JP2845346B2 - 骨形成具 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 関連した出願の引例 本出願は“骨形成具”という名称の米国特許出願第42
2,699号（1989年10月17日出願）および“移植のための
骨コラーゲンマトリックス”という名称の米国特許出願
第483,913号（1990年２月22日出願）の一部継続出願で
ある。
2,699号（1989年10月17日出願）および“移植のための
骨コラーゲンマトリックス”という名称の米国特許出願
第483,913号（1990年２月22日出願）の一部継続出願で
ある。
発明の背景 本発明は骨形成具、哺乳動物において新しい骨の形成
を誘導することができる蛋白質をコードする遺伝子、お
よび組み換えDNA技術を用いた哺乳動物におけるこれら
の蛋白質の生産のための方法に関する。本発明はまた、
同種移植あるいは異種の移植に有用なマトリックス物質
および新しい骨の形成を誘導する骨形成蛋白質のキャリ
アーとして働くマトリックス物質、および骨形成具を使
用する骨および軟骨の修復方法に関する。
を誘導することができる蛋白質をコードする遺伝子、お
よび組み換えDNA技術を用いた哺乳動物におけるこれら
の蛋白質の生産のための方法に関する。本発明はまた、
同種移植あるいは異種の移植に有用なマトリックス物質
および新しい骨の形成を誘導する骨形成蛋白質のキャリ
アーとして働くマトリックス物質、および骨形成具を使
用する骨および軟骨の修復方法に関する。
哺乳動物の骨組織はおそらく成長および本来の骨の治
療の間活性があり、軟骨性骨の形成を引き起こす細胞の
出来事の発生のカスケードを誘発しうる、ひとつあるい
は幾つかの蛋白様物質を含むことが知られている。この
活性因子は文献の中で骨形態形成あるいは形態発生蛋白
質、骨誘導蛋白質（bone inductive protein）、骨形成
蛋白質、オステオジェニン、あるいは骨誘導蛋白質（os
teoinductive protein）とさまざまに呼ばれている。
療の間活性があり、軟骨性骨の形成を引き起こす細胞の
出来事の発生のカスケードを誘発しうる、ひとつあるい
は幾つかの蛋白様物質を含むことが知られている。この
活性因子は文献の中で骨形態形成あるいは形態発生蛋白
質、骨誘導蛋白質（bone inductive protein）、骨形成
蛋白質、オステオジェニン、あるいは骨誘導蛋白質（os
teoinductive protein）とさまざまに呼ばれている。
骨の分化の発生のカスケードは間葉細胞の漸増、始原
細胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵入、骨の
形成、改造、および骨髄分化からなる（Reddi（1981）C
ollagen Rel．Res．1:209−226）。
細胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵入、骨の
形成、改造、および骨髄分化からなる（Reddi（1981）C
ollagen Rel．Res．1:209−226）。
これらの表現型形質転換の基礎となる詳細な機構は明
らかではないが、本来の骨マトリックスの軟骨性骨への
分化の活性が分離的に抽出され、そして不活性な残存コ
ラーゲン様マトリックスとともに再構成されて十分な骨
の誘導活性を回復させる（Sam path and Reddi（1981）
Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:7599−7603）。これ
はin vivoにおいて蛋白質抽出物の軟骨性骨を誘導する
活性を分析する実験方法を提供する。哺乳動物の幾つか
の種は種間の移植実験により証明されているような密接
に関連した蛋白質を生産する（Sampath and Reddi（198
1）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:6591−6595）。
らかではないが、本来の骨マトリックスの軟骨性骨への
分化の活性が分離的に抽出され、そして不活性な残存コ
ラーゲン様マトリックスとともに再構成されて十分な骨
の誘導活性を回復させる（Sam path and Reddi（1981）
Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:7599−7603）。これ
はin vivoにおいて蛋白質抽出物の軟骨性骨を誘導する
活性を分析する実験方法を提供する。哺乳動物の幾つか
の種は種間の移植実験により証明されているような密接
に関連した蛋白質を生産する（Sampath and Reddi（198
1）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:6591−6595）。
これらの蛋白質の潜在的な利用性は広く理解されてき
た。その蛋白質の有用性は整形法の薬、ある種の形成外
科、および歯根膜および脳顔面頭蓋の再生方法に大変革
をもたらすと予期されている。
た。その蛋白質の有用性は整形法の薬、ある種の形成外
科、および歯根膜および脳顔面頭蓋の再生方法に大変革
をもたらすと予期されている。
これらの蛋白質画分の観察された特性は、骨形成に必
須な純粋の因子を単離し同定するために幾つかの研究室
における精力的検索の努力を誘発してきた。哺乳動物の
骨からの骨形成蛋白質の精製技術の現在の状況はサンパ
ス（Sampath）ら（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA
80により開示された。ウリスト（Urist）ら（1984）P
roc．Soc．Exp．Biol．Med．173:194−199は、塩化カル
シウム−尿素無機−有機溶液混合物により脱イオン化さ
れた皮質性の骨から抽出され、そして塩酸グアニジンで
の分別沈殿および調製用ゲル電気泳動により回収された
ヒト骨形成蛋白質画分を開示している。著者はその蛋白
質画分が酸性ポリペプチドからなるアミノ酸組成および
17−18kDの範囲の分子量をもつことを報告している。
須な純粋の因子を単離し同定するために幾つかの研究室
における精力的検索の努力を誘発してきた。哺乳動物の
骨からの骨形成蛋白質の精製技術の現在の状況はサンパ
ス（Sampath）ら（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA
80により開示された。ウリスト（Urist）ら（1984）P
roc．Soc．Exp．Biol．Med．173:194−199は、塩化カル
シウム−尿素無機−有機溶液混合物により脱イオン化さ
れた皮質性の骨から抽出され、そして塩酸グアニジンで
の分別沈殿および調製用ゲル電気泳動により回収された
ヒト骨形成蛋白質画分を開示している。著者はその蛋白
質画分が酸性ポリペプチドからなるアミノ酸組成および
17−18kDの範囲の分子量をもつことを報告している。
ウリスト（Urist）ら（1984）Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA 81:371−375は酸性ポリペプチドで約18kDの分
子量という特性をもつウシの骨形態形成蛋白質抽出物を
開示している。著者はその蛋白質がヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィーにより分離された画分に存在し、
マウス後部筋肉における骨の形成およびラットおよびイ
ヌの頭蓋中の管錘欠損における骨の再生を誘導すること
を報告した。骨からの抽出物を得るこれらの方法は十分
に限定されない不純な調製物を与える。ヨーロッパ特許
出願第148,155号（1985年10月７日公開）はウシ、ブタ
およびヒトの系統に由来する骨形成蛋白質を開示するこ
とを目的としている。発明者によりP3蛋白質と命名され
た22−24kDの分子量の蛋白質のうちの一つが本質的に均
質な状態に精製された事が示されている。この物質は哺
乳動物に移植されたとき、骨の形成を誘導すると報告さ
れている。
i．USA 81:371−375は酸性ポリペプチドで約18kDの分
子量という特性をもつウシの骨形態形成蛋白質抽出物を
開示している。著者はその蛋白質がヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィーにより分離された画分に存在し、
マウス後部筋肉における骨の形成およびラットおよびイ
ヌの頭蓋中の管錘欠損における骨の再生を誘導すること
を報告した。骨からの抽出物を得るこれらの方法は十分
に限定されない不純な調製物を与える。ヨーロッパ特許
出願第148,155号（1985年10月７日公開）はウシ、ブタ
およびヒトの系統に由来する骨形成蛋白質を開示するこ
とを目的としている。発明者によりP3蛋白質と命名され
た22−24kDの分子量の蛋白質のうちの一つが本質的に均
質な状態に精製された事が示されている。この物質は哺
乳動物に移植されたとき、骨の形成を誘導すると報告さ
れている。
PCT出願第87/01537号（1988年１月14日公開）（国際
公開第W088/00205号）は骨の誘発の性質をもつウシの骨
からの不純な画分を開示している。その出願人は組み換
えDNA技術により生産された仮想上の“骨誘発因子”も
また開示している。４つのDNA配列がヒトおよびウシの
ゲノミックあるいはcDNAライブラリーから回収されそし
て組換え体宿主細胞内において発現された。出願人は、
発現された蛋白質が骨形態発生蛋白質であろうと陳述し
ているが、骨の誘発は証明されておらず、組換え体蛋白
質が骨形成蛋白質でないことを示唆している。同じグル
ープが引き続いて（Science，242:1528,Dec.1988）４つ
の因子のうちの３つが軟骨の形成を誘導し、そして骨の
形成活性が“制御分子の混合物による”ことおよび“骨
の形成はこれらの分子との相互関係により制御されてい
る可能性が強い”と仮定すると報告している。再び、骨
の誘導はcDNAの発現の生産物によるものでなくなった。
骨形態発生剤という名称のウリスト（Urist）らのヨー
ロッパ特許出願第212,474号もまた参照せよ。
公開第W088/00205号）は骨の誘発の性質をもつウシの骨
からの不純な画分を開示している。その出願人は組み換
えDNA技術により生産された仮想上の“骨誘発因子”も
また開示している。４つのDNA配列がヒトおよびウシの
ゲノミックあるいはcDNAライブラリーから回収されそし
て組換え体宿主細胞内において発現された。出願人は、
発現された蛋白質が骨形態発生蛋白質であろうと陳述し
ているが、骨の誘発は証明されておらず、組換え体蛋白
質が骨形成蛋白質でないことを示唆している。同じグル
ープが引き続いて（Science，242:1528,Dec.1988）４つ
の因子のうちの３つが軟骨の形成を誘導し、そして骨の
形成活性が“制御分子の混合物による”ことおよび“骨
の形成はこれらの分子との相互関係により制御されてい
る可能性が強い”と仮定すると報告している。再び、骨
の誘導はcDNAの発現の生産物によるものでなくなった。
骨形態発生剤という名称のウリスト（Urist）らのヨー
ロッパ特許出願第212,474号もまた参照せよ。
ワング（Wang）ら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．U
SA 85:9484−9488は軟骨および骨の形成活性をもつ脱
イオン化された骨のグアニジン抽出物からウシの骨形態
形成蛋白質を、ゲル抽出により決定された30kDの分子量
に等しい塩基性蛋白質として精製したことを開示してい
る。その蛋白質の精製は分離されると不活性な30,18,お
よび16kDの蛋白質を生じた。この結果から見て、著者は
活性のある物質の厳密な同定はまだ決定されていない事
を認めている。
SA 85:9484−9488は軟骨および骨の形成活性をもつ脱
イオン化された骨のグアニジン抽出物からウシの骨形態
形成蛋白質を、ゲル抽出により決定された30kDの分子量
に等しい塩基性蛋白質として精製したことを開示してい
る。その蛋白質の精製は分離されると不活性な30,18,お
よび16kDの蛋白質を生じた。この結果から見て、著者は
活性のある物質の厳密な同定はまだ決定されていない事
を認めている。
ワング（Wang）ら（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．U
SA 87:2220−2227はPCT出願第87/01537号に記述されて
いるcDNA配列のうちの一つの発現および部分精製を記述
している。これらの蛋白質を用いる場合の確実な軟骨お
よび／または骨の形成は最小限600ngの50％純粋な材料
を必要とする。
SA 87:2220−2227はPCT出願第87/01537号に記述されて
いるcDNA配列のうちの一つの発現および部分精製を記述
している。これらの蛋白質を用いる場合の確実な軟骨お
よび／または骨の形成は最小限600ngの50％純粋な材料
を必要とする。
PCT出願第89/04458号（1990年４月19日公開）（国際
公開第W090/003733号）はP3 OF 31−34と呼ばれる骨形
成因子ファミリーの精製および分析を記述している。そ
の蛋白質ファミリーはペプチド断片の配列により特徴づ
けられた少なくとも４つの蛋白質を含む。不純な混合物
P3 OF 31−34の骨形成活性も分析された。しかしながら
個別の蛋白質の活性は評価も議論もされなかった。
公開第W090/003733号）はP3 OF 31−34と呼ばれる骨形
成因子ファミリーの精製および分析を記述している。そ
の蛋白質ファミリーはペプチド断片の配列により特徴づ
けられた少なくとも４つの蛋白質を含む。不純な混合物
P3 OF 31−34の骨形成活性も分析された。しかしながら
個別の蛋白質の活性は評価も議論もされなかった。
骨形成の因子の移植の成功には使用されるin vivoの
領域において蛋白質を維持することができる有用なキャ
リアー材料と蛋白質との結合を必要とする。キャリアー
は生物的に適合性があり、生物的に分解されそして細胞
浸潤に十分な多孔性であることが望まれる。粉末化され
た骨のグアニジン抽出および脱脂後に残る不溶性のコラ
ーゲン粒子は幾つかの種の異質遺伝子型の移植において
通常は効果的であった。しかしながら、骨誘導蛋白質
（osteoinductive protein）は種を通じて有効である
が、通常軟骨性骨形成を誘導するのに使用されるコラー
ゲン様骨マトリックスは種特異的であることが研究によ
り示された（Sampath and Reddi（1983）Proc．Natl．A
cad．Sci．USA 80:6591−6594）。in vivoにおいて移
植された脱イオン化され、脱脂され、抽出された外因性
の骨マトリックスキャリアーは、おそらく骨マトリック
ス中における阻害性あるいは免疫原性成分のために骨形
成を誘導することができない。多くの種においては、骨
形成用具において同種の骨マトリックスを使用しても骨
誘導の骨形成（osteoinductive bone formation）には
不十分であろう。例えば、脱イオン化され、脱脂された
サルの骨のマトリックスの皮下へ同種の移植物はサルに
おいて骨の形成を誘導しないと報告されている(Asperbe
rg et al.(1988)J.Bone Joint Surg.(Br)70-B:625-62
7)。
領域において蛋白質を維持することができる有用なキャ
リアー材料と蛋白質との結合を必要とする。キャリアー
は生物的に適合性があり、生物的に分解されそして細胞
浸潤に十分な多孔性であることが望まれる。粉末化され
た骨のグアニジン抽出および脱脂後に残る不溶性のコラ
ーゲン粒子は幾つかの種の異質遺伝子型の移植において
通常は効果的であった。しかしながら、骨誘導蛋白質
（osteoinductive protein）は種を通じて有効である
が、通常軟骨性骨形成を誘導するのに使用されるコラー
ゲン様骨マトリックスは種特異的であることが研究によ
り示された（Sampath and Reddi（1983）Proc．Natl．A
cad．Sci．USA 80:6591−6594）。in vivoにおいて移
植された脱イオン化され、脱脂され、抽出された外因性
の骨マトリックスキャリアーは、おそらく骨マトリック
ス中における阻害性あるいは免疫原性成分のために骨形
成を誘導することができない。多くの種においては、骨
形成用具において同種の骨マトリックスを使用しても骨
誘導の骨形成（osteoinductive bone formation）には
不十分であろう。例えば、脱イオン化され、脱脂された
サルの骨のマトリックスの皮下へ同種の移植物はサルに
おいて骨の形成を誘導しないと報告されている(Asperbe
rg et al.(1988)J.Bone Joint Surg.(Br)70-B:625-62
7)。
米国特許出願第4,563,350号（1986年１月７日発行）
は、トリプシン処理されたウシの骨のマトリックスが、
抽出され、部分精製された骨−誘導蛋白質の調製物を用
いた移植のときに骨形成活性に影響する異種のマトリッ
クスとして使用されることをー開示している。骨の形成
は少なくとも５％、好ましくは少なくとも10％の非繊維
状コラーゲンの存在を必要とすることが示されている。
著者らは、コラーゲンの調製物の免疫原性に一部関係す
るテロペプチドの除去が異種性の移植において、より有
効であると主張している。
は、トリプシン処理されたウシの骨のマトリックスが、
抽出され、部分精製された骨−誘導蛋白質の調製物を用
いた移植のときに骨形成活性に影響する異種のマトリッ
クスとして使用されることをー開示している。骨の形成
は少なくとも５％、好ましくは少なくとも10％の非繊維
状コラーゲンの存在を必要とすることが示されている。
著者らは、コラーゲンの調製物の免疫原性に一部関係す
るテロペプチドの除去が異種性の移植において、より有
効であると主張している。
ヨーロッパ特許出願第309,241号（1989年３月29日公
開）は、骨形成蛋白質調製物、および無機成分あるいは
骨コラーゲン粉末60−98％からなるマトリックスキャリ
アーおよび２−40％のアテロペプチド低免疫原性コラー
ゲンからなる軟骨性骨の形成の誘導具を開示している。
開）は、骨形成蛋白質調製物、および無機成分あるいは
骨コラーゲン粉末60−98％からなるマトリックスキャリ
アーおよび２−40％のアテロペプチド低免疫原性コラー
ゲンからなる軟骨性骨の形成の誘導具を開示している。
デセラージ（Detherage）ら（1987）Collagen Rel.Re
s. 7:2225−2231は、一回のイオン交換カラムにより最
小限に精製されたウシの骨のマトリックス抽出物および
再構成され、高度に精製されたヒトType−Ｉ胎盤コラー
ゲンからなる明白な外因性移植具を開示すると主張して
いる。
s. 7:2225−2231は、一回のイオン交換カラムにより最
小限に精製されたウシの骨のマトリックス抽出物および
再構成され、高度に精製されたヒトType−Ｉ胎盤コラー
ゲンからなる明白な外因性移植具を開示すると主張して
いる。
米国特許出願第3,394,370号（1983年７月19日発行）
は、異種性の移植において有用であると紹介されている
再構成されたコラーゲンのマトリックスを記述してい
る。コラーゲン繊維は免疫原性をもつ可能性があるテロ
