JP3675569B2 - 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組み換えファウルポックスウイルス及びそれから成るワクチンに関し、さらに詳しくは、ヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ、または糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡおよびｇＩをコードするＤＮＡを、異種外来抗原タンパク質をコードするＤＮＡと共に、その増殖に非必須なゲノム領域に挿入した組み換えファウルポックスウイルス、および当該組み換えファウルポックスウイルスを有効成分とするワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在の養鶏分野においては、種鶏、産卵鶏、及び肉用鶏の別を問わず、ワクチネーションによる疾病予防は衛生管理の柱である。しかしながらワクチネーションのプログラムは実に過密であり、従ってこれに要する人手、時間ならびに経費は大きな問題となっている。
【０００３】
この解決策として、近年、組み換えＤＮＡ技術により、ある病原体より免疫誘導に必要なタンパク質をコードする遺伝子のみを取り出し、これを含む組み換えウイルスを構築することが可能となった。このような組み換えウイルスを組み換え生ワクチンとして接種することにより、挿入した遺伝子がコードする抗原タンパク質に対する免疫を誘導することが可能となった。ポックスウイルスに属するアビポックスウイルスはそのような組み換えウイルスの構築に用いるのに好適なウイルスである。ファウルポックスウイルス（以下、ＦＰＶという）に代表されるこれらウイルスは、大きなゲノムＤＮＡを持ち、その多くの領域がウイルス増殖に非必須であり、同一ウイルスのこれらの非必須領域に複数の抗原遺伝子を挿入することができる。このような組み換えウイルスワクチンは、ワクチンを接種した宿主の液性免疫、細胞性免疫を誘導することができると推測される。この方法は、従来、鶏痘に対する生ワクチンとして使用されてきた弱毒化ＦＰＶに遺伝子工学的手法を用いて外来遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶとして応用されてきた。外来遺伝子として、鶏病ウイルスであるニューカッスル病ウイルスの抗原をコードした遺伝子（以下、抗原遺伝子という）、マレック病ウイルスの抗原遺伝子、鶏インフルエンザウイルスの抗原遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶが構築され、実験的にＳＰＦ鶏に接種して、ワクチン効果を確認している（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７８、２９７−３００（１９９０）；Ｎａｚｅｒｉａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０９−１４１３（１９９２）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、６、５０４−５０８（１９８８））。このように組み換えＦＰＶは、目的に応じて種々の外来抗原遺伝子を挿入することができ、また同時に複数の抗原遺伝子を挿入できるために、１回接種で複数の病原体に対して有効な多価ワクチン可能になり、その結果前述の過密なワクチンプログラム問題の解決策と成りうると有望視されている。
【０００４】
一方、新しいワクチンを実用化する過程で考慮しなければならない重大な事柄の１つに移行抗体が挙げられる。生まれて間もない個体は、免疫機構が未熟なため病原体の感染の危険に曝されている。生体側の防御機能として母親から種々の病原体に対する抗体を受け取り、生まれてくる。このような母親由来の抗体は、移行抗体と呼ばれ、生後数週間、個体を病原体の感染から守ってくれる。しかし、その反面、この時期ワクチンとして接種した弱毒ウイルスも同様に移行抗体によって排除される。この結果、ワクチンによるプライミング効果は得られず、移行抗体が消失するころに病原体に対する感染の危険性が高まる。さらにこの移行抗体は、個体によってその成分、力価にばらつきがあるため、移行抗体の消失時期を見計らって集団ワクチン接種することが望まれるが、実際には不可能に近い。たとえば、ニワトリの初生に接種するニューカッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶという）生ワクチンの場合、初生雛の時期に２、３回の接種を行い、個体の移行抗体価のばらつきによるワクチン効果の低減を最小限に押さえる努力がなされている。また伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶという）ワクチンの場合は、繁殖雌鶏に、およそ２２週令の産卵期の始まる前に不活化した油−乳濁性ウイルスワクチンを接種し、受精卵内に高いレベルの移行抗体を含有させて羽化後の数週間にわたって鶏を保護することを目的としている。かりに、前述のワクチン効果が認められたと文献で報告されている組み換えＦＰＶを実験室レベルで飼育されているＳＰＦ鶏ではなく市販の移行抗体を保有している鶏に接種した場合、移行抗体の影響を受けてワクチン効果が低減すると予想される。さらに、複数の抗原遺伝子を挿入した多価組み換えＦＰＶを接種すれば、それぞれの抗原に対する移行抗体が速やかにこの組み換えＦＰＶを排除するためさらに移行抗体の影響は大きくなり、いずれの抗原に対するワクチン効果もできないことが予想される。
【０００５】
ところで最近の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の研究で、宿主の免疫グロブリン（以下、ＩｇＧという）と結合する特性を有する２つの糖タンパク質ｇＩとｇＥとが同定された。この二つのタンパク質は複合体を形成しており、ＩｇＧのＦｃ領域と結合するＦｃレセプターとしての機能を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２、１３４７−１３５４（１９８８））。組み換えＤＮＡ技術を用いて作製したｇＥあるいはｇＩ遺伝子欠損変異体ＨＳＶはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ＨＳＶ抗体の存在下で、著しく増殖が阻害された（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７７、４３７−４４４（１９９０）；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、７０４６−７０５０（１９９１））。これらの研究結果よりＨＳＶのｇＩ、ｇＥは、ウイルスの抗体の関与する免疫応答より逃避するために重要な役割を果たしていると推測される。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてのｇＩ、ｇＥの機能は未解明であるが、唯一ｇＩ、ｇＥは、ウイルスの増殖に必須ではないことが明らかになっている。
【０００６】
ＭＤＶにおいても最近ｇＩ遺伝子の全長とｇＥ遺伝子の一部の塩基配列が明らかになった（Ｖｅｌｉｃｅｒら、米国特許第５，２５２，７１６号）。しかし、それらの機能面については全く明らかにされておらず、さらにこれらの遺伝子を組み換えウイルスで発現したときにどのような現象が現れるかを予測することは困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、移行抗体の影響を受けにくい新たな組み換えファウルポックスワクチンを得るべく鋭意検討した結果、ファウルポックスウイルスの増殖に非必須な領域に、ヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質であるｇＥをコードするＤＮＡを病原体の抗原遺伝子と一緒に挿入すると、移行抗体による影響を受けにくい新しいタイプのワクチンとして機能する組み換えファウルポックスウイルスが得られることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かくして本発明によれば、ファウルポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に、（１）マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ、またはマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ及び糖タンパク質ｇＩをコードするＤＮＡを含有し、更に（２）異種外来抗原タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組み換えファウルポックスウイルスが提供され、更に当該組み換えファウルポックスウイルスを有効成分とするワクチンが提供される。
【０００９】
本発明の組み換えファウルポックスウイルスは、例えば、以下のようにして調製される。予め親ウイルスであるファウルポックスウイルスの非必須領域を組み込んだプラスミドの当該非必須領域に、親ウイルス内で機能するプロモーターの支配下となるように連結されたｇＥ遺伝死闘を組み込み、プラスミドベクターを得る。ついで、親ウイルス感染細胞にこのプラスミドベクターを導入することにより、相同組み換えを起こさせ、その結果生じたウイルスを選択、純化し、目的とする組み換えファウルポックスウイルスを得る。
親ウイルスとなるファウルポックスウイルス（ＦＰＶ）の具体例としては、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−２２９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２８８、西ヶ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワクチン株由来のウイルスのうち、鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に感染したとき大きいプラークを形成するものなどのごとき狭義のＦＰＶや、ＮＰ株（鶏胎化鳩痘中野株）等のごとき狭義のＦＰＶと近縁のウイルスであって、鳩痘生ワクチン株として使用されるウイルスなどが例示される。これらは、市販または分譲などにより容易に入手できる。
【００１０】
（非必須領域）
本発明で使用される非必須領域は、親ウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域であり、ＴＫ遺伝子領域や特開平１−１６８２７９号に記載されている領域を使用することができる。その具体例としては、例えば前記公報に記載されたＮＰ株ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（約７．３ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．０ｋｂ）、ＢａｍＨＩ断片（約４．０ｋｂ）、ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．２ｋｂ）が挙げられる。
【００１１】
（非必須領域を含有するベクター）
後述する本発明の組み換え用ベクターの構築には、ウイルスの非必須領域をクローニングするためのベクターが用いられる。このようなベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９等のコスミド等のベクターを適当な制限酵素で処理して、常法に従って上述したようなウイルス非必須領域のＤＮＡ断片を組み込むことにより得られる。
【００１２】
（組み換え用ベクター）
本発明で用いる組み換え用ベクターは、抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入された非必須領域を含むものである。前述の非必須領域を含むベクターのウイルス非必須領域に後述するｇＥ遺伝子またはｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子、および抗原遺伝子と、さらにそれぞれ各遺伝子を支配するプロモーターを挿入すればよく、また、そのようなベクター由来の抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入されたファウルポックスウイルスの非必須領域を含む断片を他のベクターに組み込んだりしてもよい。さらに、組み換えファウルポックスウイルスの純化などの効率化のために大腸菌のｌａｃＺ遺伝子などのマーカー遺伝子とそれを発現するための後述するプロモーターを組み込んでもよい。
【００１３】
（ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子）
