JPH05346428A - 顆粒球の迅速なカウントのためのキット及び前記キットを使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒト血液及び任意の他の生物学的液体中の顆粒
球をカウントするキット及び該キットを使用するための
方法を提供すること。 【構成】本キットは、以下の構成要素からできている。 ａ）任意に標識された特異抗体を含有する決められた量
の顆粒球希釈剤及び標識剤を含む容器。 ｂ）同じ特異性抗体を結合した磁気粒子を含む第二の容
器。及び、 ｃ）磁化された端部を有する測定ロッドと呼ばれるロッ
ド。 更に、本発明は上記キットを使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、顆粒球を迅速にカウン
トするためのキット及び前記キットを使用する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】顆粒球とも呼ばれる白血球は、３つの部
分集団（subpopulations）、即ち好中球性、好塩基性及
び好酸性顆粒球より成る。

【０００３】通常、抹消血中に存在する顆粒球は、尿、
髄液、胸膜液又は気管支肺胞の洗浄から生じる液体のよ
うな他の生物学的な液体中において、伝染性の病的条件
で観測され得る。

【０００４】血液中の多核白血球の通常の平均値は、一
定の環境下で変化させうる。血液中の多核白血球数の異
常な増加は、病的な状態を示しうる。例えば、過顆粒球
増加症（hypergranulocytosis ）は、過好酸球増加の
間、又は骨髄性白血病において病原菌によって起こる。
逆に、多核白血球数の異常な減少（顆粒球減少症）は、
薬剤又は化学療法的な治療によって誘導されうる。ある
薬剤は、顆粒球数の実質的な変化を起こすことができ
る。これは例えば、G. Siest et al. 編、試験所及び薬
剤の検査（Examinations of Laboratories and Drugs)
、Expansion Scientifique、1985、163-181 において
P. Tarallo and J. F. Guelfi によって説明されてい
る。これらの薬剤の望まない効果は、血液細胞の数（全
体数及び白血球百分率（differential count) ）を数え
ることによって体系的で、定期的に評価されなければな
らない。

【０００５】従って、血液学で最もしばしば行なわれる
試験の１つは、白血球百分率を確立するための試験であ
る。赤血球と個々の白血球の比に対して、全細胞のカウ
ントの平均値が決定され、他で決定された正常であると
考えられる限界値（下限及び上限）と比較される。

【０００６】例として、化学療法治療を受ける前及び治
療中に、患者の状態を観測し、相応した治療に適応させ
るために全顆粒球のカウントを行なう。現代の治療実務
において、化学療法は、たびたび外来患者（hospital d
ay patients ）に対して行なわれるので、実質的に即時
結果が容易に得られる、顆粒球を迅速に計測するための
キットを医者が所有することは、非常に有効である。

【０００７】従来、全血液細胞のカウントは、顕微鏡検
査によって、または自動装置の助けを借りて行なわれて
いた。例えば、コールトロニクス（Coultronics ）（登
録商標）のコールターカウンター型の電子カウンターを
使用することができる。この電子カウンターにおいて、
測定は、細胞が存在する培地の固有抵抗の多様性に基づ
いている。Hematolog D （登録商標）のような他の装置
が、細胞化学的測定に使用される。

【０００８】細胞表面の抗原あるいはマーカーの知識
は、ケーラー及びミルシュタイン（Koehler and Milste
in）（Nature, 1975, 256, 495-497）によるリンパ球ハ
イブリディゼーション方の開発、及びモノクローナル抗
体の発見でおおいに進歩した。国際協定によって、ヒト
白血球の表面のマーカーは、Bulletin de l'Organisati
on Mondiale de la Sante 1984,62(5), 813-815 に記載
され、定期的に改定される1984年のIUIS-WHO小委員会に
よって定義された識別群（differentiation group ）や
クラス（ＣＤ）に分類されている。

【０００９】欧州特許出願311492には、細胞集団の特徴
的な表面抗体をアッセイする免疫的測定方法が記載され
ている。これは、一方では、アッセイされる細胞集団の
表面抗原に向けられたモノクローナル抗体が結合される
固体支持体を使用し、他方では、アッセイされる細胞集
団に特異的な他の標識されたモノクローナル抗体を含有
する溶液を使用する。この方法は、１段階で、固体支持
体上の免疫補足によってアッセイされる細胞集団の特異
的な固定化、及び標識化抗体による前記集団の表面抗原
の再認識法に効果がある。

【００１０】欧州特許出願311492に記載された幾つかの
使用例には、血液細胞によって運ばれる表面抗原のアッ
セイが含まれている。通常、全血液から血液細胞を分離
するためのステップが、固有のアッセイに優先すること
が見い出されており、例５で、アッセイの結果につい
て、選択された分離方法（赤血球の遠心分離又は細胞溶
解）の影響が研究されている。同様の例において、観測
された結果について、細胞の免疫的補足及び標識のため
の培養時間の影響も決定され、１０分間の接触時間の後
に、分析的に使用可能な特異的なシグナルが得られるこ
とが示された。しかし、記載された例にしたがって、効
果的な培養時間は、２０分以下にならないことが見い出
された。

【００１１】欧州特許出願311492の例１５には、免疫補
足のための固体支持体として抗−ＣＤ２抗体でコートさ
れた磁気ビーズを使用することによるヒトＴリンパ球の
ＣＤ５抗原のアッセイが記載されている。この例では、
免疫補足及びアッセイのための培養ステップ以前に、単
核細胞も全血液から分離される。更に、前記の例では、
培養ステップのみに１時間かかる。

【００１２】例１１には、ヒト顆粒球によって運ばれる
ＣＤ１５のアッセイが記載されている。測定は、全血液
に由来する顆粒球で行なわれた：第一段階では、顆粒球
は、潅流（プラスミオン（Plasmion）（登録商標））で
使用される生理学的培地と混合することによって赤血球
と分離される；次に、４５分間放置した後、白血球の懸
濁液を液体培地の表面から除去する。この前懸濁ステッ
プは１時間以上かかる。次に、顆粒球は、ＣＤ４５抗原
に特異的なモノクローナル抗体によって、ミクロタイタ
ープレートのウェルに固定化される。このＣＤ４５抗原
は、全白血球の細胞膜に存在する。ペルオキシダーセに
よって標識された抗−ＣＤ１５抗体は、アッセイに使用
される。

【００１３】更に、欧州特許出願311492に記載された種
々の例は、操作の数及び実行時間、即ちアッセイされる
細胞集団が結合される固体支持体を洗浄するためのステ
ップの見地から重要性である。

