JPH04502336A - 骨形成具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２１、上記骨コラーゲン粒子が１μｍから１００μｍの範囲の平均直径の穴また はくぼみを有する請求項１または１６に記載の発明。

２２、上記コラーゲン粒子が７０ｍｍから４２０ｍｍの範囲の平均直径を持つ請 求項１または１６に記載の発明。

２３、哺乳動物宿主細胞中において組換え体ＤＮＡから発現され、二量体を構成 する２つの酸化されたサブユニットかラヌリ、上記二量体がマトリックスととも に哺乳動物に移植されたときに骨あるいは軟骨の形成を誘発できるような第２図 （Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　７）の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と十 分な相同性を持つ上記サブユニットのアミノ酸配列からなる骨形成蛋白質。

２４、第８図において示された画分１２の成分が除去されてなる、脱イオン化さ れ、脱脂された、Ｔｙｐｅ　Ｉの不溶性骨コラーゲン粒子からなる、生体適合性 、」ｖｉｖｏにおいて生物的に分解されうる、哺乳動物における移植のためのマ トリックス。

明細書 骨形成具 ｘｌばＩ」眩囲胴 本出願は”骨形成具”という名称の米国特許出願第４２２．６９９号（１９８９ 年１０月１７日出ｉｉ）および°移植のための骨コラーゲンマトリックス１と１ １つ名称の米国特許出願第４８３．９１３号（１９９０年２月２２日出願）の一 部継続出願である。

兄朋Ω背景 本発明は骨形成具、哺乳動物において新しい骨の形成を誘導すること力（できる 蛋白質をコードする遺伝子、および組み換えＤＮＡ技術を用し）た哺乳動物にお Ｃするこれらの蛋白質の生産のための方法に関する。本発明はまた、同種移植あ る０は異種の移植に有用なマトリックス物質および哺乳動物にお１１て新し％Ｘ 骨の形成を誘導する骨形成蛋白質のキャリアーとして働くマトリックス物質、お よび骨形成具を使用する骨および軟骨の修復方法に関する。

哺乳動物の骨組織はおそらく成長および本来の骨の治療の間活性力（あり、軟骨 性骨の形成を引き起こす細胞の出来事の発生のカスケードを誘発しつる、ひとつ あるいは幾つかの蛋白様物質を含むことが知られてし）る。この活性因子Ｃま文 献の中で骨形態形成あるいは形態発生蛋白質、骨誘導蛋白質（ｂｏｎｅ　１ｎｄ ｕｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、骨形成蛋白質、オステオジエニン、あるいは 骨誘導蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）とさまざまに呼 ばれている。

骨の分化の発生のカスケードは開票細胞の漸増、始原細胞の増殖、軟骨のカルシ ウム沈着、血管の侵入、骨の形成、改造、および骨髄分化力・らなる（Ｒｅｄｄ ｉ（１９８１）ρ旦邦弘制２．＆狙、　１：２０９−２２６）。

これらの形質転換の基礎となる詳細な機構は明らかでなし）が、本来の骨マド１ ノックスの軟骨性骨への分化の活性が、十分な骨の誘導活性を回復させる不活性 な残存のコラーゲン様マトリックスにより分離的に抽出されそして再構成される （Ｓａｗｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８ニア５９９−７６０３）。

■黷bま罰 ｖｉｖｏにおいて蛋白質抽出物の軟骨性骨を誘導する活性を分析する実験方法を 提供する。哺乳動物の幾つかの種は種間の移植実験により証明されて（旭るよう な密接に関連した蛋白質を生産する（Ｓａｃｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ　（ １９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

鏑、腸別：６５９１−６５９５）。

これらの蛋白質の潜在的な利用性は広く理解されてきた。その蛋白質の有用性は 整形法の薬、ある種の形成外科、および歯根膜および脳顔面頭蓋の再生方法に大 変革をもたらすと予期されている。

これらの蛋白質画分の観察された特性は、骨形成に必須な純粋の因子を単離し同 定するために幾つかの研究室における精力的検索の努力を誘発してきた。哺乳動 物の骨からの骨形成蛋白質の精製技術の現在の状況はサン、＜ス（Ｓａｍｐａｔ ｈ）ら（１９８７）ヒ匹、唾、紅閃、ジ巨、男込別により開示された。ウリスト （Ｕｒｉｓｔ）ら（１９８４）■匹、　Ｓａｃ、　Ｅｇ、臥は、均似、　１７３ ：１９４−１９９は、塩化カルシウム−尿素無機−有機溶液混合物により脱イオ ン化された皮質性の骨から抽出され、そして塩酸グアニジンでの分別沈殿および 調製用ゲル電気泳動により回収されたヒト骨形成蛋白質画分を開示している。著 者はその蛋白質画分が酸性ポリペプチドからなるアミノ酸組成および１７−１８ 　ｋＤの範囲の分子量をもつことを報告している。

ウリスト（ｔｌｒｉｓｔ）ら（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８１：３７１−３７５は酸性ポリペプチドで約１８ｋ Ｄの分子量という特性をもつウシの骨形態形成蛋白質抽出物を開示している。著 者はその蛋白質がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離された画 分に存在し、マウス後く筋肉における骨の形成およびラットおよびイヌの頭蓋中 の管錘欠損における骨の再生を誘導することを報告した。骨からの抽出物を得る これらの方法は十分に限定されない不純な調製物を与える。

ヨーロッパ特許出願第１４８．１５５号（１９８５年１０月７日公開）はウシ、 ブタおよびヒトの系統に由来する骨形成蛋白質を開示することを目的としている 。発明者によりＰ３蛋白質と命名された２２−２４　ｋＤの分子量の蛋白質のう ちの一つが本質的に均質な状態に精製された事が示されている。この物質は哺乳 動物に移植されたとき、骨の形成を誘導すると報告されている。

ＰＣＴ出願第８７１０１５３７号（１９８８年１月１４日公開）（国際公開第Ｗ Ｏ３８１００２０５号）は骨の誘発の性質をもつウシの骨からの不純な画分を開 示している。その出願人は組み換えＤＮＡ技術により生産された仮想上の”骨誘 発因子”もまた開示してし）る。

４つのＤＮＡ配列がヒトおよびウシのゲノミックあるいはｃＤＮＡライブラリー から回収されそして組換え体宿主細胞内において発現された。出願人は、発現さ れた蛋白質が骨形態発生蛋白質であろうと陳述しているが、骨の誘発は証明され ”骨の形成はこれらの分子との相互関係により制御されて０る可能性力（強ｔ　 Ｘｍと仮定すると報告している。再び、骨の誘導はｃＤＮＡの発現の生産物ｔこ よるものでなくなった。骨形態発生剤という名称のウリスト（Ｕｒｉｓｔ）らの ヨーロツノく特許出願第２１２．４７４号もまた参照せよ。

ワンプ（ｆａｎｇ）ら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８５：９４８４−９４８８＋よ軟骨および骨の形成活性をもつ 脱イオン化された骨のグアニジン抽出物からウシの骨形態３０、１８．および１ ６ｋＤの蛋白質を生じた。この結果から見て、著者は活性のある物質の厳密な同 定はまだ決定されていない事を認めている。

ワンプ（ｆａｎｇ）ら（１９９０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８７：２２２０−２２２７はＰＣＴ出願第８７１０１５３７号 に記述されているｃＤＮＡ配列のうちの一つの発現および部分精製を記述してい る。これらの蛋白質を用いる場合の確実な軟骨および／または骨の形成は最小限 ６００　ｎＨの５０％純粋な材料を必要とする。

ＰＣＴ出願第８９１０４４５８号（１９９０年４月１９日公開）（国際公開第ｗ ｏ９０１００３７３３号）はＰ３０Ｆ　３１−３４と呼ばれる骨形成因子ファミ リーの精製および分析を記述している。

その蛋白質ファミリーはペプチド断片の配列により特徴づけられた少なくとも４ つの蛋白質を含む。不純な混合物Ｐ３０Ｆ　３１−３４の骨形成活性も分析され た。しかしながら個別の蛋白質の活性は評価も議論もされなかった。

骨形成の因子の移植の成功には使用されるｉｎ　ｖｉｖｏの領域において蛋白質 を維持することができる有用なキャリアー材料と蛋白質との結合を必要とする。

キャリアーは生物的に適合性があり、生物的に分解されそして細胞浸潤に十分な 多孔性であることが望まれる。粉末化された骨のグアニジン抽出および脱脂後に 残る不溶性のコラーゲン粒子は幾つかの種の異質遺伝子型の移植において通常は 効果的であった。しかしながら、骨誘導蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ 　ｐｒｏｔｅｉｎ）は種を通じて有効であるが、通常軟骨性骨形成を誘導するの に使用されるコラーゲン様骨マトリックスは種特異的であることが研究により示 された（Ｓａｍｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：６５９１−６５９４）。」匹 ζコお０て移植された脱イオン化され、脱脂され、抽出された外因性の骨マトリ ・ノクスキャリア−＋ｉ、おそらく骨マトリックス中における阻害性あるいは免 疫原性成分のため（こ骨形成を誘導することができない。多くの種においては、 骨形成用具にお０て同種の骨マトリックスを使用しても骨誘導の骨形成（ｏｓｔ ｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　ｂｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ｌこは不十分であろ う。例えば、脱イオン化され、脱脂されたサルの骨のマトリックスの皮下へ同種 の移植物はサルにおいて骨の形成を誘導しないと報告されて（する（＾ｓｐｅｒ ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒ 　、　（Ｂｒ）　肚６２５−６２７）。

米国特許出願第４．５６３．３５０号（１９８６年１月７日発行）は、トリプシ ン処理されたウシの骨のマトリックスが、抽出され、部分精製された骨−誘導蛋 白質の調製物を用いた移植のときに骨形成活性に影響する異種のマトリックスと して使用されることを開示している。骨の形成は少なくとも５％、好ましくは少 なくとも１０％の非繊維状コラーゲンの存在を必要とすることが示されている。

著者らは、コラーゲンの調製物の免疫原性に一部関係するテロペプチドの除去が 異種性の移植において、より有効であると主張している。

ヨーロッパ特許出願第３０９．２４１号（１９８９年３月２９日公開）は、骨形 成蛋白質調製物、および無機成分あるいは骨コラーゲン粉末６０−９８％からな るマトリックスキャリアーおよび２−４０％のアテロペプチド低免疫原性コラー ゲンからなる軟骨性骨の形成の誘導具を開示している。

デセラージ（Ｄｅｔｈｅｒａｇｅ）ら（１９８７）　Ｃｏ１１ａ　ｅｎ　Ｒｅ１ ．　Ｆｌｅｓ、ヱ：２２２５−２２３１は、−回のイオン交換カラムにより最小 限に精製されたウシの骨のマトリックス抽出物および再構成され、高度に精製さ れたヒトＴｙｐｅ−Ｉ胎盤コラーゲンからなる明白な外因性移植具を開示すると 主張している。

米国特許出願第３．３９４．３７０号（１９８３年７月１９日発行）は、異種性 の移植において有用であると紹介されている再構成されたコラーゲンのマトリッ クスを記述している。コラーゲン繊維は免疫原性をもつ可能性があるテロペプチ ド（繊維内部の交差結合の主な原因でもある）を除去するために酵素により処理 されそして付随している非コラーゲン組成物を除去するために溶解された。再構 成されたコラーゲンを酢酸中で分散させることにより基本コラーゲン分子の無秩 序なマトリックスを形成し、これを次に骨形成因子と混合し、そして凍結乾燥し て、好ましくは交差結合している１半硬性のフオームあるいはスボンン”を形成 することによりマトリックスを組み立てた。組み立てられたマトリックスはｉｎ 　ｖｉｖｏにおいて試験されない。

米国特許出願第４．１７２．１２８号（１９７９年１０月２３日発行）は、貴様 材料を分解しそして低い免疫原性をもつように再生する方法を記述し、その方法 が種を越えて有用であるとしている。脱イオン化された骨の粒子は付随している 全てのムコ多糖（グリコサミノグリカン）を溶解するために膨張剤で処理され、 そして引き続いてコラーゲン繊維を均質なコロイド溶液を形成するために溶解さ れる。次に、生理学的に活性のないムコ多糖および繊維形成の促進のための電解 質を使用して再構成植において骨を誘導することができる、分散された骨形成蛋 白質を含むマトリックスからなる骨形成具を提供することである。もう一つの目 的は、哺乳動物細胞から発現され、そしてヒトを含む哺乳動物において軟骨性骨 の形成を誘導することができる、組換え体骨形成蛋白質を提供することである。

さらにもう一つの目的は、骨形成蛋白質をコードする遺伝子および組み換えＤＮ Ａ技術を使用したそれらの生産方法を提供することである。なおさらにもう一つ の目的は、骨形成蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）と 組み合わせて、ヒトを含む哺乳動物において軟骨性骨の形成をすることができる 、生物的に適合性があり、胡■四において生物的に分解されうるマトリックスを 提供することである。

