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BR112020018758A2 - agente de ácido ribonucleico de fita dupla, célula, vetor, composição farmacêutica, e, métodos para inibição da expressão de 17¿-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13, para tratamento de um indivíduo, para prevenção de um sintoma em um indivíduo, para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica, para inibição da progressão de esteatose, para inibição do acúmulo de gotículas de lipídios - Google Patents

agente de ácido ribonucleico de fita dupla, célula, vetor, composição farmacêutica, e, métodos para inibição da expressão de 17¿-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13, para tratamento de um indivíduo, para prevenção de um sintoma em um indivíduo, para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica, para inibição da progressão de esteatose, para inibição do acúmulo de gotículas de lipídios Download PDF

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BR112020018758A2
BR112020018758A2 BR112020018758-5A BR112020018758A BR112020018758A2 BR 112020018758 A2 BR112020018758 A2 BR 112020018758A2 BR 112020018758 A BR112020018758 A BR 112020018758A BR 112020018758 A2 BR112020018758 A2 BR 112020018758A2
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BR
Brazil
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nucleotides
dsrna
agent
double
antisense
Prior art date
Application number
BR112020018758-5A
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English (en)
Inventor
Gregory Hinkle
Aris Baras
Alan Shuldiner
Stuart Milstein
Frederic Tremblay
Noura S. Abul-Husn
Omri Gottesman
Alexander Li
Xiping Cheng
Yurong Xin
Jesper Gromada
Frederick E. Dewey
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE FITA DUPLA, CÉLULA, VETOR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE 17?-HIDROXIESTEROIDE DESIDROGENASES TIPO 13, PARA TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO, PARA PREVENÇÃO DE UM SINTOMA EM UM INDIVÍDUO, PARA REDUÇÃO DO RISCO DE DESENVOLVER DOENÇA HEPÁTICA CRÔNICA, PARA INIBIÇÃO DA PROGRESSÃO DE ESTEATOSE, PARA INIBIÇÃO DO ACÚMULO DE GOTÍCULAS DE LIPÍDIOS. A invenção refere-se a composições de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) direcionadas para o gene HSD17B13, bem como métodos para inibir a expressão de HSD17B13 e métodos para tratar indivíduos que se beneficiariam da redução na expressão de HSD17B13, tais como indivíduos portadores de uma doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13, usando tais composições de dsRNA.

Description

1 / 395 AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE FITA DUPLA, CÉLULA, VETOR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE 17Β-HIDROXIESTEROIDE DESIDROGENASES TIPO 13, PARA TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO, PARA PREVENÇÃO DE UM SINTOMA EM UM INDIVÍDUO, PARA REDUÇÃO DO RISCO DE DESENVOLVER DOENÇA HEPÁTICA CRÔNICA, PARA INIBIÇÃO DA PROGRESSÃO DE ESTEATOSE, PARA INIBIÇÃO DO ACÚMULO DE GOTÍCULAS DE
LIPÍDIOS Referência cruzada a pedidos de patente correlatos
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/645 941, depositado em 21 de março de 2018, ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/770 298, depositado em 21 de novembro de 2018 e ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/775 590, depositado em 05 de dezembro de 2018. O conteúdo de cada um dos pedidos de patente provisórios anteriores é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Listagem de sequências
[002] O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi submetida por via eletrônica, em formato ASCII, e é ora incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia em ASCII, criada em 12 de março de 2019, é denominada 121301-08420_SL.txt e possui
1.374.047 bytes de tamanho. Fundamentos da invenção
[003] 17β-hidroxiesteroide desidrogenase Tipo 13 (HSD17B13) faz parte da família de enzimas 17β-Hidroxiesteroide desidrogenase (HSD17B) cujos membros possuem várias funções, incluindo, por exemplo, redução ou oxidação de hormônios sexuais, ácidos graxos e ácidos biliares in vivo (Moeller e Adamski (2009) Mol Cell Endocrinol 301:7). Os membros da
2 / 395 família HSD17B diferem em distribuição tecidual, localização subcelular, preferência catalítica, e possuem especificidades diversas por substratos, pois também catalisam as conversões de outros substratos além de esteroides, como, por exemplo, lipídios e retinoides (Marchais-Oberwinkler, et al. (2011) J Steroid Biochem Mol Biol 125(1-2):66-82). HSD17B13 demonstrou intensificar a lipogênese hepática no fígado de camundongos normais e em hepatócitos humanos cultivados (Su, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111:11437).
[004] Os hepatócitos, que formam o tecido parenquimatoso do fígado, são responsáveis por mobilizar lipídios para geração de energia e o armazenamento dos lipídios em excesso na forma de gotículas de lipídios (LDs), tornando o fígado o órgão primário responsável pela homeostase lipídica.
[005] LDs são agora reconhecidas como organelas bioativas envolvidas no metabolismo dos lipídios, no tráfego da membrana e na transdução de sinais. LDs são em geral compostas por um núcleo de lipídios neutros (tais como triacilgliceróis (TGs) e ésteres de colesterol, cercado por uma monocamada de fosfolipídio/colesterol. Inúmeras proteínas LD- específicas associam-se com a membrana de LDs e têm como função, p. ex., controlar o fluxo de moléculas para dentro e para fora das LDs. As proteínas predominantes associadas a LD hepatocelulares fazem parte da família de proteínas perilipina, mas proteínas não perilipina, tais como proeína 2 induzível por hipóxia (HIG2), domínio de fosfolipase tipo patatina-3 (PNPLA3) e HSD17B13, também foram identificadas como proteínas associadas a LDs (Carr e Ahima (2016) Exp Cell Res 15:187; Su, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111:11437).
[006] O acúmulo aumentado de LDs está associado com muitas doenças metabólicas e doenças fibroinflamatórias crônicas do fígado, tais como fibrose hepática, esteato-hepatite não alcóolica (NASH) e doença
3 / 395 hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). HSD17B13 foi identificada como uma das proteínas mais abundantemente expressas na superfície de LD, localizada especificamente na superfície de LDs em humanos e camundongos com NAFLD. Foi demonstrado também que o nível de expressão de HSD17B13 é regulado positivamente nos fígado de pacientes e camundongos com NAFLD. A superexpressão de HSD17B13 resultou em um aumento no número e tamanho de LDs. A superexpressão hepática de HSD17B13 em camundongos C57BL/6 aumentou significativamente a lipogênese e o teor de TG nos fígados, levando a um fenótipo de fígado gorduroso.
[007] Não há atualmente tratamento para doenças hepáticas fibro- inflamatórias crônicas. O padrão atual de cuidados para indivíduos com uma doença hepática fibro-inflamatória crônica inclui modificação do estilo de vida e controle das comorbidades associadas, p. ex., hipertensão, hiperlipidemia, diabetes, obesidade, etc. Consequentemente, considerando que a prevalência de doenças hepáticas fibro-inflamatórias crônicas tem aumentado progressivamente nos últimos anos e que se prevê aumente, há necessidade na técnica de tratamentos alternativos para indivíduos portadores de uma doença hepática fibro-inflamatória crônica. Sumário da invenção
[008] A presente invenção provê composições de iRNA que efetuam a clivagem mediada pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene 17β-hidroxiesteroide desidrogenase Tipo 13 (HSD17B13). O gene HSD17B13 pode estar dentro de uma célula, p. ex., uma célula dentro de um indivíduo, tal como um humano. A presente invenção também provê métodos para utilização das composições de iRNA da invenção para inibir a expressão de um gene HSD17B13 e/ou para tratar um indivíduo que se beneficiaria de inibir ou reduzir a expressão de um gene HSD17B13, p. ex., um indivíduo que sofre ou é propenso a sofrer uma doença associada ao HSD17B13, por exemplo, uma doença hepática
4 / 395 fibro-inflamatória crônica.
[009] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção provê um agente ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:8 ou 9. Em algumas modalidades, o agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:8 ou 9.
[0010] Em outro aspecto, a presente invenção provê um agente ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a dita fita antisense compreende uma região de complementaridade com um mRNA que codifica HSD17B13 e que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13. Em algumas modalidades, o agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a dita fita antisense compreende uma região de complementaridade com um mRNA que codifica HSD17B13 e que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
5 / 395
[0011] Em uma modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer um dentre os nucleotídeos 213-242; 256- 287; 361-385; 447-480; 483-529; 489-529; 630-653; 688-711; 752-777; 753- 779; 772-806; 781-806; 791-851; 829-858; 870-896; 893-930; 900-930; 910- 932; 980-1092; 1101-1158; 1176-1210; 1320-1350; 1335-1373; 1456-1482; 1506-1535; 1558-1588; 1699-1740; 1725-1757; 2182-2210; 2190-2254; 2194-2216; 2240-2373; ou 2242-2264 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um dentre os nucleotídeos 213-242; 256- 287; 361-385; 447-480; 483-529; 489-529; 630-653; 688-711; 752-777; 753- 779; 772-806; 781-806; 791-851; 829-858; 870-896; 893-930; 900-930; 910- 932; 980-1092; 1101-1158; 1176-1210; 1320-1350; 1335-1373; 1456-1482; 1506-1535; 1558-1588; 1699-1740; 1725-1757; 2182-2210; 2190-2254; 2194-2216; 2240-2373; ou 2242-2264 de SEQ ID NO:1.
[0012] Em outra modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer um dentre os nucleotídeos 71-93, 101-123, 108-130, 109-131, 112-134, 123-145; 213-235; 220-242, 256-278;292-314, 293-315, 299-321, 301-323, 324-346, 349-371, 350-372, 351-373, 352-374; 353-375, 355-377, 356-378, 357-379, 361-383; 363-385, 365-387, 402-424, 422-444, 423-445, 427-449, 428-450, 431-453, 447-469, 489-511, 490-512, 507-529, 541-563, 547-569, 548-570, 585-607, 589-611, 592-614, 593-615, 620-642, 630-652, 631-653, 632-654, 649-671, 676-698, 688-710, 723-745, 728-750, 752-774, 753-775, 755-777, 757-779, 763-785, 764-786, 772-794, 778-800, 780-802, 781-803,791-813, 792-814, 794-816, 795-817, 807-829, 828-850, 829-851; 832-854; 836-858; 838-860; 839-861, 840-862, 832-861; 870-892; 874-896, 894-916; 895-917; 896-918; 897-919; 898-920; 899-921; 900-922; 901-923; 902-924; 906-928; 908-930; 894-930; 910-932; 965-
6 / 395
987;966-988981-1003; 1005-1027; 1006-1028; 1010-1032; 1005-1032;1052- 1074; 1097-1119;1101-1123; 1102-1124; 1103-1125; 1133-1155; 1135-1157; 1136-1158; 1097-1125;1133-1158; 1176-1198;1188-1210;1243-1265;1315- 13371320-1342; 1322-1344; 1325-1347; 1327-1349;1328-1350; 1320- 1507;1335-1357;1336-1358;1458-1480; 1459-1481; 1460-1482; 1458- 1482;1497-1519;1498-1520;1506-1528;1513-1535; 1565-1587;1566- 1588;1613-1635;1614-1636;1622-1644;1643-1665; 1699-1721; 1717-1739; 1718-1740; 1724-1746; 1725-1747; 1726-1748; 1727-1749; 1728-1750; 1717-1750; 1737-1759; 1768-1790; 2188-2210; 2190-2212; 2188-2212; 2194-2216; 2195-2217; 2250-2272; 2232-2254; 2240-2262; 2232-2262; 2242-2264; 2245-2267 2249-2271; 2232-2271; 2347-2369; 2351-2373; ou 2347-2373 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um dentre os nucleotídeos 71-93, 101-123, 108-130, 109-131, 112- 134, 123-145; 213-235; 220-242, 256-278;292-314, 293-315, 299-321, 301- 323, 324-346, 349-371, 350-372, 351-373, 352-374; 353-375, 355-377, 356- 378, 357-379, 361-383; 363-385, 365-387, 402-424, 422-444, 423-445, 427- 449, 428-450, 431-453, 447-469, 489-511, 490-512, 507-529, 541-563, 547- 569, 548-570, 585-607, 589-611, 592-614, 593-615, 620-642, 630-652, 631- 653, 632-654, 649-671, 676-698, 688-710, 723-745, 728-750, 752-774, 753- 775, 755-777, 757-779, 763-785, 764-786, 772-794, 778-800, 780-802, 781- 803,791-813, 792-814, 794-816, 795-817, 807-829, 828-850, 829-851; 832- 854; 836-858; 838-860; 839-861, 840-862, 832-861; 870-892; 874-896, 894- 916; 895-917; 896-918; 897-919; 898-920; 899-921; 900-922; 901-923; 902- 924; 906-928; 908-930; 894-930; 910-932; 965-987;966-988981-1003; 1005- 1027; 1006-1028; 1010-1032; 1005-1032;1052-1074; 1097-1119;1101-1123; 1102-1124; 1103-1125; 1133-1155; 1135-1157; 1136-1158; 1097-1125;1133- 1158; 1176-1198;1188-1210;1243-1265;1315-13371320-1342; 1322-1344; 1325-1347; 1327-1349;1328-1350; 1320-1507;1335-1357;1336-1358;1458-
7 / 395 1480; 1459-1481; 1460-1482; 1458-1482;1497-1519;1498-1520;1506- 1528;1513-1535; 1565-1587;1566-1588;1613-1635;1614-1636;1622- 1644;1643-1665; 1699-1721; 1717-1739; 1718-1740; 1724-1746; 1725-1747; 1726-1748; 1727-1749; 1728-1750; 1717-1750; 1737-1759; 1768-1790; 2188-2210; 2190-2212; 2188-2212; 2194-2216; 2195-2217; 2250-2272; 2232-2254; 2240-2262; 2232-2262; 2242-2264; 2245-2267 2249-2271; 2232- 2271; 2347-2369; 2351-2373; ou 2347-2373 de SEQ ID NO:1.
[0013] Em outra modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer um dentre os nucleotídeos 108-130; 109- 131; 108-131; 112-134; 293-315; 301-323; 293-323; 361-383; 402-424; 423- 445; 428-450; 423-450; 428-453; 431-453; 489-511; 490-512; 489-512; 649- 671; 753-775; 772-794;791-813; 792-814; 795-817; 791-817; 829-851; 832- 854; 836-858; 829-858; 870-892; 874-896; 870-896; 898-920; 900-922; 902- 924; 906-928; 908-930; 902-930; 910-932; 966-988;1328-1350; ou 2194- 2216; 2242-2264; ou 2249-2271 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um dentre os nucleotídeos 108-130; 109-131; 108-131; 112-134; 293-315; 301-323; 293-323; 361-383; 402-424; 423-445; 428-450; 423-450; 428-453; 431-453; 489-511; 490-512; 489-512; 649-671; 753-775; 772-794;791-813; 792-814; 795-817; 791-817; 829-851; 832-854; 836-858; 829-858; 870-892; 874-896; 870-896; 898-920; 900-922; 902-924; 906-928; 908-930; 902-930; 910-932; 966-988;1328-1350; ou 2194-2216; 2242-2264; ou 2249-2271 de SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 898-930 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 898-930 de SEQ ID NO:1.
8 / 395
[0014] Em uma modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 910-932 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 910-932 de SEQ ID NO:1.
[0015] Em uma modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 2194-2216 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 2194-2216 de SEQ ID NO:1.