【００１４】従って、前記特許出願において示された速
度に対する懸念にもかかわらず、アッセイの全実行時間
は通常長い。即ち、これは、１時間以下か又は１時間に
等しい。実際に、以下のステップは、アッセイを行なう
ために必要である。

【００１５】−全血液からの血液細胞の分離に適当であ
れば、アッセイされるサンプルを調製すること。

【００１６】−少なくとも１０分間、好ましくはより長
い培養。

【００１７】−固体支持体の洗浄。

【００１８】及び、 −酵素標識の場合には、酵素活性の発現（ペルオキシダ
ーゼで２０から２５分、他の酵素でより長く）。

【００１９】これらの操作は全て、当業者によって４５
から６０分の間の時間で行なわれる。

【００２０】最後に、結果の表示には、選択された測定
方法の関数として標準化が要求される。この標準化は、
定量的な細胞蛍光測定法（cytofluorimetry method）に
よって抗原に関してあらかじめ測定された細胞プレパレ
ーションで行なわれる。

【００２１】

【発明の概要】本発明に従えば、免疫的測定法に基づい
た顆粒球をカウントするシステムであって、迅速な診断
テスト特に、使用の簡便さ、実施の速度、及び結果の信
頼性の基準を満たすシステムが見い出される。即ち −顆粒球の測定は、アッセイされる細胞の補足及び標識
と同様の抗体を用いて行なわれるので、細胞の数が直接
測定される。

【００２２】−測定は、全血液又は生物学的液体のサン
プルで行なわれる。これにより全血液又は生物学的液体
から多核白血球を分離するための長い予備ステップが回
避される。

【００２３】−適切な磁気粒子の使用、並びに補足のた
め及び測定される細胞を運ぶ前記粒子を洗浄するための
選択された方法が簡略化され、洗浄時間が短縮される。

【００２４】及び −内部標準を非常に簡単に添加できる可能性があるため
測定結果の直接の表示が可能になる。

【００２５】本発明に従えば、顆粒球を補足し標識する
ために使用される抗体、以後特異性抗体と呼ぶ、は、顆
粒球に特異的な表面抗原に向けられたモノクローナル抗
体である。

【００２６】従って、前記抗原は、顆粒球の表面に存在
するが、他の細胞表面には存在しない。更に、この抗原
は、顆粒球の表面に十分豊富にあり、後者を特異性抗体
によって補足し、標識することが可能である。

【００２７】本発明は、正常又は異常なヒト血液又は他
のヒト生物学的液体中の顆粒球の迅速なカウントのため
のキットに関し、前記キットは以下の構成要素を含有す
る。

【００２８】ａ）任意に標識された特異性抗原を含有す
る決まったの量の顆粒球の希釈剤及び標識剤を含有する
第一の容器。

【００２９】ｂ）標識されていないが、同じ特異性抗原
が結合した磁気粒子を含有する第二の容器。

【００３０】及び ｃ）磁化された末端部分を有する測定ロッドと呼ばれる
ロッド。

【００３１】有利には、本発明に従ったキットは、以下
の１以上の要素も含んでいる。

【００３２】ｄ）決定された量の血液又は生物学的液体
を除去するための装置。

【００３３】ｅ）洗浄液を含有する装置。

【００３４】ｆ）特異性抗体のマーカーを発現するため
の手段−例えば、酵素プローブで標識された特異性抗原
の場合、酵素の発現器を含有する１以上の容器、即ち酵
素のための基質及び適切であれば、酵素の活性を測定す
るために必要な１以上の試薬を含有する１以上の溶液。

【００３５】及び ｇ）少なくとも１つの参照ロッドと呼ばれるロッド。こ
のロッドは、個々のロッドで異なるが、決まった量の抗
種ポリクローナル抗体（anti-specires polyclonal ant
ibodies ）であって、前記種が、特異性抗原を生じさせ
る動物種であるポリクローナル抗体、又は決まった量の
特異性抗原のどちらかで、その末端部分がコートされて
いる。

【００３６】本発明の他の態様において、本キットは、
測定ロッドも参照ロッドも含まないが、補足剤及び標識
剤を含有する容器の外面に適用するとき、その使用に
は、前記容器の内表面に磁気粒子を固定化することを可
能にする磁気棒が含有される。本キットが参照ロッドを
含まないときは、自動装置の助けを借りてカウントする
ことによって測定された公知の数の顆粒球を各々含有す
る別の参照サンプルをキットに加えることが可能であ
る。

【００３７】”決定された量の血液又は生物学的液体を
除去するための装置”は、静脈血のサンプルを取るため
の、針を装着した決まった容積のシリンジ、又は目盛の
ついたキャピラリー管が取付けられた針を意味し、さも
なければ、存在するサンプルから与えられた容積の血液
あるいは生物学的液体を除去するための任意の適切な装
置を意味すると解される。

【００３８】本発明に従ったキットで使用される磁気粒
子は、種々の形、即ち球形又は非球形を有する。これら
の最大の大きさは好ましくは、０. １から２０μｍの間
である。例として、サイズが０. １から１０μｍまで変
化し、０. ８μｍの平均値を有するRhone-Poulenc によ
って売り出されているEstapor （登録商標）粒子のよう
なポリスチレンコートされた磁気粒子を挙げることがで
きる。また、Dynal によって売り出されている約２μｍ
のサイズを有するDynabeads 粒子のような多層複合磁気
粒子を挙げることもできる。

【００３９】更なる可能性は、公知の方法、例えばAmer
ican Chemical Society SymposiumSeries, 1982, 200 R
eprographic Tecnology, 553-576 において、M. Ronay
によって説明された方法を用いて調製された磁気材料の
存在下に、欧州特許104101に従ってガンマー線の照射下
でアクリル誘導体を重合することによって調製された粒
子を使用することである。これらの粒子は１から１０μ
ｍの間のサイズを有する。

【００４０】特に好ましくは、本発明に従ったキットに
使用される磁気粒子は、０. ５から４μｍの間の大きさ
を有する。

【００４１】磁気粒子にモノクローナル抗体を結合させ
るには、物理吸着又は共有結合が有効である。粒子が、
市場で入手可能であれば、製造主によって提案された手
段を用いるか、さもなければ、欧州特許104101で説明さ
れた手段を使用することが可能である。

【００４２】磁気粒子を含有する容器は、通常の手順で
製造される。即ち、食塩を加えることによって等張にさ
れ、牛血清アルブミン又は牛胎児血清のような蛋白を含
有するリン酸緩衝液中に、モノクローナル抗体を結合す
る磁気粒子が、約７のｐＨで置かれる。小量のこの溶液
を容器中に置き、この後、後者を凍結乾燥し、栓をし、
次いで低温（５℃以下）で保存する。小量というのは、
容器の容積よりも約１００倍小さいことを意味すると解
される。