本発明の、これらのおよび他の目的および特徴は以下の説明、図面、および請求 の範囲から明らかにされる。

産朋虫攪１ 本発明は、哺乳動物の体に移植したとき、移植部位において血管形成、無機質化 、および骨の骨髄分化を含む軟骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導する ことができる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供する。この骨形成具は、こ こではマトリックスと呼ばれ、以下に開示された特徴をもち、そして組み換えＤ ＮＡ技術を使用して生産されそして真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞から 発現された骨形成蛋白質を分散して含んだキャリアー材料からなる。

ここに開示されたマトリックス中に分散した組換え体蛋白質の好ましい態様は、 天然の材料から抽出されそして同種の脱イオン化された骨粉のマトリックス材料 中で再構成された天然の形の蛋白質の生理学的な活性と密接に類似している。

好ましい蛋白質は、従来報告された生合成されたどのような材料よりもはるかに 高い比活性を有し、すなわち活性分析法の精度の限度内において米国特許出願第 １７９、４０６号（１９８８年４月８日発行）（Ｆ’ＣＴ　ＵＳ／８９０１４５ ３）において述べられたようにして生産された実質的に純粋な材料と本質的に同 一と認められる活性をもつ。したがって、本出願は天然の骨の治療において起こ るのと本質的に同様な軟骨性骨の完全な発生のカスケードを誘導する骨形成具の 製造方法および使用方法を開示する。

これらの開発の鍵は、アミノ酸配列の推定および天然の骨形成蛋白質の構造デー タである。一つのプロトコルを作成し、それにしたがって、骨形成活性の半最大 活性値が移植片１ｍｇあたり約０．８から１．Ｏｎｇの哺乳動物の骨からの実質 的に純粋な骨形成蛋白質を回収した。その材料を入手できたことにより、本発明 者らは骨形成を達成するために必要な蛋白質の詳細な全構造を推定することがで きた。

蛋白質のアミノ酸配列および他の構造的な特徴の知識により天然の遺伝子を同定 およびクローニングすることができた。

部分的な配列データおよび引例において開示された制御蛋白質との間の観察され た相同性に基づいたコンセンサスＤＮＡ配列をゲノミックおよびｃＤＮＡライブ ラリーから骨形成蛋白質をコードする遺伝子を抽出するためのプローブとして使 用した。コンセンサス配列のプローブの内の一つが、これまでに未同定のＤＮＡ 配列を単離した：その一部分を連結したときコードするタンパク質は、正確に修 飾され、適切なマトリックスに取り込まれそしてここに開示されたように移植さ れるときに、軟骨性骨の形成を誘導することができる領域を有していた。ここで ＯＰＩと呼ばれている蛋白質並びにさまざまに欠失させた型および融合物を完全 長のｃＤＮＡ配列およびさまざまに欠失させた合成りＮＡから大腸菌およびさま ざまな哺乳動物において発現させ、そしてホモダイマーとしであるいはＢＭＰ２ 、すなわちコンセンサス配列のプローブによるヒトＤＮＡライブラリーがら抽出 された他の骨形成蛋白質とのヘテロダイマーとして骨形成活性を示すことを見い 出した。

ＯＰＩ遺伝子の特徴決定および活性に必要なりＮＡおよびアミノ酸配列の同定に より哺乳動物細胞においてその遺伝子を発現させることができた。哺乳動物の蛋 白質の哺乳動物細胞における発現、特に治療のための使用を意図とした組換え体 蛋白質の発現は通常天然の材料構造によく似た構造をもった蛋白質を生じると考 えられている。このことは、原核細胞往動系において行われることがないグリコ ジル化のような特定の後翻訳修飾を必要とする分泌蛋白質においては特に真実で ある。大腸菌内におけるＯＰＩ遺伝子の発現により、グリコジル化されていない 型の蛋白質は骨形成活性をもつことが示されたが、例えば、蛋白質の安定性、溶 解性、あるいは免疫原性に関連したまだ決定されていないオリゴサツカロイドの 機能のような他のものがあるかも知れない。さらに、培養液中に分泌された蛋白 質の精製は、原核往動細胞の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ）から 誘導された蛋白質を抽出する方法に代替する方法を提供する。

遺伝子の哺乳動物細胞におＣする発現は、成熟蛋白質のＮ末端の決定もまた可能 にした。ＯＰＩの成熟型であると信じられるもののアミノ酸配列は次のとおりで ある（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　１）：５ＴＧＳＫＱＲ８ＱＮＲＳＫＴＰ ＫＮＱＥＡＬＲＭＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　ｒ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＴＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

組み替えにより生産されたＯＰＩは蛋白質のＮ末端を欠失させた幾つかの型にお いても活性をもっている。欠失させたＯＰＩの内の主要な一種は次のものである （Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　２） ＳＱＮＲ３ＫＴＰ ＫＮＱＥＡＬＲＭＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｔ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

４つの他の活性のある短いＯＰＩ配列は：０Ｐ１−１６Ｌ（Ｓｅｑ、　ＩＤＮｏ 、　３）ＬＲＭＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＴＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＩ（Ａ　Ｉ　ＶＱＴＬＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　Ｌ、ＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡＣＧ　ＣＨ。

ＯＰｌ　１６Ｍ（Ｓｅｑ、　ＩＤＮｏ、　４）ＭＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　ＩＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ； ０ＰＩ−１６Ａ（ＳｅＱ、　ＩＤＮｏ、　５）ＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｉ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＯＰ　１−１６　Ｖ（Ｓｅｑ、１０　Ｎｏ、　６）ＡＥＮＳ Ｓ　５ＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｉ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

これらの６種のＯＰＩのｉｎ　ｖｉｖｏにおける骨形成活性を調べそしてすべて が可溶性マトリックスと一緒に哺乳動物において移植したときに薬剤量に依存し た様式で軟骨性骨形成を誘導することが示された。これらの種の比活性は実質的 に純粋な、天然物を源とする骨形成蛋白質の比活性に近い。さらに、これらの蛋 白質は従来報告された他の骨形成蛋白質ＰＩ製物よりも天然物を源とする材料の 活性とより密接に似ている。

相換え体により生産されたＯＰＩは唾乳動物内においてグリコジル化されたホモ ダイマーとして発現される。０ＰＩ−１８のホモダイマーは５ＤＳ−ＰＡＧＥに より決定すると、酸化された時には約３６　ｋＤ、還元された時には約１８　ｋ Ｄの見がけ分子量である。　０ＰＩ−１６３，０ＰＩ−１６Ｖ、　ＯＰＩ−１６ Ｍ、　０ＰＩ−１６Ａおよび０ＰＩ−１６Ｌは５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定する と還元された時には約１６　ｋＤであり、そしてこれらの蛋白質のホモダイマー 並びに０ＰＩ−１８とのヘテロダイマーは酸化された時に約３０−３６　ｋＤの 範囲内の見かけ分子量である。還元された状態においては、これらの蛋白質は検 出できるような骨の形成活性を示さない。

ＯＰＩは今日迄に多くのさまざまな哺乳動物において発現され、それらすべての 細胞は翻訳後に蛋白質をグリコジル化しそしてプロセスする。オリゴサツカロイ ドの側鎖の詳細な構造はセルラインの種類により異なるであろうが、すべての場 合において発現された配列は特異的なそして薬剤依存性の様式において骨形成の 活性をもつ。

本発明はそれらの特異的な構成物に限定されない。したがって、本発明の骨形成 蛋白質は宿主の真核生物細胞において組換え体ＤＮＡの発現により生産されたさ まざまなグリコジル化のパターン、Ｎ末端の変化、アミノ酸相同性領域をもった 関連する蛋白質のファミリー、および天然のアミノ酸配列を欠失させたり変異を 起こさせたものを含む。本発明の骨形成具において有用な活性配列は、０ＰＩ− １６Ｖとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、の配列相同性 をもった骨形成蛋白質を含む。これは長い型の蛋白質や対立遺伝子の変異物およ び変異蛋白質をも含む。

したがって、本開示からみて、遺伝子工学の当業者は適切なアミノ酸をコードす るｃＤＮＡあるいはゲノミックライブラリーから遺伝子を単離、あるいはオリゴ ヌクレオチドからＤＮＡをつ（ることができる。そしてヒトを含んだ哺乳動物に おいて骨の形成を誘導することができる活性型蛋白質を大量に生産するために、 さまざまなタイプの宿主真核生物細胞においてそれらを発現することができる骨 形成蛋白質は適切な送達剤あるいは支持系（マトリックス）とともに、臨床の応 用において有用である。マトリックスは、生物的に適応でき、蛋白質を抽出され 、無機塩類を含まず、脱脂された不溶性のＴｙｐｅ−Ｉ骨コラーゲン粒子からな り、これは宿主にとって同種あるいは異種であり得る。粒子は好ましくは、粒子 の形態を変えるために、すなわち粒子内部の多孔性および粒子の表面の領域を増 加させるために、お湯あるいは他の繊維修飾溶剤のような繊維修飾剤で処理され る。粒子は共にマトリックスを形成させるために詰め込まれる。粒子間の空間は 先祖細胞の移動そして引き続く細胞の分化および増殖のための範囲でなけ粗ｆな らない。粒子の大きさは７０〜８５０μ１１好ましくは１５０　ｕ　ｖａ−４２ ０μｍの範囲内がよし）。

マトリックスは骨の欠損にまたがる形に粒子をぴったりと詰め込むことにより、 あるいは粒子を望まれる形に他の方法で詰め込んでかたちづくることにより作り 上げる。マトリックスはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて生物的に適応しく炎症性のなシ １）、そして生物的に分解され得る、そして”一時的骨格′および移動性の先祖 細胞を呼び集める土台として、およびそれらの引き続く固着および増殖のための 基礎として用いられる。ここに開示されたように、マトリックスは哺乳動物体内 におし）て確実にそして再現性よく軟骨性骨の形成を誘導する骨形成蛋白質と組 み合わせることができる。

このマトリックスの材料の開発は異種性の骨のマトリックスおよび骨形成蛋白質 の移植の成功のために必要な鍵となる特徴の発見の結果として開発された。実質 的に純粋な骨形成蛋白質および同種の脱イオン化され、脱脂された蛋白質−抽出 骨マトリックスからなる骨形成具は、移動する先祖細胞の流入、増殖および分化 のための寸法の間隙をもつ必要があるということを研究が示唆した。異種性の骨 マトリックスからなる骨形成具がｉｎ　ｖｉｖｏにおいてほとんどあるいは全く 軟骨性骨形成を誘導しないということもまた観察された。異種性のマトリックス による骨の形成がないことは、一般的にマトリックス中にまだ存在してし）る成 分（例えば、コラーゲンテロペプチドあるいは付随する非コラーゲン性糖蛋白質 ）に対する免疫原性あるいは阻害的な応答によると考えられてきた。

粒子の総合的比表面積（表面領域／単位物質量）、多孔性および微小なくぼみの 程度、およびマトリックス粒子のくぼみおよび穴の大きさが異種性移植、および 特定の種においては同種移植にさえも重要であることが今日発見されている。

第１図のパネルＡおよびＢはそれぞれラットおよび子ウシからの脱イオン化され 、グアニジン抽出された骨マトリックスの粒子構造を示す走査電子顕微鏡写真で ある。これらの写真から観察され得るように、子ウシの骨マトリックスにおいて よりもラットの骨マトリックスにおいて顕著なより大きい生来の多孔性、あるい は表面積がある。骨マトリックスの多孔性および粒子内部の表面の領域を増加さ せることは、ランドのコラーゲン性骨マトリックスの移植により明らかにされた ように、骨形成の誘導を促進することができる。このことは、その形態を変える ために一定の溶剤又は加熱によりコラーゲン性骨マトリックスを処理することに より達成される。この目的に適する薬剤はここで開示されそしてコラーゲン繊維 −修飾剤と呼ばれる。

したがって、本発明の一つの局面は表面積およびマトリックスのコラーゲン粒子 の多孔性を実質的に増加させるために処理されたマトリックスからなる骨形成具 を含む。

本発明の骨形成具において有用な、現時点で好ましい繊維−修飾剤は熱せられた 水性溶媒で、最も好ましくは水である。脱イオン化され脱脂されグアニジン抽出 された骨のコラーゲンを水中で高温にて（３７°−６５°、好ましく、は４５’ −６０℃）約１時間熱することは、望まれた表面の形態を得るのに通常は十分で ある。機構は明らかでないが、熱処理はコラーゲン繊維を変化させ、その結果粒 子の表面積を増加させると仮定される。したがって、骨のマトリックスは水中（ Ｉｇ／３０ｍ１）で撹拌しながらさまざまに高めた温度で処理し、そして濾過す ることができる。水中で温度を上昇させることにより不溶性のコラーゲンを処理 することにより、らせん構造から非らせん構造への完全な遷移の１／４から３／ ４に達するのに必要な温度である融解遷移（Ｔｍ）に最初に到達する。その後繊 維は収縮温度（Ｔｓ）と呼ばれるいくらか高い温度において突然に何分の−かに 収縮する。Ｔｓは通常Ｔｍより高く、分子の詰め込みにより更に安定性が高まる ことを反映する。約５以下のｐＨにおいては、熱せられたコラーゲンのＴＩＩお よびＴｓの両値は減少する。

