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JP7538795B2 - 操作された細胞外小胞及びその使用 - Google Patents

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Description

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願において提出された電子的に提出された配列表の内容（名前：４０００＿０４１ＰＣ０１＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：１１６，３４４バイト、及び作成日：２０１９年５月２２日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、がん及び他の疾患の予防または治療のための薬剤として有用であり得る、細胞外小胞の内腔表面と会合された足場タンパク質が富化された細胞外小胞、例えば、エクソソームを提供する。
エクソソームは、細胞間コミュニケーションの重要な媒介物質である。これらはまた、がんなどの多くの疾患の診断及び予後における重要なバイオマーカーである。薬物送達ビヒクルとして、エクソソームは、多くの治療領域において、新たな治療モダリティとして、従来の薬物送達方法を超えて多くの利益を提供する。
エクソソームの中心的特徴は、それらの内部空間、または内腔内に生物学的に活性なペイロードを含む能力である。エクソソームは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、炭水化物、及び脂質を含む内因性ペイロードを含むことは周知であるが、所望の治療的ペイロードの特異的担持を導く能力は、現在限定される。エクソソームは、産生細胞において所望の治療的ペイロードを過剰発現することによって担持され得るが、この担持は、細胞エクソソーム処理センターへのペイロードの確率論的な局在化に起因して、効率が限定されていることが多い。あるいは、精製されたエクソソームは、例えば、エレクトロポレーションによってエクスビボで担持され得る。これらの方法は、低効率に苦しみ得るか、またはｓｉＲＮＡのような小さなペイロードに限定され得る。したがって、エクソソームベースの技術の治療的使用及び他の用途をより良く可能にするために、非常に効率的で明確に定義された担持エクソソームを生成するための好適な方法が必要とされる。
本開示の態様は、細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、治療的使用のためのエクソソームを担持する新規な方法に関する。具体的には、方法は、エクソソームの内腔表面から新たに識別されるタンパク質マーカーを使用する。特に、タンパク質の群（例えば、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）及び脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１））は、エクソソームの内腔表面上で非常に豊富であることが特定された。さらに、ＢＡＳＰ１のアミノ末端の短い配列、例えば、少なくとも７つのアミノ酸は、蛍光タンパク質分子の高効率担持を全長ＢＡＳＰ１タンパク質と同じ程度に導くのに十分であることが示された。少なくとも７個のアミノ酸及び１０個未満のアミノ酸であるこの断片は、操作されたＥＶ担持の分野において有意な進歩を提示し、エクスビボ操作の追加のステップを伴わず、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔への任意の生物学的に活性な分子、例えば、治療的タンパク質ペイロードの効率的で再現可能な担持を可能にする。本明細書に記載される融合タンパク質を使用したＥＶ、例えば、エクソソームの担持は、これまでに記載された任意の他の遺伝子工学的方法と比較して著しく高いペイロードレベルを有する操作されたＥＶ、例えば、操作されたエクソソームを産生する。
エクソソームから新たに同定されたタンパク質及びペプチド配列は、本開示の様々な実施形態で使用される。例えば、いくつかの実施形態は、ＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質またはタンパク質断片（すなわち、足場タンパク質）と生物学的に活性な分子（例えば、治療的に関連するタンパク質）とをコンジュゲートすることによって融合タンパク質を生成し、ＥＶの内腔表面上に融合タンパク質を含むＥＶ、例えば、エクソソームを産生することに関する。生物学的に活性な分子の天然の完全長タンパク質または生物学的に活性な断片（例えば、治療的に関連するタンパク質）は、エクソソームが富化されたタンパク質またはタンパク質断片にコンジュゲートされることによって、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に輸送され得る。
本開示は、さらに、より効率的な担持、またはＥＶ、例えば、エクソソームの内腔中の生物学的に活性な分子（例えば、治療的に関連するタンパク質）の担持のために設計された内腔操作されたＥＶ、例えば、内腔操作されたエクソソームの生成または使用に関する。例えば、ＥＶの内腔表面は、より高い濃度の天然全長ＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質及び／または内腔表面上の天然ＥＶの断片もしくは改変されたタンパク質、例えば、エクソソームタンパク質を含むように改変され得る。
本開示のいくつかの実施形態は、産生細胞、またはそのような内腔操作されたＥＶを産生するための産生細胞の生成方法に関する。外因性ポリヌクレオチドは、産生細胞中に一過性または安定的に導入され、産生細胞から内腔操作されたＥＶ、例えば、内腔操作されたエクソソームを生成し得る。
したがって、一態様において、本開示は、足場タンパク質を含むＥＶ、例えば、エクソソームを提供し、足場タンパク質の少なくとも一部は外因性配列から発現され、足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片、変異体、誘導体、もしくは改変を含む。
いくつかの態様において、足場タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム中に、異なるＥＶ、例えば、エクソソーム中の異なる足場タンパク質よりも高い密度で存在し、異なる足場タンパク質は、従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質またはその変異体を含む。いくつかの実施形態において、従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びそれらの断片からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、外因性配列を含むよう遺伝子改変された細胞から産生され、任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、外因性配列を含むプラスミドを含む。
いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に対して３’または５’に位置するゲノム部位に挿入される。いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入される。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片、及び治療的ペプチドを含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または治療的化合物へのリンカーからなる群から選択される治療的ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的化合物）は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、抗体またはその断片もしくは改変である。いくつかの実施形態において、治療的ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはその断片もしくは改変である。いくつかの実施形態において、治療的ペプチドは、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変である。
いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、第２の足場タンパク質をさらに含み、第２の足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、第２の足場タンパク質をさらに含み、第２の足場タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片を含む。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、パターン（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）またはＮ末端（Ｍ）を有しない該パターンに対応するペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）のペプチド、またはＮ末端（Ｍ）を有しないペプチドを含み、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は、（＋）ではなく、６位は、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、配列（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）のペプチド、またはＮ末端（Ｍ）を有しないペプチドを含み、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は、（＋）ではなく、６位は、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。アミノ酸の命名法についてはＲ．Ａａｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ５１３（２００２）：１４１－１４４を参照されたい。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、配列番号４～１１０のいずれか１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）のペプチド、またはＮ末端Ｍを有しないペプチドを含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、配列番号１１０のペプチド、またはＮ末端Ｍを有しない対応するペプチドを含む。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、配列番号１３のペプチド、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応するペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、ペイロード、例えば、ペプチドをさらに含む。
別の実施形態において、本開示は、本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム、及び賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、巨大分子を実質的に含まず、巨大分子は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びそれらの組み合わせから選択される。
さらに別の実施形態において、本開示は、本明細書で提供されるＥＶ、例えば、エクソソームを産生するための細胞集団を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞集団は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１またはそれらの断片もしくは改変を含む足場タンパク質をコードする外因性配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞集団は、第２の足場タンパク質をコードする第２の外因性配列をさらに含み、第２の足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片もしくは改変を含む。いくつかの実施形態において、細胞集団は、第２の足場タンパク質をコードする第２の外因性配列をさらに含み、第２の足場タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片を含む。
いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入され、外因性配列及びゲノム配列は、足場タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、外因性配列は、プラスミド中にある。
いくつかの実施形態において、外因性配列は、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）をコードする。いくつかの実施形態において、治療的ペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または治療的化合物へのリンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、治療的化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、治療的ペプチドは、抗体またはその断片もしくは改変である。特定の実施形態において、抗体は、ナノボディである。当業者は、本開示のＥＶにおいて使用される抗体は、例えば、代替抗体フォーマット、抗原－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または免疫毒素などを含む、当該技術分野で既知の任意の抗原結合分子であり得ることを理解するであろう。
いくつかの実施形態において、治療的ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはその断片もしくは改変である。いくつかの実施形態において、治療的ペプチドは、抗菌ペプチドまたはそれらの断片もしくは改変である。
いくつかの実施形態において、外因性配列は、標的指向性部分をコードする。いくつかの実施形態において、標的指向性部分は、器官、組織、または細胞に特異的である。
いくつかの実施形態において、第２の足場タンパク質は、標的指向性部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、標的指向性部分は、器官、組織、または細胞に特異的である。
一実施形態において、本開示は、ＥＶ、例えば、エクソソームを改変するためのポリペプチドを提供し、以下の配列、
（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列、
（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置はアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は、（＋）ではなく、６位は、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、または
（ｉｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置がアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は、（＋）ではなく、６位は、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、を含む。
いくつかの実施形態において、足場のポリペプチドは、配列番号４～１１０のいずれかの配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１１０の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）の配列であって、Ｘは、任意のアミノ酸である配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む。
一態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの実施形態において、コード配列は、コドン最適化される。
別の態様において、本開示は、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを作製する方法を提供し、以下の工程、
ａ．
（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片もしくは改変をコードする第１の配列、及び
（ｉｉ）ペイロード、例えば治療的ペプチドなどの生物学的に活性な分子をコードする第２の配列、を含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を細胞に導入する工程と、
ｂ．細胞に融合ポリペプチドを発現させる条件下で細胞を維持する工程と、
ｃ．該細胞から融合ポリペプチドを含む操作されたエクソソームを得る工程と、を含む。
いくつかの実施形態において、第１の配列は、以下の配列
（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列、
（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置はアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、または
（ｉｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置がアミノ酸を表し、πが（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は、（＋）ではなく、６位は、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４～１１０のいずれかの配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１０の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質よりも高い密度で、操作されたＥＶ、例えば、操作されたエクソソームの内腔表面上に存在し、異なる足場タンパク質は、従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質またはその変異体を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質よりも２倍超高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質よりも４倍超、１６倍超、１００倍超、または１０，０００倍超高い密度で存在する。
本開示は、足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）を対象とし、足場タンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤ及びＥＤはイオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、配列において少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。いくつかの実施形態において、ＮＤは、ミリストイル化を介して、ＥＶの内腔表面と会合される。他の実施形態において、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。
いくつかの実施形態において、ＥＤは、少なくとも３つのＬｙｓ、少なくとも４つのＬｙｓ、少なくとも５つのＬｙｓ、少なくとも６つのＬｙｓ、または少なくとも７つのＬｙｓを含む。他の実施形態において、ＥＤは、ペプチド結合によってＮＤに連結される。いくつかの実施形態において、ＥＤは、（Ｌｙｓ）ｎを含み、ｎは、１～１０の整数である。他の実施形態において、ＥＤは、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
他の実施形態において、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載のアミノ酸配列を含み、Ｇは、Ｇｌｙとして表されるグリシンであり、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６のそれぞれは、独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される。
他の実施形態において、本開示は、足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であり、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載のアミノ酸配列を含み、Ｇは、Ｇｌｙによって表されるグリシンであり、「：」はペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６のそれぞれは、独立してアミノ酸であり、Ｘ６は塩基性アミノ酸を含み、ＥＤは、ペプチド結合によってＸ６に連結され、ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む。いくつかの実施形態において、ＥＤは、ウイルスの膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。他の実施形態において、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質のＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、
Ｇは、Ｇｌｙを表し、
「：」は、ペプチド結合を表し、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、アミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、Ｘ３は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＮＤ及びＥＤは、リンカーによって接合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）を対象とし、足場タンパク質は、ＮＤ－ＥＤを含み、
ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６を含み、
Ｇは、Ｇｌｙを表し、
「：」は、ペプチド結合を表し、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、アミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり、
「－」は、１つ以上のアミノ酸を含む任意のリンカーであり、
ＥＤは、（ｉ）ペプチド結合もしくは１つ以上のアミノ酸によってＸ６に連結される少なくとも２つの連続するリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によってＸ６に直接連結される少なくとも１つのリジンを含むエフェクタードメインである。
他の実施形態において、Ｘ２は、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ３は、Ｌｙｓである。いくつかの実施形態において、Ｘ４は、ＬｅｕまたはＧｌｕである。いくつかの実施形態において、Ｘ５は、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ６は、Ｌｙｓである。他の実施形態において、Ｘ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、Ｘ３は、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ４は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、及びＧｌｕであり、Ｘ５は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ６は、Ｌｙｓである。
いくつかの実施形態において、ＮＤ及びＥＤは、１つ以上のアミノ酸を含むリンカーによって連結される。いくつかの実施形態において、ＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１５７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１５８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１５９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号１６０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６１）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６２）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６３）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６４）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号１６５）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号１６６）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号１６７）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号１６８）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸長である。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１６９）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７０）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７１）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７２）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号１７３）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号１７４）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号１７５）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号１７６）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１７８）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号１７９）を含む。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、Ｎ末端にＭｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、足場タンパク質のＮ末端にミリストイル化アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。いくつかの実施形態において、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、合成である。いくつかの実施形態において、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、グリシン類似体である。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、配列番号１（ＭＡＲＫＳ）、配列番号２（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、または配列番号３（ＢＡＳＰ１）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、ＥＶの内腔表面上にある。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、足場タンパク質のＥＤドメインと、生物学的に活性な分子との間にある。いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、小胞外ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、小胞外ドメインに連結される。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、リンカーによって生物学的に活性な分子に連結される。いくつかの実施形態において、ＮＤドメインは、リンカーによってＥＤドメインに連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカーを含む。
他の実施形態において、生物学的に活性な分子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、化学化合物、ウイルス、イオノフォア、イオノフォア用担体、チャネルもしくはポアを形成する部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、組換えペプチド、天然ペプチド、合成ペプチド、抗体、融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、酵素、サイトカイン、リガンド、受容体、転写因子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
他の実施形態において、ＥＶは、第２の足場タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の足場タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）ポリペプチド、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド、ネプリライシン（ＭＭＥ）ポリペプチド、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）ポリペプチド、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。いくつかの実施形態において、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、免疫原性タンパク質である。
他の実施形態において、生物学的に活性な分子は、毒素、トキソイド、または毒素の非毒性変異体である。いくつかの実施形態において、毒素は、ジフテリア毒素である。いくつかの実施形態において、トキソイドは、破傷風トキソイドである。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、ジフテリア毒素の非毒性変異体である。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子の活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子は、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子の活性化剤は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
他の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、腫瘍抗原を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。
他の実施形態において、ＥＶは、エクソソームである。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のＥＶ及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を対象とする。いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のＥＶを生成する細胞を対象とする。いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のＥＶ及び使用説明書を含むキットを対象とする。
他の実施形態において、本開示は、好適な条件下で本開示の細胞を培養し、ＥＶを得ることを含む、ＥＶの作製方法を対象とする。いくつかの実施形態において、本開示は、生物学的に活性な分子を明細書に開示される足場タンパク質に連結することを含む、生物学的に活性な分子を細胞外小胞に固定する方法を対象とする。
他の実施形態において、本開示は、本開示のＥＶを投与することを含む、それを必要とする対象における疾患を予防または治療する方法を対象とし、疾患は、抗原と関連付けられる。いくつかの実施形態において、ＥＶは、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内投与される。
実施形態
Ｅ１．足場タンパク質を含むＥＶ、例えば、エクソソームであって、足場タンパク質の少なくとも一部は外因性配列から発現され、足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片もしくは改変を含む。
Ｅ２．足場タンパク質が、ＥＶ、例えば、エクソソームにおいて、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質よりも高い密度で存在し、異なる足場タンパク質が、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質またはその変異体を含む、実施形態Ｅ１に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ３．従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びそれらの断片からなる群から選択される、実施形態Ｅ２に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ４．ＥＶ、例えば、エクソソームが、外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意で、細胞がＨＥＫ２９３細胞である、実施形態Ｅ１～Ｅ３のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ５．細胞が、外因性配列を含むプラスミドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ６．細胞が、細胞のゲノムに挿入された外因性配列を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ７．外因性配列が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に対して３’または５’に位置するゲノム部位に挿入される、実施形態Ｅ１～Ｅ６に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ８．外因性配列が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入される、実施形態Ｅ１～Ｅ７に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ９．足場タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片、及び治療的ペプチドを含む融合タンパク質である、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか一つに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１０．治療的ペプチドが、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または治療的化合物へのリンカーからなる群から選択される、実施形態Ｅ９に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１１．治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群から選択される、実施形態Ｅ９に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１２．治療的ペプチドが、抗体またはその断片もしくは改変である、実施形態Ｅ９に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１３．治療的ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはそれらの断片もしくは改変である、実施形態Ｅ９に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１４．治療的ペプチドが、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変である、実施形態Ｅ９に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１５．第２の足場タンパク質をさらに含み、第２の足場タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１４のいずれに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１６．第２の足場タンパク質をさらに含み、第２の足場タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１４のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１７．足場タンパク質が、配列（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）のペプチド、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１６のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１８．足場タンパク質が、配列（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列のペプチドを含み、各括弧位置が、アミノ酸を表し、πが、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘが、任意のアミノ酸であり、Φが（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）が、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位が、（＋）でなく、６位が、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、実施形態Ｅ１～Ｅ１７のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ１９．足場タンパク質が、配列（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）のペプチド、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列を含み、各括弧位置がアミノ酸を表し、πが、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξが、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φが、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）が、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位が、（＋）でなく、６位が、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、実施形態Ｅ１～Ｅ１８のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ２０．足場タンパク質が配列番号４～１１０のいずれか１つのペプチド、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかを含む、実施形態Ｅ１８またはＥ１９のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ２１．足場タンパク質が、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）のペプチド、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含み、Ｘが任意のアミノ酸である、実施形態Ｅ１８またはＥ１９のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ２２．足場タンパク質が、配列番号１１０のペプチド、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ２０に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ２３．足場タンパク質が、配列番号１３のペプチド、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ２０に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ２４．足場タンパク質が、ペイロード、例えば、ペプチドなどの生物学的に活性な分子をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２４のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム。
Ｅ２５．実施形態Ｅ１～Ｅ２４のいずれかに記載のＥＶ、例えば、エクソソーム、及び賦形剤を含む、薬学的組成物。
Ｅ２６．巨大分子が、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びそれらの組み合わせから選択される、実施形態Ｅ２５に記載の薬学的組成物。
Ｅ２７．実施形態Ｅ１～Ｅ２４のいずれかのＥＶ、例えば、エクソソームを産生するための細胞集団。
Ｅ２８．ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの断片もしくは改変を含む、足場タンパク質をコードする外因性配列を含む、実施形態Ｅ２７に記載の細胞集団。
Ｅ２９．第２の足場タンパク質をコードする第２の外因性配列をさらに含み、第２の足場タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１またはそれらの断片もしくは改変を含む、実施形態Ｅ２８に記載の細胞集団。
Ｅ３０．第２の足場タンパク質をコードする第２の外因性配列をさらに含み、第２の足場タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片を含む、実施形態Ｅ２８に記載の細胞集団。
Ｅ３１．外因性配列が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入され、外因性配列及びゲノム配列が、足場タンパク質をコードする、実施形態Ｅ２７～Ｅ３０のいずれかに記載の細胞集団。
Ｅ３２．外因性配列が、プラスミド中にある、実施形態Ｅ２７～Ｅ３０のいずれかに記載の細胞集団。
Ｅ３３．外因性配列が、生物学的に活性な分子、例えば、治療的ペプチドをコードする、実施形態Ｅ２７～Ｅ３２のいずれかに記載の細胞集団。
Ｅ３４．治療的ペプチドが、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または治療的化合物へのリンカーからなる群から選択される、実施形態Ｅ３３に記載の細胞集団。
Ｅ３５．治療的化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群から選択される、実施形態Ｅ３３に記載の細胞集団。
Ｅ３６．治療的ペプチドが、抗体またはその断片もしくは改変である、実施形態Ｅ３３に記載の細胞集団。
Ｅ３７．治療的ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはそれらの断片もしくは改変である、実施形態Ｅ３３に記載の細胞集団。
Ｅ３８．治療的ペプチドが、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変である、実施形態Ｅ３３に記載の細胞集団。
Ｅ３９．外因性配列が、標的指向性部分をコードする、実施形態Ｅ２８に記載の細胞集団。
Ｅ４０．標的指向性部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、実施形態Ｅ３９に記載の細胞集団。
Ｅ４１．第２の足場タンパク質が、標的指向性部分をさらに含む、実施形態Ｅ２９またはＥ３０に記載の細胞集団。
Ｅ４２．標的指向性部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、実施形態Ｅ４１に記載の細胞集団。
