JPH0523192A - Ｌ−アラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−アラニンの製造方法Info
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- JPH0523192A JPH0523192A JP3203842A JP20384291A JPH0523192A JP H0523192 A JPH0523192 A JP H0523192A JP 3203842 A JP3203842 A JP 3203842A JP 20384291 A JP20384291 A JP 20384291A JP H0523192 A JPH0523192 A JP H0523192A
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- dehydrogenase
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｌ−アラニンを高収率で効率よく製造する
方法を提供する。 【構成】 アラニン脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素、ＮＡＤ及びアンモニウム塩の存在下、Ｌ−リンゴ酸
からＬ−アラニンを合成する。
方法を提供する。 【構成】 アラニン脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素、ＮＡＤ及びアンモニウム塩の存在下、Ｌ−リンゴ酸
からＬ−アラニンを合成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬用等に有用なＬ−
アラニンの製造方法に関するものである。
アラニンの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来よりＬ−アラニンの酵素合成法とし
ては２つの方法が報告されている。１つは、フマール酸
を原料としてアスパルターゼとアスパラギン酸脱炭酸酵
素を用いる方法が知られている。もう１つは、アミノ酸
脱水素酵素を利用する方法としてＤ．Ｌ−乳酸を原料と
してＤ．Ｌ−乳酸脱水素酵素とアラニン脱水素酵素の共
役反応系を用いる方法が知られている。前者はＬ−アラ
ニンの工業生産に実際に利用されている。ここでいうア
ラニン脱水素酵素とは酵素番号Ｅ．Ｃ．１．４．１．１
であり、系統名Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ：ＮＡＤ+ ｏｘｉｄ
ｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｄｅａｍｉｎａｔｉｎｇ）のこ
とであり、リンゴ酸脱水素酵素とは酵素番号Ｅ．Ｃ．
１．１．１．３８．３９であり、系統名Ｌ−Ｍａｌａｔ
ｅ：ＮＡＤ+ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｄｅｃａ
ｒｂｏｘｙｌａｔｉｎｇ）のことである。
ては２つの方法が報告されている。１つは、フマール酸
を原料としてアスパルターゼとアスパラギン酸脱炭酸酵
素を用いる方法が知られている。もう１つは、アミノ酸
脱水素酵素を利用する方法としてＤ．Ｌ−乳酸を原料と
してＤ．Ｌ−乳酸脱水素酵素とアラニン脱水素酵素の共
役反応系を用いる方法が知られている。前者はＬ−アラ
ニンの工業生産に実際に利用されている。ここでいうア
ラニン脱水素酵素とは酵素番号Ｅ．Ｃ．１．４．１．１
であり、系統名Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ：ＮＡＤ+ ｏｘｉｄ
ｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｄｅａｍｉｎａｔｉｎｇ）のこ
とであり、リンゴ酸脱水素酵素とは酵素番号Ｅ．Ｃ．
１．１．１．３８．３９であり、系統名Ｌ−Ｍａｌａｔ
ｅ：ＮＡＤ+ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｄｅｃａ
ｒｂｏｘｙｌａｔｉｎｇ）のことである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法は異なる微
生物から抽出され、精製された２及び３種の異なる酵素