溶剤で処理された骨のコラーゲン性マトリックスの実験は、脱イオン化されグア ニジン−抽出された異種性の子ウシの骨はさらに別の物質の混合物も含むことを 示し、そしてこれらの物質を抽出するとマトリックスの特性を改良できることを 示している。抽出物中の成分をクロマトグラフィーにより分離し、続いてクロマ トグラフィーのピークに対応するさまざまな抽出画分を活性マトリックスに加え 戻すことにより、骨形成の誘導効果（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｎｅ　ｅｆｆｅ ｃｔ）を阻害できる活性があることが示唆された。この阻害画分内の物質の正体 はまだ決定されていない。本発明の一つの局面において、上述されたタイプのＴ ｙｐｅ−Ｉ骨コラーゲン粒子からなりさらに該コラーゲン粒子が阻害作用を示す 成分を除去されている点において特徴づけられるマトリックスか提供される。

本明細書の開示から見て、当業者は骨形成具を確立するのに有用な、そしてｇＡ Ｊえば骨の誘導を促進するためのパツキンとして、あるｔｓは生物的ζ二分解さ れる徐放性の耐えられる放出移植片として他の移植可能な材料として有用な望ま れた多孔性および表面の微小構造をもつ、生物的に適応できる特別上質のマトリ ックスを創ることができる。

ここに開示された骨形成蛋白質および移植可能な骨形成具（こより、医師＋ｉ％ Ｉえば、後天性および先天性の脳顔面頭蓋のおよび他の骨格あるし）は歯の奇形 を矯正するために最善の予測できる骨の形成をすることができる（Ｇｌｏｗａｃ ｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）匡匹ｅｔ　１：　９５９−９６３）。この骨 形成具は動物実験にお（＼て証明されたような癒着不良骨折において、および骨 の形成が必要な歯周の適用を含む他の治療の適用において、局部の軟骨性骨の形 成を誘導するのに使用される。他の潜在的な治療の適用は例えば、骨関節炎の処 理における軟骨の修復においてである。

区面Ω間里ケ説朋 本発明自身、さらにそのさまざまな特徴、本発明の前述のおよび他の目的は添付 の図面とともに解釈されるとき、以下の説明からより完全に理解される・図ＩＡ およびＩＢは、脱イオン化され、脱脂された（Ａ）ラットの骨コラーゲン粒子、 そして（Ｂ）ウシの骨コラーゲン粒子の電子顕微鏡写真（５０００Ｘ）である。

図２−１および２−２はヒトＯＰＩ遺伝子のプレプロフオームの完全長のｃＤＮ Ａおよびコードされるアミノ酸配列を表す（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　７）；図 ３Ａないし３ＦはＯＰＩの哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざ まな発現ベクターの制限地図である。

図４は　ＣＯＳ細胞＝（Ａ）ｐＨ７１７，（Ｂ）ｐＨ７３１；　ＣＨＯ細胞−（ Ｃ）ｐＨ７５４，（Ｄ）ｐＨ１７５２、およびＢＳＣ細胞＝（Ｅ）ｐＨ７１７， （Ｆ）ｐＷ２４；から発現されたＯＰｌを比較するウェスタンプロット（イムノ プロット）の写真から作成した図である。

図５Ａ−ＣはＢＳＣ細胞から発現されそして　（Ａ）Ｓ−セファロース、（Ｂ） フェニル−セファロース、および（Ｃ）Ｃ−１８カラムの順で精製された（１） 溶出図および（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真から作成した図である。

図６はヂチオスレイトールで還元後（１８ｋＤ、レーン５）の酸化状態の完全な ダイマー（３６ｋＤ、レーン１）および対応するモノマーと分子量スタンダード （レーン２−４）を比較したＢＳＣ細胞から精製されたＯＰＩの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅの写真力）ら作成した図である： 図７Ａないし７Ｄは水中で（Ａ）３７℃、（Ｂ）４５℃、（Ｃ）５５℃、そして （Ｄ）６５’Ｃ霧こおいて熱処理された、脱イオン化され、脱脂されたウシの骨 のマド１ノツクスの走査電子顕微鏡写真（約１０００Ｘ）である：図８は湯で処 理された子ウシのマトリ・ノクスから単離された抽出物の２１４ｎ−こおける吸 光の記録であり、個々の画分はｉｎ　ｖｉｖｏの骨の形成への阻害効果を同定し た： 図９Ａおよび９Ｂはお湯で処理されたマトリックスの抽出物のＯＰ１活性に対す る阻害効果を（Ａ）アルカリホスファターゼ活性および（Ｂ）１２日目の移植片 のカルシウム含有量を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定することにより表し た棒グラフである： 図１０Ａ−ＦはＣＯ８，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成 の発生カスケードに続＜ｏｐｉの同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００Ｘ）で ある図１１はＢＳＣ細胞から発現されたＯＰＩおよびお湯で処理された外因性ウ シマトリックスを使用した本発明の異種性移植物の組織構造（１２日目）の光学 顕微鏡写真である。

図１２はＣＯ３，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現されたＯＰｌを含む同種移植 片のアルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含有量により測定された１２ 日目の同種移植片の薬剤量依存性を表す、そして図１３Ａおよび１３ＢはＣｏＳ およびＢＳＣ細胞において発現されたＯＰｌの薬剤量に対する依存性を蛋白質の 濃度の増加に対する（ｎｇで表される薬剤量曲線）（Ａ）アルカリホスファター ゼ活性および（Ｂ）異種性移植片（１２日目）におけるカルシウム含有量を測定 することにより表した棒グラフである。

脱型 哺乳動物の骨か°らの蛋白質の粗抽出物に存在する骨形成の蛋白質の単離を可能 にした精製のプロトコルが最初に開発された。（へ丁第ＵＳ８９１０１４５３号 、および米国特許出願第１７９．４０６号（１９８８年４月８日出願）を参照） 。新鮮な子ウシの骨を入手できたことと、上記方法が開発されたことにより、実 質的に純粋なウシの骨形成蛋白質（Ｂ　ＯＰ）を単離できた。ＢＯＰは有意に同 定された；ネコ、うさぎ、およびラットにおける軟骨および最後の軟骨性骨を誘 導するその能力は証明され、そして研究された；従来は不均買な骨の抽出物内の 未知の蛋白質によると見なされていた骨の形成の発生カスケードを誘導すること が可能であることが示された。この薬剤量依存性および高い特異活性は、蛋白質 がグリコジル化されていてもいなくても存在した（米国特許出願第２３２．６３ ０号（１９８８年８月１５日出願）およびＳａｍｐａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　（ １９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　２６５：　ｐｐ、　１３１９８ −１３２０５を参照せよ）。ウシの材料から得られた配列データはプローブの構 想を与え、ヒトの遺伝子を単離するために使用された。ヒトのＯＰＩに相当する 蛋白質は今日発現されそして十分に同定されている。

ホモダイマーとして個々にそしてヘテロダイマーとして別の種と結合した全体的 に新規な、非天然蛋白質構成物をコードするＤＮＡを調製することを可能にした これらの発見は、真の軟骨性骨を生産することが可能である（ＰＣＴ出願第８９ １０１４６９号（１９８９年４月７日出願）および米国特許出願第３１５．３４ ２号（１９８９年２月２３日出願）を参照せよ）。それらは、ここに開示された 技術を使用してそして自動化され市販されている装置を使用することにより生産 された合成りＮＡからあるいは天然源から回収されたｃＤＮＡおよびゲノミック ＤＮＡから、天然の材料、欠失させた型、変異蛋白質、アナログ、融合蛋白質、 そしてさまざまな他の由来物および構成物を発現させることもまた可能にした。

ＤＮＡは原核生物細胞および真核生物生物細胞においてよく確立された分子生物 学および組み替えＤＮＡ技術を使用して発現され、そして必要ならば、生物学的 に活性のある蛋白質を生産するためにｉｎ　ｖｉカ遠において酸化されそして再 びおりたたまれる。

ゲノミックおよびｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡ配列のうちの一つ はここでＯＰＩと呼ばれる、これまで未同定の遺伝子をコードしていた。単離さ れたＤＮＡによりコードされている蛋白質はＴＧＦ−βファミリー内の蛋白質と のアミノ酸相同性から最初に同定された。コンセンサスなスプライスシグナルは エクソンとイントロンの境界と呼ばれているアミノ酸相同性が終わるところで見 いだされた。７つのシスティンを含む機能的なＴＧＦ−β様ドメインを得るため に、３つのエクソンを結合させた。（例えば、米国特許出願第３１５．３４２号 （１９８０年２月２３日出願）、あるいは０ｚｋａｙｎａｋ、　Ｅ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　（１９９０）　ＥＭＢＯ，！、　９：　ｐｐ、　２０８５−２０９３） 。

ＯＰＩの完全長のｃＤＮＡ配列はそれがコードするアミノ酸配列を含めて第２図 に示されている。ＯＰＩの完全長のｃＤＮＡ配列、さらにこの遺伝子をさまざま に欠失させた型、および融合させた遺伝子を大腸菌において発現させ、そしてマ トリックスと結合させて哺乳動物において移植したときに骨の形成活性をもつこ とが示された。

天然の型の蛋白質は蛋白質の適切な分泌のためのシグナルペプチド配列を含む” プレプロ２型として最初に発現される。シグナルペプチドが切断される部位は第 ２図において下線力弓１かれている。シグナルペプチドの除去により蛋白質の” プロ”型を生じ、これが分泌時にプロセスされて成熟蛋白質を生じる。成熟配列 を生じる切断部位は第２図において矢印で示されている。成熟型であると信じら れているアミノ酸配列は次のとおりである（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　１）、５ ＴＧＳＫＱＲ３ＱＮＲ３ＫＴＰ Ｋ　Ｎ　Ｑ　Ｅ　Ａ　Ｌ　ＲＭ　Ａ　Ｎ　ｖ　Ａ　Ｅ　Ｎ　ＳＳＳＤＱＲＱＡＣ ＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＴＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｉ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　Ｉ　ＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

正しくダイマーにされ、おりたたまれ、マトリックスに吸収され、そして移植さ れた時に、プロ型およびプレプロ型の両者は骨形成活性を示すが、これはおそら く分割および成熟型の蛋白質あるいは活性のある欠失されたアナログ蛋白質を生 じるような分解酵素による分解のためである。

活性型のＯＰＩはまた蛋白質のＮ末端部分がない、欠失された型で精製されうる 。ＯＰＩの活性をもつ欠失された型の一つは次のものである（Ｓｅｑ、　ＩＤ　 Ｎｏ、　２）ＳＱｒＮＲＳＫＴＰ ＫＮＱＥＡＬＲＭＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ Ｇ　Ｙ　Ａ　Ａ　Ｙ　Ｙ　ＣＥ−Ｇ　Ｅ　ＣＡ　Ｆ　Ｐ　Ｌ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｉ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

ＯＰＩの活性のある欠失された型の他の４つは次のものである。

０ＰＩ−１６Ｌ　（Ｓｅｑ、　ＩＤＮｏ、　３）Ｓ　５ＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬ ＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　ｒＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｔ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ； ＯＰ　１−１６Ｍ　（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　４）ＭＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ５０　１１Ａ　６０ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　ＩＶＱＴＬ ＶＨＦ　ＩＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

０ＰＩ−１６Ａ　（Ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、　５）ＡＮＶＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＴ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｉ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　Ｉ　ＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ，および ＯＰＩ　１６Ｖ　（Ｓｅｑ、　ＩＤＮｏ、　６）ＡＥＮＳ ＳＳＤＱＲＱＡＣＫＫＨＥＬＹＶ ＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩ　ＩＡＰＥ ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ ０９Ｏ ＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ　Ｉ　ＶＱＴＬ ＶＨＦ　Ｉ　ＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣＡ ｌｌｏ　１２０ ＰＴＱＬＮＡ　Ｉ　５ＶＬＹＦＤＤＳ ＳＮＶ　Ｉ　ＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡ ＣＧ　ＣＨ。

前述のアミノ酸およびＤＮＡ配列の情報により、さまざまなりＮＡが融合蛋白質 、成熟蛋白質の他の欠失型、および類似の構成物に加えて、ＯＰｌの少なくとも 最小限の活性ドメイン、および、それらのさまざまなアナログをコードするよう に構成されうる。これらのＤＮＡは、ゲノミックＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離、 合成されたオリゴヌクレオチドからの合成りＮＡの構成、およびカセット変異導 入技術を含む、よく知られたＤＮＡ操作を使用して当業者により製造されつる。

１５−１５−１Ｏ０のオリゴヌクレオチドはバイオサーチＤＮ＾モデル８６００ 合成機により合成され、そしてＴｒｉｓ−はう酸−ＥＤＴＡ緩衝液においてポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製される。そしてＤＮＡをゲ ルから電気的に溶出する。オーバーラツプするオリゴマーをＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼによりリン酸化しそしてＰＡＧＥによっても精製されるより大きなブ ロックに連結する。

