DE19838429C2 - Anordnung zum schnellen Nachweis von mikrobiologischen oder biochemischen Stoffen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum schnellen Nachweis von mikrobiologischen oder biochemischen Stoffen wie beispielsweise Adenosintriphosphat (ATP).

Der schnelle und unkomplizierte Nachweis von bestimmten Stoffen in einem Volumen oder an einer Ober­ fläche ist in vielen Bereichen von großer Bedeutung. Ein Beispiel hierfür ist der Lebensmittel- oder Hygie­ nesektor, auf denen der mikrobiologische Nachweis von Bakterien oder Keimen einen wesentlichen Faktor dar­ stellt. Dieser Nachweis sollte schnell durchführbar und auch von Laien leicht handhabbar sein.

Es sind daher auf dem Markt Schnelltestsysteme, sogenannte Testkits, verfügbar, mit denen diese Anfor­ derungen erfüllt werden. Schnelltestsysteme zeichnen sich durch wenige, einfach durchzuführende Verfahrens­ schritte aus. Sie können von Laien bedient werden und liefern in der Regel nur qualitative, keine quantita­ tiven Ergebnisse. Eine exakte Kalibrierung solcher Schnelltestsysteme wäre zu aufwendig.

Ein sehr kritisches Anwendungsgebiet solcher Schnelltestsysteme ist der Nachweis bzw. die regel­ mäßige Kontrolle von Vorrichtungen, wie beispielsweise Produktionsanlagen in der Lebensmitteltechnologie, auf krankheitserregende Bakterien oder Keime.

Für diesen Nachweis sind Verfahren bekannt, die die Bakterien oder Keime über deren interzelluläre Stoffwechselprodukte nachweisen. Bei einer häufig eingesetzten Nachweisreaktion erfolgt beispielsweise der Nachweis von interzellulären Stoffwechselprodukten wie z. B. ATP oder DNA/RNA, mit den nachfolgenden Verfah­ rensschritten.

Das nachzuweisende Stoffwechselprodukt wird zu­ nächst biochemisch oder physikalisch, beispielsweise mit einem speziellen Extraktionsmittel, aus den Zellen der Bakterien oder Keime in dem zu untersuchenden Medium extrahiert. Die resultierende Extraktionslösung muß anschließend neutralisiert werden, um die biochemi­ schen Voraussetzungen für die anschließende Signal­ erzeugung zu schaffen und somit Fehlmessungen zu ver­ meiden. Dies ist gerade bei einfach zu handhabenden Schnelltests ein sehr kritischer Verfahrensschritt. Die biochemische Signalerzeugung erfolgt in der Regel durch Zugabe eines Nachweisstoffes, der eine Reaktion mit dem nachzuweisenden Stoff eingeht und hierbei ein Signal erzeugt. Es erfolgen anschließend Schritte wie die Signalerfassung und Auswertung sowie die Ausgabe bzw. Anzeige des Nachweisergebnisses. Im Falle des Nach­ weises von ATP wird beispielsweise ein Glühwürmchen­ luciferasereagens als Nachweisstoff zugegeben, das bei Anwesenheit von ATP eine Leuchtreaktion hervorruft. Die hierbei emittierte Strahlung kann dabei über einen Photodetektor als Signalerfassungseinrichtung nach­ gewiesen werden.

Ein derartiger Schnelltest mit einem Verfahren zur Extraktion von interzellulären Komponenten ist bei­ spielsweise in der DE 692 21 604 T2 beschrieben. Die hierbei verwendeten biochemischen Verfahren sind der US 5705345 zu entnehmen, wobei der Schwerpunkt auf der biochemischen Freisetzung der interzellulären Produkte wie ATP, DNA oder RNA sowie dem besonders heiklen anschließenden Neutralisationsschritt liegt.