を利用しており、製造コストがかかるうえに酵素反応速
度的に共役反応に難があった。また、常温製細菌由来の
酵素を利用してる関係で安定性に問題があり、アラニン
生成速度が遅いとか、酵素量が多く必要であるなどの点
で問題があった。
生物から抽出され、精製された２及び３種の異なる酵素
を利用しており、製造コストがかかるうえに酵素反応速
度的に共役反応に難があった。また、常温製細菌由来の
酵素を利用してる関係で安定性に問題があり、アラニン
生成速度が遅いとか、酵素量が多く必要であるなどの点
で問題があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点を解決すべく、好熱菌を対象に広くアラニン合成系
酵素を検索した。本発明者は、好熱菌放線菌サーモアク
チノマイセス属ブルガリスＩＦＯ１３６０６（Ｔｈｅｒ
ｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｌｉｓ ＩＦ
Ｏ１３６０６）にリンゴ酸脱水素酵素とアラニン脱水素
酵素の高い活性を見い出した。この両酵素の共役反応を
利用して、Ｌ−リンゴ酸からＬ−アラニンを高収率で合
成することが可能であることを確認した。
題点を解決すべく、好熱菌を対象に広くアラニン合成系
酵素を検索した。本発明者は、好熱菌放線菌サーモアク
チノマイセス属ブルガリスＩＦＯ１３６０６（Ｔｈｅｒ
ｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｌｉｓ ＩＦ
Ｏ１３６０６）にリンゴ酸脱水素酵素とアラニン脱水素
酵素の高い活性を見い出した。この両酵素の共役反応を
利用して、Ｌ−リンゴ酸からＬ−アラニンを高収率で合
成することが可能であることを確認した。
【０００５】本発明の要旨は、アラニン脱水素酵素、リ
ンゴ酸脱水素酵素、ＮＡＤ及びアンモニウム塩の存在
下、Ｌ−リンゴ酸からＬ−アラニンを合成することを特
徴とするＬ−アラニンの製造方法に存する。
ンゴ酸脱水素酵素、ＮＡＤ及びアンモニウム塩の存在
下、Ｌ−リンゴ酸からＬ−アラニンを合成することを特
徴とするＬ−アラニンの製造方法に存する。
【０００６】アラニン脱水素酵素及びリンゴ酸脱水素酵
素の調製法としては、一般に知られる酵素の培養生産方
法、抽出、精製方法が利用出来る。酵素の培養生産方法
について説明する。サーモアクチノマイセスブルガリス
ＩＦＯ１３６０６株を普通寒天培地上で１〜２日生育さ
せたスラントを種菌として利用する。酵素生産培地とし
ては、Ｃ源としてグリセリン、有機酸類、グルコース、
庶糖などの糖類、天然物のポリペプトン、デンプンを利
用し、又、Ｎ源としてリジン、アルギニン、オルニチ
ン、チロシンなどのアミノ酸類、天然物の肉エキス、酵
母エキス、コーン・スティープ・リカーなどを利用す
る。無機類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどが必要で
ある。上記の様な成分を検討し、酵素生産に最も適した
組成を明らかにする。さらにｐＨや培養温度、通気量、
撹拌条件などの要因を加え、最適条件を明らかにする。
ｐＨは６〜９の中性付近、培養温度は３５℃〜５５℃が
好ましい。両酵素の遺伝子を取り出し、適当なベクター
に連結させ、大腸菌や枯草菌の宿主にクローニングさ
せ、強力な発現系を構築することにより、より高い生産
性を得ることを検討することは言うに及ばない。
素の調製法としては、一般に知られる酵素の培養生産方
法、抽出、精製方法が利用出来る。酵素の培養生産方法
について説明する。サーモアクチノマイセスブルガリス
ＩＦＯ１３６０６株を普通寒天培地上で１〜２日生育さ
せたスラントを種菌として利用する。酵素生産培地とし
ては、Ｃ源としてグリセリン、有機酸類、グルコース、
庶糖などの糖類、天然物のポリペプトン、デンプンを利
用し、又、Ｎ源としてリジン、アルギニン、オルニチ
ン、チロシンなどのアミノ酸類、天然物の肉エキス、酵
母エキス、コーン・スティープ・リカーなどを利用す
る。無機類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどが必要で
ある。上記の様な成分を検討し、酵素生産に最も適した
組成を明らかにする。さらにｐＨや培養温度、通気量、
撹拌条件などの要因を加え、最適条件を明らかにする。
ｐＨは６〜９の中性付近、培養温度は３５℃〜５５℃が
好ましい。両酵素の遺伝子を取り出し、適当なベクター