[0016] Em uma modalidade, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 2242-2264 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 2242-2264 de SEQ ID NO:1.
[0017] Em uma modalidade, o agente dsRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
[0018] Em uma modalidade, substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação. Em outra modalidade, substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação. Em ainda outra modalidade, substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
[0019] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense formando uma
9 / 395 região de fita dupla, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:8 ou 9, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados e em que a fita sense é conjugada a um ligante anexado à terminação 3’. Em algumas modalidades, o agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:8 ou 9, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados e em que a fita sense é conjugada a um ligante anexado à terminação 3’.
[0020] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação. Em outra modalidade, todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação. Em ainda outra modalidade, todos os nucleotídeos da fita sense e todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
[0021] Em uma modalidade, pelo menos um dos ditos nucleotídeos modificados é selecionado a partir do grupo que consiste em um desoxi- nucleotídeo, um nucleotídeo desoxi-timina (dT) no terminal 3’, um nucleotídeo 2’-O-metila modificado, um nucleotídeo 2’-flúor modificado, um nucleotídeo 2’-desoxi modificado, um nucleotídeo bloqueado (locked), um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo de conformação restringida, um nucleotídeo com etila restrito, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo 2’- amino modificado, um nucleotídeo 2’-O-alila modificado, um nucleotídeo 2’-
10 / 395 C-alquila modificado, um nucleotídeo 2’-hidroxila modificado, um nucleotídeo 2’-metoxietila modificado, um nucleotídeo 2’-O-alquila modificado, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, um nucleotídeo compreendendo base não natural, um nucleotídeo modificado com tetrahidropirano, um nucleotídeo modificado com 1,5-anidrohexitol, um nucleotídeo modificado com ciclohexenila, um nucleotídeo compreendendo um grupo fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo compreendendo um 5’-fosfato, um nucleotídeo compreendendo um mimético 5’-fosfato, um nucleotídeo modificado com glicol, um nucleotídeo modificado com 2-O-(N- metilacetamida) e combinações dos mesmos.
[0022] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações 2’-O-metila e/ou 2’-fluoro.
[0023] A região de complementaridade pode ter pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento; 19 a 30 nucleotídeos de comprimento; 19-25 nucleotídeos de comprimento; ou 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.
[0024] Cada fita não pode ter mais que 30 nucleotídeos de comprimento, p. ex., cada fita tem independentemente 19-30 nucleotídeos de comprimento; cada fita tem independentemente 19-25 nucleotídeos de comprimento; cada fita tem independentemente 21-23 nucleotídeos de comprimento.
[0025] O dsRNA pode incluir pelo menos uma fita que compreende uma saliência 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo; ou pelo menos uma fita que compreende uma saliência 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
[0026] Em alguma modalidade, o agente dsRNA compreende ainda um ligante.
[0027] Em uma modalidade, o ligante é conjugado à extremidade 3’ da fita sense do agente dsRNA.
[0028] Em uma modalidade, o ligante é um derivado de N-
11 / 395 acetilgalactosamina (GalNAc).
[0029] Em uma modalidade, o ligante é:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN
O HO OH O O H H
HO O N N O AcHN
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O .
[0030] Em uma modalidade, o agente dsRNA é conjugado ao ligante como mostrado no desenho esquemático seguinte: 3'
O O P X OH O N HO OH O H H O
HO O N N O AcHN O
HO OH O O H H H O N N O N
HO AcHN O O O O
HO OH O
HO O N N O AcHN H H
O e, em que X é O ou S.
[0031] Em uma modalidade, o X é O.
[0032] Em uma modalidade, a região de complementaridade compreende qualquer uma das sequências antisense em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
[0033] Em um aspecto, a presente invenção provê uma fita dupla para inibir a expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento,
12 / 395 em que o dito agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q, e q’ são cada um independentemente 0-6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; np, np’, nq, e nq’, os quais podem, cada um, estar presentes ou não, representam, cada um, independentemente um nucleotídeo saliente; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante.
[0034] Em uma modalidade, i é 0; j é 0; i é 1; j é 1; i e j são ambos 0; ou i e j são ambos 1. Em outra modalidade, k é 0; l é 0; k é 1; l é 1; k e l são ambos 0; ou k e l são ambos 1.
[0035] Em uma modalidade, XXX é complementar a X’X’X’, YYY é complementar a Y’Y’Y’ e ZZZ é complementar a Z’Z’Z’.
[0036] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre perto ou no sítio
13 / 395 de clivagem da fita sense, p. ex., o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12 e 13 da fita antisense a partir da extremidade 5’.
[0037] Em uma modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIa): sense: 5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-na’-nq’ 5’ (IIIa).
[0038] Em outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIb): sense: 5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-na’-nq’ 5’ (IIIb) em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados.
[0039] Em ainda outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIc): sense: 5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-na’-nq’ 5’ (IIIc) em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados.
[0040] Em outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIId): sense: 5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-X’X’X’- Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’ 5’ (IIId) em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados e cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-10 nucleotídeos modificados.
[0041] A região de complementaridade pode ter pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento; 19 a 30 nucleotídeos de comprimento;19-25
14 / 395 nucleotídeos de comprimento; ou 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.
[0042] Cada fita não pode ter mais do que 30 nucleotídeos de comprimento, p. ex., cada fita tem independentemente 19-30 nucleotídeos de comprimento.
[0043] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos são selecionadas a partir do grupo que consiste em LNA, HNA, CeNA, 2’- metoxietila, 2’-O-alquila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’-fluoro, 2’-O-metila, 2’- desoxi, 2’-hidroxila e combinações dos mesmos.
[0044] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro.
[0045] Em uma modalidade, o Y’ é um nucleotídeo modificado com 2’-O-metila ou 2’-fluoro.
[0046] Em uma modalidade, pelo menos uma fita do agente dsRNA pode compreender uma saliência (overhang) 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo; ou uma saliência 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
[0047] Em uma modalidade, o agente dsRNA compreende ainda pelo menos uma ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos.
[0048] Em uma modalidade, a ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos é na terminação 3’ de uma fita. Em uma modalidade, a fita é a fita antisense. Em outra modalidade, a fita é a fita sense.
[0049] Em uma modalidade, a ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos é na terminação 5’ de uma fita. Em uma modalidade, a fita é a fita antisense. Em outra modalidade, a fita é a fita sense.
[0050] Em uma modalidade, a fita é a fita antisense. Em outra modalidade, a fita é a fita sense.
[0051] Em uma modalidade, a ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos é na terminação 5’ e na 3’ de uma fita.
[0052] Em uma modalidade, o par de bases na posição 1 da extremidade 5’ da fita antisense do duplex é um par de bases AU.
15 / 395
[0053] Em uma modalidade, p’>0. Em outra modalidade, p’=2.
[0054] Em uma modalidade, q’=0, p=0, q=0 e p’ nucleotídeos salientes são complementares ao mRNA alvo. Em outra modalidade, q’=0, p=0, q=0 e p’ nucleotídeos salientes são não complementares ao mRNA alvo.
[0055] Em uma modalidade, a fita sense tem, no total, 21 nucleotídeos e a fita antisense tem, no total, 23 nucleotídeos.
[0056] Em uma modalidade, pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato. Em outra modalidade, em que todos os np’ são ligados a nucleotídeos vizinhos por ligações fosforotioato.
[0057] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos da fita sense e todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
[0058] Em uma modalidade, o ligante é conjugado à extremidade 3’ da fita sense do agente dsRNA.
[0059] Em uma modalidade, o ligante é um ou mais derivados de N- acetilgalactosamina (GalNAc) anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
[0060] Em uma modalidade, o ligante é:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN
O HO OH O O H H
HO O N N O AcHN
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O .
[0061] Em uma modalidade, o agente dsRNA é conjugado ao ligante como mostrado no desenho esquemático seguinte:
16 / 395 3'
O O P X OH O N HO OH O H H O
HO O N N O AcHN O
HO OH O O H H H O N N O N
HO AcHN O O O O
HO OH O
HO O N N O AcHN H H
O e em que X é O ou S.
[0062] Em uma modalidade, o X é O.
[0063] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q e q’ são cada um independentemente 0-6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência
17 / 395 oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; cada np, np’, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações on Nb’ diferem da modificação em Y’; em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante.
[0064] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q e q’ são cada um independentemente 0-6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato;
18 / 395 cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante.
[0065] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes,
19 / 395 representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q e q’ são cada um independentemente 0-6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
[0066] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III):
20 / 395 sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q, e q’ são cada um independentemente 0-6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; em que a fita sense compreende pelo menos uma ligação fosforotioato; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
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[0067] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-YYY-na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’ (IIIa) em que: cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q, e q’ são cada um independentemente 0-6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; YYY e Y’Y’Y’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila e/ou 2’-fluoro; em que a fita sense compreende pelo menos uma ligação fosforotioato; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
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[0068] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais do que 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 ou 2, e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais do que 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8 ou 9, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a fita sense compreende duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a fita antisense compreende duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 5’ e duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 3’, e em que a fita sense é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente na terminação 3’. Em algumas modalidades, o agente dsRNA inclui uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos odef SEQ ID NO:8 ou 9, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a fita sense compreende duas ligações fosforotioato entre
23 / 395 nucleotídeos na terminação 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a fita antisense compreende duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 5’ e duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 3’, e em que a fita sense é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente na terminação 3’.
[0069] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos da fita sense e todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados.
[0070] Em uma modalidade, a região de complementaridade compreende qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13. Em uma modalidade, o agente é selecionado a partir do grupo que consiste em AD-288917, AD-288996, AD- 413639, AD-413644, e AD-413669. Em uma modalidade, o agente RNAi é AD-288917. Em outra modalidade, o agente é AD-288996. Em outra modalidade, o agente é AD-413639. Em uma modalidade, o agente é AD-
413644. Em outra modalidade, o agente é AD-413669
[0071] Em uma modalidade, a fita sense e a fita antisense compreendem sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos de qualquer um dos agentes listados em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
[0072] A presente invenção também provê células, vetores e composições farmacêuticas que incluem qualquer um dos agentes dsRNA da invenção. Os agentes dsRNAs podem ser formulados em uma solução não tamponada, p. ex., solução salina ou água, ou em uma solução tamponada, p. ex., uma solução compreendendo acetato, citrato, prolamina, carbonato, fosfato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a solução tamponada é solução salina com tampão fosfato (PBS).
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[0073] Em um aspecto, a presente invenção provê um método para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula. O método inclui colocar a célula em contato com um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção, inibindo, assim, a expressão de HSD17B13 na célula.
[0074] A célula pode estar dentro de um indivíduo, tal como um humano.
[0075] Em uma modalidade, a expressão de HSD17B13 é inibida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou até abaixo do nível de detecção da expressão de HSD17B13.
[0076] Em uma modalidade, o humano sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13. Em uma modalidade, a doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13 é uma doença hepática fibro-inflamatória crônica. Em uma modalidade, a doença hepática fibro-inflamatória crônica é selecionada a partir do grupo que consiste em inflamação do fígado, fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco e necrose hepatocelular.
[0077] Em um aspecto, a presente invenção provê um método para inibição da expressão de HSD17B13 em um indivíduo. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção, inibindo, assim, a expressão de HSD17B13 no indivíduo.
[0078] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição
25 / 395 farmacêutica da invenção, tratando, assim, o indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13.
[0079] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de um gene HSD17B13. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção, prevenindo, assim, pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de um gene HSD17B13.
[0080] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica em um indivíduo portador de esteatose. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção, reduzindo, assim, o risco de desenvolver doença hepática crônica no indivíduo portador de esteatose.
[0081] Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê um método para inibição da progressão de esteatose para esteato-hepatite em um indivíduo que sofre de esteatose. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção, inibindo, assim, a progressão de esteatose para esteato-hepatite no indivíduo.
[0082] Em um aspecto, a presente invenção provê um método para inibição do acúmulo de gotículas de lipídios no fígado de um indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção e de um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente direcionado para um gene PNPLA3,
26 / 395 inibindo, assim, o acúmulo de gordura no fígado do indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13.
[0083] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção e de um agente direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente direcionado para um gene PNPLA3, tratando, assim, o indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13.
[0084] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de um gene HSD17B13. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção e de um agente direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente direcionado para um gene PNPLA3, prevenindo, assim, pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de um gene HSD17B13.
[0085] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica em um indivíduo portador de esteatose. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção e de um agente direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente direcionado para um gene PNPLA3, reduzindo, assim, o risco de desenvolver doença hepática crônica no indivíduo portador de esteatose.
[0086] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para
27 / 395 inibição da progressão de esteatose para esteato-hepatite em um indivíduo que sofre de esteatose. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção e de um agente direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente direcionado para um gene PNPLA3, inibindo, assim, da progressão de esteatose para esteato- hepatite no indivíduo.
[0087] Em uma modalidade, a administração do agente dsRNA ou da composição farmacêutica ao indivíduo provoca uma diminuição na atividade enzimática de HSD17B13, uma diminuição no acúmulo de proteína HSD17B13, uma diminuição na atividade enzimática de PNPLA3, uma diminuição no acúmulo de proteína PNPLA3 e/ou uma diminuição no acúmulo de gordura e/ou expansão de gotículas de lipídios no fígado de um indivíduo.
[0088] Em uma modalidade, a doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13 é uma doença hepática fibro-inflamatória crônica.
[0089] Em uma modalidade, a doença hepática fibro-inflamatória crônica é selecionada a partir do grupo que consiste em acúmulo de gordura no fígado, inflamação do fígado, fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco e necrose hepatocelular.
[0090] Em uma modalidade, a doença hepática fibro-inflamatória crônica é esteato-hepatite não alcoólica (NASH).
[0091] Em uma modalidade, o indivíduo é obeso.
[0092] Em uma modalidade, os métodos e usos da invenção incluem ainda administrar um agente terapêutico adicional ao indivíduo.
[0093] Em uma modalidade, o agente dsRNA é administrado ao
28 / 395 indivíduo a uma dose entre aproximadamente 0,01 mg/kg e 10 mg/kg ou entre aproximadamente 0,5 mg/kg e 50 mg/kg.
[0094] O agente pode ser administrado ao indivíduo por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em uma modalidade, o agente é administrado ao indivíduo por via subcutânea.
[0095] Em uma modalidade, os métodos e uses da invenção incluem ainda determinar o nível de HSD17B13 no indivíduo.
[0096] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β- hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, em que o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer um dos agentes em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, e a fita antisense compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer um dos agentes em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, em que substancialmente todos os nucleotídeo da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados e em que o agente dsRNA é conjugado a um ligante. Breve descrição dos desenhos
[0097] A Figura 1 mostra que HSD17B13 rs72613567:TA está associado com risco reduzido de fenótipos de doença hepática alcoólica. Especificamente, a Figura 1 mostra que HSD17B13 rs72613567:TA foi associado com chances menores de várias doenças hepáticas crônicas de maneira dependente da dose do alelo. Especificamente, foram observados efeitos dependentes da dose do alelo para doenças hepáticas tanto alcoólicas como não alcoólicas, cirrose e carcinoma hepatocelular. As razões de chance foram calculadas por regressão logística, com ajuste para idade, sexo, IMC e etnia auto-relatada.