Ｅ４３．ＥＶ、例えば、エクソソームを改変するためのポリペプチドであって、以下の配列、
（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列、
（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置が、アミノ酸を表し、πが、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘが、任意のアミノ酸であり、Φが、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）が、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位が、（＋）ではなく、６位が、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、または
（ｉｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置が、アミノ酸を表し、πが、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξが、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φが、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）が、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位が、（＋）ではなく、６位が、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない任意のアミノ酸である、配列、を含む。
Ｅ４４．配列番号４～１１０のいずれかの配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかを含む、実施形態Ｅ４３に記載のポリペプチド。
Ｅ４５．配列番号１３の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ４３に記載のポリペプチド。
Ｅ４６．配列番号１１０の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ４３に記載のポリペプチド。
Ｅ４７．ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）の配列、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含み、Ｘが、任意のアミノ酸である、実施形態Ｅ４３に記載のポリペプチド。
Ｅ４８．ポリペプチドが、ペイロード、例えば、ペプチドなどの生物学的に活性な分子に融合される、実施形態Ｅ４３～Ｅ４７のいずれかに記載のポリペプチド。
Ｅ４９．ポリペプチドが、ペプチドのＮ末端に融合される、実施形態Ｅ４８に記載のポリペプチド。
Ｅ５０．実施形態Ｅ４３～Ｅ４９のいずれかに記載のポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド構築物。
Ｅ５１．コード配列がコドン最適化される、実施形態Ｅ５０に記載のポリヌクレオチド構築物。
Ｅ５２．操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを作製する方法であって、以下の工程、
ａ．（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１またはそれらの断片もしくは改変をコードする第１の配列、及び（ｉｉ）ペイロード、例えばペプチドなどの生物学的に活性な分子をコードする第２の配列、を含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を細胞に導入する工程と、
ｂ．細胞に融合ポリペプチドを発現させる条件下で細胞を維持する工程と、
ｃ．該細胞から融合ポリペプチドを含む操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを得る工程と、を含む。
Ｅ５３．第１の配列が、以下の配列、
（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列、
（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置が、アミノ酸を表し、πが、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘが、任意のアミノ酸であり、Φが、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）が、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位が、（＋）ではなく、６位が、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、または
（ｉｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）、またはＮ末端（Ｍ）を有しない対応する配列であって、各括弧位置が、アミノ酸を表し、πが（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξが、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φが、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）が、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位が、（＋）ではなく、６位が、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、配列、を含む、実施形態Ｅ５２に記載の方法。
Ｅ５４．第１の配列が、配列番号４～１１０のいずれか、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかを含む、実施形態Ｅ５２またはＥ５３のいずれかに記載の方法。
Ｅ５５．第１の配列が、配列番号１３、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５６．第１の配列が、配列番号１１０、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含む、実施形態Ｅ５５に記載の方法。
Ｅ５７．第１の配列がＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列を含み、Ｘが、任意のアミノ酸である、実施形態Ｅ５３に記載の方法。
Ｅ５８．融合ポリペプチドが、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面上に、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質よりも高い密度で存在し、異なる足場タンパク質が、従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質またはその変異体を含む、実施形態Ｅ５２～Ｅ５７のいずれかに記載の方法。
Ｅ５９．融合ポリペプチドが、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質より２倍超の密度で存在する、実施形態Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０．融合ポリペプチドが、異なるＥＶ、例えば、エクソソームにおける異なる足場タンパク質より４倍超、１６倍超、１００倍超、または１０，０００倍超高い密度で存在する、実施形態Ｅ５９に記載の方法。
図面は、例示のみを目的として本開示の様々な態様を示す。当業者は、本明細書に例示される構造及び方法の代替的な態様が、本明細書に記載される本開示の原理から逸脱することなく用いられ得ることを以下の考察から容易に認識するであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記足場タンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤは前記ＥＶの内腔表面と会合し、前記ＥＤはイオン相互作用によって前記ＥＶの前記内腔表面と会合し、前記ＥＤは配列中に少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む、前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
（項目２）
前記ＮＤが、ミリストイル化を介して前記ＥＶの前記内腔表面と会合する、項目１に記載のＥＶ。
（項目３）
前記ＮＤが、Ｎ末端にＧｌｙを有する、項目２に記載のＥＶ。
（項目４）
前記ＥＤが、少なくとも３つのＬｙｓ、少なくとも４つのＬｙｓ、少なくとも５つのＬｙｓ、少なくとも６つのＬｙｓ、または少なくとも７つのＬｙｓを含む、項目１～３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５）
前記ＥＤが、ペプチド結合によって前記ＮＤに連結される、項目１～４のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目６）
前記ＥＤが、（Ｌｙｓ）ｎを含み、ｎが１～１０の整数である、項目４または５に記載のＥＶ。
（項目７）
前記ＥＤが、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１～６のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目８）
前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載されるアミノ酸配列を含み、ＧがＧｌｙとして表されるグリシンであり、「：」がペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６のそれぞれが独立してアミノ酸であり、前記Ｘ６が塩基性アミノ酸を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目９）
前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される、項目８に記載のＥＶ。
（項目１０）
足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記足場タンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載のアミノ酸配列を含み、ＧはＧｌｙによって表されるグリシンであり、「：」はペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６のそれぞれは独立してアミノ酸であり、前記Ｘ６は塩基性アミノ酸を含み、前記ＥＤはペプチド結合によってＸ６に連結され、前記ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む、前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
（項目１１）
前記ＥＤが、ウイルスの膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含まない、項目１～１０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１２）
前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される、項目８～１１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１３）
前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される、項目８～１２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１４）
前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される、項目８～１３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１５）
前記足場タンパク質の前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）Ｇが、Ｇｌｙを表し、
（ｉｉ）「：」が、ペプチド結合を表し、
（ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｉｖ）前記Ｘ３が、アミノ酸であり、
（ｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｖｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｖｉｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である、項目１～１４のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１６）
前記Ｘ３が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される、項目８～１５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１７）
前記ＮＤ及び前記ＥＤが、リンカーによって接合される、項目１～９及び１１～１６のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１８）
前記リンカーが、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む、項目１７に記載のＥＶ。
（項目１９）
足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記足場タンパク質はＮＤ－ＥＤを含み、
ａ．ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６を含み、
ｉ．ＧはＧｌｙを表し、
ｉｉ．「：」はペプチド結合を表し、
ｉｉｉ．前記Ｘ２はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｉｖ．前記Ｘ３はアミノ酸であり、
ｖ．前記Ｘ４はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｖｉ．前記Ｘ５はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｖｉｉ．前記Ｘ６はＬｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｂ．「－」は１つ以上のアミノ酸を含む任意のリンカーであり、
ｃ．ＥＤは（ｉ）ペプチド結合もしくは１つ以上のアミノ酸によって前記Ｘ６に連結される少なくとも２つの連続するリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によって前記Ｘ６に直接連結される少なくとも１つのリジンを含むエフェクタードメインである、前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
（項目２０）
前記Ｘ２が、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される、項目８～１９のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２１）
前記Ｘ３が、Ｌｙｓである、項目８～２０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２２）
前記Ｘ４が、ＬｅｕまたはＧｌｕである、項目８～２１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２３）
前記Ｘ５が、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される、項目８～２２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２４）
前記Ｘ６がＬｙｓである、項目８～２３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２５）
前記Ｘ２が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、前記Ｘ３が、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、前記Ｘ４が、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、及びＧｌｕであり、前記Ｘ５が、ＳｅｒまたはＡｌａであり、前記Ｘ６が、Ｌｙｓである、項目８～２４のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２６）
前記ＮＤ及び前記ＥＤが、１つ以上のアミノ酸を含むリンカーによって連結される、項目１９～２５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２７）
前記ＥＤが、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１９～２６のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２８）
前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１５７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１５８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１５９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号１６０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１～２７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２９）
前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６１）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６２）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６３）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６４）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号１６５）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号１６６）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号１６７）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号１６８）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載のＥＶ。
（項目３０）
前記足場タンパク質が、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸長である、項目１～２９のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目３１）
前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１６９）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７０）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７１）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７２）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号１７３）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号１７４）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号１７５）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号１７６）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１７８）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号１７９）を含む、項目１～３０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３２）
前記足場タンパク質が、Ｎ末端にＭｅｔを含まない、項目１～３１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３３）
前記足場タンパク質が、前記足場タンパク質の前記Ｎ末端にミリストイル化アミノ酸残基を含む、項目１～３２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３４）
前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、Ｇｌｙである、項目３３に記載のＥＶ。
（項目３５）
前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、合成物質である、項目３３または３４に記載のＥＶ。
（項目３６）
前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、グリシン類似体である、項目３３または３５に記載のＥＶ。
（項目３７）
前記足場タンパク質が、配列番号１（ＭＡＲＫＳ）、配列番号２（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、または配列番号３（ＢＡＳＰ１）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～３６のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目３８）
前記生物学的に活性な分子が、前記ＥＶの前記内腔表面または内腔上にある、項目１～３７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３９）
前記足場タンパク質が、膜貫通ドメインをさらに含む、項目１及び８のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４０）
前記膜貫通ドメインが、前記足場タンパク質のＥＤドメインと前記生物学的に活性な分子との間にある、項目３９に記載のＥＶ。
（項目４１）
前記足場タンパク質が、小胞外ドメインをさらに含む、項目１～４０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４２）
前記生物学的に活性な分子が、前記小胞外ドメインに連結される、項目４１に記載のＥＶ。
（項目４３）
前記足場タンパク質が、リンカーによって前記生物学的に活性な分子に連結される、項目１～４２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４４）
ＮＤドメインが、リンカーによってＥＤドメインに連結される、項目１～４３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４５）
前記リンカーが、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む、項目４３または４４に記載のＥＶ。
（項目４６）
前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、項目１７～１９、２６、及び４３～４５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４７）
前記リンカーが、柔軟なリンカーを含む、項目１７～１９、２６、及び４３～４５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４８）
前記生物学的に活性な分子が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、化学化合物、ウイルス、イオノフォア、イオノフォア用担体、チャネルもしくは細孔を形成する部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１～４７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４９）
前記タンパク質が、組換えペプチド、天然ペプチド、合成ペプチド、抗体、融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目５０）
前記タンパク質が、酵素、サイトカイン、リガンド、受容体、転写因子、またはそれらの組み合わせを含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目５１）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目５２）
前記ＥＶが、第２の足場タンパク質をさらに含む、項目１～５１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５３）
前記第２の足場タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）ポリペプチド、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド、ネプリライシン（ＭＭＥ）ポリペプチド、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）ポリペプチド、またはそれらの断片を含む、項目５２に記載のＥＶ。
（項目５４）
前記生物学的に活性な分子が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、項目１～５３のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目５５）
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される、項目５４に記載のＥＶ。
（項目５６）
前記生物学的に活性な分子が、免疫原性タンパク質である、項目１～４７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５７）
前記生物学的に活性な分子が、毒素、トキソイド、または毒素の非毒性変異体である、項目１～４７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５８）
前記毒素が、ジフテリア毒素である、項目５７に記載のＥＶ。
（項目５９）
前記トキソイドが、破傷風トキソイドである、項目５７に記載のＥＶ。
（項目６０）
前記生物学的に活性な分子が、ジフテリア毒素の非毒性変異体である、項目５７に記載のＥＶ。
（項目６１）
前記生物学的に活性な分子が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、項目１～６０のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目６２）
前記正の共刺激分子が、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである、項目６１に記載のＥＶ。
（項目６３）
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される、項目６２に記載のＥＶ。
（項目６４）
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである、項目６３に記載のＥＶ。
（項目６５）
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーが、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２からなる群から選択される、項目６４に記載のＥＶ。
（項目６６）
前記正の共刺激分子が、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子である、項目６１に記載のＥＶ。
（項目６７）
前記ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子が、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である、項目６６に記載のＥＶ。
（項目６８）
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である、項目６７に記載のＥＶ。
（項目６９）
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５からなる群から選択される、項目５０に記載のＥＶ。
（項目７０）
前記タンパク質が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体を含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目７１）
前記タンパク質が、腫瘍抗原を含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目７２）
前記腫瘍抗原が、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、項目７１に記載のＥＶ。
（項目７３）
前記ＥＶがエクソソームである、項目１～７２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目７４）
項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶ及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
（項目７５）
項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶを産生する細胞。
（項目７６）
１つ以上のベクターを含む細胞であって、前記ベクターが、前記足場タンパク質及び項目１～７３のいずれか一項に記載の生物学的に活性な分子をコードする核酸配列を含む、前記細胞。
（項目７７）
前記核酸配列が、プロモーターに作用可能に結合している、項目７６に記載の細胞。
（項目７８）
項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶ及び使用説明書を含む、キット。
（項目７９）
好適な条件下で項目７５～７７のいずれか一項に記載の細胞を培養し、前記ＥＶを得ることを含む、ＥＶの作製方法。
（項目８０）
項目１～７３のいずれか一項に記載の生物学的に活性な分子を項目１～７３のいずれか一項に記載の足場タンパク質に連結することを含む、生物学的に活性な分子を細胞外小胞に固定する方法。
（項目８１）
疾患の予防または治療を必要とする対象において前記疾患を予防または治療する方法であって、項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶを投与することを含み、前記疾患は前記抗原と関連付けられる、前記方法。
（項目８２）
前記ＥＶが、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内で投与される、項目８１に記載の方法。
図１Ａは、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合したＢＡＳＰ１断片を含む融合タンパク質の配列（それぞれ、出現順に配列番号１３５～１４２）を示す。図１Ｂは、図１Ａの融合タンパク質の１つを安定して発現する細胞から精製されたエクソソームについての抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットの結果を示す。図１Ａ及び１Ｂの両方について、アミノ酸位置、例えば、ＢＡＳＰ１、１～３０は、遺伝子構築物によって最初にコードされるＢＡＳＰ－１断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 図２Ａは、ＢＡＳＰ１断片（１～３０）（配列番号４）由来の配列、ならびにＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合したその改変（１－３０－Ｓ６Ｄ、１－３０－Ｓ６Ａ、及び１－３０－Ｌ５Ｑ）（それぞれ、出現順に配列番号１４３～１４５）を示す。図２Ｂは、図２Ａの融合タンパク質の１つを安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームについての抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａ及び２Ｂの両方について、アミノ酸位置、例えば、ＢＡＳＰ１、１～３０は、遺伝子構築物によって最初にコードされるＢＡＳＰ－１断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 図２Ａは、ＢＡＳＰ１断片（１～３０）（配列番号４）由来の配列、ならびにＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合したその改変（１－３０－Ｓ６Ｄ、１－３０－Ｓ６Ａ、及び１－３０－Ｌ５Ｑ）（それぞれ、出現順に配列番号１４３～１４５）を示す。図２Ｂは、図２Ａの融合タンパク質の１つを安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームについての抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａ及び２Ｂの両方について、アミノ酸位置、例えば、ＢＡＳＰ１、１～３０は、遺伝子構築物によって最初にコードされるＢＡＳＰ－１断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 すべてＦＬＡＧ（登録商標）－ＧＦＰに融合させた、全長ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１のアミノ酸１～３０を安定的に発現する細胞から精製したエクソソーム試料でのＣｏｏｍｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色タンパク質ゲルの画像を示す。画像上の白い矢印は、融合タンパク質に対応するバンドを示す。図３について、アミノ酸位置、例えば、ＢＡＳＰ１、１～３０は、遺伝子構築物によって最初にコードされるＢＡＳＰ－１断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 ＢＡＳＰ１の最初の２８個のアミノ酸（保存領域１）、アミノ酸１－７、ＭＡＲＣＫＳの１５２－１７３（保存領域２）、ならびにＭＡＲＣＫＳＬ１のアミノ酸１－７及び８７－１１０（保存領域３）の間のタンパク質配列アライメントを示す。 ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～３０の配列（「ＢＡＳＰ１－３０」）（配列番号４）、及びＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１～３を含む融合タンパク質、またはＭＡＲＣＫＳのＰＳＤドメインに融合されたその改変もしくはその改変（「ＭＡＲＣＫＳ－ＭＧ－ＰＳＤ」、「ＭＡＲＣＫＳ－ＭＡ－ＰＳＤ」、「ＭＡＲＣＫＳ－ＭＧ－ＰＳＤ－Ｋ６Ｓ」及び「ＭＡＲＣＫＳ－ＭＧ－ＰＳＤ－Ｋ６Ａ」）（それぞれ、出現順で、配列番号１４６－１４９）を示す。ＭＡＲＣＫＳ配列に導入された変異点は太字である。アミノ酸位置、例えば、ＢＡＳＰ１のａａ１－３０またはＭＡＲＣＫＳのａａ１－３は、最初に遺伝子構築物によってコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 図５Ａ及びＦＬＡＧ（登録商標）のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を安定的に発現する細胞からの精製されたエクソソームの抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットの結果を示す。 ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１の機能研究、ならびに内腔表面への結合を介してペイロードをエクソソームの内腔に担持するための配列のそれぞれのアミノ酸要件に由来する３つの異なるコンセンサス配列（３つの配列全てが配列番号１１８によって表される）を示す。 ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０または１～３０に融合したＣａｓ９を安定的に発現し、及び組換えＣａｓ９の量を減少させた細胞から精製された天然エクソソームまたはエクソソームの総タンパク質（上部）及び抗Ｃａｓ９ウエスタンブロット（下部）を示す。アミノ酸位置、例えば、ＢＡＳＰのａａ１－１０またはＢＡＳＰ１のａａ１－３０は、最初に遺伝子構築物によってコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 上部パネルは、図７Ａのウエスタンブロットの結果のＣａｓ９濃度測定に由来する標準曲線を示す。底面パネルは、標準曲線に基づいて推定された、ＢＡＳＰ１の１～３０のアミノ酸または１～１０のアミノ酸断片（処理後のＢＡＳＰ１の２～３０個のアミノ酸または２～１０個のアミノ酸断片（すなわち、最初のＭｅｔが切断される））にコンジュゲートされた融合タンパク質として、各精製されたエクソソームあたりに担持されるＣａｓ９の量をさらに提供する。 オボアルブミンへのＢＡＳＰ１Ｎ末端（アミノ酸１～１０）融合（「ＢＡＳＰ１（１～１０）－ＯＶＡ」）を発現する構築物を安定にトランスフェクションした細胞、または一方はオボアルブミンへのＢＡＳＰ１Ｎ末端（アミノ酸１～１０）融合を発現し、他方は膜貫通タンパク質ＰＴＧＦＲＮに融合したＣＤ４０Ｌを発現する（「ＢＡＳＰ１（１～１０）－ＯＶＡ；３×ＣＤ４０Ｌ－ＰＴＧＦＲＮ」）２つの構築物を安定にトランスフェクションした細胞から精製したエクソソームのタンパク質ゲル画像を示す。図８Ａは、組換えＯＶＡの量を減少させて充填したタンパク質ゲル画像をさらに示す。アミノ酸番号付け、例えば、アミノ酸１～１０は、遺伝子構築物によって最初にコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 図８Ａからの試料の抗オボアルブミンウエスタンブロット結果を示す。 組換えｏｖａを、ｅｘｏＴＯＰＥに融合したｏｖａと比較したウエスタンブロットの結果を示す。 （ｉ）エクソソームの内腔側におけるオボアルブミンに連結したｅｘｏＴＯＰＥ、及び（ｉｉ）エクソソームの内腔における免疫刺激物質を含むエクソソームの図を示す。 図９Ａは、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０及びＦＬＡＧ（登録商標）タグに融合したＧＦＰに対して指向されるラクダ科ナノボディの配列（配列番号１５０）を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０は、最初に遺伝子構築物によってコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。図９Ｂは、図１０Ａの融合タンパク質（「ＢＡＳＰ１（１－１０）－ナノボディ」）またはＢＡＳＰ１配列を欠くタンパク質（「ナノボディ」）を安定して発現する細胞由来の精製されたエクソソームのタンパク質ゲル及び抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットの結果を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１（１－１０）－ナノボディは、遺伝子構築物によって最初にコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 図９Ａは、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０及びＦＬＡＧ（登録商標）タグに融合したＧＦＰに対して指向されるラクダ科ナノボディの配列（配列番号１５０）を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０は、最初に遺伝子構築物によってコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。図９Ｂは、図１０Ａの融合タンパク質（「ＢＡＳＰ１（１－１０）－ナノボディ」）またはＢＡＳＰ１配列を欠くタンパク質（「ナノボディ」）を安定して発現する細胞由来の精製されたエクソソームのタンパク質ゲル及び抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットの結果を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１（１－１０）－ナノボディは、遺伝子構築物によって最初にコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 （ｉ）ＦＬＡＧ（登録商標）及び単量体または二量体ＭＣＰ変異体（１×ＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ）（「８１５」、配列番号１１１）、１×ＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋ）（「８１７」、配列番号１１２）、２×ＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ）（「８１９」、配列番号１１３）または２×ＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋ）（「８２１」、配列番号１１４））に融合されたＢＡＳＰ１（１～３０）、ならびに（ｉｉ）３×ＭＳ２ヘアピンループ（「ルシフェラーゼ－ＭＳ２ｍＲＮＡ」または「８１１」、配列番号１１５）を含むルシフェラーゼｍＲＮＡを含むエクソソームｍＲＮＡ担持システムの概略図を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１（１－３０）は、最初に遺伝子構築物によってコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 図１１Ａは、図１０に記載のｍＲＮＡ担持構築物、様々なＢＡＳＰ１融合タンパク質（８１５、８１７、または８１９）と組み合わせたルシフェラーゼｍＲＮＡ（８１１）を含むエクソソームのタンパク質ゲルを示す。図１１Ｂは、図１１Ａにおける試料の抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットを示す。 図１１Ａは、図１０に記載のｍＲＮＡ担持構築物、様々なＢＡＳＰ１融合タンパク質（８１５、８１７、または８１９）と組み合わせたルシフェラーゼｍＲＮＡ（８１１）を含むエクソソームのタンパク質ゲルを示す。図１１Ｂは、図１１Ａにおける試料の抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットを示す。 図１０に示すｍＲＮＡ担持構築物を含む細胞（上部）またはエクソソーム（下部）におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの量についてのＲＴ－ｑＰＣＲの結果を示す。 ルシフェラーゼｍＲＮＡの確率的担持からの富化倍率を含む、図１２Ａの試料由来の精製されたエクソソームにおけるルシフェラーゼｍＲＮＡの量を定量する表を示す。 エクソソームの内腔表面に固定された膜貫通タンパク質の外部表面表示を可能にするために、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のＮ末端断片に融合されたＣＤ４０Ｌトリマーの概略図を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＭＡＲＣＫＳ１－３０、ＭＡＲＣＫＳＬ１ １－３０、ＢＡＳＰ１ １－３０、ＢＡＳＰ１ １－１０ＥｘｏＴＯＰＥは、遺伝子構築物によって最初にコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のＮ末端断片に融合したＣＤ４０Ｌ表面発現エクソソームでインキュベートされた培養物におけるマウスＢ細胞活性化の結果を示す。 ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のＮ末端断片に融合されたＣＤ４０Ｌ表面発現エクソソームでインキュベートされた培養物におけるヒトＢ細胞活性化の結果を示す。 ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、または全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端配列に融合した場合の異なるＣＤ４０Ｌ表面表示エクソソームの相対的な効力のチャートを示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１ １－３０は、遺伝子構築物によって最初にコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。 異なる起源の様々な細胞株（ＨＥＫ２９３ＳＦ、腎臓、ＨＴ１０８０、結合組織、Ｋ５６２、骨髄、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、乳房、Ｒａｊｉ、リンパ芽球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄）から精製されたエクソソームにおける内腔タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１）及び従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質（ＣＤ８１及びＣＤ９）のペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の数を示す。 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来エクソソーム単独、またはＦＬＡＧ（登録商標）－ＧＦＰに融合したＢＡＳＰ１もしくはＢＡＳＰ１Ｎ末端断片（１～３０もしくは１～８）を過剰発現する細胞由来のタンパク質ゲル（左）及び抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロット（右）を示す。アミノ酸番号付け、例えば、ＢＡＳＰ１（１－３０）は、遺伝子構築物によって最初にコードされる断片を指す。最初のＭｅｔは、処理中に切断される。