モしてｃＤＮＡあるいは合成りＮＡを蛋白質の発現のために発現ベクターに挿入 しそして適切な宿主細胞内にトランスフェクトする。原核細胞生物は蛋白質をグ リコジル化できないが蛋白質の骨形成活性は壊さないから、宿主は原核細胞生物 あるいは真核細胞生物を使用する。有効な宿主細胞には大腸菌、酵母、昆虫／バ キュロウィルス細胞系、ミエローマ細胞、およびさまざまな噛り動物細胞が含ま れる。本発明の蛋白質はここに開示されたように、好ましくは哺乳動物において 発現される。ベクターは付加的に転写プロモーターおよび終結配列、エンハンサ −配列、好ましいリポソーム結合部位配列、好ましいｍＲＮＡリーダー配列、蛋 白質の分泌のための好ましいシグナル配列、および類似物を含む組換え体蛋白質 の正確な発現を促進するさまざまな配列をコードしていてもよい。興味のある遺 伝子をコードするＤＮＡ配列はまた、潜在的に阻害をする配列を除去するために あるいは望まれない二次構造の形成を最小限にするために操作される。組換え体 骨形成蛋白質はまた、融合蛋白質としても発現されうる。翻訳された後に、蛋白 質は細胞自身から精製あるいは培養液から回収されうる。すへての生物学的に活 性のある蛋白質の型は、個々のサブユニットの発現後に適切な真核生物細胞内あ るいは釦Ω１ρにおいて、さまざまな組換え体蛋白質のひとつあるいはいくつか が酸化およびおりたたまれることにより、ジスルフィド結合により連結されるか 他の方法で結合されて生産されるダイマ一種からなる。

前述したように、治療における使用のための哺乳動物の組換え体蛋白質の生産は 、その構造が天然の物質に最も近い蛋白質を生産するために、好ましくは哺乳動 物細胞培養系において発現されるということが通常は考えられている。踊り動物 細胞内における組換え体蛋白質の生産は、トランスフェクトが簡単で、外来のＤ ＮＡを並び方が変化していない配列で安定に維持し、そして転写、翻訳、後翻訳 修飾、および蛋白質の分泌に十分な必要な細胞の成分をもった適切な細胞および 細胞ラインの確立を必要とする。さらに、興味のある遺伝子を運ぶ適当なベクタ ーもまた必要である。ｌ＠乳動物細胞へのトランスフエフシランのためのＤＮＡ ベクターの構成はコザックコンセンサス配列のような翻訳効率を高める配列に加 えて、適切な転写の開始、終結、およびエンハンサ−配列を含む上述されたよう な興味ある遺伝子の発現を促進する適切な配列を含むべきである。好ましいＤＮ Ａはまたマーカー遺伝子および興味ある遺伝子のコピー数を増幅する手段を含む してこの系の多くの局面は十分に特徴づけられた。有用な細胞、蛋白質発現−プ ロモーター配列、マーカー遺伝子、および遺伝子増幅法を含む、哺乳動物におけ る外来蛋白質の生産の技術の状況の詳細な論評は、ベンディグ（Ｂｅｎｄｉｇ） 、マリ−（Ｍａｒｙ）　Ｍ、、（１９８８）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅ ｒｉｎ　、　７：９１−１２７に開示されている。

簡潔に言えば、特定の哺乳動物内において外来の遺伝子を発現するのに有用な最 もよく特徴づけられた転写プロモーターはＳＶ４０前期プロモーター、アデノウ ィルスプロモーター（＾ｄＭＬＰ）、マウスメタロチオネイン−■プロモーター （ｍＭＴ−Ｉ）、ニワトリ肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）長末端重複（ＬＴＲ）、マウ ス乳癌ウィルス長末端重複（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、およびヒトサイトメガロウィ ルス主要中間−前期プロモーター（ｈｃＭＶ）である。すべてのそれらのＤＮＡ 配列はその分野においてわかっており市販されている。

哺乳動物系に郁いてよりよく特徴づｌすられた遺伝子増幅の方法の一つはｄｈｆ ｒ−セルラインにおける誘導可能なりＨＦＲ遺伝子の使用である。通常、ＤＢＦ Ｒ遺伝子は興味ある遺伝子を運ぶベクター中に供給され、そして細胞毒性薬剤メ トトレキセートの付加による誘導により、関連した興味ある遺伝子のコピー数に 加えてＤＨＦＲ遺伝子のコピー数も増幅される。トランスフェクトされたチャイ ニーズハムスター卵巣セルライン（ＣＨＯ細胞）における誘導可能な、増幅マー カー遺伝子としてのＤＨＦＲはその分野において特によく特徴づけられている。

誘導可能な遺伝子増幅器として有用な他の遺伝子は、アデノシン脱アミノ酵素（ ＡＤＡ）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子である。

細胞あるいはセルラインの選択もまた重要であり実験者の必要に依存している。

サル腎細胞（ＣＯ３）は高いレベルの一過性の遺伝子発現を提供し、ベクター構 成物およびクローン化された遺伝子の発現の迅速な試験に有用な手段を提供する 。

ＣＯ８細胞は興味ある遺伝子を運ぶシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）ベクタ ーでトランスフェクトされる。トランスフェクトされたＣＯ５細胞はやがて死滅 し、そのため望まれた蛋白質の長期間の生産は妨げられる。しかしながら、一過 性の発現は安定なセルラインの開発に必要な時間を消費する過程（しばしば数週 間）を必要としない。

確立されたセルラインの間で、ＣＯＯ細胞は今日まで最も特徴がよくわかってい る。それらはまた広い範囲の細胞型由来の蛋白質を発現させることが可能である 。ＣＯＯ細胞の一般的応用可能性および関係のない細胞型由来の各種のヒト蛋白 質の生産が成功している事実は、すべての哺乳動物細胞における根源的な類似性 を強調する。そして、哺乳動物発現系において生産された組換え体蛋白質のグリ コジル化パターンは天然の蛋白質と同一でないかも知れないが、オリゴサツカラ イドの側鎖のちがいは発現された蛋白質の生物活性に本質的でないことがしばし ばある。

さまざまな哺乳動物細胞から組換え体ＯＰＩを発現させそして精製する方法、天 然の異種性マトリックス、および請求された主題の性格、有用性およびそれをい かに作りそして使用するかということに関する他の較点は、本発明の実施のため に現在最良であると知られた方法を構成する以下の記載からさらに理解されるで あろう。

ｒ、＋＊乳動物細胞における組換え体蛋白質の発現いくつかの違った哺乳動物細 胞の発現系か、本発明の組換え体ＯＰＩ蛋白質の発現に使用された。特に、ＣＯ ８細胞はＣＯ３細胞中にＤＮＡ配列をトランスフェクトするためにＳＶ４０ベク ターを使用して、ベクターの構築および遺伝子の発現の迅速な評価のために使用 される。安定なセルラインはＯＰＩ蛋白質の長期間の生産のｔ＝　メｌ：ｃＨＯ 細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）およびＢＳＣ細胞の高温感受性株（サ ルの腎細胞、Ｂ５Ｃ４０−ｔｓＡ５８、（１９８ｇ）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ 　６：１１９７−１１９６）を使用して開発される。２つの違ったプロモーター をＯＰｌの転写に使用する　ラウス肉腫ウィルスＬＴＲからのエンハンサ−によ り増幅されたＣＭＹプロモーター、および１１１Ｍ丁プロモーター（マウスメタ ロチオネインプロモーター）６いくつかの選択マーカー遺伝子、例えば、ｎｅｏ （ネオマイシン）およびＤＨＦＲ，もまた使用される。ＤＨＦＲ遺伝子はまたＣ ＯＯ細胞の遺伝子増幅計画の一部として使用されうる。他の遺伝子増幅計画はＳ Ｖ４０ベクターでトランスフェクトされたＢ５Ｃ４０−ｔｓ＾５８の温度感受性 （ｔｓ）を利用する。３３℃への温度の低下は、ｔｓ　ＳＶ４０　Ｔ抗原を安定 化し、それによって挿入された、トランスフェクトされたベクターＤＮＡの切り 出しおよび増幅が生じ、したがって結合された興味ある遺伝子もまた増幅する。

安定なセルラインはＢ５Ｃ４０−ｔｓＡ５８細胞（以下Ｂ５Ｃｍ胞′と呼ぶ）に 加えてＣＯＯ細胞でも確立された。本発明のＯＰＩ蛋白質の哺乳動物細胞の発現 のために選択されたさまざまなセルラインおよびＤＮＡ配列は遺伝子工学の分野 においてよく特徴づけられており容易に入手できる。他のプロモーター、選択可 能なマーカー、遺伝子増幅法および細胞も本発明のＯＰＩ蛋白質並びに他の骨形 成蛋白質の発現に利用されうる。トランスフェクション、発現、および組換え体 蛋白質の精製の特別な詳細はその分野においてよ（書物に記載されそして当業者 によって理解されている。哺乳動物発現系における外来遺伝子の組み換え体の生 産において使用されたそれぞれの段階のさまざまな技術的な側面のさらなる詳細 は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏ　、　Ｆ、Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ、、　Ｊ ｏ■氏@Ｗｉｌｅｙ ＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７のようなその分野における多くの テキストおよび実験マニュアルに見いだされうる。

１、　発現ベクターの例 第３図は哺乳動物におけるＯＰＩ蛋白質の発現のために考案されたさまざまな発 現ベクターの例の制限地図を開示している。これらのベクター構成物のそれぞれ は最初にヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト胎盤）から単離され、そして引き続い て挿入部位においてｐＬｌｃポリリンカー配列を使用して慣用的なｐＵＣベクタ ー（ｐＬＩｃ−１８）にクローン化された完全長のｃＤＮＡ配列を使用している 。これらの構成物のそれぞれにクローン化されたＯＰＩ　ｃＤＮＡ断片は第２図 に描かれた完全なＳｍａＩ−ＢａｍＢＩ　ＯＰＩ　ｃＤＮＡ断片（Ｓｅｑ、　Ｉ Ｄ　Ｎｏ、　７）、あるいはこの断片から標準的な分子生物学方法論を使用して 、周辺のコードしていない５°および／または３°配列を再度切り取った修飾断 片である。それぞれのベクターはまた霊長類細胞（例えば、ＣＯ５およびＢＳＣ 細胞）においてプラスミドの複製を伝達するのに有用なＳＶ４０の複製起点（ｏ ｒｉ）も使用している。さらに、前期ＳＶ４０プロモーターをベクター上のマー カー遺伝子（例えば、ｎｅｏおよびＤＨＦＲ）の転写の制御に使用している。

ｐＨ７１７発現ベクター（第３図Ａ）は、誘導可能な選択マーカーとしてネオマ イシン（ｎｅｏ）遺伝子を含む。このマーカー遺伝子は遺伝子工学の分野におい てよく特徴づけられており市販されている。一方、他の選択可能なマーカーも使 用可能である。ｐＨ７１７のためのｎｅｏ遺伝子ＤＮＡ断片の提供に使用される 特定のベクター（ｐｉ＾Ｍ−ｎｅｏ−ｂｌｕｅ）は、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｉｎ ｃ、、　Ｐａ１ｏ＾ｌｔｏ、　ＣＡから入手できる。ｐＨ７１７において、ＯＰ Ｉ　ＤＮＡの転写はＲＳＶ−ＬＴＲおよびＭ訂Ｖ−ＬＴＲ（７ウス乳癌ウイルス ）エンハンサ−配列により増幅されるＣＭＶプロモーターにより制御されている 。これらの配列はその分野においてよく知られており、そして市販されている。

例えば、このプロモーター／エンハンサ−配列を含むベクター（例えば、ｐＣＤ Ｍ８）はＩｎｖｉｔｒ。

ｇｅｎ　Ｉｎｃ、　、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ、からえられる。

発現ベクターｐＨ７３１（第３図Ｂ）はＯＰｌの転写を制御するためにＳＶ４０ 後期プロモーターを利用している。上で述べられたように、このプロモーターの 配列および特徴はまたその分野においてよく知られている。一方、ｐＨ７３１は ｐＥｔｌＫ−ＣＩ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、 　ＣＡ）にＯＰＩのＳｔａｒ−ＲａｍｌｌＴ断片を挿入することにより生産され る。

ｐＨ７５４発現ベクター（第３図Ｃ）は選択マーカーとしておよび誘導可能な遺 伝子増幅器としてＤＩＩＦＲ配列を含む。ｏＰｌはｃＭｖ制御下にある、ＤＩＩ ＩＦＨのＤＮＡ配列は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており、市販 されている。一方、ｐＥＩ７５４はｎｅｏ遺伝子（ＢａａｌｌＩ分解物）をＤＦ ｉＦＲ遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片（例えば、ｐｓＶ５−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ＃ ３７１４８）から得られる）に置き換えることにより、ｐＭ＾ＩＩ−ｎｅｏ（Ｃ １ｏｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）から生産できる。