本発明で用いるｇＥ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、ヘルペス属に属するウイルスのゲノム由来のものであればよい。ヘルペス属ウイルスは、人に感染する単純ヘルペスウイルス、ウシに感染する牛ヘルペスウイルス、馬に感染する馬ヘルペスウイルス、ブタに感染するオーセスキー病ウイルス、猫に感染する猫鼻気管炎ウイルスなど哺乳類に感染するヘルペス属ウイルスや、マレック病ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルスなど鳥類に感染するヘルペス属ウイルス等が挙げられる。ワクチン接種の対象となる動物種に感染するウイルス由来のｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子を利用するのが好ましい。即ち、鶏用ワクチンとして利用するにはマレック病ウイルス由来の遺伝子を用いるのが好ましい。
【００１４】
また本発明に用いるｇＥ遺伝子及びｇＩ遺伝子は、その全長を１００％としたとき、一部の塩基の欠落や挿入、付加などの自然または人工的な変異によって通常約８０％〜約１２０％程度、好ましくは約９０％〜１１０％程度の範囲で全長（塩基の長さ）が変化した遺伝子や、自然または人工的な変異によりｇＥ遺伝子またはｇＩ遺伝子の塩基の一部（ここで言う一部とは、通常、全体の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下）が置換され、別のアミノ酸をコードする塩基に変化した遺伝子であっても、遺伝子によってコードされたタンパク質が、通常天然のｇＥやｇＩの機能と実質的に等価の機能を有しているものであればよい。ここでいう天然のｇＥやｇＩの機能とは、ｇＩとｇＥとの複合体（ｇＩ−ｇＥ）またはｇＥ単独が、ＩｇＧのＦｃ部位と結合する生理活性を有し、その結果、保体または抗体依存性の細胞障害による免疫応答が阻害される機能であり、出生直後の移行抗体の約５０％をまだ保有している生物に、抗原遺伝子、ｇＥ遺伝子、必要に応じてｇＩ遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスをワクチンとして接種し、移行抗体が約１０％程度となった時点で強毒株を接種し、移行抗体が実質的に失われた時点での感染防御率が、ｇＥ、ｇＩ非発現で同じ抗原遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスをワクチンとして接種した群の約１．５倍以上、好ましくは約２倍以上であるときを天然のｇＥ、ｇＩと実質的に等価の機能であると判断する。
【００１５】
本発明において人工的な変異を起こす方法は特に制限されず、常法に従って行うことができる。その具体例としては、天然のｇＥ遺伝子を適当な制限酵素で処理した後、アミノ酸への翻訳の読み枠がずれないように適当なＤＮＡ断片を挿入し（または脱落させて）、再び連結する方法やＦｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎらのインビトロ突然変異法（Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７−６４９７（１９８２））などによりアミノ酸の一部を別のアミノ酸に翻訳するように改変させる方法などが挙げられる。
【００１６】
このようなヘルペス属ウイルス由来のｇＥ遺伝子としては、マレック病ウイルスＩ型ＧＡ株由来の配列番号１３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１の第１２０７番目〜第２６９７番目の配列が挙げられる。また、ヘルペス属ウイルス由来のｇＩ遺伝子としては、マレック病ウイルスＩ型ＧＡ株由来の配列番号１２記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１記載の第１番目〜第１０６５番目の配列が挙げられる。
【００１７】
本発明においては、ｇＥ遺伝子のみでも移行抗体の影響を受けにくいワクチンとしての効果を得ることはできるが、より高い効果を得るためにはｇＩ遺伝子と共に組み込むのが望ましい。組み換えウイルス中のｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子および後述する抗原の遺伝子の連結の順番は、各遺伝子が実質的にｇＥ、ｇＩおよび抗原タンパク質を発現し得るように連結されている限り特に制限されない。すなわち、５’上流側からｇＥ遺伝子−ｇＩ遺伝子−抗原遺伝子の順番、ｇＩ遺伝子−ｇＥ遺伝子−抗原遺伝子の順番、ｇＥ遺伝子−抗原遺伝子−ｇＩ遺伝子の順番、ｇＩ遺伝子−抗原遺伝子−ｇＥ遺伝子の順番、抗原遺伝子−ｇＥ遺伝子−ｇＩ遺伝子の順番、抗原遺伝子−ｇＩ遺伝子−ｇＥ遺伝子の順番の何れであっても構わないが、操作上の簡便さから、ｇＩ遺伝子の後ろ（３’側）にｇＥ遺伝子が連結され、抗原遺伝子はこれらの遺伝子の５’側または３’側に連結するのが望ましい。また、組み換えウイルスの選択に有用なマーカー遺伝子を組み込む場合、その連結部位も特に制限されない。これらの遺伝子の連結方法も特に制限されず、適当なリンカー等を用いて各遺伝子を連結させて予め挿入すべき遺伝子を作製する方法や各遺伝子を有するベクターを用いる相同組み換えにより組み換えベクターを直接作製する方法などの常法に従って連結することができる。
【００１８】
（異種外来抗原タンパク質、抗原遺伝子）
本発明において異種外来抗原タンパク質は、親ウイルスとは異なるウイルスや細菌由来のタンパク質であり、親ウイルス中で転写、翻訳されて抗原タンパク質として発現されるものであればよい。鶏用ワクチンを得る場合の異種抗原タンパク質をコードするＤＮＡ（抗原遺伝子）の具体例としては、ＭＤＶの糖タンパク質をコードする遺伝子（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１７８９−１８０４（１９８８））、ＮＤＶのＨＮをコードする遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、１９１７−１９２７（１９８６））、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（ＭｃＧｉｎｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５、３４３−３５６（１９８６））、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの構造タンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７１、１３０３−１３１２（１９９０））等の感染防御に関与した抗原をコードした遺伝子が好ましい。
【００１９】
（プロモーター）
本発明で用いるプロモーターは、組み換えファウルポックスウイルス感染宿主中でプロモーターとして機能するののであれば、特に限定されない。例えば、７．５Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、１１Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーターなどが例示されるほか、プロモーターとして機能する限りにおいては、一部を削除するなど改変したものであってもよく、また合成されたものであってもよい。本発明のおいては、初期プロモーターと後期プロモーターの両方の配列を有する合成プロモーター（Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、７４９−７６９、およびｐ７７１−７８１（１９８９））やその一部をプロモーター活性が喪失しない範囲で削除する、塩基を変更するなどして改変したもの（例えば、塩基配列が、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣ−３’で示されるもの）を用いることが特に好ましい。なお、この合成プロモーターあるいはその改変物は、その塩基配列の５’側の端にＴ（チミジン）が多数連続しているが、プロモーター活性の高さ、抗原遺伝子の発現量の多さの点から、１５〜４０個のＴが連続していることが好ましく、１８〜３０個のＴが連続していることがより好ましい。
【００２０】
もちろん、ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子、抗原遺伝子、マーカー遺伝子をそれぞれ支配するように、プロモーターを連結させることができるが、各遺伝子に連結したプロモーターは、必ずしも同じプロモーターである必要はない。
【００２１】
（組み換えファウルポックスウイルスの作製方法）
組み換えファウルポックスウイルスの作製方法は特に限定されず、常法に従って行えばよい。すなわち、予め親ウイルスを感染させた細胞に、例えば、リン酸カルシウム共沈法等によりｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子、抗原遺伝子等を有する組み換えベクターが導入されることにより、ベクターと感染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み換えが起こり、組み換えファウルポックスウイルスが構築される。得られた組み換えウイルスは、イーグルＭＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、生育してくるプラークを組み込んだ抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法や、抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現等の方法により候補株を純化し、組み込んだ抗原遺伝子によりコードされたポリペプチドに対する抗体を使用し、イムノアッセイ等の方法により、目的の組み換えファウルポックスウイルスであることを確認すればよい。例えば、マーカー遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換えファウルポックスウイルスの場合、β−ガラクトシダーゼを発現する。よって、その気質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）存在下で青いプラークを形成するので、その性質を利用して選択、純化することができる。宿主細胞としては、用いるウイルスが感染し、増殖することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、鶏繊維芽（ＣＥＦ）細胞や、発育鶏卵しょう尿膜細胞等が挙げられる。
【００２２】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、１種類以上の本発明の組み換えファウルポックスウイルスからなるワクチンである。即ち、本発明により開示されたＭＤＶ由来のｇＥ遺伝子またはｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子、および抗原遺伝子等を有する組み換えウイルスを単独で用いるほか、他の２〜３種類の組み換えウイルスを組み合わせてもよい。また、組み換えファウルポックスウイルス以外にも薬理学的に問題のないキャリアー、例えば生理食塩水、安定剤などを含んでいてもよい。本発明のワクチンの調製方法は特に限定されない。例えば、本発明で組み換えファウルポックスウイルスが生育することのできる細胞を、本発明の組み換えウイルスで感染し、組み換えファウルポックスウイルスが増殖するまで培養する。その後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分離機によって遠心分離チューブ中で沈殿物と組み換えファウルポックスウイルスを含んだ高力価上清とに分離する。本質的に宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み換えファウルポックスウイルスを含んだこの遠心上清は、本発明のワクチンとして使用できる。また、薬理学的に受け入れられる生理食塩水などのようなもので、希釈して使用してもよい。遠心上清を凍結乾燥することにより凍結乾燥ワクチンとしても利用できる。
【００２３】
本発明のワクチンが鶏用ワクチンである場合、ワクチン中の組み換えウイルスが家禽に感染して防御免疫を引き起こすような方法であれば、どのような方法で家禽に投与してもよい。例えば、翼膜穿刺、皮膚に引っかき傷をつけてワクチンを接種したり、注射針やその他の器具で家禽の皮下にワクチン接種することができる。また、ワクチンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料の固形物に混入して、経口接種させることも可能である。さらに、エアロゾルやスプレーなどによるワクチンを吸入させる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種法等を用いることもできる。
【００２４】
接種量は、例えば、鶏の場合、１羽あたり通常１０〜１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）であり、好ましくは１０２〜１０４ＰＦＵである。注射する場合には、この量を生理食塩水等の薬理学的に受け入れられる液体で希釈して０．１ｍｌ程度にすればよい。本発明のワクチンは、普通のワクチンと同様の条件下で保存、使用することが可能である。例えば、本発明の組み換えウイルスを凍結乾燥すれば、冷蔵庫（０〜４℃）での保存が可能であり、さらに短期間であれば室温（２０〜２２℃）での保存も可能である。また、ウイルスの懸濁液を−２０〜−７０℃にして凍結させ、保存することも可能である。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００２６】