[0098] A Figura 2A é um gráfico apresentando o efeito de uma dose
29 / 395 única de AD-288917 em camundongos com expressão de HSD17B13 humana.
[0099] A Figura 2B é um gráfico apresentando o efeito de uma dose única de AD-288917 em macacos Cynomolgus. Descrição detalhada da invenção
[00100] A presente invenção provê composições de iRNA, que efetuam a clivagem mediada por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene HSD17B13. O gene HSD17B13 pode estar dentro de uma célula, p. ex., uma célula dentro de um indivíduo, tal como um humano. A presente invenção também provê métodos de utilização das composições de iRNA da invenção para inibição da expressão de um gene HSD17B13, e para tratamento de um indivíduo que se beneficiaria de inibir ou reduzir a expressão de um gene HSD17B13, p. ex., um indivíduo que se beneficiaria de uma redução na inflamação do fígado, p. ex., um indivíduo que sofre ou é propenso a sofrer de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13, tal como um indivíduo sofrendo ou propenso a sofrer de fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose do fígado, cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco e necrose hepatocelular.
[00101] Os iRNAs da invenção direcionados para HSD17B13 podem incluir uma fita de RNA (a fita antisense) tendo uma região com aproximadamente 30 nucleotídeos ou menos de comprimento, p. ex., 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ou 21-22
30 / 395 nucleotídeos de comprimento, cuja região é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito do mRNA de um gene HSD17B13.
[00102] Em algumas modalidades, uma ou ambas as fitas dos agentes RNAi de fita dupla da invenção têm até 66 nucleotídeos de comprimento, p. ex., 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleotídeos de comprimento, com uma região de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um transcrito do mRNA de um gene HSD17B13. Em algumas modalidades, tais agentes iRNA com fitas antisense de comprimento mais longo incluem uma segunda fita de RNA fita (a fita sense) com 20-60 nucleotídeos de comprimento, em que a fita sense e a antisense formam um duplex de 18-30 nucleotídeos contíguos.
[00103] O uso dos agentes iRNA aqui descritos possibilita a degradação direcionada de mRNAs de um gene HSD17B13 em mamíferos.
[00104] Doses muito baixas dos iRNAs, em particular, podem mediar especificamente e com eficiência a interferência por RNA (RNAi), resultando em inibição significante da expressão de um gene HSD17B13. Assim, métodos e composições incluindo esses iRNAs são úteis para tratar um indivíduo que se beneficiaria de inibir ou reduzir a expressão de um gene HSD17B13, p. ex., um indivíduo que se beneficiaria de uma redução de inflamação do fígado, p. ex., um indivíduo sofrendo ou propenso a sofrer de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13, tal como um indivíduo sofrendo ou propenso a sofrer de fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose do fígado, cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco e necrose hepatocelular.
[00105] A descrição detalhada a seguir expõe o modo como preparar e usar as composições contendo iRNAs para inibir a expressão de um gene HSD17B13, bem como composições e métodos para tratar indivíduos com
31 / 395 doenças e transtornos que se beneficiariam da inibição e/ou redução da expressão desse gene. I. Definições
[00106] Para que a presente invenção possa ser entendida mais prontamente, certos termos são inicialmente definidos. Além disso, deve-se ressaltar que sempre que um valor ou faixa de valores de um parâmetro são mencionados, a intenção é que valores e faixas intermediárias dos valores mencionados façam também parte dessa invenção.
[00107] Os artigos “um” e “uma”, neste relatório descritivo, referem-se a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento, p. ex., uma pluralidade de elementos.
[00108] O termo “incluindo”, neste relatório descritivo, significa e é usado alternadamente com a expressão “incluindo, entre outros”.
[00109] O termo “ou”, neste relatório descritivo, significa e é usado alternadamente com o termo “e/ou” a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[00110] O termo “aproximadamente”, neste relatório descritivo, significa dentro das faixas típicas de tolerâncias na técnica. Por exemplo, “aproximadamente” pode ser entendido como aproximadamente 2 desvios padrão da média. Em certas modalidades, aproximadamente significa +10%. Em certas modalidades, aproximadamente significa +5%. Quando aproximadamente está presente antes de uma série de números ou uma faixa, entende-se que “aproximadamente” pode modificar cada um dos números na séria ou faixa.
[00111] O termo “HSD17B13”, também conhecido como “hidroxiesteroide 17-beta desidrogenase 13”, “membro 16C da família desidrogenase/redutase de cadeia curta”, “short-chain desidrogenase/redutase 9 de cadeia curta”, “17-beta-HSD 13”, “17β-HSD13”, “SDR16C3”,
32 / 395 “SCDR9”, “Membro 3, família 16C de desidrogenase/redutase de cadeia curta”, “hidroxiesteroide (17-beta) desidrogenase 13”, “17-beta- hidroxiesteroide desidrogenase 13”, “17-beta hidroxiesteroide desidrogenase”, “HMFN0376” e “NIIL497”, refere-se ao gene bem conhecido codificador de uma proteína 17β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 13 de qualquer fonte de vertebrados ou mamíferos, incluindo, entre outros, humano, bovino, galinha, roedor, camundongo, rato, suíno, ovino, primata, macaco e cobaia, a menos que especificado de outra forma.
[00112] O termo também se refere a fragmentos e variantes de HSD17B13 nativo que mantenham pelo menos uma atividade in vivo ou in vitro de um HSD17B13 nativo. O termo abrange formas precursoras completes não processadas de HSD17B13, bem como formas maduras resultantes da clivagem pós-traducional do peptídeo sinal e formas resultantes do processamento proteolítico.
[00113] Duas variantes do gene HSD17B13 humano foram identificados anteriormente, a variante A (ou Transcrito A) e a variante B (ou Transcrito B). O Transcript A inclui todos os sete exons do gene HSD17B13, enquanto o exon 2 é omitido no Transcrito B. A sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma variante A do HSD17B13 humano podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: NM_178135.4; SEQ ID NO:1); e a sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma variante B do HSD17B13 humano podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: NM_001136230.2; SEQ ID NO:2. Como descrito no Pedido de Patente U.S. No: 15/875,514, depositado em 19 de janeiro de 2018, e Pedido de Patente PCT No: PCT/US2018/014357, depositado em 19 de janeiro de 2018 (cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência), seis transcritos adicionais de HSD17B13 que são expressos (C-H, SEQ ID NOS: 17, 18, 19, 20, 21 e 22, respectivamente) foram identificados. No Transcrito C, o exon 6 é omitido
33 / 395 quando comparado ao Transcrito A. No Transcrito D, há inserção de uma guanina 3’ do exon 6, resultando em um truncamento frameshift (na fase de leitura) e prematuro do exon 7 quando comparado ao Transcrito A. No Transcrito E, há um exon adicional entre os exons 3 e 4 quando comparado ao Transcrito A. No Transcrito F, que é expresso somente em portadores da variante HSD17B13 rs72613567, há uma transleitura (read-through) do exon 6 para intron 6 quando comparado ao Transcrito A. No Transcrito G, o exon 2 é omitido, e há inserção de uma guanina 3’ do exon 6, resultando em um truncamento frameshift e prematuro do exon 7 quando comparado ao Transcrito A. No Transcrito H, há um exon adicional entre os exons 3 e 4, e há inserção de uma guanina 3’ do exon 6, resultando em um truncamento frameshift e prematuro do exon 7 quando comparado ao Transcrito A.
[00114] Um transcrito adicional HSD17B13 que é expresso em níveis baixos (F’, SEQ ID NO: 23) foi também identificado. Do mesmo modo que o Transcrito F, o Transcrito F’ também inclui uma transleitura do exon 6 para intron 6 quando comparado ao Transcrito A, mas, ao contrário do Transcrito F, a transleitura não inclui a timina inserida presente no gene variante HSD17B13 rs72613567. As posições de nucleotídeos dos exons dentro dos genes HSD17B13 para cada Transcrito são fornecidas abaixo.
[00115] SEQ ID NO:15 é a sequência nucleotídica da Sequência Genômica do HSD17B13 do Tipo Selvagem (Human Genome Assembly GRCh38) e SEQ ID NO: 16 é a sequência nucleotídica da Variante da Sequência Genômica de HSD17B13 (Human Genome Assembly GRCh38; rs72613567- inserção de T em chr4: 87310241-87310240): Inserção de T na posição 12666.
[00116] Posições de nucleotídeos na SEQ ID NO: 15 para Exons dos transcritos mais prevalentes de HSD17B13 em indivíduos homozigotos para o gene HSD17B13 do tipo selvagem Transcrito A Transcrito B Transcrito E Transcrito F’ Exon 1 1-275 1-275 1-275 1-275
34 / 395 Exon 2 4471-4578 omitido 4471-4578 4471-4578 Exon 3 5684-5815 5684-5815 5684-5815 5684-5815 Exon 3’ não presente não presente 6210-6281 não presente Exon 4 7308-7414 7308-7414 7308-7414 7308-7414 Exon 5 8947-9084 8947-9084 8947-9084 8947-9084 Exon 6 12548-12664 12548-12664 12548-12664 12548-13501* Exon 7 17599-19118 17599-19118 17599-19118 omitido *Inclui transleitura do exon 6 para intron 6; transleitura = posições 12665-13501
[00117] Posições de nucleotídeos na SEQ ID NO: 16 para Exons dos transcritos mais prevalentes de HSD17B13 em indivíduos homozigotos para o gene variante rs72613567 HSD17B13 (Inserção de T na posição 12666). Transcrito C Transcrito D Transcrito F Transcrito G Transcrito H Exon 1 1-275 1-275 1-275 1-275 1-275 Exon 2 4471-4578 4471-4578 4471-4578 omitido 4471-4578 Exon 3 5684-5815 5684-5815 5684-5815 5684-5815 5684-5815 Exon 3’ não presente não presente não presente não presente 6210-6281 Exon 4 7308-7414 7308-7414 7308-7414 7308-7414 7308-7414 Exon 5 8947-9084 8947-9084 8947-9084 8947-9084 8947-9084 Exon 6 omitido 12548-12665^ 12548-13502* 12548-12665^ 12548-12665^ Exon 7 17600-19119 17600-19119 omitido 17600-19119 17600-19119 ^Inclui o resíduo adicional 12665 na extremidade 3’ quando comparado ao Transcrito A *Inclui transleitura do exon 6 para intron 6; transleitura = posições 12665-13502
[00118] Existem duas variantes do gene HSD17B13 de camundongo; a sequência de nucleotídeos e de aminoácidos de um Hsd17b13 de camundongo, variante do transcrito 1 podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: NM_001163486.1; SEQ ID NO:3); e a sequência de nucleotídeos e de aminoácidos de um Hsd17b13 de camundongo, variante do transcrito 2 podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: NM_198030.2; SEQ ID NO:4. A sequência de nucleotídeos e de aminoácidos de um gene Hsd17b13 de rato podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: NM_001009684.1; SEQ ID NO:5). A sequência de nucleotídeos e de aminoácidos de um gene HSD17B13 de Macaca mulatta podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: XM_015138766.1; SEQ ID NO:6). A sequência de nucleotídeos e de aminoácidos de um gene HSD17B13 de Macaca fascicularis podem ser encontradas em, por exemplo, Sequência de Referência do GenBank: XM_005555367.2; SEQ ID NO:7). Exemplos adicionais de sequências do mRNA de HSD17B13 estão facilmente
35 / 395 disponíveis em bancos de dados disponíveis publicamente, p. ex., GenBank, UniProt e OMIM.
[00119] O termo “HSD17B13”, neste relatório descritivo, também se refere a um polipeptídeo em particular expresso em uma célula por variações que ocorrem naturalmente na sequência de DNA do gene HSD17B13, tais como um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene HSD17B13. Inúmeros SNPs dentro do gene HSD17B13 foram identificados e podem ser encontrados em, por exemplo, NCBI dbSNP (ver, p. ex., www.ncbi.nlm.nih.gov/snp).
[00120] Neste relatório descritivo, “sequência alvo” refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene HSD17B13, incluindo o mRNA que é produzido pelo processamento do RNA de um produto primário da transcrição. Em uma modalidade, a porção alvo da sequência será no mínimo suficientemente longa para servir como substrato para a clivagem direcionada pelo iRNA perto ou naquela porção da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene HSD17B13.
[00121] A sequência alvo de um gene HSD17B13 pode ter aproximadamente 9-36 nucleotídeos de comprimento, p. ex., aproximadamente 15-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sequência alvo pode ter aproximadamente 15-30 nucleotídeos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento. Intervalos e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos mencionados acima são também contemplados como parte da invenção.
36 / 395
[00122] Neste relatório descritivo, o termo “fita compreendendo uma sequência” refere-se a um oligonucleotídeo que compreende uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura padrão de nucleotídeos.
[00123] “G”, “C”, “A”, “T” e “U” representam em geral um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como base, respectivamente. No entanto, será entendido que o termo “ribonucleotídeo” ou “nucleotídeo” pode também se referir a um nucleotídeo modificado, como descrito mais detalhadamente adiante, ou uma porção alternativa substituta (ver, p. ex., Tabela 1). O técnico no assunto está bem ciente de que guanina, citosina, adenina e uracila podem ser substituídas por outras porções sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento das bases de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo carregando tal porção de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode emparelhar a base com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Consequentemente, nucleotídeos contendo uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos do dsRNA apresentado na invenção por um nucleotídeo que contenha, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, adenina e citosina em qualquer lugar no oligonucleotídeo podem ser substituídos por guanina e uracila, respectivamente, para formar um emparelhamento de base Wobble G-U com o mRNA alvo. Sequências que contêm tais porções de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.
[00124] Os termos “iRNA”, “agente RNAi”, “agente iRNA”, “agente RNA de interferência”, como usados alternadamente neste relatório descritivo, referem-se a um agente que contém RNA como esse termo é definido no presente, e atua como mediador na clivagem direcionada de um transcrito de RNA pela via do complexo de silenciamento induzido por RNA
37 / 395 (RISC). O iRNA direciona a degradação específica da sequência do mRNA através de um processo conhecido como interferência por RNA (RNAi). O iRNA modula, p. ex., inibe, a expressão do gene HSD17B13 em uma célula, p. ex., uma célula dentro de um indivíduo, tal como um mamífero.
[00125] Em uma modalidade, um agente RNAi da invenção inclui um RNA de fita simples que interage com uma sequência de RNA alvo, p. ex., uma sequência de mRNA alvo de HSD17B13, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem a intenção de vincular-se à teoria, acredita-se que o RNA longo de fita dupla introduzido em células é quebrado em siRNA por um tipo de endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs interferentes curtos com 19-23 pares de base com duas saliências características de bases 3’ (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), em que uma ou mais helicases desenrolam o complexo siRNA, possibilitando que a fita antisense complementar oriente o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Quando da ligação ao mRNA alvo adequado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Assim, em um aspecto, a invenção refere-se a um RNA de fita simples (sssiRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo RISC para efetuar o silenciamento do gene alvo, ou seja, um gene HSD17B13. Consequentemente, o termo “siRNA” é também usado no presente para referir-se a um RNAi como descrito acima.