そしてＯＰＩ　ＤＮＡは藷丁ＶＬＴＲ配列（マウス乳癌ウィルスＬＴＲ）の下流 のポリリンカ一部位に挿入され得、ｐＨ７５２を生じる（第３図Ｄ）。そしテＣ ＭＶプロモーター配列を、−ＣＩ’ａｌ−ＸｂａＩ断片（例えば、ｐＭＡＭ−ｎ ｅｏ　ｂｌｕｅ。

Ｃ１ｏｎｔｅｃｂ、　Ｉｎｃ、から）としてｐＨ７５２（Ｃ１ａＩ−ＮｈｅＩに おいて開がれた）に挿入できる。

ｐＷ２４ベクター（第３図Ｅ）はｎｅｏがＤＦＩＦＨの代わりにマーカー遺伝子 （ｐｌ＋７１７ヲ参照）として使用されていることを除いてｐ７５４の配列と本 質的に同一である。

同様にして、ｐｆ１７８３（第３図Ｆ）は増幅可能なマーカーＤＩＩＦＲを含む が、ここではＯＰＩはｅＭＴ（マウスメタロチオネインプロモーター）制御下に ある。ｍＭＴプロモーターは遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており 市販されている。一方、Ｉｌ１ＭＴプロモーター配列（Ａｌｌｅｇｒｏ　Ｎ１ｃ ｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｓａｎ　Ｊｕａｎ 　bａ ｐｉｓｔｒａｎｏ、　ＣＡから手に入る）を含むＣ１ａｌ−Ｎｈｅｌ断片はｐＨ ７８３を生産するためにＩ）Ｂ２Ｓ３に挿入され得る。

試験されたすべてのベクターはＯＰＩを発現するために使用されたさまざまな細 胞において安定であり、そしである範囲内のＯＰ１発現レベルを提供する。

２、ｊｉ＠乳動物細胞の例 組換え体ＯＰＩは３つの違った細胞発現系において発現された：　さまざまな発 現ベクター構成物の機能性を迅速にスクリーニングするためのＣＯ３細胞、安定 なセルラインの確立のためのＣＯＯ細胞、およびＯＰＩ蛋白質を生産する他の手 段としてのＢ５Ｃ４０−ｔｓＡ５８細胞。

Ａ、ＣＯ３細胞 ＣＯ８細胞（サルの腎細胞）はベクター構成物の迅速なスクリーニングおよびＯ Ｐｌ蛋白質の迅速かつ小スケールの生産に使用される。ＣＯ８細胞はその分野に おいてよく特徴づけられており市販されている。ここに記述された特定のセルラ イン（ＡＴＣＣ＃ＣＯ３−１，ＣＲＬ−１６５０）は＾ｌ１ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎを通じて得られる。

ノーザンおよびウェスタンプロットにより分析された種々のベクターからのＯＰ １発現レベルは以下の表１に比較されている。

表１ ＣＯＳ細　にお番るＯＰＩ　の ｐＨ７５２＋＋＋　、　＋＋＋＋ ｐＨ７５４＋＋＋　＋＋＋＋ ｐｔ１７５４でトランスフェクトされたＣＯ３細胞は今日最も高い収率でＯＰｌ を生産することが明らかになっている。しかしながら、トランスフェクトされた ＣＯ３細胞は分裂せずにトランスフェクション後に数日で死ぬので、個々のスケ ールアップされた形質転換には大量のプラスミドＤＮＡが必要となる。

トランスフェクトされたＣＯ３細胞からのＯＰＩの大スケールでの調製は慣用的 なローラーボトル技術を使用して生産される。簡潔に言えば、１４Ｘ１０’の細 胞がそれぞれのボトルに接種するのに使用される。２４時間の成育後に、ＤＥＡ Ｅ−デキストラン法を使用して、１０６細胞あたり１０μｇのベクターＤＮＡ（ 例えば、ｐＩＩＩ７１７）で細胞をトランスフェクトする。そして、蛋白質の分 析のために培地を採取する前に１２０時間血清を含まない培地で処理する。この プロトコルに従うと、ＯＰＩの収率は約２−６　ｎｇ／ｍｌになる。

Ｂ、　ＣＨＯＭＩ胞 ＣＢＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）は長期間のＯＰＩの生産に使用 される。Ｃｌｌ０セルラインは外来遺伝子の小および大スケールの生産のために よく特徴づけられておりそして市販されている。ここに記述された特定のセルラ インはＣｌｌ０−ＤＸＢＩＩ、（Ｌａｕｒｅｎｃｅ　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｃｏｌｕ ｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　ＮＹ）である。以下の表ＩＩはさまざまな 発現ベクターで得られるＯＰＩの収率例を表す。

表Ｈ 本　ｐＨ７５２／ｐＨ７５４ｐＨＲＲ１００−１５０＊細胞が０．１μＭメトト レキセート中で成育するように馴化したＣＦＩＯ細胞は慣用的なリン酸カルシウ ム法によりトランスフェクトできる。Ｃ■Ｏ細胞を好ましくはｐＨ７５４あるい はｐＨ７５２でトランスフェクトし、そしてＯＰＩの収率を高めると思われるの で、血清蛋白質を含んだ培地において処理される。有用な培地は０．１−０．５ ％の透析された胎児のウシの血清を含む培地を含む。

Ｃ，ＢＳＣ細胞 Ｂ５Ｃ４０−ｔｓＡ５８セルライン（ＢＳＣ細胞）はＣＯ８細胞に関連した幾つ かの問題に打ち勝つサルの腎細胞の温度感受性株である（１９８８．　Ｂｉｏｔ ｅｃｂｎｏｌｏ　６：　１１９２−１１９６）。これらのＢＳＣ細胞は、潜在的 に存置な薬剤を外部から添加することを必要としないで温度を下げることにより 迅速に大スケールで遺伝子配列を増幅することができる利点をもっている。さら に、細胞は再利用されうる。すなわち、ＯＰＩ発現の誘導および刺激後、細胞を 新しい成育培地に移し変え、３９５℃において飽和状態（コンフルエンス）まで 成育させ、そして温度を３３℃に下げることにより再び誘導することが可能であ る。ＥＳＣ細胞は蛋白質を産生ずる安定なセルラインを迅速に確立するために使 用されうる。

トランスフェクトされたＢＳＣ細胞は１０％のＦｅ２を含む培地において温度を ３３°Ｃに低下させることにより誘導され、そしてインキュベーションから９６ 時間後に処理された培地を収穫する。ＣＥＯ細胞と比較して同定度の量（例えば 、ｐＨ＋７１７でトランスフェクトされたＢＳＣクローンから産生培地１ｍｌあ たり１００−１５０　ｎｇのＯＰｌ）ＯＰＩＲＮＡおよび蛋白質が得られる。

３、０ＰＩでトランスフェクトされた細胞の評価トランスフェクトされたＯＰＩ 配列の発現レベルは総細胞ＲＮＡおよび慣用的なハイブリダイゼーション方法を 使用して、ｍＲＮＡのレベル（ノーザンプロット）を分析することにより種々の 系において測定される。通常、約１×１０６の細胞がｍＲＮＡの分析に必要であ る。個々のセルライン間のデータの比較は、細胞の総数およびｍＲＮＡの総量を 内部スタンダードとしてｒＲＮＡを使用して標準化することにより行うこきがで きる。リポソームＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために該ＲＮＡをニトロ セルロースフィルターに転写する前に、エチヂウムブロマイドでアガロースゲル を染色することにより可視化される。リポソームＲＮＡはまたＲＮＡの調製に、 完全さの指示指標を提供する。

ＯＰ１蛋白質のレベルはヒトＯＰ１に対するウサギの抗血清を使用してウェスタ ンプロット（イムノプロット）により測定することもできる。第４図は　ＣＯ８ 細胞−（Ａ）ｐＨ７１７，（Ｂ）ｐＨ＋７３１；　ＣＥＯ細胞−（Ｃ）ｐＨ７５ ４，（Ｄ）ｐＨ７５２；およびＢＳＣ細胞−（Ｅ）ｐＨ７１７および（Ｆ）ｐＨ ２４におけるＯＰＩの生産を表すイムノプロットである。

サザンプロットは挿入されたＯＰＩ配列の状態およびそれらのコピー数増幅の範 囲を評価するために使用できる。温度を変化させたＢＳＣ細胞における切り出さ れたプラスミドのコピー数もまたサザンプロット分析を使用して決定されうる。

Ｉｌ、蛋白質の精製 本発明の組換え体骨形成蛋白質を精製するために開発された精製計画は迅速で高 い効果を示す。プロトコルは３つのクロマトグラフィーステップ（Ｓ−セファロ ース、フェニルセファ０−スおよびＣ−１８ＨＰＬＣ）を含み、そして約９０％ 純粋なＯＰｌを産生ずる。

０．５％ＦＣ３によって処理されたトランスフェクトされたＢＳＣ細胞の典型的 な２Ｌの調製物において、総蛋白質は７０ｈｇである。ウェスタンプロットによ り見積もられる培地中のＯＰｌ量は約８０μｇである。ＯＰＩ培地は６Ｍ尿素、 ０．０５Ｍ塩化ナトリウム、１３ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，０に希釈され、 そして亜硫酸基を持ちそして強力チオン交換体として働くＳ−セファロースカラ ム上に載せられる。ＯＰＩは低塩濃度でカラムに結合し、そして血清蛋白質は除 去される。カラムは引き続き２段階の塩溶用で展開される。最初の溶出（０，１ Ｍ塩化ナトリウム）は混在物および約１０％の結合したＯＰＩを除去する。そし て残りの９０％のＯＰＩは６Ｍ尿素、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０　ｍＭ　［ ＩＥＰＥＳ、　ｐＨ７，０中に溶出される。

この０，３Ｍ塩化ナトリウム画分に硫酸アンモニウムを加えて、６Ｍ尿素、１Ｍ 硫酸アンモニウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ ７，０の最終的な溶液状態を得る。そしてサンプルをフェニルセファロースカラ ム（疎水性結合クロマトグラフィー）に載せる。ｏＰｌは高濃度の弱いカオトロ ピック塩（例えば、１Ｍ硫酸アンモニウム）存在下においてフェニルセファ０− スに結合させる。ＯＰＩを結合させた後、カラムを、硫酸アンモニウムの濃度を 下げて使用して２段階の溶出で展開する。最初の溶出（０，６Ｍの硫酸アンモニ ウムを含む）は最初に混在物を除去する。そして結合したＯＰＩは硫酸アンモニ ウムを含まない６Ｍ尿素、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、 　ｐｌ　７．０緩衝液で溶出する。

フェニルセファロースカラムから溶出されたＯＰｌを水で透析し、さらに３０％ アセトニトリル（０，１％ＴＦＡ）で透析し、そしてＣ−１８逆相［ＩＰＬＣカ ラムに載せる。第５図Ａ、Ｂ、およびＣは（Ａ　）Ｓ−セファ０−ス、（Ｂ）フ ェニルセファロース、および（Ｃ）Ｃ７１８カラムから溶出したものの（１）ク ロマトグラムおよび（２）ヂチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元後画分のクマシ ー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。酸化されそして還元されたＯＰＩサンプル のゲルによる分離は、還元されたサブユニットが約１８ｋＤの見かけ分子量をも つこと、および第６図に示されるように、ダイマーは約３６ｋＤの見かけ分子量 をもつことを表す。このサブユニットの大きさは、天然源ノｂＯＰの大きさに加 えて、ＣＯ８細胞から精製されたものの大きさとも同一であることか明らかにな った。現在のプロトコルは、ゲルスキャニングにより見積もったところ２Ｌの産 生培地で約３０μｇのＯＰＩ、すなわち約２５％の回収、の収量を得た。

別法のクロマトグラフィープロトコルは、６Ｍ尿素非存在下においてＳ−セファ ロースクロマトグラフィーを行う。そして結合したタンパク質は塩のステップ溶 出（例えば、１００−４００　ｆｆ１Ｍ塩化ナトリウム）で溶出される。ＯＰＩ のほとんどは約３００１Ｍの塩化ナトリウムで溶出される。そして残りのＯＰＩ はさらに６Ｍ尿素存在下の３００　ｍＭの塩化ナトリウムで溶出されうる。１段 階で最大の回収を達成するために、尿素を使用しない溶出に代えて６Ｍ尿素の溶 出を使用してもよい。

ＯＰＩはまたヒドロキシアパタイトに効果的に結合する、ただし６Ｍ尿素非存在 下および低リン酸濃度（リン酸５ｃＭ以下）においてのみである。結合したＯＰ Ｉは、ＩＩＭから０．５Ｍのステップ溶出（０，５Ｍ塩化ナトリウム、５０　ｍ Ｍ　ＴｒｉｓＳｐＨ７，０中で）でカラムから除去されつる。ＯＰＩは約２５０ 　ｔ＋Ｈのリン酸で溶出される。さらに、溶出ステップの間に尿素（６Ｍ）を加 えてもよい。