（実施例１）ＭＤＶのＧＡ株ゲノムＤＮＡの抽出
ＭＤＶのＧＡ株が感染したＣＥＦ細胞をトリプシン処理でシャーレにより回収し、ＰＢＳで２回その細胞を洗った後、プロテナーゼＫバッファー（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）で懸濁し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を５０μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。５５℃で２時間放置した後、フェノール／クロロホルムで２回、タンパク質の除去を行い、２倍量のエタノールを加えて−２０℃で２０分間放置した後、遠心し、ＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡを得た。
【００２７】
（実施例２）ＭＤＶのｇＩ、ｇＥ遺伝子のクローニング
ｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とをＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡからクローンニングするためにＶｅｌｉｃｅｒらが発表したＭＤＶのＧＡ株のユニークショート領域の塩基配列（Ｖｅｌｉｃｅｒら、米国特許第５，２５２，７１６号）をもとに配列番号１および２記載の２種類のＤＮＡプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号１）、５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴ−３’（配列番号２））を使用した。配列番号１のプライマーは、配列番号１１で示されるｇＩ遺伝子の第１番目〜１８番目に記載される塩基配列を含み、配列番号２のプライマーは、配列番号１１で示されるｇＥ遺伝子の第１４９６番目〜１５１８番目に記載される塩基配列を含む。これらのプライマーを用いて実施例１で得たＭＤＶのＧＡ株ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲという）により、ｇＩ遺伝子の全長およびｇＥ遺伝子の一部を有するＤＮＡ断片の増幅を行った。反応組成はＭＤＶゲノムＤＮＡ２０ピコグラムを含む水溶液６４．５μｌに８μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ反応バッファー（２００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ塩化カリウム、２５ｍＭ塩化マグネシウム）、４μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、５Ｕ／μｌ濃度のタックポリメラーゼ０．５μｌおよび２０μｍの各プライマー１μｌづつを加えた。反応条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを５５℃で２分間、ポリメラーゼ反応を７２℃で２分間、３０サイクロをパーキンエルマーシータス社製のサーマルサイクラー４８０で行った。その結果、ｇＩ遺伝子の全長とｇＥ遺伝子の５’末端の一部の塩基配列を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
【００２８】
実施例１で得たＭＤＶのＧＡ株を各種制限酵素で切断後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲル中のＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、前述のＰＣＲ産物をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｇＩ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ ＤＮＡ断片とｇＥ遺伝子を含む約６．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片がハイブリダイズしている事を確認した。これらのＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、それぞれｐＵＣ−ｇＩ−１とｐＵＣ−ｇＥ−１を得た。ｐＵＣ−ｇＥ−１にクローニングした約６．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断して、制限酵素地図を作製した。これを利用して、ｇＥ遺伝子を含む約２．２ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ−ｇＥ−２を得た。ｇＥ遺伝子の全塩基配列（配列番号１１中、第１２０７〜２７００番目の塩基配列）は、サンガーのダイデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７（１９７７））によって、ｐＵＣ−ｇＥ−２の一連の欠失変異体の配列を調べることにより決定した。
【００２９】
（実施例３）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９（図１参照）
プラスミドｐＮＺ９８（特開平３−２７８４号公報記載）を制限酵素ＳａｃＩで部分消化後、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。一方、プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０８（１９９２））をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、この部位に配列番号３と配列番号４に記載の２種類の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号３）、５’−ＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニーリングしたＳｆｉＩ部位を含む合成アダプターを挿入し、プラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを構築した。このプラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、さらに制限酵素ＳａｃＩで部分消化し、前述の約１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ ＤＮＡ断片を挿入して、目的のプラスミドｐＮＺ５９２９を構築した。
【００３０】
（実施例４）抗原遺伝子挿入用プラスミドｐＧＰＴｓおよびｐＧＴＰ７．５の構築
プラスミドｐＧＰＴｓは、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１７１９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０８（１９９２））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’）を挿入し、次にＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号６記載の合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’）を挿入し、最後にＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号７記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’）を挿入して構築した。プラスミドｐＧＴＰ７．５は、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１０３７（Ｏｇａｗａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８、４８６−４９０（１９９０））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩとで消化して得られた約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’）を挿入し、次にＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号６記載の合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’）を挿入し、最後にＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号７記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’）を挿入して構築した。
【００３１】
（実施例５）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥの構築（図２、３参照）
実施例２で得たｐＵＣ−ｇＥ−１を鋳型とし、配列番号８と９に示すプライマーを利用してＰＣＲを行った。反応組成および条件は、実施例２と同様とした。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩとで消化後、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、プラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位の間にＢｇｌＩＩ部位を作るための配列番号１０記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡ−３’）を組み込んで調製したプラスミドｐＵＣ−ＸＧのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣ−ｇＥ−ＰＣＲを構築した。挿入したＤＮＡ断片の塩基配列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見られなかった。このプラスミドｐＵＣ−１８−ｇＥ−ＰＣＲを制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩとで消化後、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ｐＧＴＰｓのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを構築した。このプラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ１８２９−ＳｆｉのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的の組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥを構築した。
【００３２】
（実施例６）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥの構築（図４参照）
実施例５で得たプラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を実施例３で得たＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ５９２９のＳｆｉＩ部位に挿入し、目的の組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥを構築した。
【００３３】
（実施例７）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥの構築（図５、６）
実施例２のＰＣＲで得た約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩで消化後、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで部分消化し、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を実施例４で得たｐＧＴＰ７．５のＢａｎＨＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入して、プラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩを構築した。挿入したＤＮＡ断片の塩基配列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見られなかった。このプラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を実施例３で得たＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ５９２９のＳｆｉＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＩを構築した。次に、実施例５で得たプラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的のＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩｇＥを構築した。