[00126] Em outra modalidade, o agente RNAi pode ser um agente RNAi de fita simples que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um mRNA alvo. Agentes de RNAi de fita simples (ssRNAi) ligam-se à endonuclease do RISC, Argonauta 2, a qual então cliva o mRNA alvo. Os siRNAs de fita simples têm geralmente 15-30 nucleotídeos e são modificados
38 / 395 quimicamente. O desenho e testes de agentes de RNAi de fita simples são descritos na Patente U.S. No 8 101 348 e em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Qualquer uma das sequências antisense de nucleotídeos aqui descritas pode ser utilizada como um siRNA de fita simples aqui descrito ou como quimicamente modificada pelos métodos descritos em Lima et al., (2012) Cell 150;:883-894.
[00127] Em outra modalidade, um “iRNA” para uso nas composições e métodos da invenção é um RNA de fita dupla e é aqui referido como “agente RNAi de fita dupla”, “molécula de RNA de fita dupla (dsRNA)”, “agente dsRNA” ou “dsRNA”. O termo “dsRNA” refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura duplex que compreende duas fitas antiparalelas e substancialmente complementares de ácido nucleico, referidas como tendo orientações “sense” e “antisense” em relação a um RNA alvo, ou seja, um gene HSD17B13. Em algumas modalidades da invenção, um RNA de fita dupla (dsRNA) desencadeia a degradação de um RNA alvo, p. ex., um mRNA, através de um mecanismo de silenciamento gênico pós- transcricional, aqui referido como interferência por RNA ou RNAi.
[00128] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada fita de uma molécula de dsRNA são ribonucleotídeos, mas, como descrito abaixo detalhadamente, cada uma ou ambas as fitas podem também incluir um ou mais não ribonucleotídeos, p. ex., um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Além disso, neste relatório descritivo, um “agente RNAi” pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente RNAi pode incluir modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos. Neste relatório descritivo, o termo “nucleotídeo modificado” refere-se a um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificado, um ligação modificada entre nucleotídeos e/ou uma nucleobase modificada. Assim, o termo nucleotídeo modificado abrange substituições, adições ou
39 / 395 remoção de, p. ex., um grupo funcional ou átomo, a ligações entre nucleosídeos, porções de açúcar ou nucleobases. As modificações adequadas para uso nos agentes da invenção incluem todos os tipos de modificações aqui descritas ou conhecidas na técnica. Qualquer uma de tais modificações, como usadas em uma molécula do tipo siRNA, é abrangida por “agente RNAi” para fins deste relatório descritivo e das reivindicações.
[00129] A região duplex pode ter qualquer comprimento que permita a degradação específica de um RNA alvo desejado através de uma via RISC, e pode variar entre aproximadamente 9 e 36 pares de bases de comprimento, p. ex., aproximadamente15-30 pares de bases de comprimento, por exemplo, aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 pares de bases de comprimento, tal como aproximadamente 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 pares de bases de comprimento. Intervalos e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos mencionados acima são também contemplados como parte da invenção.
[00130] As duas fitas que forma a estrutura duplex podem ser porções diferentes de uma molécula maior de RNA, ou podem ser moléculas separadas de RNA. Quando as duas fitas fazem parte de uma molécula maior e, portanto, estão conectadas por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da respectiva outra fita que forma a estrutura duplex, a cadeia de conexão do RNA é referida como uma “alça hairpin (tipo grampo de cabelo)”. Uma alça hairpin pode compreender pelo menos um nucleotídeo não emparelhado. Em algumas modalidades, a alça hairpin pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3,
40 / 395 pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 23 ou mais nucleotídeos não emparelhados.
[00131] Quando as duas fitas substancialmente complementares de um dsRNA são compostas por moléculas separadas de RNA, essas moléculas não precisam, mas podem ser conectadas covalentemente. Quando as duas fitas são conectadas covalentemente por outros meios que não uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da respectiva outra fita que forma a estrutura duplex, a estrutura conectora é referida como um “linker”. As fitas de RNA podem ter o mesmo ou um número diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotídeos na fita mais curta do dsRNA menos quaisquer saliências que estejam presentes no duplex. Além da estrutura duplex, um RNAi pode compreender uma ou mais saliências de nucleotídeos.
[00132] Em uma modalidade, um agente RNAi da invenção é um dsRNA, cujas fitas compreendem menos de 30 nucleotídeos, p. ex., 17-27, 19-27, 17-25, 19-25 ou 19-23, que interage com uma sequência alvo de RNA, p. ex., uma sequência de mRNA alvo de HSD17B13, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Em outra modalidade, um agente RNAi da invenção é um dsRNA, cujas fitas compreendem 19-23 nucleotídeos, que interage com uma sequência alvo de RNA, p. ex., uma sequência de mRNA alvo de HSD17B13, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Em uma modalidade, a fita sense tem 21 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a fita antisense tem 23 nucleotídeos de comprimento.
[00133] Neste relatório descritivo, o termo “saliência de nucleotídeo” refere-se a pelo menos um nucleotídeo não emparelhado que se salienta da estrutura duplex de um iRNA, p. ex., um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3’ de uma fita de um dsRNA estende-se para além da extremidade 5’ da outra fita, ou vice-versa, há uma saliência de nucleotídeo.
41 / 395 Um dsRNA pode compreender uma saliência de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente, a saliência pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma saliência de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) saliência(s) pode(m) ser na fita sense, na fita antisense ou qualquer combinação das mesmas. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma saliência pode(m) estar presente(s) na extremidade 5’, extremidade 3’ ou em ambas as extremidades de uma fita antisense ou sense de um dsRNA.
[00134] Em uma modalidade, a fita antisense de um dsRNA tem uma saliência de 1-10 nucleotídeos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em uma modalidade, a fita sense de um dsRNA tem uma saliência de 1-10 nucleotídeos, p. ex., a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na saliência são substituídos por um nucleosídeo tiofosfato.
[00135] Em certas modalidades, a saliência na fita sense ou na fita antisense, ou em ambas, pode incluir comprimentos estendidos mais longos do que 10 nucleotídeos, p. ex., 10-30 nucleotídeos, 10-25 nucleotídeos, 10-20 nucleotídeos ou 10-15 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, há uma saliência estendida na fita sense do duplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 3’ da fita sense do duplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 5’ da fita sense do duplex. Em certas modalidades, há uma saliência estendida na fita antisense do duplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 3’ da fita antisense do duplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 5’ da fita antisense do duplex. Em certas modalidades, um ou
42 / 395 mais dos nucleotídeos na saliência estendida são substituídos por um nucleosídeo tiofosfato.
[00136] Os termos “cega (blunt)” ou “extremidade cega”, usado neste relatório descritivo em referência a um dsRNA, significa que não há nucleotídeos não emparelhados ou análogos de nucleotídeos em uma data extremidade terminal de um dsRNA, ou seja, sem saliência de nucleotídeo. Uma ou ambas as extremidades de um dsRNA podem ser cegas. Quando ambas as extremidades de um dsRNA são cegas, diz-se que o dsRNA tem extremidades cegas. Para esclarecer, um dsRNA com “extremidades cegas” é um dsRNA que é cego em ambas as extremidades, ou seja, não tem saliência de nucleotídeo em qualquer extremidade da molécula. Mais frequentemente, tal molécula será fita dupla ao longo de todo o seu comprimento.
[00137] O termo “fita antisense” ou “fita guia” refere-se à fita de um iRNA, p. ex., um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência alvo, p. ex., um mRNA de HSD17B13.
[00138] Neste relatório descritivo, o termo “região de complementaridade” refere-se à região na fita antisense que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo, p. ex., uma sequência nucleotídica de HSD17B13, como aqui definida. Quando a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência alvo, os erros de pareamento (mismatches) podem ser nas regiões internas ou terminais da molécula. Em geral, os erros de pareamento mais tolerados são nas regiões terminais, p. ex., dentro de 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos da terminação 5’ e/ou 3’ do iRNA.
[00139] O termo “fita sense” ou “fita passageira”, neste relatório descritivo, refere-se à fita de um iRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antisense como esse termo é aqui definido.
[00140] Neste relatório descritivo, o termo “região de clivagem”
43 / 395 refere-se a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. O sítio de clivagem é o sítio no alvo no qual ocorre a clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende três bases em cada extremidade e imediatamente adjacentes ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende duas bases em cada extremidade e imediatamente adjacentes ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no sítio ligado pelos nucleotídeos 10 e 11 da fita antisense, e a região de clivagem compreende os nucleotídeos 11, 12 e 13.
[00141] Neste relatório descritivo, e a menos que indicado de outra forma, o termo “complementar”, quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos em relação a uma segunda sequência de nucleotídeos, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende a primeira sequência de nucleotídeos para hibridizar e formar uma estrutura duplex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende a segunda sequência de nucleotídeos, como será entendido pelo técnico no assunto. Tais condições podem ser, por exemplo, condições rigorosas, em que as condições rigorosas podem incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50 ºC ou 70 ºC por 12-16 horas, seguido por lavagem (ver, p. ex., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outras condições, tais como condições fisiologicamente relevantes, como podem ser encontradas no interior de um organismo, podem se aplicar. O técnico no assunto será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridizados.
[00142] Sequências complementares dentro de um iRNA, p. ex., dentro de um dsRNA como aqui descrito, incluem o emparelhamento de bases do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende uma primeira sequência
44 / 395 de nucleotídeos com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende uma segunda sequência de nucleotídeos ao longo de todo o comprimento de uma ou de ambas as sequências de nucleotídeos. Tais sequências podem ser referidas como “totalmente complementares” em relação uma à outra. No entanto, quando uma primeira sequência é referida como “substancialmente complementar” em relação a uma segunda sequência, as duas sequências podem ser totalmente complementares ou podem formar um ou mais, mas geralmente não mais do que 5, 4, 3 ou 2 erros de pareamento de bases quando da hibridização para um duplex de até 30 pares de bases, enquanto retendo a capacidade para hibridizar sob as condições mais relevantes para a sua aplicação final, p. ex., inibição da expressão gênica por uma via RISC. No entanto, quando dois oligonucleotídeos são desenhados para formar, quando da hibridização, uma ou mais saliências de fita simples, tais saliências não serão consideradas erros de pareamento com respeito à determinação de complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo com 21 nucleotídeos de comprimento e outro oligonucleotídeo com 23 nucleotídeos de comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode ainda ser referida como “totalmente complementar” para as finalidades aqui descritas.
[00143] Sequências “complementares”, neste relatório descritivo, podem também incluir, ou ser formadas inteiramente por pares de bases não de Watson-Crick e/ou pares de bases formados por nucleotídeos não naturais e modificados, desde que os requisitos acima em relação à sua capacidade para hibridizar sejam cumpridos. Tais pares de bases não de Watson-Crick incluem, entre outros, emparelhamento de bases G:U Wobble ou Hoogstein.
[00144] Os termos “complementar”, “totalmente complementar” e “substancialmente complementar”, neste relatório descritivo, podem ser
45 / 395 usados com respeito à combinação correta de bases entre a fita sense e a fita antisense de um dsRNA, ou entre a fita antisense de um agente iRNA e uma sequência alvo, como será entendido a partir do contexto do uso delas.
[00145] Neste relatório descritivo, um polinucleotídeo que é “substancialmente complementar a pelo menos parte de” um RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (p. ex., um mRNA que codifica HSD17B13). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de HSD17B13 se a sequência for substancialmente complementar a uma porção não interrompida de um mRNA que codifica HSD17B13.
[00146] Consequentemente, em algumas modalidades, os polinucleotídeos da fita antisense aqui descrita são totalmente complementares à sequência alvo de HSD17B13. Em outras modalidades, os polinucleotídeos da fita antisense aqui descrita são substancialmente complementares à sequência alvo de HSD17B13 e compreendem uma sequência de nucleotídeos contíguos que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1, ou um fragmento de SEQ ID NO:1, tal como aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente % 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% ou aproximadamente 99% complementar.
[00147] Em uma modalidade, um agente RNAi da invenção inclui uma fita sense que é substancialmente complementar a um polinucleotídeo antisense que, por sua vez, é complementar a uma sequência alvo de HSD17B13, e em que o polinucleotídeo da fita sense compreende uma
46 / 395 sequência de nucleotídeos contíguos que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de todo seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8, ou qualquer fragmento da SEQ ID NO:8, tal como aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente % 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% ou aproximadamente 99% complementar.
[00148] Em algumas modalidades, um iRNA da invenção inclui uma fita antisense que é substancialmente complementar à sequência alvo de HSD17B13 e compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de todo seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos de qualquer uma das fitas sense em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, ou um fragmento de qualquer uma das fitas sense em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, tal como aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar ou 100% complementar.
[00149] O termo “inibir”, neste relatório descritivo, é usado alternadamente com “reduzir”, “silenciar”, “regular negativamente”, “suprimir” e outros termos semelhantes, e inclui qualquer nível de inibição.
[00150] A expressão “inibição da expressão de um gene HSD17B13”, neste relatório descritivo, inclui a inibição da expressão de qualquer gene HSD17B13 (tal como, p. ex., gene HSD17B13 de camundongo, gene HSD17B13 de rato, gene HSD17B13 de macaco ou gene HSD17B13 humano) bem como variantes ou mutantes de um gene HSD17B13 que codifique uma proteína HSD17B13.
[00151] A “inibição da expressão de um gene HSD17B13” inclui
47 / 395 qualquer nível de inibição de um gene HSD17B13, p. ex., pelo menos supressão parcial da expressão de um gene HSD17B13, tal como inibição em pelo menos aproximadamente 20%. Em certas modalidades, a inibição é em pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%,pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99%.
[00152] A expressão de um gene HSD17B13 pode ser avaliada tendo como base o nível de qualquer variável associada com a expressão do gene HSD17B13, p. ex., nível do mRNA de HSD17B13 ou nível da proteína HSD17B13. A expressão de um gene HSD17B13 pode também ser avaliada indiretamente tendo como base, por exemplo, os níveis de alanina aminotransferase (ALT) circulantes, ou a atividade enzimática de HSD17B13 em uma amostra de tecido, como uma amostra de fígado. A inibição pode ser avaliada por uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais dessas variáveis em comparação a um nível controle. O nível controle pode ser qualquer tipo de nível controle que seja utilizado na técnica, p. ex., um nível basal pré-dose ou um nível determinado de um indivíduo, célula ou amostra semelhante que não seja tratado ou tratado com um controle (tal como, p. ex., controle apenas com tampão ou controle por agente inativo).
[00153] Em uma modalidade, a supressão pelo menos parcial da
48 / 395 expressão de um gene HSD17B13 é avaliada por uma redução da quantidade de mRNA de HSD17B13, o qual pode ser isolado ou detectado em uma primeira célula ou grupo de células nas quais um gene HSD17B13 é transcrito e que foi ou foram tratadas de tal modo que a expressão de um gene HSD17B13 é inibida, em comparação a uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idênticos à primeira célula ou grupo de células, mas que não foi ou foram assim tratados (células controle).
[00154] O grau de inibição pode ser expresso em termos de: (mRNA em células controle) – (mRNA em células tratadas) • 100% (mRNA em células controle)
[00155] A expressão “colocar uma célula em contato com um agente RNAi”, tal como um dsRNA, neste relatório descritivo, inclui colocar uma célula em contato por qualquer meio possível. O contato de uma célula com um agente RNAi inclui o contato de uma célula in vitro com o iRNA ou o contato de uma célula in vivo com o iRNA. O contato pode ser realizado direta ou indiretamente. Assim, por exemplo, o agente RNAi pode ser colocado em contato físico com a célula pelo indivíduo que realiza o método ou, alternativamente, o agente RNAi pode ser colocado em uma situação que permitirá ou fará com que subsequentemente este entre em contato com a célula.