本開示は、足場タンパク質を介してＥＶ、例えば、エクソソームに連結した少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームを対象とし、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶの内腔表面、例えば、エクソソームと会合し、ＥＤは、（ｉ）ＥＤにおけるリジン反復、または（ｉｉ）ＮＤ、例えば、ＮＤにおけるＣ末端のＫ及びＥＤにおけるＮ末端のＫと組み合わせるときのリジン反復を含み、ＮＤ及びＥＤは、直接、すなわち、ペプチド結合によって、連結される。本開示はまた、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面にペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を固定することができる最小のアミノ酸の数、例えば、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、または７～８個のアミノ酸断片を提供する。ＮＤは、ミリストイル化を介してＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合し得、一方、ＥＤは、イオン相互作用、例えば、誘引静電相互作用を介してＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合し得る。様々な態様の非限定的な例は、本開示に示される。
本開示がより詳細に説明される前に、本開示は、説明される特定の組成物またはプロセス工程に限定されず、もちろん、変化し得ることを理解されたい。本開示を読む当業者には明らかであるように、本明細書に説明及び例示される個々の態様の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に切り離され得るか、または組み合わされ得る別個の成分及び特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で行われ得る。
本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様の制限ではなく、本明細書全体を参照することによって定義され得る。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
したがって、以下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
Ｉ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書で使用される際、以下の用語は、以下に帰する意味を有する。
用語「ａ」または「ａｎ」実体は、その実体のうちの１つ以上を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書で同義に使用され得る。特許請求の範囲は、いずれかの任意的要素を除外するように起草され得ることを、さらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などのような排他的な専門用語の使用のため、または否定的な制限の使用のための先行詞として役立つよう意図される。
さらに、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、他の有無にかかわらず、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。したがって、本明細書における「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される用語「及び／または」は、以下の態様、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
本明細書において、態様が言語「含む」で説明される場合は常に、さもなければ「からなる」及び／または「から本質的になる」に関して説明される類似の態様もまた提供されることが理解される。
単位、接頭辞、及び記号は、そのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）承認の形式で表される。
数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。値の範囲が記載される場合、その範囲の記載された上限値及び下限値との間の各介在整数値、及びその各端数も、そのような値間の各下位範囲と共に特に開示されていることを理解されるべきである。任意の範囲の上限値及び下限値は、独立して範囲内に含まれるか、または範囲から除外され得、いずれかの限界値を含む、いずれの限界値も含まない、または両方の限界値を含む各範囲も、本開示内に包含される。
したがって、本明細書に記載される範囲は、記載されるエンドポイントを含んだ範囲内のすべての値の略語であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むと理解される。
別途示されない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物への言及は、各立体異性体、及びそれらの立体異性体の全ての組み合わせを意図する。
値が明示的に記載される場合、記載される値とほぼ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）である値も、本開示の範囲内であることを理解されたい。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各下位組み合わせもまた特に開示され、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素または要素の群が個別に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。開示の任意の要素が複数の代替物を有するものとして開示される場合、各代替物が単独でまたは他の代替物と任意の組み合わせで除外されるその開示の例も、本明細書によって開示され、開示の２つ以上の要素は、そのような除外を有し得、そのような除外を有する要素のすべての組み合わせが、本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、それらの一般に許容される単一文字コードによって参照される。別途示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’方向で左から右に書かれる。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される、それらの一般的に知られている一文字記号によって本明細書で言及される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で左から右に書かれる。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般に知られている三文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される一文字記号のいずれかによって参照される。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、おおよそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、おおよそ（ａｒｏｕｎｄ）、またはその領域を意味するために本明細書で使用される。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは記載された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、用語「約」は、上または下に（より高いまたはより低い）例えば、１０％の相違によって、記載された値を上回る及び下回る数値を修正することができる。
本明細書で使用される際、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、１つ以上の関心のある値に適用される場合、記載された基準値に類似する値を指す。ある特定の態様において、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、別途記載されない限り、または文脈から別途明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、記載された基準値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）において１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に該当する値の範囲を指す。
用語「投与」、「投与すること」ならびにそれらの文法変異形は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）のような組成物を薬学的に許容される経路を介して対象へと導入することを指す。本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）などの組成物の対象への導入は、腫瘍内、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下）、直腸、リンパ内、髄腔内、眼周または局所を含む任意の好適な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を実行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈へと導入することによって投与される。
本明細書で使用する場合、用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を産生する分子を指す。受容体は、内因性または外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例は、ホルモン、神経伝達物質、及び環状ジヌクレオチドを含む。外因性アゴニストの非限定的な例は、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドを含む。アゴニストは、完全アゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合すると生物学的応答そのものを誘発するよりも、むしろアゴニスト媒介性応答を遮断または抑制する分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することにより、それらの効力を達成する。アンタゴニストの非限定的な例は、アルファ遮断薬、ベータ遮断薬、及びカルシウムチャネル遮断薬を含む。アンタゴニストは、競合的、非競合的、または不競合的アンタゴニストであり得る。
本明細書で使用される際、用語「細胞外小胞」または「ＥＶ」は、内部空間（内腔）を封入する膜を含む細胞由来小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞を含む。概して、細胞外小胞は、直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内、外部表面もしくは細胞外小胞の内腔表面上に表示されて、及び／または膜にまたがって、のいずれかで、様々なペイロードを含み得る。ペイロードは、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。例として、及び限定することなく、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、及び／または培養された細胞に由来し得る。いくつかの態様において、ＥＶは、本明細書に開示される足場タンパク質を含む。
本明細書で使用される際、用語「エクソソーム」は、内部空間（内腔）を封入する膜を含む細胞由来の小さい（直径２０～３００ｎｍの間、より好ましくは直径４０～２００ｎｍ）細胞外小胞（ＥＶ）を指し、いくつかの態様において、例えば直接原形質膜出芽によるか、または後期エンドソームの原形質膜との融合によって、細胞（例えば、産生細胞）から生成される。エクソソームは、細胞外小胞（ＥＶ）の一種である。いくつかの態様において、エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例えば、治療薬などの生物学的に活性な分子）、レシーバー（例えば、標的指向性部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）、または他の分子を含む。エクソソームは、産生細胞に由来し得、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。いくつかの態様において、エクソソームは、本開示の足場タンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示のエクソソームは、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
本明細書で使用される場合、「エクソソーム内腔タンパク質」という用語は、足場タンパク質、すなわち、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に取り付けたまたは会合したタンパク質、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの任意の機能的断片、それらの任意の変異体、それらの任意の誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを指し、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面にペイロード、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、治療的タンパク質）を標的とするための足場としての使用に好適である。
本明細書で使用される際、用語「ナノ小胞」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さい（直径２０～２５０ｎｍの間、例えば直径３０～１５０ｎｍ）小胞を指し、ナノ小胞がそのような操作なしに産生細胞によって産生されないように、直接的または間接的操作によって細胞（例えば産生細胞）から生成される。ナノ小胞を産生する産生細胞の適切な操作は、これらに限定されないが、連続押出、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含む。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、産生細胞の破壊を生じ得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。いくつかの態様において、ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的指向性部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。ナノ小胞は、ナノ小胞が操作に従って産生細胞に由来するため、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。いくつかの態様において、ナノ小胞は、本明細書に開示される足場タンパク質を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「内腔操作されたＥＶ」は、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または内腔が、改変前のＥＶ、例えば、エクソソーム、または天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または内腔と異なるように、その組成において改変されたＥＶ、例えば、エクソソームの膜の内腔表面または内腔を有するＥＶ、例えば、エクソソームを指す。
操作は、ＥＶの内腔及び／または内腔表面、例えば、エクソソームが変更されるように、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔（すなわち、ＥＶ内の空隙）または膜、特にＥＶの内腔表面内に直接であり得る。例えば、膜は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面が改変されるように、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物などのその組成において改変される。同様に、内腔の内容物は改変され得る。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって以前に改変された細胞から産生されることによって変更され得る。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、または遺伝子工学によって以前に改変された細胞から産生されることによって変更され得る。いくつかの態様において、内腔操作されたＥＶ、例えば、内腔操作されたエクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または内腔において曝露され得る、またはＥＶ、例えば、エクソソームの内層で曝露される部分のための固定ポイント（取り付け）であり得る外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エクソソームが天然に発現しないタンパク質）またはその断片もしくは変異体を含む。他の態様において、内腔操作されたＥＶ、例えば、内腔操作されたエクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔に曝露され得る、またはＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に曝露された部分のための固定ポイント（取り付け）であり得る、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、足場タンパク質）またはその断片もしくは変異体のより高い発現を含む。
本明細書で使用される際、用語「表面操作されたＥＶ」は、操作されたＥＶの外部表面が改変前のＥＶの外部表面または天然に存在するＥＶの外部表面と異なるように、その組成において改変されたＥＶの外部表面を有するＥＶを指す。
本明細書で使用される場合、用語「表面操作されたエクソソーム」は、操作されたエクソソームの外部表面が、改変前のエクソソームの外部表面または天然に存在するエクソソームの外部表面と異なるように、その組成において改変されたエクソソームの外部表面を有するエクソソームを指す。
本明細書に記載のＥＶ、例えば、エクソソームの文脈で使用される用語「改変された」は、改変されたＥＶ、例えば、エクソソームが天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームと異なるように、ＥＶ、例えば、エクソソーム及び／またはその産生細胞の変更または操作を指す。いくつかの態様において、本明細書に記載の改変されたＥＶ、例えば、エクソソームは、天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームの膜と比較してタンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む。例えば、膜は、より高い密度または数の天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を含み、及び／または膜は、ＥＶ、例えば、エクソソームに天然に見られないタンパク質を含む。ある特定の態様において、膜へのそのような改変は、ＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、本明細書に記載の表面操作されたＥＶ及びエクソソーム）の外部表面を変化させる。ある特定の態様において、膜へのそのような改変は、ＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、本明細書に記載の内腔操作されたＥＶ及びエクソソーム）の内腔表面を変化させる。
例えば、内腔は、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物などのその組成において改変される。組成物は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって以前に改変された細胞から産生されることによって変更することができる。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、または遺伝子工学によって以前に改変された細胞から産生されることによって変更され得る。
本明細書で使用される際、タンパク質の「改変」という用語、例えば、「改変されたタンパク質」もしくは「タンパク質改変」またはその文法変異形で使用される際、タンパク質の非変異アミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体を含む。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体に対する化学的または物理的改変をさらに含み得る。いくつかの態様において、改変されたタンパク質は、改変されていないタンパク質の少なくとも１つの生理学的機能を保持する。
本明細書で使用される際、タンパク質（例えば、治療的タンパク質などの生物学的に活性な分子、または本明細書で開示される足場タンパク質）の「断片」という用語は、天然に存在する配列よりも短い、例えば、天然に存在するタンパク質と比較してＮ末端及び／またはＣ末端を欠失したタンパク質を指す。
本明細書で使用される際、用語「機能的断片」は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。したがって、いくつかの態様において、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの本明細書に開示される足場タンパク質の機能的断片は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面上に生物学的に活性な分子を固定する能力を保持する。
断片がその意味で機能的断片であるかどうかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び例えばＧＦＰのような自己蛍光タンパク質との断片の融合物を含む、ＥＶ、例えば、エクソソームのタンパク質含有量を決定する任意の技術分野で既知の方法によって評価され得る。特定の態様において、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１の断片は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔上または外部表面上にペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を固定するための天然に存在するＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１の能力の例えば少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％を保持する。特定の態様において、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１の変異体の能力、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片の能力は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔上または外部表面上にペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を固定するためのＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１それぞれの能力の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％である。この能力は、実験セクションに記載されているアッセイにおいて、例えば、蛍光標識変異体によって評価され得る。
本明細書で使用される用語「誘導体」は、化学的もしくは酵素的に改変された、ＥＶ、例えば、エクソソーム、成分（例えば、タンパク質もしくは脂質）、本開示の足場タンパク質、またはペイロード、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、抗体もしくはその断片）を指す。
本明細書で使用される際、タンパク質の「変異体」という用語は、当該技術分野で既知の方法による比較（例えば、配列アライメントによる）時に、ある特定の構造的（例えば、アミノ酸配列同一性）及び機能的な同一性を別のタンパク質と共有するタンパク質を指す。例えば、タンパク質の変異体は、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再配列を含み得る。いくつかの態様において、タンパク質の変異体は、非変異体タンパク質の少なくとも１つの生理学的機能を保持する。
具体的な態様において、変異体は、完全長、成熟ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片と少なくとも７０％の同一性を有する変異体タンパク質である。
いくつかの態様において、ＭＡＲＣＫＳの変異体またはＭＡＲＣＫＳの断片の変異体は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する対アライメントによって決定されるように、配列番号１によるＭＡＲＣＫＳまたはその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。
いくつかの態様において、ＭＡＲＣＫＳＬ１の変異体またはＭＡＲＣＫＳＬ１の断片の変異体は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する対アライメントによって決定されるように、配列番号２によるＭＡＲＣＫＳＬ１またはその機能的断片と、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。
いくつかの態様において、ＢＡＳＰ１の変異体またはＢＡＳＰ１の断片の変異体は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する対アライメントによって決定されるように、配列番号３によるＢＡＳＰ１またはその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。
いくつかの態様において、足場タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１）の変異体、足場タンパク質の機能的断片、または足場タンパク質の機能的断片の変異体は、誘導体である。
上記の各々の場合において、足場タンパク質の変異体または足場タンパク質の断片の変異体（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１の変異体、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片）は、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔上または外部表面上に固定する能力を保持する。
本明細書で提供する任意のタンパク質の記載は、タンパク質の機能的変異体を包含する。タンパク質の「機能的変異体」という用語は、ＥＶの内腔または外部表面、例えば、エクソソーム上に生物学的に活性な分子を固定する能力を保持するタンパク質の変異体を指す。特定の態様において、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１の機能的変異体、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片の機能的変異体の能力は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔上または外部表面上にペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を固定するためのＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１それぞれの能力の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％である。
天然に存在する変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで変化し得、本開示に含まれる。代替的には、非天然の変異体は、突然変異誘発技術によって、または直接合成によって産生され得る。
タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、変異体が生成され、ポリペプチドの特徴を改善または変更することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な喪失なしに、分泌タンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失した後であっても、ヘパリン結合活性を有する変異型ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、最大１０倍の活性を示した。（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）、その全体が参照により組み込まれる）
さらに、十分な証拠は、変異体がしばしば天然に存在するタンパク質と同様の生物学的な活性を保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅと同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な変異分析を行った。彼らは、ランダム変異誘発を使用して、分子の全長にわたって変異体あたり２．５アミノ酸変化に平均化した、３，５００個を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。可能なすべてのアミノ酸位置で複数の変異が検査された。研究者らは、「分子のほとんどが結合または生物学的な活性のいずれにもほとんど影響を与えずに変更され得ること」を発見した。（要約を参照）実際、試験した３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、２３個の独自のアミノ酸配列のみが、野生型と活性が著しく異なるタンパク質を産生した。
上述のように、変異体または誘導体は、例えば、改変ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖タンパク質の変異体または誘導体は、化学改変及び／または内因性改変の結果である。いくつかの態様において、変異体または誘導体は、インビボ改変の結果である。いくつかの態様において、変異体または誘導体は、インビトロ改変の結果である。さらに他の態様において、変異体または誘導体は、産生細胞における細胞内改変の結果である。
変異体及び誘導体において存在する改変は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の取り付け、ヘム部分の共有結合性の取り付け、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性の取り付け、脂質または脂質誘導体の共有結合性の取り付け、ホスホチジリノシトールの共有結合性の取り付け、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化を含む。
用語「アミノ酸置換」は、親または参照配列（例えば、野生型配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、例えば、化学ペプチド合成または当該技術分野で既知の組換え方法を介して、親または参照配列（例えば、野生型ポリペプチド配列）で置換されることができる。したがって、「Ｘ位での置換」への言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸と代替アミノ酸残基との置換を指す。いくつかの態様において、置換パターンは、スキーマＡｎＹに従って説明され得、Ａは、ｎ位に天然に、または元々存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。他の態様において、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）に従って説明され得、Ａは、ｎ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する単一文字コードであり、Ｙ及びＺは、Ａを置換することができる代替的なアミノ酸残基である。
本明細書で使用される際、用語「抗体」は、天然の、または部分的もしくは完全に合成的に産生される免疫グロブリン、及びその断片を包含する。本用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。用語抗体の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、その断片を含むことを意味し、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片などの抗体断片、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、それらが所望の生物学的な活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。本開示のいくつかの態様において、ペイロードは、抗体またはその抗原結合断片を含む生物学的に活性な分子である。いくつかの態様において、抗体（例えば、本開示の生物学的に活性な分子）は、ナノボディである。
用語「抗体－薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」は互換的に使用され、治療薬（本明細書では薬剤、薬物、または活性薬学的成分として時々称される）または薬剤に共有結合した抗体を指す。本開示のいくつかの態様において、ペイロードは、抗体－薬物コンジュゲートを含む生物学的に活性な分子である。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ポリペプチド内のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸に置き換えられた場合、置換は保存的であると見なされる。別の態様において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似するストリングで保存的に置き換えることができる。
本明細書で使用される場合、用語「保存された」は、それぞれ、比較される２つ以上の配列の同じ位置において変化なしに生じるものであるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の場所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりもより関連性の高い配列の間で保存されているものである。
いくつかの態様において、２つ以上の配列は、互いに１００％同一である場合、「完全に保存された」または「同一である」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、互いに少なくとも７０％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも９０％同一である、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。
いくつかの態様において、２つ以上の配列は、互いに約７０％同一である、約８０％同一である、約９０％同一である、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存された」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存された」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用され得るか、またはそれらの一部、領域もしくは特徴に適用し得る。
本明細書で使用される際、用語「相同性」は、高分子間、例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一般に、用語「相同性」は、２つの分子間の進化関係を意味する。したがって、相同である２つの分子は、共通の進化先祖を有するであろう。本開示の文脈において、用語相同性は、同一性及び類似性の両方を包含する。
いくつかの態様において、ポリマー分子は、分子におけるモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が同一（完全に同じモノマー）であるか、または類似（保存的置換）である場合、互いに「相同」であると見なされる。用語「相同」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。
本開示の文脈において、置換（それらがアミノ酸置換と称される場合でも）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替アミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間の全体的なモノマー保存を指す。任意の追加の修飾子のない用語「同一」、例えば、タンパク質Ａは、タンパク質Ｂと同一である、とは、配列が１００％同一であることを暗示する（１００％配列同一性）。例えば、「７０％同一である」として２つの配列を記述することは、例えば、「７０％の配列同一性」を有するとしてそれらを記述することに等しい。
２つのポリペプチド配列の同一性の割合の計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列をアライメントさせることによって実行され得る（例えば、ギャップは、最適なアライメントのために第１及び第２のポリペプチド配列の一方または両方に導入され得、同一でない配列は、比較目的のために無視され得る）。ある特定の態様において、比較目的のためにアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸を比較する。
第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は、２つの配列の最適アライメントのために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
比較のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：１５ ２３７－４４（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３（１９８９）Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５－６５（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）において説明される。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ２０ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０）Ｊは、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＢＣｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）及びインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。ＢＬＡＳＴ、及びプログラムを使用して配列同定を決定する方法の説明は、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のもとのＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の公式ウェブサイトでアクセスされ得る。
他の好適なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒ、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳ ｓｕｉｔｅの一部であり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａでＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも入手可能である。配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当該技術分野で既知の方法を使用して実施され得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアライメントする単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自の配列同一性の割合を有し得る。配列同一性の割合の値は、最も近い１０分の１に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１まで切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２まで切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることに留意されたい。
ある特定の態様において、第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の同一性の割合（％ＩＤ）または第１のアミノ酸配列（または核酸配列）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、Ｙは、（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによってアライメントされるように）第１及び第２の配列のアライメントにおいて同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性の割合は、第１の配列に対する第２の配列の同一性の割合よりも高い。
当業者は、配列同一性の割合の計算のための配列アライメントの生成が、一次配列データによって排他的に駆動される二値配列比較に限定されないことを理解するであろう。また、配列アライメントは、構造データ（例えば、結晶タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データ等の異種情報源からのデータと配列データを統合することによって生成され得ることも理解されるであろう。多重配列アライメントを生成するために不均一なデータを統合する好適なプログラムは、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、代替的に、例えば、ＥＢＩから入手可能である。また、配列同一性の割合を計算するために使用される最終アライメントは、自動的にまたは手動のいずれかでキュレートされ得ることも理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに類似性の割合の計算は、同一性の割合の計算と同じ方法で実行され得るが、類似性パーセントの計算は、当該技術分野で理解されるように保存的置換を考慮に入れることを除いてはならない。類似性の割合は、使用される比較尺度、すなわち、アミノ酸が、例えば、それらの進化近接度、電荷、体積、柔軟性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、またはそれらの組み合わせに従って比較されるかどうかに不随することが理解される。
本明細書で使用される際、用語「産生細胞」は、ＥＶ、例えば、エクソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、インビトロで培養された細胞、またはインビボ細胞であり得る。産生細胞は、これらに限定されないが、ＥＶの生成に有効であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊水細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞を含む。ある特定の態様において、産生細胞は、抗原提示細胞ではない。いくつかの態様において、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。