Der Aufbau eines denkbaren Schnelltestsystems ist exemplarisch in Fig. 1 dargestellt. Die Anordnung besteht aus den Bestandteilen Küvette 1, Kappe 2, Probenstab 3, Verschlußkappe 4 und Membran 5.

Der Test läuft in der folgenden Weise ab. Zunächst wird das zu testende Medium (im folgenden auch als Probe bezeichnet) mit dem Probenstab 1 aufgenommen und mit der Verschlußkappe 4 in die Küvette 1 ein­ gesteckt. In der Küvette befindet sich eine Extrak­ tionslösung 6, die auf die Probe einwirkt. Nach Ab­ lauf einer definierten Zeitspanne für die Extraktion wird mit dem Probenstab 3 die Membran 5 durch­ stochen, so daß der Reaktions- bzw. Nachweisstoff 7 für die Signalerzeugung freigesetzt wird. Das Nach­ weissignal wird mit einer nicht dargestellten Signal­ erfassungseinrichtung detektiert.

Aufgrund der kritischen Anwendungsbereiche mancher Testsysteme geht die Entwicklung in Richtung einer Er­ höhung der Zuverlässigkeit der Schnelltests. Bei den bisherigen Bemühungen lag hierbei der Schwerpunkt auf der biochemischen Seite, insbesondere bei der Verbesse­ rung der Neutralisation der jeweiligen Extraktions­ lösung zur Vermeidung von Fehlmessungen.

Allerdings birgt auch der prinzipielle Aufbau der bekannten Testsysteme je nach Verwendung und Test­ prinzip Unsicherheiten. Dies liegt an der Problematik einer doppelt-negativen Logik, die diese Testsysteme in sich tragen.

Ein Beispiel hierfür ist der Nachweis der An­ wesenheit von biologischen Elementen als Indiz für eine biologische Verunreinigung einer Anlage, wenn das bio­ logische Material bzw. das in ihm gebundene ATP als Energieträger für die Nachweisreaktion verwendet wird. Bei diesem Testverfahren wird sowohl in dem gewünschten und damit wahrscheinlicheren Fall des Vorliegens keiner Verunreinigung und somit keines biologischen Energie­ trägers als auch im Fall eines nicht mehr funktions­ fähigen Schnelltests kein Signal erzeugt. In letzterem Fall kann daher eine vorhandene Verunreinigung nicht erkannt werden. Dieser Versagensfall des Testes kann z. B. bei einer Getränkeabfüllanlage zu katastrophalen Folgen führen.

Aus einer Vielzahl von Druckschriften ist die Verwendung von Referenzstoffen zur Kalibrierung einer Meßeinrichtung bekannt, so beispielsweise aus der GB 2 288 232 A, die ein Verfahren und einen Kit zum Kalibrieren einer ATP-Biolumineszenz-Prüfeinheit offenbart. Aus dieser Druckschrift ist es bekannt, dem Nachweisstoff unmittelbar nach Durchführung des Nachweises an einer Probe eine bekannte Menge an ATP beizugeben. Aus einem Vergleich des hierbei erzeugten Luminenszenzsignals mit dem beim Nachweis erhaltenen Luminenszenzsignal kann ein quantitativer Wert für den ATP-Gehalt der Probe abgeleitet werden.

In der WO 91/19196 A1 ist ein Testkit beschrieben, bei dem eine Referenzstoffmenge getrennt vom Nachweissystem in einem abgeschlossenen Volumen gelagert wird. Der Testkit umfasst zwei voneinander getrennte Testbereiche, einen für die Nachweisreaktion, den anderen für eine parallele Kalibrierungsmessung mit der Referenzstoffmenge.

Die WO 86/03589 A1, EP 0093613 A1, EP 0314293 A2, EP 0253464 A1, DE 69 22 0557 T2 zeigen weitere Anordnungen, bei denen eine von einer Testfläche getrennte Referenz­ fläche zur Kalibrierung vorgesehen ist. Die vorge­ stellten Systeme dienen allerdings lediglich zur Kalibrierung der eingesetzten Sensoren, wobei kein Kontakt zwischen einer Referenzstoffmenge und dem Nachweissystem erfolgt.