他の関連したクロマトグラフィ一方法もまた哺乳動物細胞系からＯＰｌを精製す るのにを用である。例えば、ヘパリンセファロースをＳ−セファロースカラムと 組み合わせて使用できる。あるいは、Ｃｕ”″−固定化金属イオン親和性クロマ トグラフィー（ＩＭＡＣ）は、６Ｍの尿素を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）中 でＯＰＩを結合するＩＩｌ、マトリックスの調製 本発明の実施には骨、好ましくは哺乳動物、例えばウシの骨の入手性を必要とす る。骨を洗浄し、骨髄を取り除き、脱脂され、脱イオン化され、適当な大きさの 粒子に砕かれ、可溶性蛋白質を除去するために抽出され、殺菌され、そしてさま ざまな臨床の使用に有用な移植できる材料を生産するようなここに開示されたよ うな方法で処理される。

本発明の材料から製造されたさまざまな形のマトリックスはさまざまな目的で外 科的に移植される。これらの目的中の主要なものは、さまざまな整形法の、歯周 の、および再構成の方法における骨の形成のマトリックスとして、徐放剤のキャ リアーとして、あるいは移植片のためのコラーゲン性コーティング剤として働か せることである。マトリックスは外科手術において期待される所望の形とし、あ るいは外科手術の間の医者あるいは技術者により型づくられてよい。すなわち、 局所性の、皮下の、腹腔内の、あるいは筋肉内の移植片として使用できる。骨折 の癌着不良を補うようにあるいは骨の欠失を満たすように型づくられる。骨の形 成あるいは誘導方法において、材料はゆっくりと体に吸収されそして移植片の形 であるいはほとんど移植片に近い形で骨と置き換えられる。

さまざまな成長因子、ホルモン、酵素、治療用組成物、抗生物質、および身体に 処理する他の薬剤もまた、キャリアー物質に吸収させそして移植すると、マトリ ックスの材料がゆっくりと吸収されるにつれて時間をかけて放出させる。こうし て、ＥＧＦ、　ＰＤＧＦ、　ＩＧＦ、　ＦＧＦ、　ＴＧＦアルファ、およびＴＧ Ｆベータのようなさまざまな既知の成長因子をｉｎ　ｖｉｖ□において吸収させ つる。材料は化学療法剤、インスリン、酵素、あるいは酵素の阻害剤を放出させ るために使用されうる。

本発明の材料をいかにして作るかおよび使用するかの詳細を以下に開示する。

１、　脱イオン化された骨の調製 脱イオン化されたウシの骨のマトリックスは、以前に公表された方法により調製 される（Ｓａｍｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ　（１２９８３）　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　８０：６T９１−６５ ９５）。ウシの骨幹（１−１０日齢）は屠殺場から得られ新鮮なうちに使用され る。骨は筋肉と脂肪を取り去り、骨膜を洗い、冷水による水圧で骨髄を取り除き 、冷やした無水アルコールに浸し、そして−２０℃で貯蔵する。そして乾燥しそ して破壊により断片化しそして大きな製粉機により粉にされる。注意を要するこ とは液体窒素を使用することにより発熱を防ぐことである。粉にされた骨は７０ −８５０μ臥好ましくは１５０μｍ−４２０μ酊の範囲の粒子の大きさの粉にさ れ、そして３倍容のクロロホルムおよびアルコール（３：１）で約２時間、２度 洗浄することにより脱脂する。そして微粒子状の骨を等容の無水アルコールで洗 浄し、そして脱脂された骨の粉を生じさせるために等容の無水エーテルで乾燥さ せる。そして脱脂された骨の粉を１００倍容０．５　Ｎ　ｌｌＣｌで４℃におい て４０分間、４回連続して処理して脱イオン化する。最後に、中和のための洗浄 を大量の水を用いて脱イオン化された骨の粉に行う。

２、グアニジン抽出 このようにして調製された脱イオン化された骨のマトリックスは５倍容の４Ｍグ アニジン−ＨＣｌ、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，０で１６時間 ４℃において抽出される。懸濁液をフィルターでこす。不溶性の物質を集めそし てマトリックスを組み立てるのに使用する。この物質は基本的に大部分コラーゲ ン性であり、それは骨形成および軟骨形成活性を持たない。

３、　マトリックスの処理 すべての骨のマトリックスの主要な成分はＴｙｐｅ−Ｉコラーゲンである。コラ ーゲンに加えて、上で開示されたように抽出された脱イオン化された骨は総量の ５％の割合を示す非コラーゲン性蛋白質を含む。異種性のマトリックス中の、こ れらの非コラーゲン様蛋白質はそれ自身潜在的な抗原として存在し、そして免疫 原性および／あるいは阻害成分を構成する。そのような成分は同種型の移植片に おいてもまた、骨の分化の発生カスケードを妨げることにより骨形成を阻害する 。マトリックス粒子をコラーゲン繊維修飾剤で処理することにより、潜在的に望 ましがが変えられる事が本発明により見いだされた。

今日最も好ましい繊維修飾剤は加熱した水性溶媒で、最も好ましくは水である。

さまざまな量の脱脂され、脱イオン化されグアニジンで抽出された骨のコラーゲ ンを湯浴中のガラスのフラスコで一定の速度で撹拌しながら水中（１ｇ／３０　 ｍｌ）で加熱し、そして指示された温度において１時間保つ。幾つかの例におい ては、水は加熱前にコラーゲンを膨張させることを助けるために０．１Ｍ酢酸で 置き換えられる。温度は室温、および約３７℃、４５℃、５５６．６５″、７５ °において一定に保たれる。熱処理後、マトリックスをフィルターで濾過しそし て凍結乾燥して移植に使用する。

マトリックス材料の形態に対するお湯の処理の効果は第６図と第１図の光学顕微 鏡写真の比較から明らかである。第６図は（ａ）　３７℃、（ｂ）　４５℃、（ ｃ）　５５℃、（ｄ）６５℃において処理された、効果的に変化したコラーゲン の表面の形態を表す。第１図の光学顕微鏡写真は非処理のラットおよびウシの骨 のマトリックスの形態を表す（それぞれＡ、およびＢ）。写真から明らかなよう に、お湯の処理は粒子の表面の微小なくぼみの程度を少なくとも約１０倍増加さ せ、実質的に粒子の多孔性をも増加させる（第１図のＢおよび第５図のＣ，Ｄを 比較せよ）。マトリックス粒子のこの形態の変化は実質的に粒子の表面積を増加 させる。穴およびくぼみの大きさを注意深く測定すると、マトリックス粒子への 熱い水性溶媒の処理は１μｍから１００μｌの範囲の粒子の穴およびくぼみの直 径を生じさせることが明らかである。

お湯の処理により産生された抽出物の特性から、この処理はまたそのマトリ・ソ クス中への共存がｉｎ　ｖｉｖｏにおいて新しい骨の形成を妨げるような成分を 除去していることも明らかにしている。第８図はお湯で処理したウシのマトリッ クスから単離された抽出物の２１４　ｎｍにおける吸光のトレースであり、それ ぞれのピーク（もしくは画分）のｉｎ　ｖｉｖｏの骨の形成に対する効果を示す 。

大スケールの調製作業（１００ｇウシマトリックス、お湯処理）からの抽出物を 集め、０．１％ＴＦ＾により酸性化し、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｄｅｌｔａ 　Ｐｒｅｐ　Ｃａｒｔｒｉｇｅを使用してＣ−１８ＨＰＬＣカラムで測定した。

画分を２５　ｍｌ／分の流速で５０］Ｌの間隔で集め、適当にプールしてトレー スされた各ピークを分離した。そしてこれらの画分のそれぞれを組換え体ＯＰ１ および適切なラットのマトリックスキャリアー（後記参照）とともに移植し、そ してその骨形成活性に対する効果を測定した。第１２画分のみが、同種型の移植 における骨の形成を阻害するようである。その阻害活性は用量に依存するようで ある。このピークに存在する阻害成分の除去は異種性の移植における骨形成活性 の維持に必要である可能性がある。第９図は１２日口の移植片においてアルカリ ホスファターゼ活性およびカルシウム含有量で調べた、お湯で処理されたマトリ ックスからの完全な溶剤抽出物の骨形成活性に対する影響を表す。どのような抽 出も行われないで移植されたラットのキャリアーマトリックスおよびＯＰＩをポ ジティブコントロールとして使用する。お湯で処理されたウシのマトリクス１０ ０グラムから得られた溶剤抽出物を蒸発させそして６Ｍの５０％アセトニトリル １０．１％ＴＦＡ中に溶解させた。その１００−３００μｌのアリコートを既知 量の組換え体ＯＰＩ、および２５　ｃｇのラットマトリックスキャリアーと混合 し、そしてアッセイした（以下を参照せよ）。結果は抽出惣が用量に依存して新 しい骨の形成を阻害することを明らかに示している。

繊維修飾剤に接触させた後、処理されたマトリックスを、以下の手続きの形にし たがって洗浄し、どのような抽出成分をも除去する：１、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝 塩）にＩｇ／２００ｍ１で懸濁させそして４℃において２時間撹拌する：あるい は６Ｍ尿素、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　５００　ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ ７，０（ＵＴＢＳ）あるいは水に懸濁させそして室温ＣＲＴ）で３０分間撹拌す る（ｐｆｌ値を中和状態にするのに十分な時間）： ２、　遠心しそして洗浄ステップを繰り返す、そして３、　遠心して：上清を捨 てて、残渣を水で洗い：そして凍結乾燥する。

他の有用な繊維修飾剤はトリフルオロ酢酸およびフッ化水素のような酸、および ジクロロメタン、アセトニトリル、イソプロパツール、およびクロロホルムのよ うな有機溶媒およびそれらの薬剤の組み合わせを含む。これらの他の繊維修飾剤 を使用したマトリックスの処理は、これらの繊維修飾剤が脱イオン化され、グア ニジン抽出された骨のコラーゲン粒子に対して及ぼす効果の詳細な物理的な分析 とともに、米国特許出願第４２２．６１３号（１，９８９年１０月１７日出願） に開示され、その開示は引用により本明細書に含まれる。

コラーゲンのマトリックスの材料は、好ましくは水に不溶性の、非接着性粒子か らなる微粉末の形をとる。新しい骨の成育あるいは持続した放出が望まれる所で 単に所定の容積に圧縮して、周辺組織によってその場所に保持して使用される。

あるいは、この粉末は身体に素早く吸収されるような例えば、ゼラチンあるいは ポリ乳酸コーティングのカプセルに入れてもよい。この粉末は与えられた寸法の 容積に形づくりそして該粒子を例えば可溶性の、種に関して生物的に適合できる コラーゲンを使用して内部接着することによりその形状に維持することもできる 。この粉末材料はまたシート状、棒状、ビーズ状、あるいは他の肉眼で見える形 につくることもできる。

ＩＶ、骨形成具の構成 上で説明されたような組換え体蛋白質および他の構成物は以下に記述される任意 の方法を用いて、適当なマトリックス調製物中に混合および分散させうる１、　 エタノール沈殿 マトリックスをグアニジン−塩酸に溶解している骨形成蛋白質に加える。サンプ ルを回転運動により撹拌して低温においてインキュベートする。そしてサンプル をさらに回転運動により撹拌する。混合物に冷たい無水のエタノールを加え、撹 拌およびインキュベートする。遠心後（微量遠心管、高速）上清を除去する。マ トリックスを、冷やした濃縮エタノール水溶液により洗浄し、そして凍結乾燥す る。

２、　アセトニトリル　トリフルオロ酢酸での凍結乾燥この方法において、アセ トニトリル　トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液中の骨その後凍結乾燥す る。骨形成蛋白質をさまざまな濃度で、そして幾つかの精製段階において加える 。この方法は今日好まれている。

３、　尿素での凍結乾燥 尿素緩衝液中において調製された骨形成蛋白質については、蛋白質をマトリック ス材料と混合し、何度も渦響き撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材 料は”そのまま“移植に使用される。

４、　１１衝化塩溶液からの凍結乾燥 生理学的塩溶液中のＯＰＩの調製物もまたマトリックスを渦巻き撹拌しそして骨 形成活性のある材料を生産するために凍結乾燥する。

これらの方法はまた、持続された放出の目的のために他の活性のある治療剤、ホ ルモン、およびさまざまな生物的に活性のある成分を吸着させるために使用され うる。

さまざまなマトリックスのｊ！！能はｉｎ　ｖｉｖｏにおけるラットのバイオア ッセイにより評価される。ラットにおける研究は、適切なマトリックス中での骨 形成の効果が、マトリックス内に分散された骨形成蛋白質の量に依存しているこ とを示している。もしもマトリックスだけが移植されたならば、活性は観察され ない。もしも上に開示されたように処理されずに移植されたときは、文献に記述 されたタイプの脱イオン化され、グアニジン抽出された異種性の骨マトリックス 材料はキャリアーとして効果がなく、骨を誘導できず、そして炎症性の免疫応答 を生じる。

多くの同種型マトリックス材料もまたキャリアーとして有効でない。以下は、対 照マトリックスおよび上で述べられたように調製されたマトリックス材料がら骨 形成具を作成するために、およびそれらの骨形成の利用性を評価するためにさま ざまな方法を示す。