[00156] O contato de uma célula in vitro pode ser realizado, por exemplo, incubando a célula com o agente RNAi. O contato de uma célula in vivo pode ser realizado, por exemplo, injetando o agente RNAi em ou perto do tecido onde a célula está localizada, ou injetando o agente RNAi em outra área, p. ex., a corrente sanguínea ou o espaço subcutâneo, tal que o agente venha a atingir subsequentemente o tecido onde a célula a ser contatada está localizada. Por exemplo, o agente RNAi pode conter e/ou ser anexado a um ligante, p. ex., GalNAc3, que direciona o agente RNAi para um sítio de interesse, p. ex., o fígado. Combinações de métodos in vitro e in vivo para o
49 / 395 contato são também possíveis. Por exemplo, uma célula pode também ser colocada em contato in vitro com um agente RNAi e subsequentemente ser transplantada em um indivíduo.
[00157] Em uma modalidade, o contato de uma célula com um iRNA inclui “introduzir” ou “entregar o iRNA na célula” facilitando ou efetuando a captação ou absorção na célula. A absorção ou captação de um iRNA pode ocorrer através de processos celulares difusivos sem auxílio ou ativos, ou por agentes auxiliares ou dispositivos. A introdução de um iRNA em uma célula pode ser in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, para introdução in vivo, o iRNA pode ser injetado em um lugar no tecido ou administrado sistemicamente. A entrega in vivo pode também ser realizada por um sistema de liberação de beta-glucanos, tal como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 5 032 401 e 5 607 677, e Publicação U.S. No 2005/0281781, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. A introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica tais como eletroporação e lipofecção. Abordagens adicionais são descritas abaixo e/ou são conhecidas na técnica.
[00158] O termo “nanopartícula lipídica” ou “LNP” refere-se a uma vesícula que compreende uma camada de lipídio encapsulando uma molécula farmaceuticamente ativa, tal como uma molécula de ácido nucleico, p. ex., um iRNA ou um plasmídeo a partir do qual um iRNA é transcrito. LNPs são descritas em, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6 858 225, 6 815 432, 8 158 601 e 8 058 069, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00159] Neste relatório descritivo, um “indivíduo” é um animal, tal como um mamífero, incluindo um primata (tal como um humano, um primata não humano, p. ex., um macaco e um chimpanzé), um não primata (tal como uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, uma cobaia, um gato, um cão, um rato, um
50 / 395 camundongo, um cavalo e uma baleia) ou uma ave (p. ex., um pato ou um ganso).
[00160] Em uma modalidade, o indivíduo é um humano, tal como um humano sendo tratado ou avaliado para uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13; um humano em risco de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13; um humano portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13; e/ou um humano sendo tratado para uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, como aqui descritas.
[00161] Em uma modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica a variação I148M do domínio fosfolipase do tipo patatina contendo proteína 3 (PNPLA3). Em outra modalidade, o indivíduo é homozigoto para o gene que codifica a variação I148M de PNPLA3. Em uma modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica a variação I144M do domínio fosfolipase do tipo patatina contendo proteína 3 (PNPLA3). Em outra modalidade, o indivíduo é homozigoto o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica a variação I144M de PNPLA3. Em uma modalidade, o indivíduo é homozigoto para o gene que codifica uma proteína HSD17B13 funcional. Em outra modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que uma proteína HSD17B13 funcional. Em ainda outra modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica uma proteína HSD17B13 funcional e um gene que codifica uma variante de perda de função de HSD17B13. Em outra modalidade, o indivíduo é portador da variante HSD17B13 rs72613567, p. ex., HSD17B13 rs72613567:TA.
[00162] Neste relatório descritivo, os termos “tratar” ou “tratamento” referem-se a um resultado benéfico ou desejado incluindo, entre outros, alívio ou melhora de um ou mais sintomas associados com a expressão do gene HSD17B13 e/ou a produção de proteína HSD17B13, p. ex., uma doença
51 / 395 associada com HSD17B13, tal como uma doença hepática fibro-inflamatória crônica, p. ex., inflamação do fígado, fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco, necrose hepatocelular e/ou carcinoma hepatocelular. “Tratamento” pode também significar prolongar a sobrevida em comparação à sobrevida prevista na ausência de tratamento.
[00163] O termo “baixar” no contexto de uma doença associada com HSD17B13 refere-se a uma diminuição estatisticamente significante em tal nível. A diminuição pode ser, por exemplo, de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais. Em certas modalidades, uma diminuição é de pelo menos 20%. “Baixar” no contexto do nível de HSD17B13 em um indivíduo é, de preferência, descer até um nível aceito como dentro da faixa de normalidade para um indivíduo sem tal transtorno.
[00164] Neste relatório descritivo, “prevenção” ou “prevenir”, quando usado em referência a uma doença, transtorno ou condição da mesma que se beneficiaria de uma redução na expressão de um gene HSD17B13, refere-se a uma redução na probabilidade de que um indivíduo venha a desenvolver um sintoma associado com tal doença, transtorno ou condição, p. ex., um sintoma da expressão gênica de HSD17B13, tal como inflamação do fígado, fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco, necrose hepatocelular e/ou carcinoma
52 / 395 hepatocelular. O não desenvolvimento de uma doença, transtorno ou condição, ou a redução no desenvolvimento de um sintoma associado com tal doença, transtorno ou condição (p. ex., em pelo menos aproximadamente 10% em uma escala clinicamente aceita para aquela doença ou transtorno), ou a exibição retardada (p. ex., por dias, semanas, meses ou anos) de sintomas tardios (p. ex., redução no acúmulo de lipídios no fígado e/ou expansão de gotículas de lipídios no fígado) é considerada prevenção eficaz.
[00165] Neste relatório descritivo, o termo “doença associada com HSD17B13” é uma doença ou transtorno que é causado ou está associado com a expressão gênica de HSD17B13 ou a produção da proteína HSD17B13. O termo “doença associada com HSD17B13” inclui uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de uma diminuição na expressão gênica ou na atividade proteica de HSD17B13.
[00166] Em uma modalidade, uma “doença associada com HSD17B13” é uma doença hepática fibro-inflamatória crônica. Uma “doença hepática fibro-inflamatória crônica” é qualquer doença, transtorno ou condição associado com inflamação e/ou fibrose hepática crônica. Exemplos não limitantes de doença hepática fibro-inflamatória crônica incluem, por exemplo, inflamação do fígado, fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco, necrose hepatocelular e/ou carcinoma hepatocelular.
[00167] “Quantidade terapeuticamente eficaz”, neste relatório descritivo, destina-se a incluir a quantidade de um agente RNAi que, quando administrada a um indivíduo com uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13, é suficiente para o tratamento eficaz da doença (p. ex., diminuindo, melhorando ou mantendo a doença existente ou um ou mais sintomas da doença). A “quantidade terapeuticamente eficaz” pode variar
53 / 395 dependendo do agente RNAi, do modo como o agente é administrado, a doença e sua gravidade e a história, idade, peso, história familiar, constituição genética, os tipos de tratamentos anteriores e concomitantes, se existirem, e de outras características pessoais do indivíduo a ser tratado.
[00168] “Quantidade profilaticamente eficaz”, neste relatório descritivo, destina-se a incluir a quantidade de um iRNA que, quando administrada a um indivíduo com uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13, é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença. Melhorar a doença inclui tornar mais lenta a evolução da doença ou reduzir a gravidade da doença que se desenvolve mais tardiamente. A “quantidade profilaticamente eficaz” pode variar dependendo do iRNA, do modo como o agente é administrado, o grau de risco de doença e da história, idade, peso, história familiar, constituição genética, os tipos tratamentos anteriores e concomitantes, se existirem, e de outras características pessoais do indivíduo a ser tratado.
[00169] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade profilaticamente eficaz” também inclui uma quantidade de um agente RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado com relação risco/benefício razoável que pode ser aplicada a qualquer tratamento. O iRNA empregado nos métodos da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade suficiente para produzir uma relação risco/benefício razoável aplicável a tal tratamento.
[00170] A expressão “farmaceuticamente aceitável” é aqui empregada para se referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas farmacêuticas que são, no âmbito do juízo médico fundamentado, adequados para uso em contato com os tecidos de humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurados com um risco/benefício razoável.
[00171] A expressão “veículo farmaceuticamente aceitável”, neste
54 / 395 relatório descritivo, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um material líquido ou sólido de preenchimento, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (p. ex., lubrificante, talco, estearato de magnésio, cálcio ou zinco ou ácido esteárico), ou material solvente de encapsulação, envolvido em carregar ou transportar o composto em questão de um órgão ou parte do corpo para outro órgão ou parte do corpo. Cada veículo deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não nocivo para o indivíduo em tratamento. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanta em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras para supositório; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, como propilenoglicol; (11) polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, como etil oleato e etil laurato; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirógenos; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tampão do pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, como polipeptídeos e aminoácidos (23) componentes do soro, como albumina sérica, HDL e LDL; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.
[00172] O termo “amostra”, neste relatório descritivo, inclui uma coleta de líquidos, células ou tecidos semelhantes isolados de um indivíduo, bem como líquidos, células ou tecidos presentes dentro de um indivíduo. Os
55 / 395 exemplos de líquidos biológicos incluem sangue, soro e líquidos serosos, plasma, líquido cefalorraquidiano, líquidos oculares, linfa, urina, saliva e semelhantes. As amostras de tecido podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, as amostras podem ser derivadas de órgãos em particular, partes de órgãos ou líquidos ou células dentro desses órgãos. Em certas modalidades, as amostras podem ser derivadas do fígado (p. ex., fígado inteiro ou certos segmentos do fígado ou certos tipos de células no fígado, tais como, p. ex., hepatócitos). Em algumas modalidades, uma “amostra derivada de um indivíduo” refere-se ao sangue ou plasma retirado do indivíduo. II. iRNAs da invenção
[00173] São aqui descritos iRNAs que inibem a expressão de um gene alvo. Em uma modalidade, os iRNAs inibem a expressão de um gene HSD17B13. Em uma modalidade, o agente iRNA inclui moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de um gene HSD17B13 em uma célula, tal como uma célula do fígado, como um célula do fígado em um indivíduo, p. ex., um mamífero, tal como um humano com uma doença, transtorno ou condição hepática fibro-inflamatória crônica, p. ex., uma doença, transtorno ou condição associado com, p. ex., o acúmulo e/ou a expansão de gotículas de lipídios no fígado e/ou fibrose do fígado.
[00174] O dsRNA inclui uma fita antisense com uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene HSD17B13. A região de complementaridade tem entre aproximadamente 30 ou menos nucleotídeos de comprimento (p. ex., aproximadamente 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 ou 18 ou menos nucleotídeos de comprimento). Quando do contato com uma célula que expressa o gene alvo, o iRNA inibe a expressão do gene alvo (p. ex., um gene alvo humano, de primata, não primata ou de ave) em pelo menos aproximadamente 10%, conforme avaliado, por exemplo, por um
56 / 395 método baseado em PCR ou DNA ramificado (bDNA), ou por um método baseado em proteína, tal como análise por imunofluorescência, usando, por exemplo, técnicas de Western Blotting ou de citometria de fluxo.
[00175] Um dsRNA inclui duas fitas de RNA que são complementares e hibridizam para formar uma estrutura duplex sob condições nas quais o dsRNA será utilizado. Uma fita de um dsRNA (a fita antisense) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente complementar e, em geral, totalmente complementar a uma sequência alvo. A sequência alvo pode ser derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene HSD17B13. A outra fita (a fita sense) inclui uma região que é complementar à fita antisense, de tal modo que as duas fitas hibridizam e formam uma estrutura duplex quando combinadas sob condições adequadas. Como descrito em outro lugar no presente e conforme sabido na técnica, as sequências complementares de um dsRNA podem também estar contidas como regiões autocomplementares de uma única molécula de ácido nucleico, em oposição a ser oligonucleotídeos separados.
[00176] Em geral, a estrutura duplex tem entre 15 e 30 pares de bases de comprimento, p. ex., entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15- 23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18- 26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19- 26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20- 26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21- 25, 21-24, 21-23 ou 21-22 pares de bases de comprimento. Intervalos e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos mencionados acima são também contemplados como parte da invenção.
[00177] Do mesmo modo, a região de complementaridade com a sequência alvo tem entre 15 e 30 nucleotídeos de comprimento, p. ex., entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22,
57 / 395 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento. Intervalos e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos mencionados acima são também contemplados como parte da invenção.
[00178] Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense do dsRNA têm independentemente entre aproximadamente 15 e 30 nucleotídeos de comprimento, ou entre aproximadamente 25 e 30 nucleotídeos de comprimento, p. ex., cada fita tem independentemente entre 15-29, 15-28, 15- 27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18- 30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19- 30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20- 30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21- 29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o dsRNA tem entre aproximadamente 15 e 23 nucleotídeos de comprimento, ou entre aproximadamente 25 e 30 nucleotídeos de comprimento. Em geral, o dsRNA é suficientemente longo para servir como substrato para a enzima Dicer. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que dsRNAs mais longos do que 21-23 nucleotídeos podem servir como substratos para Dicer. Conforme será também reconhecido por qualquer técnico no assunto, a região de um RNA direcionado para clivagem será, mais frequentemente, parte de uma molécula maior de RNA, muitas vezes uma molécula de mRNA. Quando relevante, uma “parte” de um mRNA alvo é uma sequência contígua de um mRNA alvo de comprimento suficiente que lhe permita ser um substrato para clivagem direcionada por RNAi (ou seja, clivagem através de uma via RISC).
[00179] O técnico no assunto também reconhecerá que a região duplex é uma porção primária funcional de um dsRNA, p. ex., uma região duplex
58 / 395 com aproximadamente 9 a 36 pares de bases, p. ex., aproximadamente 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 pares de bases. Assim, em uma modalidade, na medida em que se torne processado para um duplex funcional de, p. ex., 15-30 pares de bases, que direciona um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA com uma região duplex maior do que 30 pares de bases é um dsRNA. Assim, qualquer técnico no assunto reconhecerá que, em uma modalidade, um miRNA é um dsRNA. Em outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA que ocorre naturalmente. Em outra modalidade, um agente iRNA útil para atingir a expressão de HSD17B13 não é gerado na célula alvo por clivagem de um dsRNA maior.
[00180] Um dsRNA como aqui descrito pode incluir ainda uma ou mais saliências de nucleotídeos de fita simples p. ex., 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos. dsRNAs com pelo menos um saliência de nucleotídeo pode exibir propriedades inibidoras inesperadamente superiores em relação a seus equivalentes com extremidades cegas. Uma saliência de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) saliência(s) pode(m) ser na fita sense, na fita antisense ou em qualquer combinação das mesmas. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma saliência pode(m) estar presente(s) na extremidade 5’, extremidade 3’ ou em ambas as extremidades de uma fita
59 / 395 antisense ou sense de um dsRNA.