ペプチド（繊維内部の交差結合の主な原因でもある）を
除去するために酵素により処理されそして付随している
非コラーゲン組成物を除去するために溶解された。再構
成されたコラーゲンを酢酸中で分散させることにより基
本コラーゲン分子の無秩序なマトリックスを形成し、こ
れを次に骨形成因子と混合し、そして凍結乾燥して、好
ましくは交差結合している“半硬性のフォームあるいは
スポンジ”を形成することによりマトリックスを組み立
てた。組み立てられたマトリックスはin vivoにおいて
試験されない。
は、異種性の移植において有用であると紹介されている
再構成されたコラーゲンのマトリックスを記述してい
る。コラーゲン繊維は免疫原性をもつ可能性があるテロ
ペプチド（繊維内部の交差結合の主な原因でもある）を
除去するために酵素により処理されそして付随している
非コラーゲン組成物を除去するために溶解された。再構
成されたコラーゲンを酢酸中で分散させることにより基
本コラーゲン分子の無秩序なマトリックスを形成し、こ
れを次に骨形成因子と混合し、そして凍結乾燥して、好
ましくは交差結合している“半硬性のフォームあるいは
スポンジ”を形成することによりマトリックスを組み立
てた。組み立てられたマトリックスはin vivoにおいて
試験されない。
米国特許出願第4,172,128号（1979年10月23日発行）
は、骨様材料を分解しそして低い免疫原性をもつように
再生する方法を記述し、その方法が種を越えて有用であ
るとしている。脱イオン化された骨の粒子は付随してい
る全てのムコ多糖（グリコサミノグリカン）を溶解する
ために膨張剤で処理され、そして引き続いてコラーゲン
繊維を均質なコロイド溶液を形成するために溶解され
る。次に、生理学的に活性のないムコ多糖および繊維形
成の促進のための電解質を使用して再構成された繊維の
ゲルを形成することができる。
は、骨様材料を分解しそして低い免疫原性をもつように
再生する方法を記述し、その方法が種を越えて有用であ
るとしている。脱イオン化された骨の粒子は付随してい
る全てのムコ多糖（グリコサミノグリカン）を溶解する
ために膨張剤で処理され、そして引き続いてコラーゲン
繊維を均質なコロイド溶液を形成するために溶解され
る。次に、生理学的に活性のないムコ多糖および繊維形
成の促進のための電解質を使用して再構成された繊維の
ゲルを形成することができる。
本発明の目的は、組換え体DNAから生産され、そして
同種および異種性の移植において骨を誘導することがで
きる、分散された骨形成蛋白質を含むマトリックスから
なる骨形成具を提供することである。もう一つの目的
は、哺乳動物細胞から発現され、そして軟骨性骨の形成
を誘導することができる、組換え体骨形成蛋白質を提供
することである。さらにもう一つの目的は、、骨形成蛋
白質をコードする遺伝子および組み換えDNA技術を使用
したそれらの生産方法を提供することである。なおさら
にもう一つの目的は、骨誘導蛋白質（osteoinductive p
rotein）と組み合わせて、軟骨性骨の形成をすることが
できる、生物的に適合性があり、in vivoにおいて生物
的に分解されうるマトリックスを提供することである。
同種および異種性の移植において骨を誘導することがで
きる、分散された骨形成蛋白質を含むマトリックスから
なる骨形成具を提供することである。もう一つの目的
は、哺乳動物細胞から発現され、そして軟骨性骨の形成
を誘導することができる、組換え体骨形成蛋白質を提供
することである。さらにもう一つの目的は、、骨形成蛋
白質をコードする遺伝子および組み換えDNA技術を使用
したそれらの生産方法を提供することである。なおさら
にもう一つの目的は、骨誘導蛋白質（osteoinductive p
rotein）と組み合わせて、軟骨性骨の形成をすることが
できる、生物的に適合性があり、in vivoにおいて生物
的に分解されうるマトリックスを提供することである。
本発明の、これらのおよび他の目的および特徴は以下
の説明、図面、および請求の範囲から明らかにされる。
の説明、図面、および請求の範囲から明らかにされる。
発明の概要 本発明は、哺乳動物の体に移植したとき、移植部位に
おいて血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む
軟骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導すること
ができる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供する。
この骨形成具は、ここではマトリックスと呼ばれ、以下
に開示された特徴をもち、そして組み換えDNA技術を使
用して生産されそして真核生物細胞、好ましくは哺乳動
物細胞から発言された骨形成蛋白質を分散して含んだキ
ャリアー材料からなる。
おいて血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む
軟骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導すること
ができる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供する。
この骨形成具は、ここではマトリックスと呼ばれ、以下
に開示された特徴をもち、そして組み換えDNA技術を使
用して生産されそして真核生物細胞、好ましくは哺乳動
物細胞から発言された骨形成蛋白質を分散して含んだキ
ャリアー材料からなる。
ここに開示されたマトリックス中に分散した組換え体
蛋白質の好ましい態様は、天然の材料から抽出されそし
て同種の脱イオン化された骨粉のマトリックス材料中で
再構成された天然の形の蛋白質の生理学的な活性と密接
に類似している。好ましい蛋白質は、従来報告された生
合成されたどのような材料よりもはるかに高い比活性を
有し、すなわち活性分析法の精度の限度内において米国
特許出願第179,406号（1988年４月８日発行）（PCT US/
89 01453）において述べられたようにして生産された実
質的に純粋な材料と本質的に同一と認められる活性をも
つ。したがって、本出願は天然の骨の治療において起こ
るのと本質的に同様な軟骨性骨の完全な発生のカスケー
ドを誘導する骨形成具の製造方法および使用方法を開示
する。
蛋白質の好ましい態様は、天然の材料から抽出されそし
て同種の脱イオン化された骨粉のマトリックス材料中で
再構成された天然の形の蛋白質の生理学的な活性と密接
に類似している。好ましい蛋白質は、従来報告された生
合成されたどのような材料よりもはるかに高い比活性を
有し、すなわち活性分析法の精度の限度内において米国
特許出願第179,406号（1988年４月８日発行）（PCT US/
89 01453）において述べられたようにして生産された実
質的に純粋な材料と本質的に同一と認められる活性をも
つ。したがって、本出願は天然の骨の治療において起こ
るのと本質的に同様な軟骨性骨の完全な発生のカスケー
ドを誘導する骨形成具の製造方法および使用方法を開示
する。
これらの開発の鍵は、アミノ酸配列の推定および天然の
骨形成蛋白質の構造データである。一つのプロトコルを
作成し、それにしたがって、骨形成活性の半最大活性値
が移植片1mgあたり約0.8から1.0ngの哺乳動物の骨から
の実質的に純粋な骨形成蛋白質を回収した。その材料を
入手できたことにより、本発明者らは骨形成を達成する
ために必要な蛋白質の詳細な全構造を推定することがで
きた。蛋白質のアミノ酸配列および他の構造的な特徴の
知識により天然の遺伝子を同定およびクローニングする
ことができた。
骨形成蛋白質の構造データである。一つのプロトコルを
作成し、それにしたがって、骨形成活性の半最大活性値
が移植片1mgあたり約0.8から1.0ngの哺乳動物の骨から
の実質的に純粋な骨形成蛋白質を回収した。その材料を
入手できたことにより、本発明者らは骨形成を達成する
ために必要な蛋白質の詳細な全構造を推定することがで
きた。蛋白質のアミノ酸配列および他の構造的な特徴の
知識により天然の遺伝子を同定およびクローニングする
ことができた。
部分的な配列データおよび引例において開示された制
御蛋白質との間の観察された相同性に基づいたコンセン
サスDNA配列をゲノミックおよびcDNAライブラリーから
骨形成蛋白質をコードする遺伝子を抽出するためのプロ
ーブとして使用した。
御蛋白質との間の観察された相同性に基づいたコンセン
サスDNA配列をゲノミックおよびcDNAライブラリーから
骨形成蛋白質をコードする遺伝子を抽出するためのプロ
ーブとして使用した。
コンセンサス配列のプローブの内の一つが、これまでに
未同定のDNA配列を単離した；その一部分を連結したと
きコードするタンパク質は、正確に修飾され、適切なマ
トリックスに取り込まれそしてここに開示されたように
移植されるときに、軟骨性骨の形成を誘導することがで
きる領域を有していた。ここでOP1と呼ばれている蛋白
質並びにさまざまに欠失させた型および融合物を完全長
のcDNA配列およびさまざまに欠失させた合成DNAから大
腸菌およびさまざまな哺乳動物において発現させ、そし
てホモダイマーとしてあるいはBMP2、すなわちコンセン
サス配列のプローブによるヒトDNAライブラリーから抽
出された他の骨形成蛋白質とのヘテロダイマーとして骨
形成活性を示すことを見い出した。
未同定のDNA配列を単離した；その一部分を連結したと
きコードするタンパク質は、正確に修飾され、適切なマ
トリックスに取り込まれそしてここに開示されたように
移植されるときに、軟骨性骨の形成を誘導することがで
きる領域を有していた。ここでOP1と呼ばれている蛋白
質並びにさまざまに欠失させた型および融合物を完全長
のcDNA配列およびさまざまに欠失させた合成DNAから大
腸菌およびさまざまな哺乳動物において発現させ、そし
てホモダイマーとしてあるいはBMP2、すなわちコンセン
サス配列のプローブによるヒトDNAライブラリーから抽
出された他の骨形成蛋白質とのヘテロダイマーとして骨
形成活性を示すことを見い出した。
OP1遺伝子の特徴決定および活性に必要なDNAおよびア
ミノ酸配列の同定により哺乳動物細胞においてその遺伝
子を発現させることができた。哺乳動物の蛋白質の哺乳
動物細胞における発現、特に治療のための使用を意図と
した組換え体蛋白質の発現は通常天然の材料構造によく
似た構造をもった蛋白質を生じると考えられている。こ
のことは、原核細胞生物系において行われることがない
グリコシル化のような特定の後翻訳修飾を必要とする分
泌蛋白質においては特に真実である。大腸菌内における
OP1遺伝子の発現により、グリコシル化されていない型
の蛋白質は骨形成活性をもつことが示されたが、例え
ば、蛋白質の安定性、溶解性、あるいは免疫原性に関連
したまだ決定されていないオリゴサッカロイドの機能の
ような他のものがあるかも知れない。さらに、培養液中
に分泌された蛋白質の精製は、原核生物細胞の封入体
（inclusion bodies）から誘導された蛋白質を抽出する
方法に代替する方法を提供する。
ミノ酸配列の同定により哺乳動物細胞においてその遺伝
子を発現させることができた。哺乳動物の蛋白質の哺乳
動物細胞における発現、特に治療のための使用を意図と
した組換え体蛋白質の発現は通常天然の材料構造によく
似た構造をもった蛋白質を生じると考えられている。こ
のことは、原核細胞生物系において行われることがない
グリコシル化のような特定の後翻訳修飾を必要とする分
泌蛋白質においては特に真実である。大腸菌内における
OP1遺伝子の発現により、グリコシル化されていない型
の蛋白質は骨形成活性をもつことが示されたが、例え
ば、蛋白質の安定性、溶解性、あるいは免疫原性に関連
したまだ決定されていないオリゴサッカロイドの機能の
ような他のものがあるかも知れない。さらに、培養液中
に分泌された蛋白質の精製は、原核生物細胞の封入体
（inclusion bodies）から誘導された蛋白質を抽出する
方法に代替する方法を提供する。
遺伝子の哺乳動物細胞における発現は、成熟蛋白質の
Ｎ末端の決定もまた可能にした。OP1の成熟型であると
信じられるもののアミノ酸配列は次のとおりである（Se
q.ID No.1）： 組み替えにより生産されたOP1は蛋白質のＮ末端を欠
失させた幾つかの型においても活性をもっている。欠失
させたOP1の内の主要な一種は次のものである（Seq.ID
No.2）： ４つの他の活性のある短いOP1配列は： これらの６種のOP1のin vivoにおける骨形成活性を
調べそしてすべてが可溶性マトリックスと一緒に哺乳動
物において移植したときに薬剤量に依存した様式で軟骨
性骨形成を誘導することが示された。これらの種の比活
性は実質的に純粋な、天然物を源とする骨形成蛋白質の
比活性に近い。さらに、これらの蛋白質は従来報告され
た他の骨形成蛋白質調製物よりも天然物を源とする材料
の活性とより密接に似ている。
Ｎ末端の決定もまた可能にした。OP1の成熟型であると
信じられるもののアミノ酸配列は次のとおりである（Se
q.ID No.1）： 組み替えにより生産されたOP1は蛋白質のＮ末端を欠
失させた幾つかの型においても活性をもっている。欠失
させたOP1の内の主要な一種は次のものである（Seq.ID
No.2）： ４つの他の活性のある短いOP1配列は： これらの６種のOP1のin vivoにおける骨形成活性を
調べそしてすべてが可溶性マトリックスと一緒に哺乳動
物において移植したときに薬剤量に依存した様式で軟骨
性骨形成を誘導することが示された。これらの種の比活
性は実質的に純粋な、天然物を源とする骨形成蛋白質の
比活性に近い。さらに、これらの蛋白質は従来報告され
た他の骨形成蛋白質調製物よりも天然物を源とする材料
の活性とより密接に似ている。
組換え体により生産されたOP1は哺乳動物内において
グリコシル化されたホモダイマーとして発現される。OP
1−18のホモダイマーはSDS−PAGEにより決定すると、酸
化された時には約36kD、還元された時には約18kDの見か
け分子量である。OP1−16S,OP1−16V,OP1−16M,OP1−16
AおよびOP1−16LはSDS−PAGEにより決定すると還元され
た時には約16kDであり、そしてこれらの蛋白質のホモダ
イマー並びにOP1−18とのヘテロダイマーは酸化された
時に約30−36kDの範囲内の見かけ分子量である。還元さ
れた状態においては、これらの蛋白質は検出できるよう
な骨の形成活性を示さない。
グリコシル化されたホモダイマーとして発現される。OP
1−18のホモダイマーはSDS−PAGEにより決定すると、酸
化された時には約36kD、還元された時には約18kDの見か
け分子量である。OP1−16S,OP1−16V,OP1−16M,OP1−16
AおよびOP1−16LはSDS−PAGEにより決定すると還元され
た時には約16kDであり、そしてこれらの蛋白質のホモダ
イマー並びにOP1−18とのヘテロダイマーは酸化された
時に約30−36kDの範囲内の見かけ分子量である。還元さ
れた状態においては、これらの蛋白質は検出できるよう
な骨の形成活性を示さない。
OP1は今日迄に多くのさまざまな哺乳動物において発
現され、それらすべての細胞は翻訳後に蛋白質をグリコ
シル化しそしてプロセスする。オリゴサッカロイドの側
鎖の詳細な構造はセルラインの種類により異なるであろ
うが、すべての場合において発現された配列は特異的な
そして薬剤依存性の様式において骨形成の活性をもつ。
現され、それらすべての細胞は翻訳後に蛋白質をグリコ
シル化しそしてプロセスする。オリゴサッカロイドの側
鎖の詳細な構造はセルラインの種類により異なるであろ
うが、すべての場合において発現された配列は特異的な
そして薬剤依存性の様式において骨形成の活性をもつ。
本発明はそれらの特異的な構成物に限定されない。し
たがって、本発明の骨形成蛋白質は宿主の真核生物細胞
において組換え体DNAの発現により生産されたさまざま
なグリコシル化のパターン、Ｎ末端の変化、アミノ酸相
同性領域をもった関連する蛋白質のファミリー、および
天然のアミノ酸配列を欠失させたり変異を起こさせたも
のを含む。本発明の骨形成具において有用な活性配列
は、OP1−16Vとの間に少なくとも70％、好ましくは少な
くとも80％、の配列相同性をもった骨形成蛋白質を含
む。これは長い型の蛋白質や対立遺伝子の変異物および
変異蛋白質をも含む。
たがって、本発明の骨形成蛋白質は宿主の真核生物細胞
において組換え体DNAの発現により生産されたさまざま
なグリコシル化のパターン、Ｎ末端の変化、アミノ酸相
同性領域をもった関連する蛋白質のファミリー、および
天然のアミノ酸配列を欠失させたり変異を起こさせたも
のを含む。本発明の骨形成具において有用な活性配列
は、OP1−16Vとの間に少なくとも70％、好ましくは少な
くとも80％、の配列相同性をもった骨形成蛋白質を含
む。これは長い型の蛋白質や対立遺伝子の変異物および
変異蛋白質をも含む。
したがって、本開示からみて、遺伝子工学の当業者は
適切なアミノ酸をコードするるcDNAあるいはゲノミック
ライブラリーから遺伝子を単離、あるいはオリゴヌクレ
オチドからDNAをつくることができる。そして骨の形成
を誘導することができる活性型蛋白質を大量に生産する
ために、さまざまなタイプの宿主真核生物細胞において
それらを発現することができる。
適切なアミノ酸をコードするるcDNAあるいはゲノミック
ライブラリーから遺伝子を単離、あるいはオリゴヌクレ
オチドからDNAをつくることができる。そして骨の形成
を誘導することができる活性型蛋白質を大量に生産する
ために、さまざまなタイプの宿主真核生物細胞において
それらを発現することができる。
骨形成蛋白質は適切な送達剤あるいは支持系（マトリ
ックス）とともに、臨床の応用において有用である。マ
トリックスは、生物的に適応でき、蛋白質を抽出され、
無機塩類を含まず、脱脂された不溶性のType−Ｉ骨コラ
ーゲン粒子からなり、これは宿主にとって同種あるいは
異種であり得る。粒子は好ましくは、粒子の形態を変え
るために、すなわち粒子内部の多孔性および粒子の表面
の領域を増加させるために、お湯あるいは他の繊維修飾
溶剤のような繊維修飾剤で処理される。粒子は共にマト
リックスを形成させるために詰め込まれる。粒子間の空
間は先祖細胞の移動そして引き続く細胞の分化および増
殖のための範囲でなければならない。粒子の大きさは70
−850μｍ、好ましくは150μｍ−420μｍの範囲内がよ
い。マトリックスは骨の欠損にまたがる形に粒子をぴっ
たりと詰め込むことにより、あるいは粒子を望まれる形
に他の方法で詰め込んでかたちづくることにより作り上
げる。マトリックスはin vivoにおいて生物的に適応し
（炎症性のない）、そして生物的に分解され得る、そし
て“一時的骨格”および移動性の先祖細胞を呼び集める
土台として、およびそれらの引き続く固着および増殖の
ための基礎として用いられる。ここに開示されたよう
に、マトリックスは哺乳動物体内において確実にそして
再現性よく軟骨性骨の形成を誘導する骨形成蛋白質と組
み合わせることができる。
ックス）とともに、臨床の応用において有用である。マ
トリックスは、生物的に適応でき、蛋白質を抽出され、
無機塩類を含まず、脱脂された不溶性のType−Ｉ骨コラ
ーゲン粒子からなり、これは宿主にとって同種あるいは
異種であり得る。粒子は好ましくは、粒子の形態を変え