移植 本明細書に引用して取り入れられている、Ｓａｍｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ （Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８３）　８０ ：　６５９１−６５９５）により記述されている骨の誘導のバイオアッセイは、 軟骨性骨の分化の活性を監視するために使用できる。このアッセイは、エーテル の知覚麻痺下における受容ラットの皮下部位への異種性のウシ試験サンプルを移 植することからなる。オスのＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット、２８−３２日齢、を 使用した。水平な切れ込み（１ｃｍ）を胸部の領域の上の皮膚に滅菌状態でつく り、そしてくぼみを鋭い切開によりつくる。約２５ｍｇの試験サンプルをくぼみ の中に深く移植しそして切れ込みを金属製の皮膚クリップで閉じる。移植の日を 実験の日と呼ぶ。移植片は１２日目に除去した。従属栄養の部位は、独立栄養部 位の使用により起こりうるあいまいさなしに骨の誘導の研究を可能とする。

縄胞例父化 移植の成功は、（１）−８目の多核性白血球による一過的な浸潤：（２〕二日目 および三日月の開先組繊細胞の遊走および増殖、（３）三日月および六日目の軟 骨細胞の出現、（４）七日目の軟骨のマトリックスめ形成：（５）へ日目の軟骨 のカルシウム沈着、（６）九日目および十日目の血管の侵入、遺骨細胞の出現、 および新しい骨の形成、（７）十二日目から十へ日目の遺骨細胞および骨の改造 の出現および移植されたマトリックスの溶解、そして（８）二十−日目の小骨に おｌする造血骨の骨髄分化を含むマトリックス誘導軟骨性骨の発育の段階を経由 して制御された発達をもたらす。その結果は、新しい骨の形は移植されたマトリ ックスの形をとるということを表す。

組織学的μ評腸 組ｍ字切片の作成および染色が、移植片の骨形成の程度を決定するために好まし い。移植片をブアン溶液で固定し、パラフィンで包み、そして６−８μ酊の切片 に切断する。トルイジノ　ブルーあるいはヘモトキシリン／エオシンによる染色 は軟骨性骨の究極的発育を明らかに証明している。十二日目の移植片は、移植片 が新しく誘導された骨を含んでいるかどうかを決定するのに通常十分である。

工惣学幻ヱニ左ニ アルカリ　ホスファターゼ活性は骨形成のマーカーとして使用できる。この酵素 活性は移植片のホモシエナイズ化の後に、分光光度法により測定できる。活性は ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて９−１０日目に最大に達しそしてその後ゆっくりと減少 する。組織学的な検査で骨の形成を示さない移植片は、この分析条件において、 はとんどあるいは全くアルカリホスファターゼ活性を示さない。この分析は移植 片がラットから除去された後に、素早く骨形成の評価を得ることおよび定量する ことに有用である。あるいは、骨の形成量は移植片のカルシウム含有量を測定す ることにより決定され得る。

ル 種々の細胞源からのおよび種々の程度に精製された（１−５％純粋から３０−９ ０％純粋）ＯＰＩで、約２５ｍｇのマトリックスを使用して上述のようにｉｎ　 ｖｉｖｏにおいて骨形成活性を試験した。以下の表ＩＩＩは全部の３つの細胞タ イプにおいて発現されたＯＰＩの組織学的な点数を示す。

表ｌｌｌ Ｂ５Ｃ４０−ｔｓ＾５８　１８ｋＤａ＊　３２．５　５０６５．０　４０ １３０、　０　８０ ２６０．０　１００ １６ｋＤａ”　１２．５　２０ ２５．０　５０ ５０．０　８０ １００．０　１００ ２００．０　１００ ＣＨＯ１６−２０ｋＤａ’　５０．０　９０１００．０　９０ ２００．０　１００ ＣＯ５１８ｋＤａ’　２５．０　１０ ５０．０　３０ １００．０　９０ ２００．０　９０ １０−３０％　中程度の骨形成 ３０−８０％　広範囲な骨形成 ８０％以上：　造血性骨髄の新たな出現の兆候を表す。

ネ　７０−９０％　純粋 ＋　３０−４０％　純粋 ゛　鴎純粋以下 ↑イムノプロットあるいはゲルスキャニングにより評価された表ＩＩＩに詳細に 示されている組織学的点数は、ＯＰＩが細胞源にかかわらず活性をもち、そして その活性は天然のウシＯＰＩににているということを表す。

骨誘導活性は高度に再現性があり、回置に依存している。組換え体ＯＰＩの骨形 成活性のさらなる証明は第１０図および１１図の写真により提供される。

第１０図Ａ−ＦはＣＯ５，ＢＳＣ，およびＣＯ３細胞から発現された組換え体ｏ Ｐ１を使用した同種型の移植片の組織を記録した写真である。マイクログラフ（ ２２０Ｘに拡大）は本発明の骨形成蛋白質により誘導された完全な発生カスケー ドの図による証明を提供し、このことはマトリックスと一緒に移植されたときに 、紐換え体により生産されたＯＰＩだけで軟骨性骨の形成を誘導するのに十分で あることを確認するものである。第】０図Ａで証明されたように、ＯＰＩを含ま ない同種型の移植片は移植後１２日目に新しい骨の形成を示さない。移植された 骨のマトリックス（酊）および周辺の開光組織だけが見られる。逆に、ＯＰＩを 含んだ移植片は移植後７日目に既に広範囲な軟骨形成の証明を示している（第１ ０図Ｂ、　５５０　ｎｇ　Ｒ３Ｃ生産蛋白質、３０％純粋）。ここで、新しく形 成された軟骨、軟骨芽細胞（Ｃｂ）、軟骨細胞（Ｃｙ）はマトリックス（ｌｌ） にぴったりと接触している。９日目の移植片の軟骨の分化により、軟骨のカルシ ウム沈着、軟骨細胞の肥大、欠陥の侵入、および新しい骨の形成の開始が全て明 らかになった（第１０図Ｃ，２２０ｎｇｃＯ５生産蛋白質、約５％純粋）。キャ ピラリーの侵入（ｃ）および血管内皮の近くの好塩基性の遺骨細胞の出現（矢印 で示された）は特に明らかである。移植の１２日後までに広範囲な骨形成および 改造がおきた（第１０図Ｄ　（２２０Ｘ）、および１０図Ｅ　（４００ｘ）、　 ＣＢＯ生産蛋白質、約６０％純粋）。遺骨細胞によりつくられて新しく形成され た骨は多核の遺骨細胞（ＯＣ）により改造されつつあり、移植されたマトリック スは再吸収されつつあり、そして改造された骨により取り替えられつつある。新 しく形成された小骨の骨の骨髄の出現もまた明らかである。最後に、小骨内部の 造血骨の骨髄の分化は、移植後２２日目に観察され得る（第１０図Ｆ、５００　 ｎｇのＢＳＣ生産蛋白質、３０％純粋）。このときまでに、はとんどの移植され たマトリックス（ｎ）は再吸収されそして赤血球および顆粒細胞系および巨核細 胞を含んだ骨の骨髄の要素で満たされた小骨を含む新しく形成された骨により占 められている。同様な組織学的な観察が、９０％よりも純粋なＯＰＩ蛋白質の調 製物を取り込んだ移植片でも見られた。

第１１図はお湯で処理されたウシマトリックスおよびＯＰ　１　（ＢＳＣで生産 された）を使用した異種性の移植片の移植後１２日目の組織学を表す顕微鏡写真 である。造血骨の骨髄の要素の出現は、ＯＰＩをもちいた異種性移植の骨形成活 性が同種型の移植のそれとパラレルである事を表す、マイクロ写真において明ら かである（第１１図と第１０［ＮＤおよびＩＯ図Ｅを比較せよ）。

ＯＰＩのマトリックスの移植により示されそして第１０図および１１図において 明らかにされた細胞の変化は、胎児の発生の間に起こる軟骨性骨の分化に本当に にている。軟骨性骨の分化は優勢なルートであったが、移植片の外側の表面の膜 内部の骨の形成の証明もある。

第１２図および第１３図は本発明の同種型の移植片（第１２図）および本発明の 異種性移植（第１３図）のアルカリホスファターゼ特異的活性およびカルシウム 含有量により決定されるような、移植後１２日目の骨形成活性の用量依存性を表 す。すべての場合において、ＯＰＩ蛋白質の濃度（イムノプロット染色あるいは ゲルスキャニングにより定量された）はナノグラムで表されている。それぞれの 場合において、骨の誘導活性はすべての細胞において用量依存的にＯＰＩに対し て特異的である。

本発明はその精神または必須の特性から離れることない他の特定の形で具体化さ れうる。したがって本明細書中の態様はすべての面において例示的な限定されな いものとして考えられ、本発明の範囲は前述の記述よりむしろ添付された請求の 範囲により決定され、請求の範囲と均等の目的および範囲内において生じるすべ ての変化はしたがってここに包含されることを意図されている。

配列リスト （１）　一般的な情報 （１）　出願人二才ソペルマン、ヘルマン（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ、　Ｈｅｒｍａ ｎｎ）クベルザンパス、サンガベル（Ｋｕｂｅｒａｓａｒｎｐａｔｂ、丁ｂａｎ ｇａｖｅｌ　）ルエガー、デビット（Ｒｕｅｇｅｒ、　Ｄａｖｉｄ）　Ｃオズカ イナック、エンギン（Ｏｚｋａｙｎａｋ、　Ｅｎｇｉｎ）パンダ、ロイ　（Ｐａ ｎｇ、　Ｒｏｙ）　Ｅ、　Ｌ。

（ｉｉ）　発明の名称、骨形成具 （ｉｉｉ）配列の数、７ （１ｖ）代理人住所・ （Ａ）受信人−ラバイブ　アンド　コックフィールド（Ｌａｈｉｖｅ　＆　Ｃｏ ｃｋｆｉｅｌｄ）（Ｂ）通り＝６０ステート　ストリート　（６（ｌ　５ｔａｔ ｅ　５ｔｒｅｅｔ）（Ｃ）市　ボストン （Ｄ）州　マサチューセッツ （Ｅ）米国 （Ｆ）郵便番号　０２１０９ （Ｖ）　コンピューターの判読可能な型：（＾）媒体の型：ディスク、３．５イ ンチ、７２０　ｋｂ貯蔵 （Ｂ）　ｍｌンビューター：　ｒＢｌｌ　ＸＴ（Ｃ）操作シフ、テＬ　：　ＤＯ ３３，３Ｔ］（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト５０（ｖｌ）出願データ （Ｂ）出願臼：　１９９０年８月２０日（ｖｉｉ）先の出願のデータ （Ａ）出願番号　Ｕｓ　４２２．６９９（Ｂ）出願臼：　１９９０年１０月１７ 日（Ｃ）出Ｈ番号−υＳ　４８３．９１３（Ｄ）出願臼　１９８９年２月２２日 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１の情報：（ｉ）配列の特性・ （Ａ）長さ＝　１３９アミノ酸 （Ｂ）型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）分子の型・蛋白質 （ｉｘ）配列：　ＳＥＱ、ＩＤ　Ｎｏ、１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（７ ）情報。

（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ二　１３２アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｘ）配列：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２：Ｓｅｒ　Ｇｌｎ Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　ＧｌｎＰ ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　ＡｌａＴｈ ｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ７５　 ８゜ Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　ＩＩｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｎＬｅ ｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｅａｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＡｓｐ 　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＣｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ。

（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１７）情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１１９アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｘ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓ ｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ 　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｃｙｓ工１ｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　 Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＴｙｒＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃ ＹＳ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＨ ｉｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＨｉｓＡｌ ａ　工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｓｐＡｓｐＳｅｒ　 Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ（２）ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：４の情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ　１１７アミノ酸 （Ｂ）型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子の型・蛋白質 Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ工１ｅ　Ａｌａ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＴｙｒＬｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅ ｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＰｈｅ　工１ｅ　Ａｓｎ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＡｌａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ５の情報・（１）配列の特性： （Ａ）長さ・　１１６アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）分子の型　蛋白質 （ｉｘ）配列：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：５：Ａユａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕ　ＡｓｎＨｉｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　ＶａＩ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａ ｌ　Ｈ１ｓ（Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｘｉ）　ｉｉｆ、、３１）　：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：Ｖａｌ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＧｌｎＡｒｇ　Ｇｉｎ　Ａ ｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　ｒｌ、ｅｕｌｏ　１５ Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＴｒｐＧ ｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　工１ｅ　ＩＩｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＴｙ ｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　’ＧｌｕＣｙ ｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　ＭｅｔＡｓｎ 　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎ５５６゜ Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ６ ５７゜ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒ。

７５８゜ Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ８ ５９゜ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＩｌｅＬ ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌｌｏ ｏ　１１０ ５Ａｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　。