に連結させ、大腸菌や枯草菌の宿主にクローニングさ
せ、強力な発現系を構築することにより、より高い生産
性を得ることを検討することは言うに及ばない。
【０００７】次に、抽出、精製方法について説明する。
培養終了後、遠心分離法や凝集沈澱法などにより、菌体
を集める。洗菌後、超音波破砕法、リゾチーム界面活性
剤などの細胞壁溶解法、ガラスビーズ破砕法、フレンチ
プレス法などにより菌体から酵素を抽出する。抽出した
酵素液を粗酵素液として合成反応に利用する。またイオ
ン交換樹脂、塩析分画、有機溶媒沈澱レッドセファロー
スなどのアフィニティクロマトグラフィーなどで部分精
製した酵素液も利用できる。酵素の安定化剤として、ユ
ーメルカプトエタノールなどの酸化防止剤を加える。
培養終了後、遠心分離法や凝集沈澱法などにより、菌体
を集める。洗菌後、超音波破砕法、リゾチーム界面活性
剤などの細胞壁溶解法、ガラスビーズ破砕法、フレンチ
プレス法などにより菌体から酵素を抽出する。抽出した
酵素液を粗酵素液として合成反応に利用する。またイオ
ン交換樹脂、塩析分画、有機溶媒沈澱レッドセファロー
スなどのアフィニティクロマトグラフィーなどで部分精
製した酵素液も利用できる。酵素の安定化剤として、ユ
ーメルカプトエタノールなどの酸化防止剤を加える。
【０００８】（酵素活性の測定）酵素活性は３４０ｎｍ
に吸収極大をもつＮＡＤＨの反応に伴う増減を分光学的
に定量することにより測定する。リンゴ酸脱水素酵素活
性においてはＮＡＤＨの増加を、アラニン脱水素酵素活
性においてはＮＡＤＨの減少を分光光度計により経時的
に測定する。測定における反応液組成はそれぞれ次の通
りである。 リンゴ酸脱水素酵素用反応液組成 ０．２Ｍ グリシン−ＫＯＨ 緩衡液（ｐＨ９．５）、
０．０２５ｍＭ Ｌ−リンゴ酸、１．２５ｍＭ ＮＡＤ
+ 、酵素、反応液１ｍｌ。 アラニン脱水素酵素用反応液組成 ０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ 緩衡液（ｐＨ８．０）、
０．２Ｍ ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ ピルビン酸、０．１
ｍＭ ＮＡＤＨ、酵素、反応液１ｍｌ。 酵素反応は反応液を３７℃で約５分間インキュベート
し、基質（Ｌ−リンゴ酸又はピルビン酸）を加えて開始
する。リンゴ酸脱水素酵素活性量は、１μｍｏｌ／ｍｉ
ｎのＮＡＤＨを生成する触媒量を、又、アラニン脱水素
酵素活性量は１μｍｏｌ／ｍｉｎのＮＡＤＨを消費する
触媒量をそれぞれ１単位と定義した。
に吸収極大をもつＮＡＤＨの反応に伴う増減を分光学的
に定量することにより測定する。リンゴ酸脱水素酵素活
性においてはＮＡＤＨの増加を、アラニン脱水素酵素活
性においてはＮＡＤＨの減少を分光光度計により経時的
に測定する。測定における反応液組成はそれぞれ次の通
りである。 リンゴ酸脱水素酵素用反応液組成 ０．２Ｍ グリシン−ＫＯＨ 緩衡液（ｐＨ９．５）、
０．０２５ｍＭ Ｌ−リンゴ酸、１．２５ｍＭ ＮＡＤ
+ 、酵素、反応液１ｍｌ。 アラニン脱水素酵素用反応液組成 ０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ 緩衡液（ｐＨ８．０）、
０．２Ｍ ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ ピルビン酸、０．１
ｍＭ ＮＡＤＨ、酵素、反応液１ｍｌ。 酵素反応は反応液を３７℃で約５分間インキュベート
し、基質（Ｌ−リンゴ酸又はピルビン酸）を加えて開始
する。リンゴ酸脱水素酵素活性量は、１μｍｏｌ／ｍｉ
ｎのＮＡＤＨを生成する触媒量を、又、アラニン脱水素
酵素活性量は１μｍｏｌ／ｍｉｎのＮＡＤＨを消費する
触媒量をそれぞれ１単位と定義した。
【０００９】（蛋白質の定量法）カルブらの方法（Ｋａ
ｌｂ．Ｖ．Ｆ．Ｊｒ．ａｎｄ Ｂｅｒｎｉｏｈｒ．Ｒ．
Ｗ（１９７７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２，３６
２−３７１）により次の式より算出した。 蛋白質濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝（Ａ２３０×１８３−Ａ２
６０×７５．８）×１０-3×希釈率、Ａ２３０、Ａ２６
０は紫外部２３０ｎｍ、２６０ｎｍのそれぞれの吸光度
を示す。
ｌｂ．Ｖ．Ｆ．Ｊｒ．ａｎｄ Ｂｅｒｎｉｏｈｒ．Ｒ．