Keine der Druckschriften beschäftigt sich jedoch mit dem obigen Problem eines möglichen Versagens von Schnelltests.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Anordnung zum Nachweis eines mikrobiologischen Stoffes anzugeben, mit der die Zuverlässigkeit des Nachweises erhöht werden kann.

Die Aufgabe wird durch eine Anordnung mit den Merkmalen des Patentanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unter­ ansprüche.

Die erfindungsgemäße Anordnung ist besonders als Testkit für Schnelltests geeignet. Sie besteht aus einem Träger, beispielsweise einem Behältnis in Form einer Küvette, zum Einbringen der Probe, einer Probenaufnahmeeinrichtung zum Aufnehmen und Abgeben der Probe sowie einem im Träger angeordneten Nachweis­ system, das bei Kontakt mit dem nachzuweisenden Stoff ein Signal erzeugt. Weiterhin beinhaltet die Anordnung eine Referenzstoffmenge des nachzuweisenden oder eines vergleichbaren Stoffes, die getrennt vom Nachweissystem in einem abgeschlossenen Volumen, vorzugsweise am Behältnis oder an der Probenaufnahmeeinrichtung, so lagert, daß sie bei Nichterzeugung eines Signals mit dem Nachweissystem in Kontakt gebracht werden kann. Der Träger ist ein Behältnis, das durch eine Membran in einen unteren und in einen oberen Abschnitt geteilt ist, wobei das Nachweissystem im unteren Abschnitt vorliegt. Der obere Abschnitt des Behältnisses enthält ein Extraktionsmittel zur Extraktion des nachzu­ weisenden Stoffes aus der Probe.

Bei dem mit dieser Anordnung durchführbaren Verfahren zum Nachweis von Stoffen wird die Probe mit einem Nachweissystem in Kontakt gebracht, das bei Vorliegen einer bestimmten (geringen) Menge des Stoffes in der Probe ein Signal erzeugt. Als Nachweissysteme können hierbei selbstverständlich neben bereits vorgestellten Nachweisstoffen in Form von Lösungen oder löslichen Feststoffen auch elektronische Nachweissysteme, beispielsweise aus der Gruppe der CHEMFETs (chemisch sensitive Feldeffekttransistoren), eingesetzt werden. Das erzeugte Signal kann eine Vielzahl von Erschei­ nungsformen haben, wie beispielsweise optische Emissio­ nen oder Veränderungen (z. B. Farbwechsel), elektroni­ sche Spannungen, Temperaturänderungen u. s. w. Bei Ausbleiben eines Signals nach Durchführung der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrensschritte wird eine Referenzstoffmenge des nachzuweisenden oder eines vergleichbaren Stoffes mit dem Nachweissystem in Kontakt gebracht, um die Funktionsfähigkeit des Nachweissystems zu verifizieren. Unter Referenzstoff­ menge ist hierbei eine Menge des nachzuweisenden Stoffes zu verstehen, die ausreicht, um bei Kontakt mit dem Nachweissystem ein Nachweissignal (als Referenz­ signal) hervorzurufen. Alternativ kann anstelle des nachzuweisenden Stoffes ein vergleichbarer Stoff eingesetzt werden, der bei Funktionsfähigkeit des Nachweissystems ein entsprechendes Nachweissignal hervorruft.

Die Anordnung ergänzt somit die ein­ leitend beschriebenen und vergleichbare bekannte Tests um ein Referenzsignal zum Nachweis der Funktionsfähig­ keit des Tests. Dieses Referenzsignal wird durch die Freisetzung einer ausreichenden Menge des nachzuweisen­ den Stoffes, beispielsweise des biologischen Energie­ trägers für die Nachweisreaktion, erzeugt. Dies erfolgt im Anschluß an den auf herkömmliche Weise durchgeführ­ ten Test für den Fall, daß dieser kein Signal geliefert hat.