【００３４】
（実施例８）組み換えＦＰＶの作製と純化
単層になったＣＥＦにＦＰＶのワクチンから単離した大型プラーク形成を表現型として持つウイルス（Ｎａｚｅｒｉａｎら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．、３３、４５８−４６５（１９８９））を０．１の感染多重度で感染した。３時間後、これらの細胞をトリプシン処理で剥がし、細胞懸濁液とした。この懸濁液からの２×１０７個の細胞と１０μｇの組み換え用プラスミドの混合物をＳａｌｉｎｅ Ｇ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁し、室温において、ジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓｅｃ条件下で、エレクトロポレーションした。プラスミドを導入した細胞を、その後、３７℃で７２時間培養し、３回の凍結乾燥によって細胞を溶解した。放出した組み換えウイルスは次のように選別された。
【００３５】
溶解した細胞から放出された子孫ウイルスを含んだ溶解液の１０倍段階希釈液を継代したＣＥＦに感染させ、生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層した。室温中で寒天を固めた後、典型的なＦＰＶのプラークが出現するまで３７℃で培養した。さらにＢｌｕｏ−ｇａｌを２５０μｇ／ｍｌ含んだ別の寒天をそれぞれの培養プレートに重層し、さらに２４時間３７℃で培養した。すべての子孫ウイルスに対して、およそ１％の比率で青色プラークが出現した。これらの青色プラークを単離し、含まれているウイルスを回収し、形成する全てのプラークがＢｌｕｏ−ｇａｌで青く染まるまで、同じ方法でさらに組み換えウイルスの純化を行った。通常、この過程は３〜４回で終了する。この純化されたウイルスを、ｆＮＺ５９２９と名付けた。このｆＮＺ５９２９は、サザンハイブリダイゼーション法により解析され、ＮＤＶのＦ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子が予想通りの位置にあることが確認された。実施例４、５、６で示した組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ、ｐＮＺ５９２９−ｇＥ、ｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥは、上記と同様の方法でＦＰＶ感染細胞に導入し、得られた組み換えウイルスを、それぞれｆＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ、ｆＮＺ５９２９−ｇＥ、ｆＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥと名付けた。
【００３６】
（実施例９）組み換えウイルスを接種した鶏の強毒ＮＤＶに対する感染防御効果
組み換えＦＰＶは、穿刺用針で１０４ＰＦＵを、３日齢のニューカッスル病に対する移行抗体保有鶏の右側翼膜に接種し、３１日齢で１０４ＰＦＵの強毒ＤＮＶ佐藤株をモモの筋肉中に接種した。その後、４５日齢になるまでニューカッスル病による死亡を記録した。この結果を、表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
この結果によれば、未接種、親株ＦＰＶ、ｆＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ接種群の鶏は、強毒ＮＤＶの攻撃試験に対し、ほとんどすべてニューカッスル病で死亡したが、ＮＤＶのＦ遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶであるｆＮＺ５９２９を接種した鶏では、２４％が生存し、ｆＮＺ５９２９にｇＥ遺伝子を挿入したｆＮＺ５９２９−ｇＥ、ｇＥとｇＩの両遺伝子を挿入したｆＮＺ５９２９−ｇＩ−ｇＥの本発明の組み換えＦＰＶを接種した鶏の生存率は、それぞれ３８％、４７％であった。特に、ｆＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥのワクチン効果はｆＮＺ５９２９のそれと比較して約２倍であったことから、ヘルペス属ウイルスのｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とを抗原遺伝子と共に組み込んだ組み換えウイルスは、移行抗体存在条件下でも有効なワクチンとして機能することが判った。
【００３９】
（実施例１０）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ９９２９ＶＰ２Ｓ−７．５ｇＩ−ｇＥの構築と組み換えＦＰＶの作製
大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研寄託番号：微工研菌寄第１２４２２号）から常法により抽出できる約６．０ｋｂのプラスミドｐＩＢＤＶをＰｖｕＩで消化後、接着末端をＫｌｅｎｏｗで平滑末端にし、さらにＫｐｎＩで消化して約３．２ｋｂｐのＩＢＤＶ ＳｅｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。実施例３で構築したプラスミドｐＮＺ１８２９ＲをＢａｍＨＩで消化後、接着末端をＫｌｅｎｏｗで平滑末端にし、さらにＫｐｎＩで消化して開裂した部位に上記の約３．２ｋｂｐのＳｅｇＡ ＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡを構築した。次に実施例７で得たプラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩをＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡのＳｆｉＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩを構築した．さらに実施例５で得たプラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥをＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的のＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩｇＥを構築した。
【００４０】
このプラスミドを用いて実施例８と同様の手法で組み換えＦＰＶを作製し、純化した。得られた組み換えＦＰＶは、実施例９で示されたのと同様、組み換え生ワクチンとして有効であると期待される。
【００４１】
【発明の効果】
かくして本発明によれば、親ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域にニューカッスル病の感染防御抗原をコードした遺伝子とともにＭＤＶのｇＩ、ｇＥ遺伝子を組み込まれた組み換えウイルスが得られ、この組み換えウイルスは、ニューカッスル病に対する移行抗体を保有している鶏に接種すると、この移行抗体の影響を低減し、ワクチンとしての高い効果を有する。さらに本発明のワクチンは、マレック病、伝染性ファブリキウス嚢病、伝染性喉頭気管炎等のニューカッスル病以外の病原体の感染防御抗原をコードした遺伝子とともにＭＤＶのｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とを組み換えウイルスに挿入した場合にも同様のワクチン効果が期待できる。
【００４２】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４３】
【配列表】
配列番号：2
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４４】
【配列表】
配列番号：3
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４５】
【配列表】
配列番号：4
配列の長さ：14４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４６】
【配列表】
配列番号：5
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４７】
【配列表】
配列番号：6
配列の長さ：17
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４８】
【配列表】
配列番号：7
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００４９】
【配列表】
配列番号：8
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００５０】
【配列表】
配列番号：9
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００５１】
【配列表】
配列番号：10
配列の長さ：14
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００５２】
【配列表】
配列番号：11
配列の長さ：2760
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：マレック病ウィルス Ｉ型
株名：ＧＡ株
配列
【００５３】
【配列表】
配列番号：12
配列の長さ：355
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：マレック病ウィルス Ｉ型
株名：ＧＡ株
配列
【００５４】
【配列表】
配列番号：13
配列の長さ：493
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：マレック病ウィルス Ｉ型
株名：ＧＡ株
配列
【００５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９の構築手順を示した説明図である。
【図２】 組み換え用プラスミドＰＧＰＴｓ−ｇＥの構築手順を示した説明図である。
【図３】 組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＭＤｇＥの構築手順を示した説明図である。
【図４】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥの構築手順を示した説明図である。
【図５】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩの構築手順を示した説明図である。
【図６】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９／７．５ｇＥｇＩの構築手順を示した説明図である。
【図７】 組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩの構築手順を示した説明図である。
【図８】 組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩｇＥの構築手順を示した説明図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、組み換えファウルポックスウイルス及びそれから成るワクチンに関し、さらに詳しくは、ヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ、または糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡおよびｇＩをコードするＤＮＡを、異種外来抗原タンパク質をコードするＤＮＡと共に、その増殖に非必須なゲノム領域に挿入した組み換えファウルポックスウイルス、および当該組み換えファウルポックスウイルスを有効成分とするワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在の養鶏分野においては、種鶏、産卵鶏、及び肉用鶏の別を問わず、ワクチネーションによる疾病予防は衛生管理の柱である。しかしながらワクチネーションのプログラムは実に過密であり、従ってこれに要する人手、時間ならびに経費は大きな問題となっている。
【０００３】
