
    ー。