Durch die Verwendung der Anordnung wird somit ein unbemerktes Versagen des einzelnen Testkits ausgeschlossen und eine hohe Nachweissicherheit er­ reicht.

Bei Einsatz einer solchen Anordnung in Form eines lagerfähigen Testkits für den Handel, muß die hier genannte ausreichende Menge des nachzuweisenden Stoffes als Überschußmenge definiert werden, die ledig­ lich bis zum Ablauf des Verfalldatums ein ausreichendes Signal erzeugen muß. Dieses Signal muß allerdings nicht für Kalibrierungszwecke sondern nur zum Funktionsnach­ weis geeignet sein.

Mit der Anordnung ist durch die Erzeugung des Referenzsignals die Sicherstellung der Funktionsfähigkeit von Testsystemen gewährleistet. Die erfindungsgemäße Anordnung wird insbesondere der Forderung nach möglichst wenigen Verfahrensschritten sowie einer einfachen, auch für Laien geeigneten Bedienung gerecht, wie sie speziell an Schnelltest­ systeme gestellt wird.

Gerade bei Testsystemen, die vor der Benutzung über größere Zeitspannen gelagert werden, wird die Größe der Referenzstoffmenge so gewählt, daß sie bei Ablauf einer vorbestimmten Zeitperiode der regelmäßigen Funktionsfähigkeit des Nachweissystems, d. h. bei Ablauf des Verfalldatums, noch ausreicht, um ein Nach­ weissignal auszulösen.

Die Anordnung wird nachfolgend anhand von Ausfüh­ rungsbeispielen in Verbindung mit den Figuren näher erläutert. Hierbei zeigen:

Fig. 1 ein Beispiel für einen denkbaren Aufbau eines Testkits;

Fig. 2 schematisch ein erstes Ausführungsbeispiel einer Anordnung;

Fig. 3 schematisch ein zweites Ausführungsbeispiel einer Anordnung; und

Fig. 4 schematisch ein drittes Ausführungsbeispiel einer Anordnung.

Für die Erzeugung des Referenzsignals sind mehrere technische Lösungsmöglichkeiten geeignet, von denen nachfolgend drei als Beispiele skizziert werden. Allen technischen Lösungen sind die folgenden prinzipiellen Schritte gemeinsam.

Zunächst werden die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrensschritte des jeweiligen Tests durchgeführt. Erzeugt das Nachweissystem ein Signal, so ist das Testsystem funktionsfähig. Erzeugt das Nach­ weissystem kein Signal, so ist ein Referenzsignal notwendig. Zur Überprüfung der Funktionsweise des Testsystems in letzterem Fall wird daher ein Referenz­ signal erzeugt. Dies erfolgt durch Freisetzen einer ausreichend Menge des nachzuweisenden Stoffes im Testsystem direkt, so daß ein unmittelbarer Kontakt bzw. eine Vermischung mit dem Nachweissystem bzw. dem signalerzeugenden Medium entsteht. Wenn hierbei ein Signal erzeugt wird, so ist das Testsystem funktions­ fähig und der im ersten Verfahrensschritt gesuchte bzw. nachzuweisende Stoff ist definitiv nicht vorhanden. Wenn allerdings kein Signal erzeugt wird, so ist das Testsystem nicht funktionsfähig und der Test muß mit einem neuen Testkit wiederholt werden (100% - Qualitätsüberprüfung).

Fig. 2 zeigt schematisch ein erstes Ausführungs­ beispiel einer Anordnung (im folgen­ den auch als Testkit bezeichnet), das eine technische Realisierung zur Freisetzung der Referenzmenge des nachzuweisenden Stoffes (Referenzstoff 8) vorstellt.