るために、すなわち粒子内部の多孔性および粒子の表面
の領域を増加させるために、お湯あるいは他の繊維修飾
溶剤のような繊維修飾剤で処理される。粒子は共にマト
リックスを形成させるために詰め込まれる。粒子間の空
間は先祖細胞の移動そして引き続く細胞の分化および増
殖のための範囲でなければならない。粒子の大きさは70
−850μｍ、好ましくは150μｍ−420μｍの範囲内がよ
い。マトリックスは骨の欠損にまたがる形に粒子をぴっ
たりと詰め込むことにより、あるいは粒子を望まれる形
に他の方法で詰め込んでかたちづくることにより作り上
げる。マトリックスはin vivoにおいて生物的に適応し
（炎症性のない）、そして生物的に分解され得る、そし
て“一時的骨格”および移動性の先祖細胞を呼び集める
土台として、およびそれらの引き続く固着および増殖の
ための基礎として用いられる。ここに開示されたよう
に、マトリックスは哺乳動物体内において確実にそして
再現性よく軟骨性骨の形成を誘導する骨形成蛋白質と組
み合わせることができる。
このマトリックスの材料の開発は異種性の骨のマトリ
ックスおよび骨形成蛋白質の移植の成功のために必要な
鍵となる特徴の発見の結果として開発された。実質的に
純粋な骨形成蛋白質および同種の脱イオン化され、脱脂
された蛋白質−抽出骨マトリックスからなる骨形成具
は、移動する先祖細胞の流入、増殖および分化のための
寸法の間隙をもつ必要があるということを研究が示唆し
た。異種性の骨マトリックスからなる骨形成具がin vi
voにおいてほとんどあるいは全く軟骨性骨形成を誘導し
ないということもまた観察された。異種性のマトリック
スによる骨の形成がないことは、一般的にマトリックス
中にまだ存在している成分（例えば、コラーゲンテロペ
プチドあるいは付随する非コラーゲン性糖蛋白質）に対
する免疫原性あるいは阻害的な応答によると考えられて
きた。
ックスおよび骨形成蛋白質の移植の成功のために必要な
鍵となる特徴の発見の結果として開発された。実質的に
純粋な骨形成蛋白質および同種の脱イオン化され、脱脂
された蛋白質−抽出骨マトリックスからなる骨形成具
は、移動する先祖細胞の流入、増殖および分化のための
寸法の間隙をもつ必要があるということを研究が示唆し
た。異種性の骨マトリックスからなる骨形成具がin vi
voにおいてほとんどあるいは全く軟骨性骨形成を誘導し
ないということもまた観察された。異種性のマトリック
スによる骨の形成がないことは、一般的にマトリックス
中にまだ存在している成分（例えば、コラーゲンテロペ
プチドあるいは付随する非コラーゲン性糖蛋白質）に対
する免疫原性あるいは阻害的な応答によると考えられて
きた。
粒子の総合的比表面積（表面領域／単位物質量）、多
孔性および微小なくぼみの程度、およびマトリックス粒
子のくぼみおよび穴の大きさが異種性移植、および特定
の種においては同種移植にさえも重要であることが今日
発見されている。
孔性および微小なくぼみの程度、およびマトリックス粒
子のくぼみおよび穴の大きさが異種性移植、および特定
の種においては同種移植にさえも重要であることが今日
発見されている。
第１図のパネルＡおよびＢはそれぞれラットおよび子
ウシからの脱イオン化され、グアニジン抽出された骨マ
トリックスの粒子構造を示す走査電子顕微鏡写真であ
る。これらの写真から観察され得るように、子ウシの骨
マトリックスにおいてよりもラットの骨マトリックスに
おいて顕著なより大きい生来の多孔性、あるいは表面積
がある。骨マトリックスの多孔性および粒子内部の表面
の領域を増加させることは、ラットのコラーゲン性骨マ
トリックスの移植により明らかにされたように、骨形成
の誘導を促進することができる。このことは、その形態
を変えるために一定の溶剤又は加熱によりコラーゲン性
骨マトリックスを処理することにより達成される。この
目的に適する薬剤はここで開示されそしてコラーゲン繊
維−修飾剤と呼ばれる。
ウシからの脱イオン化され、グアニジン抽出された骨マ
トリックスの粒子構造を示す走査電子顕微鏡写真であ
る。これらの写真から観察され得るように、子ウシの骨
マトリックスにおいてよりもラットの骨マトリックスに
おいて顕著なより大きい生来の多孔性、あるいは表面積
がある。骨マトリックスの多孔性および粒子内部の表面
の領域を増加させることは、ラットのコラーゲン性骨マ
トリックスの移植により明らかにされたように、骨形成
の誘導を促進することができる。このことは、その形態
を変えるために一定の溶剤又は加熱によりコラーゲン性
骨マトリックスを処理することにより達成される。この
目的に適する薬剤はここで開示されそしてコラーゲン繊
維−修飾剤と呼ばれる。
したがって、本発明の一つの局面は表面積およびマト
リックスのコラーゲン粒子の多孔性を実質的に増加させ
るために処理されたマトリックスからなる骨形成具を含
む。
リックスのコラーゲン粒子の多孔性を実質的に増加させ
るために処理されたマトリックスからなる骨形成具を含
む。
本発明の骨形成具において有用な、現時点で好ましい
繊維−修飾剤は熱せられた水性溶媒で、最も好ましくは
水である。脱イオン化され脱脂されグアニジン抽出され
た骨のコラーゲンを水中で高温にて（37°−65°、好ま
しくは45°−60℃）約１時間熱することは、望まれた表
面の形態を得るのに通常は十分である。機構は明らかで
ないが、熱処理はコラーゲン繊維を変化させ、その結果
粒子の表面積を増加させると仮定される。したがって、
骨のマトリックスは水中（1g/30ml）で撹拌しながらさ
まざまに高めた温度で処理し、そして濾過することがで
きる。水中で温度を上昇させることにより不溶性のコラ
ーゲンを処理することにより、らせん構造から非らせん
構造への完全な遷移の1/4から3/4に達するのに必要な温
度である融解遷移（Tm）に最初に到達する。その後遷移
は収縮温度（Ts）と呼ばれるいくらか高い温度において
突然に何分の一かに収縮する。Tsは通常Tmより高く、分
子の詰め込みにより更に安定性が高まることを反映す
る。約５以下のpHにおいては、熱せられたコラーゲンの
TmおよびTsの両値は減少する。
繊維−修飾剤は熱せられた水性溶媒で、最も好ましくは
水である。脱イオン化され脱脂されグアニジン抽出され
た骨のコラーゲンを水中で高温にて（37°−65°、好ま
しくは45°−60℃）約１時間熱することは、望まれた表
面の形態を得るのに通常は十分である。機構は明らかで
ないが、熱処理はコラーゲン繊維を変化させ、その結果
粒子の表面積を増加させると仮定される。したがって、
骨のマトリックスは水中（1g/30ml）で撹拌しながらさ
まざまに高めた温度で処理し、そして濾過することがで
きる。水中で温度を上昇させることにより不溶性のコラ
ーゲンを処理することにより、らせん構造から非らせん
構造への完全な遷移の1/4から3/4に達するのに必要な温
度である融解遷移（Tm）に最初に到達する。その後遷移
は収縮温度（Ts）と呼ばれるいくらか高い温度において
突然に何分の一かに収縮する。Tsは通常Tmより高く、分
子の詰め込みにより更に安定性が高まることを反映す
る。約５以下のpHにおいては、熱せられたコラーゲンの
TmおよびTsの両値は減少する。
溶剤で処理された骨のコラーゲン性マトリックスの実
験は、脱イオン化されグアニジン−抽出された異種性の
子ウシの骨はさらに別の物質の混合物も含むことを示
し、そしてこれらの物質を抽出するとマトリックスの特
性を改良できることを示している。抽出物中の成分をク
ロマトグラフィーにより分離し、続いてクロマトグラフ
ィーのピークに対応するさまざまな抽出画分を活性マト
リックスに加え戻すことにより、骨形成の誘導効果（os
teoinductine effect）を阻害できる活性があることが
示唆された。この阻害画分内の物質の正体はまだ決定さ
れていない。本発明の一つの局面において、上述された
タイプのType−Ｉ骨コラーゲン粒子からなりさらに該コ
ラーゲン粒子が阻害作用を示す成分を除去されている点
において特徴づけられるマトリックスが提供される。
験は、脱イオン化されグアニジン−抽出された異種性の
子ウシの骨はさらに別の物質の混合物も含むことを示
し、そしてこれらの物質を抽出するとマトリックスの特
性を改良できることを示している。抽出物中の成分をク
ロマトグラフィーにより分離し、続いてクロマトグラフ
ィーのピークに対応するさまざまな抽出画分を活性マト
リックスに加え戻すことにより、骨形成の誘導効果（os
teoinductine effect）を阻害できる活性があることが
示唆された。この阻害画分内の物質の正体はまだ決定さ
れていない。本発明の一つの局面において、上述された
タイプのType−Ｉ骨コラーゲン粒子からなりさらに該コ
ラーゲン粒子が阻害作用を示す成分を除去されている点
において特徴づけられるマトリックスが提供される。
本明細書の開示から見て、当業者は骨形成具を確立す
るのに有用な、そして例えば骨の誘導を促進するための
パッキンとして、あるいは生物的に分解される徐放性の
耐えられる放出移植片として他の移植可能な材料として
有用な望まれた多孔性および表面の微小構造をもつ、生
物的に適応できる特別上質のマトリックスを創ることが
できる。
るのに有用な、そして例えば骨の誘導を促進するための
パッキンとして、あるいは生物的に分解される徐放性の
耐えられる放出移植片として他の移植可能な材料として
有用な望まれた多孔性および表面の微小構造をもつ、生
物的に適応できる特別上質のマトリックスを創ることが
できる。
ここに開示された骨形成蛋白質および移植可能な骨形
成具により、医師は例えば、後天性および先天性の脳顔
面頭蓋のおよび他の骨格あるいは歯の奇形を矯正するた
めに最善の予測できる骨の形成をすることができる（Gl
owacki et al.（1981）Lancet 1:959−963）。この骨
形成具は動物実験において証明されたような癒着不良骨
折において、および骨の形成が必要な歯周の適用を含む
他の治療の運用において、局部の軟骨性骨の形成を誘導
するのに使用される。他の潜在的な治療の適用は例え
ば、骨関節炎の処理における軟骨の修復においてであ
る。
成具により、医師は例えば、後天性および先天性の脳顔
面頭蓋のおよび他の骨格あるいは歯の奇形を矯正するた
めに最善の予測できる骨の形成をすることができる（Gl
owacki et al.（1981）Lancet 1:959−963）。この骨
形成具は動物実験において証明されたような癒着不良骨
折において、および骨の形成が必要な歯周の適用を含む
他の治療の運用において、局部の軟骨性骨の形成を誘導
するのに使用される。他の潜在的な治療の適用は例え
ば、骨関節炎の処理における軟骨の修復においてであ
る。
図面の簡単な説明 本発明自身、さらにそのさまざまな特徴、本発明の前
述のおよび他の目的は添付の図面とともに解釈されると
き、以下の説明からよりー完全に理解される： 図1AおよびＢは、脱イオン化され、脱脂された（Ａ）
ラットの骨コラーゲン粒子、そして（Ｂ）ウシの骨コラ
ーゲン粒子の電子顕微鏡写真（5000x）である。
述のおよび他の目的は添付の図面とともに解釈されると
き、以下の説明からよりー完全に理解される： 図1AおよびＢは、脱イオン化され、脱脂された（Ａ）
ラットの骨コラーゲン粒子、そして（Ｂ）ウシの骨コラ
ーゲン粒子の電子顕微鏡写真（5000x）である。
図２−１および２−２はヒトOP1遺伝子のプレプロフ
ォームの完全長のcDNAおよびコードされるアミノ酸配列
を表す（seq.ID No.7）； 図3Aないし3FはOP1の哺乳動物細胞における発現のた
めに考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図であ
る； 図４は:COS細胞−（Ａ）pH717,（Ｂ）pH731;CHO細胞
−（Ｃ）pH754,（Ｄ）pH752,およびBSC細胞（Ｅ）pH71
7,（Ｆ）pW24;から発現されたOP1を比較するウエスタン
ブロット（イムノブロット）の写真から作成した図であ
る。
ォームの完全長のcDNAおよびコードされるアミノ酸配列
を表す（seq.ID No.7）； 図3Aないし3FはOP1の哺乳動物細胞における発現のた
めに考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図であ
る； 図４は:COS細胞−（Ａ）pH717,（Ｂ）pH731;CHO細胞
−（Ｃ）pH754,（Ｄ）pH752,およびBSC細胞（Ｅ）pH71
7,（Ｆ）pW24;から発現されたOP1を比較するウエスタン
ブロット（イムノブロット）の写真から作成した図であ
る。
図5A−ＣはBSC細胞から発現されそして：（Ａ）Ｓ−
セファロース、（Ｂ）フェニル−セファロース、および
（Ｃ）Ｃ−18カラムの順で精製された（１）溶出図およ
び（２）SDS−PAGEゲルの写真から作成した図である； 図６はヂチオスレイトールで還元後（18kD,レーン
５）の酸化状態の完全なダイマー（36kD,レーン１）お
よび対応するモノマーと分子量スタンダード（レーン２
−４）を比較したBSC細胞から精製されたOP1のSDS−PAG
Eの写真から作成した図である； 図7Aないし7Dは水中で（Ａ）37℃、（Ｂ）45℃、
（Ｃ）55℃、そして（Ｄ）65℃において熱処理された、
脱イオン化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの
走査電子顕微鏡写真（約1000x）である； 図８は湯で処理された子ウシのマトリックスから単離
された抽出物の214nmにおける吸光の記録であり、個々
の画分はin vivoの骨の形成への阻害効果を同定した； 図9Aおよび9Bはお湯で処理されたマトリックスの抽出
物のOP1活性に対する阻害効果を（Ａ）アルカリホスフ
ァターゼ活性および（Ｂ）12日目の移植片のカルシウム
含有量を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定すること
により表した棒グラフである； 図10A−ＦはCOS,BSCおよびCHO細胞から発現され、そ
して軟骨形成の発生カスケードに続くOP1の同種の移植
片の光学顕微鏡写真（200x）である； 図11はBSC細胞から発現されたOP1およびお湯で処理さ
れた外因性ウシマトリックスを使用した本発明の異種性
移植物の組織構造（12日目）の光学顕微鏡写真である； 図12はCOS,BSCおよびCHO細胞から発現されたOP1を含
む同種移植片のアルカリホスファターゼ活性およびカル
シウム含有量により測定された12日目の同種移植片の薬
剤量依存性を表す； そして 図13Aおよび13BはCOSおよびBSC細胞において発現され
たOP1の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加に
対する（ngで表される薬剤量曲線）（Ａ）アルカリホス
ファターゼ活性および（Ｂ）異種性移植片（12日目）に
おけるカルシウム含有量を測定することにより表した棒
グラフである。
セファロース、（Ｂ）フェニル−セファロース、および
（Ｃ）Ｃ−18カラムの順で精製された（１）溶出図およ
び（２）SDS−PAGEゲルの写真から作成した図である； 図６はヂチオスレイトールで還元後（18kD,レーン
５）の酸化状態の完全なダイマー（36kD,レーン１）お
よび対応するモノマーと分子量スタンダード（レーン２
−４）を比較したBSC細胞から精製されたOP1のSDS−PAG
Eの写真から作成した図である； 図7Aないし7Dは水中で（Ａ）37℃、（Ｂ）45℃、
（Ｃ）55℃、そして（Ｄ）65℃において熱処理された、
脱イオン化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの
走査電子顕微鏡写真（約1000x）である； 図８は湯で処理された子ウシのマトリックスから単離
された抽出物の214nmにおける吸光の記録であり、個々
の画分はin vivoの骨の形成への阻害効果を同定した； 図9Aおよび9Bはお湯で処理されたマトリックスの抽出
物のOP1活性に対する阻害効果を（Ａ）アルカリホスフ
ァターゼ活性および（Ｂ）12日目の移植片のカルシウム
含有量を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定すること
により表した棒グラフである； 図10A−ＦはCOS,BSCおよびCHO細胞から発現され、そ
して軟骨形成の発生カスケードに続くOP1の同種の移植
片の光学顕微鏡写真（200x）である； 図11はBSC細胞から発現されたOP1およびお湯で処理さ
れた外因性ウシマトリックスを使用した本発明の異種性
移植物の組織構造（12日目）の光学顕微鏡写真である； 図12はCOS,BSCおよびCHO細胞から発現されたOP1を含
む同種移植片のアルカリホスファターゼ活性およびカル
シウム含有量により測定された12日目の同種移植片の薬
剤量依存性を表す； そして 図13Aおよび13BはCOSおよびBSC細胞において発現され
たOP1の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加に
対する（ngで表される薬剤量曲線）（Ａ）アルカリホス
ファターゼ活性および（Ｂ）異種性移植片（12日目）に
おけるカルシウム含有量を測定することにより表した棒
グラフである。
説明 哺乳動物の骨からの蛋白質の粗抽出物に存在する骨形
成の蛋白質の単離を可能にした精製のプロトコルが最初
に開発された。（PCT第US89/01453号、および米国特許
出願第179,406号（1988年４月８日出願）を参照）。新
鮮な子ウシの骨を入手できたことと、上記方法が開発さ
れたことにより、実質的に純粋なウシの骨形成蛋白質
（BOP）を単離できた。BOPは有意に同定された；ネコ、
うさぎ、およびラットにおける軟骨および最後の軟骨性
骨を誘導するその能力は証明され、そして研究された；
従来は不均質な骨の抽出物内の未知の蛋白質によると見
なされていた骨の形成の発生カスケードを誘導すること
が可能であることが示された。この薬剤量依存性および
高い特異活性は、蛋白質がグリコシル化されていてもい
なくても存在した（米国特許出願第232,630号（1988年
８月15日出願）およびSampath et al.,（1990）J.Biol.
Chem. 265:pp.13198−13205を参照せよ）。ウシの材料か
ら得られた配列データはプローブの構想を与え、ヒトの
遺伝子を単離するために使用された。ヒトのOPに相当す
る蛋白質は今日発現されそして十分に同定されている。
成の蛋白質の単離を可能にした精製のプロトコルが最初
に開発された。（PCT第US89/01453号、および米国特許
出願第179,406号（1988年４月８日出願）を参照）。新
鮮な子ウシの骨を入手できたことと、上記方法が開発さ
れたことにより、実質的に純粋なウシの骨形成蛋白質
（BOP）を単離できた。BOPは有意に同定された；ネコ、
うさぎ、およびラットにおける軟骨および最後の軟骨性
骨を誘導するその能力は証明され、そして研究された；
従来は不均質な骨の抽出物内の未知の蛋白質によると見
なされていた骨の形成の発生カスケードを誘導すること
が可能であることが示された。この薬剤量依存性および
高い特異活性は、蛋白質がグリコシル化されていてもい
なくても存在した（米国特許出願第232,630号（1988年
８月15日出願）およびSampath et al.,（1990）J.Biol.