【００４３】標識された特異性抗体は、放射性同位体標
識、酵素標識、蛍光剤を用いた標識のような当業者に公
知の標識法の任意の一つによって、従来の方法で得るこ
とができる。

【００４４】顆粒球は、１０から１０μｍの大きさであ
り、不規則な形である。即ち、顆粒球は、多数の細胞マ
ーカーあるいは抗原をその表面に有している。ＣＤ４５
抗体のようなこれらのうちの幾つかは、全ての白血球に
存在し、ＣＤ１５のような他のものは、顆粒球に特異的
なものである。

【００４５】本発明に従った免疫的なアッセイの１つの
独特な態様に対して、ＣＤ１５細胞抗原が顆粒球を補足
及び標識するために選ばれる。この抗原は、顆粒球の表
面に非常に大量に存在する。

【００４６】従って、これらの細胞の数を決定すること
を目的とした顆粒球の補足及び標識は、抗原に対する親
和性が１０⁸ Ｍ^-1よりも大きい抗−ＣＤ１５モノクロー
ナル抗体で効果がある。

【００４７】本発明の１つの独特な態様において、使用
されるモノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＭの免
疫グロブリンである。このような免疫グロブリン分子
は、１０の抗体部位を有するが、アイソタイプＩｇＧの
免疫グロブリン分子は、僅か２の抗体部位を有するのみ
である。

【００４８】これらが有する多数の結合部位（免疫グロ
ブリンＩｇＧの５倍以上）によって、抗−ＣＤ１５Ｉｇ
Ｍは、顆粒球の表面に存在するＣＤ１５抗原を認識する
ための、従って前記顆粒球を補足するためのより大きな
容量を提供する。更に、抗−ＣＤ１５ＩｇＭは、酵素プ
ローブあるいは放射性同位体プローブからなるより多く
のトレーサー分子を付着することができ、これによっ
て、これらに顆粒球上のＣＤ１５抗原を標識するための
非常に高い容量が与えられる。

【００４９】バイオシス（BIOSYS）によって販売されて
いるＳＭＹ １５ａ抗体は、本発明に従ったアッセイを
行なうのに特に適した免疫グロブリンＩｇＭである。Im
munotechによって販売されている８０Ｈ５クローン抗−
ＣＤ１５抗体を使用することも可能である。

【００５０】顆粒球補足剤及び標識剤は、約７のｐＨを
有する生理食塩水緩衝液、例えば燐酸緩衝生理食塩水で
あって、前記緩衝液が牛血清アルブミン又は牛胎児血清
のような蛋白を含有する緩衝液中に希釈された抗−ＣＤ
１５抗体（蛍光性か、又は酵素プローブあるいは放射性
同位体プローブで標識されたもの）を含有した試薬を意
味すると解される。

【００５１】試薬は、この試薬に含まれる抗−ＣＤ１５
抗体の濃度が、０. ５から５μｇ／ｍｌとなるように使
用される。

【００５２】洗浄液は、約７のｐＨを有する生理食塩水
緩衝液、例えば食塩を添加することによって等張にされ
たリン酸緩衝液のような、洗浄するための従来の病理学
的液体を意味すると解される。

【００５３】”蛍光モノクローナル抗体”という表現
は、抗体が、フルオレセインイソシアネートのような適
切な蛍光色素（fluorochrome）で蛍光性にされたことを
意味する。

【００５４】”放射性同位体プローブで標識されたモノ
クローナル抗体”という表現は、モノクローナル抗体
が、その構造、例えば構成要素をなすチロシン残基の成
分として、あるいはこれらに結合した適切な基として、
放射性同位体を有することを意味する。そして、前記放
射性同位体は、それらに関連した放射能をカウントする
ことによって前記モノクローナル抗体をアッセイするこ
とを可能にする。

【００５５】”酵素プローブで標識されたモノクローナ
ル抗体”という表現は、モノクローナル抗体が、適切な
試薬の使用に関連するとき、このモノクローナル抗体の
定量的測定を可能にする酵素と結合されることを意味す
る。

【００５６】反応の最終生成物、又は酵素及びこれらの
基質に起因する反応順序が、以下のどちらかになるよう
に基質及び試薬が選択される。

【００５７】−着色物質又は蛍光物質。これらは、細胞
を取り巻く液体培地に分散し、それぞれ最終的な分光光
度測定あるいは蛍光測定の対象であるか、又は標準化さ
れたシェードの範囲に比較して適切であれば、視覚的な
評価の対象である。

【００５８】−又は、不溶性着色剤。これは、細胞及び
細胞が結合した支持体に堆積し、反射率分光法（reflec
tance photometry）によって測定されるか、又は標準化
されたシェードの範囲に比較して適切であれば、視覚的
な評価の対象となる。

【００５９】蛍光性にされた抗体を使用するとき、細胞
に関連した蛍光は、適切な装置で直接に読みあげられ
る。

【００６０】例えばヨウ素１２５のような放射性同位体
プローブを使用するとき、細胞に関する放射能は、任意
の適切な形式に従って、例えばアルカリ性溶液（例えば
水酸化ナトリウム溶液）で細胞を可溶化し、吸収性緩衝
液によって放射能を含む溶液を回収した後に、ガンマー
線計測器でカウントされる。

【００６１】モノクローナル抗体に酵素プローブを使用
するとき、着色生成物及び蛍光性生成物の出現は、アッ
セイされる抗原をもつ細胞集団が結合されている固体支
持体に、酵素に対する基質及び１以上の補助試薬を含有
する溶液を加えることによって達成される。これらの試
薬によって、培地に溶解する着色生成物あるいは不溶性
着色生成物、又は上で説明した可溶性の蛍光性生成物を
最終生成物として得ることが可能になる。次に、この方
法で処理されたサンプルから得られる光シグナルは、個
々の場合に適した装置、即ち透過光度計（transmission
photometer ）、反射光度計、蛍光計によってそれぞれ
測定される。そのほかには、標準化した着色溶液の範囲
が適切であれば、得られた着色も視覚的に評価されう
る。