Ｗ（１９７７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２，３６
２−３７１）により次の式より算出した。 蛋白質濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝（Ａ２３０×１８３−Ａ２
６０×７５．８）×１０-3×希釈率、Ａ２３０、Ａ２６
０は紫外部２３０ｎｍ、２６０ｎｍのそれぞれの吸光度
を示す。
【００１０】（Ｌ−アラニンの合成）本発明は、アラニ
ン脱水素酵素のアミノ基受容体（ピルビン酸）と補酵素
ＮＡＤＨの電子供与体の基質としてリンゴ酸を用い、化
１に示す２つの酵素反応系を利用するものである。
ン脱水素酵素のアミノ基受容体（ピルビン酸）と補酵素
ＮＡＤＨの電子供与体の基質としてリンゴ酸を用い、化
１に示す２つの酵素反応系を利用するものである。
【化１】
本発明において、アラニン脱水素酵素及びリンゴ酸脱水
素酵素を含有する酵素液、ＮＡＤ溶液、Ｌ−リンゴ酸溶
液及びアンモニウム塩溶液を反応液とし、これを反応さ
せることによって、Ｌ−アラニンが得られる。なお、ア
ンモニウム塩としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム等を使用することができる。また、必須の成分では
ないがフッ素ピルビン酸溶液を加えるとＬ−アラニンの
生産量が向上し、好ましい。反応液の濃度は特に限定さ
れるものではないが、ＮＡＤ溶液は通常１〜２ｍＭ、Ｌ
−リンゴ酸溶液は通常０．４Ｍ〜１Ｍ、アンモニウム塩
溶液は通常０．５〜１．０Ｍ、フッ素ピルビン酸溶液は
通常１ｍＭ〜１０ｍＭ、反応温度は通常３７〜５５℃、
好ましくは５０℃である。反応時間は通常２４〜４８時
間、好ましくは２４時間である。
素酵素を含有する酵素液、ＮＡＤ溶液、Ｌ−リンゴ酸溶
液及びアンモニウム塩溶液を反応液とし、これを反応さ
せることによって、Ｌ−アラニンが得られる。なお、ア
ンモニウム塩としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム等を使用することができる。また、必須の成分では
ないがフッ素ピルビン酸溶液を加えるとＬ−アラニンの
生産量が向上し、好ましい。反応液の濃度は特に限定さ
れるものではないが、ＮＡＤ溶液は通常１〜２ｍＭ、Ｌ
−リンゴ酸溶液は通常０．４Ｍ〜１Ｍ、アンモニウム塩
溶液は通常０．５〜１．０Ｍ、フッ素ピルビン酸溶液は
通常１ｍＭ〜１０ｍＭ、反応温度は通常３７〜５５℃、
好ましくは５０℃である。反応時間は通常２４〜４８時
間、好ましくは２４時間である。
【００１１】（生成物溶液中のアラニンの光学異性体の
同定）得られた生成物溶液を調製済みのＤｏｗｅｘ５０
Ｘ−８のカラム（１ｃｍ×２０ｃｍ）に通す。このカラ
ムをカラムの１０倍量ぐらいの蒸留水で洗い流し、次に
ＩＮ−ＮＨ4ＯＨ約８０ｍｌでアラニンを溶出させる。
フラクションコレクターで分画した液中のアラニンの検
出は、濾紙に分画液の１部を滴下後、ニンヒドリンで検
出する。濾紙にニンヒドリン溶液（ニンヒドリン０．２
ｇ、アセトン８０ｍｌ、エタノール２０ｍｌ）をかけ、
ドライヤーで熱し、赤紫色に変色した分画液をとる。こ
れをアラニン精製液とする。アラニン精製液の光学異性
体を分析するには、光学活性用分離ＨＰＬＣ（カラムは
ダイセル社製ＣＲＯＷＮＰＡＫ Ｒｅ（＋）、ポンプは
東ソーエクセレントポンプ、紫外可視分光光度検出器は
東ソーのＣＣＰＥ型ＵＶ−８０００（検出波長２００ｎ
ｍ、溶離流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液ｐＨ１．５過
塩素酸）を用いた。
同定）得られた生成物溶液を調製済みのＤｏｗｅｘ５０
Ｘ−８のカラム（１ｃｍ×２０ｃｍ）に通す。このカラ
ムをカラムの１０倍量ぐらいの蒸留水で洗い流し、次に
ＩＮ−ＮＨ4ＯＨ約８０ｍｌでアラニンを溶出させる。
フラクションコレクターで分画した液中のアラニンの検
出は、濾紙に分画液の１部を滴下後、ニンヒドリンで検
出する。濾紙にニンヒドリン溶液（ニンヒドリン０．２
ｇ、アセトン８０ｍｌ、エタノール２０ｍｌ）をかけ、
ドライヤーで熱し、赤紫色に変色した分画液をとる。こ
れをアラニン精製液とする。アラニン精製液の光学異性
体を分析するには、光学活性用分離ＨＰＬＣ（カラムは
ダイセル社製ＣＲＯＷＮＰＡＫ Ｒｅ（＋）、ポンプは