Chem. 265:pp.13198−13205を参照せよ）。ウシの材料か
ら得られた配列データはプローブの構想を与え、ヒトの
遺伝子を単離するために使用された。ヒトのOPに相当す
る蛋白質は今日発現されそして十分に同定されている。
ホモダイマーとして個々にそしてヘテロダイマーとし
て別の種と結合した全体的に新規な、非天然蛋白質構成
物をコードするDNAを調製することを可能にしたこれら
の発現は、真の軟骨性骨を生産することが可能である
（PCT出願第89/01469号（1989年４月７日出願）および
米国特許出願第315,342号（1989年２月23日出願）を参
照せよ）。それらは、ここに開示された技術を使用して
そして自動化され市販されている装置を使用することに
より生産された合成DNAからあるいは天然源から回収さ
れたcDNAおよびゲノミックDNAから、天然の材料、欠失
させた型、変異蛋白質、アナログ、融合蛋白質、そして
さまざまな他の由来物および構成物を発現させることも
また可能にした。DNAは原核生物細胞および真核生物生
物細胞においてよく確立された分子生物学および組み替
えDNA技術を使用して発現され、そして必要ならば、生
物学的に活性のある蛋白質を生産するためにin vitro
において酸化されそして再びおりたたまれる。
て別の種と結合した全体的に新規な、非天然蛋白質構成
物をコードするDNAを調製することを可能にしたこれら
の発現は、真の軟骨性骨を生産することが可能である
（PCT出願第89/01469号（1989年４月７日出願）および
米国特許出願第315,342号（1989年２月23日出願）を参
照せよ）。それらは、ここに開示された技術を使用して
そして自動化され市販されている装置を使用することに
より生産された合成DNAからあるいは天然源から回収さ
れたcDNAおよびゲノミックDNAから、天然の材料、欠失
させた型、変異蛋白質、アナログ、融合蛋白質、そして
さまざまな他の由来物および構成物を発現させることも
また可能にした。DNAは原核生物細胞および真核生物生
物細胞においてよく確立された分子生物学および組み替
えDNA技術を使用して発現され、そして必要ならば、生
物学的に活性のある蛋白質を生産するためにin vitro
において酸化されそして再びおりたたまれる。
ゲノミックおよびcDNAライブラリーから単離されたDN
A配列のうちの一つはここでOP1と呼ばれる、これまで未
同定の遺伝子をコードしていた。単離されたDNAにより
コードされている蛋白質はTGF−βファミリー内の蛋白
質とのアミノ酸相同性から最初に同定された。コンサン
セスなスプライスシグナルはエクソンとイントロンの境
界と呼ばれているアミノ酸相同性が終わるところで見い
だされた。７つのシステインを含む機能的なTGF−β様
ドメインを得るために、３つのエクソンを結合させた。
（例えば、米国特許出願第315,342号（1980年２月23日
出願）、あるいはOzkaynak,E.et al.,（1990）EMBO．
J．9:pp.2085−2093）。
A配列のうちの一つはここでOP1と呼ばれる、これまで未
同定の遺伝子をコードしていた。単離されたDNAにより
コードされている蛋白質はTGF−βファミリー内の蛋白
質とのアミノ酸相同性から最初に同定された。コンサン
セスなスプライスシグナルはエクソンとイントロンの境
界と呼ばれているアミノ酸相同性が終わるところで見い
だされた。７つのシステインを含む機能的なTGF−β様
ドメインを得るために、３つのエクソンを結合させた。
（例えば、米国特許出願第315,342号（1980年２月23日
出願）、あるいはOzkaynak,E.et al.,（1990）EMBO．
J．9:pp.2085−2093）。
OP1の完全長のcDNA配列はそれがコードするアミノ酸
配列を含めて第２図に示されている。OP1の完全長のcDN
A配列、さらにこの遺伝子をさまざまに欠失させた型、
および融合させた遺伝子を大腸菌において発現させ、そ
してマトリックスと結合させて哺乳動物において移植し
たときに骨の形成活性をもつことが示された。
配列を含めて第２図に示されている。OP1の完全長のcDN
A配列、さらにこの遺伝子をさまざまに欠失させた型、
および融合させた遺伝子を大腸菌において発現させ、そ
してマトリックスと結合させて哺乳動物において移植し
たときに骨の形成活性をもつことが示された。
天然の型の蛋白質は蛋白質の適切な分泌のためのシグ
ナルペプチド配列を含む”プレプロ”型として最初に発
現される。シグナルぺプチドが切断される部位は第２図
において下線が引かれている。シグナルペプチドの除去
により蛋白質の”プロ”型を生じ、これが分泌時にプロ
セスされて成熟蛋白質を生じる。成熟配列を生じる切断
部位は第２図において矢印で示されている。成熟型であ
ると信じられているアミノ酸配列は次のとおりである
（seq.ID No.1）： 正しくダイマーにされ、おりたたまれ、マトリックス
に吸収され、そして移植された時に、プロ型およびプレ
プロ型の両者は骨形成活性を示すが、これはおそらく分
割および成熟型の蛋白質あるいは活性のある欠失された
アナログ蛋白質を生じるような分解酵素による分解のた
めである。
ナルペプチド配列を含む”プレプロ”型として最初に発
現される。シグナルぺプチドが切断される部位は第２図
において下線が引かれている。シグナルペプチドの除去
により蛋白質の”プロ”型を生じ、これが分泌時にプロ
セスされて成熟蛋白質を生じる。成熟配列を生じる切断
部位は第２図において矢印で示されている。成熟型であ
ると信じられているアミノ酸配列は次のとおりである
（seq.ID No.1）： 正しくダイマーにされ、おりたたまれ、マトリックス
に吸収され、そして移植された時に、プロ型およびプレ
プロ型の両者は骨形成活性を示すが、これはおそらく分
割および成熟型の蛋白質あるいは活性のある欠失された
アナログ蛋白質を生じるような分解酵素による分解のた
めである。
活性型のOP1はまた蛋白質のＮ末端部分がない、欠失
された型で精製されうる。OP1の活性をもつ欠失された
型の一つは次のものである（seq.ID No.2）： OP1の活性のある欠失された型の他の４つは次のもの
である： 前述のアミノ酸およびDNA配列の情報により、さまざ
まなDNAが融合蛋白質、成熟蛋白質の他の欠失型、およ
び類似の構成物に加えて、OP1の少なくとも最小限の活
性ドメイン、および、それらのさまざまなアナログをコ
ードするように構成されうる。これらのDNAは、ゲノミ
ックDNAおよびcDNAの単離、合成されたオリゴヌクレオ
チドからの合成DNAの構成、およびカセット変異導入技
術を含む、よく知られたDNA操作を使用して当業者によ
り製造されうる。15−100merのオリゴヌクレオチドはバ
イオサーチDNAモデル8600合成機により合成され、そし
てTris−ほう酸−EDTA緩衝液においてポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）により精製される。そしてDNA
をゲルから電気的に溶出する。オーバーラップするオリ
ゴマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し
そしてPAGEによっても精製されるより大きなブロックに
連結する。
された型で精製されうる。OP1の活性をもつ欠失された
型の一つは次のものである（seq.ID No.2）： OP1の活性のある欠失された型の他の４つは次のもの
である： 前述のアミノ酸およびDNA配列の情報により、さまざ
まなDNAが融合蛋白質、成熟蛋白質の他の欠失型、およ
び類似の構成物に加えて、OP1の少なくとも最小限の活
性ドメイン、および、それらのさまざまなアナログをコ
ードするように構成されうる。これらのDNAは、ゲノミ
ックDNAおよびcDNAの単離、合成されたオリゴヌクレオ
チドからの合成DNAの構成、およびカセット変異導入技
術を含む、よく知られたDNA操作を使用して当業者によ
り製造されうる。15−100merのオリゴヌクレオチドはバ
イオサーチDNAモデル8600合成機により合成され、そし
てTris−ほう酸−EDTA緩衝液においてポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）により精製される。そしてDNA
をゲルから電気的に溶出する。オーバーラップするオリ
ゴマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し
そしてPAGEによっても精製されるより大きなブロックに
連結する。
そしてcDNAあるいは合成DNAを蛋白質の発現のために
発現ベクターに挿入しそして適切な宿主細胞内にトラン
スフェクトする。原核細胞生物は蛋白質をグリコシル化
できないが蛋白質の骨形成活性は壊さないから、宿主は
原核細胞生物あるいは真核細胞生物を使用する。有効な
宿主細胞には大腸菌、酵母、昆虫／バキュロウイルス細
胞系、ミエローマ細胞、およびさまざまな哺乳動物細胞
が含まれる。本発明の蛋白質はここに開示されたよう
に、好ましくは哺乳動物において発現される。ベクター
は付加的に転写プロモーターおよび終結配列、エンハン
サー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましい
mRNAリーダー配列、蛋白質の分泌のための好ましいシグ
ナル配列、および類似物を含む組換え体蛋白質の正確な
発現を促進するさまざまな配列をコードしていてもよ
い。興味のある遺伝子をコードするDNA配列はまた、潜
在的に阻害をする配列を除去するためにあるいは望まれ
ない二次構造の形成を最小限にするために操作される。
組換え体骨形成蛋白質はまた、融合蛋白質としても発現
されうる。翻訳された後に、蛋白質は細胞自身から精製
あるいは培養液から回収されうる。すべての生物学的に
活性のある蛋白質の型は、個々のサブユニットの発現後
に適切な真核生物細胞内あるいはin vitroにおいて、
さまざまな組換え体蛋白質のひとつあるいはいくつかが
酸化およびおりたたまれることにより、ジスルフィド結
合により連結されるか他の方法で結合されて生産される
ダイマー種からなる。
発現ベクターに挿入しそして適切な宿主細胞内にトラン
スフェクトする。原核細胞生物は蛋白質をグリコシル化
できないが蛋白質の骨形成活性は壊さないから、宿主は
原核細胞生物あるいは真核細胞生物を使用する。有効な
宿主細胞には大腸菌、酵母、昆虫／バキュロウイルス細
胞系、ミエローマ細胞、およびさまざまな哺乳動物細胞
が含まれる。本発明の蛋白質はここに開示されたよう
に、好ましくは哺乳動物において発現される。ベクター
は付加的に転写プロモーターおよび終結配列、エンハン
サー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましい
mRNAリーダー配列、蛋白質の分泌のための好ましいシグ
ナル配列、および類似物を含む組換え体蛋白質の正確な
発現を促進するさまざまな配列をコードしていてもよ
い。興味のある遺伝子をコードするDNA配列はまた、潜
在的に阻害をする配列を除去するためにあるいは望まれ
ない二次構造の形成を最小限にするために操作される。
組換え体骨形成蛋白質はまた、融合蛋白質としても発現
されうる。翻訳された後に、蛋白質は細胞自身から精製
あるいは培養液から回収されうる。すべての生物学的に
活性のある蛋白質の型は、個々のサブユニットの発現後
に適切な真核生物細胞内あるいはin vitroにおいて、
さまざまな組換え体蛋白質のひとつあるいはいくつかが
酸化およびおりたたまれることにより、ジスルフィド結
合により連結されるか他の方法で結合されて生産される
ダイマー種からなる。
前述したように、治療における使用のための哺乳動物
の組換え体蛋白質の生産は、その構造が天然の物質に最
も近い蛋白質を生産するために、好ましくは哺乳動物細
胞培養系において発現されるということが通常は考えら
れている。哺乳動物細胞内における組換え体蛋白質の生
産は、トランスフェクトが簡単で、外来のDNAを並び方
が変化していない配列で安定に維持し、そして転写、翻
訳、後翻訳修飾、および蛋白質の分泌に十分な必要な細
胞の成分をもった適切な細胞および細胞ラインの確立を
必要とする。さらに、興味のある遺伝子を運ぶ適当なベ
クターもまた必要である。哺乳動物細胞へのトランスフ
ェクションのためのDNAベクターの構成はコザックコン
センサス配列のような翻訳効率を高める配列に加えて、
適切な転写の開始、終結、およびエンハンサー配列を含
む上述されたような興味ある遺伝子の発現を促進する適
切な配列を含むべきである。好ましいDNAはまたマーカ
ー遺伝子および興味ある遺伝子のコピー数を増幅する手
段を含む。
の組換え体蛋白質の生産は、その構造が天然の物質に最
も近い蛋白質を生産するために、好ましくは哺乳動物細
胞培養系において発現されるということが通常は考えら
れている。哺乳動物細胞内における組換え体蛋白質の生
産は、トランスフェクトが簡単で、外来のDNAを並び方
が変化していない配列で安定に維持し、そして転写、翻
訳、後翻訳修飾、および蛋白質の分泌に十分な必要な細
胞の成分をもった適切な細胞および細胞ラインの確立を
必要とする。さらに、興味のある遺伝子を運ぶ適当なベ
クターもまた必要である。哺乳動物細胞へのトランスフ
ェクションのためのDNAベクターの構成はコザックコン
センサス配列のような翻訳効率を高める配列に加えて、
適切な転写の開始、終結、およびエンハンサー配列を含
む上述されたような興味ある遺伝子の発現を促進する適
切な配列を含むべきである。好ましいDNAはまたマーカ
ー遺伝子および興味ある遺伝子のコピー数を増幅する手
段を含む。
哺乳動物細胞の発現系の発展における実質的な進歩は
この十年間につくられそしてこの系の多くの局面は十分
に特徴づけられた。有用な細胞、蛋白質発現−プロモー
ター配列、マーカー遺伝子、および遺伝子増幅法を含
む、哺乳動物における外来蛋白質の生産の技術の状況の
詳細な論表は、ベンディグ（Bendig）、マリー（Marr
y）M.,（1988）Genetic Engineering,7:91−127に開示
されている。
この十年間につくられそしてこの系の多くの局面は十分
に特徴づけられた。有用な細胞、蛋白質発現−プロモー
ター配列、マーカー遺伝子、および遺伝子増幅法を含
む、哺乳動物における外来蛋白質の生産の技術の状況の
詳細な論表は、ベンディグ（Bendig）、マリー（Marr
y）M.,（1988）Genetic Engineering,7:91−127に開示
されている。
簡潔に言えば、特定の哺乳動物内において外来の遺伝
子を発現するのに有用な最もよく特徴づけられた転写プ
ロモーターはSV40前期プロモーター、アデノウイルスプ
ロモーター（AdMLP）、マウスメタロチオネイン−Ｉプ
ロモーター（mMT−Ｉ）、ニワトリ肉腫ウイルス（RSV）
長末端重複（LTR）、マウス乳癌ウイルス長末端重複（M
MTV−LTR）、およびヒトサイトメガロウイルス主要中間
−前期プロモーター（hCMV）である。すべてのそれらの
プロモーターのDNA配列はその分野においてわかってお
り市販されている。
子を発現するのに有用な最もよく特徴づけられた転写プ
ロモーターはSV40前期プロモーター、アデノウイルスプ
ロモーター（AdMLP）、マウスメタロチオネイン−Ｉプ
ロモーター（mMT−Ｉ）、ニワトリ肉腫ウイルス（RSV）
長末端重複（LTR）、マウス乳癌ウイルス長末端重複（M
MTV−LTR）、およびヒトサイトメガロウイルス主要中間
−前期プロモーター（hCMV）である。すべてのそれらの
プロモーターのDNA配列はその分野においてわかってお
り市販されている。
哺乳動物においてよりよく特徴づけられた遺伝子増幅
の方法の一つはdhfr−セルラインにおける誘導可能なDH
FR遺伝子の使用である。通常、DHFR遺伝子は興味ある遺
伝子を運ぶベクター中に供給され、そして細胞毒性薬剤
メトトレキセートの付加による誘導により、関連した興
味ある遺伝子のコピー数に加えてDHFR遺伝子のコピー数
も増幅される。トランスフェクトされたチャイニーズハ
ムスター卵巣セルライン（CHO細胞）における誘導可能
な、増幅マーカー遺伝子としてのDHFRはその分野におい
て特によく特徴づけられている。誘導可能な遺伝子増幅
器として有用な他の遺伝子は、アデノシン脱アミノ酸素
（ADA）およびグルタミン合成酵素（GS）遺伝子であ
る。
の方法の一つはdhfr−セルラインにおける誘導可能なDH
FR遺伝子の使用である。通常、DHFR遺伝子は興味ある遺
伝子を運ぶベクター中に供給され、そして細胞毒性薬剤
メトトレキセートの付加による誘導により、関連した興
味ある遺伝子のコピー数に加えてDHFR遺伝子のコピー数
も増幅される。トランスフェクトされたチャイニーズハ
ムスター卵巣セルライン（CHO細胞）における誘導可能
な、増幅マーカー遺伝子としてのDHFRはその分野におい
て特によく特徴づけられている。誘導可能な遺伝子増幅
器として有用な他の遺伝子は、アデノシン脱アミノ酸素
（ADA）およびグルタミン合成酵素（GS）遺伝子であ
る。
細胞あるいはセルラインの選択もまた重要であり実験
者の必要に依存している。サル腎細胞（COS）は高いレ
ベルの一過性の遺伝子発現を提供し、ベクター構成物お
よびクローン化された遺伝子の発現の迅速な試験に有用
な手段を提供する。COS細胞は興味ある遺伝子を運ぶシ
ミアンウイルス40（SV40）ベクターでトランスフェクト
される。トランスフェクトされたCOS細胞はやがて死滅
し、そのため望まれた蛋白質の長期間の生産は妨げられ
る。しかしながら、一過性の発現は安定なセルラインの
開発に必要な時間を消費する過程（しばしば数週間）を
必要としない。
者の必要に依存している。サル腎細胞（COS）は高いレ
ベルの一過性の遺伝子発現を提供し、ベクター構成物お
よびクローン化された遺伝子の発現の迅速な試験に有用
な手段を提供する。COS細胞は興味ある遺伝子を運ぶシ
ミアンウイルス40（SV40）ベクターでトランスフェクト
される。トランスフェクトされたCOS細胞はやがて死滅
し、そのため望まれた蛋白質の長期間の生産は妨げられ
る。しかしながら、一過性の発現は安定なセルラインの
開発に必要な時間を消費する過程（しばしば数週間）を
必要としない。
確立されたセルラインの間で、CHO細胞は今日まで最
も特徴がよくわかっている。それらはまた広い範囲の細
胞型由来の蛋白質を発現させることが可能である。CHO
細胞の一般的応用可能性および関係のない細胞型由来の
各種のヒト蛋白質の生産が成功している事実は、すべて
の哺乳動物細胞における根源的な類似性を強調する。そ
して、哺乳動物発現系において生産された組換え体蛋白
質のグリコシル化パターンは天然の蛋白質と同一でない
かも知れないが、オリゴサッカライドの側鎖のちがいは
発現された蛋白質の生物活性に本質的でないことがしば
しばある。
も特徴がよくわかっている。それらはまた広い範囲の細
胞型由来の蛋白質を発現させることが可能である。CHO
細胞の一般的応用可能性および関係のない細胞型由来の
各種のヒト蛋白質の生産が成功している事実は、すべて
の哺乳動物細胞における根源的な類似性を強調する。そ
して、哺乳動物発現系において生産された組換え体蛋白
質のグリコシル化パターンは天然の蛋白質と同一でない
かも知れないが、オリゴサッカライドの側鎖のちがいは
発現された蛋白質の生物活性に本質的でないことがしば
しばある。
さまざまな哺乳動物細胞から組換え体OP1を発現させ
そして精製する方法、天然の異種性マトリックス、およ
び請求された主題の性格、有用性およびそれをいかに作
りそして使用するかということに関する他の観点は、本
発明の実施のために現在最良であると知られた方法を構
成する以下の記載からさらに理解されるであろう。
そして精製する方法、天然の異種性マトリックス、およ
び請求された主題の性格、有用性およびそれをいかに作
りそして使用するかということに関する他の観点は、本
発明の実施のために現在最良であると知られた方法を構
成する以下の記載からさらに理解されるであろう。
I.哺乳動物細胞における組換え体蛋白質の発現 いくつかの違った哺乳動物細胞の発現系が、本発明の