【００６２】アルカリ性ホスファターゼを酵素プローブ
として使用する場合、この酵素は、Boehringer Mannhei
m-Biochemicaによって提案された方法によってモノクロ
ーナル抗体と結合される。この酵素に対する好ましい基
質は、分光光度法で最終的な読み取りをするためのパラ
ニトロフェニルホスフェート、蛍光計で読み取るための
４−メチルウンベリフェリルホスフェート、又は、不溶
性の反応生成物を与える５−ブロモ−４−クロロインド
ール−３−イルホスフェートである。同様に、β−ガラ
クトシダーゼを酵素プローブとして使用することもでき
る。この場合に、好ましい基質は、β−ガラクトピラノ
シド又は４−メチルウンベリフェリルβ−ガラクトピラ
ノシドである。

【００６３】好ましくは、モノクローナル抗体は、ペル
オキシダーゼと結合されうる。この場合、結合過程は、
W. Knapp, K. Kolubar及びG. Wicks編、免疫蛍光及び関
連染色技術（Immunofluorescence and Related Stainin
g Techniques）Elsebier/North Holland, Amsterdam, 1
978, p.215-224において、M. B. WILSON及びP. K. NAKA
NEによって説明された方法から導かれる。酵素接合体の
調製のための初期プロトコルと比較することによって導
入される変更は、以下の点に関連する。即ち、 −ペルオキシダーゼ／抗体が３に等しく、これはプロト
コルでは２に対比されること、及び −提案された過ヨウ素酸ナトリウム中での３３％還元に
よるペルオキシダーゼの糖鎖ユニットの厳密性の低い酸
化、である。

【００６４】モノクローナル抗体と接合したペルオキシ
ダーゼを発現するために使用される試薬には、酵素に対
する基質である過酸化水素、及び適切なクロモゲン(chr
omogen) 、例えば培地中に溶解し得る着色した最終反応
生成物を得るためのオルトフェニレンジアミン又は２，
２−アジノビス（３−エチルチアゾリン−６−スルホニ
ック）アシッド（ＡＢＴＳ）が含まれ、さもなければ、
不溶性の最終反応生成物を得るための３，３’−ジアミ
ノベンジジ、３−アミノ−９−エチルカルバゾールある
いは４−クロロ−α−ナフトールが含まれ、そのほかに
は、培地に溶解する蛍光性最終反応生成物を得るための
パラヒドロキシフェニルプロピオン酸が含まれる。

【００６５】本発明の他の態様はアセチルコリンエステ
ラーゼと結合されたモノクローナル抗体の使用である。

【００６６】アセチルコリンエステラーゼは、好ましく
は、フランス特許No2550799 に記載されたものから誘導
される方法を使用して抗体と結合されるか、又は概略と
して、公知の技術、即ち適切なヘテロ二官能性試薬（he
terobifunctional agent）との反応によって酵素を変化
することによって抗体のフラグメントを調製し、そし
て、最後に、これによって得られた生成物をカップリン
グすることを具備した方法を使用して抗体と結合され
る。免疫酵素接合を構築するための他の公知の方法もこ
の場合使用することができる。

【００６７】アセチルコリンエステラーゼ接合によって
認識される細胞抗原と特異的に関連した酵素活性の発現
は、好ましくは、酵素に対する基質及びエルマンズ試薬
としてアセチルチオコリンを使用する良く知られた技術
にしたがって行なわれるか、又は実験に即した、例えば
Pradelles 等Anal. Chem., 1985,57,1170-1173に記載さ
れた変化に従ってクロモゲンとして５，５’−ジチオ−
２−ニトロ安息香酸を使用する良く知られた技術にした
がって行なわれる。

【００６８】引用したクロモゲンは、そのものか、又は
水溶性の塩の形で使用される。

【００６９】本発明に従った、ロッド（測定ロッド及び
参照ロッド）は、大きさが磁気粒子を含有する容器の大
きさに適した固体支持体である。実際、このロッドは、
前記容器に部分的に浸され、次に容易に引き出せること
が意図されている。従って、末端に磁気を帯した測定ロ
ッドは、アッセイキットの第二の容器に含まれる全ての
磁気粒子を補足することができる。

【００７０】測定ロッドとして、例えば溶血管の大きさ
に適した、約１０センチメートルの長さ、約１センチメ
ートルの幅、及び１から２ミリメートルの厚さの平たい
スパチュラが選ばれ得る。

【００７１】磁気部はスパチュラの両側で約１ｃｍ² の
表面積を覆っている。例えば、アレレック（Arelec）に
よって販売されているFlexor 15 （登録商標）磁気テー
プの適切な形のパッチを用意することが可能である。ま
たロッドの末端部分の内側に磁石をモールドすることも
可能である。

【００７２】１又は２以上の参照ロッドは、好ましくは
測定ロッドと同じ長さを有するが、それよりもほそい。
また、それらの横断面は、例えば円形（直径で約２ｍ
ｍ）である。更に、測定ロッド及び参照ロッドは、これ
らを補足、標識、及び洗浄操作で一緒に操作することが
可能となるように一端でしっかりと固定されている。こ
れらは、本来の測定前に容易に分離することができる。
言い換えれば、それぞれのロッドで、免疫酵素標識の場
合には、抗体と結合された酵素活性の発現が行なえ、ま
た、放射性同位元素標識の場合には放射能のカウントが
行なえる。

【００７３】決められた量の精製又は未精製ＣＤ１５抗
原は参照ロッドの末端部に、例えば、物理吸着あるいは
共有結合で結合される。また、決まった量の抗種抗体
（anti-species antibody ）であって、前記種が、使用
されるＣＤ１５モノクローナル抗体を発生する動物種で
ある抗体（例えば抗−ＣＤ１５抗体がねずみ由来である
場合には、抗−マウス免疫グロブリン抗体）を結合する
ことも可能である。

【００７４】実際に、本発明に従えば、希釈剤及び標識
剤に存在する、酵素又は放射性同位元素プローブで標識
した既知量の抗−ＣＤ１５抗体を参照ロッドで補足する
ことが意図される。

【００７５】参照ロッドに結合したＣＤ１５抗原及び非
同種抗体の量は、あらかじめ決定される。その結果、本
発明に従った方法の最後で決定され得るシグナルは、分
析を受けたサンプル中の顆粒球の数の閾値に対応する。

【００７６】幾つかの参照ロッドを使用するとき、個々
の１つは異なった量のＣＤ１５抗原又は抗種抗体でコー
トされる。その結果、本工程の最後でそれぞれの参照ロ
ッドに対して測定されうるシグナルは、顆粒球の数に関
しては異なった値に対応する。