本明細書で使用される場合、用語「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、同様に「抽出された」及び「抽出すること」、及びその文法変異形は互換的に使用され、所望のＥＶ、例えば、エクソソーム、調製物の精製、例えば、選択または富化の１つ以上のプロセスを経た所望のＥＶ、例えば、エクソソーム、調製物の調製の状態（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される単離することまたは精製することは、産生細胞を含む試料からＥＶ、例えば、エクソソームを除去、部分的に除去する（例えば、画分）プロセスである。いくつかの実施形態において、単離されたＥＶ、例えば、エクソソーム、組成物は望ましくない活性を検出可能でない、または代替的に、望ましくない活性のレベルもしくは量が、許容されるレベルもしくは量、またはそれ未満である。
他の実施形態において、単離されたＥＶ、例えば、エクソソーム、組成物は、許容される量及び／または濃度、またはそれより上である、所望のＥＶ、例えば、エクソソームの量及び／または濃度を有する。他の態様において、単離されたＥＶ、例えば、エクソソーム、組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比較して富化される。この富化は、出発物質と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または約９９．９９９９％超までであり得る。
いくつかの態様において、単離されたＥＶ、例えば、エクソソーム、調製物は、残留の生物学的な産物（例えば、汚染物質）を実質的に含まない。いくつかの態様において、単離されたＥＶ、例えば、エクソソーム、調製物は、任意の汚染生物学的物質を、約１００％含まない、少なくとも約９９％含まない、少なくとも約９８％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９６％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９４％含まない、少なくとも約９３％含まない、少なくとも約９２％含まない、少なくとも約９１％含まない、または少なくとも約９０％含まない。残留の生物学的な産物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含み得ない。ある特定の態様において、単離されたＥＶ、例えば、エクソソーム、調製物は、任意の巨大分子、例えば、任意の核酸、タンパク質、脂質、及び／または炭水化物を、約１００％含まない、少なくとも約９９％含まない、少なくとも約９８％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９６％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９４％含まない、少なくとも約９３％含まない、少なくとも約９２％含まない、少なくとも約９１％含まない、または少なくとも約９０％含まない。残留の生物学的な産物を実質的に含まないことは、ＥＶ、例えば、エクソソーム、組成物が検出可能な産生細胞を含まず、ＥＶ、例えば、エクソソームのみが検出可能であることを意味し得る。
用語「賦形剤」または「担体」は、化合物の投与をさらに促進するために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、及びその文法変異形は、米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、またはヒトを含む動物での使用について米国薬局方に列挙されている薬剤のいずれか、同様に対象に重大な刺激を与えず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない任意の担体もしくは希釈剤を包含する。医薬組成物を調製する際に有用であり、概して安全であり、無毒であり、及び望ましい、賦形剤ならびに担体が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、本開示の足場に取り付けられ、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームの膜に固定され得る任意の分子を指す。いくつかの実施形態において、ペイロードは、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜の内腔表面に取り付けられる。ペイロードという用語は、生物学的に活性な分子、例えば、治療及び／または予防効果を有し得る分子だけでなく診断分子を包含する。したがって、ペイロードという用語は、検出可能な部分、例えば、リガンドまたはタグによって認識され得る放射性核種、蛍光分子、造影剤、タグ、または分子実体などの検出可能な部分も包含する。
本明細書で使用される場合、用語ペイロードは、用語「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」と同等であり、交換可能である。したがって、「カーゴタンパク質」または「カーゴペプチド」は、本開示の足場に結合した特定のタイプのペイロード分子（それぞれタンパク質及びペプチド）を指す。
本明細書で使用される「生物学的に活性な分子」という用語は、本開示の足場を介してＥＶ、例えば、エクソソームに取り付けられ得る任意の分子を指し、その分子は、それを必要とする対象において治療もしくは予防効果を有し得る、または対象における細胞もしくは組織の恒常性に影響を及ぼし得る。ＥＶ、例えば、エクソソーム、及び／または産生細胞に導入され得る生物学的に活性な分子の非限定的な例は、例えば、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または転写を中断させるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素のようなポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡのような制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または翻訳を中断させるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素もしくは抗体）、脂質、炭水化物、ウイルス及びウイルス粒子（例えば、アデノ随伴ウイルス及びウイルス粒子、レトロウイルス、アデノウイルスなど）、ならびにＭＬ－ＲＲ Ｓ２及び３’－３’ｃＡＩＭＰｄＦＳＨのような環状ジヌクレオチドを含む小分子ＳＴＩＮＧアゴニストを含む低分子（例えば、低分子薬物及び毒素）などの治療薬を含む。ある特定の態様において、ペイロードは、抗原を含む。ある特定の態様において、生物学的に活性な分子、例えば、治療薬、例えば、ヒトに対する治療薬は、本明細書に開示される足場タンパク質と融合したときに、生物学的機能、例えば、治療的機能を保持する。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも４５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも５５個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも６５個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、または少なくとも５００個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１０個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５０個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１００個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５個のアミノ酸、例えば、５～５００個、５～４５０個、５～４００個、５～３５０個、５～３００個、５～２５０個、５～２００個、５～１５０個、５～１００個、５～９０個、５～８０個、５～７０個、５～６０個、５～５０個、５～４０個、５～３０個、５～２０個、５～１５個、または５～１０個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１０個のアミノ酸、例えば、１０～５００個、１０～４５０個、１０～４００個、１０～３５０個、１０～３００個、１０～２５０個、１０～２００個、１０～１５０個、１０～１００個、１０～９０個、１０～８０個、１０～７０個、１０～６０個、１０～５０個、１０～４０個、１０～３０個、１０～２０個、または１０～１５個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５０個のアミノ酸、例えば、５０～５００個、５０～４５０個、５０～４００個、５０～３５０個、５０～３００個、５０～２５０個、５０～２００個、５０～１５０個、５０～１００個、５０～９０個、５０～８０個、５０～５０個、または５０～６０個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１００個のアミノ酸、例えば、１００～５００個、１００～４５０個、１００～４００個、１００～３５０個、１００～３００個、１００～２５０個、１００～２００個、または１００～１５０個のアミノ酸を有し得る。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、少なくとも１５０個、少なくとも１６０個、少なくとも１７０個、少なくとも１８０個、少なくとも１９０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、または少なくとも５００個のヌクレオチドを有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも２個のヌクレオチド、例えば、２～１０００個、２～９００個、２～５００個、２～３００個、または２～５０個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１０個のヌクレオチド、例えば、１０～１０００個、１０～９００個、１０～５００個、１０～３００個、または１０～５０個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１５個のヌクレオチド、例えば、１５～１０００個、１５～９００個、１５～５００個、１５～３００個、または１５～５０個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも２０個のヌクレオチド、例えば、２０～１０００個、２０～９００個、２０～５００個、２０～３００個、または２０～５０個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５０個のヌクレオチド、例えば、５０～１０００個、５０～９００個、５０～５００個、５０～３００個、または５０～１００個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも１００個のヌクレオチド、例えば、１００～１００００個、１００～９０００個、１００～５００５個、１００～３０００個、または１００～５００個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも２００個のヌクレオチド、例えば、２００～１００００個、２００～９０００個、２００～５０００個、２００～３０００個、または２００～５００個を有する。他の態様において、生物学的に活性な分子は、少なくとも５００個のヌクレオチド、例えば、５００～１００００個、５００～９０００個、５００～５０００個、または５００～３０００個を有する。本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、対象に導入される際に、それ自体に対する免疫応答（細胞性または体液性）を引き起こす任意の薬剤を指す。いくつかの態様において、ペイロード分子は、ＥＶ、例えば、エクソソームに共有結合で連結される。他の態様において、ペイロードは、アジュバントを含む。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して産生されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。操作された宿主細胞において発現される組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されていると見なされる。本明細書に開示されるポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法を使用して組換え技術で産生され得る。あるいは、本明細書に開示されるタンパク質及びペプチドは、化学的に合成され得る。本開示のいくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームに存在する足場タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソームにおける足場タンパク質のレベルが、そのような足場タンパク質を過剰発現しない産生細胞のＥＶ、例えば、エクソソームに存在する足場タンパク質のレベルに関して有意に増加するよう、産生細胞における足場タンパク質を過剰発現することによって組換え技術で産生される。
本明細書で使用される場合、足場タンパク質を介して本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面または外部表面上に生物学的に活性な分子を「固定」または「固定する」という用語は、それぞれ、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面または外部表面上に位置する足場分子の部分に生物学的に活性な分子を共有結合で取り付けることを指す。
用語「会合した」、「会合」、及びその文法変異形は、互換的に使用され、それぞれ、第２の部分、例えば、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有結合でまたは非共有結合で接合した第１の部分、例えば、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１の部分は、第２の部分に直接接合または並置され得る、あるいは、介在する部分は、第１の部分を第２の部分に共有結合で接合させ得る。いくつかの実施形態において、用語「会合した」は、ミリストイル化、イオン相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で使用される用語「連結された」または「融合された」は、ペプチド結合によって、または１つ以上のアミノ酸のリンカーによって、Ｃ末端またはＮ末端で第１の部分が第２の部分に融合されることを指す。用語「連結された」または「融合された」はまた、第２の部分（またはそれぞれ第１の部分）における任意の２つの点、例えばアミノ酸中への第１の部分全体（または第２の部分）の挿入を含む。一態様において、第１の部分は、ペプチド結合またはリンカーによって第２の部分に連結される。第１の部分は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２の部分に連結され得る。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖の場合）、またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）、または任意の化学部分（ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド鎖、または任意の化学分子の場合）であり得る。用語「連結された」はまた、ハイフン（－）によって示され得る。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソーム上の足場タンパク質は、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子に連結または融合され得る。
本明細書で使用される場合、「哺乳類対象」は、これらに限定されず、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含む全ての哺乳類を含む。
用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」、ならびにそれらの変異形は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または治療が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト療法及び獣医学的用途の両方に適用可能である。いくつかの態様において、対象は哺乳動物であり、他の態様において、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、「実質的に含んでいない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」という用語は、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）％濃度で、１０％未満の巨大分子、例えば汚染物質を含むことを意味する。いくつかの画分は、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、または約１０％（ｍ／ｖ）未満の巨大分子を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「巨大分子」は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物（例えば、ポリマー代謝産物）、またはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「従来のＥＶタンパク質」は、以前にＥＶが豊富であることが知られているタンパク質を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質」は、これらに限定されないが、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、またはそれらに結合するペプチドを含む、エクソソームが豊富であることが既知のタンパク質を意味する。疑いを避けるために、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片もしくは変異体は、従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質ではない。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的組成物」は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤などの１つ以上の他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わされ、または懸濁された本開示のエクソソームなどのＥＶなどの本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上を指す。医薬組成物の１つの目的は、ＥＶ、例えば、エクソソームの調製物の対象への投与を促進することである。
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含む任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、同様に三本鎖、二本鎖及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、改変された、例えば、アルキル化によって、及び／またはキャッピングによって、ならびに未改変の形態のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、スプライシングされているか非スプライシングかにかかわらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに、非ヌクレオチド骨格、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマーを含む他のポリマー、ならびにポリマーがＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含むことを提供する他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様において、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。いくつかの態様において、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様において、ある特定のクラスの全ての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにおける全てのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置き換えられ得る）。本開示のいくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、ポリヌクレオチドである。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、改変アミノ酸を含み得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは改変も包含する。定義の中には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）だけでなく当該技術分野で既知の他の改変を含むポリペプチドも含まれる。本開示のいくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームに結合したペイロード、例えば、生物学的に活性な分子は、ポリペプチド、例えば、ＡＤＣ、ＰＲＯＴＡＣ、毒素、融合タンパク質、または酵素等の抗体またはその誘導体である。
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オーソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の等価物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであり得るか、または二量体、三量体、または四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドを含み得る。最も一般的に、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見られる。用語ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用し得る。いくつかの態様において、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、「ペプチド」は、少なくとも約２～約５０、少なくとも約３～約５０、少なくとも約４～約５０、少なくとも約５～約５０、少なくとも約１０～約５０、少なくとも約１５～約５０、少なくとも約２０～約５０、少なくとも約２５～約５０、少なくとも約３０～約５０、少なくとも約３５～約５０、少なくとも約４０～約５０、または少なくとも約４５～約５０アミノ酸長であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「本開示の足場タンパク質」、または文法変異形は、以下、
（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に位置するタンパク質（天然発現、化学的もしくは酵素的に合成、または組換え技術で産生される）、
（ｉｉ）（ｉ）の任意の機能的断片、
（ｉｉｉ）（ｉ）～（ｉｉ）の任意の機能的変異体、
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の誘導体、
（ｖ）ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に結合し得る（ｉ）におけるタンパク質に由来するドメインもしくはそれらの組み合わせに対応する任意のペプチド、またはそのようなペプチドを含む分子、
（ｖｉ）ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に結合し得る（ｉ）におけるタンパク質に由来するモチーフに由来する任意のペプチド、またはそのようなペプチドを含む分子、
（ｖｉｉ）少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む（ｉ）～（ｖｉ）の分子、
（ｖｉｉｉ）またはそれらの任意の組み合わせ、
それは、ペイロード、例えば生物学的に活性な分子（例えば治療用タンパク質）をＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に標的化（取り付け）するための足場としての使用に好適である、を指す。
本明細書で使用される場合、用語「本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム」または文法変異形は、本開示の少なくとも１つの足場タンパク質を含むＥＶ、例えば、エクソソームを指す。
本明細書で使用される場合、用語「本開示の産生細胞」、または文法変異形は、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームを産生し得る細胞を指す。
ＩＩ．細胞外小胞タンパク質、例えば、エクソソームタンパク質
本開示のいくつかの態様は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面において高度に富化されたＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質（足場タンパク質）の同定、使用、及び改変に関する。そのようなＥＶタンパク質またはエクソソームタンパク質（足場タンパク質）は、質量分析または当該技術分野で既知の他の方法で高度に精製されたＥＶ、例えば、エクソソームを分析することによって同定され得る。
本開示の足場タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム膜上で豊富な、膜貫通タンパク質（すなわち、１つ以上の膜貫通ヘリックスを介してＥＶ膜にまたがるタンパク質）、一体型タンパク質、及び末梢タンパク質（すなわち、静電相互作用及び／またはアンカー部分を介して表面と相互作用する内腔表面上のタンパク質）などの様々な内腔タンパク質または膜タンパク質を含む。具体的には、本開示の足場タンパク質は、これらに限定されないが、以下、
（１）ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、
（２）ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び
（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）、を含む。
本明細書で特定される１つ以上のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）は、産生細胞、産生条件、精製方法、またはエクソソームの意図される適用に応じて選択的に使用され得る。
特定のサイズ範囲、標的指向性部分、電荷密度、ペイロードなどを有する特定のＥＶ、例えば、エクソソームの内腔（例えば、ＥＶ膜の内腔表面上）で富化されたＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質は、本開示のいくつかの態様で同定され、使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示される２つ以上のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、それらの任意の機能的断片、変異体、もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせなどの足場タンパク質）は、本開示の治療用ＥＶ、例えば、エクソソームの生成及び単離のために同時にまたはその後使用され得る。
ＩＩＩ．内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム
細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームは、典型的には、直径２０ｎｍ～１０００ｎｍである。小細胞外小胞であるエクソソームは、典型的には、直径１００～２００ｎｍである。ＥＶ、例えば、エクソソームは、限定脂質二重層ならびに多様な一式のタンパク質及び核酸から構成される（Ｍａａｓ，Ｓ．Ｌ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２７（３）：１７２－１８８（２０１７）。ＥＶ、例えば、エクソソームは、別個の細胞型及び組織において優先的な取り込みを示し、それらの向性は、標的細胞の表面上の受容体と相互作用するタンパク質をそれらの表面に付加することによって指向され得る（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（４）：３４１－３４５（２０１１））。
抗体とは異なり、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームあたり数千～数万オーダーの分子で、それらの表面に取り付けられた多数の分子を収容し得る。したがって、ＥＶ、例えば、エクソソーム、及びペイロード、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、治療的分子）を含むコンジュゲートまたは複合体は、高濃度の治療的または診断的化合物を個別の細胞型に送達し、同時に、化合物への全体的な全身曝露を制限するプラットフォームを表し、これは、オフターゲット毒性を低減させる。さらに、ＥＶ、例えば、エクソソームは、異なる区画に複数のペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を収容する可能性を提供する。例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームは、例えば、特定の標的細胞（例えば、がん細胞）または標的組織（例えば、肝臓または脳）にＥＶを導くであろうＥＶの外部表面に取り付けられた標的指向性部分、１つ以上の治療学部分（例えば、薬物）、及び／または１つ以上の検出可能な部分（例えば、造影剤または放射性核種）を含み得る。
ＥＶ、例えば、エクソソームはまた、異なるペイロード、例えば、ＥＶの内腔表面に取り付けられた治療学部分（例えば、薬物）及び／または検出可能部分（例えば、造影剤または放射性核種）を含み得る。加えて、ＥＶ、例えば、エクソソームはまた、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔に１つ以上のペイロード、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、治療薬、診断試薬、アジュバントなど）を含み得る。
したがって、ＥＶ、例えば、エクソソームは、複数のペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を、単一の送達ビヒクルにおいて、非常に高い密度で同じまたは異なる役割と組み合わせる送達フォーマットを提供する。
本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エクソソームは、約２０～３００ｎｍの間の直径を有する細胞外小胞である。ある特定の実施形態において、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、約２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、２０～２００ｎｍ、２０～１９０ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０～１７０ｎｍ、２０～１６０ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１４０ｎｍ、２０～１３０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２０～１１０ｎｍ、２０～１００ｎｍ、２０～９０ｎｍ、２０～８０ｎｍ、２０～７０ｎｍ、２０～６０ｎｍ、２０～５０ｎｍ、２０～４０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～３００ｎｍ、３０～２９０ｎｍ、３０～２８０ｎｍ、３０～２７０ｎｍ、３０～２６０ｎｍ、３０～２５０ｎｍ、３０～２４０ｎｍ、３０～２３０ｎｍ、３０～２２０ｎｍ、３０～２１０ｎｍ、３０～２００ｎｍ、３０～１９０ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０～１７０ｎｍ、３０～１６０ｎｍ、３０～１５０ｎｍ、３０～１４０ｎｍ、３０～１３０ｎｍ、３０～１２０ｎｍ、３０～１１０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３０～９０ｎｍ、３０～８０ｎｍ、３０～７０ｎｍ、３０～６０ｎｍ、３０～５０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、４０～２９０ｎｍ、４０～２８０ｎｍ、４０～２７０ｎｍ、４０～２６０ｎｍ、４０～２５０ｎｍ、４０～２４０ｎｍ、４０～２３０ｎｍ、４０～２２０ｎｍ、４０～２１０ｎｍ、４０～２００ｎｍ、４０～１９０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、４０～１６０ｎｍ、４０～１５０ｎｍ、４０～１４０ｎｍ、４０～１３０ｎｍ、４０～１２０ｎｍ、４０～１１０ｎｍ、４０～１００ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４０～８０ｎｍ、４０～７０ｎｍ、４０～６０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２９０ｎｍ、５０～２８０ｎｍ、５０～２７０ｎｍ、５０～２６０ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２４０ｎｍ、５０～２３０ｎｍ、５０～２２０ｎｍ、５０～２１０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１９０ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、５０～１４０ｎｍ、５０～１３０ｎｍ、５０～１２０ｎｍ、５０～１１０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２９０ｎｍ、６０～２８０ｎｍ、６０～２７０ｎｍ、６０～２６０ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、６０～２４０ｎｍ、６０～２３０ｎｍ、６０～２２０ｎｍ、６０～２１０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、６０～１９０ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０～１７０ｎｍ、６０～１６０ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、６０～１４０ｎｍ、６０～１３０ｎｍ、６０～１２０ｎｍ、６０～１１０ｎｍ、６０～１００ｎｍ、６０～９０ｎｍ、６０～８０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～３００ｎｍ、７０～２９０ｎｍ、７０～２８０ｎｍ、７０～２７０ｎｍ、７０～２６０ｎｍ、７０～２５０ｎｍ、７０～２４０ｎｍ、７０～２３０ｎｍ、７０～２２０ｎｍ、７０～２１０ｎｍ、７０～２００ｎｍ、７０～１９０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７０～１６０ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１４０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７０～１２０ｎｍ、７０～１１０ｎｍ、７０～１００ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～３００ｎｍ、８０～２９０ｎｍ、８０～２８０ｎｍ、８０～２７０ｎｍ、８０～２６０ｎｍ、８０～２５０ｎｍ、８０～２４０ｎｍ、８０～２３０ｎｍ、８０～２２０ｎｍ、８０～２１０ｎｍ、８０～２００ｎｍ、８０～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０～１７０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、８０～１５０ｎｍ、８０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８０～９０ｎｍ、９０～３００ｎｍ、９０～２９０ｎｍ、９０～２８０ｎｍ、９０～２７０ｎｍ、９０～２６０ｎｍ、９０～２５０ｎｍ、９０～２４０ｎｍ、９０～２３０ｎｍ、９０～２２０ｎｍ、９０～２１０ｎｍ、９０～２００ｎｍ、９０～１９０ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０～１７０ｎｍ、９０～１６０ｎｍ、９０～１５０ｎｍ、９０～１４０ｎｍ、９０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１１０～２９０ｎｍ、１２０～２８０ｎｍ、１３０～２７０ｎｍ、１４０～２６０ｎｍ、１５０～２５０ｎｍ、１６０～２４０ｎｍ、１７０～２３０ｎｍ、１８０～２２０ｎｍ、または１９０～２１０ｎｍの間の直径を有する。本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エクソソームのサイズは、以下に記載される方法に従って測定され得る。
いくつかの態様において、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、内部表面及び外部表面を含む二脂質膜（「ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜」）を含む。ある特定の実施形態において、内部表面は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内側コア（すなわち、内腔）に面する。ある特定の態様において、外部表面は、産生細胞または標的細胞のエンドソーム、多小胞体、または膜／細胞質と接触し得る。
いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。
いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は、内側リーフレット及び外側リーフレットを含む。内側及び外側リーフレットの組成は、当該技術分野で既知のトランスバイレイヤー（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ）分布アッセイによって決定され得、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。いくつかの態様において、外側リーフレットの組成物は、およそ７０～９０％の間のコリンリン脂質、およそ０～１５％の間の酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％の間のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様において、内側リーフレットの組成物は、およそ１５～４０％の間のコリンリン脂質、およそ１０～５０％の間の酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％の間のホスファチジルエタノールアミンである。
一態様において、本開示は、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの生成及び使用に関する。内腔操作されたエクソソームは、その組成において改変された、例えば、天然に見出されるエクソソームの組成に関して改変された内部空間（ＥＶの内腔表面）を有する。例えば、内腔表面の組成は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔側の構成要素のタンパク質、脂質またはグリカン含有量を変化させることによって改変され得る。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面は、ＥＶ、例えば、エクソソームに天然ではない１つ以上の組換え発現タンパク質、例えば、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み得る。したがって、本開示は、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をＥＶ、例えば、エクソソームに固定することを可能にする組成物を提供し、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子を本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質に連結することを含む。本開示はまた、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をＥＶ、例えば、エクソソームに固定する方法を提供し、生物学的に活性な分子を本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質に連結することを含む方法も提供する。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、脂質化を介してＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に取り付けられる。いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質は脂肪アシル化される。いくつかの態様において、足場タンパク質は、ミリストイル化される。
ミリストイル化は、ミリスチン酸に由来するミリストイル基が、アミド結合によってＮ末端グリシンのα－アミノ基に共有結合で取り付けられる脂質化改変である。ミリスチン酸は、ｎ－テトラデカン酸の系統名を有する１４炭素飽和脂肪酸（１４：４）である。この改変は、共翻訳的または翻訳後のいずれかで付加され得る。ミリストイル基の共翻訳付加中、Ｎ末端グリシンは、新たに形成された成長ポリペプチドにおけるＮ末端メチオニン残基の切断後に改変される。これは、ミリストイル化タンパク質のおよそ８０％で発生する。翻訳後のミリストイル化は、典型的には、内部グリシン残基の曝露をもたらすカスパーゼ切断事象の後に生じ、次いで、ミリスチン酸添加に利用可能であろう。共翻訳または翻訳後のミリストイル化（インビボまたはインビトロのいずれか、例えば酵素的に実施）に加えて、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質のミリストイル化は、化学合成を介して、例えば、合成ステップとして、化学合成中に足場タンパク質にミリスチン酸を付加することによっても生じ得る。
いくつかの実施形態において、生物学的膜への脂質固定は、パルミトイル化ではない（すなわち、パルミチン酸、一般的にはシステインへ、及びより少ない頻度でセリンまたはトレオニンへの取り付け）。他の実施形態において、生物学的膜への脂質定着は、プレニル化（プレニル基の結合）またはグリコシルホスファチジルイノシトール連結（ＧＰＩ連結）である。プレニル化タンパク質は、タンパク質のシステイン残基で共有結合により結合した疎水性イソプレンポリマー（すなわち、分枝状５炭化水素）を有するタンパク質である。ＧＰＩ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端カルボキシル基へのアミド結合を介してＧＰＩ複合体分子基に取り付けられる。ＧＰＩの取り付けは、ＧＰＩ－トランスアミダーゼ複合体の作用を通じて生じる。ホスファチジルイノシトールの脂肪酸鎖は、膜に挿入され、したがって、タンパク質を膜に固定するものである。
いくつかの実施形態において、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合のような化学的及び／または物理的方法により生成される。
他の実施形態において、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、遺伝子操作によって生成される。遺伝子改変産生細胞または遺伝子改変細胞の子孫から産生されるエクソソームは、改変内腔組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、より高い密度またはより低い密度でＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、足場タンパク質、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはそれらの組み合わせなどのエクソソーム内腔タンパク質）を有するか、またはＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の改変もしくは断片（例えば、任意の機能的断片、変異体、もしくはそれらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。