（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアの情報：（ｉ）配列の特性゛ （Ａ）長さ：１８．２２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティヵル： なし くｉｖ）アンチセンス・なし くｖｉ　）起源： （Ａ）生物名：ウシ （Ｂ）組織の種類：骨 （ｖｉｉ）直接の起源・ （Ａ）ライブラリー名・ヒト胎窟 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：ＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧ　ＡＧＣＣＣＧＧＧＴＡ　ＧＣＧＣＧＴＡＧＡＧ　４０ＣＣＧＧＣＧＣ Ｇ　ＡＴＧ　ＣＡＣＧＴＧ　ＣＧＣＴＣＡ　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　 ７５Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌ ａＧＣＧ　ＣＣＧ　ＣＡＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣＴＧＧ　ＧＣＡ 　ＣＣＣ１０８ＣＡＣＡＡＣＴＣＧ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＴＧ　ＴＴＣＡＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＣＣＴＧ　３０６ＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＡ Ｇ　ＧＡＧ　ＧＧＣＧＧＣＧＧＧ　３３９ＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＧ　ＧＧＣＴ ＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＧ　３７２ＧＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧＴ　ＡＣ ＣＣＡＧ　ＧＧＣＣＣＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＧＣＣ４０５Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ 　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｌａｌｌｏ　 １１５ ＡＧＣＣＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＡＧＣＣＡＴ　ＴＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＧＣ Ｃ４３８ＧＡＣＡＴＧ　ＧＴＣＡＴＧ　ＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧ 　ＧＡＡ　４７１ＣＡＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＣＡ　 ＣＧＣＴＡＣＣＡＣ５０４ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＧＡＧ　ＴＴＣＣＧＧ　ＴＴＴ　Ｃ ＡＴ　ＣＴＴ　ＴＣＣＡＡＧ　ＡＴＣ５３７ＣＣＡ　ＧＭ　ＧＧＧ　ＧＭ　ＧＣ Ｔ　ＧＴＣＡＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＧＡＡ　ＴＴＣ５７０ＣＧＧ　ＡＴＣＴＡＣ ＭＧ　ＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＧＧ　ＧＡＡ　ＣＧＣＴＴＣ６０３ＧＡＣＡＡＴ　 ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＴＴＣＣＧＧ　ＡＴＣ−ＡＧＣＧＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　６３ ６ＧＴＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＣＴＴＧ　ＧＧＣＡＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣ Ｇ　ＧＡＴ　６６９ＣＴＣＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＣＧＡＣＡＧＣＣＧＴ　ＡＣＣＣ ＴＣＴＧＧ　ＧＣＣ７０２Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　 Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　ＡｌａＴＣＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＴＧ Ｇ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　Ｔｒｒ　ＧＡＣＡＴＣＡＣＡ　７３５Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＧＣ ＣＡＣＣＡＧＣＭＣＣＡＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＡＴ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　７ ６８Ａｌａ　ＴｈｒＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ 　Ｐｒｏ　ＡｒｇＣＡＣＡＡＣＣｒＧ　ＧＧＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＣＧ　 ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　８０１Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＣＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡ Ｇ　ＡＧＣＡＴＣＡＡｃ　ｃｃｃ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＧＣＧ　８３４ＧＧＣＣＴ Ｇ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＡＣＧＧＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＡＧ　８ ６７ＣＡＧ　ＣＣＣＴＴＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＴＴＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＣ ＣＡＣＧ　９００Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＴｈｒＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＡＴ ＣＣＧＧ　ＴＣＣＡＣＧ　ＧＧＧ　９３３ＡＧＣＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＧＣＡＧＣ ＣＡＧ　ＡＡＣＣＧＣＴＣＣｋＡＧ　ＡＣＧ　９６６ＣＣＣＡＡＧ　ＡＡＣＣＡ Ｇ　ＧＡＡ　ＧＣＣＣＴＧ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣＡＡＣ９９９ＧＴＧ　ＧＣ Ａ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　１０３ ２Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ 　Ａｒｇ　Ｇ１ｎＧＣＣＴＧＴ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＡ Ｔ　ＧＴＣＡＧＣＴＴＣ１０６５Ａｌａ　、Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　 Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＣＧＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＧ ＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣＴＧＧ　ＡＴＣＡＴＣＧＣＧ　１０９８ＣＣＴ　ＧＡ Ａ　ＧＧＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　１１３１ ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＧＣＣＴＴＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣ’ｒｃｃ　ＴＡＣＡＴＧ 　ＡＡＣ１１６４ＧＣＣＡＣＣＭＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧ　ＣＡＧ　ＡＣＧ 　ＣＴＧ　ＧＴＣ１１９７ＡＩａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　 Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａ１ＣＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＣＧ　Ｇ ＡＡ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＣＣＣＡＡＧ　ＣＣＣユ２３０Ｈｉｓ　Ｐｈｅ工ｌｅ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

ＴＧＣＴＧＴ　ＧＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＡＡＴ　ＧＣＣＡＴＣＴ ＣＣ１２６３ＧＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＣＧＡＴ　ＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＧＴ ＣＡＴＣ１２９６ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＭ　ＴＡＣＡＧＡ　ＡＡＣＡＴＧ　ＧＴＧ 　ＧＴＣＣＧＧ　ＧＣＣ１３２９ＴＧＴ　ＧＧＣＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣ？ ’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧ　ユ３６１Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　１（ｉｓ ＡＣＣＣＴＴＴＧＧＧ　ＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴ　ＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴ　ＣＣＡ ＴＴＧＣＴＣＧ　１４０１ｃｃｒｒｃｃｃｃｘｃ　ＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧ　ＡＣ ＣＡＡＣＴＧＣＣＴＴＴｒＧＴＧＡＧＡ　１４４１ＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴ ＡＴＣＣＣＣＡ　ＡＣＴＴＴＡＭＧＧ　ＴＧＴＧＡＧＡＧＴＡ　１４８１ＴＴＡ ＧＧＡＡＡＣＡ　ＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴ　ＡＴＧＧＣＴＴＴＴＧ　ＡＴＣＡＧＴ ｒＴＴＴ　１５２１ＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡ　ＣＡＡＧＡＴ ＣＣＴＡ　ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣ１５６１ＡＧＧＣＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＡＧＧ ＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＧＣＡτ黒ω倶　１６０１ＡＡＡＴＧＧＣＣＧＧ 　ＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴ　ＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡ　ＧＴＣＴＣＡＧＣＣＡ　１６ ４１ＴＧＣＡＣＧＧＡＣＴ　ＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡ　ＧＧＴＡＡＴＴＡＴＧ　Ａ ＧＣＧＣＣＴＡＣＣ１６８１ＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡ　ＣＡＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧ ＴＧＣＧＡＡＡＧ　ＧＡＡＭＴＴＧＡＣ１７６１ＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴ ＡＡＴＡＡＡ　ＴＧＴＣＡＣＡＡＴＡ　ＡＡＡＣＧＡＡＴＧＡ　１８０１ＡＴＧ ＡＡＡＡＡＡＡ　λυいＡ入υい五Ａ　１Ｂ２２浄８（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　４ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ｕ８　Ｅ、　Ｅ２ｕＥｉｌ　Ｅ、、　Ｅ、２＄５１５　Ａ−２茅５ＷＪ　Ｂ−２ 等５図Ｃ−２ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７Ａ ＦＩＧ、　７Ｂ 浄ｉＦ（内容に変更ない ＦＩＧ、　１０Ａ ＦＩＧ、　１０Ｂ ＦＩＧ、　ｌ０Ｃ ＦＩＧ、　１０Ｄ ＦＩＧ、　１０Ｅ ＦＩＧ、　１０Ｆ ＦＩＧ、Ｉｌ 国際調査報告 １ｍ１１１Ｍ１．１１１１１１１　Ａ＋＋１Ｍｍｂい、、、ＰＣＴ／１７５９０ １０５９０３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非コラーゲン性蛋白質が除去され、無機質を含まない、脱脂されたＴｙｐｅ Ｉ不溶性骨コラーゲン粒子の生体適合性で、ｉｎｖｉｖｏにおいて生物的に分解 されうるマトリックス；および 下記のアミノ酸配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．６）：ＯＰ１−１６Ｖ 【配列があります】 と十分に近似の２つの酸化されたアミノ酸配列のサブユニットからなり、哺乳動 物宿主細胞中で組換え体ＤＮＡを発現させることにより生産される蛋白質（但し 、上記サブユニットからなる二量体は、上記マトリックス中に含ませて上記哺乳 動物中に移植されるとき哺乳動物に軟骨性骨の形成を誘導することができるよう なコンホメーションを持つ）からなる哺乳動物における移植のための骨形成具。 ２．哺乳動物宿主細胞中で組換え体ＤＮＡから発現され、そして上記マトリック ス中に含ませて上記哺乳動物中に移植されるとき該哺乳動物において軟骨性骨の 形成を誘導することができる骨形成蛋白質であって；下記のアミノ酸配列（Ｓｅ ｑ．ＩＤＮｏ．６）：ＯＰ１−１６Ｖ 【配列があります】 と十分に近似の２つの酸化されたアミノ酸配列のサブユニットからなり、哺乳動 物宿主細胞中で組換え体ＤＮＡを発現させることにより生産される蛋白質（但し 、上記サブユニットからなる二量体は、上記マトリックス中に含ませて上記哺乳 動物中に移植されるとき哺乳動物に軟骨性骨の形成を誘導することができるよう なコンホメーションを持つ）。 ３．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が、下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ ．６）：ＯＰ１−１６Ｖ 【配列があります】 と少なくとも７０％の相同性を示すような請求項１または２に記載の発明。 ４．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が、下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ ．６）：ＯＰ１−１６Ｖ 【配列があります】 と少なくとも８０％の相同性を示すような請求項１または２に記載の発明。 ５．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ． ６）：ＯＰ１−１６Ｖ 【配列があります】 からなる請求項１または２に記載の発明。 ６．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ． １）：ＯＰ１−１８ 【配列があります】 からなる請求項１または２に記載の発明。 ７．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ． ２）：ＯＰ１−１６Ｓ 【配列があります】 からなる請求項１または２に記載の発明。 ８．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ． ３）：ＯＰ１−１６Ｌ 【配列があります】 からなる請求項１または２に記載の発明。 ９．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ． ４）：ＯＰ１−１６Ｍ 【配列があります】 からなる請求項１または２に記載の発明。 １０．それぞれのサブユニットのアミノ酸配列が下記の配列（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ ．５）：ＯＰ１−１６Ａ 【配列があります】 からなる請求項１または２に記載の発明。 １１．上記蛋白質が、酸化されたときにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動における分子量スタンダードとの比較により決定される約３０ｋＤの見かけ分 子量を持つ請求項１または２に記載の発明。 １２．上記蛋白質が、酸化されたときにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動における分子量スタンダードとの比較により決定される約３６ｋＤの見かけ分 子量を持つ請求項１または２に記載の発明。 １３．上記蛋白質がグリコシル化されていない請求項１または２に記載の発明１ ４．上記哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１ま たは２に記載の発明。 １５．上記哺乳動物宿主細胞がサルの腎細胞である請求項１または２に記載の発 明。 １６．非コラーゲン性蛋白質が除去され、約３７℃以上の温度を持つ熱い水性溶 媒によって上記粒子の形態を変えるために十分な時間処理されて、脱イオン化さ れ、脱脂された、ＴｙｐｅＩ不溶性骨コラーゲン粒子からなる生体適合性で、ｉ ｎｖｉｖｏにおいて生物的に分解されうる、哺乳動物に対する移植のためのマト リックス。 １７．上記マトリックスが３７℃ないし６５℃の範囲の温度を持つ熱い水性溶媒 で処理されたものである請求項１または１６に記載の発明。 １８．上記マトリックスが４５℃ないし６０℃の範囲の温度を持つ熱い水性溶媒 で処理されたものである請求項１または１６に記載の発明。 １９．上記マトリックスが上記コラーゲン粒子上の穴および微小くぼみの数を少 なくとも３倍増加させるために処理されたものである請求項１または１６に記載 の発明。 ２０．上記マトリックスが上記コラーゲン粒子上の穴およびくぼみの数を少なく とも１０倍増加させるために処理されたものである請求項１または１６に記載の 発明。 ２１．上記骨コラーゲン粒子が１μｍから１００μｍの範囲の平均直径の穴また はくぼみを有する請求項１または１６に記載の発明。 ２２．上記コラーゲン粒子が７０ｍｍから４２０ｍｍの範囲の平均直径を持つ請 求項１または１６に記載の発明。 ２３．哺乳動物宿主細胞中において組換え体ＤＮＡから発現され、二量体を構成 する２つの酸化されたサブユニットからむり、上記二量体がマトリックスととも に哺乳動物に移植されたときに骨あるいは軟骨の形成を誘発できるような第２図 （Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．７）の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と十分な相 同性を持つ上記サブユニットのアミノ酸配列からなる骨形成蛋白質。 ２４．第８図において示された画分１２の成分が除去されてなる、脱イオン化さ れ、脱脂された、ＴｙｐｅＩの不溶性骨コラーゲン粒子からなる、生体適合性、 ｉｎｖｉｖｏにおいて生物的に分解されうる、哺乳動物における移植のためのマ トリックス。