【００７７】血液サンプル中の顆粒球がカウントされる
とき、例えば、健康な験体中でカウントされる顆粒球の
平均値に対する最小値に対応する閾値、即ち１ｍｍ³ の
血液当たり約２０００の細胞を選択することができる。
また、より厳密な顆粒球減少症に対応するより低い値、
即ち例えば、１ｍｍ³ の血液当たり５００から１０００
のあいだの細胞を選択することもできる。

【００７８】測定ロッドの磁化部分への細胞の接近を妨
げてはならない。この前提のために、参照ロッドが測定
ロッドより細くなっており、またこれ等のロッドは、夫
々が適切な幾何学的配置を取ることによって、お互いに
接触することを防止するようになっている。例えば、他
のロッドに向けて突き出ている一つのロッドのふくらみ
があることによって、これらのロッドを所定の距離、例
えば１から２ミリメーター離して保持することが可能に
なる。

【００７９】ロッドを互いに一時的に固定する装置は、
測定ロッドの磁化部分とは反対側の端部上か、又は抗種
抗体あるいはＣＤ１５抗原を付着した部分とは反対側の
参照ロッド上のどちらかに配置される。

【００８０】２つのロッドの１つの独特の態様は、図１
及び１ａに示されている。ここで、（１）は、その低部
に磁化部分（２）を有する測定ロッドを表わす。（３）
は、抗マウス免疫グロブリン抗体でコートした領域
（４）をその低部に具備した参照ロッドを表わす。

【００８１】ロッド（１）及び（３）は、これらを分離
できる方法でお互いを固定することが可能な雄部及び雌
部からなる結合手段（５ａ及び５ｂ）を具備している。

【００８２】図１ａは、アッセイ操作中にお互いを固定
するロッド（１）及び（３）を示しており、前記ロッド
は、反応培地又は洗浄液（７）を含有する管のような容
器（６）に挿入される。更に、ロッドの１つは、他のロ
ッドに向けて突き出しているふくらみ（８）を有してい
る。このロッドは、半球状のグリップ（９）を有しう
る。

【００８３】本発明の一つの態様において、使用される
洗浄装置は、洗浄液を含有した別の容器からなる。この
容器には、測定ロッド及びもし適切であれば１又は２以
上の参照ロッドが浸され、それ（又はそれら）がしっか
りと固定される。選択される洗浄容器の大きさは、磁気
粒子を含有するアッセイキットの第２の容器の大きさと
同じであり得る。更に洗浄は、測定ロッド及びもし適切
であれば、１又は２以上の参照ロッドを、洗浄液を含有
した個々の容器に順次浸すことによって行なわれる。

【００８４】他の態様として、使用される洗浄装置は、
１回のアッセイに必要な洗浄液の全量を含有する容器か
らなり得、前記装置は循環システムを有している。更
に、これは、洗浄溶液が流れる磁気粒子を含有した容器
（第二の容器）にはめることができうる。その場合に、
磁気粒子を含有する容器も循環装置を具備する。洗浄液
の流れは、アッセイキットの第二の容器に置かれる測定
ロッド及び、もし適切であれば、１又は２以上の参照ロ
ッドを洗浄することができる。

【００８５】本発明は、更に本発明に従ったキットを使
用して顆粒球を迅速にカウントするための方法に関す
る。これには、以下のことが包含される。

【００８６】ａ）決まった量のヒト血液あるいは生物学
的液体を、特異性抗体であって、この特異性抗体が従来
の方法で標識されているものを含有する固定された量の
顆粒細胞希釈剤及び標識剤と混合すること。

【００８７】ｂ）得られたサンプルを、同じ特異性抗体
であるが、標識されていない抗体を結合した磁気粒子を
含有する装置中に移動し、該容器内でそれらを振るこ
と。 ｃ）磁化末端部分に与えられた測定ロッド、及び、もし
適切であれば、少なくとも１つの参照ロッドを容器に導
入すること。ここで、前記参照ロッドは、その末端部分
が、決まった量の抗種ポリクローナル抗体であって、前
記種が特異性抗体を発生する動物種である抗体か、又は
決まった量の特異性抗原のどちらかでコートされた参照
ロッドである。

【００８８】ｄ）反応時間の後に、測定ロッド及び適切
であれば、１又は２以上の参照ロッドを引き出し、測定
ロッド及び適切であれば参照ロッド又はロッド等を洗浄
すること。及び ｅ）顆粒球を実際にカウントすること。

【００８９】本発明に従った方法の他の態様において、
ステップａ）及びｂ）は交換しうる。

【００９０】ステップｄ）に記載した反応時間は１から
５分の間である。

【００９１】ステップｄ）で、洗浄は、洗浄溶液の流れ
で、又は洗浄液を含有する容器中に順次沈めることによ
って、それぞれの容器中で５から１０秒間で行なわれ
る。

【００９２】本発明の１つの独特の態様において、使用
される特異性抗原は抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体で
ある。これは、物理吸着又は共有結合によって磁気粒子
に結合する。特異性抗原が酵素プローブで標識された場
合、本発明に従った方法も酵素に対する基質、及び、も
し必要であれば、１以上の補助試薬を有する測定ロッド
を処理することが包含される。もし適切であれば、次に
参照ロッドにも同様な処理が適用される。

【００９３】測定ロッドに結合した顆粒球の実際の測定
は、特異性抗原を標識した方法に依存する。例えば、実
際の測定は、結合した放射能をカウントすることによっ
て、又は別の方法として、伝導あるいは反射光測定法、
蛍光放出の測定、標準化シグナルの範囲と比較して適当
であれば視覚的評価によって行なわれる。適切であれ
ば、１又は２以上の参照ロッドから生じる光測定シグナ
ル又は放射能シグナルの測定は、同様な方法で行なわ
れ、その後、１又は２以上の参照ロッドから生じる光測
定シグナル又は放射能シグナルを測定ロッドからのシグ
ナルと比較する。

【００９４】本発明の１つの独特の態様では、使用され
る１又は２以上の参照ロッドは、測定ロッドにしっかり
固定される。この場合、別のロッドの分離は、ステップ
ｄ）に続いてステップｄ１）で行なわれる。

【００９５】本発明に従って、幾つかのロッドが使用さ
れ得る。一つは、測定ロッドと呼ばれるものであり、も
う一方あるいはほかのものは、参照ロッドと呼ばれる。
後者によって、顆粒球の数に対する１又は幾つかの値の
結果を知ることが可能になる。従って、サンプルに存在
する顆粒球を正確にカウントすることが望まれるとき、
測定ロッドによって付着された標識細胞による吸光度が
本方法の最後で測定され、もし適切であれば、１又は２
以上の参照ロッドで発生した吸光度の測定値が、内部標
準として使用される。アッセイされたサンプル中の顆粒
球の数を、選ばれた１又は２以上の閾値と比較すること
が望まれる場合には、それぞれのロッドで得られた着色
を視覚的に比較することで十分である。