組換え体OP1蛋白質の発現に使用された。特に、COS細胞
はCOS細胞中にDNA配列をトランスフェクトするためにSV
40ベクターを使用して、ベクターの構築および遺伝子の
発現の迅速な評価のために使用される。安定なセルライ
ンはOP1蛋白質の長期間の生産のためにCHO細胞（チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞）およびBSC細胞の高温感受
性株（サルの腎細胞、BSC40−tsA58、（1988）Biotechn
ology 6:1197−1196）を，使用して開発される。２つの
違ったプロモーターをOP1の転写に使用する：ラウス肉
腫ウイルスLTRからのエンハンサーにより増幅されたCMV
プロモーター、およびmMTプロモーター（マウスメタロ
チオネインプロモーター）。いくつかの選択マーカー遺
伝子、例えば、neo（ネオマイシン）およびDHFR、もま
た使用される。DHFR遺伝子はまたCHO細胞の遺伝子増幅
計画の一部として使用されうる。他の遺伝子増幅計画は
SV40ベクターでトランスフェクトされたBSC40−tsA58の
温度感受性（ts）を利用する。33℃への温度の低下は、
ts SV40 T抗原を安定化し、それによって挿入された、
トランスフェクトされたベクターDNAの切り出しおよび
増幅が生じ、したがって結合された興味ある遺伝子もま
た増幅する。
組換え体OP1蛋白質の発現に使用された。特に、COS細胞
はCOS細胞中にDNA配列をトランスフェクトするためにSV
40ベクターを使用して、ベクターの構築および遺伝子の
発現の迅速な評価のために使用される。安定なセルライ
ンはOP1蛋白質の長期間の生産のためにCHO細胞（チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞）およびBSC細胞の高温感受
性株（サルの腎細胞、BSC40−tsA58、（1988）Biotechn
ology 6:1197−1196）を，使用して開発される。２つの
違ったプロモーターをOP1の転写に使用する：ラウス肉
腫ウイルスLTRからのエンハンサーにより増幅されたCMV
プロモーター、およびmMTプロモーター（マウスメタロ
チオネインプロモーター）。いくつかの選択マーカー遺
伝子、例えば、neo（ネオマイシン）およびDHFR、もま
た使用される。DHFR遺伝子はまたCHO細胞の遺伝子増幅
計画の一部として使用されうる。他の遺伝子増幅計画は
SV40ベクターでトランスフェクトされたBSC40−tsA58の
温度感受性（ts）を利用する。33℃への温度の低下は、
ts SV40 T抗原を安定化し、それによって挿入された、
トランスフェクトされたベクターDNAの切り出しおよび
増幅が生じ、したがって結合された興味ある遺伝子もま
た増幅する。
安定なセルラインはBSC40−tsA58細胞（以下“BSC細
胞”と呼ぶ）に加えてCHO細胞でも確立された。本発明
のOP1蛋白質の哺乳動物細胞の発現のために選択された
さまざまなセルラインおよびDNA配列は遺伝子工学の分
野においてよく特徴づけられており容易に入手できる。
他のプロモーター、選択可能なマーカー、遺伝子増幅お
よび細胞も本発明のOP1蛋白質並びに他の骨形成蛋白質
の発現に利用されうる。トランスフェクション、発現、
および組換え体蛋白質の精製の特別な詳細はその分野に
おいてよく書物に記載されそして当業者によって理解さ
れている。哺乳動物発現系における外来遺伝子の組み換
え体の生産において使用されたそれぞれの段階のさまざ
まな技術的な側面のさらなる詳細は、例えば、Current
Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,
ed.,John Wiley ＆ Sons,New York 1987のようなその分野における多くのテキストお
よび実験マニュアルに見いだされうる。
胞”と呼ぶ）に加えてCHO細胞でも確立された。本発明
のOP1蛋白質の哺乳動物細胞の発現のために選択された
さまざまなセルラインおよびDNA配列は遺伝子工学の分
野においてよく特徴づけられており容易に入手できる。
他のプロモーター、選択可能なマーカー、遺伝子増幅お
よび細胞も本発明のOP1蛋白質並びに他の骨形成蛋白質
の発現に利用されうる。トランスフェクション、発現、
および組換え体蛋白質の精製の特別な詳細はその分野に
おいてよく書物に記載されそして当業者によって理解さ
れている。哺乳動物発現系における外来遺伝子の組み換
え体の生産において使用されたそれぞれの段階のさまざ
まな技術的な側面のさらなる詳細は、例えば、Current
Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,
ed.,John Wiley ＆ Sons,New York 1987のようなその分野における多くのテキストお
よび実験マニュアルに見いだされうる。
1.発現ベクターの例 第３図は哺乳動物におけるOP1蛋白質の発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの例の制限地図を開
示している。これらのベクター構成物のそれぞれは最初
にヒトcDNAライブラリー（ヒト胎盤）から単離され、そ
して引き続いて挿入部位においてpUCポリリンカー配列
を使用して慣用的なpUCベクター（pUC−18）にクローン
化された完全長のcDNA配列を使用している。これらの構
成物のそれぞれにクローン化されたOP1 cDNA断片は第２
図に描かれた完全なSmaI−BamHI OP1 cDNA断片（seq.ID
No.7）、あるいはこの断片から標準的な分子生物学方
法論を使用して、周辺のコードしていない５′および／
または３′配列を再度切り取った修飾断片である。それ
ぞれのベクターはまた霊長類細胞（例えば、COSおよびB
SC細胞）においてプラスミドの複製を伝達するのに有用
なSV40の複製起点（ori）も使用している。さらに、前
期SV40プロモーターをベクター上のマーカー遺伝子（例
えば、neoおよびDHFR）の転写の制御に使用している。
考案されたさまざまな発現ベクターの例の制限地図を開
示している。これらのベクター構成物のそれぞれは最初
にヒトcDNAライブラリー（ヒト胎盤）から単離され、そ
して引き続いて挿入部位においてpUCポリリンカー配列
を使用して慣用的なpUCベクター（pUC−18）にクローン
化された完全長のcDNA配列を使用している。これらの構
成物のそれぞれにクローン化されたOP1 cDNA断片は第２
図に描かれた完全なSmaI−BamHI OP1 cDNA断片（seq.ID
No.7）、あるいはこの断片から標準的な分子生物学方
法論を使用して、周辺のコードしていない５′および／
または３′配列を再度切り取った修飾断片である。それ
ぞれのベクターはまた霊長類細胞（例えば、COSおよびB
SC細胞）においてプラスミドの複製を伝達するのに有用
なSV40の複製起点（ori）も使用している。さらに、前
期SV40プロモーターをベクター上のマーカー遺伝子（例
えば、neoおよびDHFR）の転写の制御に使用している。
pH717発現ベクター（第３図Ａ）は、誘導可能な選択
マーカーとしてネオマイシン（neo）遺伝子を含む。こ
のマーカー遺伝子は遺伝子工学の分野においてよく特徴
づけられており市販されている。一方、他の選択可能な
マーカーも使用可能である。pH717のためのneo遺伝子DN
A断片の提供に使用される特定のベクター（pMAM−neo−
blue）は、Clontech,Inc.,Palo Alto,CAから入手でき
る。pH717において、OP1 DNAの転写はRSV−LTRおよびMM
TV−LTR（マウス乳癌ウイルス）エンハンサー配列によ
り増幅されるCMVプロモーターにより制御されている。
これらの配列はその分野においてよく知られており、そ
して市販されている。例えば、このプロモーター／エン
ハンサー配列を含むベクター（例えば、pCDM8）はInvit
rogen Inc.,San Diego,Ca,からえられる。
マーカーとしてネオマイシン（neo）遺伝子を含む。こ
のマーカー遺伝子は遺伝子工学の分野においてよく特徴
づけられており市販されている。一方、他の選択可能な
マーカーも使用可能である。pH717のためのneo遺伝子DN
A断片の提供に使用される特定のベクター（pMAM−neo−
blue）は、Clontech,Inc.,Palo Alto,CAから入手でき
る。pH717において、OP1 DNAの転写はRSV−LTRおよびMM
TV−LTR（マウス乳癌ウイルス）エンハンサー配列によ
り増幅されるCMVプロモーターにより制御されている。
これらの配列はその分野においてよく知られており、そ
して市販されている。例えば、このプロモーター／エン
ハンサー配列を含むベクター（例えば、pCDM8）はInvit
rogen Inc.,San Diego,Ca,からえられる。
発現ベクターpH731（第３図Ｂ）はOP1の転写を制御す
るためにSV40後期プロモーターを利用している。上で述
べられたように、このプロモーターの配列および特徴は
またその分野においてよく知られている。一方、pH731
はpEUK−Cl（Clontech,Inc.,Palo Alto,CA）にOP1のSma
I−BamHI断片を挿入することにより生産される。
るためにSV40後期プロモーターを利用している。上で述
べられたように、このプロモーターの配列および特徴は
またその分野においてよく知られている。一方、pH731
はpEUK−Cl（Clontech,Inc.,Palo Alto,CA）にOP1のSma
I−BamHI断片を挿入することにより生産される。
pH754発現ベクター（第３図Ｃ）は選択マーカーとし
ておよび誘導可能な遺伝子増幅器としてDHFR配列を含
む。OP1はCMV制御下にある、DHFRのDNA配列は遺伝子工
学の分野においてよく特徴づけられており、市販されて
いる。一方、pH754はneo遺伝子（BamHI分解物）をDHFR
遺伝子を含むBamHI断片（例えば、pSV5−dhfr（ATCC ＃
37148）から得られる）に置き換えることにより、pMAM
−neo（Clontech,Inc.,Palo Alto,CA）から生産でき
る。そしてOP1 DNAはMMTVLTR配列（マウス乳癌ウイルス
LTR）の下流のポリリンカー部位に挿入され得、pH752を
生じる（第３図Ｄ）。そしてCMVプロモーター配列を、C
laI−XbaI断片（例えば、pMAM−neo blue,Clontech,In
c.から）としてpH752（ClaI−NheIにおいて開かれた）
に挿入できる。
ておよび誘導可能な遺伝子増幅器としてDHFR配列を含
む。OP1はCMV制御下にある、DHFRのDNA配列は遺伝子工
学の分野においてよく特徴づけられており、市販されて
いる。一方、pH754はneo遺伝子（BamHI分解物）をDHFR
遺伝子を含むBamHI断片（例えば、pSV5−dhfr（ATCC ＃
37148）から得られる）に置き換えることにより、pMAM
−neo（Clontech,Inc.,Palo Alto,CA）から生産でき
る。そしてOP1 DNAはMMTVLTR配列（マウス乳癌ウイルス
LTR）の下流のポリリンカー部位に挿入され得、pH752を
生じる（第３図Ｄ）。そしてCMVプロモーター配列を、C
laI−XbaI断片（例えば、pMAM−neo blue,Clontech,In
c.から）としてpH752（ClaI−NheIにおいて開かれた）
に挿入できる。
pW24ベクター（第３図Ｅ）はneoがDHFRの代わりにマ
ーカー遺伝子（pH717を参照）として使用されているこ
とを除いてp754の配列と本質的に同一である。
ーカー遺伝子（pH717を参照）として使用されているこ
とを除いてp754の配列と本質的に同一である。
同様にして、pH783（第３図Ｆ）は増幅可能なマーカ
ーDHFRを含むが、ここではOP1はmMT（マウスメタロチオ
ネインプロモーター）制御下にある。mMTプロモーター
は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており市
販されている。一方、mMTプロモーター配列（Allegro N
ichols Institute Diagnostics,San Juan Capistrano,C
Aから手に入る）を含むClaI−NheI断片はpH783を生産す
るためにpH752に挿入され得る。
ーDHFRを含むが、ここではOP1はmMT（マウスメタロチオ
ネインプロモーター）制御下にある。mMTプロモーター
は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており市
販されている。一方、mMTプロモーター配列（Allegro N
ichols Institute Diagnostics,San Juan Capistrano,C
Aから手に入る）を含むClaI−NheI断片はpH783を生産す
るためにpH752に挿入され得る。
試験されたすべてのベクターはOP1を発現するために
使用されたさまざまな細胞において安定であり、そして
ある範囲内のOP1発現レベルを提供する。
使用されたさまざまな細胞において安定であり、そして
ある範囲内のOP1発現レベルを提供する。
2.哺乳動物細胞の例 組換え体OP1は３つの違った細胞発現系において発現
された： さまざまな発現ベクター構成物の機能性を迅
速にスクリーニングするためのCOS細胞、安定なセルラ
インの確立のためのCHO細胞、およびOP1蛋白質を生産す
る他の手段としてのBSC40−tsA58細胞。
された： さまざまな発現ベクター構成物の機能性を迅
速にスクリーニングするためのCOS細胞、安定なセルラ
インの確立のためのCHO細胞、およびOP1蛋白質を生産す
る他の手段としてのBSC40−tsA58細胞。
A.COS細胞 COS細胞（サルの腎細胞）はベクター構成物の迅速な
スクリーニングおよびOP1蛋白質の迅速かつ小スケール
の生産に使用される。COS細胞はその分野においてよく
特徴づけられており市販されている。ここに記述された
特定のセルライン（ATCC ＃COS−1,CRL−1650）はAmeri
can Type Culture Collectionを通じて得られる。
スクリーニングおよびOP1蛋白質の迅速かつ小スケール
の生産に使用される。COS細胞はその分野においてよく
特徴づけられており市販されている。ここに記述された
特定のセルライン（ATCC ＃COS−1,CRL−1650）はAmeri
can Type Culture Collectionを通じて得られる。
ノーザンおよびウエスタンブロットにより分析された
種々のベクターからのOP1発現レベルは以下の表Ｉに比
較されている： pH754でトランスフェクトされたCOS細胞は今日最も高
い収率でOP1を生産することが明らかになっている。し
かしながら、トランスフェクトされたCOS細胞は分裂せ
ずにトランスフェクション後に数日で死ぬので、個々の
スケールアップされた形質転換には大量のプラスミドDN
Aが必要となる。
種々のベクターからのOP1発現レベルは以下の表Ｉに比
較されている： pH754でトランスフェクトされたCOS細胞は今日最も高
い収率でOP1を生産することが明らかになっている。し
かしながら、トランスフェクトされたCOS細胞は分裂せ
ずにトランスフェクション後に数日で死ぬので、個々の
スケールアップされた形質転換には大量のプラスミドDN
Aが必要となる。
トランスフェクトされたCOS細胞からのOP1の大スケー
ルでの調製は慣用的なローラーボトル技術を使用して生
産される。簡潔に言えば、14×106の細胞がそれぞれの
ボルトに接種するのに使用される。24時間の成育後に、
DEAE−デキストラン法を使用して、106細胞あたり19μ
ｇのベクターDNA（例えば、pH717）で細胞をトランスフ
ェクトする。そして、蛋白質の分析のために培地を採取
する前に120時間血清を含まない培地で処理する。この
プロトコルに従うと、OP1の収率は約２−6ng/mlにな
る。
ルでの調製は慣用的なローラーボトル技術を使用して生
産される。簡潔に言えば、14×106の細胞がそれぞれの
ボルトに接種するのに使用される。24時間の成育後に、
DEAE−デキストラン法を使用して、106細胞あたり19μ
ｇのベクターDNA（例えば、pH717）で細胞をトランスフ
ェクトする。そして、蛋白質の分析のために培地を採取
する前に120時間血清を含まない培地で処理する。この
プロトコルに従うと、OP1の収率は約２−6ng/mlにな
る。
B.CHO細胞 CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）は長期
間のOP1の生産に使用される。CHOセルラインは外来遺伝
子の小および大スケールの生産のためによく特徴づけら
れておりそして市販されている。ここに記述された特定
のセルラインはCHO−DXBll、（Laurence Chasin,Columb
ia University,NY）である。以下の表IIはさまざまな発
現ベクターで得られるOP1の収率例を表す。
間のOP1の生産に使用される。CHOセルラインは外来遺伝
子の小および大スケールの生産のためによく特徴づけら
れておりそして市販されている。ここに記述された特定
のセルラインはCHO−DXBll、（Laurence Chasin,Columb
ia University,NY）である。以下の表IIはさまざまな発
現ベクターで得られるOP1の収率例を表す。
C.BSC細胞 BSC40−tsA58セルライン（BSC細胞）はCOS細胞に関連
した幾つかの問題に打ち勝つサルの腎細胞の温度感受性
株である（1988,Biotechnology 6:1192−1196）。これ
らのBSC細胞は、潜在的に有毒な薬剤を外部から添加す
ることを必要としないで温度を下げることにより迅速に
大スケールで遺伝子配列を増幅することができる利点を
もっている。さらに、細胞は再利用されうる。すなわ
ち、OP1発現の誘導および刺激後、細胞を新しい成育倍
地に移し変え、39.5℃において飽和状態（コンフルエン
ス）まで成育させ、そして温度を33℃に下げることによ
り再び誘導することが可能である。BSC細胞は蛋白質を
産生する安定なセルラインを迅速に確立するために使用
されうる。
した幾つかの問題に打ち勝つサルの腎細胞の温度感受性
株である（1988,Biotechnology 6:1192−1196）。これ
らのBSC細胞は、潜在的に有毒な薬剤を外部から添加す
ることを必要としないで温度を下げることにより迅速に
大スケールで遺伝子配列を増幅することができる利点を
もっている。さらに、細胞は再利用されうる。すなわ
ち、OP1発現の誘導および刺激後、細胞を新しい成育倍
地に移し変え、39.5℃において飽和状態（コンフルエン
ス）まで成育させ、そして温度を33℃に下げることによ
り再び誘導することが可能である。BSC細胞は蛋白質を
産生する安定なセルラインを迅速に確立するために使用
されうる。
トランスフェクトされたBSC細胞は10％のFCSを含む培
地において温度を33℃に低下させることにより誘導さ
れ、そしてインキュベーションから96時間後に処理され
た培地を収穫する。CHO細胞と比較して同程度の量（例
えば、pH717でトランスフェクトされたBSCクローンから
産生培地1mlあたり100−150ngのOP1）OP1 RNAおよび蛋
白質が得られる。
地において温度を33℃に低下させることにより誘導さ
れ、そしてインキュベーションから96時間後に処理され
た培地を収穫する。CHO細胞と比較して同程度の量（例
えば、pH717でトランスフェクトされたBSCクローンから
産生培地1mlあたり100−150ngのOP1）OP1 RNAおよび蛋
白質が得られる。
3.OP1でトランスフェクトされた細胞の評価 トランスフェクトされたOP1配列の発現レベルは総細
胞RNAおよび慣用的なハイブリダイゼーション方法を使
用して、mRNAのレベル（ノーザンブロット）を分析する
ことにより種々の系において測定される。通常、約１×