東ソーエクセレントポンプ、紫外可視分光光度検出器は
東ソーのＣＣＰＥ型ＵＶ−８０００（検出波長２００ｎ
ｍ、溶離流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液ｐＨ１．５過
塩素酸）を用いた。
【００１２】
参考例１
下記培地組成を用い、以下の培養を行い菌体を得た。ペ
プトン１５ｇ、酵母エキス２ｇ、肉エキス２ｇ、グリセ
リン２ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
０．０５ｇ、ＮＨ4 Ｃｌ２．５ｇ、Ｌ−オルニチン１．
０ｇ、Ｌ−チロシン０．４ｇを約８００ｍｌの水道水に
溶解し、ｐＨを３Ｎ−ＮａＯＨで７．２に調製したの
ち、水道水で１リットルにした。減菌はオートクレーブ
を用い、１２１℃、１５分間処理を行った。サーモアク
チノマイセス ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓｖｕｌｇａｒｉｓ）ＩＦＯ１３６０６の寒天
培地上の保存菌株を試験管に減菌した培養液１０ｍｌに
白金耳で植菌し、５０℃で一晩振盪培養を行い、前培養
液とした。前培養で増殖した菌を、２リットルの坂口フ
ラスコに減菌した培養液８００ｍｌに加え、５０℃で７
〜９時間震盪培養を行った。培養した菌を遠心分離（１
０，０００ｇ×１０分）で集菌し、これに０．８５％Ｎ
ａＣｌを加え、懸濁し、再び遠心分離（１０，０００ｇ
×１０分）して、洗菌を行った。洗菌した菌を０．０１
％２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衡液（ｐＨ７．２）約２０ｍｌに懸濁し、休止菌
体とした。
プトン１５ｇ、酵母エキス２ｇ、肉エキス２ｇ、グリセ
リン２ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
０．０５ｇ、ＮＨ4 Ｃｌ２．５ｇ、Ｌ−オルニチン１．
０ｇ、Ｌ−チロシン０．４ｇを約８００ｍｌの水道水に
溶解し、ｐＨを３Ｎ−ＮａＯＨで７．２に調製したの
ち、水道水で１リットルにした。減菌はオートクレーブ
を用い、１２１℃、１５分間処理を行った。サーモアク
チノマイセス ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓｖｕｌｇａｒｉｓ）ＩＦＯ１３６０６の寒天
培地上の保存菌株を試験管に減菌した培養液１０ｍｌに
白金耳で植菌し、５０℃で一晩振盪培養を行い、前培養
液とした。前培養で増殖した菌を、２リットルの坂口フ
ラスコに減菌した培養液８００ｍｌに加え、５０℃で７
〜９時間震盪培養を行った。培養した菌を遠心分離（１
０，０００ｇ×１０分）で集菌し、これに０．８５％Ｎ
ａＣｌを加え、懸濁し、再び遠心分離（１０，０００ｇ
×１０分）して、洗菌を行った。洗菌した菌を０．０１
％２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衡液（ｐＨ７．２）約２０ｍｌに懸濁し、休止菌
体とした。
【００１３】参考例２
無細胞抽出液の調製は以下の通りに実施した。休止菌体
を氷冷し、１０℃以下に保ちながら超音波破砕機で断続
的に約２分間破砕した。これを遠心分離（１０，０００
×１０分）し、上澄みを無細胞抽出液として用いた。無
細胞抽出液中のリンゴ酸、脱水素酵素活性は、０．３９
ユニット（Ｕ）／ｍｇで、アラニン脱水素酵素活性は
９．９Ｕ／ｍｇであった。両酵素の酵素特性は次の通り
であった。
を氷冷し、１０℃以下に保ちながら超音波破砕機で断続
的に約２分間破砕した。これを遠心分離（１０，０００
×１０分）し、上澄みを無細胞抽出液として用いた。無
細胞抽出液中のリンゴ酸、脱水素酵素活性は、０．３９
ユニット（Ｕ）／ｍｇで、アラニン脱水素酵素活性は
９．９Ｕ／ｍｇであった。両酵素の酵素特性は次の通り
であった。
【００１４】参考例３
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素の
それぞれの基質に対するＫｍ値を求めた。Ｋｍ値の算出
は上述した酵素活性測定法に準じて行った。
それぞれの基質に対するＫｍ値を求めた。Ｋｍ値の算出
は上述した酵素活性測定法に準じて行った。
【表１】
【００１５】参考例４
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素の
熱安定性を検討した。残存活性は詳細な説明で記述した