【００９６】従来的には、例えば、ペルオキシダーゼの
活性は２０分間で発現される。一方、アルカリ性ホスフ
ァターゼの活性は約２時間で発現される（欧州特許3114
92）。得られた着色の強度（吸光度）は、次に光測定器
によって測定される。

【００９７】本発明に従って、測定ロッドと１又は２以
上の参照ロッドの間の吸光度の差を視覚的に測定するた
めには、ペルオキシダーゼの発現時間は２分で十分であ
ることが見い出された。また、この発現時間は、測定ロ
ッドによって運ばれる細胞の吸光度を測定するのにも十
分である。その上、標識に使用された任意の酵素に対し
て、免疫測定的アッセイに従来提案された発現時間は、
実質的に短縮されうる。

【００９８】本発明の１つの独特の態様において、血液
サンプル中の顆粒球は、測定ロッド及び参照ロッドを含
有し、しかも抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体が、ペル
オキシダーゼで標識されたアイソタイプＭの免疫グロブ
リンである本発明に従ったキットを使用して、本発明に
従った方法によってカウントされる。この場合、本方法
の種々のステップが以下に示した近似時間で行なわれ
る。

【００９９】ステップａ）：１５秒 ステップｂ）：１５秒 ステップｄ）：２分３０秒 抗−ＣＤ１５抗体が酵素プローブで標識される場合、測
定ロッドが酵素に対する基質で処理されるステップは２
分以下である。同様なことが、もし適切であれば、１又
は２以上の参照ロッドの処理に適用される。

【０１００】従って、予備実行時間は６分以下である。

【０１０１】

【実施例】以下の例では、次の用語、又は略語を無差別
に使用する。

【０１０２】ＢＳＡ： 牛血清アルブミン ＰＢＳ： ｐＨ７．４での燐酸緩衝生理食塩水 ＩｇＧ： 免疫グロブリンＧ ＩｇＭ： 免疫グロブリンＭ ｃｐｍ： １分当たりのカウント数 ｄｐｍ： １分当たりの崩壊数 ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸 ＰＯＤ： ペルオキシダーゼ 例１ ヒト血液サンプル中の顆粒球の測定 Ａ）アッセイキットの調製 ａ）磁気粒子の調製 手順は、欧州特許104101と同じであり磁気酸化物を添加
した。

【０１０３】以下のものを含んだ溶液が調製された。

【０１０４】−３. ８ｍｌのメタアクリル酸 −１２１. ９ｍｌの、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリル
アミドを１リットル当たり２０ｇ含有する水溶液 −８８. １ｍｌのアクロレイン −９３. ２ｍｌのヒドロキシエチルメタアクリレート −１９３ｍｌの水。

【０１０５】従って、保存溶液と呼ばれるこの溶液は、
３７. ５容積％のモノマーを含有する。

【０１０６】１リットル当たり１８. ８ｇに希釈された
Atochem −Forafac （登録商標）１１５７−によって標
識されたフッ素化された界面活性剤。

【０１０７】Ferrofluidics から販売されているＥＧＭ
８０５（登録商標）が磁気酸化物として使用される。

【０１０８】以下のものが１８. ８ｍｌの密封管中で混
合される。

【０１０９】−２. ５ｍｌの保存溶液 −０. １ｍｌの界面活性剤溶液 −１ｍｌのＥＧＭ８０５（登録商標） −必要な量の水 窒素気流が通された後、反応媒体を液体窒素で凍らせ、
アンプルを真空下で密封する。

【０１１０】コバルトの入った鉛容器（⁶⁰Ｃｏ）からの
γ線を用い、６０krad/hour で３時間照射することによ
って重合を行なう。

【０１１１】得られた磁気粒子の直径は１から１０μｍ
であった。

【０１１２】ｂ）磁気粒子を含有する管の調製。

【０１１３】使用される磁気粒子は、ステップａ）で調
製された粒子か、又はEstapor （登録商標）０. ８μｍ
の平均直径を有するRhone-Poulenc によって販売されて
いる、商品番号Ｍ1 ．０７０／４０のラテックス粒子で
ある。これらの粒子は、ＣＤ１５に特異的な抗体と結合
される。選ばれる抗体は、Biosysから発売されているア
イソタイプＭの抗体ＳＭＹ １５ａである。ラテックス
粒子は、以下に示した手段で抗体に結合される。

【０１１４】０. １ｍｌの１０％ラテックス粒子懸濁液
を硝子管に置く。１ｍｌのＰＢＳの抗体の溶液１ｍｇを
加え、次に混合物を３０分５６℃で振とうする。４℃で
１日後、これを３０から６０分遠心器にかけ（１５・１
０³ ｒｐｍ，４℃）、次に１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、再
度遠心した。最後に、残渣を、０. ２％のＢＳＡを含有
する１ｍｌのＰＢＳで飽和した。

【０１１５】これによって得られた粒子を、０. ２％の
牛アルブミンを含有する１ｍｌの燐酸緩衝生理食塩水に
置いた。２５μｌのこの混合物を、５ｍｌの容積を有す
る溶血反応管に導入した。この方法で調製された管は、
凍結乾燥され、栓をされ、次いで、封をされたプラスチ
ックバッグ中で、＋４℃で保存される。

【０１１６】ｃ）モノクローナル抗体／ペルオキシダー
ゼ接合体の溶液を含有する装置の調製。

【０１１７】Boeringer Mannheim Biochemica （商品番
号814393）によって販売されているペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）を使用した。

【０１１８】抗体とペルオキシダーゼを結合する方法
は、０. ３６ｍｌの蒸留水中の１. ５ｍｇのＰＯＤをペ
ルオキシダーゼの酸化に使用したこと、及び５０μｌの
過塩素酸ナトリウム溶液を加えたこと以外、免疫蛍光及
び関連染色技術（Immunofluorescence and Related Sta
ining Techniques）(W. Knapp, K. Kolubar 及びG. Wic
ks編、Elsebier/North Holland, Amsterdam, 1978, p.2
15-224) において、M. B. WILSON及びP. K. NAKANEによ
って説明されたものである。生成物は、５００μｌの炭
酸塩緩衝液に含まれる２ｍｇの抗−ＣＤ１５抗体ＩｇＭ
と結合される。水素化硼素ナトリウムで処理し、ＰＢＳ
に対して透析した後、ＩｇＭ／ＰＯＤ接合物は、０. ２
２μｍの膜で濾過することによって殺菌される。