[00181] Um dsRNA pode ser sintetizado por métodos padrão conhecidos na técnica, conforme discutidos mais detalhadamente abaixo, p. ex., com o uso de um sintetizador automático de DNA, tal como disponibilizados comercialmente, por exemplo, pela Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
[00182] Compostos de iRNA da invenção podem ser preparados por meio de um procedimento em duas etapas. Em primeiro lugar, as fitas individuais da molécula de RNA de fita dupla são preparadas separadamente. Depois, as fitas componentes são aneladas. As fitas individuais do composto de siRNA podem ser preparadas por meio de síntese orgânica em fase solúvel ou fase sólida, ou ambos. A síntese orgânica oferece a vantagem de que as fitas do oligonucleotídeo compreendendo nucleotídeos não naturais ou modificados podem ser facilmente preparadas. Os oligonucleotídeos de fita simples da invenção podem ser preparados por meio de síntese orgânica em fase solúvel ou fase sólida, ou ambos.
[00183] Em um aspecto, um dsRNA da invenção inclui pelo menos duas sequências de nucleotídeos, uma sequência sense e uma sequência antisense. A sequência da fita sense é selecionada dentre o grupo de Sequências fornecidas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, e a sequência de nucleotídeos da fita antisense, correspondente da fita sense, é selecionada dentre o grupo de Sequências de qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13. Nesse aspecto, uma das duas sequências é complementar à outra das duas sequências, com uma das sequências sendo substancialmente complementar a uma sequência de um mRNA gerado na expressão de um gene HSD17B13. Assim, nesse aspecto, um dsRNA incluirá dois oligonucleotídeos, em que um oligonucleotídeo é descrito como a fita sense (fita passageira) em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, e o segundo oligonucleotídeo é descrito como a fita antisense (fita guia)
60 / 395 correspondente da fita sense em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13 Em uma modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em oligonucleotídeos separados. Em outra modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em um único oligonucleotídeo.
[00184] Será entendido que, embora as sequências nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13 sejam descritas como sequências modificadas, não modificadas não conjugadas e/ou conjugadas, o RNA do iRNA da invenção p. ex., um dsRNA da invenção, pode compreender qualquer uma das sequências apresentadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13 que seja não modificada, não conjugada e/ou modificada e/ou conjugada de modo diferente daquele ali descrito.
[00185] O técnico no assunto está bem ciente de que dsRNAs com uma estrutura duplex entre aproximadamente 20 e 23 pares de bases, p. ex., 21 pares de bases foram assinalados como especialmente eficazes em induzir a interferência por RNA (Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888). No entanto, outros constataram que estruturas duplex de RNA mais curtas ou mais longas podem também ser eficazes (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714- 1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências dos oligonucleotídeos aqui providos, os dsRNAs aqui descritos podem incluir pelo menos um fita com comprimento de no mínimo 21 nucleotídeos. Pode-se prever razoavelmente que duplex mais curtos, com menos alguns nucleotídeos em uma ou ambas as extremidades, podem ser igualmente eficazes quando comparados aos dsRNAs descritos acima. Consequentemente, dsRNAs com uma sequência de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos, derivados de uma das sequências aqui providas, e diferindo na capacidade para inibir a expressão de um gene HSD17B13 em não mais do que aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25 ou 30% da inibição de um dsRNA que compreende a sequência
61 / 395 completa, são contemplados e abrangidos pelo âmbito da presente invenção.
[00186] Além disso, os RNAs descritos em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13 identificam um ou mais sítios em um transcrito de HSD17B13 que são suscetíveis à clivagem mediada por RISC. Assim, a presente invenção apresenta ainda iRNAs que atingem um alvo dentro desse(s) sítio(s). Neste relatório descritivo, diz-se que um iRNA atinge um alvo dentro de um sítio em particular de um transcrito de RNA se o iRNA promover a clivagem do transcrito em qualquer lugar dentro daquele sítio em particular. Tal iRNA geralmente incluirá pelo menos aproximadamente 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências aqui providas, anexados a sequências de nucleotídeos adicionais retirados da região contígua à sequência selecionada no gene.
[00187] Embora uma sequência alvo tenha em geral aproximadamente 15-30 nucleotídeos de comprimento, há uma grande variação na adequação de sequências específicas nessa faixa para direcionar a clivagem de qualquer dado RNA alvo. Vários pacotes de softwares e as diretrizes aqui apresentadas fornecem orientação para a identificação de sequências alvo ótimas para qualquer dado gene alvo, mas uma abordagem empírica pode também ser adotada, na qual uma “janela” ou “máscara” de um dado tamanho (como um exemplo não limitante, 21 nucleotídeos) é literal ou figurativamente (incluindo, p. ex., in silico) colocada na sequência alvo do RNA para identificar sequências na faixa de tamanho que pode servir como sequências alvo. Deslocando a “janela” da sequência progressivamente um nucleotídeo a montante ou a jusante de uma localização inicial da sequência alvo, a sequência alvo potencial seguinte pode ser identificada, até que o conjunto completo de sequências possíveis seja identificado para qualquer dado tamanho alvo selecionado. Esse processo, acoplado com a síntese sistemática e testes das sequências identificadas (por meio de ensaios como aqui descritos ou como conhecidos na técnica) para identificar aquelas sequências com
62 / 395 desempenho ótimo, pode identificar aquelas sequências de RNA que, quando direcionadas com um agente iRNA, medeiam a melhor inibição da expressão do gene alvo. Assim, embora as sequências aqui identificadas representem sequências alvo eficazes, contempla-se que a otimização adicional da eficiência de inibição possa ser alcançada “deslocando-se a janela” progressivamente por um nucleotídeo a montante ou a jusante nas dadas sequências para identificar sequências com características iguais ou melhores de inibição.
[00188] Além disso, contempla-se que, para qualquer sequência aqui identificada, seria possível alcançar otimização adicional com a adição ou remoção sistemática de nucleotídeos para gerar sequências mais longas ou mais curtas e testar essas sequências geradas deslocando uma janela do tamanho mais longo ou mais curto, para cima ou baixo do RNA alvo a partir daquele ponto. Mais uma vez, essa abordagem para geração de novos alvos candidatos, acoplada a testes quanto à eficácia de iRNAs baseados nessas sequências alvo em um ensaio de inibição, como conhecido na técnica e/ou como aqui descritos, pode levar a melhorias adicionais na eficiência da inibição. Mais ainda, tais sequências otimizadas podem ser ajustadas, p. ex., pela introdução de nucleotídeos modificados, como aqui descrito ou conhecido na técnica, a adição ou alterações na saliência ou outras modificações conhecido na técnica e/ou aqui discutido para otimizar mais a molécula (p. ex., aumentar a estabilidade no soro ou a meia-vida circulante, aumentar a estabilidade térmica, reforçar a entrega transmembrana, direcionar para uma localização em particular ou tipo de célula, aumentar a interação com enzimas da via de silenciamento, aumentar a liberação por endossomos) como um inibidor de expressão.
[00189] Um agente iRNA como aqui descrito pode conter um ou mais erros de pareamento em relação à sequência alvo. Em uma modalidade, um iRNA como aqui descrito não contém mais do que 3 erros de pareamento. Se
63 / 395 a fita antisense do iRNA contiver erros de pareamento em relação a uma sequência alvo, é preferível que a área do erro de pareamento não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a fita antisense do iRNA contiver erros de pareamento em relação à sequência alvo, é preferível que o erro de pareamento fique restrito dentro dos últimos 5 nucleotídeos a partir da extremidade 5’ ou 3’ da região de complementaridade. Por exemplo, para um agente iRNA com 23 nucleotídeos, a fita que é complementar a uma região de um gene HSD17B13, em geral, não contém erro de pareamento dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos aqui descritos ou métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar se um iRNA contendo um erro de pareamento em relação a uma sequência alvo é eficaz em inibir a expressão de um gene HSD17B13. Considerar a eficácia de iRNAs com erros de pareamento em inibir a expressão de um gene HSD17B13 é importante, especialmente se a região de complementaridade específica em um gene HSD17B13 é conhecida por ter uma variação polimórfica na sequência dentro da população. III. iRNAs modificados da invenção
[00190] Em uma modalidade, o RNA do iRNA da invenção p. ex., um dsRNA, é não modificado e não compreende, p. ex., modificações químicas e/ou conjugações conhecidas na técnica e aqui descritas. Em outra modalidade, o RNA de um iRNA da invenção, p. ex., um dsRNA, é modificado quimicamente para reforçar a estabilidade ou outras características benéficas. Em certas modalidades da invenção, substancialmente todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Em outras modalidades da invenção, todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. iRNAs da invenção nos quais “substancialmente todos os nucleotídeos são modificados” são modificados em grande medida, mas não totalmente e não incluem mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos não modificados.
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[00191] Em alguns aspectos da invenção, substancialmente todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados e os agentes iRNA não compreendem mais de 10 nucleotídeos compreendendo modificações 2’- fluoro (p. ex., não mais de 9 modificações 2’-fluoro, não mais de 8 modificações 2’-fluoro, não mais de 7 modificações 2’-fluoro, não mais de 6 modificações 2’-fluoro, não mais de 5 modificações 2’-fluoro, não mais de 4 modificações 2’-fluoro, não mais de 5 modificações 2’-fluoro, não mais de 4 modificações 2’-fluoro, não mais de 3 modificações 2’-fluoro ou não mais de 2 modificações 2’-fluoro). Por exemplo, em algumas modalidades, a fita sense não compreende mais de 4 nucleotídeos compreendendo modificações 2’-fluoro (p. ex., não mais de 3 modificações 2’-fluoro ou não mais de 2 modificações 2’-fluoro). Em outras modalidades, a fita antisense não compreende mais de 6 nucleotídeos compreendendo modificações 2’-fluoro (p. ex., não mais de 5 modificações 2’-fluoro, não mais de 4 modificações 2’- fluoro, não mais de 4 modificações 2’-fluoro ou não mais de 2 modificações 2’-fluoro).
[00192] Em outros aspectos da invenção, todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados e os agentes iRNA não compreendem mais de 10 nucleotídeos compreendendo modificações 2’-fluoro (p. ex., não mais de 9 modificações 2’-fluoro, não mais de 8 modificações 2’-fluoro, não mais de 7 modificações 2’-fluoro, não mais de 6 modificações 2’-fluoro, não mais de 5 modificações 2’-fluoro, não mais de 4 modificações 2’-fluoro, não mais de 5 modificações 2’-fluoro, não mais de 4 modificações 2’-fluoro, não mais de 3 modificações 2’-fluoro ou não mais de 2 modificações 2’-fluoro).
[00193] Em uma modalidade, o agente RNAi de fita dupla da invenção compreende ainda um 5’-fosfato ou um mimético de 5’-fosfato no nucleotídeo 5’ da fita antisense. Em outra modalidade, o agente RNAi de fita dupla compreende ainda um mimético de 5’-fosfato no nucleotídeo 5’ da fita antisense. Em uma modalidade específica, o mimético de 5-fosfato é 5’-
65 / 395 vinilfosfato (5’-VP).
[00194] Os ácidos nucleicos apresentados na invenção podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, como aqueles descritos em “Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, EUA, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. As modificações incluem, por exemplo, modificações na extremidade, p. ex., modificações na extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações na extremidade 3’ (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas etc.); modificações em bases, p. ex., substituição por bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras ou bases que emparelham a base com um repertório ampliado de parceiros, remoção de bases (nucleotídeos abásico) ou bases conjugadas; modificações no açúcar (p. ex., na posição 2’ ou posição 4’) ou substituição do açúcar; e/ou modificações na cadeia principal (backbone), incluindo modificação ou substituição das ligações fosfodiéster. Exemplos específicos de compostos de iRNA úteis nas modalidades aqui descritas incluem, entre outros, RNAs que contêm cadeias principais modificadas ou sem ligações naturais entre nucleotídeos. Os RNAs com cadeias principais modificadas incluem, entre outros, aqueles que não possuem átomo de fósforo na cadeia principal. Para fins deste relatório descritivo, e como às vezes mencionado na técnica, RNAs modificados sem átomo de fósforo na sua cadeia principal internucleosídica podem também ser considerados oligonucleosídeos. Em algumas modalidades, um iRNA modificado terá um átomo de fósforo em sua cadeia principal internucleosídica.
[00195] Cadeias principais modificadas de RNA incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioato quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros alquil fosfonatos incluindo 3’- alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo
66 / 395 3’-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e boranofosfatos com ligações 3’-5’ normais, análogos 2’-5’-ligados desses e aqueles com polaridade invertida, em que os pares adjacentes as unidades de nucleosídeo são ligados 3’-5’ para 5’-3’ ou 2’-5’ para 5’-2’. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre estão também incluídos. Em algumas modalidades da invenção, os agentes dsRNA da invenção estão na forma de ácido livre. Em outras modalidades da invenção, os agentes dsRNA da invenção estão em forma de sal. Em uma modalidade, os agentes dsRNA da invenção estão em uma forma de sal de sódio. Em certas modalidades, quando os agentes dsRNA da invenção estão na forma de sal de sódio, os íons sódio estão presentes no agente como contraíons de substancialmente todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato presentes no agente. Agentes nos quais substancialmente todas as ligações fosfodiéster e/ou fosforotioato têm um contraíon sódio não incluem mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 ligações fosfodiéster e/ou fosforotioato sem um contraíon sódio. Em algumas modalidades, quando os agentes dsRNA da invenção estão na forma de sal de sódio, os íons sódio estão presentes no agente como contraíons de todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato presentes no agente.
[00196] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação das ligações acima contendo fósforo incluem, entre outras, as Patentes U.S. Nos 3 687 808; 4 469 863; 4 476 301; 5 023 243; 5 177 195; 5 188 897; 5 264 423; 5 276 019; 5 278 302; 5 286 717; 5 321 131; 5 399 676; 5 405 939; 5 453 496; 5 455 233; 5 466 677; 5 476 925; 5 519 126; 5 536 821; 5 541 316; 5 550 111; 5 563 253; 5 571 799; 5 587 361; 5 625 050; 6 028 188; 6 124 445; 6 160 109; 6 169 170; 6 172 209; 6 239 265; 6 277 603; 6 326 199; 6 346 614; 6 444 423; 6 531 590; 6 534 639; 6 608 035; 6 683 167; 6 858 715; 6 867 294; 6 878 805; 7 015 315; 7 041 816; 7 273 933; 7 321 029; e Patente U.S. RE39464, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por
67 / 395 referência.
[00197] Cadeias principais modificadas de RNA que não incluem um átomo de fósforo têm cadeias principais que são formadas por ligações de alquila ou cicloalquila de cadeia curta entre nucleosídeos, heteroátomos mistos e ligações de alquila e cicloalquila entre nucleosídeos, ou uma ou mais ligações de heteroátomos ou heterocíclicos de cadeia curta entre nucleosídeos. Essas incluem aqueles com ligações de morfolinos (formadas em parte da porção de açúcar de um nucleosídeo); cadeias principais de siloxano; cadeias principais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetila e tioformacetila; cadeias principais de metileno formacetila e tioformacetila; cadeias principais contendo alceno; cadeias principais de sulfamato; cadeias principais de metilenoimino e metileno-hidrazino; cadeias principais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e outras tendo partes componentes mistas de N, O, S e CH2.