酵素活性測定法に準じた。図１に示す様に、１０分間熱
処理後の残存活性を測定したところリンゴ酸脱水素酵素
は６０℃まで、アラニン脱水素酵素は７０℃まで安定で
あった。
熱安定性を検討した。残存活性は詳細な説明で記述した
酵素活性測定法に準じた。図１に示す様に、１０分間熱
処理後の残存活性を測定したところリンゴ酸脱水素酵素
は６０℃まで、アラニン脱水素酵素は７０℃まで安定で
あった。
【００１６】実施例１
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（１）温度による影響。 アラニン合成系反応液の組成は以下の通りで行った。 ３７℃、５０℃、６０℃で２４時間振盪し反応させた
のち、Ｌ−アラニンの生成量を比較したところ次の様な
結果が得られた。 温 度 （℃） ３７℃ ５０℃ ６０℃ Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ（％） ３０％ １００％ ８％ （％）は５０℃におけるＬ−Ａｌａｎｉｎｅの生成量に
対する割合を示す。
役系によるアラニンの合成（１）温度による影響。 アラニン合成系反応液の組成は以下の通りで行った。 ３７℃、５０℃、６０℃で２４時間振盪し反応させた
のち、Ｌ−アラニンの生成量を比較したところ次の様な
結果が得られた。 温 度 （℃） ３７℃ ５０℃ ６０℃ Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ（％） ３０％ １００％ ８％ （％）は５０℃におけるＬ−Ａｌａｎｉｎｅの生成量に
対する割合を示す。
【００１７】実施例２
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（２）反応時間による影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成を用い、５０℃でア
ラニン合成反応を行なった結果、図２に示す通り、約２
４時間でほぼ反応が終了することが判った。なお、無細
胞抽出液中の使用酵素量はリンゴ酸脱水素酵素は０．３
６Ｕ、アラニン脱水素酵素は４．５１Ｕを使用した。
役系によるアラニンの合成（２）反応時間による影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成を用い、５０℃でア
ラニン合成反応を行なった結果、図２に示す通り、約２
４時間でほぼ反応が終了することが判った。なお、無細
胞抽出液中の使用酵素量はリンゴ酸脱水素酵素は０．３
６Ｕ、アラニン脱水素酵素は４．５１Ｕを使用した。
【００１８】実施例３
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（３）ＮＡＤ+ の濃度による
影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、ＮＡＤ+ だ
けは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間アラニン
合成反応を行なった結果、図３に示す通りになった。約
１ｍＭのＮＡＤが必要であることが判った。なお、無細
胞抽出液中の使用酵素量はリンゴ酸脱水素酵素は０．６
１Ｕ、アラニン脱水素酵素は１５．４Ｕを使用した。
役系によるアラニンの合成（３）ＮＡＤ+ の濃度による
影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、ＮＡＤ+ だ
けは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間アラニン
合成反応を行なった結果、図３に示す通りになった。約
１ｍＭのＮＡＤが必要であることが判った。なお、無細
胞抽出液中の使用酵素量はリンゴ酸脱水素酵素は０．６
１Ｕ、アラニン脱水素酵素は１５．４Ｕを使用した。
【００１９】実施例４
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（４）ＮＨ4 Ｃｌの濃度の影
響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、ＮＨ4 Ｃｌ
だけは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間アラニ
ン合成反応を行なった結果、図４に示す通りになった。