106の細胞がmRNAの分析に必要である。個々のセルライ
ン間のデータの比較は、細胞の総数およびmRNAの総量を
内部スタンダードとしてrRNAを使用して標準化すること
により行うことができる。リボソームRNAは、ハイブリ
ダイゼーションのために該RNAをニトロセルロースフィ
ルターに転写する前に、エチヂウムブロマイドでアガロ
ースゲルを染色することにより可視化される。リボソー
ムRNAはまたRNAの調製に、完全さの指示指標を提供す
る。
胞RNAおよび慣用的なハイブリダイゼーション方法を使
用して、mRNAのレベル（ノーザンブロット）を分析する
ことにより種々の系において測定される。通常、約１×
106の細胞がmRNAの分析に必要である。個々のセルライ
ン間のデータの比較は、細胞の総数およびmRNAの総量を
内部スタンダードとしてrRNAを使用して標準化すること
により行うことができる。リボソームRNAは、ハイブリ
ダイゼーションのために該RNAをニトロセルロースフィ
ルターに転写する前に、エチヂウムブロマイドでアガロ
ースゲルを染色することにより可視化される。リボソー
ムRNAはまたRNAの調製に、完全さの指示指標を提供す
る。
OP1蛋白質のレベルはヒトOP1に対するウサギの抗血清
を使用してウエスタンブロット（イムノブロット）によ
り測定することもできる。第４図は:COS細胞−（Ａ）pH
717,（Ｂ）pH731;CHO細胞−（Ｃ）pH754,（Ｄ）pH752;
およびBSC細胞−（Ｅ）pH717および（Ｆ）pW24における
OP1の生産を表すイムノブロットである。
を使用してウエスタンブロット（イムノブロット）によ
り測定することもできる。第４図は:COS細胞−（Ａ）pH
717,（Ｂ）pH731;CHO細胞−（Ｃ）pH754,（Ｄ）pH752;
およびBSC細胞−（Ｅ）pH717および（Ｆ）pW24における
OP1の生産を表すイムノブロットである。
サザンブロットは挿入されたOP1配列の状態およびそ
れらのコピー数増幅の範囲を評価するために使用でき
る。温度を変化させたBSC細胞における切り出されたプ
ラスミドのコピー数もまたサザンブロット分析を使用し
て決定されうる。
れらのコピー数増幅の範囲を評価するために使用でき
る。温度を変化させたBSC細胞における切り出されたプ
ラスミドのコピー数もまたサザンブロット分析を使用し
て決定されうる。
II.蛋白質の精製 本発明の組換え体骨形成蛋白質を精製するために開発
された精製計画は迅速で高い効果を示す。プロトコルは
３つのクロマトグラフィーステップ（Ｓ−セファロー
ス、フェニルセファロースおよびＣ−18 HPLC）を含
み、そして約90％純粋なOP1を産生する。
された精製計画は迅速で高い効果を示す。プロトコルは
３つのクロマトグラフィーステップ（Ｓ−セファロー
ス、フェニルセファロースおよびＣ−18 HPLC）を含
み、そして約90％純粋なOP1を産生する。
0.5％FCSによって処理されたトランスフェクトされた
BSC細胞の典型的な2Lの調製物において、総蛋白質は700
mgである。ウエスタンブロットにより見積もられる培地
中のOP1量は約80μｇである。OP1培地は6M尿素、0.05M
塩化ナトリウム、13mM HEPES、pH7.0に希釈され、そし
て亜硫酸基を持ちそして強力カチオン交換体として働く
Ｓ−セファロースカラム上に載せられる。OP1は低塩濃
度でカラムに結合し、そして血清蛋白質は除去される。
カラムは引き続き２段階の塩溶出で展開される。最初の
溶出（0.1M塩化ナトリウム）は混在物および約10％の結
合したOP1を除去する。そして残りの90％のOP1は6M尿
素、0.3M塩化ナトリウム、20mM HEPES、pH7.0中に溶出
される。
BSC細胞の典型的な2Lの調製物において、総蛋白質は700
mgである。ウエスタンブロットにより見積もられる培地
中のOP1量は約80μｇである。OP1培地は6M尿素、0.05M
塩化ナトリウム、13mM HEPES、pH7.0に希釈され、そし
て亜硫酸基を持ちそして強力カチオン交換体として働く
Ｓ−セファロースカラム上に載せられる。OP1は低塩濃
度でカラムに結合し、そして血清蛋白質は除去される。
カラムは引き続き２段階の塩溶出で展開される。最初の
溶出（0.1M塩化ナトリウム）は混在物および約10％の結
合したOP1を除去する。そして残りの90％のOP1は6M尿
素、0.3M塩化ナトリウム、20mM HEPES、pH7.0中に溶出
される。
この3.0M塩化ナトリウム画分に硫酸アンモニウムを加
えて、6M尿素、1M硫酸アンモニウム、0.3M塩化ナトリウ
ム、20mM HEPES、pH7.0の最終的な溶液状態を得る。そ
してサンプルをフェニルセファロースカラム（疎水性結
合クロマトグラフィー）に載せる。。OP1は高濃度の弱
いカオトロピック塩（例えば、1M硫酸アンモニウム）存
在下においてフェニルセファロースに結合させる。OP1
を結合させた後、カラムを、硫酸アンモニウムの濃度を
下げて使用して２段階の溶出で展開する。最初の溶出
（0.6Mの硫酸アンモニウムを含む）は最初に混在物を除
去する。そして結合したOP1は硫酸アンモニウムを含ま
ない6M尿素、0.3M塩化ナトリウム、20mM HEPES、pH7.0
緩衝液で溶出する。
えて、6M尿素、1M硫酸アンモニウム、0.3M塩化ナトリウ
ム、20mM HEPES、pH7.0の最終的な溶液状態を得る。そ
してサンプルをフェニルセファロースカラム（疎水性結
合クロマトグラフィー）に載せる。。OP1は高濃度の弱
いカオトロピック塩（例えば、1M硫酸アンモニウム）存
在下においてフェニルセファロースに結合させる。OP1
を結合させた後、カラムを、硫酸アンモニウムの濃度を
下げて使用して２段階の溶出で展開する。最初の溶出
（0.6Mの硫酸アンモニウムを含む）は最初に混在物を除
去する。そして結合したOP1は硫酸アンモニウムを含ま
ない6M尿素、0.3M塩化ナトリウム、20mM HEPES、pH7.0
緩衝液で溶出する。
フェニルセファロースカラムから溶出されたOP1を水
で透析し、さらに30％アセトニトリル（0.1％TFA）で透
析し、そしてＣ−18逆相HPLCカラムに載せる。第５図
Ａ、Ｂ、およびＣは（Ａ）Ｓ−セファロース、（Ｂ）フ
ェニルセファロース、および（Ｃ）Ｃ−18カラムから溶
出したものの（１）クロマトグラムおよび（２）ヂチオ
スレイトール（DTT）で還元後画分のクマジー染色SDS−
PAGEゲルである。酸化されそして還元されたOP1サンプ
ルのゲルによる分離は、還元されたサブユニットが約18
kDの見かけ分子量をもつこと、および第６図に示される
ように、ダイマーは約36kDの見かけ分子量をもつことを
表す。このサブユニットの大きさは、天然源のbOPの大
きさに加えて、COS細胞から精製されたものの大きさと
も同一であることが明らかになった。現在のプロトコル
は、ゲルスキャニングにより見積もったところ2Lの産生
培地で約30μｇのOP1、すなわち約25％の回収、の収量
を得た。
で透析し、さらに30％アセトニトリル（0.1％TFA）で透
析し、そしてＣ−18逆相HPLCカラムに載せる。第５図
Ａ、Ｂ、およびＣは（Ａ）Ｓ−セファロース、（Ｂ）フ
ェニルセファロース、および（Ｃ）Ｃ−18カラムから溶
出したものの（１）クロマトグラムおよび（２）ヂチオ
スレイトール（DTT）で還元後画分のクマジー染色SDS−
PAGEゲルである。酸化されそして還元されたOP1サンプ
ルのゲルによる分離は、還元されたサブユニットが約18
kDの見かけ分子量をもつこと、および第６図に示される
ように、ダイマーは約36kDの見かけ分子量をもつことを
表す。このサブユニットの大きさは、天然源のbOPの大
きさに加えて、COS細胞から精製されたものの大きさと
も同一であることが明らかになった。現在のプロトコル
は、ゲルスキャニングにより見積もったところ2Lの産生
培地で約30μｇのOP1、すなわち約25％の回収、の収量
を得た。
別法のクロマトグラフィープロトコルは、6M尿素非存
在下においてＳ−セファロースクロマトグラフィーを行
う。そして結合したタンパク質は塩のステップ溶出（例
えば、100〜400mM塩化ナトリウム）で溶出される。OP1
のほとんどは約300mMの塩化ナトリウムで溶出される。
そして残りのOP1はさらに6M尿素存在下の300mMの塩化ナ
トリウムで溶出されうる。１段階で最大の回収を達成す
るために、尿素を使用しない溶出に代えて6M尿素に溶出
を使用してもよい。
在下においてＳ−セファロースクロマトグラフィーを行
う。そして結合したタンパク質は塩のステップ溶出（例
えば、100〜400mM塩化ナトリウム）で溶出される。OP1
のほとんどは約300mMの塩化ナトリウムで溶出される。
そして残りのOP1はさらに6M尿素存在下の300mMの塩化ナ
トリウムで溶出されうる。１段階で最大の回収を達成す
るために、尿素を使用しない溶出に代えて6M尿素に溶出
を使用してもよい。
OP1はまたヒドロキシアパタイトに効果的に結合す
る、ただし6M尿素非存在下および低リン酸濃度（リン酸
5mM以下）においてのみである。結合したOP1は、1mMか
ら0.5Mのステップ溶出（0.5M塩化ナトリウム、50mM Tri
s、pH7.0中で）でカラムから除去されうる。OP1は約250
mMのリン酸で溶出される。さらに、溶出ステップの間に
尿素（6M）を加えてもよい。
る、ただし6M尿素非存在下および低リン酸濃度（リン酸
5mM以下）においてのみである。結合したOP1は、1mMか
ら0.5Mのステップ溶出（0.5M塩化ナトリウム、50mM Tri
s、pH7.0中で）でカラムから除去されうる。OP1は約250
mMのリン酸で溶出される。さらに、溶出ステップの間に
尿素（6M）を加えてもよい。
他の関連したクロマトグラフィー方法もまた哺乳動物
細胞系からOP1を精製するのに有用である。例えば、ヘ
パリンセファロースをＳ−セファロースカラムと組み合
わせて使用できる。あるいは、Cu2+−固定化金属イオン
親和性クロマトグラフィー（IMAC）は、6Mの尿素を含む
リン酸緩衝液（pH7.0）中でOP1を結合する。
細胞系からOP1を精製するのに有用である。例えば、ヘ
パリンセファロースをＳ−セファロースカラムと組み合
わせて使用できる。あるいは、Cu2+−固定化金属イオン
親和性クロマトグラフィー（IMAC）は、6Mの尿素を含む
リン酸緩衝液（pH7.0）中でOP1を結合する。
III.マトリックスの調製 本発明の実施には骨、好ましくは哺乳動物、例えばウ
シの骨の入手性を必要とする。骨を洗浄し、骨髄を取り
除き、脱脂され、脱イオン化され、適当な大きさの粒子
に砕かれ、可溶性蛋白質を除去するために抽出され、殺
菌され、そしてさまざまな臨床の使用に有用な移植でき
る材料を生産するようなここに開示されたような方法で
処理される。
シの骨の入手性を必要とする。骨を洗浄し、骨髄を取り
除き、脱脂され、脱イオン化され、適当な大きさの粒子
に砕かれ、可溶性蛋白質を除去するために抽出され、殺
菌され、そしてさまざまな臨床の使用に有用な移植でき
る材料を生産するようなここに開示されたような方法で
処理される。
本発明の材料から製造されたさまざまな形のマトリッ
クスはさまざまな目的で外科的に移植される。これらの
目的中の主要なものは、さまざまな整形法の、歯周の、
および再構成の方法における骨の形成のマトリックスと
して、徐放剤のキャリアーとして、あるいは移植片のた
めのコラーゲン性コーティング剤として働かせることで
ある。マトリックスは外科手術において期待される所望
の形とし、あるいは外科手術の間の医者あるいは技術者
により型づくられてよい。すなわち、局所性の、皮下
の、腹腔内の、あるいは筋肉内の移植片として使用でき
る；骨折の癒着不良を補うようにあるいは骨の欠失を満
たすように型づくられる。骨の形成あるいは誘導方法に
おいて、材料はゆっくりと体に吸収されそして移植片の
形であるいはほとんど移植片に近い形で骨と置き換えら
れる。
クスはさまざまな目的で外科的に移植される。これらの
目的中の主要なものは、さまざまな整形法の、歯周の、
および再構成の方法における骨の形成のマトリックスと
して、徐放剤のキャリアーとして、あるいは移植片のた
めのコラーゲン性コーティング剤として働かせることで
ある。マトリックスは外科手術において期待される所望
の形とし、あるいは外科手術の間の医者あるいは技術者
により型づくられてよい。すなわち、局所性の、皮下
の、腹腔内の、あるいは筋肉内の移植片として使用でき
る；骨折の癒着不良を補うようにあるいは骨の欠失を満
たすように型づくられる。骨の形成あるいは誘導方法に
おいて、材料はゆっくりと体に吸収されそして移植片の
形であるいはほとんど移植片に近い形で骨と置き換えら
れる。
さまざまな成長因子、ホルモン、酵素、治療用組成
物、抗生物質、および身体に処理する他の薬剤もまた、
キャリアー物質に吸収させそして移植すると、マトリッ
クスの材料がゆっくりと吸収されるにつれて時間をかけ
て放出させる。こうして、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGFア
ルファ、およびTGFベータのようなさまざまな既知の成
長因子をin vivoにおいて吸収させうる。材料は化学療
法剤、インスリン、酵素、あるいは酵素の阻害剤を放出
させるために使用されうる。
物、抗生物質、および身体に処理する他の薬剤もまた、
キャリアー物質に吸収させそして移植すると、マトリッ
クスの材料がゆっくりと吸収されるにつれて時間をかけ
て放出させる。こうして、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGFア
ルファ、およびTGFベータのようなさまざまな既知の成
長因子をin vivoにおいて吸収させうる。材料は化学療
法剤、インスリン、酵素、あるいは酵素の阻害剤を放出
させるために使用されうる。
本発明の材料をいかにして作るかおよび使用するかの
詳細を以下に開示する。
詳細を以下に開示する。
1.脱イオン化された骨の調製 脱イオン化されたウシの骨のマトリックスは、以前に
公表された方法により調製される（Sampath and Reddi
（12983）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:6591−659
5）。ウシの骨幹（１−10日齢）は屠殺場から得られ新
鮮なうちに使用される。骨は筋肉と脂肪を取り去り、骨
膜を洗い、冷水による水圧で骨髄を取り除き、冷やした
無水アルコールに浸し、そして−20℃で貯蔵する。そし
て乾燥しそして破壊により断片化しそして大きな製粉機
により粉にされる。注意を要することは液体窒素を使用
することにより発熱を防ぐことである。粉にされた骨は
70−850μｍ、好ましくは150μｍ−420μｍの範囲の粒
子の大きさの粉にされ、そして３倍容のクロロホルムお
よびメタノール（3:1）で約２時間、２度洗浄すること
により脱脂する。そして微粒子状の骨を等容の無水エタ
ノールで洗浄し、そして脱脂された骨の粉を生じさせる
ために等容の無水エーテルで乾燥させる。そして脱脂さ
れた骨の粉を10倍容の0.5N HClで４℃において40分間、
４回連続して処理して脱イオン化する。最後に、中和の
ための洗浄を大量の水を用いて脱イオン化された骨の粉
に行う。
公表された方法により調製される（Sampath and Reddi
（12983）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:6591−659
5）。ウシの骨幹（１−10日齢）は屠殺場から得られ新
鮮なうちに使用される。骨は筋肉と脂肪を取り去り、骨
膜を洗い、冷水による水圧で骨髄を取り除き、冷やした
無水アルコールに浸し、そして−20℃で貯蔵する。そし
て乾燥しそして破壊により断片化しそして大きな製粉機
により粉にされる。注意を要することは液体窒素を使用
することにより発熱を防ぐことである。粉にされた骨は
70−850μｍ、好ましくは150μｍ−420μｍの範囲の粒
子の大きさの粉にされ、そして３倍容のクロロホルムお
よびメタノール（3:1）で約２時間、２度洗浄すること
により脱脂する。そして微粒子状の骨を等容の無水エタ
ノールで洗浄し、そして脱脂された骨の粉を生じさせる
ために等容の無水エーテルで乾燥させる。そして脱脂さ
れた骨の粉を10倍容の0.5N HClで４℃において40分間、
４回連続して処理して脱イオン化する。最後に、中和の
ための洗浄を大量の水を用いて脱イオン化された骨の粉
に行う。
2.グアニジン抽出 このようにして調製された脱イオン化された骨のマト
リックスは５倍容の4Mグアニジン−HCl,50mM Tris−HC
l,pH7.0で16時間４℃において抽出される。懸濁液をフ
ィルターでこす。不溶性の物質を集めそしてマトリック
スを組み立てるのに使用する。この物質は基本的に大部
分コラーゲン性であり、それは骨形成および軟骨形成活
性を持たない。
リックスは５倍容の4Mグアニジン−HCl,50mM Tris−HC
l,pH7.0で16時間４℃において抽出される。懸濁液をフ
ィルターでこす。不溶性の物質を集めそしてマトリック
スを組み立てるのに使用する。この物質は基本的に大部
分コラーゲン性であり、それは骨形成および軟骨形成活
性を持たない。
3.マトリックスの処理 すべての骨のマトリックスの主要な成分はType−Ｉコ
ラーゲンである。コラーゲンに加えて、上で開示された
ように抽出された脱イオン化された骨は総量の５％の割
合を示す非コラーゲン性蛋白質を含む。異種性のマトリ
ックス中の、これらの非コラーゲン様蛋白質はそれ自身
潜在的な抗原として存在し、そして免疫原性および／あ
るいは阻害成分を構成する。そのような成分は同種型の
移植片においてもまた、骨の分化の発生カスケードを妨
げることにより骨形成を阻害する。マトリックス粒子を
コラーゲン繊維修飾剤で処理することにより、潜在的に
望ましからぬ成分がマトリックスから抽出され、そして
マトリックスの材料の表面の構造が変えられる事が本発
明により見いだされた。
ラーゲンである。コラーゲンに加えて、上で開示された
ように抽出された脱イオン化された骨は総量の５％の割
合を示す非コラーゲン性蛋白質を含む。異種性のマトリ
ックス中の、これらの非コラーゲン様蛋白質はそれ自身
潜在的な抗原として存在し、そして免疫原性および／あ
るいは阻害成分を構成する。そのような成分は同種型の
移植片においてもまた、骨の分化の発生カスケードを妨
げることにより骨形成を阻害する。マトリックス粒子を
コラーゲン繊維修飾剤で処理することにより、潜在的に
望ましからぬ成分がマトリックスから抽出され、そして
マトリックスの材料の表面の構造が変えられる事が本発
明により見いだされた。
今日最も好ましい繊維修飾剤は加熱した水性溶媒で、
最も好ましくは水である。さまざまな量の脱脂され、脱
イオン化されグアニジンで抽出された骨のコラーゲンを
湯浴中のガラスのフラスコで一定の速度で撹拌しながら
水中（1g/30ml）で加熱し、そして指示された温度にお
いて１時間保つ。幾つかの例においては、水は加熱前に
コラーゲンを膨張させることを助けるために0.1M酢酸で
置き換えられる。温度は室温、および約37℃、45℃、55
°、65°、75°において一定に保たれる。熱処理後、マ
トリックスをフィルターで濾過しそして凍結乾燥して移
植に使用する。
最も好ましくは水である。さまざまな量の脱脂され、脱
イオン化されグアニジンで抽出された骨のコラーゲンを
湯浴中のガラスのフラスコで一定の速度で撹拌しながら
水中（1g/30ml）で加熱し、そして指示された温度にお
いて１時間保つ。幾つかの例においては、水は加熱前に
コラーゲンを膨張させることを助けるために0.1M酢酸で
置き換えられる。温度は室温、および約37℃、45℃、55
°、65°、75°において一定に保たれる。熱処理後、マ
トリックスをフィルターで濾過しそして凍結乾燥して移
植に使用する。
マトリックス材料の形態に対するお湯の処理の効果は
第６図と第１図の光学顕微鏡写真の比較から明らかであ
る。第６図は（ａ）37℃、（ｂ）45℃、（ｃ）55℃、
（ｄ）65℃において処理された、効果的に変化したコラ
ーゲンの表面の形態を表す。第１図の光学顕微鏡写真は