【０１１９】ＳＭＹ １５ａ抗体／ペルオキシダーゼ接
合体は、ＰＢＳと牛胎児血清の等量混合物の１ｍｌあた
り２μｌの抗体の濃度で、４００μｌの、いつでも使用
できる試薬の単位投与量でパッケージ化される。これ
は、５ｍｌの溶血反応管か、Becton-Dickinsonによって
販売されている商品番号5826のUnopette（登録商標）装
置にパッケージ化される。

【０１２０】ｄ）発現試薬の調製 ８１０ｍｇのオルトフェニレンジアミン二塩酸塩を２５
ｍｌのＰＢＳに溶解し、５０μｌのこの溶液をそれぞれ
含有する５ｍｌの溶血反応管を調製した。この管を凍結
乾燥し、栓をし、＋４℃で封をしたプラスチックバッグ
に保存した。使用する直前に、Pasteur Sanofi Diagnos
ticsによって販売されている６００μｌの発現溶液、即
ちクエン酸緩衝液及び過酸化水素（酵素に対する基質）
をそれぞれの管に添加した。

【０１２１】ｅ）測定ロッドの調製。

【０１２２】Safaa によって販売されている白色のプラ
スチック製の１０センチの長さのスパチュラを使用し
た。個々のスパチュラの端で、Arelec（商品番号：Flex
or 15,15/10^e ）によって販売されている、直径で８ｍ
ｍの、のりや水を使わずに接着できる１パッチの磁気テ
ープを両側に固定した。スパチュラを１分間蒸留水及び
Paragem （フランス）によって販売されているManisoft
（登録商標）洗浄剤で洗浄し、蒸留水で軽く洗浄し、次
に乾燥して、アルミニウムバッグに保存する。

【０１２３】ｆ）参照ロッドの調製。

【０１２４】Somater によって販売されている１０ｃｍ
の長さで、２ミリメートルの直径のプラスチック製のス
パチュラを使用した。抗−マウス免疫グロブリン抗体
を、以下の手段によってこのロッドの一端に吸着した。
即ち、ロッドの一端（５ｍｍの高さ）を、ＰＢＳに溶解
した抗体の４μｇ／ｍｌを含有する溶液に４℃で１２時
間浸し、次にロッドをＰＢＳ中の０. ２％牛アルブミン
溶液に１０分間浸して、最後に乾燥した。

【０１２５】ｇ）洗浄管の調製。

【０１２６】４ｍｌのＰＢＳを何本かの５ｍｌ溶血反応
管に導入し、次にこの管を閉じた。これによってこの管
はいつでも使用できる。

【０１２７】Ｂ）血液サンプルのアッセイ ａ）顆粒球の標識及び補足。

【０１２８】抗凝固剤に採取された４４μｌの血液を抗
体／ＰＯＤ接合体を含有するステップＡのｃ）で調製し
た管に置き、内容物を５秒間混合した。血液は、針を取
付けたシリンジによって採取された静脈血か、又はBect
on-Dickinsonによって販売されている装置である商品番
号6357のMicrotainer （登録商標）針によって指の先か
ら採取された毛細管血である。

【０１２９】抗体／ＰＯＤ接合体溶液を含有するUnopet
te（登録商標）装置を使用するとき、製造元（Becton-D
ickinson）によって提案されている毛細管は４４μｌの
血液を導入するために使用される。

【０１３０】ステップＡのｂ）で調製された磁気粒子を
含有する栓をされた管をあけ、あらかじめ調製した血液
と抗体／ＰＯＤ接合体の混合物、即ち全量で４４４μｌ
を素早くその中に置く。内容物を１５秒間振とうし、次
いでステップＡのｅ）で調製した測定ロッド及びステッ
プＡのｆ）で調製した参照ロッドを管に導入し、ロッド
を２分３０秒間管中に放置する。

【０１３１】操作は２×８のサンプルで行なわれる。

【０１３２】ｂ）洗浄及び酵素活性の発現。

【０１３３】ロッドを標識管から引き出し、次いで４秒
間上下にゆすることによって洗浄し、順次１管当たり５
秒の割合、即ち全体で２０秒で管を洗浄する。

【０１３４】ロッドはまた、２０秒間洗浄液の流れでも
洗浄され得る。次に個々のロッドを６００μｌの発現溶
液を加えたステップＡのｄ）で調製したオルトフェニレ
ンジアミンを含有した発現管に浸す。

【０１３５】ｃ）結果。

【０１３６】２分後、測定されたサンプルのための測定
ロッドから発生する発現培地の黄色い発色が、参照ロッ
ドから発生するものよりも非常に濃くなることが見い出
される。

【０１３７】更に、発現培地の吸光度を、４５０ｎｍの
波長で、校正された分光光度計によって２００μｌの溶
液で測定した。

【０１３８】健康な提供者から採取された２×８のサン
プルを測定した。個々の提供者には、２つのサンプル、
即ち静脈血及び毛細管血を設定した。

【０１３９】また、１ｍｍ³ の血液に含まれる顆粒球の
数は、自動測定器によって個々のサンプルの静脈血に対
して測定された。この測定は、Diagnostic System によ
って販売されているOrtho ELT 8 装置で細胞を自動的に
カウントすることによって行なわれた。Hematrak（登録
商標）装置も白血球部分集団の割合を決定するために使
用される。

【０１４０】結果を以下の表１に示した。

【０１４１】

【表１】 表１は、測定結果が静脈血及び毛細管血で同じであるこ
とを示す。更に、それぞれのサンプルに対して測定され
た吸光度と同じサンプルに対してカウントされた顆粒球
細胞の数との間の相関係数の値ｒを計算した。この係数
ｒは静脈血のサンプルに対して０. ９５５であり、毛細
管血のサンプルで０. ９４３である。

【０１４２】例２ 全血液中の顆粒球を補足する方法の有効性 まず最初に、１ｍｍ³ 中に存在する顆粒球の数は、健康
な提供者から採取した５つの血液サンプルを自動測定す
ることによって測定した。次に、同様な測定を、例１で
示したような磁気粒子による補足法を適用した後に行っ
た。それぞれのサンプルに対して、補足された顆粒球の
割合を、磁気粒子による細胞の補足の前後でカウントさ
れた顆粒球数の差として得た。

【０１４３】これらの実験で、磁気粒子及び顆粒球は、
例１で説明した手段によって磁化ロッドを用いて、ある
いは管の外に置かれた磁気棒からなる固定された磁石に
よって反応培地から分離される。