例えば、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質、またはＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の改変もしくは断片（例えば、足場タンパク質、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、それらの任意の機能的断片、変異体、もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせなどのエクソソーム内腔タンパク質）をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生され得る。外因性配列から発現されるタンパク質を含むＥＶ、例えば、エクソソームは、改変内腔表面タンパク質（足場タンパク質）組成物を含み得る。
ＥＶタンパク質、例えば、エクソソームタンパク質（例えば、足場タンパク質、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、それらの任意の機能的断片、変異体、もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせなどのエクソソーム内腔タンパク質）の様々な改変または断片は、本開示の実施形態に使用され得る。例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面をより効果的に標的化されるように改変されたタンパク質が使用され得る。ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面を特異的かつ効果的に標的にする必要な最小断片を含むように改変されたタンパク質もまた、使用され得る。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９９６６）は、プロテインキナーゼＣ基質、８０ｋＤａタンパク質、軽鎖としても知られている。全長ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は、３３２アミノ酸長であり、アミノ酸残基１５２～１７６にカルモジュリン結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質の断片、変異体、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質において存在するＮ末端メチオニンを欠く。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１、及びマクロファージミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質としても知られる、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９００６）を含む。全長ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、１９５アミノ酸長である。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、アミノ酸残基８７～１１０における脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインを有する。いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質の断片、変異体、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質において存在するＮ末端メチオニンを欠く。
いくつかの態様において、本開示の足場は、２２ｋＤａニューロン組織が豊富な酸性タンパク質またはニューロン軸索膜タンパク質ＮＡＰ－２２としても知られるＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８０７２３）を含む。全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、２２７アミノ酸長である。選択的スプライシングによって産生される異性体は、異性体１からアミノ酸８８～１４１が欠損している。いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質は、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質の断片、変異体、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質において存在するＮ末端メチオニンを欠く。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」を含み、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶの内腔表面、例えば、エクソソームと会合する。本明細書で使用される場合、用語「会合」は、膜成分への共有結合を伴わない、本開示の足場タンパク質とＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面との間の相互作用を指す。例えば、本開示の足場は、例えば、脂質アンカー（例えば、ミリスチン酸）、及び／または膜リン脂質の負荷電ヘッドと静電気的に相互作用する多塩基性ドメインを介して、ＥＶの内腔表面と会合し得る。他の態様において、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤは、ＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、イオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、配列において少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
他の態様において、ＥＤは、１つ以上の低複雑性領域、例えば、ＰＥＳＴモチーフをさらに含む。ＰＥＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）が豊富なペプチド配列である。いくつかの態様において、ＥＤは、負荷電残基（例えば、Ｇｌｕ）ならびに一過性リン酸化を受ける多くのＳｅｒ及びＴｈｒをさらに含む（したがって、両方ともＥＤ外の領域に負荷電を付加する）。
いくつかの態様において、ＮＤは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と、脂質化を介して、例えば、ミリストイル化を介して会合する。いくつかの実施形態において、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。いくつかの実施形態において、Ｎ末端Ｇｌｙは、ミリストイル化される。いくつかの態様において、ＮＤはＮ末端にＭｅｔを含まない。他の実施形態において、ＮＤは、ミリストイル化されたＧｌｙを含み、Ｎ末端にＭｅｔを含まない。
いくつかの態様において、ＥＤは、イオン相互作用によってＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。いくつかの実施形態において、ＥＤは、静電相互作用、特に、魅力的な静電相互作用によって、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に会合する。
いくつかの態様において、ＥＤは、（ｉ）塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、または（ｉｉ）ポリペプチド配列において互いに隣接する２つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）を含む。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。いくつかの実施形態において、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、ｎは、１～１０の整数である。
他の態様において、ＥＤは、少なくともリジンを含み、ＥＤのＮ末端がＮＤのＣ末端でリジンに直接連結されている場合、ＮＤはＣ末端でリジンを含み、すなわち、リジンはＥＤのＮ末端にあり、ＮＤのＣ末端でリジンに融合される。他の実施形態において、ＥＤのＮ末端がリンカー、例えば、１つ以上のアミノ酸によってＮＤのＣ末端に連結されている場合、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。
いくつかの態様において、ＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本開示はまた、いくつかの態様において、リジン反復はアルギニンで置き換えられ得ることも提供する。他の態様において、ＥＤまたは足場タンパク質におけるアルギニン反復は、リジン有効性と比較して低い担持有効性を提供する。
いくつかの態様において、本開示について有用な足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、ＥＤまたはＮＤと共にするＥＤにおける配列において反復する少なくとも２つのリジンまたは少なくとも３つのリジン、すなわち、ＮＤのＣ末端におけるリジン及びＥＤのＮ末端におけるＫを必要とする。いくつかの実施形態において、ＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載されるアミノ酸配列を含み、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６のそれぞれは、独立して、アミノ酸を表し、Ｘ６は塩基性アミノ酸を表す。いくつかの態様において、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｘ５アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ２アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される。いくつかの態様において、足場タンパク質は、Ｎ末端に、例えば、ミリストイル化されたＭｅｔを含まない。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、ＮＤ及びＥＤを含み、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載のアミノ酸配列を含み、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６のそれぞれは、独立して、アミノ酸を表し、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を表し、Ｘ５アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択され、Ｘ３は、アミノ酸を表し、Ｘ２アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択され、ＥＤは、少なくとも１つのアミノ酸、例えば、少なくとも１つのＬｙｓを含み、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０、もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列ではない。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載されるアミノ酸配列を含み、Ｇは、Ｇｌｙとして表されるグリシンであり、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６のそれぞれは、独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含み、ＥＤは、ペプチド結合によってＸ６に連結され、ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む。いくつかの態様において、足場タンパク質は、Ｎ末端に、例えば、ミリストイル化されたＭｅｔを含まない。他の態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０、もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まない、またはそれらからならない。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質のＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、
ａ．Ｇは、Ｇｌｙを表し、
ｂ．「：」は、ペプチド結合を表し、
ｃ．Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｄ．Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、
ｅ．Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｆ．Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｇ．Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表す。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、Ｎ末端に、例えば、ミリストイル化されたＭｅｔを含まない。他の態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まない、またはそれらからならない。いくつかの態様において、Ｘ３アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。
いくつかの態様において、ＮＤ及びＥＤは、リンカーによって接合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、用語「リンカー」は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドもしくはポリペプチド配列）、または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。いくつかの態様において、２つ以上のリンカーは、直列に連結し得る。概して、リンカーは、柔軟さを提供する、または立体障害を予防／改善する。リンカーは、典型的には切断されないが、ある特定の態様において、そのような切断が望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のプロテアーゼ切断可能部位を含み得、それはリンカーの配列内に位置し得るか、リンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接し得る。ＮＤ及びＥＤがリンカーによって接合されるとき、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。
いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含み得る。
いくつかの態様において、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍによるグリシン／セリンリンカーであり、式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である。他の態様において、グリシン／セリンリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚによるものであり、式中、ｘは１～４の整数であり、ｙは０または１であり、ｚは１～５０の整数である。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは配列Ｇｎを含み、ｎは１～１００の整数であり得る。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎを含み得、式中、ｎは１～１００の整数である。他の態様において、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み得、式中、ｎは１～１００の整数である。
いくつかの態様において、ペプチドリンカーは合成、すなわち、非天然に存在する。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖配列を、天然に連結されていないか、または天然に遺伝子融合されていないアミノ酸の第２の直鎖配列に連結するか、または遺伝子融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然に存在するまたは天然に存在しないペプチド）を含む。例えば、一態様において、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含み得る。
他の態様において、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含み得る。さらに他の態様において、ペプチドリンカーは、天然に存在しない直鎖配列における存在する天然に存在するアミノ酸を含み得る。さらに他の態様において、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含み得る。
本開示はまた、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質に結合した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームも提供し、足場タンパク質は、ＮＤ－ＥＤを含み、
ａ．ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６を含み、
ｉ．Ｇは、Ｇｌｙを表し、
ｉｉ．「：」は、ペプチド結合を表し、
ｉｉｉ．Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｉｖ．Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、
ｖ．Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｖｉ．Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｖｉｉ．Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表し、
ｂ．「－」は、任意のリンカーを表し、
ｃ．ＥＤは、（ｉ）少なくとも２つの連続するリジン（Ｌｙｓ）、ペプチド結合もしくは１つ以上のアミノ酸によってＸ６に連結したＮ末端リジン、または（ｉｉ）ペプチド結合によってＸ６に直接連結された少なくとも１つのリジンを含むエフェクタードメインである。いくつかの態様において、足場タンパク質は、Ｎ末端に、例えば、ミリストイル化されたＭｅｔを含まない。他の態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まない、またはそれらからならない。
いくつかの態様において、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｘ３アミノ酸はＬｙｓである。いくつかの態様において、Ｘ４アミノ酸はＬｅｕまたはＧｌｕである。いくつかの態様において、Ｘ５アミノ酸は、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｘ６アミノ酸はＬｙｓである。いくつかの態様において、Ｘ２アミノ酸はＧｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、Ｘ３アミノ酸はＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ４アミノ酸はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕであり、Ｘ５アミノ酸はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ６アミノ酸はＬｙｓである。いくつかの態様において、－リンカーは、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質におけるＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１５３）、ＲＲＲＲＲ（配列番号１５４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１５７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１５８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１５９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号１６０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせに記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）～（ｖ）の配列のＮ末端にＭｅｔを有するアミノ酸配列を含まない。他の態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、もしくは１２２～１５０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まないか、またはそれらからならない。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質中のＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号２０３）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫ（配列番号２０４）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫ（配列番号２０５）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫ（配列番号２０６）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含み、足場タンパク質中のＥＤは、ａ）Ｋ、（ｂ）ＫＫ、（ｃ）ＫＫＫ、（ｄ）ＫＫＫＧ（配列番号２０７）、（ｅ）ＫＫＫＧＹ（配列番号２０８）、（ｆ）ＫＫＫＧＹＮ（配列番号２０９）、（ｇ）ＫＫＫＧＹＮＶ（配列番号２１０）、（ｈ）ＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号２１１）、（ｉ）ＫＫＫＧＹＳ（配列番号２１２）、（ｋ）ＫＫＫＧＹＧ（配列番号２１３）、（ｌ）ＫＫＫＧＹＧＧ（配列番号２１４）、（ｍ）ＫＫＫＧＳ（配列番号２１５）、（ｎ）ＫＫＫＧＳＧ（配列番号２１６）、（ｏ）ＫＫＫＧＳＧ（配列番号２１７）、（ｐ）ＫＫＫＧＳＧＳ（配列番号２１８）、（ｑ）ＫＫＫＳ（配列番号２１９）、（ｒ）ＫＫＫＳＧ（配列番号２２０）、（ｓ）ＫＫＫＳＧＧ（配列番号２２１）、（ｔ）ＫＫＫＳＧＧＳ（配列番号２２２）、（ｕ）ＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号２２３）、（ｖ）ＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号２２４）、（ｗ）ＫＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２２５）、（ｘ）ＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号２２６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）～（ｖ）の配列のＮ末端にＭｅｔを有するアミノ酸配列を含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まないか、またはそれらからならない。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１５７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１５８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１５９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号１６０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６１）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６２）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６３）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６４）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号１６５）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号１６６）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号１６７）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号１６８）、または（ｉｘ）それらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）～（ｉｘ）の配列のＮ末端にＭｅｔを有するアミノ酸配列を含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まない、またはそれらからならない。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６１）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６２）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６３）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６４）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号１６５）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号１６６）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号１６７）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号１６８）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約５０、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３３５、少なくとも約３４０、少なくとも約３４５、または少なくとも約３５０アミノ酸長である。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、約１９０～約２００、約２００～約２１０、約２１０～約２２０、約２２０～約２３０、約２３０～約２４０、約２４０～約２５０、約２５０～約２６０、約２６０～約２７０、約２７０～約２８０、約２８０～約２９０、約２９０～約３００、約３００～約３１０、約３１０～約３２０、約３２０～約３３０、約３３０～約３４０、または約３４０～約２５０アミノ酸長である。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１６９）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７０）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７１）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７２）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号１７３）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号１７４）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号１７５）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号１７６）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１７８）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号１７９）を含む。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）～（ｘｉ）の配列のＮ末端にＭｅｔを有するアミノ酸配列を含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まないか、またはそれらからならない。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１６９）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７０）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７１）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７２）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号１７３）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号１７４）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号１７５）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号１７６）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１７８）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号１７９）からなる。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）～（ｘｉ）の配列のＮ末端にＭｅｔを有するアミノ酸配列を含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まないか、またはそれらからなる。
他の態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、本明細書に開示される配列のいずれか１つを含むが、Ｎ末端にＭｅｔを有する対応する配列、例えば、配列番号４～１０９を含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、表１の配列のいずれか１つを含むが、（ｉ）配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０または１８０～１９０を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１１５または１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含まないか、またはそれらからならない。
本開示について有用な足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質の非限定的な例を以下に列挙する。






いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、本開示の配列のいずれかからなる、またはそれらから本質的になる。いくつかの態様において、本開示の足場は、表１に開示される配列からなる。いくつかの態様において、本開示の足場は、本明細書に開示される配列、例えば、膜アンカー（例えば、ミリスチン酸）に共有結合で取り付けた表１に開示される配列からなる。いくつかの態様において、膜固定は、脂質化を介して実施し得る。いくつかの実施形態において、脂質化は、例えば、脂肪アシル化であり得る。いくつかの態様において、脂肪アセチル化は、例えば、ミリストイル化であり得る。いくつかの態様において、膜アンカーは、本明細書に開示される配列、例えば、表１に開示される配列のＮ末端アミノ酸に共有結合で取り付けられる。いくつかの態様において、膜アンカーは、本明細書に開示される配列、例えば、表１に開示される配列のＮ末端グリシンに共有結合で取り付けられる。したがって、いくつかの態様において、本開示の足場は、Ｎ－ミリストイル化された開示された配列、例えば、表１に開示された配列からなる。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、足場タンパク質のＮ末端に脂質アンカーとして機能する脂質化アミノ酸、例えば、ミリストイル化アミノ酸を含む。いくつかの態様において、Ｇｌｙにおける足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基。Ｎ末端Ｇｌｙの存在は、Ｎ－ミリストイル化の要件である。いくつかの態様において、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、合成である。いくつかの態様において、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである。
いくつかの態様において、脂質アンカーは、化学合成によって、または本開示の足場タンパク質の任意のＮ末端アミノ酸に酵素的に取り付けられ得る。
他の態様において、脂質アンカーは、当該技術分野で既知の任意の脂質アンカー、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。まれな状況下では、例えば、ミリスチン酸が制限されている培養培地を使用することによって、短鎖及び不飽和を含むいくつかの他の脂肪酸が、Ｎ末端グリシンに取り付けられ得る。例えば、ＢＫチャネルにおいて、ミリスチン酸塩は、ヒドロキシエステル結合を介して内部セリン／トレオニンまたはチロシン残基に翻訳後に取り付けられることが報告されている。当該技術分野で既知の膜アンカーは、以下の表に提示される。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、配列番号１（ＭＡＲＣＫＳ）、配列番号２（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、または配列番号３（ＢＡＳＰ１）の成熟形態、すなわち、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸なしと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、配列番号１（ＭＡＲＣＫＳ）、配列番号２（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、または配列番号３（ＢＡＳＰ１）の成熟形態、すなわち、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸なしの機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本開示の足場タンパク質に取り付けた生物学的に活性な分子は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔側にある。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔側に位置する足場タンパク質のＥＤドメインと、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子との間に挿入される。したがって、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の外部表面に固定される。
いくつかの態様において、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、小胞外ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、小胞外ドメインは、膜貫通ドメインと生物学的に活性な分子との間に挿入される。
いくつかの態様において、足場タンパク質は、少なくとも１つのリンカー、例えばペプチドリンカーを介して生物学的に活性な分子に連結される。いくつかの態様において、ＮＤは、両方のドメイン間に直接挿入されたリンカーによってＥＤに連結される。いくつかの態様において、リンカーは、例えば、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは切断可能なリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは柔軟なリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、自己崩壊性リンカーを含む。
本開示の足場タンパク質と生物学的に活性な分子（例えば、治療活性を有する分子）との間の融合もまた使用され得る。例えば、融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１などの足場タンパク質、またはそれらの改変、特にそれらの断片もしくは変異体、及びペイロード、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）を含み得る。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＢＡＳＰ１のアミノ末端の断片を含む足場タンパク質を含む。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、化学化合物、ウイルス、イオノフォア、イオノフォア用担体、チャネルもしくは細孔を形成する部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、融合タンパク質、または治療的化合物へのリンカーからなる群から選択され得る。生物学的に活性な分子（例えば、治療的化合物）はまた、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、または低分子であり得る。生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、抗体、酵素、リガンド、抗原（例えば、腫瘍抗原、または細菌、ウイルス、真菌、もしくは原生動物などの感染性薬剤由来の抗原）、受容体、抗菌ペプチド、転写因子、またはそれらの断片もしくは改変であり得る。
ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子に融合またはコンジュゲートされた本開示の足場を含む融合タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に取り付けられ得、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームに治療的活性を提供する。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、ゲノム編集複合体の成分である。いくつかの実施形態において、該ゲノム編集複合体は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬ－エフェクターヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２もしくはＣ２ｃ３複合体、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹもしくはＣａｓＸ複合体、または当該技術分野で既知の任意の他の適切なＣＲＩＳＰＲ複合体、または当該技術分野で既知の任意の他の適切なゲノム編集複合体またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、膜貫通ペプチドである。本明細書に記載の膜貫通ペプチドは、本明細書に記載の配列のいずれか、またはその任意の断片もしくは変異体への融合タンパク質として発現され得る。いくつかの実施形態において、膜貫通タンパク質は、ＥＶ例えば、エクソソームの内腔における内腔配列に融合された第１の端部、及びＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に発現される第２の端部を有する。
いくつかの実施形態において、例えば、本開示のＥＶは、第２の足場タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、第２の足場タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）ポリペプチド、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリー１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド、ネプリリシン（ＭＭＥ）ポリペプチド、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）ポリペプチド、またはそれらの断片、変異体、もしくは誘導体を含む膜貫通タンパク質を含む。第２の足場タンパク質の非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，１９５，２９０号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／０４０９２０号に見出され得る。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、核酸結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、核酸結合タンパク質は、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ＴＲＢＰ、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質である。いくつかの実施形態において、核酸結合タンパク質は、１つ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、タンパク質－タンパク質相互作用系の一部である。いくつかの実施形態において、タンパク質間相互作用システムは、ＦＲＢ－ＦＫＢＰ相互作用システム、例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００５ Ａｐｒ ６；１２７（１３）：４７１５－２１に記載されるようなＦＲＢ－ＦＫＢＰ相互作用システムを含む。
融合タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面を標的化され得、ＥＶ、例えば、エクソソームに治療的活性を提供し得る。
いくつかの実施形態において、標的指向性部分を有する融合タンパク質が、使用される。例えば、融合タンパク質は、（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１などの足場タンパク質、またはそれらの断片、変異体、もしくは改変、及び（ｉｉ）標的指向性部を含み得る。標的指向性部は、ＥＶ、例えば、エクソソームを使用した治療のために、ＥＶ、例えば、エクソソームを標的化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的指向性部は、抗体またはその抗原結合断片である。
抗体及びそれらの抗原結合断片は、抗体全体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含み、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ及びＦｄ断片などの抗体断片、ダイアボディ、ミニボディ、ラクダ抗体、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含む。