非処理のラットおよびウシの骨のマトリックスの形態を
表す（それぞれＡ、およびＢ）。写真から明らかなよう
に、お湯の処理は粒子の表面の微小なくぼみの程度を少
なくとも約10倍増加させ、実質的に粒子の多孔性をも増
加させる（第１図のＢおよび第５図のC,Dを比較せ
よ）。マトリックス粒子のこの形態の変化は実質的に粒
子の表面積を増加させる。穴およびくぼみの大きさを注
意深く測定すると、マトリックス粒子への熱い水性溶媒
の処理は１μｍから100μｍの範囲の粒子の穴およびく
ぼみの直径を生じさせることが明らかである。
第６図と第１図の光学顕微鏡写真の比較から明らかであ
る。第６図は（ａ）37℃、（ｂ）45℃、（ｃ）55℃、
（ｄ）65℃において処理された、効果的に変化したコラ
ーゲンの表面の形態を表す。第１図の光学顕微鏡写真は
非処理のラットおよびウシの骨のマトリックスの形態を
表す（それぞれＡ、およびＢ）。写真から明らかなよう
に、お湯の処理は粒子の表面の微小なくぼみの程度を少
なくとも約10倍増加させ、実質的に粒子の多孔性をも増
加させる（第１図のＢおよび第５図のC,Dを比較せ
よ）。マトリックス粒子のこの形態の変化は実質的に粒
子の表面積を増加させる。穴およびくぼみの大きさを注
意深く測定すると、マトリックス粒子への熱い水性溶媒
の処理は１μｍから100μｍの範囲の粒子の穴およびく
ぼみの直径を生じさせることが明らかである。
お湯の処理により産生された抽出物の特性から、この
処理はまたそのマトリックス中への共存がin vivoにお
いて新しい骨の形成を妨げるような成分を除去している
ことも明らかにしている。第８図はお湯で処理したウシ
のマトリックスから単離された抽出物の214nmにおける
吸光のトレースであり、それぞれのピーク（もしくは画
分）のin vivoの骨の形成に対する効果を示す。
処理はまたそのマトリックス中への共存がin vivoにお
いて新しい骨の形成を妨げるような成分を除去している
ことも明らかにしている。第８図はお湯で処理したウシ
のマトリックスから単離された抽出物の214nmにおける
吸光のトレースであり、それぞれのピーク（もしくは画
分）のin vivoの骨の形成に対する効果を示す。
大スケールの調製作業（100gウシマトリックス、お湯
処理）からの抽出物を集め、0.1％TFAにより酸性化し、
そしてMillipore Delta Prep Cartrigeを使用してＣ−1
8 HPLCカラムで測定した。画分を25ml/分の流速で50mL
の間隔で集め、適当にプールしてトレースされた各ピー
クを分離した。そしてこれらの画分のそれぞれを組換え
体OP1および適切なラットのマトリックスキャリアー
（後記参照）とともに移植し、そしてその骨形成活性に
対する効果を測定した。第12画分のみが、同種型の移植
における骨の形成を阻害するようである。その阻害活性
は用量に依存するようである。このピークに存在する阻
害成分の除法は異種性の移植における骨形成活性の維持
に必要である可能性がある。第９図は12日目の移植片に
おいてアルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含
有量で調べた、お湯で処理されたマトリックスからの完
全な溶剤抽出物の骨形成活性に対する影響を表す。どの
ような抽出も行われないで移植されたラットのキャリア
ーマトリックスおよびOP1をポジティブコントロールと
して使用する。お湯で処理されたウシのマトリクス100
グラムから得られた溶剤抽出物を蒸発させそして6Mの50
％アセトニトリル/0.1％TFA中に溶解させた。その100−
300μｌのアリコートを既知量の組換え体OP1、および25
mgのラットマトリックスキャリアーと混合し、そしてア
ッセイした（以下を参照せよ）。結果は抽出物が用量に
依存して新しい骨の形成を阻害することを明らかに示し
ている。
処理）からの抽出物を集め、0.1％TFAにより酸性化し、
そしてMillipore Delta Prep Cartrigeを使用してＣ−1
8 HPLCカラムで測定した。画分を25ml/分の流速で50mL
の間隔で集め、適当にプールしてトレースされた各ピー
クを分離した。そしてこれらの画分のそれぞれを組換え
体OP1および適切なラットのマトリックスキャリアー
（後記参照）とともに移植し、そしてその骨形成活性に
対する効果を測定した。第12画分のみが、同種型の移植
における骨の形成を阻害するようである。その阻害活性
は用量に依存するようである。このピークに存在する阻
害成分の除法は異種性の移植における骨形成活性の維持
に必要である可能性がある。第９図は12日目の移植片に
おいてアルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含
有量で調べた、お湯で処理されたマトリックスからの完
全な溶剤抽出物の骨形成活性に対する影響を表す。どの
ような抽出も行われないで移植されたラットのキャリア
ーマトリックスおよびOP1をポジティブコントロールと
して使用する。お湯で処理されたウシのマトリクス100
グラムから得られた溶剤抽出物を蒸発させそして6Mの50
％アセトニトリル/0.1％TFA中に溶解させた。その100−
300μｌのアリコートを既知量の組換え体OP1、および25
mgのラットマトリックスキャリアーと混合し、そしてア
ッセイした（以下を参照せよ）。結果は抽出物が用量に
依存して新しい骨の形成を阻害することを明らかに示し
ている。
繊維修飾剤に接触させた後、処理されたマトリックス
を、以下の手続きの形にしたがって洗浄し、どのような
抽出成分をも除去する： 1.TBS（Tris緩衝塩）に1g/200mlで懸濁させそして４℃
において２時間撹拌する；あるいは6M尿素、50mM Tris
−HCl,500mM NaCl,pH7.0（UTBS）あるいは水に懸濁させ
そして室温（RT）で30分間撹拌する（pH値を中和状態に
するのに十分な時間）； 2.遠心しそして洗浄ステップを繰り返す；そして 3.遠心して；上清を捨てて；残渣を水で洗い；そして凍
結乾燥する。
を、以下の手続きの形にしたがって洗浄し、どのような
抽出成分をも除去する： 1.TBS（Tris緩衝塩）に1g/200mlで懸濁させそして４℃
において２時間撹拌する；あるいは6M尿素、50mM Tris
−HCl,500mM NaCl,pH7.0（UTBS）あるいは水に懸濁させ
そして室温（RT）で30分間撹拌する（pH値を中和状態に
するのに十分な時間）； 2.遠心しそして洗浄ステップを繰り返す；そして 3.遠心して；上清を捨てて；残渣を水で洗い；そして凍
結乾燥する。
他の有用な繊維修飾剤はトリフルオロ酢酸およびフッ
化水素のような酸、およびジクロロメタン、アセトニト
リル、イソプロパノール、およびクロロホルムのような
有機溶媒およびそれらの薬剤の組み合わせを含む。これ
らの他の繊維修飾剤を使用したマトリックスの処理は、
これらの繊維修飾剤が脱イオン化され、グアニジン抽出
された骨のコラーゲン粒子に対して及ぼす効果の詳細な
物理的な分析とともに、米国特許出願第422,613号（198
9年10月17日出願）に開示され、その開示は引用により
本明細書に含まれる。
化水素のような酸、およびジクロロメタン、アセトニト
リル、イソプロパノール、およびクロロホルムのような
有機溶媒およびそれらの薬剤の組み合わせを含む。これ
らの他の繊維修飾剤を使用したマトリックスの処理は、
これらの繊維修飾剤が脱イオン化され、グアニジン抽出
された骨のコラーゲン粒子に対して及ぼす効果の詳細な
物理的な分析とともに、米国特許出願第422,613号（198
9年10月17日出願）に開示され、その開示は引用により
本明細書に含まれる。
コラーゲンのマトリックスの材料は、好ましくは水に
不溶性の、非接着性粒子からなる微粉末の形をとる。新
しい骨の成育あるいは持続した放出が望まれる所で単に
所定の容積に圧縮して、周辺組織によってその場所に保
持して使用される。あるいは、この粉末は身体に素早く
吸収されるような例えば、ゼラチンあるいはポリ乳酸コ
ーティングのカプセルに入れてもよい。この粉末は与え
られた寸法の容積に形づくりそして該粒子を例えば可溶
性の、種に関して生物的に適合できるコラーゲンを使用
して内部接着することによりその形状に維持することも
できる。この粉末材料はまたシート状、棒状、ビーズ
状、あるいは他の肉眼で見える形につくることもでき
る。
不溶性の、非接着性粒子からなる微粉末の形をとる。新
しい骨の成育あるいは持続した放出が望まれる所で単に
所定の容積に圧縮して、周辺組織によってその場所に保
持して使用される。あるいは、この粉末は身体に素早く
吸収されるような例えば、ゼラチンあるいはポリ乳酸コ
ーティングのカプセルに入れてもよい。この粉末は与え
られた寸法の容積に形づくりそして該粒子を例えば可溶
性の、種に関して生物的に適合できるコラーゲンを使用
して内部接着することによりその形状に維持することも
できる。この粉末材料はまたシート状、棒状、ビーズ
状、あるいは他の肉眼で見える形につくることもでき
る。
IV.骨形成具の構成 上で説明されたような組換え体蛋白質および他の構成
物は以下に記述される任意の方法を用いて、適当なマト
リックス調製物中に混合および分散させうる： 1.エタノール沈殿 マトリックスをグアニジン−塩酸に溶解している骨形
成蛋白質に加える。サンプルを回転運動により撹拌して
低温においてインキュベートする。そしてサンプルをさ
らに回転運動により撹拌する。混合物に冷たい無水のエ
タノールを加え、撹拌およびインキュベートする。遠心
後（微量遠心管、高速）上清を除去する。マトリックス
を、冷やした濃縮エタノール水溶液により洗浄し、そし
て凍結乾燥する。
物は以下に記述される任意の方法を用いて、適当なマト
リックス調製物中に混合および分散させうる： 1.エタノール沈殿 マトリックスをグアニジン−塩酸に溶解している骨形
成蛋白質に加える。サンプルを回転運動により撹拌して
低温においてインキュベートする。そしてサンプルをさ
らに回転運動により撹拌する。混合物に冷たい無水のエ
タノールを加え、撹拌およびインキュベートする。遠心
後（微量遠心管、高速）上清を除去する。マトリックス
を、冷やした濃縮エタノール水溶液により洗浄し、そし
て凍結乾燥する。
2.アセトニトリル トリフルオロ酢酸での凍結乾燥 この方法において、アセトニトリル トリフルオロ酢
酸（ACN/TFA）溶液中の骨形成蛋白質をキャリアー材料
に加えた。サンプルを何度も激しく渦巻き撹拌してその
後凍結乾燥する。骨形成蛋白質をさまざまな濃度で、そ
して幾つかの精製段階において加える。この方法は今日
好まれている。
酸（ACN/TFA）溶液中の骨形成蛋白質をキャリアー材料
に加えた。サンプルを何度も激しく渦巻き撹拌してその
後凍結乾燥する。骨形成蛋白質をさまざまな濃度で、そ
して幾つかの精製段階において加える。この方法は今日
好まれている。
3.尿素での凍結乾燥 尿素緩衝液中において調製された骨形成蛋白質につい
ては、蛋白質をマトリックス材料と混合し、何度も渦巻
き撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材料
“そのまま”移植に使用される。
ては、蛋白質をマトリックス材料と混合し、何度も渦巻
き撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材料
“そのまま”移植に使用される。
4.緩衝化塩溶液からの凍結乾燥 生理学的塩溶液中のOPの調製物もまたマトリックスを
渦巻き撹拌しそして骨形成活性のある材料を生産するた
めに凍結乾燥する。
渦巻き撹拌しそして骨形成活性のある材料を生産するた
めに凍結乾燥する。
これらの方法はまた、持続された放出の目的のために
他の活性のある治療剤、ホルモン、およびさまざまな生
物的に活性のある成分を吸着させるために使用されう
る。
他の活性のある治療剤、ホルモン、およびさまざまな生
物的に活性のある成分を吸着させるために使用されう
る。
V.バイオアッセイ さまざまなマトリックスの機能はin vivoにおけるラ
ットのバイオアッセイにより評価される。ラットにおけ
る研究は、適切なマトリックス中での骨形成の効果が、
マトリックス内に分散された骨形成蛋白質の量に依存し
ていることを示している。もしもマトリックスだけがが
移植されたならば、活性は観察されない。もしも上に開
示されたように処理されずに移植されたときは、文献に
記述されたタイプの脱イオン化され、グアニジン抽出さ
れた異種性の骨マトリックス材料はキャリアーとして効
果がなく、骨を誘導できず、そして炎症性の免疫応答を
生じる。多くの同種型マトリックス材料もまたキャリア
ーとして有効でない。以下は、対照マトリックスおよび
上で述べられたように調製されたマトリックス材料から
骨形成具を作成するために、およびそれらの骨形成の利
用性を評価するためにさまざまな方法を示す。
ットのバイオアッセイにより評価される。ラットにおけ
る研究は、適切なマトリックス中での骨形成の効果が、
マトリックス内に分散された骨形成蛋白質の量に依存し
ていることを示している。もしもマトリックスだけがが
移植されたならば、活性は観察されない。もしも上に開
示されたように処理されずに移植されたときは、文献に
記述されたタイプの脱イオン化され、グアニジン抽出さ
れた異種性の骨マトリックス材料はキャリアーとして効
果がなく、骨を誘導できず、そして炎症性の免疫応答を
生じる。多くの同種型マトリックス材料もまたキャリア
ーとして有効でない。以下は、対照マトリックスおよび
上で述べられたように調製されたマトリックス材料から
骨形成具を作成するために、およびそれらの骨形成の利
用性を評価するためにさまざまな方法を示す。
移植 本明細書に引用して取り入れられている、Sampath an
d Reddi（Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1983）80:6591
−6595）により記述されている骨の誘導のバイオアッセ
イは、軟骨性骨の分化の活性を監視するために使用でき
る。このアッセイは、エーテルの知覚麻痺下における受
容ラットの皮下部位への異種性のウシ試験サンプルを移
植することからなる。オスのLong−Evansラット、28−3
2日齢、を使用した。水平な切れ込み（1cm）を胸部の領
域の上の皮膚に滅菌状態でつくり、そしてくぼみを鋭い
切開によりつくる。約25mgの試験サンプルをくぼみの中
に深く移植しそして切れ込みを金属製の皮膚クリップで
閉じる。移植の日を実験の日と呼ぶ。移植片は12日目に
除去した。従属栄養の部位は、独立栄養部位の使用によ
り起こりうるあいまいさなしに骨の誘導の研究を可能と
する。
d Reddi（Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1983）80:6591
−6595）により記述されている骨の誘導のバイオアッセ
イは、軟骨性骨の分化の活性を監視するために使用でき
る。このアッセイは、エーテルの知覚麻痺下における受
容ラットの皮下部位への異種性のウシ試験サンプルを移
植することからなる。オスのLong−Evansラット、28−3
2日齢、を使用した。水平な切れ込み（1cm）を胸部の領
域の上の皮膚に滅菌状態でつくり、そしてくぼみを鋭い
切開によりつくる。約25mgの試験サンプルをくぼみの中
に深く移植しそして切れ込みを金属製の皮膚クリップで
閉じる。移植の日を実験の日と呼ぶ。移植片は12日目に
除去した。従属栄養の部位は、独立栄養部位の使用によ
り起こりうるあいまいさなしに骨の誘導の研究を可能と
する。
細胞の変化 移植の成功は：（１）一日目の多核性白血球による一
過的な浸潤；（２）二日目および三日目の間充組織細胞
の遊走および増殖；（３）五日目および六日目の軟骨細
胞の出現；（４）七日目の軟骨のマトリックスの形成：
（５）八日目の軟骨のカルシウム沈着：（６）九日目お
よび十日目の血管の侵入、造骨細胞の出現、および新し
い骨の形成；（７）十二日目から十八日目の造骨細胞お
よび骨の改造の出現および移植されたマトリックスの溶
解；そして（８）二十一日目の小骨における造血骨の骨
髄分化を含むマトリックス誘導軟骨性骨の発育の段階を
経由して制御された発達をもたらす。その結果は、新し
い骨の形は移植されたマトリックスの形をとるというこ
とを表す。
過的な浸潤；（２）二日目および三日目の間充組織細胞
の遊走および増殖；（３）五日目および六日目の軟骨細
胞の出現；（４）七日目の軟骨のマトリックスの形成：
（５）八日目の軟骨のカルシウム沈着：（６）九日目お
よび十日目の血管の侵入、造骨細胞の出現、および新し
い骨の形成；（７）十二日目から十八日目の造骨細胞お
よび骨の改造の出現および移植されたマトリックスの溶
解；そして（８）二十一日目の小骨における造血骨の骨
髄分化を含むマトリックス誘導軟骨性骨の発育の段階を
経由して制御された発達をもたらす。その結果は、新し
い骨の形は移植されたマトリックスの形をとるというこ
とを表す。
組織学的な評価 組織学切片の作成および染色が、移植片の骨形成の程
度を決定するために好ましい。移植片をブアン溶液で固
定し、パラフィンで包み、そして６−８μｍの切片に切
断する。トルイジン ブルーあるいはヘモトキシリン／
エオシンによる染色は軟骨性骨の究極的発育を明らかに
証明している。十二日目の移植片は、移植片が新しく誘
導された骨を含んでいるかどうかを決定するのに通常十
分である。
度を決定するために好ましい。移植片をブアン溶液で固
定し、パラフィンで包み、そして６−８μｍの切片に切
断する。トルイジン ブルーあるいはヘモトキシリン／
エオシンによる染色は軟骨性骨の究極的発育を明らかに
証明している。十二日目の移植片は、移植片が新しく誘
導された骨を含んでいるかどうかを決定するのに通常十
分である。
生物学的マーカー アルカリ ホスファターゼ活性は骨形成のマーカーと
して使用できる。この酵素活性は移植片のホモジェナイ
ズ化の後に、分光光度法により測定できる。活性はin
vivoにおいて９−10日目に最大に達しそしてその後ゆっ
くりと減少する。組織学的な検査で骨の形成を示さない
移植片は、この分析条件において、ほとんどあるいは全
くアルカリ ホスファターゼ活性を示さない。この分析
は移植片がラットから除去された後に、素早く骨形成の
評価を得ることおよび定量することに有用である。ある
いは、骨の形成量は移植片のカルシウム含有量を測定す
ることにより決定され得る。
して使用できる。この酵素活性は移植片のホモジェナイ
ズ化の後に、分光光度法により測定できる。活性はin
vivoにおいて９−10日目に最大に達しそしてその後ゆっ
くりと減少する。組織学的な検査で骨の形成を示さない
移植片は、この分析条件において、ほとんどあるいは全
くアルカリ ホスファターゼ活性を示さない。この分析
は移植片がラットから除去された後に、素早く骨形成の
評価を得ることおよび定量することに有用である。ある
いは、骨の形成量は移植片のカルシウム含有量を測定す
ることにより決定され得る。
結果 種々の細胞源からのおよび種々の程度に精製された
（１−５％純粋から30−90％純粋）OP1で、約25mgのマ
トリックスを使用して上述のようにin vivoにおいて骨
形成活性を試験した。以下の表IIIは全部の３つの細胞
タイプにおいて発現されたOP1の組織学的な点数を示
す。
（１−５％純粋から30−90％純粋）OP1で、約25mgのマ
トリックスを使用して上述のようにin vivoにおいて骨
形成活性を試験した。以下の表IIIは全部の３つの細胞
タイプにおいて発現されたOP1の組織学的な点数を示
す。
表IIIに詳細に示されている組織学的点数は、OP1が細
胞源にかかわらず活性をもち、そしてその活性は天然の
ウシOP1ににているということを表す。骨誘導活性は高
度に再現性があり、用量に依存している。組換え体OP1
の骨形成活性のさらなる証明は第10図および11図の写真
により提供される。
胞源にかかわらず活性をもち、そしてその活性は天然の
ウシOP1ににているということを表す。骨誘導活性は高
度に再現性があり、用量に依存している。組換え体OP1
の骨形成活性のさらなる証明は第10図および11図の写真