[00198] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem, entre outras, as Patentes U.S. Nos 5 034 506; 5 166 315; 5 185 444; 5 214 134; 5 216 141; 5 235 033; 5 64 562; 5 264 564; 5 405 938; 5 434 257; 5 466 677; 5 470 967; 5 489 677; 5 541 307; 5 561 225; 5 596 086; 5 602 240; 5 608 046; 5 610 289; 5 618 704; 5 623 070; 5 663 312; 5 633 360; 5 677 437; e 5 677 439, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00199] Em outras modalidades, são contemplados miméticos adequados de RNA para uso em iRNAs, nos quais tanto o açúcar como a ligação entre nucleosídeos, ou seja, a cadeia principal das unidades de nucleotídeo são substituídos por grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um de tais compostos oligoméricos, um mimético de RNA que demonstrou ter excelentes propriedades de hibridização é referido como ácido peptidonucleico (PNA). Em compostos PNA, a cadeia principal com ácido de
68 / 395 um RNA é substituída por uma cadeia principal contendo amida, especialmente, uma cadeia principal com aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e ligadas direta ou indiretamente a átomos de nitrogênio aza da porção amida da cadeia principal. Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, entre outros, Patentes U.S. Nos 5 539 082; 5 714 331; e 5 719 262, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Compostos PNA adicionais para uso nos iRNAs da invenção são descritos em, por exemplo, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[00200] Algumas modalidades apresentadas na invenção incluem RNAs com cadeias principais de fosforotioato e oligonucleosídeos com cadeias principal de contendo heteroátomos e, em particular --CH2--NH-- CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[conhecido como cadeia principal de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)-- N(CH3)--CH2-- e --N(CH3)--CH2----[em que a cadeia principal nativa com fosfodiéster é representada como --O--P--O--CH2--] da Patente U.S. No 5 489677 mencionada acima, e as cadeia principais com amida da Patente U.S. No 5 602 240 mencionada acima. Em algumas modalidades, os RNAs aqui apresentados possuem estruturas de cadeia principal com morfolino da Patente U.S. No 5 034 506 mencionada acima.
[00201] RNAs modificados podem também conter uma ou mais porções de açúcar substituído. Os iRNAs, p. ex., dsRNAs, aqui apresentados podem incluir um dos seguintes na posição 2’: OH; F; O-, S- ou N-alquila; O- , S- ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que o alquila, alquenila e podem ser alquila C1 a C10 substituído ou não substituído ou alquenila e alquinila C2 a C10. Modificações exemplares adequadas incluem O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde n e m são de 1 a aproximadamente 10. Em outras modalidades, os dsRNAs incluem um dos
69 / 395 seguintes na posição 2’: alquila inferior C1 a C10, alquila inferior substituído, alquilarila, arilalquila, O-alquilarila ou O-arilalqula, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalquilarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituído, um grupo para clivagem do RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um iRNA ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um iRNA, e outros substituintes com propriedades semelhantes. Em algumas modalidades, a modificação inclui um 2’-metoxietoxi (2’-O--CH2CH2OCH3, também conhecido como 2’-O-(2-metoxietil) ou 2’-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) ou seja, um grupo alcóxi-alcóxi. Outra modificação exemplar é 2’-dimetilamino-oxietoxi, ou seja, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2’-DMAOE, conforme descrito nos exemplos abaixo, e 2’-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica as 2’-O- dimetilaminoetoxietila ou 2’-DMAEOE), ou seja, 2’-O--CH2--O--CH2-- N(CH2)2. Modificações exemplares adicionais incluem: nucleotídeos 5’-Me- 2’-F, nucleotídeos 5’-Me-2’-OMe, desoxinucleotídeos 5’-Me-2’-, (isômeros R e S nessas três famílias); 2’-alcoxialqula; e 2’-NMA (N-metilacetamida).
[00202] Outras modificações incluem 2’-metoxi (2’-OCH3), 2’- aminopropoxi (2’-OCH2CH2CH2NH2) e 2’-fluoro (2’-F). Modificações semelhantes também podem ser feitas em outras posições no RNA de um iRNA, especialmente a posição 3’ do açúcar no nucleotídeo 3’ terminal ou em dsRNAs 2’-5’ ligados e na posição 5’ do nucleotídeo 5’. iRNAs podem também ter miméticos de açúcar, tais como porções ciclobutila no lugar do açúcar pentofuranosila. Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificado incluem, entre outras, as Patentes U.S. Nos 4 981 957; 5 118 800; 5 319 080; 5 359 044; 5 393 878; 5 446 137; 5 466 786; 5 514 785; 5 519 134; 5 567 811; 5 576 427; 5 591 722; 5 597 909; 5 610 300; 5 627 053; 5 639 873; 5 646 265; 5 658 873; 5 670
70 / 395 633; e 5 700 920, algumas destas de propriedade comum com o presente pedido de patente. O conteúdo de cada uma das anteriores é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00203] Um iRNA da invenção pode também incluir modificações ou substituições da nucleobase (frequentemente referida na técnica simplesmente como “base”). Neste relatório descritivo, as nucleobases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases purínicas adenina (A) e guanina (G), e as bases pirimidinícas timina (T), citosina (C) e uracila (U). As nucleobases modificadas incluem nucleobases sintéticas e outras naturais tais como 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2- propila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2- tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinila-uracila e citosina, 6-azo-uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4- tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilam 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, especialmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8- azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-daazaadenina e 3- deazaguanina e 3-deazaadenina. Nucleobases adicionais incluem aquelas reveladas na Patente U.S. No 3 687 808, aquelas reveladas em Modified Nucleosides em Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; aquelas reveladas em The Concise Enciclopedia Of Polimer Science and Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas reveladas por Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613, e aquelas reveladas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289- 302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algumas dessas nucleobases são especialmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na invenção. Essas incluem pirimidinas
71 / 395 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. Substituições 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 ºC (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pág. 276-278) e são substituições exemplares de bases, ainda mais especialmente quando combinadas com modificações 2’-O-metoxietila no açúcar.
[00204] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de algumas das nucleobases modificadas anotadas acima, bem como outras nucleobases modificadas incluem, entre outras, as Patentes U.S. Nos 3 687 808 4 845 205; 5 130 30; 5 134 066; 5 175 273; 5 367 066; 5 432 272; 5 457 187; 5 459 255; 5 484 908; 5 502 177; 5 525 711; 5 552 540; 5 587 469; 5 594 121 5 596 091; 5 614 617; 5 681 941; 5 750 692; 6 015 886; 6 147 200; 6 166 197; 6 222 025; 6 235 887; 6 380 368; 6 528 640; 6 639 062; 6 617 438; 7 045 610; 7 427 672; e 7 495 088 anotadas acima, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00205] Um iRNA da invenção pode também ser modificado para incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados, (Locked nucleic acid, LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo com uma porção ribose modificada, em que a porção ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2’ e 4’. Essa estrutura efetivamente “bloqueia” a ribose na conformação estrutural extremidade 3’o. A adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs demonstrou aumentar a estabilidade do siRNA no soro e reduzir efeitos fora do alvo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[00206] Um iRNA da invenção pode também ser modificado para incluir uma ou mais porções de açúcar bicíclico. Um “açúcar bicíclico” é um
72 / 395 anel furanosila modificado pela ponte entre dois átomos.
Um ”nucleosídeo bicíclico” (“BNA”) é um nucleosídeo com uma porção de açúcar compreendendo uma ponte que conecta dois átomos de carbono do anel do açúcar, formando, assim, um sistema de anel bicíclico.
Em certas modalidades, a ponte conecta o carbono 4’ e o carbono 2’ do anel do açúcar.
Assim, em algumas modalidades um agente da invenção pode incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo com uma porção ribose modificada, em que a porção ribose compreende uma ponte extra que conecta os carbonos 2’ e 4’. Em outras palavras, um LNA é um nucleotídeo compreendendo uma porção de açúcar bicíclico que compreende uma ponte 4’-CH2-O-2’. Essa estrutura efetivamente “bloqueia” a ribose na conformação estrutural extremidade 3’o.
A adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs demonstrou aumentar a estabilidade do siRNA no soro e reduzir efeitos fora do alvo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Exemplos de nucleosídeos bicíclicos para uso nos polinucleotídeos da invenção incluem, entre outros, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos 4’ e 2’ do anel ribosila.
Em certas modalidades, os agentes polinucleotídeos antisense da invenção incluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos compreendendo uma ponte 4’ para 2’. Exemplos de tais nucleosídeos bicíclicos com uma ponte 4’ para 2’ incluem, entre outros, 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ (também referido como “etila impedido” ou “cEt”) e 4’- CH(CH2OCH3)-O-2’ (e análogos dos mesmos; ver, p. ex., Patente U.S.
No 7 399 845); 4’-C(CH3)(CH3)-O-2’ (e análogos dos mesmos; ver, p. ex., Patente U.S.
No 8 278 283); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (e análogos dos mesmos; ver, p. ex., Patente U.S.
No 8 278 425); 4’-CH2-O-N(CH3)-2’ (ver, p. ex., Publicação de Patente U.S.
No 2004/0171570); 4’-CH2-N(R)-O-2’, em que R
73 / 395 é H, alquila C1-C12 ou um grupo protetor (ver, p. ex., Patente U.S. No 7 427 672); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2’ (ver, p. ex., Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); e 4’-CH2-C(=CH2)-2’ (e análogos dos mesmos; ver, p. ex., Patente U.S. No 8 278 426). O conteúdo de cada uma das anteriores é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00207] Patentes U.S. representativas adicionais e Publicações de Patente U.S. que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácidos nucleicos bloqueados incluem, entre outras, as seguintes: Patentes U.S. Nos 6 268 490; 6 525 191; 6 670 461; 6 770 748; 6 794 499; 6 998 484; 7 053 207; 7 034 133;7 084 125; 7 399 845; 7 427 672; 7 569 686; 7 741 457; 8 022 193; 8 030 467; 8 278 425; 8 278 426; 8 278 283; US 2008/0039618; e US 2009/0012281, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00208] Qualquer um dos nucleosídeos bicíclicos anteriores pode ser preparado para que tenha uma ou mais configurações estereoquímicas adicionais do açúcar incluindo por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D- ribofuranose (ver WO 99/14226).
[00209] Um iRNA da invenção pode também ser modificado para incluir um ou mais nucleotídeos com etila impedido. Neste relatório descritivo, um “nucleotídeo com etila impedido” ou “cEt” é um ácido nucleico bloqueado compreendendo uma porção de açúcar bicíclico que compreende uma ponte 4’-CH(CH3)-0-2’. Em uma modalidade, um nucleotídeo com etila restrito está na conformação S, aqui referido como “S- cEt”.
[00210] Um iRNA da invenção pode também incluir um ou mais “nucleotídeos de conformação com restrição” (“CRN”). CRN são análogos de nucleotídeos com um linker conectando os carbonos C2’ e C4’ de ribose ou os carbonos C3 e C5’ de ribose. CRN bloqueiam o anel da ribose em uma conformação estável e aumentam a afinidade por hibridização com mRNA. O linker é de comprimento suficiente para posicionar o oxigênio em uma
74 / 395 posição ótima para estabilidade e afinidade resultando em menos puckering (enrugamento) do anel da ribose.
[00211] Publicações representativas que ensinam a preparação alguns dos CRN anotados acima incluem, entre outros, a Publicação de Patente U.S. No 2013/0190383; e Publicação PCT WO 2013/036868, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00212] Em algumas modalidades, um iRNA da invenção compreende um ou mais monômeros que são nucleotídeos UNA (ácido nucleico não bloqueado). UNA é um ácido nucleico acíclico não bloqueado, em que qualquer uma das ligações do açúcar foi removida, formando um resíduo de “açúcar” não bloqueado. Em um exemplo, UNA também abrange o monômero com ligações entre C1’-C4’ que foram removidas (ou seja, a ligação covalente carbono-oxigênio-carbono entre os carbonos C1’ e C4’). Em outro exemplo, a ligação C2’-C3’ (ou seja, a ligação covalente carbono- carbono entre os carbonos C2’ e C3’) do açúcar foi removida (ver, Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) e Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, aqui incorporados por referência).
[00213] Publicações U.S. representativas que ensinam a preparação de UNA incluem, entre outras, Patente U.S. No 8 314 227; e Publicações de Patente U.S. Nos 2013/0096289; 2013/0011922; e 2011/0313020, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00214] As modificações potencialmente estabilizadoras às extremidades de moléculas de RNA podem incluir N-(acetilaminocaproil)-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N- (acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2’-0-desoxitimidina (éter), N- (aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil-uridina-3”- fosfato, base invertida dT (idT) e outras. A descrição dessa modificação pode ser encontrada na Publicação PCT No WO 2011/005861.
[00215] Outras modificações de um iRNA da invenção incluem um 5’
75 / 395 fosfato ou mimético de 5’ fosfato, p. ex., um fosfato 5’-terminal ou mimético de fosfato na fita antisense de um agente RNAi. Miméticos de fosfato são descritos em, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No 2012/0157511, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00216] Em certas modalidades específicas, um agente RNAi da presente invenção é um agente que inibe a expressão de um gene HSD17B13 que é selecionado dentre o grupo de agentes listados em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13. Qualquer um desses agentes pode compreender ainda um ligante. A. iRNAs modificados compreendendo motivos da invenção
[00217] Em certos aspectos da invenção, os agentes RNAi de fita dupla da invenção incluem agentes com modificações químicas como reveladas, por exemplo, em WO 2013/075035, depositado em 16 de novembro de 2012, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00218] Consequentemente, a invenção provê agentes RNAi de fita dupla capazes de inibir a expressão de um gene alvo ( ou seja, um gene HSD17B13) in vivo. O agente RNAi compreende uma fita sense e uma fita antisense. Cada fita do agente RNAi pode variar de 12-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, cada fita pode ter entre 14-30 nucleotídeos de comprimento, 17-30 nucleotídeos de comprimento, 25-30 nucleotídeos de comprimento, 27-30 nucleotídeos de comprimento, 17-23 nucleotídeos de comprimento, 17-21 nucleotídeos de comprimento, 17-19 nucleotídeos de comprimento, 19-25 nucleotídeos de comprimento, 19-23 nucleotídeos de comprimento, 19-21 nucleotídeos de comprimento, 21-25 nucleotídeos de comprimento ou 21-23 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a fita sense tem 21 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a fita antisense tem 23 nucleotídeos de comprimento.
[00219] A fita sense e a fita antisense formam tipicamente um RNA duplex de fita dupla (“dsRNA”), também aqui referido como “agente RNAi”.
76 / 395 A região duplex de um agente RNAi pode ter 12-30 pares de nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a região duplex pode ter entre 14-30 pares de nucleotídeos de comprimento, 17-30 pares de nucleotídeos de comprimento, 27-30 pares de nucleotídeos de comprimento, 17 - 23 pares de nucleotídeos de comprimento, 17-21 pares de nucleotídeos de comprimento, 17-19 pares de nucleotídeos de comprimento, 19-25 pares de nucleotídeos de comprimento, 19-23 pares de nucleotídeos de comprimento, 19- 21 pares de nucleotídeos de comprimento, 21-25 pares de nucleotídeos de comprimento ou 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento. Em outro exemplo, a região duplex é selecionada dentre 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27 nucleotídeos de comprimento.