抗体及びそれらの抗原結合断片は、所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体も含む。抗体のモジュラーアーキテクチャは、６０を超える異なる二重特異性抗体フォーマットを作製するために利用されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７：９５－１０６を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態において、二重特異性抗体フォーマットは、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（二重作用Ｆａｂ）（２イン１）、ＤＡＦ（４イン１）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブインホール共通ＬＣ、ノブインホールアセンブリ、チャージペア、Ｆａｂ－アーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、トリオマブ（Ｔｒｉｏｍａｂ）、ＬＵＺ－Ｙ（２つのＨＣのヘテロ二本化を誘導する白血球ジッパーを備えた二重特異性抗体）、Ｆｃａｂ、Ｋλ－ｂｏｄｙ、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ（二重可変ドメインＩｇＧ）、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ（４イン１）、ナノボディ、ナノボディ－ＨＳＡ、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導体）、ダイアボディ、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）、ＴａｎｄＡｂ（タンデム抗体）、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２－ＳｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、イントラボディ、Ｄｏｃｋ及びＬｏｃｃｋ、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ｓｃダイアボディ－ＨＳＡ、タンデムｓｃＦｖ－トキシン、ＩｇＧ－ＩｇＧ、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、ならびにｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦＶ２から選択される。二重特異性抗体は、軽鎖または重鎖のいずれかのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかを追加の抗原結合単位で付加することによって、二重特異性のために操作された単一特異性抗体であり得る。これらの追加の抗原結合単位の代替としては、単一ドメイン抗体（対合されていないＶＬまたはＶＨ）、対合抗体可変ドメイン（例えば、ＦｖまたはｓｃＦｖ）、または操作されたタンパク質足場が挙げられる。二重特異性抗体定常ドメインの一部または全てを欠く多数の二重特異性断片形態は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、治療的ペプチド）は、本開示の足場タンパク質及びウイルスタンパク質を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシド、エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面上に保持される完全なままのウイルスの集合を可能にする。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。いくつかの実施形態において、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、免疫原性タンパク質である。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、毒素、トキソイド、または毒素の非毒性変異体である。いくつかの実施形態において、毒素は、ジフテリア毒素である。いくつかの実施形態において、トキソイドは、破傷風トキソイドである。いくつかの実施形態において、ジフテリア毒素は、ジフテリア毒素の非毒性変異体である。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子は、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子の活性化剤は、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２からなる群から選択されるＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子は、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、正の共刺激分子の活性化剤は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、以下からなる群から選択されるサイトカインである：ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体を含むタンパク質である。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、腫瘍抗原を含むタンパク質である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。
いくつかの態様において、本開示の生物学的に活性な分子及び足場タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、または本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）、またはその改変、特にその断片もしくは変異体）を含む融合タンパク質は、足場タンパク質を欠く生物学的に活性な分子の発現と比較して、ＥＶ、例えば、エクソソームにおける生物学的に活性な分子の富化をもたらす。いくつかの態様において、本開示の生物学的に活性な分子及び足場タンパク質（例えば、Ｎ末端Ｍを有しないＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、Ｎ末端Ｍを有しない配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０もしくは１８０～１９０のアミノ酸配列、配列番号１１５もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１））を含む融合タンパク質は、足場タンパク質を欠く生物学的に活性な分子の発現と比較して、ＥＶ、例えば、エクソソームにおける生物学的に活性な分子の富化をもたらす。
いくつかの実施形態において、本開示について有用な足場タンパク質は、配列番号４～１０９のうちのいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、または表１に開示される任意の配列を含む。いくつかの態様において、本開示について有用な足場タンパク質は、配列番号４～１０９のいずれかを含み、足場タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、表１に開示される配列を含み、足場タンパク質はＮ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの態様において、本開示について有用な足場タンパク質は、Ｎ末端Ｍを有しないＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、Ｎ末端Ｍを有しない配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０、もしくは１８０～１９０のアミノ酸配列、配列番号１１５、もしくは１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む。いくつかの態様において、本開示について有用な足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１を含み、足場タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、配列番号４～１１４、１１６～１１８、１２２～１５０、または１８０～１９０のアミノ酸配列を含み、足場タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、配列番号１１５または１１８～１２１によってコードされるアミノ酸配列を含み、足場タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。他の実施形態において、本開示について有用な足場タンパク質は、本明細書に開示される任意の配列を含むが、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない表１に開示される任意の配列のうちのいずれか１つではない。他の実施形態において、本開示について有用な足場タンパク質は、本明細書に開示される任意の配列を含むが、配列番号４～１０９のうちのいずれか１つを含まない。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列ＭＧＸＫＬＳＫＫＫを有し、Ｘがアラニンまたは任意の他のアミノ酸であるペプチド（配列番号１１７）、または（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含む足場タンパク質を含み、得られる融合タンパク質が、生物学的に活性な分子に接合したＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号４２５）または（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）を含むように、Ｎ末端Ｍが切断され、各括弧位置はアミノ酸を表し、πは（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。いくつかの実施形態において、本開示について有用な足場タンパク質は、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫではなく、Ｘはアラニンまたは任意の他のアミノ酸（配列番号１１７）であり、または（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドではない。いくつかの実施形態において、本開示に有用な足場タンパク質は、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫを含まず、Ｘはアラニンまたは任意の他のアミノ酸（配列番号１１７）であり、または（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含まない。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）または（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含む足場タンパク質を含み、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Φは（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含む足場タンパク質を含み、足場タンパク質は、Ｎ末端Ｍ（例えば、Ｎ末端メチオニン）を含まない。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含む足場タンパク質を含み、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Φは（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもなく、配列は（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）ではない。いくつかの態様において、足場タンパク質は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、足場タンパク質はＮ末端Ｍｅｔを含まない。
いくつかの実施形態において、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びそれらの断片、変異体、または誘導体からなるリストから選択される。
いくつかの実施形態において、エクソソームにおけるＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、または配列番号４～１０９のいずれかを含む融合タンパク質の富化は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４～１０９のいずれかを欠く融合タンパク質よりも、または従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を含む融合タンパク質と比較して＞２倍、＞４倍、＞８倍、＞１６倍、＞２５倍、＞５０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞５００倍、＞７５０倍、＞１，０００倍、＞２，０００倍、＞５，０００倍、＞７，５００倍、＞１０，０００倍高い。いくつかの態様において、エクソソームにおけるＮ末端Ｍを有しないＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、Ｎ末端Ｍを有しない配列番号４～１０９のいずれか、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の配列、例えば、表１を含む融合タンパク質の富化は、Ｎ末端Ｍを有しないＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、Ｎ末端Ｍを有しない配列番号４～１０９のいずれか、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の配列、例えば、表１を欠く融合たんぱく質よりも、または従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を含む融合タンパク質と比較して、＞２倍、＞４倍、＞８倍、＞１６倍、＞２５倍、＞５０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞５００倍、＞７５０倍、＞１，０００倍、＞２，０００倍、＞５，０００倍、＞７，５００倍、＞１０，０００倍高い。
いくつかの実施形態において、エクソソームにおけるＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質の富化は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を欠く融合タンパク質よりも、または従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を含む融合タンパク質と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１，５００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約２，５００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約３，５００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約４，５００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約５，５００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約６，５００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約７，５００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約８，５００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約９，５００倍、または少なくとも約１０，０００倍高い。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれかのタンパク質配列、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）は、融合タンパク質でＥＶ、例えば、エクソソームを担持するのに十分である。
いくつかの実施形態において、本明細書で新たに特定された外因性配列（例えば、生物学的に活性な分子）及びＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）を含む融合タンパク質を含む内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、当該技術分野で既知の従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、またはそれらに結合するペプチド）にコンジュゲートされた外因性配列を含む、同様に操作されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも高い密度の融合タンパク質を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で新たに特定されたＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）を含む融合タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面において、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を使用して同様に改変された他のＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面における融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本明細書で新たに特定されたＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）を含む融合タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面において、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を使用して同様に改変された他のＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔表面における融合タンパク質よりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームにおいて、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ラクタドヘリンを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の変異体を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ラクタドヘリンを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳＬ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の変異体を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ラクタドヘリンを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームにおいて、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（例えば、ＢＡＳＰ１、変異体、断片、断片の変異体、またはその改変）を含む融合タンパク質は、従来のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質の変異体を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質よりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ラクタドヘリンを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ラクタドヘリンを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂｔを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、従来のプロティエンを使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームよりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、配列番号１～１０９のいずれか、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む融合タンパク質は、従来のＥＶタンパク質、例えば、エクソソームタンパク質の変異体を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質よりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号１～１０９のいずれかを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まず、融合タンパク質は、従来のＥＶタンパク質、例えば、エクソソームタンパク質を使用して同様に改変されたＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質よりも２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、当該技術分野で既知の内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームと比較して優れた特徴を示す。例えば、本明細書で提供される新たに特定されたＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質を使用することによって産生される内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、従来技術におけるＥＶ、例えば、エクソソーム、例えば、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を使用して産生されるものと比較して、それらの内腔表面上でより多く富化された改変タンパク質を含む。
さらに、本開示の内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、当該技術分野で既知の内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームと比較して、より素晴らしく、より特異的に、またはより制御された生物学的活性を有し得る。例えば、本明細書に記載のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質またはその断片（例えば、ＢＡＳＰ１またはその断片、変異体、もしくは誘導体などの本開示の足場）に融合したペイロード、例えば、治療的または生物学的に関連する外因性配列を含む内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、当該技術分野で既知の足場への融合よりも所望の操作された特徴のうちのより多くを有し得る。
当該技術分野で既知の足場タンパク質としては、テトラスパニン分子（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９など）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２及びＬＡＭＰ２Ｂ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリン及びそれらの断片、ならびにそれらのタンパク質またはその断片のいずれかに親和性を有するペプチドが挙げられる。疑いを避けるために、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片もしくは変異体は、従来のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質ではない。以前、外因性タンパク質の過剰発現は、内腔操作されたエクソソームを産生するために、外因性タンパク質のエクソソームへの確率的またはランダムな配置に依存した。これは、エクソソームにおける外因性タンパク質の低レベルで予測不可能な密度をもたらした。したがって、本明細書に記載のＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質及びその断片は、新規のＥＶ、例えば、エクソソーム組成物及びその作製方法における重要な進歩を提供する。
本明細書で提供する融合タンパク質は、本開示の足場タンパク質、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、及び追加のペプチドを含み得る。追加のペプチドは、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）またはその断片、変異体、または誘導体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに取り付けられ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供する融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、及び２つの追加のペプチドなどの本開示の足場タンパク質を含む。２つの追加のペプチドの両方は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）、またはその断片、変異体、もしくは誘導体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに取り付けられ得る。いくつかの実施形態において、２つの追加のペプチドの一方は、Ｎ末端に取り付けられ、２つの追加のペプチドの他方は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）またはその断片、変異体、または誘導体のＣ末端に取り付けられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の内腔操作された細胞外小胞を生成する組成物及び方法は、ナノ小胞を含む。
ＩＶ．内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの産生のための産生細胞
本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、インビトロまたは対象の体液で成長した細胞から産生され得る。ＥＶ、例えば、エクソソームがインビトロ細胞培養から産生されるとき、様々な産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞は、本開示のために使用され得る。本明細書に記載される内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの産生に使用し得る追加の細胞型としては、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びがん細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、本開示は、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームを産生する細胞を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上のベクターを含み、ベクターは、足場タンパク質及びペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸配列は、足場タンパク質をコードし、第２の核酸配列は、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をコードする。いくつかの実施形態において、足場タンパク質をコードする核酸配列及びペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をコードする核酸配列は、単一のオープンリーディングフレーム内にあり、したがって、発現産物は、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子に融合された足場タンパク質を含む融合タンパク質であろう。いくつかの実施形態において、核酸配列は、プロモーターに作用可能に連結される。
産生細胞は、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを産生するための１つ以上の外因性配列を含むように遺伝子改変され得る。遺伝子改変産生細胞は、一過性または安定な形質転換によって外因性配列を含み得る。外因性配列は、プラスミドとして形質転換され得る。外因性配列は、標的部位またはランダム部位で、産生細胞のゲノム配列に安定的に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、安定した細胞株は、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの産生のために生成される。
外因性配列は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質をコードする内因性配列の内部、上流（５’末端）または下流（３’末端）に位置する、産生細胞のゲノム配列に挿入され得る。当該技術分野で既知の様々な方法は、産生細胞への外因性配列の導入のために使用され得る。例えば、様々な遺伝子編集方法（例えば、相同組換え、トランスポゾン媒介系、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して改変された細胞は、本開示の範囲内である。
外因性配列は、本開示の足場タンパク質（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質、またはＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の改変もしくは断片）をコードする配列を含み得る。足場タンパク質（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質）をコードする配列の追加のコピーはより高い密度のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質を有する内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを産生するために導入され得る。ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の改変または断片をコードする外因性配列は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質の改変または断片を含む内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを産生するために導入され得る。親和性タグをコードする外因性配列は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質に取り付けた親和性タグを含む融合タンパク質を含む内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームを産生するために導入され得る。
いくつかの実施形態において、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、同じまたは類似の産生細胞型から単離された天然ＥＶ、例えば、エクソソームよりも高い密度のＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）を有する。いくつかの実施形態において、該ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）は、該内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、天然ＥＶ＜、例えば、エクソソームよりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）は、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、天然ＥＶ、例えば、エクソソームよりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）を含む融合タンパク質は、該内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム上の未改変ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）よりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）の断片または変異体は、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム上の未改変ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）よりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。
特定の実施形態において、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳの断片もしくは変異体、またはそれらの改変は、該内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、該天然ＥＶ、例えば、エクソソーム上の未改変ＭＡＲＣＫＳよりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１の断片もしくは変異体、またはそれらの改変は、該内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、該天然ＥＶ、例えば、エクソソーム上の未改変ＭＡＲＣＫＳＬ１よりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＢＡＳＰ１、ＢＡＳＰ１の断片もしくは変異体、またはそれらの改変は、該内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム上に、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム上の未改変ＢＡＳＰ１よりも、２～４倍、４～８倍、８～１６倍、１６～３２倍、３２～６４倍、６４～１００倍、１００～２００倍、２００～４００倍、４００～８００倍、８００～１，０００倍またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、産生細胞は、追加の外因性配列を含むために、さらに改変される。例えば、追加の外因性配列は、内因性遺伝子発現を調節するか、またはペイロードとしてある特定のポリペプチドを含むエクソソームを産生するために含まれ得る。いくつかの実施形態において、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、１つは、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）、またはＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（足場タンパク質）の改変もしくは断片をコードし、他方は、ペイロードをコードする。
より具体的には、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、これらに限定されないが（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む１つ以上のエクソソーム内腔タンパク質（足場タンパク質）をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。本明細書に記載される１つ以上のＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）のいずれかは、プラスミド、ゲノムに挿入された外因性配列、または合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの他の外因性核酸から発現され得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＥＶ、例えば、エクソソーム内腔タンパク質（足場タンパク質）は、その完全長の内因性形態をコードする外因性配列で形質転換された細胞で発現される。いくつかの実施形態において、そのような外因性配列は、配列番号１のＭＡＲＣＫＳタンパク質、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列をコードする。ある特定の態様において、そのような外因性配列は、配列番号１のＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、そのような外因性配列は、配列番号１のＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードし、外因性配列によってコードされるＭＡＲＫＳタンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、そのような外因性配列は、配列番号２のＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列をコードする。ある特定の態様において、そのような外因性配列は、配列番号２のＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、そのような外因性配列は、配列番号２のＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質をコードし、外因性配列によってコードされるＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、そのような外因性配列は、配列番号３のＢＡＳＰ１タンパク質またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列をコードする。ある特定の態様において、そのような外因性配列は、配列番号３のＢＡＳＰ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、そのような外因性配列は、配列番号３のＢＡＳＰ１タンパク質をコードし、外因性配列によってコードされるＢＡＳＰ１タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。
内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、これらに限定されないが（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む１つ以上のＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の断片をコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された細胞から産生され得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、または３００個のアミノ酸を欠くＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）の断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、または３００個のアミノ酸を欠くＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）の断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、または３００個のアミノ酸を欠くＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）の断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠くＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）の断片をコードする。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４～１０９のペプチド、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４～１０９のペプチド、または本明細書に開示される任意の足場タンパク質配列（例えば、表１）を含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３のペプチドを含み、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１７）またはＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号４２５）を有するペプチドを含む足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み、Ｘはアラニンまたは任意の他のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列ＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号４２５）を有するペプチドを含む足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み、Ｘはアラニンまたは任意の他のアミノ酸であり、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列ＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号４２５）を有するペプチドを含む足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み、Ｘはアラニンまたは任意の他のアミノ酸であり、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号４２５）のアミノ酸配列を含む足場タンパク質を含み、Ｘは、アラニンまたは任意の他のアミノ酸であり、足場タンパク質は、例えば、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１７）を含むアミノ酸配列のＮ末端にＭｅｔを有しない。他の実施形態において、融合タンパク質は、ＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号４２５）のアミノ酸配列を含む足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み、融合タンパク質は、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫを含まない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）または（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含む足場タンパク質を含み、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質、（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）のアミノ酸配列を含み、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）を含まない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、（（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）または（（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含む足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は、（＋）ではなく、６位は、（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。他の実施形態において、融合タンパク質は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）のアミノ酸配列を含む足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質を含み、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）を含まない。
いくつかの実施形態において、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、足場タンパク質、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などのエクソソーム内腔タンパク質）または１つ以上の異種タンパク質に融合したその断片もしくは改変をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）またはその改変、特にその断片もしくは変異体のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）またはその改変、特にその断片もしくは変異体のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１などの足場タンパク質）またはその改変、特にその断片もしくは変異体のＮ末端及びＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、哺乳類タンパク質である。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
いくつかの実施形態において、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、これらに限定されないが、