約０．５ＭのＮＨ4 Ｃｌが必要であることが判った。な
お、無細胞抽出液中の使用酵素量はリンゴ酸脱水素酵素
は０．３９Ｕ、アラニン脱水素酵素は４．５２Ｕを使用
した。
役系によるアラニンの合成（４）ＮＨ4 Ｃｌの濃度の影
響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、ＮＨ4 Ｃｌ
だけは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間アラニ
ン合成反応を行なった結果、図４に示す通りになった。
約０．５ＭのＮＨ4 Ｃｌが必要であることが判った。な
お、無細胞抽出液中の使用酵素量はリンゴ酸脱水素酵素
は０．３９Ｕ、アラニン脱水素酵素は４．５２Ｕを使用
した。
【００２０】実施例５
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（５）ＮＡＤ+ 及び無細胞抽
出液の影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成を用い、５０℃で２
４時間反応させたのち、さらに２５ｍＭ ＮＡＤ+ 溶液
を０．０４ｍｌ追加し、５０℃で１６時間反応させたと
ころ、２８９ｍＭのアラニンが合成できた（収率７２
％）。同様に実施例１のアラニン合成反応液組成を用
い、５０℃で２４時間反応させたのち、さらに無細胞抽
出液を０．２１ｍｌ追加し、５０℃で１６時間反応させ
たところ、２６５ｍＭのアラニンが合成できた（収率６
６％）。又、実施例１のアラニン合成反応液組成を用
い、５０℃で２４時間反応させたのち、さらに２５ｍＭ
ＮＡＤ+ 溶液を０．０４ｍｌ及び無細胞抽出液を０．
２１ｍｌ追加し、５０℃で１６時間反応させたところ、
３５３ｍＭのアラニンが合成できた（収率８８％）。
役系によるアラニンの合成（５）ＮＡＤ+ 及び無細胞抽
出液の影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成を用い、５０℃で２
４時間反応させたのち、さらに２５ｍＭ ＮＡＤ+ 溶液
を０．０４ｍｌ追加し、５０℃で１６時間反応させたと
ころ、２８９ｍＭのアラニンが合成できた（収率７２
％）。同様に実施例１のアラニン合成反応液組成を用
い、５０℃で２４時間反応させたのち、さらに無細胞抽
出液を０．２１ｍｌ追加し、５０℃で１６時間反応させ
たところ、２６５ｍＭのアラニンが合成できた（収率６
６％）。又、実施例１のアラニン合成反応液組成を用
い、５０℃で２４時間反応させたのち、さらに２５ｍＭ
ＮＡＤ+ 溶液を０．０４ｍｌ及び無細胞抽出液を０．
２１ｍｌ追加し、５０℃で１６時間反応させたところ、
３５３ｍＭのアラニンが合成できた（収率８８％）。
【００２１】実施例６
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（６）基質Ｌ−リンゴ酸の影
響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、Ｌ−リンゴ
酸だけは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間反応
を行なった結果、図５に示すように２００ｍＭまでのリ
ンゴ酸濃度では１００％に近いモル収率でアラニンに変
換されることが判った。４００ｍＭでは、Ｌ−リンゴ酸
からは約８５％の収率で約３０ｇ／ｌのアラニンが生産
できることが判った。
役系によるアラニンの合成（６）基質Ｌ−リンゴ酸の影
響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、Ｌ−リンゴ
酸だけは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間反応
を行なった結果、図５に示すように２００ｍＭまでのリ
ンゴ酸濃度では１００％に近いモル収率でアラニンに変
換されることが判った。４００ｍＭでは、Ｌ−リンゴ酸
からは約８５％の収率で約３０ｇ／ｌのアラニンが生産
できることが判った。
【００２２】実施例７
リンゴ酸脱水素酵素及びアラニン脱水素酵素の両酵素共
役系によるアラニンの合成（７）フッ素ピルビン酸によ
る影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、フッ素ピル
ビン酸だけは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間