Bei dieser und den folgenden Figuren wurden je­ weils gleiche Bezugszeichen für die gleichen Elemente wie bei der Anordnung der Fig. 1 verwendet. Ebenso wird die in Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebene Verfahrensabfolge einschließlich des Schrittes der Frei­ setzung des Nachweisstoffes auch beim Einsatz der nach­ folgend dargestellten Anordnungen durchgeführt.

Der Testkit bestehend aus einer Küvette 1 als Behältnis, dem Probenstab 3 und dem Nachweisstoff 7 enthält gekapselt den Referenzstoff 8. Der Bediener des Testsystems entnimmt den Testkit nach einem erfolg­ ten Meßvorgang ohne Signalentstehung aus der (nicht dargestellten) Signalmeßeinrichtung, setzt den Refe­ renzstoff frei und bringt den Testkit wieder in die Signalmeßeinrichtung ein. Das Freisetzen kann zum Bei­ spiel durch das "Aufquetschen" einer am Probenstab (siehe Fig. 2) oder an der Innenwandung der Küvette vorgesehenen Kapsel erfolgen. Dies kann entweder durch das Einwirken einer Kraft über die (beispielsweise elastische) Küvette 1 oder ein "Ausdrücken" an der durchbrochenen Membran 5 erfolgen.

Ein Beispiel für eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Anordnung zeigt Fig. 3. Analog zum ersten Ausführungsbeispiel ist auch hier der Referenz­ stoff 10 in den Testkit integriert. Die Freisetzung des Referenzstoffes im Anschluß an den durchgeführten Test erfolgt durch mechanische Einwirkung, welche sich auch einfach automatisieren läßt. Fig. 3 zeigt hierbei ein Beispiel der Integration in einen Hohlraum des Pro­ benstabes 3 oberhalb einer speziell vorgesehenen Sollbruchstelle 9. Die Freisetzung des Referenzstof­ fes 10 erfolgt durch einen mechanisch induzierten Bruch dieser Sollbruchstelle 9, wodurch der Referenz­ stoff mit dem Nachweisstoff 7 in Kontakt treten kann.

Auch hier sind neben der dargestellten zahlreiche weitere Ausführungsvarianten möglich, die der Fachmann aus der dargestellten Anordnung ableiten kann.

Eine dritte Ausführungsform der Anordnung basiert auf einer Speicherung bzw. Lagerung des Referenzstoffes in oder bei einer Signal­ meßeinrichtung zur Erfassung des Nachweissignals. Die Signalmeßeinrichtung wird nicht nach jeder Messung ersetzt, wie dies beim Testkit der Fall ist, und eignet sich daher für die Lagerung einer größeren Menge des Referenzstoffes.

Bei dieser Ausführungsform weist die Küvette 1, wie in Fig. 4 dargestellt, eine Membran oder eine ver­ dünnte Stelle 11 auf. Der Referenzstoff 10 wird nach erfolgter Durchführung der herkömmlichen Test­ schritte von außen in den Testkit eingebracht. Dies kann z. B. mit Hilfe einer Spritze 12 erfolgen, die durch die Membran oder verdünnte Stelle 11 in die Küvette 1 eindringen kann.

Bei dieser Ausführungsform ist die Lagerung des Referenzstoffes von den Testkits entkoppelt. Dies ist vor allem dann zu bevorzugen, wenn der Referenzstoff von den restlichen (chemischen oder biochemischen) Komponenten im Testsystem abweichende Haltbarkeits­ zeiten aufweist, seine Lagerung kritischer, die Kapse­ lung im System schwierig oder der Stoff verhältnismäßig teuer ist.

Die Anordnung kann bei Schnelltestsystemen, z. B. bei einem Testkit mit der Bezeichnung "HY-LITE®-Pen" der Firma Merck für Hygienemonitoring in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden. In diesem Bereich ist durch die zunehmend kritischeren Verbrau­ cher und eine Vielzahl an Lebensmittelskandalen (z. B.: BSE) eine starke Verschärfung der Gesetze und Kontrol­ len zu verzeichnen, welche auch in Zukunft mit Sicher­ heit anhalten wird. Diesen Anforderungen wird ein erfindungsgemäß um das beschriebene Referenzsignal erweitertes Testsystem gerecht.