【０１４４】得られた結果を以下の表２に示した。

【０１４５】

【表２】 表２に示された結果の観測から、本発明に従った技術に
よって補足された顆粒球の割合が、血液サンプルに存在
する顆粒球の数に関係なく、更に補足のために選択され
た磁石のタイプに関係なく高い（９７から１００％）こ
とがわかる。

【０１４６】例３ 感染された尿培地中の顆粒球のアッセイ。

【０１４７】４０μｌの感染された尿及び４００μｌ
の、例１のステップＡのｃ）で調製されたようなペルオ
キシダーゼで標識された抗−ＣＤ１５抗体接合体を、例
１のステップＡのｂ）で調製された磁気粒子を含有する
管に導入した。３０秒間振とうした後、例１のステップ
Ａのｅ）で調製された測定ロッドを２分３０秒間導入し
た。次に、前記ロッドを、４ｍｌのＰＢＳを含有する４
つの管に順次浸し、ロッドを５秒間それぞれの管中で振
とうすることによって洗浄した。最後に、ロッドを、例
１のステップＡのｄ）で調製した６００μｌのペルオキ
シダーゼ発現試薬に浸した。２分後、吸光度を４５０ｎ
ｍの波長で分光光度計によって測定した。結果を、同様
な条件下で、感染されていない尿のサンプルに対して測
定された結果と比較した。

【０１４８】また、感染された尿のサンプル中に含まれ
る顆粒球の数は、セルカウンターで測定した。

【０１４９】結果を以下の表３に示した。

【０１５０】

【表３】 例４ 種々の血液サンプル中の顆粒球のカウント。

【０１５１】例１で調製したような測定ロッド及び参照
ロッドを具備した本発明に従ったアッセイキットが使用
され、８つの血液サンプルに対して得られた結果物を４
５０ｎｍでの分光光度法で測定した。比較のために、１
ｍｍ³ の血液当たりの顆粒球の数をカウンターによって
測定した。結果を表４に与えた。

【０１５２】

【表４】 それぞれのサンプルに対して、測定ロッドの黄色い着色
が、参照ロッドの着色よりも非常に濃くなることが肉眼
で観測される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の１つの態様を表わした図。

【符号の説明】 １…測定ロッド。２…磁化部分。３…参照ロッド。４…
抗マウス免疫グロブリン抗体でコートした部分。５ａ…
結合手段の雌部。５ｂ…結合手段の雄部。６…容器。７
…反応培地又は洗浄液。８…ふくらみ。９…半球状のグ
リップ。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血液又は任意のたのヒト生物学的液
   体中の顆粒球をカウントするためのキットであって、 ａ）従来法で標識された特異性抗体を含有する決まった
   量の顆粒球希釈剤及び標識剤を含有する第一の容器； ｂ）標識されていないが、同じ特異性抗原が結合された
   磁気粒子を含有する第二の容器；及び ｃ）磁化された末端部分を有する測定ロッドと呼ばれる
   ロッド；を具備したキット。
2. 【請求項２】 請求項１に記載されたキットであって、 ｄ）決められた量の血液又は生化学的液体を除去するた
   めの装置； ｅ）洗浄液を含有する装置； ｆ）特異性抗体のマーカーを発現するための手段；及び ｇ）少なくとも１つの参照ロッドと呼ばれるロッドであ
   って、個々のロッドで異なるが、決まった量の抗種ポリ
   クローナル抗体（anti-species polyclonalantibodie
   s）であり、前記種が特異性抗原を生じさせる動物種で
   あるポリクローナル抗体か、又は決まった量の特異性抗
   原のどちらかで、その末端部分がコートされているロッ
   ド；をも具備するキット。
3. 【請求項３】 請求項２に記載されたキットであって、
   １又は２以上の前記参照ロッドが、測定ロッドに固定す
   るための分離可能な手段を具備したキット。
4. 【請求項４】 請求項１から３の任意の１つに記載され
   たキットであって、磁気粒子が０. １から２０μｍの間
   のザイズを有するキット。
5. 【請求項５】 請求項４に記載されたキットであって、
   磁気粒子が０. ５から４μｍの間のザイズを有するキッ
   ト。
6. 【請求項６】 請求項１から５の任意の１つに記載され
   たキットであって、特異性抗体が蛍光試薬、酵素プロー
   ブ、又は放射性同位体プローブで標識されたキット。
7. 【請求項７】 請求項２から６の任意の１つに記載され
   たキットであって、特異性抗体が、酵素プローブで、並
   びに、酵素に対する基質及び、適切であれば、酵素の活
   性を測定するために必要な１以上の試薬を含有する１以
   上の容器からなる手段ｆ）で標識されたキット。
8. 【請求項８】 請求項１から７の任意の１つに記載され
   たキットであって、特異性抗体が抗−ＣＤ１５モノクロ
   ーナル抗体であるキット。
9. 【請求項９】 請求項８に記載されたキットであって、
   抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体がアイソタイプＩｇＭ
   の免疫グロブリンであるキット。
10. 【請求項１０】 顆粒球の迅速な計数のための方法であ
    って、 ａ）決まった量のヒト血液あるいは生物学的液体を、特
    異性抗体であって、前記特異性抗体が従来の方法で標識
    されているものを含有する固定された量の顆粒細胞希釈
    剤及び標識剤と混合； ｂ）生じたサンプルを移動、及び標識されていないが、
    同じ特異性抗体を結合した磁気粒子を含有する装置中で
    それらを振とう； ｃ）磁化末端部分に与えられる測定ロッド、及び、もし
    適切であれば、少なくとも１つの参照ロッドであって、
    前記参照ロッドが決まった量の抗種ポリクローナル抗体
    であり、前記種が、特異性抗体を発生する動物種である
    ものか、又は決まった量の特異性抗原のどちらかでその
    末端部分をコートした参照ロッドの容器への導入； ｄ）反応時間の後に、測定ロッド及び適切であれば、１
    又は２以上の参照ロッドの引き出し、測定ロッド及び適
    切であれば、１又は２以上の参照ロッドの洗浄；及び ｅ）顆粒球の実際のカウント；を具備した方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載された方法であっ
    て、ステップａ）及びｂ）が入れ替えられる方法。
12. 【請求項１２】 請求項１０又は請求項１１に記載され
    た方法であって、特異性モノクローナル抗体が抗−ＣＤ
    １５モノクローナル抗体である方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載された方法であっ
    て、抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体がアイソタイプＩ
    ｇＭの免疫グロブリンである方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０から１３の任意の１つに記
    載された方法であって、ステップｄ）の反応時間が１か
    ら５分の間である方法。