反応を行った結果、図６に示すようにフッ素ピルビン酸
を反応系に添加すると非存在下に比較して約２倍のアラ
ニンの生産性が増強することが判った。これはフッ素ピ
ルビン酸が基質のリンゴ酸やピルビン酸あるいは生成物
のアラニンの分解反応を行う混在酵素を阻害することに
起因しているものと推定される。
役系によるアラニンの合成（７）フッ素ピルビン酸によ
る影響。 実施例１のアラニン合成反応液組成（但し、フッ素ピル
ビン酸だけは各濃度に設定）を用い、５０℃で２４時間
反応を行った結果、図６に示すようにフッ素ピルビン酸
を反応系に添加すると非存在下に比較して約２倍のアラ
ニンの生産性が増強することが判った。これはフッ素ピ
ルビン酸が基質のリンゴ酸やピルビン酸あるいは生成物
のアラニンの分解反応を行う混在酵素を阻害することに
起因しているものと推定される。
【００２３】実施例８
生産されたアラニンの光学純度の判定
発明の詳細な説明で記述した方法により分析したとこ
ろ、図７に示すようにＤ−アラニンはみとめられず、Ｌ
−アラニンがほぼ１００％生産されていることが判っ
た。又、本粗酵素にはアラニンラセマーゼ活性は検出さ
れなかった。
ろ、図７に示すようにＤ−アラニンはみとめられず、Ｌ
−アラニンがほぼ１００％生産されていることが判っ
た。又、本粗酵素にはアラニンラセマーゼ活性は検出さ
れなかった。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アラニンを高収率
で効率よく製造することができる。
で効率よく製造することができる。
【図１】参考例５のアラニン脱水素酵素の熱安定性を示
す図
す図
【図２】実施例２の反応時間による影響を示す図
【図３】実施例３のＮＡＤ+ の影響を示す図
【図４】実施例４のＮＨ4 Ｃｌの影響を示す図
【図５】実施例６のＬ−リンゴ酸の影響を示す図
【図６】実施例７のフッ素ピルビン酸の影響を示す図
【図７】実施例８のアラニンの光学異性体の同定を示す
図
図
Claims (3)
- 【請求項１】 アラニン脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素、ＮＡＤ及びアンモニウム塩の存在下、Ｌ−リンゴ酸
からＬ−アラニンを合成することを特徴とするＬ−アラ
ニンの製造方法。 - 【請求項２】 アラニン脱水素酵素及びリンゴ酸脱水素
酵素が好熱性放線菌に由来する酵素である請求項１記載
のＬ−アラニンの製造方法。 - 【請求項３】 好熱性放線菌がサーモアクチノマイセス
属である請求項２記載のＬ−アラニンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3203842A JPH0523192A (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | Ｌ−アラニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3203842A JPH0523192A (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | Ｌ−アラニンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0523192A true JPH0523192A (ja) | 1993-02-02 |
Family
ID=16480606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3203842A Pending JPH0523192A (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | Ｌ−アラニンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0523192A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
-
1991
- 1991-07-18 JP JP3203842A patent/JPH0523192A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
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