Gegenüber bekannten Testsystemen wird mit der erfindungsgemäßen Anordnung eine 100% Qualitäts­ sicherung durch den individuellen Funktionsnachweis jedes einzelnen Testkits erreicht. Die Erfindung läßt sich durch eine einfache Integration der zusätzlichen Referenzfunktion in bestehende Testsysteme realisieren. Es sind also beispielsweise keine neuen Signal­ erfassungseinrichtungen erforderlich. Bei der Zugabe des Referenzstoffes handelt es sich zudem um einen unkritischen Verfahrensschritt in der Mengenhandhabung, da eine Überdosierung des Referenzstoffes in den bekannten Verfahren zulässig ist.

Claims (10)

1. Anordnung zum schnellen Nachweis von mikro­ biologischen oder biochemischen Stoffen, mit

• - einem Träger (1) zum Einbringen einer Probe;
• - einer Probenaufnahmeeinrichtung (3) zum Aufneh­ men und Abgeben der Probe;
• - einem in dem Träger (1) vorliegenden Nachweis­ system (7), das bei Kontakt mit dem nachzuweisen­ den Stoff ein Signal erzeugt; und
• - einer Referenzstoffmenge (8, 10) des nachzu­ weisenden oder eines vergleichbaren Stoffes, die getrennt vom Nachweissystem (7) in einem abgeschlossenen Volumen so lagert, daß sie bei Nichterzeugung eines Signals mit dem Nachweis­ system (7) im Träger (1) in Kontakt gebracht werden kann,

wobei der Träger (1) ein Behältnis ist, das durch eine Membran (5) in einen unteren und in einen oberen Abschnitt geteilt ist, wobei das Nachweis­ system (7) im unteren Abschnitt des Behältnisses angeordnet ist, und wobei der obere Abschnitt des Behältnisses (1) ein Extraktionsmittel (6) zur Extraktion des nachzuweisenden Stoffes aus der Probe enthält.

2. Anordnung nach Anspruch 1, wobei das abgeschlossene Volumen für die Referenzstoffmenge (8, 10) am Träger (1) oder an der Probenaufnahmeeinrichtung (3) angeordnet ist.

3. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Referenzstoffmenge (8, 10) so gewählt ist, daß sie bei Ablauf einer vorbestimmten Zeitperiode der regelmäßigen Funktionsfähigkeit des Nachweissystems noch ausreicht, um ein Nachweissignal auszulösen.

4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probenaufnahmeeinrichtung (3) eine pipettenförmige Gestalt aufweist.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nachweissystem (7) ein Nachweisstoff ist, der eine Reaktion mit dem nachzuweisenden Stoff der Probe eingeht.

6. Anordnung nach Anspruch 5, wobei der Nachweisstoff (7) eine Luciferin/­ Luciferasereaktion auslöst.

7. Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das abgeschlossene Volumen in der Probenaufnahmeeinrichtung (3) angeordnet ist, wobei die Probenaufnahmeeinrichtung (3) eine Soll­ bruchstelle (9) aufweist, bei deren Bruch der Referenzstoff (10) entweicht.

8. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das abgeschlossene Volumen eine Kapsel ist, die durch äußere Krafteinwirkung geöffnet bzw. ausgedrückt werden kann.

9. Anordnung nach Anspruch 1, wobei am Träger (1) ein dünnwandiger Bereich (11) ausgebildet ist, über den die Referenzstoffmenge (8, 10) mit dem Nachweissystem in Kontakt gebracht werden kann.

10. Anordnung nach Anspruch 9, wobei der dünnwandige Bereich (11) durch eine Membran gebildet ist.