この解決策として、近年、組み換えＤＮＡ技術により、ある病原体より免疫誘導に必要なタンパク質をコードする遺伝子のみを取り出し、これを含む組み換えウイルスを構築することが可能となった。このような組み換えウイルスを組み換え生ワクチンとして接種することにより、挿入した遺伝子がコードする抗原タンパク質に対する免疫を誘導することが可能となった。ポックスウイルスに属するアビポックスウイルスはそのような組み換えウイルスの構築に用いるのに好適なウイルスである。ファウルポックスウイルス（以下、ＦＰＶという）に代表されるこれらウイルスは、大きなゲノムＤＮＡを持ち、その多くの領域がウイルス増殖に非必須であり、同一ウイルスのこれらの非必須領域に複数の抗原遺伝子を挿入することができる。このような組み換えウイルスワクチンは、ワクチンを接種した宿主の液性免疫、細胞性免疫を誘導することができると推測される。この方法は、従来、鶏痘に対する生ワクチンとして使用されてきた弱毒化ＦＰＶに遺伝子工学的手法を用いて外来遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶとして応用されてきた。外来遺伝子として、鶏病ウイルスであるニューカッスル病ウイルスの抗原をコードした遺伝子（以下、抗原遺伝子という）、マレック病ウイルスの抗原遺伝子、鶏インフルエンザウイルスの抗原遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶが構築され、実験的にＳＰＦ鶏に接種して、ワクチン効果を確認している（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７８、２９７−３００（１９９０）；Ｎａｚｅｒｉａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０９−１４１３（１９９２）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、６、５０４−５０８（１９８８））。このように組み換えＦＰＶは、目的に応じて種々の外来抗原遺伝子を挿入することができ、また同時に複数の抗原遺伝子を挿入できるために、１回接種で複数の病原体に対して有効な多価ワクチン可能になり、その結果前述の過密なワクチンプログラム問題の解決策と成りうると有望視されている。
【０００４】
一方、新しいワクチンを実用化する過程で考慮しなければならない重大な事柄の１つに移行抗体が挙げられる。生まれて間もない個体は、免疫機構が未熟なため病原体の感染の危険に曝されている。生体側の防御機能として母親から種々の病原体に対する抗体を受け取り、生まれてくる。このような母親由来の抗体は、移行抗体と呼ばれ、生後数週間、個体を病原体の感染から守ってくれる。しかし、その反面、この時期ワクチンとして接種した弱毒ウイルスも同様に移行抗体によって排除される。この結果、ワクチンによるプライミング効果は得られず、移行抗体が消失するころに病原体に対する感染の危険性が高まる。さらにこの移行抗体は、個体によってその成分、力価にばらつきがあるため、移行抗体の消失時期を見計らって集団ワクチン接種することが望まれるが、実際には不可能に近い。たとえば、ニワトリの初生に接種するニューカッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶという）生ワクチンの場合、初生雛の時期に２、３回の接種を行い、個体の移行抗体価のばらつきによるワクチン効果の低減を最小限に押さえる努力がなされている。また伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶという）ワクチンの場合は、繁殖雌鶏に、およそ２２週令の産卵期の始まる前に不活化した油−乳濁性ウイルスワクチンを接種し、受精卵内に高いレベルの移行抗体を含有させて羽化後の数週間にわたって鶏を保護することを目的としている。かりに、前述のワクチン効果が認められたと文献で報告されている組み換えＦＰＶを実験室レベルで飼育されているＳＰＦ鶏ではなく市販の移行抗体を保有している鶏に接種した場合、移行抗体の影響を受けてワクチン効果が低減すると予想される。さらに、複数の抗原遺伝子を挿入した多価組み換えＦＰＶを接種すれば、それぞれの抗原に対する移行抗体が速やかにこの組み換えＦＰＶを排除するためさらに移行抗体の影響は大きくなり、いずれの抗原に対するワクチン効果もできないことが予想される。
【０００５】
ところで最近の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の研究で、宿主の免疫グロブリン（以下、ＩｇＧという）と結合する特性を有する２つの糖タンパク質ｇＩとｇＥとが同定された。この二つのタンパク質は複合体を形成しており、ＩｇＧのＦｃ領域と結合するＦｃレセプターとしての機能を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２、１３４７−１３５４（１９８８））。組み換えＤＮＡ技術を用いて作製したｇＥあるいはｇＩ遺伝子欠損変異体ＨＳＶはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ＨＳＶ抗体の存在下で、著しく増殖が阻害された（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７７、４３７−４４４（１９９０）；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、７０４６−７０５０（１９９１））。これらの研究結果よりＨＳＶのｇＩ、ｇＥは、ウイルスの抗体の関与する免疫応答より逃避するために重要な役割を果たしていると推測される。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてのｇＩ、ｇＥの機能は未解明であるが、唯一ｇＩ、ｇＥは、ウイルスの増殖に必須ではないことが明らかになっている。
【０００６】
ＭＤＶにおいても最近ｇＩ遺伝子の全長とｇＥ遺伝子の一部の塩基配列が明らかになった（Ｖｅｌｉｃｅｒら、米国特許第５，２５２，７１６号）。しかし、それらの機能面については全く明らかにされておらず、さらにこれらの遺伝子を組み換えウイルスで発現したときにどのような現象が現れるかを予測することは困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、移行抗体の影響を受けにくい新たな組み換えファウルポックスワクチンを得るべく鋭意検討した結果、ファウルポックスウイルスの増殖に非必須な領域に、ヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質であるｇＥをコードするＤＮＡを病原体の抗原遺伝子と一緒に挿入すると、移行抗体による影響を受けにくい新しいタイプのワクチンとして機能する組み換えファウルポックスウイルスが得られることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かくして本発明によれば、ファウルポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に、（１）マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ、またはマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ及び糖タンパク質ｇＩをコードするＤＮＡを含有し、更に（２）異種外来抗原タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組み換えファウルポックスウイルスが提供され、更に当該組み換えファウルポックスウイルスを有効成分とするワクチンが提供される。
【０００９】
本発明の組み換えファウルポックスウイルスは、例えば、以下のようにして調製される。予め親ウイルスであるファウルポックスウイルスの非必須領域を組み込んだプラスミドの当該非必須領域に、親ウイルス内で機能するプロモーターの支配下となるように連結されたｇＥ遺伝死闘を組み込み、プラスミドベクターを得る。ついで、親ウイルス感染細胞にこのプラスミドベクターを導入することにより、相同組み換えを起こさせ、その結果生じたウイルスを選択、純化し、目的とする組み換えファウルポックスウイルスを得る。
親ウイルスとなるファウルポックスウイルス（ＦＰＶ）の具体例としては、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−２２９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２８８、西ヶ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワクチン株由来のウイルスのうち、鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に感染したとき大きいプラークを形成するものなどのごとき狭義のＦＰＶや、ＮＰ株（鶏胎化鳩痘中野株）等のごとき狭義のＦＰＶと近縁のウイルスであって、鳩痘生ワクチン株として使用されるウイルスなどが例示される。これらは、市販または分譲などにより容易に入手できる。
【００１０】
（非必須領域）
本発明で使用される非必須領域は、親ウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域であり、ＴＫ遺伝子領域や特開平１−１６８２７９号に記載されている領域を使用することができる。その具体例としては、例えば前記公報に記載されたＮＰ株ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（約７．３ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．０ｋｂ）、ＢａｍＨＩ断片（約４．０ｋｂ）、ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．２ｋｂ）が挙げられる。
【００１１】
（非必須領域を含有するベクター）
後述する本発明の組み換え用ベクターの構築には、ウイルスの非必須領域をクローニングするためのベクターが用いられる。このようなベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９等のコスミド等のベクターを適当な制限酵素で処理して、常法に従って上述したようなウイルス非必須領域のＤＮＡ断片を組み込むことにより得られる。
【００１２】
（組み換え用ベクター）
本発明で用いる組み換え用ベクターは、抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入された非必須領域を含むものである。前述の非必須領域を含むベクターのウイルス非必須領域に後述するｇＥ遺伝子またはｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子、および抗原遺伝子と、さらにそれぞれ各遺伝子を支配するプロモーターを挿入すればよく、また、そのようなベクター由来の抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入されたファウルポックスウイルスの非必須領域を含む断片を他のベクターに組み込んだりしてもよい。さらに、組み換えファウルポックスウイルスの純化などの効率化のために大腸菌のｌａｃＺ遺伝子などのマーカー遺伝子とそれを発現するための後述するプロモーターを組み込んでもよい。
【００１３】
（ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子）
本発明で用いるｇＥ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、ヘルペス属に属するウイルスのゲノム由来のものであればよい。ヘルペス属ウイルスは、人に感染する単純ヘルペスウイルス、ウシに感染する牛ヘルペスウイルス、馬に感染する馬ヘルペスウイルス、ブタに感染するオーセスキー病ウイルス、猫に感染する猫鼻気管炎ウイルスなど哺乳類に感染するヘルペス属ウイルスや、マレック病ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルスなど鳥類に感染するヘルペス属ウイルス等が挙げられる。ワクチン接種の対象となる動物種に感染するウイルス由来のｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子を利用するのが好ましい。即ち、鶏用ワクチンとして利用するにはマレック病ウイルス由来の遺伝子を用いるのが好ましい。
【００１４】
また本発明に用いるｇＥ遺伝子及びｇＩ遺伝子は、その全長を１００％としたとき、一部の塩基の欠落や挿入、付加などの自然または人工的な変異によって通常約８０％〜約１２０％程度、好ましくは約９０％〜１１０％程度の範囲で全長（塩基の長さ）が変化した遺伝子や、自然または人工的な変異によりｇＥ遺伝子またはｇＩ遺伝子の塩基の一部（ここで言う一部とは、通常、全体の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下）が置換され、別のアミノ酸をコードする塩基に変化した遺伝子であっても、遺伝子によってコードされたタンパク質が、通常天然のｇＥやｇＩの機能と実質的に等価の機能を有しているものであればよい。ここでいう天然のｇＥやｇＩの機能とは、ｇＩとｇＥとの複合体（ｇＩ−ｇＥ）またはｇＥ単独が、ＩｇＧのＦｃ部位と結合する生理活性を有し、その結果、保体または抗体依存性の細胞障害による免疫応答が阻害される機能であり、出生直後の移行抗体の約５０％をまだ保有している生物に、抗原遺伝子、ｇＥ遺伝子、必要に応じてｇＩ遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスをワクチンとして接種し、移行抗体が約１０％程度となった時点で強毒株を接種し、移行抗体が実質的に失われた時点での感染防御率が、ｇＥ、ｇＩ非発現で同じ抗原遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスをワクチンとして接種した群の約１．５倍以上、好ましくは約２倍以上であるときを天然のｇＥ、ｇＩと実質的に等価の機能であると判断する。