（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、
（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質１（基質（ＭＡＲＣＫＳＬ１）及び
（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片と同一または類似の配列のポリペプチドをコードする配列で形質転換された細胞から産生される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約５０％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに５０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約５５％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約５５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約６０％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約６０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約６５％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約６５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約７０％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約７５％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約７５％同一である。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約８０％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約８５％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約８５％同一である。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約９０％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約９５％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約９９％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然ＥＶ、例えば、エクソソーム、内腔タンパク質（足場タンパク質）の全長または断片に少なくとも約９９．９％同一であり、例えば、配列番号１～３またはＮ末端Ｍを有しない対応する配列のいずれかに少なくとも約９９．９％同一である。
いくつかの実施形態において、細胞から産生される内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）の断片と同一または類似の配列のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約５０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約５０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約５５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約５０％同一である。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約６０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約６０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約６５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約６５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約７０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約７５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約７５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約８０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約８５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約８５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９９％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９９．９％同一であり、例えば、配列番号４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の断片に約１００％同一であり、例えば、４～１０９、Ｎ末端Ｍを有しない対応する配列、またはＮ末端Ｍを有しない本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に約１００％同一である。
いくつかの実施形態において、細胞から産生される内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）の断片に同一または類似の配列のポリペプチドを含み、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約５０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約５０％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約５５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約５０％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約６０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約６０％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約６５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約６５％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約７０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約７０％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約７５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約７５％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約８０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載される任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約８０％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約８５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約８５％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９０％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９０％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９５％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９５％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９９％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に少なくとも約９９％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片に少なくとも約９９．９％同一であり、例えば、配列番号４～１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列（例えば、表１）に少なくとも約９９．９％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の断片に約１００％同一であり、例えば、４－１０９または本明細書に記載の任意のＢＡＳＰ１配列、例えば、表１に約１００％同一であり、ポリペプチドは、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。
ＶＩ．作製方法
本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、より大きな分子の生化学的または酵素的断片化、前述の組み合わせ、または任意の他の方法によって産生され得る。一実施形態において、本開示は、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）にコンジュゲートする方法を提供する。方法は、生物学的に活性な分子を、上述のＥＶ（例えば、エクソソーム）に連結することを含む。
本開示のいくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、本開示のエクソソームは、上述の産生細胞を使用して製造され得る。したがって、本開示は、好適な条件下で本明細書に開示される産生細胞を培養し、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームを得ることを含む、ＥＶ、例えば、エクソソームの作製方法を提供する。
他の実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、組換え技術で産生され得、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームに組み込まれ得る。他の実施形態において、足場タンパク質のポリペプチド部分のみが、組換え技術で産生される。いくつかの実施形態において、組換え技術で産生された足場タンパク質のポリペプチド部分は、その後、膜アンカー（例えば、Ｎ末端ミリスチン酸）を組み込むために、例えば、化学的または酵素的に改変される。いくつかの実施形態において、半組換え技術で産生される足場タンパク質（すなわち、ポリペプチド部分の組換え産物を続く化学的または酵素的改変と組み合わせる）は、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームに組み込まれる。
他の実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、例えば、固相ペプチド合成を使用して化学的に産生され得、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームに組み込まれ得る。他の実施形態において、足場タンパク質のポリペプチド部分のみが合成的に産生される。いくつかの実施形態において、合成的に産生された足場タンパク質のポリペプチド部分は、その後、膜アンカー（例えば、Ｎ末端ミリスチン酸）を組み込むために、例えば、化学的または酵素的に改変される。いくつかの実施形態において、半合成的に産生される足場タンパク質（すなわち、ポリペプチド部分の合成産物を続く化学的または酵素的改変と組み合わせる）は、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム中に組み込まれる。
他の実施形態において、本開示の足場タンパク質、例えば、エクソソーム内腔タンパク質は、例えば、網膜細胞系などの無細胞発現を使用して、インビトロで産生され得、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームに組み込まれ得る。他の実施形態において、足場タンパク質のポリペプチド部分のみが、インビトロで、例えば、無細胞系で産生される。いくつかの実施形態において、インビトロで、例えば、無細胞系で産生された足場タンパク質のポリペプチド部分は、その後、膜アンカー（例えば、Ｎ末端ミリスチン酸）を組み込むために、例えば、化学的または酵素的に改変される。いくつかの実施形態において、半インビトロで産生される足場タンパク質（すなわち、ポリペプチド部分のインビトロ産物を続く化学的または酵素的改変と組み合わせる）は、その後、本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム中に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、それらの産生及び精製の間に各収集された画分に含まれるＥＶ、例えば、エクソソームを特徴付ける工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソームの内容物は、研究及び特徴付けのために抽出され得る。いくつかの実施形態において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、単離され、これらに限定されないが、サイズ、形状、形態、または核酸、タンパク質、代謝産物、及び脂質などの分子組成を含む測定基準によって特徴付けられる。
ＶＩＩ．医薬組成物及び投与方法
本開示は、対象への投与に適した、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物も提供する。医薬組成物は、概して、対象への投与に適した形態で、複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合でまたは非共有結合で連結した、少なくとも１つのペイロード、例えば、生物学的に活性な分子と、薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む、複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む。
薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的に、投与される特定の化合物、同様に組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）参照）。医薬組成物は、概して滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合で連結した小分子などの１つ以上の化学化合物を含む。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の治療薬または診断薬及び本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む。ある特定の実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、薬学的に許容される担体において、１つ以上の追加の治療薬または診断薬と共投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療薬または診断薬の投与の前に投与される。他の実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療薬または診断薬の投与後に投与される。さらなる実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療薬または診断薬と同時に投与される。
所望の純度を有する本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）と、対象への投与に適した形態の薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与される特定の化合物、同様に組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定され得る。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）参照）。医薬組成物は、概して滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の治療薬または診断薬及び本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む。ある特定の実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、薬学的に許容される担体中で、１つ以上の追加の治療薬または診断薬と共投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療薬または診断薬の投与の前に投与される。他の実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療薬または診断薬の投与後に投与される。さらなる実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療薬または診断薬と同時に投与される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエント（例えば、動物またはヒト）に対して無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、ヘキサメトニウム塩化物、ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
担体または希釈剤の例は、これらに限定されないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを含む。そのような媒体及び化合物の薬学的活性物質への使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または化合物が本明細書に記載の細胞外小胞と互換性がない場合を除き、その組成物中における使用が企図される。補充治療薬は、組成物中へと組み込まれることもできる。典型的には、医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮膚内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路、または吸入剤として投与され得る。ある特定の実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、任意で、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が意図された疾患、障害または状態を治療することに少なくとも部分的に有効である他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
溶液または懸濁液は、以下の成分、水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などキレート化合物、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整のための化合物を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数の用量バイアルに封入し得る。
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与については、好適な担体は、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は、概して滅菌され、容易に注射可能である程度の流体である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散液であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。所望の場合、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物に添加され得る。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、所望されるように、本明細書に列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する有効量で適切な溶媒に本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を組み込むことによって調製され得る。概して、分散液は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を、基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、前もって滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の持続的または拍動性放出を可能にするような様式で製剤化され得る、デポー注射またはインプラント調製物の形態で投与され得る。
本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む組成物の全身投与はまた、経粘膜手段によるものであり得る。経粘膜投与のために、バリアに浸透するのに適した浸透剤が、製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与用の、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレーの使用を通じて達成されることができる。
ある特定の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、医薬組成物の恩恵を受けるであろう対象へと静脈内投与される。特定の他の実施形態において、組成物は、例えば、リンパ内注射もしくはリンパ節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１０５（４６）：１７９０８（２００８）参照）、または筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射、胸腺もしくは肝臓への直接注射によってリンパ系に投与される。
ある特定の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、投与後にデポーを形成し得る製剤として投与される。ある特定の好ましい実施形態において、デポーは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を血液循環にゆっくり放出するか、またはデポー形態のままである。
典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成要素である場合、水は、汚染物質、例えば、エンドトキシンを含まないように高度に精製及び加工される。
薬学的に許容される担体は、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱物油であり得るが、これらに限定されない。薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤及び／または保存料をさらに含み得る。
本明細書に記載される医薬組成物は、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）と、任意選択で、薬学的活性剤または治療薬、及び／または診断薬と、を含む。治療薬は、生物学的薬、小分子薬、または核酸約であり得る。診断薬は、例えば、造影試薬であり得る。
本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物が、提供される。いくつかの実施形態において、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。いくつかの実施形態において、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
ある特定の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）の調製物は、残留複製能のある核酸を破壊するために、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線のような放射線照射に供する。
ある特定の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）の調製物は、１ｋＧｙ超、５ｋＧｙ超、１０ｋＧｙ超、１５ｋＧｙ超、２０ｋＧｙ超、２５ｋＧｙ超、３０ｋＧｙ超、３５ｋＧｙ超、４０ｋＧｙ超、５０ｋＧｙ超、６０ｋＧｙ超、７０ｋＧｙ超、８０ｋＧｙ超、９０ｋＧｙ超、１００ｋＧｙ超、または１００ｋＧｙ超の線量を使用するガンマ照射に供される。
ある特定の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）の調製物は、０．１超、０．５超、１超、５超、１０超、１５超、２０超、２５超、３０超、３５超、４０超、５０超、６０超、７０超、８０超、９０超、１００超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、２０００超、３０００超、４０００超、５０００超、６０００超、７０００超、８０００超、９０００超、１００００超または、の線量を使用するＸ線照射に供される。
本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、他の薬物と同時に使用され得る。具体的には、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ホルモン治療薬、化学療法剤、免疫療法剤、細胞成長因子または細胞成長因子受容体の作用を阻害する薬剤などの薬剤と共に使用され得る。
ＶＩＩＩ．治療用途
本開示は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または状態を治療する方法を提供する。本開示はまた、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または状態の症状を予防または改善する方法を提供する。本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または状態を診断する方法も提供される。療法に使用するための、薬剤として使用するための、それを必要とする対象における疾患もしくは状態の治療に使用するための、それを必要とする対象における疾患もしくは状態の症状を予防もしくは改善するための、またはそれを必要とする対象における疾患もしくは状態を診断するための、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）も提供される。
一実施形態において、疾患または障害は、がん、炎症性疾患、神経変性障害、中枢神経疾患、または代謝疾患である。
本開示はまた、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害の予防及び／または治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法で治療され得る疾患または障害は、がん、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、感染疾患、または線維性疾患を含む。いくつかの実施形態において、治療は、予防的である。他の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、免疫応答を誘導するために使用される。他の実施形態において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象にワクチン接種するために使用される。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、がんである。
いくつかの実施形態において、疾患または障害は、感染性疾患である。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、発がん性ウイルスである。いくつかの実施形態において、本開示で治療され得る感染症は、これらに限定されないが、ヒトガンマヘルペスウイルス４（エプスタインバーウイルス）、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、サイトメガロウイルス、黄色ブドウ球菌、結核マイコバクテリウム、クラミジアトラコマチス、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、コロナウイルス（例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳＣｏＶ）、フィロウイルス（例えば、マーブルグ及びエボラ）、連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、プラスモジア属（例えば、ビバクス及びファルシパルム）、チンガウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトヘルペスウイルス８、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、クレブシエラ属、緑膿菌、エンテロコッカス属、プロテウス属、エンテロバクター属、アクチノバクター属、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、マイコプラズマ属、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象の循環系に静脈内投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の静脈へと投与される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象の循環系に動脈内投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の動脈へと投与される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、髄腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶが脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象の１つ以上の腫瘍へと腫瘍内投与される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、局所投与または全身投与のいずれかの形態で、鼻を通して吸送され得る。ある特定の実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、鼻腔スプレーとして投与される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、腹腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の腹膜へと注射される。いくつかの実施形態において、腹腔内投与は、リンパ管へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布をもたらす。いくつかの実施形態において、該腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／または骨髄へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布を生じる。いくつかの実施形態において、腹腔内投与は、１つ以上のリンパ節へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布をもたらす。いくつかの実施形態において、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１つ以上へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布をもたらす。いくつかの実施形態において、腹腔内投与は、膵臓へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布をもたらす。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、眼周囲投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、眼周囲組織へと注射される。眼周囲薬物投与は、結膜下、前側テノン嚢下、後側テノン嚢下、及び球後投与の経路が含まれる。
ＩＸ．キット
本開示はまた、本開示の１つ以上のＥＶ（例えば、エクソソーム）及び任意で使用説明書を含むキットまたは製品を提供する。いくつかの実施形態において、キットまたは製造産物は、本開示の少なくとも１つのＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む本明細書に記載の薬学的組成物及び使用説明書を含む。
いくつかの実施形態において、キットまたは製造産物は、１つ以上の容器中に本開示の少なくとも１つのＥＶ（例えば、エクソソーム）またはＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物を含む。当業者は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物、またはそれらの組み合わせが、当該技術分野で周知の確立されたキット形式のうちの１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
いくつかの実施形態において、キットまたは製造産物は、（ｉ）ＥＶ（例えば、エクソソーム）、（ｉｉ）１つ以上のペイロード、例えば、生物学的に活性な分子、（ｉｉｉ）１つ以上のペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合で取り付けるための試薬、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ、及び１つ以上のペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合で取り付けるための反応を行うための説明書を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）にコンジュゲートするための試薬、及びコンジュゲーションを実施するための説明書を含む。
本開示の実施は、別途示されない限り、当該技術分野内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を採用する。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６））、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）ａｎｄ ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
































以下の実施例は、当業者に本開示を作成する及び使用する方法の完全なる開示ならびに説明を提供するように提案され、発明者がその開示と見なす範囲を限定することが意図されるものではなく、または、以下の実験が実行された全てもしくは唯一の実験であることを表すことが意図されるものではない。使用される数（例えば、量、温度など）に関しての正確性を確実にするために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差や偏差は説明されるべきである。
別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、または大気圧に近い。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）などが使用され得る。
本開示の実施は、別途示されない限り、当技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を採用する。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、ＡＬ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００５）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（ｌ９９２）を参照されたい。
実施例１
内腔エクソソームペイロードを担持するために十分な最小タンパク質配列の同定
上述のように、担持を容易にした１２個のアミノ酸切断及び、担持を容易にすることができなかった６個のアミノ酸切断の間の最小限のＢＡＳＰ１アミノ酸配列を同定するために、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合したＢＡＳＰ１のＮ末端の個々の切断変異体が生成され、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞内で安定して発現された（図１Ａ）。エクソソームを上述の安定細胞培養物から精製した。７～１２個のアミノ酸のＢＡＳＰ１配列は、エクソソーム中にＧＦＰを高密度で担持することができたが、最初の６個のアミノ酸は担持しなかった（図１Ｂ）。これらのデータは、位置６の後の少なくとも１つのリジン残基が、ＢＡＳＰ１のＮ末端を有するエクソソームの内腔担持、すなわち、エクソソームの内腔表面への取り付けのために必要であることを実証する。
ＢＡＳＰ１の６位のセリンは、種間ならびにＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１において高度に保存されている。このアミノ酸がエクソソームへのペイロード担持に必要であったかどうかを判断するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞は、ＢＡＳＰ１ １－３０－ＦＬＡＧ（登録商標）－ＧＦＰまたは点変異、セリン６をアスパラギン酸で（Ｓ６Ｄ；極性荷電置換）またはアラニン（Ｓ６Ａ；小さな非極性置換）で置換していることを含むＢＡＳＰ１ １－３０－ＦＬＡＧ（登録商標）－ＧＦＰをコードする発現プラスミドで安定にトランスフェクションされた。加えて、５位のリジンをグルタミン酸（Ｌ５Ｑ）に変異させて、いくつかの膜関連タンパク質のミリストイル化、パルミトイル化、及び他の膜機能の調節におけるこの位置の潜在的な役割を試験した（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ－Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｄｅｃ １；２７（２４）：３９２６－３９３６）（図２Ａ）。ＢＡＳＰ１ Ｓ６Ｄは、ＧＦＰのエクソソームへの担持を完全に廃止したが、Ｓ６Ａは担持を変更しなかった。ＢＡＳＰ１ Ｌ５Ｑも内腔担持に影響を与えず、６位の負の電荷が担持を中断する一方で、５位の極性アミノ酸置換が十分に許容されることを示した（図２Ｂ）。
ＢＡＳＰ１の最初の３０個のアミノ酸は、上で同定されたＮ末端リーダー配列を含み、続いて、アミノ酸のリジン豊富な伸長を含む。ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１Ｎ末端がＢＡＳＰ１と同様にエクソソームを担持し得るかどうかを理解するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞は、ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１全長タンパク質またはＦＬＡＧ（登録商標）－ＧＦＰに融合したアミノ酸１～３０で安定にトランスフェクションされた。精製されたエクソソームはＳＤＳページ及びＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）染色によって分析され、担持の程度を決定した。全長ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１は、エクソソームにＧＦＰを担持することができたが、アミノ酸１～３０は全長タンパク質よりも劣っており、担持に必要なＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質の末梢領域に追加の構造的または配列特徴が存在することを示唆している（図３）。ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１の配列分析は、ＢＡＳＰ１のＮ末端に対する潜在的な配列相同性を有する領域を明らかにした。
ＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１５２～１７３及びＭＡＲＣＫＳＬ１のアミノ酸８７～１１０は、散在したフェニルアラニン及びセリン残基を有するリジンリッチであり、リン酸化部位ドメイン（ＰＳＤ）またはエフェクタードメイン（ＥＤ）であると予測される（図４）。ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞は、ＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１～３をＰＳＤドメインに融合するプラスミド構築物（ＭＧ－ＰＳＤ）で安定にトランスフェクションされた。個々の点変異は、予測されるミリストイル化部位（ＭＡ－ＰＳＤ）及び６位（Ｋ６Ｓ及びＫ６Ａ）で生成され、エクソソームの担持におけるこれらの残基の役割を判断した（図５Ａ）。精製されたエクソソームのウエスタンブロットは、ＢＡＳＰ１ １－３０の陽性対照と比較して、ＭＧ－ＰＳＤもＭＡ－ＰＳＤもエクソソームを効率的に担持することができなかったことを実証した。興味深いことに、Ｋ６Ａ及びＫ６Ｓ変異は、担持の改善をもたらし、６位の正電荷がエクソソームペイロードの担持を防止し、ＭＡＲＣＫＳのＰＳＤが内因性Ｎ末端配列に対して機能的に相補的であり得ることを示唆している（図５Ｂ）。合わせて、これらの研究は、ペイロードをエクソソームに担持するのに十分ないくつかのモチーフの同定を可能にした（図６）。
最も狭いモチーフ、モチーフ１は、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）または第１のＭｅｔを有しない（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号２０２）のタンパク質配列を可能にし、各括弧文字または文字群はアミノ酸位置であり、さらに、５位は正荷電アミノ酸（Ｋ／Ｒ／Ｈ）ではなく、６位は負荷電アミノ酸（Ｄ／Ｅ）ではない。
モチーフ１のサブモチーフとしては、限定するものではないが、タンパク質配列：
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８０）
（Ｇ）（Ｇ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９１）
（Ｍ）（Ｇ）（Ａ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８１）
（Ｇ）（Ａ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９２）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８２）
（Ｇ）（Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９３）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８３）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９４）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８４）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９５）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８５）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９６）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｆ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８６）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｆ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９７）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｓ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８７）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｓ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９８）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８８）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９９）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１８９）