により提供される。
第10図Ａ−ＦはCOS、BSC、およびCOS細胞から発現さ
れた組換え体OP1を使用した同種型の移植片の組織を記
録した写真である。マイクログラフ（220xに拡大）は本
発明の骨形成蛋白質により誘導された完全な発生カスケ
ードの図による証明を提供し、このことはマトリックス
と一緒に移植されたときに、組換え体により生産された
OP1だけで軟骨性骨の形成を誘導するのに十分であるこ
とを確認するものである。第10図Ａで証明されたよう
に、OP1を含まない同種型の移植片は移植後12日目に新
しい骨の形成を示さない。移植された骨のマトリックス
（ｍ）および周辺の間充組織だけが見られる。逆に、OP
1を含んだ移植片は移植後７日目に既に広範囲な軟骨形
成の証明を示している（第10図Ｂ、550ng BSC生産蛋白
質、30％純粋）。ここで、新しく形成された軟骨、軟骨
芽細胞（Cb）、軟骨細胞（Cy）はマトリックス（ｍ）に
ぴったりと接触している。９日目の移植片の軟骨の分化
により、軟骨のカルシウム沈着、軟骨細胞の肥大、血管
の侵入、および新しい骨の形成の開始が全て明らかにな
った（第10図C,220ngCOS生産蛋白質、約５％純粋）。キ
ャピラリーの侵入（ｃ）および血管内皮の近くの好塩基
性の造骨細胞の出現（矢印で示された）は特に明らかで
ある。移植の12日後までに広範囲な骨形成および改造が
おきた（第10図Ｄ（220x），および10図Ｅ（400x）,CHO
生産蛋白質、約60％純粋）。造骨細胞によりつくられて
新しく形成された骨は多核の造骨細胞（Oc）により改造
されつつあり、移植されたマトリックスは再吸収されつ
つあり、そして改造された骨により取り替えられつつあ
る。新しく形成された小骨の骨の骨髄の出現もまた明ら
かである。最後に、小骨内部の造血骨の骨髄の分化は、
移植後22日目に観察され得る（第10図Ｆ、500ngのBSC生
産蛋白質、30％純粋）。このときまでに、ほとんどの移
植されたマトリックス（ｍ）は再吸収されそして赤血球
および顆粒細胞系および巨核細胞を含んだ骨の骨髄の要
素で満たされた小骨を含む新しく形成された骨により占
められている。同様な組織学的な観察が、90％よりも純
粋なOP1蛋白質の調製物を取り込んだ移植片でも見られ
た。
れた組換え体OP1を使用した同種型の移植片の組織を記
録した写真である。マイクログラフ（220xに拡大）は本
発明の骨形成蛋白質により誘導された完全な発生カスケ
ードの図による証明を提供し、このことはマトリックス
と一緒に移植されたときに、組換え体により生産された
OP1だけで軟骨性骨の形成を誘導するのに十分であるこ
とを確認するものである。第10図Ａで証明されたよう
に、OP1を含まない同種型の移植片は移植後12日目に新
しい骨の形成を示さない。移植された骨のマトリックス
（ｍ）および周辺の間充組織だけが見られる。逆に、OP
1を含んだ移植片は移植後７日目に既に広範囲な軟骨形
成の証明を示している（第10図Ｂ、550ng BSC生産蛋白
質、30％純粋）。ここで、新しく形成された軟骨、軟骨
芽細胞（Cb）、軟骨細胞（Cy）はマトリックス（ｍ）に
ぴったりと接触している。９日目の移植片の軟骨の分化
により、軟骨のカルシウム沈着、軟骨細胞の肥大、血管
の侵入、および新しい骨の形成の開始が全て明らかにな
った（第10図C,220ngCOS生産蛋白質、約５％純粋）。キ
ャピラリーの侵入（ｃ）および血管内皮の近くの好塩基
性の造骨細胞の出現（矢印で示された）は特に明らかで
ある。移植の12日後までに広範囲な骨形成および改造が
おきた（第10図Ｄ（220x），および10図Ｅ（400x）,CHO
生産蛋白質、約60％純粋）。造骨細胞によりつくられて
新しく形成された骨は多核の造骨細胞（Oc）により改造
されつつあり、移植されたマトリックスは再吸収されつ
つあり、そして改造された骨により取り替えられつつあ
る。新しく形成された小骨の骨の骨髄の出現もまた明ら
かである。最後に、小骨内部の造血骨の骨髄の分化は、
移植後22日目に観察され得る（第10図Ｆ、500ngのBSC生
産蛋白質、30％純粋）。このときまでに、ほとんどの移
植されたマトリックス（ｍ）は再吸収されそして赤血球
および顆粒細胞系および巨核細胞を含んだ骨の骨髄の要
素で満たされた小骨を含む新しく形成された骨により占
められている。同様な組織学的な観察が、90％よりも純
粋なOP1蛋白質の調製物を取り込んだ移植片でも見られ
た。
第11図はお湯で処理されたウシマトリックスおよびOP
1（BSCで生産された）を使用した異種性の移植片の移植
後12日目の組織学を表す顕微鏡写真である。造血骨の骨
髄の要素の出現は、OP1をもちいた異種性移植の骨形成
活性が同種型の移植のそれとパラレルである事を表す、
マイクロ写真において明らかである（第11図と第10図Ｄ
および10図Ｅを比較せよ）。
1（BSCで生産された）を使用した異種性の移植片の移植
後12日目の組織学を表す顕微鏡写真である。造血骨の骨
髄の要素の出現は、OP1をもちいた異種性移植の骨形成
活性が同種型の移植のそれとパラレルである事を表す、
マイクロ写真において明らかである（第11図と第10図Ｄ
および10図Ｅを比較せよ）。
OP1のマトリックスの移植により示されそして第10図
および11図において明らかにされた細胞の変化は、胎児
の発生の間に起こる軟骨性骨の分化に本当ににている。
軟骨性骨の分化は優勢なルートであったが、移植片の外
側の表面の膜内部の骨の形成の証明もある。
および11図において明らかにされた細胞の変化は、胎児
の発生の間に起こる軟骨性骨の分化に本当ににている。
軟骨性骨の分化は優勢なルートであったが、移植片の外
側の表面の膜内部の骨の形成の証明もある。
第12図および第13図は本発明の同種型の移植片（第12
図）および本発明の異種性移植（第13図）のアルカリホ
スファターゼ特異的活性およびカルシウム含有量により
決定されるような、移植後12日目の骨形成活性の用量依
存性を表す。すべての場合において、OP1蛋白質の濃度
（イムノブロット染色あるいはゲルスキャニングにより
定量された）はナノグラムで表されている。それぞれの
場合において、骨の誘導活性はすべての細胞において用
量依存的にOP1に対して特異的である。
図）および本発明の異種性移植（第13図）のアルカリホ
スファターゼ特異的活性およびカルシウム含有量により
決定されるような、移植後12日目の骨形成活性の用量依
存性を表す。すべての場合において、OP1蛋白質の濃度
（イムノブロット染色あるいはゲルスキャニングにより
定量された）はナノグラムで表されている。それぞれの
場合において、骨の誘導活性はすべての細胞において用
量依存的にOP1に対して特異的である。
本発明はその精神または必須の特性から離れることな
い他の特定の形で具体化されうる。したがって本明細書
中の態様はすべての面において例示的な限定されないも
のとして考えられ、本発明の範囲は前述の記述よりむし
ろ添付された請求の範囲により決定され、請求の範囲と
均等の目的および範囲内において生じるすべての変化は
したがってここに包含されることを意図されている。
い他の特定の形で具体化されうる。したがって本明細書
中の態様はすべての面において例示的な限定されないも
のとして考えられ、本発明の範囲は前述の記述よりむし
ろ添付された請求の範囲により決定され、請求の範囲と
均等の目的および範囲内において生じるすべての変化は
したがってここに包含されることを意図されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ５６９，９２０ (32)優先日 1990年８月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 ルージャー，デーヴィッド・シー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02132，ウエスト・ロックスベリー，エ ッジミア・ロード 150，アパートメン ト ４ (72)発明者 オズカイナック，エンジン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01757，ミルフォード，パーデュー・ド ライブ 44 (72)発明者 パング，ロイ・エイチ・エル アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02053，メドウェイ，キンバリー・ドラ イブ 16 (56)参考文献 特開 昭60−226814（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／205（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．86，ｐ．4554− 4558（1989)
Claims (42)
- 【請求項１】活性な骨形成蛋白質を生産する方法であっ
て、該骨形成蛋白質は、酸化状態で結合している一対の
ポリペプチド鎖を含み、該一対のポリペプチド鎖は軟骨
性骨形成を誘導し得る構造のダイマー種を形成し、該一
対のポリペプチド鎖の少なくとも一方は、114またはそ
れ以上のアミノ酸を有し、かつ、（ｉ）以下のアミノ酸
配列： または（ii）該アミノ酸配列と少なくとも70％の配列相
同性を有するポリペプチドを含み、 以下の工程： （ａ）該ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列
を含む遺伝物質を提供する工程； （ｂ）該遺伝物質を宿主細胞へ導入する工程；および （ｃ）該宿主細胞内の該遺伝物質を発現させる工程 を包含する、方法。 - 【請求項２】前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター
卵巣細胞またはサルの腎細胞である、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】前記ポリペプチド鎖の各々が前記宿主細胞
において個々に発現され、ホモダイマー種またはヘテロ
ダイマー種を形成するようにin vitroにおいて、酸化さ
れ、再びおりたたまれる、請求項１または２に記載の方
法。 - 【請求項４】前記ダイマー蛋白質が、前記宿主細胞から
酸化されたダイマーとして分泌され、該細胞の培養液か
ら精製される、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】前記蛋白質が融合蛋白質として発現され
る、請求項１から４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】前記一対のポリペプチド鎖の各々が、 からなる群から独立して選択される、請求項１から５の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項７】前記蛋白質が、前記一対のポリペプチド鎖
の一方が骨形態形成タンパク質２（BMP2）であるヘテロ
ダイマーである、請求項１から６のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項８】前記蛋白質が、前記一対のポリペプチド鎖
の一方が前記OP1−18であって、他方が前記OP1−16V、O
P1−16S、OP1−16L、OP1−16MまたはOP1−16Aから選択
される、ヘテロダイマーである、請求項１から６のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項９】前記遺伝物質のコピー数が前記宿主細胞内
で増幅される、請求項１から８のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１０】酸化状態で結合している一対のポリペプ
チド鎖を含み、該一対のポリペプチド鎖は軟骨性骨形成
を誘導し得る構造のダイマー種を形成している骨形成蛋
白質であって、該一対のポリペプチド鎖の少なくとも一
方は、114またはそれ以上のアミノ酸を有し、かつ、以
下のアミノ酸配列： を含む、骨形成蛋白質。 - 【請求項１１】前記一対のポリペプチド鎖の少なくとも
一方が、以下の配列： を含む、請求項10に記載の蛋白質。 - 【請求項１２】請求項１から９のいずれかに記載の方法
により生産される、骨形成蛋白質。 - 【請求項１３】SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
における分子量マーカーとの比較により決定される、約
30〜36kDの見かけ分子量を酸化された時に有する、請求
項10から12に記載の蛋白質。 - 【請求項１４】SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
における分子量マーカーとの比較により決定される、約
36kDの見かけ分子量を酸化された時に有する、請求項13
に記載の蛋白質。 - 【請求項１５】グリコシル化されていない、請求項10か
ら14のいずれかに記載の蛋白質。 - 【請求項１６】前記一対のポリペプチド鎖の各々が以下
の遺伝子： から得られるヌクレオチド配列にコードされたポリペプ
チドである、請求項10から15のいずれかに記載の蛋白
質。 - 【請求項１７】骨形成活性の半最大活性値が、移植片1m
gあたり約0.8から1.0ngである、請求項10から16のいず
れかに記載の蛋白質。 - 【請求項１８】哺乳動物への移植のための骨形成具であ
って： （ａ）該哺乳動物の体からの移動性先祖細胞の流入、分
化および増殖に十分な大きさの孔を有する、生体適合性
でin vivoにおいて生物的に分解されるマトリックス；
および （ｂ）請求項10から17のいずれかに記載の蛋白質 を含む、骨形成具。 - 【請求項１９】前記マトリックスが同種または異種の骨
コラーゲンを含む、請求項18に記載の骨形成具。 - 【請求項２０】前記マトリックスが、脱イオン化され、
脱脂されたType I不溶性骨コラーゲン粒子であって、非
コラーゲン性蛋白質が除去され、該粒子の形態を変える
のに十分な量および時間で、約37℃以上の温度の水性溶
媒によって処理された、Type I不溶性骨コラーゲン粒子
を含む、請求項18または19に記載の骨形成具。 - 【請求項２１】前記マトリックスが、37℃から65℃の範
囲の温度の水性溶媒で処理された、請求項18から20のい
ずれかに記載の骨形成具。 - 【請求項２２】前記マトリックスが、前記コラーゲン粒
子の表面上の孔およびくぼみの数が少なくとも10倍増加
するように処理された、請求項18から21のいずれかに記
載の骨形成具。 - 【請求項２３】前記骨コラーゲン粒子が１μｍから100
μｍの範囲の平均直径を有する孔およびくぼみを含む、
請求項20から22のいずれかに記載の骨形成具。 - 【請求項２４】前記コラーゲン粒子が70μｍから850μ
ｍの範囲の平均直径を有する、請求項20から23に記載の
骨形成具。 - 【請求項２５】脱イオン化され、脱脂されたType I不溶
性骨コラーゲン粒子であって、約37℃以上の温度の水性
溶媒で、骨形成を阻害する物質を除去するに十分な量お
よび時間で処理することによって、骨形成を阻害する物
質が除去された、Type I不溶性骨コラーゲン粒子を含
む、請求項18から24のいずれかに記載の骨形成具。 - 【請求項２６】軟骨性骨形成または軟骨修復に用いるた
めの請求項10から17のいずれかに記載の蛋白質。 - 【請求項２７】前記軟骨性骨形成または軟骨修復が、歯
周の治療、骨関節炎治療、癒着不良骨折矯正、および、
後天性および先天性の脳顔面頭蓋、他の骨格または歯の
奇形治療からなる群から選択される治療のためである、
請求項26に記載の蛋白質。 - 【請求項２８】軟骨性骨形成または軟骨修復に用いるた
めの請求項18から25のいずれかに記載の骨形成具。 - 【請求項２９】前記軟骨性骨形成または軟骨修復が、歯
周の治療、骨関節炎治療、癒着不良骨折矯正、および、
後天性および先天性の脳顔面頭蓋、他の骨格または歯の
奇形治療からなる群から選択される治療のためである、
請求項28に記載の骨形成具。 - 【請求項３０】骨形成蛋白質のアミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を含む核酸であって、該アミノ酸配
列は以下の配列： を含む、核酸。 - 【請求項３１】前記アミノ酸配列が以下の配列： を含む、請求項30に記載の核酸。
- 【請求項３２】請求項10から17のいずれかに記載の蛋白
質のポリペプチド鎖の一つをコードする核酸であって、
以下の遺伝子： に含まれるヌクレオチド配列中： （ａ）1000位から1341位の配列； （ｂ）994位から1341位の配列； （ｃ）991位から1341位の配列； （ｄ）985位から1341位の配列； （ｅ）946位から1341位の配列； （ｆ）925位から1341位の配列； （ｇ）139位から1341位の配列；または （ｈ）49位から1341位の配列； のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸であって、該
ヌクレオチド配列は、配列（ａ）〜（ｈ）のいずれか１
つによりコードされるポリペプチドと同じポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列変異物を包含する、核
酸。 - 【請求項３３】請求項30から32のいずれかに記載の核酸
を含むベクター。 - 【請求項３４】請求項30から32のいずれかに記載の核
酸、または請求項33に記載のベクターを含む宿主細胞。 - 【請求項３５】チャイニーズハムスター卵巣細胞および
サルの腎細胞からなる群から選択される、請求項34に記
載の宿主細胞。 - 【請求項３６】ヒトOP1蛋白質に対する抗血清。
- 【請求項３７】ヒトOP1蛋白質に対する抗血清を生産す
る方法であって、以下の工程： （ａ）請求項10から17のいずれかに記載の蛋白質を調製
する工程；および （ｂ）該蛋白質で動物を免疫する工程 を包含する、方法。 - 【請求項３８】骨形成活性を有するOP1合成由来物を生
産する方法であって、以下の工程： （ａ）少なくとも114のアミノ酸および以下の配列： を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
提供する工程； （ｂ）該配列の一つまたはそれ以上のヌクレオチドを欠
失、付加または置換し、変異配列を作成する工程、ここ
で該変異配列にコードされる合成ポリペプチド鎖は、別
のポリペプチド鎖と結合してダイマー種を形成したと
き、該ダイマー種は、軟骨性骨形成を誘導し得る；およ
び （ｃ）該変異配列を宿主細胞内で発現させる工程 を包含する、方法。 - 【請求項３９】骨形成活性を有するOP1合成由来物を生
産する方法であって、以下の工程： （ａ）少なくとも114のアミノ酸および以下の配列： を有するアミノ酸配列を提供する工程；および （ｂ）該配列の変異配列を含むポリペプチド鎖が生産さ
れ、別のポリペプチド鎖と結合してダイマー種を形成し
たとき、該ダイマー種が、軟骨性骨形成を誘導し得るよ
うに、該配列の一つまたはそれ以上のアミノ酸を欠失、
付加または置換する工程 を包含する、方法。 - 【請求項４０】前記OP1合成由来物が、前記OP1−16Vの
アミノ酸配列に対して少なくとも70％の配列相同性を有
する、請求項38または39に記載の方法。 - 【請求項４１】前記ヌクレオチド配列が、以下の遺伝
子： に含まれるヌクレオチド配列中： （ａ）1000位から1341位の配列； （ｂ）994位から1341位の配列； （ｃ）991位から1341位の配列； （ｄ）985位から1341位の配列； （ｅ）946位から1341位の配列； （ｆ）925位から1341位の配列； （ｇ）139位から1341位の配列；または （ｈ）49位から1341位の配列； のいずれかを含む、請求項１から９、38、39および40の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項４２】請求項38から41のいずれかに記載の方法
により生産される、骨形成活性を有するOP1合成由来
物。
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