【００１５】
本発明において人工的な変異を起こす方法は特に制限されず、常法に従って行うことができる。その具体例としては、天然のｇＥ遺伝子を適当な制限酵素で処理した後、アミノ酸への翻訳の読み枠がずれないように適当なＤＮＡ断片を挿入し（または脱落させて）、再び連結する方法やＦｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎらのインビトロ突然変異法（Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７−６４９７（１９８２））などによりアミノ酸の一部を別のアミノ酸に翻訳するように改変させる方法などが挙げられる。
【００１６】
このようなヘルペス属ウイルス由来のｇＥ遺伝子としては、マレック病ウイルスＩ型ＧＡ株由来の配列番号１３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１の第１２０７番目〜第２６９７番目の配列が挙げられる。また、ヘルペス属ウイルス由来のｇＩ遺伝子としては、マレック病ウイルスＩ型ＧＡ株由来の配列番号１２記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１記載の第１番目〜第１０６５番目の配列が挙げられる。
【００１７】
本発明においては、ｇＥ遺伝子のみでも移行抗体の影響を受けにくいワクチンとしての効果を得ることはできるが、より高い効果を得るためにはｇＩ遺伝子と共に組み込むのが望ましい。組み換えウイルス中のｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子および後述する抗原の遺伝子の連結の順番は、各遺伝子が実質的にｇＥ、ｇＩおよび抗原タンパク質を発現し得るように連結されている限り特に制限されない。すなわち、５’上流側からｇＥ遺伝子−ｇＩ遺伝子−抗原遺伝子の順番、ｇＩ遺伝子−ｇＥ遺伝子−抗原遺伝子の順番、ｇＥ遺伝子−抗原遺伝子−ｇＩ遺伝子の順番、ｇＩ遺伝子−抗原遺伝子−ｇＥ遺伝子の順番、抗原遺伝子−ｇＥ遺伝子−ｇＩ遺伝子の順番、抗原遺伝子−ｇＩ遺伝子−ｇＥ遺伝子の順番の何れであっても構わないが、操作上の簡便さから、ｇＩ遺伝子の後ろ（３’側）にｇＥ遺伝子が連結され、抗原遺伝子はこれらの遺伝子の５’側または３’側に連結するのが望ましい。また、組み換えウイルスの選択に有用なマーカー遺伝子を組み込む場合、その連結部位も特に制限されない。これらの遺伝子の連結方法も特に制限されず、適当なリンカー等を用いて各遺伝子を連結させて予め挿入すべき遺伝子を作製する方法や各遺伝子を有するベクターを用いる相同組み換えにより組み換えベクターを直接作製する方法などの常法に従って連結することができる。
【００１８】
（異種外来抗原タンパク質、抗原遺伝子）
本発明において異種外来抗原タンパク質は、親ウイルスとは異なるウイルスや細菌由来のタンパク質であり、親ウイルス中で転写、翻訳されて抗原タンパク質として発現されるものであればよい。鶏用ワクチンを得る場合の異種抗原タンパク質をコードするＤＮＡ（抗原遺伝子）の具体例としては、ＭＤＶの糖タンパク質をコードする遺伝子（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１７８９−１８０４（１９８８））、ＮＤＶのＨＮをコードする遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、１９１７−１９２７（１９８６））、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（ＭｃＧｉｎｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５、３４３−３５６（１９８６））、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの構造タンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７１、１３０３−１３１２（１９９０））等の感染防御に関与した抗原をコードした遺伝子が好ましい。
【００１９】
（プロモーター）
本発明で用いるプロモーターは、組み換えファウルポックスウイルス感染宿主中でプロモーターとして機能するののであれば、特に限定されない。例えば、７．５Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、１１Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーターなどが例示されるほか、プロモーターとして機能する限りにおいては、一部を削除するなど改変したものであってもよく、また合成されたものであってもよい。本発明のおいては、初期プロモーターと後期プロモーターの両方の配列を有する合成プロモーター（Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、７４９−７６９、およびｐ７７１−７８１（１９８９））やその一部をプロモーター活性が喪失しない範囲で削除する、塩基を変更するなどして改変したもの（例えば、塩基配列が、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣ−３’で示されるもの）を用いることが特に好ましい。なお、この合成プロモーターあるいはその改変物は、その塩基配列の５’側の端にＴ（チミジン）が多数連続しているが、プロモーター活性の高さ、抗原遺伝子の発現量の多さの点から、１５〜４０個のＴが連続していることが好ましく、１８〜３０個のＴが連続していることがより好ましい。
【００２０】
もちろん、ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子、抗原遺伝子、マーカー遺伝子をそれぞれ支配するように、プロモーターを連結させることができるが、各遺伝子に連結したプロモーターは、必ずしも同じプロモーターである必要はない。
【００２１】
（組み換えファウルポックスウイルスの作製方法）
組み換えファウルポックスウイルスの作製方法は特に限定されず、常法に従って行えばよい。すなわち、予め親ウイルスを感染させた細胞に、例えば、リン酸カルシウム共沈法等によりｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子、抗原遺伝子等を有する組み換えベクターが導入されることにより、ベクターと感染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み換えが起こり、組み換えファウルポックスウイルスが構築される。得られた組み換えウイルスは、イーグルＭＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、生育してくるプラークを組み込んだ抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法や、抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現等の方法により候補株を純化し、組み込んだ抗原遺伝子によりコードされたポリペプチドに対する抗体を使用し、イムノアッセイ等の方法により、目的の組み換えファウルポックスウイルスであることを確認すればよい。例えば、マーカー遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換えファウルポックスウイルスの場合、β−ガラクトシダーゼを発現する。よって、その気質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）存在下で青いプラークを形成するので、その性質を利用して選択、純化することができる。宿主細胞としては、用いるウイルスが感染し、増殖することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、鶏繊維芽（ＣＥＦ）細胞や、発育鶏卵しょう尿膜細胞等が挙げられる。
【００２２】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、１種類以上の本発明の組み換えファウルポックスウイルスからなるワクチンである。即ち、本発明により開示されたＭＤＶ由来のｇＥ遺伝子またはｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子、および抗原遺伝子等を有する組み換えウイルスを単独で用いるほか、他の２〜３種類の組み換えウイルスを組み合わせてもよい。また、組み換えファウルポックスウイルス以外にも薬理学的に問題のないキャリアー、例えば生理食塩水、安定剤などを含んでいてもよい。本発明のワクチンの調製方法は特に限定されない。例えば、本発明で組み換えファウルポックスウイルスが生育することのできる細胞を、本発明の組み換えウイルスで感染し、組み換えファウルポックスウイルスが増殖するまで培養する。その後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分離機によって遠心分離チューブ中で沈殿物と組み換えファウルポックスウイルスを含んだ高力価上清とに分離する。本質的に宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み換えファウルポックスウイルスを含んだこの遠心上清は、本発明のワクチンとして使用できる。また、薬理学的に受け入れられる生理食塩水などのようなもので、希釈して使用してもよい。遠心上清を凍結乾燥することにより凍結乾燥ワクチンとしても利用できる。
【００２３】
本発明のワクチンが鶏用ワクチンである場合、ワクチン中の組み換えウイルスが家禽に感染して防御免疫を引き起こすような方法であれば、どのような方法で家禽に投与してもよい。例えば、翼膜穿刺、皮膚に引っかき傷をつけてワクチンを接種したり、注射針やその他の器具で家禽の皮下にワクチン接種することができる。また、ワクチンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料の固形物に混入して、経口接種させることも可能である。さらに、エアロゾルやスプレーなどによるワクチンを吸入させる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種法等を用いることもできる。
【００２４】
接種量は、例えば、鶏の場合、１羽あたり通常１０〜１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）であり、好ましくは１０２〜１０４ＰＦＵである。注射する場合には、この量を生理食塩水等の薬理学的に受け入れられる液体で希釈して０．１ｍｌ程度にすればよい。本発明のワクチンは、普通のワクチンと同様の条件下で保存、使用することが可能である。例えば、本発明の組み換えウイルスを凍結乾燥すれば、冷蔵庫（０〜４℃）での保存が可能であり、さらに短期間であれば室温（２０〜２２℃）での保存も可能である。また、ウイルスの懸濁液を−２０〜−７０℃にして凍結させ、保存することも可能である。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００２６】
（実施例１）ＭＤＶのＧＡ株ゲノムＤＮＡの抽出
ＭＤＶのＧＡ株が感染したＣＥＦ細胞をトリプシン処理でシャーレにより回収し、ＰＢＳで２回その細胞を洗った後、プロテナーゼＫバッファー（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）で懸濁し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を５０μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。５５℃で２時間放置した後、フェノール／クロロホルムで２回、タンパク質の除去を行い、２倍量のエタノールを加えて−２０℃で２０分間放置した後、遠心し、ＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡを得た。
【００２７】
（実施例２）ＭＤＶのｇＩ、ｇＥ遺伝子のクローニング
ｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とをＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡからクローンニングするためにＶｅｌｉｃｅｒらが発表したＭＤＶのＧＡ株のユニークショート領域の塩基配列（Ｖｅｌｉｃｅｒら、米国特許第５，２５２，７１６号）をもとに配列番号１および２記載の２種類のＤＮＡプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号１）、５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴ−３’（配列番号２））を使用した。配列番号１のプライマーは、配列番号１１で示されるｇＩ遺伝子の第１番目〜１８番目に記載される塩基配列を含み、配列番号２のプライマーは、配列番号１１で示されるｇＥ遺伝子の第１４９６番目〜１５１８番目に記載される塩基配列を含む。これらのプライマーを用いて実施例１で得たＭＤＶのＧＡ株ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲという）により、ｇＩ遺伝子の全長およびｇＥ遺伝子の一部を有するＤＮＡ断片の増幅を行った。反応組成はＭＤＶゲノムＤＮＡ２０ピコグラムを含む水溶液６４．５μｌに８μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ反応バッファー（２００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ塩化カリウム、２５ｍＭ塩化マグネシウム）、４μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、５Ｕ／μｌ濃度のタックポリメラーゼ０．５μｌおよび２０μｍの各プライマー１μｌづつを加えた。反応条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを５５℃で２分間、ポリメラーゼ反応を７２℃で２分間、３０サイクロをパーキンエルマーシータス社製のサーマルサイクラー４８０で行った。その結果、ｇＩ遺伝子の全長とｇＥ遺伝子の５’末端の一部の塩基配列を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
【００２８】
実施例１で得たＭＤＶのＧＡ株を各種制限酵素で切断後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲル中のＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、前述のＰＣＲ産物をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｇＩ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ ＤＮＡ断片とｇＥ遺伝子を含む約６．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片がハイブリダイズしている事を確認した。これらのＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、それぞれｐＵＣ−ｇＩ−１とｐＵＣ−ｇＥ−１を得た。ｐＵＣ−ｇＥ−１にクローニングした約６．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断して、制限酵素地図を作製した。これを利用して、ｇＥ遺伝子を含む約２．２ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ−ｇＥ−２を得た。ｇＥ遺伝子の全塩基配列（配列番号１１中、第１２０７〜２７００番目の塩基配列）は、サンガーのダイデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７（１９７７））によって、ｐＵＣ−ｇＥ−２の一連の欠失変異体の配列を調べることにより決定した。
【００２９】
（実施例３）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９（図１参照）
プラスミドｐＮＺ９８（特開平３−２７８４号公報記載）を制限酵素ＳａｃＩで部分消化後、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。一方、プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０８（１９９２））をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、この部位に配列番号３と配列番号４に記載の２種類の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号３）、５’−ＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニーリングしたＳｆｉＩ部位を含む合成アダプターを挿入し、プラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを構築した。このプラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、さらに制限酵素ＳａｃＩで部分消化し、前述の約１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ ＤＮＡ断片を挿入して、目的のプラスミドｐＮＺ５９２９を構築した。
【００３０】
（実施例４）抗原遺伝子挿入用プラスミドｐＧＰＴｓおよびｐＧＴＰ７．５の構築
プラスミドｐＧＰＴｓは、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１７１９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０８（１９９２））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’）を挿入し、次にＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号６記載の合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’）を挿入し、最後にＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号７記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’）を挿入して構築した。プラスミドｐＧＴＰ７．５は、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１０３７（Ｏｇａｗａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８、４８６−４９０（１９９０））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩとで消化して得られた約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’）を挿入し、次にＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号６記載の合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’）を挿入し、最後にＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号７記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’）を挿入して構築した。
【００３１】
（実施例５）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥの構築（図２、３参照）
実施例２で得たｐＵＣ−ｇＥ−１を鋳型とし、配列番号８と９に示すプライマーを利用してＰＣＲを行った。反応組成および条件は、実施例２と同様とした。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩとで消化後、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、プラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位の間にＢｇｌＩＩ部位を作るための配列番号１０記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡ−３’）を組み込んで調製したプラスミドｐＵＣ−ＸＧのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣ−ｇＥ−ＰＣＲを構築した。挿入したＤＮＡ断片の塩基配列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見られなかった。このプラスミドｐＵＣ−１８−ｇＥ−ＰＣＲを制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩとで消化後、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ｐＧＴＰｓのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを構築した。このプラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ１８２９−ＳｆｉのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的の組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥを構築した。
【００３２】
（実施例６）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥの構築（図４参照）
実施例５で得たプラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を実施例３で得たＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ５９２９のＳｆｉＩ部位に挿入し、目的の組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥを構築した。
【００３３】
（実施例７）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥの構築（図５、６）
実施例２のＰＣＲで得た約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩで消化後、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで部分消化し、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を実施例４で得たｐＧＴＰ７．５のＢａｎＨＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入して、プラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩを構築した。挿入したＤＮＡ断片の塩基配列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見られなかった。このプラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を実施例３で得たＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ５９２９のＳｆｉＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＩを構築した。次に、実施例５で得たプラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的のＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩｇＥを構築した。
【００３４】
（実施例８）組み換えＦＰＶの作製と純化
単層になったＣＥＦにＦＰＶのワクチンから単離した大型プラーク形成を表現型として持つウイルス（Ｎａｚｅｒｉａｎら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．、３３、４５８−４６５（１９８９））を０．１の感染多重度で感染した。３時間後、これらの細胞をトリプシン処理で剥がし、細胞懸濁液とした。この懸濁液からの２×１０７個の細胞と１０μｇの組み換え用プラスミドの混合物をＳａｌｉｎｅ Ｇ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁し、室温において、ジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓｅｃ条件下で、エレクトロポレーションした。プラスミドを導入した細胞を、その後、３７℃で７２時間培養し、３回の凍結乾燥によって細胞を溶解した。放出した組み換えウイルスは次のように選別された。
【００３５】