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号２００）
（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号１９０）及び
（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ａ）（Ｋ）（Ｋ） （配列番号２０１）
５位は正荷電アミノ酸（Ｋ／Ｒ／Ｈ）ではなく、６位は負荷電アミノ酸（Ｄ／Ｅ）ではない。
より広範なモチーフであるモチーフ２は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）または、第１のＭｅｔを有しない（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）として表現され得、各括弧位置はアミノ酸を表し、πは（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、位置５は（＋）ではなく、６は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。アミノ酸の命名法については、Ｒ．Ａａｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ５１３（２００２）：１４１－１４４を参照されたい。
最も広いモチーフであるモチーフ３は、第１のＭｅｔなしで（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）または第１のＭｅｔなしで（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）として表現され得、各括弧位置はアミノ酸を表し、πは（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Φは（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。モチーフ１～３の全ての場合において、配列は、１つのアミノ酸によって切断されて、７個の総アミノ酸長（すなわち、モチーフ１～３に示される順序でアミノ酸１～７からなる）とし得る。モチーフ１、２、または３のいずれかに由来する配列（またはアミノ酸７を欠くこれらのモチーフ）のいずれかは、ＢＡＳＰ１の全長ＢＡＳＰ１またはＢＡＳＰ１の天然切断配列と同じ程度または同等にペイロードをエクソソームに担持するために使用され得る。アミノ酸配列－構造－機能のこの深い分析は、産生細胞によって生物学的に発現されたペイロードをエクソソームに導くための要件についての新たな洞察を提供する。
実施例２
ＢＡＳＰ１のＮ末端は、多様なクラスのタンパク質を担持するのに十分である
実施例１における結果は、ＢＡＳＰ１のＮ末端が、産生細胞から直接内腔に担持されたエクソソームを生成するための足場を操作するのに有益であり得ることを示唆する。この仮説を試験するために、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～３０または１～１０に融合したコドン最適化を有する全長Ｃａｓ９タンパク質を発現するための安定したＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を生成した（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｖｏｌｚ ＳＥ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２に記載されている）。エクソソームは、上述の細胞培養物から精製され、抗Ｃａｓ９抗体（Ａｂｃａｍ；Ｃａｔａｌｏｇ＃ａｂ１９１４６８、クローン７Ａ９－３Ａ３）を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって分析された。図７Ａに示されるように、ＢＡＳＰ１ １－３０及び１－１０の両方は、エクソソームにおいてＣａｓ９を担持するのに十分であった。組換えＣａｓ９タンパク質を、ウエスタンブロットの陽性対照として使用した。ウエスタンブロット実験からの様々な量の組換えＣａｓ９及びＢＡＳＰ１－Ｃａｓ９エクソソームレーンの密度計量及び比較は、エクソソームがエクソソームあたり４～５個のＣａｓ９分子で担持されたことが明らかになった（図７Ｂ）。質量で約１６０ｋＤａであるこのＣａｓ９酵素は、上記に示されるＧＦＰ実験と比較して、ペイロードサイズの著しい増加を表す。
ＢＡＳＰ１のＮ末端への融合物として担持され得るペイロードタンパク質の多様性の追加の検証として、オボアルブミンが、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞内で、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０への融合物（「ＢＡＳＰ１（１～１０）－ＯＶＡ」）として安定に発現された。別個の細胞株は、同じプラスミド及び第２の選択マーカーを使用して、エクソソーム特異的表面糖タンパク質ＰＴＧＦＲＮに融合した３量体ＣＤ４０Ｌ（「３×ＣＤ４０Ｌ－ＰＴＧＦＲＮ」）をコードする第２のプラスミドで共トランスフェクションされた。エクソソームは、２つのトランスフェクションした細胞培養物から精製され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図８Ａ）及び抗オボアルブミンウエスタンブロット（Ａｂｃａｍ；カタログ番号ａｂ１７２９３、クローン６Ｃ８）によって分析された（図８Ｂ）。対照として、組換えオボアルブミン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；カタログ番号ｖａｃ－ｐｏｖａ）が別個のゲル中で滴定された。オボアルブミンは、単一構築物としてＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０に融合したとき、または追加の過剰発現プラスミド（３×ＣＤ４０Ｌ－ＰＴＧＦＲＮ）と組み合わせたときに、エクソソームに強力に担持された。この結果は、エクソソームが、内腔ペイロード及び別個の転写産物からの同時表面ペイロード（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の両方で組み合わせて操作され得ることを実証する。
治療的エクソソームの文脈において有用であり得る別のクラスのタンパク質は、抗体及び抗体断片である。ＧＦＰを標的とする一本鎖ラクダナノボディ（Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ Ｅ，Ｋａｎｃａ Ｏ，Ａｆｆｏｌｔｅｒ Ｍ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ－ＧＦＰ ｎａｎｏｂｏｄｙ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１Ｄｅｃ１１；１９（１）：１１７－２１に記載されている）は、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞において、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０及びＦＬＡＧ（登録商標）タグ（「ＢＡＳＰ１（１－１０）－ナノボディ」）またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ単独（「ナノボディ」）への融合タンパク質として安定に発現された（図９Ａ）。精製されたエクソソームは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロットによって分析され、ナノボディがＢＡＳＰ１のＮ末端に融合されたときに、等量の全担持タンパク質でナノボディの実質的な富化があったことを実証した（図９Ｂ）。これらの結果は、多様なクラスのタンパク質ペイロードが、ＢＡＳＰ１のＮ末端に由来する非常に短いタンパク質配列、すなわち足場を使用して、産生細胞によって発現され、エクソソームにパッケージ化され得ることを実証する。
実施例３
ＢＡＳＰ１のＮ末端は、エクソソームの内腔において核酸を担持するために使用され得る
核酸、及び特にＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）は、治療的エクソソームの内腔に担持される治療的ペイロードの魅力的なクラスである。ＲＮＡのエクソソーム担持は、細胞外環境中の分解からＲＮＡを保護し得、担持されたエクソソームは、さらなるレベルのエクソソーム操作、例えば、標的指向性構築物の表面発現を通じて、特定の細胞及び／または組織に向けられ得る。上記で同定されたＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質（またはタンパク質断片）が、ｍＲＮＡ担持エクソソームを生成するために使用され得るかどうかを理解するために、組み合わせ操作されたエクソソームが生成された。図１０に示されるように、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～３０は、ＦＬＡＧ（登録商標）及びファージタンパク質ＭＣＰの変異体への融合物として発現された。ＭＣＰは、ＭＳ２と呼ばれるｍＲＮＡステムループを認識して、結合し、ｍＲＮＡ及び他のＲＮＡへの転写融合物として発現され得、したがって、目的のＭＣＰ融合タンパク質及びＭＳ２融合ＲＮＡの間の物理的会合を促進する。変異分析は、ＭＣＰにおけるＭＳ２に対する親和性を増加させる２つの位置、すなわち、２９位でのイソロイシンのバリンへの置換（Ｖ２９Ｉ；Ｌｉｍ＆Ｐｅａｂｏｄｙ，ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｓｅｐ １１；２２（１８）：３７４８－５２）、及び５５位でのアスパラギンのリジンへの置換（Ｎ５５Ｋ、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９４Ｍａｒ２５；２６９（１２）：９００６－１０）を以前に特定した。ＢＡＳＰ１ １－３０は単量体または二量体ＭＣＰ変異体に融合され、各ＭＣＰはＶ２９Ｉまたは二重変異Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋのいずれかであった。ルシフェラーゼレポーター構築物は、別個のプラスミドからの３つのＭＳ２ステムループとの融合物として、発現された。ルシフェラーゼ－ＭＳ２単独（＃８１１）またはＢＡＳＰ１－ＭＣＰ変異体の各々と組み合わせ（＃８１５、８１７、８１９、または８２１）のいずれかの５つの安定したＨＥＫ２９３ＳＦ細胞株が生成された（図１０）。追加の対照として、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞はＦＬＡＧタグ付きＢＡＳＰ１ １－２７で安定にトランスフェクションされた。エクソソームは単離され、ベンゾナーゼ（登録商標）で処理され、任意の外部関連ｍＲＮＡを除去し、上記の方法に従って精製した。精製されたエクソソームはＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１１Ａ）及び抗ＦＬＡＧ（登録商標）ウエスタンブロット（図１１Ｂ）によって分析され、各エクソソーム調製物中の等量の総タンパク質及び同等レベルのＢＡＳＰ１－ＦＬＡＧ（登録商標）融合物を実証した。重要なことに、ＢＡＳＰ１－ＭＣＰ融合物は、ＭＣＰタンパク質を欠くＢＡＳＰ１ １－２７ＦＬＡＧ融合物として同等レベルに発現し、ＭＣＰモノマーまたは二量体の添加がエクソソームにおけるタンパク質のＢＡＳＰ１媒介担持を破壊しないことを実証した。
ＢＡＳＰ１－ＭＣＰ及びルシフェラーゼ－ＭＳ２ｍＲＮＡを安定して発現する細胞が単離され、総ルシフェラーゼｍＲＮＡはＲＴ－ｑＰＣＲ（ＦＷＤプライマー：５’－ＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧ－３’（配列番号１１９）、ＲＥＶプライマー：５’－ＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＴ－３’（配列番号１２０）、プローブ：５’－／５６－ＦＡＭ／ＣＡＧＣＴＴＴＣＣ／ＺＥＮ／ＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号１２１））によって定量化した。未トランスフェクション細胞は、ルシフェラーゼの同等レベルを発現した８１１発現細胞の全てよりも低いレベルのルシフェラーゼを発現した（図１２Ａ、上部）。安定した細胞株の各々からの精製されたエクソソームも、ＲＴ－ｑＰＣＲによって分析された。天然エクソソームは、検出可能なレベルのルシフェラーゼＭＳ２を有さず、一方、８１１単独を発現する細胞は、検出可能であるが、非常に低いレベルのルシフェラーゼＭＳ２を有した。重要なことに、ＢＡＳＰ１－ＭＣＰ融合タンパク質の各々は、より多くの量のルシフェラーゼ－ＭＳ２ｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡのエクソソームへの担持を容易にするためのＭＣＰ及びＭＳ２の間の結合の重要性を実証した（図１２Ａ、下部）。群間の相対ｍＲＮＡの定量化は、８１１単独に対して全てのＢＡＳＰ１－ＭＣＰ融合物について約３０～６０倍の富化を示した（図１２Ｂ）。二量体ＭＣＰ Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋを含んだＢＡＳＰ１－ＭＣＰ構築物８２１は、ＭＳ２ｍＲＮＡに対して最大の親和性を有すると予測され、実際には、この実験において最大量のルシフェラーゼ－ＭＳ２を含んだ。これらの結果は、ＢＡＳＰ１断片が、核酸を含む多様なペイロードをエクソソームの内腔に担持するための堅牢で多目的な足場タンパク質であることを実証する。
実施例４
ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、及びＭＡＲＣＫＳＬ１は、表面装飾エクソソームを生成するために使用され得る
以前の実験の結果は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１の全長及びＮ末端領域が、内腔担持エクソソームを生成するために使用され得ることを実証する。エクソソーム操作のためのこれらのタンパク質の可能性をさらに探索するために、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１及びＢＡＳＰ１のアミノ酸１～３０、またはＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０は、ホモトリマーとして発現するＣＤ４０Ｌの内因性膜貫通領域に融合された。リガンドが他の種の同族受容体と交差反応しないため、ＣＤ４０Ｌのヒト及びマウス配列の両方について構築物が調製された（図１３）。エクソソームは、ＣＤ４０Ｌ発現構築物の１つで安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から精製され、マウスまたはヒトＢ細胞のいずれかでインキュベートされた。エクソソーム上の入力ＣＤ４０Ｌの量は、ＣＤ４０Ｌ ＥＬＩＳＡ（ヒトＣＤ４０Ｌの測定について、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＣＤＬ４０、ロット番号Ｐ１６８２４８、及び、マウスＣＤ４０Ｌの測定について、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１１９５１７、ロット番号ＧＲ３２１８８５０－２が使用された）によって定量化され、Ｂ細胞はＢ細胞マーカーを使用して定量化され、ＣＤ１９、及びＢ細胞活性化は、ＣＤ６９に対して陽性のゲート細胞の割合によって測定された。種適合培養物中のマウス（図１４Ａ）またはヒト（図１４Ｂ）エクソソームＣＤ４０Ｌの用量滴定曲線は、粒子間ベース構築物間で（左のグラフ及び下の表）または互いに及びＣＤ４０Ｌモルベースで等量の組換えタンパク質と比較して、同等の活性を示した（右のグラフ及び下の表）。ＣＤ４０Ｌ構築物が同様にモノマーとして発現された場合、同等の活性が観察され、高密度エクソソーム表示足場であるＰＴＧＦＲＮのＮ末端に発現する３量体ＣＤ４０Ｌよりもわずかに強力ではなかった。（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８０２６号参照）（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１が、ヒト及び動物用途での使用のための様々なクラスの操作されたエクソソームの生成に有用な多様で堅牢な足場であることを実証する。
実施例５
多様な細胞型は、ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、及び／またはＭＡＲＣＫＳＬ１を発現する
異なる起源組織（ＨＥＫ２９３、腎臓、ＨＴ１０８０、結合組織、Ｋ５６２、骨髄、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、乳房、Ｒａｊｉ、リンパ芽細胞）由来の細胞株が、対数増殖期にまで増殖させ、化学的に定義された培地で増殖させたＨＥＫ２９３細胞を除き、約６日間エクソソーム欠失血清を補充した培地に移した。骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を３Ｄマイクロキャリア上で５日間増殖させ、無血清培地中で３日間補充させた。各細胞株培養物から上清が単離され、上記のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配超遠心分離方法を使用して、エクソソームが精製された。精製されたエクソソーム調製物の各々は、上記のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析され、ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、及びＭＡＲＣＫＳＬ１、ならびに広く研究された２つのＥＶ、例えば、エクソソームタンパク質（ＣＤ８１及びＣＤ９）についてペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の数が定量された。テトラスパニンＣＤ８１及びＣＤ９は、ほとんどの精製されたエクソソーム集団において検出可能であったが、場合によっては、内腔ＥＶ、例えば、エクソソーム、タンパク質（例えば、ＣＤ９をＢＡＳＰ１またはＭＡＲＣＫＳＬ１と比較する）と同等以下であった（図１５）。この発見は、新たに同定された内腔エクソソームマーカーが、異なる組織に由来するいくつかの無関係な細胞株から操作されたエクソソームを生成するための好適な融合タンパク質であり得ることを示す。
実施例６
ＢＡＳＰ１を過剰発現する非ヒト細胞は、内腔操作されたエクソソームを産生する
実施例５における結果は、多数のヒト由来細胞がＢＡＳＰ１及び他の新規ＥＶを自然に発現することを実証する。ＢＡＳＰ１がユニバーサルエクソソーム足場タンパク質として使用され得るかどうかを決定するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合した全長ＢＡＳＰ１を発現するプラスミド（「ＢＡＳＰ１－ＧＦＰ－ＦＬＡＧ」）、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合したＢＡＳＰ１のアミノ酸１～３０を発現するプラスミド（「ＢＡＳＰ１（１－３０）－ＧＦＰ－ＦＬＡＧ」）、またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ及びＧＦＰに融合したＢＡＳＰ１のアミノ酸１～８を発現するプラスミド（「ＢＡＳＰ１（１－８）－ＧＦＰ－ＦＬＡＧ」）のいずれかで安定にトランスフェクションされた。エクソソームは、野生型ＣＨＯ細胞から精製され、３つのＢＡＳＰ１プラスミドのうちの１つでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を精製した。図１６Ａ～図１６Ｂに示されるように、ＢＡＳＰ１及びＢＡＳＰ１断片融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞において過剰発現に成功し、無染色ＰＡＧＥ（図１６Ａ）及びＦＬＡＧ（登録商標）に対する抗体を用いたウエスタンブロットによって検出されるようにエクソソームに担持された（図１６Ｂ）。この結果は、ＣＨＯ細胞などの非ヒト細胞が、ヒトＢＡＳＰ１断片を過剰発現するエクソソームを産生することができ、この過剰発現が、高密度でエクソソームの内腔にペイロードタンパク質を駆動し得ることを実証する。この結果は、ＢＡＳＰ１が、多くの異なる細胞型及び種から操作されたエクソソームを生成するための普遍的足場タンパク質であることを示す。
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詳細説明セクションが、概要及び要約セクションではなく、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されることを理解されたい。概要及び要約セクションは、発明者（複数可）によって企図される本開示の全てではないが１つ以上の例示的な実施形態を記載し得、したがって、本開示及び添付の特許請求の範囲をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。
本開示は、特定の機能の実装及びその関係を例示する機能的構築ブロックを用いて上述されている。これらの機能的構築ブロックの境界は、説明の便宜のために本明細書で任意に定義されている。代替の境界は、特定の機能及びそれらの関係が適切に実行される限り、定義され得る。
参照による組み込み
本出願に引用された全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的のために参照により組み込まれることが個々に示されている場合と同様に、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
等価物
本開示は、とりわけ、ＥＶ、例えば、エクソソームにおける外因性タンパク質の富化に使用するための改変された外因性タンパク質及びペプチドを含むＥＶ、例えば、エクソソームの組成物を提供する。本開示はまた、富化されたＥＶ、例えば、エクソソームを産生する方法（ｍｅｔｈｏｄ）及び方法（ｍｅｔｈｏｄｓ）を提供する。様々な特定の実施形態が例示され、説明されているが、上記の仕様は、限定的ではない。本開示の幅及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。本開示（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されるであろう。本明細書を再検討すると、多くの変形形態が当業者に明らかになるであろう。
本出願は、２０１８年１１月１６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９号、及び２０１９年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／８３５，４３０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (22)

  1. 足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、
    前記足場タンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、
    前記ＮＤは前記ＥＶの内腔表面と会合し、前記ＥＤはイオン相互作用によって前記ＥＶの前記内腔表面と会合し、
    前記ＮＤは、ＧＧＫＬＳＫ（配列番号２０３）のアミノ酸配列を含むが、Ｎ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）を含まず、
    前記ＥＤは、前記ＮＤの配列番号２０３のＣ末端のリジンに直接連結したリジン（Ｌｙｓ）をそのＮ末端に含み、
    前記アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫは、前記足場タンパク質のＮ末端に位置し、
    前記生物学的に活性な分子は、前記足場タンパク質のＣ末端に融合した１つ以上の異種タンパク質を含む、
    前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
  2. 前記ＥＤが、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載のＥＶ。
  3. 前記ＮＤ及び前記ＥＤが、ペプチド結合によって直接連結される、請求項１または請求項２に記載のＥＶ。
  4. 前記足場タンパク質が、ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１５７）のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  5. 前記足場タンパク質が、ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６１）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＥＶ。
  6. 前記足場タンパク質が、少なくとも８アミノ酸長である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  7. 前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、Ｇｌｙ、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである、請求項１～６のいずれかに記載のＥＶ。
  8. 前記生物学的に活性な分子が、前記ＥＶの前記内腔表面上または内腔中にある、請求項１～７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  9. 前記足場タンパク質が、リンカーによって前記生物学的に活性な分子に連結される、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  10. 前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、請求項９に記載のＥＶ。
  11. 前記生物学的に活性な分子が、
    （ａ）タンパク質、
    （ｂ）ポリペプチド；
    （ｃ）ペプチド；
    （ｄ）ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）；
    （ｅ）化学化合物；
    （ｆ）ウイルス；
    （ｇ）イオノフォア；
    （ｈ）イオノフォア用担体；
    （ｉ）チャネルもしくは細孔を形成する部分；または
    （ｊ）それらの任意の組み合わせ
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＥＶ。
  12. 前記タンパク質が、
    （ｉ）組換えペプチド、天然ペプチド、合成ペプチド、抗体、融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせ
    （ｉｉ）酵素、サイトカイン、リガンド、受容体、転写因子、またはそれらの組み合わせ；
    （ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体；
    （ｉｖ）腫瘍抗原であって、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される腫瘍抗原；あるいは
    （ｉｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの組み合わせ
    を含む、請求項１１に記載のＥＶ。
  13. 前記生物学的に活性な分子が、
    （ａ）負のチェックポイント調節因子であり、ここで、前記負のチェックポイント調節因子は、
    （ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、
    （ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、
    （ｉｉｉ）リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、
    （ｉｖ）Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、
    （ｖ）Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、
    （ｖｉ）Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、
    （ｖｉｉ）Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、
    （ｖｉｉｉ）アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、
    （ｉｘ）キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、
    （ｘ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、
    （ｘｉ）ＣＤ２０、
    （ｘｉｉ）ＣＤ３９、および
    （ｘｉｉｉ）ＣＤ７３
    からなる群から選択される；
    （ｂ）免疫原性タンパク質である；
    （ｃ）毒素、トキソイド、または毒素の非毒性変異体であり、ここで、
    （ｉ）前記毒素はジフテリア毒素である、または
    （ｉｉ）前記トキソイドは破傷風トキソイドである；あるいは
    （ｄ）正の共刺激分子または前記正の共刺激分子の活性化剤であり、ここで、前記正の共刺激分子は、
    （ｉ）ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーであって、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択され、ここで、正の共刺激分子の前記活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２からなる群から選択される、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー；ならびに
    （ｉｉ）ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子であって、ＩＣＯＳ
    及びＣＤ２８から選択され、ここで、正の共刺激分子の前記活性化剤は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子からなる群から選択される、
    請求項１～１２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  14. 前記ＥＶがエクソソームである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＶ及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  16. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＶを産生する細胞であって、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｋ５６２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞からなる群から選択される、前記細胞。
  17. １つ以上のベクターを含む細胞であって、前記ベクターが、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＶにおける前記足場タンパク質及び前記生物学的に活性な分子をコードする核酸配列を含み、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｋ５６２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞からなる群から選択される、前記細胞。
  18. 前記核酸配列が、プロモーターに作用可能に結合している、請求項１７に記載の細胞。
  19. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＶを使用するためのキットであって、前記ＥＶ及び前記ＥＶを使用するための説明書を含む、キット。
  20. 好適な条件下で請求項１６～１８のいずれか一項に記載の細胞を培養し、前記ＥＶを得ることを含む、ＥＶの作製方法。
  21. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＶにおける前記生物学的に活性な分子を請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＶにおける前記足場タンパク質に連結することを含む、生物学的に活性な分子を細胞外小胞に固定する方法。
  22. 疾患の予防または治療を必要とする対象において前記疾患を予防または治療するための、請求項１～１４のいずれかに記載のＥＶを含む薬学的組成物。
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220323519A1 (en) * 2019-04-17 2022-10-13 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2021003445A1 (en) 2019-07-03 2021-01-07 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
AU2020328611A1 (en) * 2019-08-14 2022-03-03 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle-aso constructs targeting STAT6
WO2021030768A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles with stat3-antisense oligonucleotides
BR112022002690A2 (pt) 2019-08-14 2022-08-23 Codiak Biosciences Inc Construtos de vesícula-aso extracelular tendo como alvo cebp/beta
JP2022544290A (ja) 2019-08-14 2022-10-17 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｋｒａｓを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する細胞外小胞
WO2021062057A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Exogenous loading of exosomes via lyophilization
CN114727947A (zh) 2019-09-25 2022-07-08 科迪亚克生物科学公司 细胞外囊泡组合物
WO2021062058A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Sting agonist comprising exosomes for treating neuroimmunological disorders
WO2021062290A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Methods of producing extracellular vesicles
EP4034150A1 (en) 2019-09-25 2022-08-03 Codiak BioSciences, Inc. Sting agonist comprising exosomes combined with il-12 displaying exosomes for treating a tumour
CN115484990A (zh) 2020-03-12 2022-12-16 基础科学研究院 诱导具有基因组序列变异的细胞凋亡的组合物及使用组合物诱导细胞凋亡的方法
WO2021184020A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating neuroinflammation
US20230114434A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles for treating neurological disorders
WO2021184021A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting pmp22
JP2023518414A (ja) 2020-03-20 2023-05-01 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療のための細胞外小胞
WO2021248133A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Codiak Biosciences, Inc. Anti-transferrin extracellular vesicles
CN116209430A (zh) * 2020-08-07 2023-06-02 阿米库斯治疗学公司 囊泡靶向蛋白及其用途
WO2022066883A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles comprising kras antigens and uses thereof
US20240241020A1 (en) 2020-09-23 2024-07-18 Lonza Sales Ag Process for preparing extracellular vesicles
WO2022066934A2 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Process for preparing extracellular vesicles
GB202015399D0 (en) * 2020-09-29 2020-11-11 Evox Therapeutics Ltd Engineered extracellular vesicles displaying enhanced pharmacokinetics
WO2022076596A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting stat6
CN112410304A (zh) * 2020-11-12 2021-02-26 天津大学 一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用
CN112899307A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 苏州大学 GluN1和/或GluN2亚基羧基末端豆蔻酰化的NMDA受体的应用
US20240167036A1 (en) * 2021-02-17 2024-05-23 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle-nlrp3 antagonist
WO2022178147A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Codiak Biosciences, Inc. Methods of loading extracellular vesicles
WO2022212884A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle compositions
CN114057893B (zh) * 2021-04-26 2022-12-30 苏州大学 一种编码线粒体定位的豆蔻酰化多肽及其制备方法与应用
CN117126886A (zh) * 2022-05-20 2023-11-28 谛邈生物科技(北京)有限公司 一种实现工程化EVs功能蛋白模块化装载的核酸构建体及其应用
WO2023229366A1 (en) * 2022-05-24 2023-11-30 Shiftbio Co., Ltd. Surface-engineered extracellular vesicles and therapeutic uses thereof
WO2024226723A1 (en) * 2023-04-26 2024-10-31 Northwestern University Active loading of biomolecular cargo into engineered vesicles

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150190430A1 (en) 2008-02-22 2015-07-09 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Mesenchymal stem cell particles
WO2017117585A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 The Regents Of The University Of California Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
FR2950350B1 (fr) 2009-09-24 2013-12-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations
EP3164420A4 (en) * 2014-06-30 2018-05-23 Tarveda Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
WO2016138525A1 (en) * 2015-02-27 2016-09-01 University Of Washington Polypeptide assemblies and methods for the production thereof
US10617768B2 (en) * 2016-07-12 2020-04-14 Santa Clara University Engineered exosomes for the delivery of bioactive cargo using transmembrane tetraspanins
US20210290556A1 (en) * 2016-08-22 2021-09-23 Codiak Biosciences, Inc. Methods of suppressing delivery of exosomes to liver and spleen
WO2018112154A1 (en) * 2016-12-15 2018-06-21 Codiak Biosciences, Inc. Methods of measuring exosomes using intrinsic fluorescence
WO2019040920A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Codiak Biosciences, Inc. PREPARATION OF THERAPEUTIC EXOSOMES USING MEMBRANE PROTEINS
WO2019099942A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of engineered exosomes and methods of loading luminal exosomes payloads
EP3841112A1 (en) * 2018-08-24 2021-06-30 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150190430A1 (en) 2008-02-22 2015-07-09 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Mesenchymal stem cell particles
WO2017117585A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 The Regents Of The University Of California Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGY OF REPRODUCTION，2005年，Vol.72，p.1452-1465，DOI 10.1095/biolreprod.104.036426
PNAS，2009年04月07日，vol.106, no.14，p.5604-5609，www.pnas.org/cgi/do/10.1073/pnas.0812101106
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1999年，Vol.274, No.17，p.11848-11853

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