溶解した細胞から放出された子孫ウイルスを含んだ溶解液の１０倍段階希釈液を継代したＣＥＦに感染させ、生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層した。室温中で寒天を固めた後、典型的なＦＰＶのプラークが出現するまで３７℃で培養した。さらにＢｌｕｏ−ｇａｌを２５０μｇ／ｍｌ含んだ別の寒天をそれぞれの培養プレートに重層し、さらに２４時間３７℃で培養した。すべての子孫ウイルスに対して、およそ１％の比率で青色プラークが出現した。これらの青色プラークを単離し、含まれているウイルスを回収し、形成する全てのプラークがＢｌｕｏ−ｇａｌで青く染まるまで、同じ方法でさらに組み換えウイルスの純化を行った。通常、この過程は３〜４回で終了する。この純化されたウイルスを、ｆＮＺ５９２９と名付けた。このｆＮＺ５９２９は、サザンハイブリダイゼーション法により解析され、ＮＤＶのＦ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子が予想通りの位置にあることが確認された。実施例４、５、６で示した組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ、ｐＮＺ５９２９−ｇＥ、ｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥは、上記と同様の方法でＦＰＶ感染細胞に導入し、得られた組み換えウイルスを、それぞれｆＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ、ｆＮＺ５９２９−ｇＥ、ｆＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥと名付けた。
【００３６】
（実施例９）組み換えウイルスを接種した鶏の強毒ＮＤＶに対する感染防御効果
組み換えＦＰＶは、穿刺用針で１０４ＰＦＵを、３日齢のニューカッスル病に対する移行抗体保有鶏の右側翼膜に接種し、３１日齢で１０４ＰＦＵの強毒ＤＮＶ佐藤株をモモの筋肉中に接種した。その後、４５日齢になるまでニューカッスル病による死亡を記録した。この結果を、表１に示す。
【００３７】
【表１】
この結果によれば、未接種、親株ＦＰＶ、ｆＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ接種群の鶏は、強毒ＮＤＶの攻撃試験に対し、ほとんどすべてニューカッスル病で死亡したが、ＮＤＶのＦ遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶであるｆＮＺ５９２９を接種した鶏では、２４％が生存し、ｆＮＺ５９２９にｇＥ遺伝子を挿入したｆＮＺ５９２９−ｇＥ、ｇＥとｇＩの両遺伝子を挿入したｆＮＺ５９２９−ｇＩ−ｇＥの本発明の組み換えＦＰＶを接種した鶏の生存率は、それぞれ３８％、４７％であった。特に、ｆＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥのワクチン効果はｆＮＺ５９２９のそれと比較して約２倍であったことから、ヘルペス属ウイルスのｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とを抗原遺伝子と共に組み込んだ組み換えウイルスは、移行抗体存在条件下でも有効なワクチンとして機能することが判った。
【００３９】
（実施例１０）ＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮＺ９９２９ＶＰ２Ｓ−７．５ｇＩ−ｇＥの構築と組み換えＦＰＶの作製
大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研寄託番号：微工研菌寄第１２４２２号）から常法により抽出できる約６．０ｋｂのプラスミドｐＩＢＤＶをＰｖｕＩで消化後、接着末端をＫｌｅｎｏｗで平滑末端にし、さらにＫｐｎＩで消化して約３．２ｋｂｐのＩＢＤＶ ＳｅｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。実施例３で構築したプラスミドｐＮＺ１８２９ＲをＢａｍＨＩで消化後、接着末端をＫｌｅｎｏｗで平滑末端にし、さらにＫｐｎＩで消化して開裂した部位に上記の約３．２ｋｂｐのＳｅｇＡ ＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡを構築した。次に実施例７で得たプラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩをＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡのＳｆｉＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩを構築した．さらに実施例５で得たプラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥをＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的のＦＰＶ組み換え用プラスミドｐＮ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩｇＥを構築した。
【００４０】
このプラスミドを用いて実施例８と同様の手法で組み換えＦＰＶを作製し、純化した。得られた組み換えＦＰＶは、実施例９で示されたのと同様、組み換え生ワクチンとして有効であると期待される。
【００４１】
【発明の効果】
かくして本発明によれば、親ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域にニューカッスル病の感染防御抗原をコードした遺伝子とともにＭＤＶのｇＩ、ｇＥ遺伝子を組み込まれた組み換えウイルスが得られ、この組み換えウイルスは、ニューカッスル病に対する移行抗体を保有している鶏に接種すると、この移行抗体の影響を低減し、ワクチンとしての高い効果を有する。さらに本発明のワクチンは、マレック病、伝染性ファブリキウス嚢病、伝染性喉頭気管炎等のニューカッスル病以外の病原体の感染防御抗原をコードした遺伝子とともにＭＤＶのｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とを組み換えウイルスに挿入した場合にも同様のワクチン効果が期待できる。
【００４２】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：2
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：3
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：4
配列の長さ：14４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：5
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：6
配列の長さ：17
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：7
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：8
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：9
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：10
配列の長さ：14
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【配列表】
配列番号：11
配列の長さ：2760
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：マレック病ウィルス Ｉ型
株名：ＧＡ株
配列
【配列表】
配列番号：12
配列の長さ：355
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：マレック病ウィルス Ｉ型
株名：ＧＡ株
配列
【配列表】
配列番号：13
配列の長さ：493
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：マレック病ウィルス Ｉ型
株名：ＧＡ株
配列
【図面の簡単な説明】
【図１】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９の構築手順を示した説明図である。
【図２】 組み換え用プラスミドＰＧＰＴｓ−ｇＥの構築手順を示した説明図である。
【図３】 組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＭＤｇＥの構築手順を示した説明図である。
【図４】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥの構築手順を示した説明図である。
【図５】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩの構築手順を示した説明図である。
【図６】 組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９／７．５ｇＥｇＩの構築手順を示した説明図である。
【図７】 組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩの構築手順を示した説明図である。
【図８】 組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩｇＥの構築手順を示した説明図である。
Claims (4)
- ファウルポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に、（１）マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ、またはマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡ及び糖タンパク質ｇＩをコードするＤＮＡを含有し、更に（２）異種外来抗原タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組み換えファウルポックスウイルス。
- 異種外来抗原タンパク質がニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、および伝染性喉頭気管炎ウイルスからなる郡より選択されるウイルス由来の抗原タンパク質である請求項１記載の組み換えファウルポックスウイルス。
- 異種外来抗原タンパク質がニューカッスル病ウイルスのＦ抗原タンパク質またはＨＮ抗原タンパク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥ、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質、および伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＢからなる群より選択される抗原タンパク質である請求項２記載の組み換えファウルポックスウイルス。
- 請求項１〜３のいずれかに記載された組み換えファウルポックスウイルスを有効成分とするワクチン。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP13108496A JP3675569B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-129523 | 1995-04-28 | ||
| JP12952395 | 1995-04-28 | ||
| JP13108496A JP3675569B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH099978A JPH099978A (ja) | 1997-01-14 |
| JP3675569B2 true JP3675569B2 (ja) | 2005-07-27 |
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ID=26464878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13108496A Expired - Fee Related JP3675569B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3675569B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1178111A1 (en) | 2000-08-03 | 2002-02-06 | Lohmann Animal Health GmbH & Co. KG | Vaccination against host cell-associated herpesviruses |
-
1996
- 1996-04-26 JP JP13108496A patent/JP3675569B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH099978A (ja) | 1997-01-14 |
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