[00220] Em uma modalidade, o agente RNAi pode conter um ou mais regiões salientes (overhang) e/ou regiões de capeamento (capping) na extremidade 3’, extremidade 5’, ou nas duas extremidades de uma ou de ambas as fitas. A saliência pode ter 1-6 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 2-6 nucleotídeos de comprimento, 1-5 nucleotídeos de comprimento, 2-5 nucleotídeos de comprimento, 1-4 nucleotídeos de comprimento, 2-4 nucleotídeos de comprimento, 1-3 nucleotídeos de comprimento, 2-3 nucleotídeos de comprimento ou 1-2 nucleotídeos de comprimento. As saliências pode ser o resultado de uma fita ser mais longa do que a outra, ou o resultado de duas fitas do mesmo comprimento ser escalonada (staggered). A saliência pode formar um erro de emparelhamento com o mRNA alvo ou pode ser complementar às sequências do gene visado ou pode ser outra sequência. A primeira e a segunda fita podem também ser unidas, p. ex., por bases adicionais para formar um hairpin (grampo de cabelo) ou por linkers que não sejam bases.
[00221] Em uma modalidade, os nucleotídeos na região saliente do agente RNAi podem ser cada um independentemente um nucleotídeo modificado ou não modificado, incluindo, entre outros, açúcar 2’-modificado,
77 / 395 tal como, 2-F, 2’-Ometil, timidina (T), 2`-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2`-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2`-O-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) e quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, TT pode ser uma sequência saliente de qualquer extremidade em qualquer fita. A saliência pode formar um erro de emparelhamento com o mRNA alvo ou pode ser complementar às sequências do gene visado ou pode ser outra sequência.
[00222] As saliências 5’ ou 3’ na fita sense, fita antisense ou em ambas as fitas do agente RNAi podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a(s) região(ões) saliente(s) contém/contêm dois nucleotídeos com um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, em que os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma modalidade, a saliência está presente na extremidade 3’ da fita sense, fita antisense ou de ambas as fitas. Em uma modalidade, essa saliência 3’ está presente na fita antisense. Em uma modalidade, essa saliência 3’ está presente na fita sense.
[00223] O agente RNAi pode conter somente uma saliência, a qual pode reforçar a atividade de interferência do RNAi, sem afetar a sua estabilidade global. Por exemplo, a saliência de fita simples pode estar localizada na extremidade 3’-terminal da fita sense ou, alternativamente, na extremidade 3’-terminal da fita antisense. O RNAi pode também ter uma extremidade cega (blunt), localizada na extremidade 5’ da fita antisense (ou da extremidade 3’ da fita sense) ou vice-versa. Em geral, a fita antisense do RNAi tem uma saliência de nucleotídeo na extremidade 3’, e a extremidade 5’ é cega. Embora sem a intenção de estar vinculado à teoria, a extremidade cega assimétrica na extremidade 5’ da fita antisense e a saliência na extremidade 3’ da fita antisense favorecem o carregamento da fita guia no processo RISC.
[00224] Em uma modalidade, o agente RNAi é um bluntmer na extremidade duplo de 19 nucleotídeos de comprimento, em que a fita sense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 7, 8, 9 a partir da extremidade 5’. A fita antisense
78 / 395 contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’.
[00225] Em outra modalidade, o agente RNAi é um bluntmer na extremidade duplo de 20 nucleotídeos de comprimento, em que a fita sense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 8, 9, 10 a partir da extremidade 5’. A fita antisense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’.
[00226] Em ainda outra modalidade, o agente RNAi bluntmer na extremidade duplo de 21 nucleotídeos de comprimento, em que a fita sense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a partir da extremidade 5’. A fita antisense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’.
[00227] Em uma modalidade, o agente RNAi compreende uma fita sense de 21 nucleotídeos e uma fita antisense de 23 nucleotídeos, em que a fita sense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a partir da extremidade 5’; a fita antisense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’, em que uma extremidade do agente RNAi é cega, enquanto a outra extremidade compreende uma saliência com 2 nucleotídeos. De preferência, a saliência com 2 nucleotídeos é na extremidade 3’ da fita antisense.
[00228] Quando a saliência com 2 nucleotídeos é na extremidade 3’ da fita antisense, pode haver duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos salientes, e o terceiro nucleotídeo e um nucleotídeo pareado ao lado do
79 / 395 nucleotídeo saliente. Em uma modalidade, o agente RNAi tem adicionalmente duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais na extremidade 5’ da fita sense e na extremidade 5’ da fita antisense. Em uma modalidade, todo nucleotídeo na fita sense e na fita antisense do agente RNAi, incluindo os nucleotídeos que fazem parte dos motivos, são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, cada resíduo é independentemente modificado com 2’-O-metila ou 3’-fluoro, p. ex., em um motivo alternante. Opcionalmente, o agente RNAi compreende ainda um ligante (de preferência, GalNAc3).
[00229] Em uma modalidade, o agente RNAi compreende uma fita sense e uma antisense, em que a fita sense tem 25-30 resíduos de nucleotídeos de comprimento, em que a partir do nucleotídeo 5’ terminal (posição 1), as posições 1 a 23 da primeira fita compreendem pelo menos 8 ribonucleotídeos; a fita antisense tem 36-66 resíduos de nucleotídeos de comprimento e, a partir do nucleotídeo 3’ terminal, compreende pelo menos 8 ribonucleotídeos nas posições emparelhadas com as posições 1-23 da fita sense para formar um duplex; em que pelo menos o nucleotídeo 3’ terminal da fita antisense não é emparelhado com a fita sense, e até 6 nucleotídeos consecutivos 3’ terminal não são emparelhados com a fita sense, formando, assim, uma saliência 3’ de fita simples com 1-6 nucleotídeos; em que a terminação 5’ da fita antisense compreende de 10-30 nucleotídeos consecutivos que não são emparelhados com a fita sense, formando, assim, uma saliência 5’ de fita simples com 10-30 nucleotídeos; em que pelo menos os nucleotídeos 5’ terminais e 3’ terminais da fita sense têm as bases emparelhadas com nucleotídeos da fita antisense quando as fitas sense e antisense são alinhadas para complementaridade máxima, formando, assim, uma região substancialmente em duplex entre as fitas sense e antisense; e a fita antisense é suficientemente complementar a um RNA alvo ao longo de pelo menos 19 ribonucleotídeos do comprimento da fita antisense para reduzir a expressão do gene alvo quando o ácido
80 / 395 nucleico de fita dupla é introduzido em uma célula de mamífero; e em que a fita sense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos, em que pelo menos um dos motivos ocorre perto ou no sítio de clivagem. A fita antisense contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos perto ou no sítio de clivagem.
[00230] Em uma modalidade, o agente RNAi compreende fitas sense e antisense, em que o agente RNAi compreende uma primeira fita tendo um comprimento que é pelo menos de 25 e no máximo de 29 nucleotídeos, e uma segunda fita tendo um comprimento que é no máximo de 30 nucleotídeos com pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos na posição 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’; em que a extremidade 3’ da primeira fita e a extremidade 5’ da segunda fita formam uma extremidade cega, e a segunda fita é 1-4 nucleotídeos mais longa em sua extremidade 3’ do que a primeira fita, em que a região duplex tem pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento, e a segunda fita é suficientemente complementar a um mRNA alvo ao longo de pelo menos 19 nucleotídeos da segunda fita para reduzir a expressão do gene alvo quando o agente RNAi é introduzido em uma célula de mamífero, sendo que que a clivagem pela enzima dicer do agente RNAi resulta preferencialmente em um siRNA que compreende a extremidade 3’ da segunda fita, reduzindo, assim, a expressão do gene alvo no mamífero. Opcionalmente, o agente RNAi compreende ainda um ligante.
[00231] Em uma modalidade, a fita sense do agente RNAi contém pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que um dos motivos ocorre no sítio de clivagem na fita sense.
[00232] Em uma modalidade, a fita antisense do agente RNAi pode também conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três
81 / 395 nucleotídeos consecutivos, em que um dos motivos ocorre perto ou no sítio de clivagem na fita antisense.
[00233] Para um agente RNAi tendo uma região duplex com 17-23 nucleotídeos de comprimento, o sítio de clivagem da fita antisense está tipicamente em volta das posições 10, 11 e 12 a partir da extremidade 5’. Assim, os motivos de três modificações idênticas pode ocorrer nas posições 9, 10, 11; posições 10, 11, 12; posições 11, 12, 13; posições 12, 13, 14; ou posições 13, 14, 15 da fita antisense, a contagem iniciando desde o 1o nucleotídeo a partir da extremidade 5’ da fita antisense, ou, a contagem iniciando desde o 1o nucleotídeo pareado dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ da fita antisense. O sítio de clivagem na fita antisense pode também mudar de acordo com o comprimento da região duplex do RNAi a partir da extremidade 5’.
[00234] A fita sense do agente RNAi pode conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no sítio de clivagem da fita; e a fita antisense pode ter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos perto ou no sítio de clivagem da fita. Quando a fita sense e a fita antisense formam um dsRNA duplex, a fita sense e a fita antisense podem ser assim alinhadas para que um motivo dos três nucleotídeos na fita sense e um motivo dos três nucleotídeos na fita antisense tenham pelo menos uma sobreposição de nucleotídeo, ou seja, pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na fita sense forma um par de bases com pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na fita antisense. Alternativamente, pelo menos dois nucleotídeos podem sobrepor-se ou todos os três nucleotídeos podem sobrepor-se.
[00235] Em uma modalidade, a fita sense do agente RNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. O primeiro motivo pode ocorrer perto ou no sítio de clivagem da fita e os outros motivos pode ter uma modificação na forma de asa. O
82 / 395 termo “modificação na forma de asa”, neste relatório descritivo, refere-se a um motivo ocorrendo em outra parte da fita que é separada do motivo perto ou no sítio de clivagem da mesma fita. A modificação na forma de asa é adjacente ao primeiro motivo ou é separada por pelo menos um ou mais nucleotídeos. Quando os motivos são imediatamente adjacentes uns aos outros, então, a química dos motivos é distinta uma da outra, e quando os motivos são separados por um ou mais nucleotídeos, então, as químicas podem ser iguais ou diferentes. Duas ou mais modificações na forma de asa podem estar presentes. Por exemplo, quando duas modificações na forma de asa estão presentes, cada modificação na forma de asa pode ocorrer em uma extremidade em relação ao primeiro motivo que é perto ou no sítio de clivagem ou em qualquer lado do motivo líder.
[00236] Do mesmo modo que a fita sense, a fita antisense do agente RNAi pode conter mais de um motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, com pelo menos um dos motivos ocorrendo perto ou no sítio de clivagem da fita. Essa fita antisense pode também conter uma ou mais modificações na forma de asa em um alinhamento semelhante às modificações na forma de asa que podem estar presentes na fita sense.
[00237] Em uma modalidade, a modificação na forma de asa na fita sense ou na fita antisense do agente RNAi tipicamente não inclui o primeiro ou dois nucleotídeos terminais na extremidade 3’, na extremidade 5’ ou em ambas as extremidades da fita.
[00238] Em outra modalidade, a modificação na forma de asa na fita sense ou na fita antisense do agente RNAi tipicamente não inclui o primeiro ou dois nucleotídeos pareados dentro da região duplex na extremidade 3’, na extremidade 5’ ou em ambas as extremidades da fita.
[00239] Quando a fita sense e a fita antisense do agente RNAi contiverem cada pelo menos uma modificação na forma de asa, as modificações na forma de asa podem situar-se na mesma extremidade da
83 / 395 região duplex, e ter uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos.
[00240] Quando a fita sense e a fita antisense do agente RNAi contiverem cada duas modificações na forma de asa, a fita sense e a fita antisense podem ser assim alinhadas de modo que as duas modificações cada de uma fita situem-se em uma extremidade da região duplex, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações cada de uma fita situam-se na outra extremidade da região duplex, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações de uma fita situam-se em cada lado do motivo líder, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos na região duplex.
[00241] Em uma modalidade, todo nucleotídeo na fita sense e na fita antisense do agente RNAi, incluindo os nucleotídeos que fazem parte dos motivos, pode ser modificado. Cada nucleotídeo pode ser modificado com a mesma modificação ou diferente, a qual pode incluir uma ou mais alterações de um ou ambos os oxigênios não de ligação do fosfato e/ou de um ou mais dos oxigênios de ligação do fosfato; a alteração de um constituinte do açúcar ribose, p. ex., da hidroxila 2’ no açúcar ribose; a substituição maciça da porção fosfato por linkers “defosfo”; a modificação ou substituição de uma base natural; e a substituição ou modificação da cadeia principal ribose- fosfato.
[00242] Como ácidos nucleicos são polímeros de subunidades, muitas das modificações ocorrem em uma posição que é repetida dentro de um ácido nucleico, p. ex., uma modificação de uma porção base ou uma porção fosfato, ou em um O não de ligação de uma porção fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições em questão no ácido nucleico, mas em muitos casos não ocorrerá. A título de exemplo, uma modificação pode ocorrer somente em uma posição 3’ ou 5’ terminal, pode ocorrer somente em uma região terminal, p. ex., em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode
84 / 395 ocorrer em uma região de fita dupla, uma região de fita simples ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer somente na região de fita dupla de um RNA ou pode ocorrer somente em uma região de fita simples de um RNA. Por exemplo, uma modificação fosforotioato em uma posição de O não de ligação pode ocorrer somente em um ou nos dois terminais, pode ocorrer somente em uma região terminal, p. ex., em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões de fita dupla e de fita simples, especialmente nos terminais. A extremidade 5’ ou as extremidades podem ser fosforiladas.
[00243] Pode ser possível, p. ex., aumentar a estabilidade, para incluir bases em particular em saliências, ou para incluir nucleotídeos modificados ou substitutos de nucleotídeos, em saliências de fita simples, p. ex., em uma saliência 5’ ou 3’, ou em ambas. Por exemplo, pode ser desejável incluir nucleotídeos de purina em saliências. Em algumas modalidades, todas ou algumas das bases em uma saliência 3’ ou 5’ podem ser modificadas, p. ex., com uma modificação aqui descrita. As modificações podem incluir, p. ex., o uso de modificações na posição 2’ do açúcar ribose com modificações que são conhecidas na técnica, p. ex., o uso de desoxirribonucleotídeos, modificados com 2’-desoxi-2’-fluoro (2’-F) ou 2’-O-metila em vez do açúcar ribose da nucleobase, e modificações no grupo fosfato, p. ex., modificações fosforotioato. As saliências não precisam ser homólogas com a sequência alvo.
[00244] Em uma modalidade, cada resíduo da fita sense e da fita antisense é independentemente modificado com LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’- O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’-desoxi, 2’-hidroxila ou 2’-fluoro. As fitas podem conter mais de uma modificação. Em uma modalidade, cada resíduo da fita sense e da fita antisense é independentemente modificado com 2’-O-metila ou 2’-fluoro.
[00245] Pelo menos duas modificações diferentes estão tipicamente
85 / 395 presentes na fita sense e na fita antisense. Essas duas modificações podem ser as modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro, ou outras.
[00246] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreendem modificações de um padrão alternante. O termo “motivo alternante”, neste relatório descritivo, refere-se a um motivo tendo uma ou mais modificações, cada modificação ocorrendo em nucleotídeos alternantes de uma fita. O nucleotídeo alternante pode referir-se a um de dois em dois nucleotídeos ou um de três em três nucleotídeos, ou um padrão semelhante. Por exemplo, se A, B e C representam cada um tipo de modificação ao nucleotídeo, o motivo alternante pode ser “ABABABABABAB…”, “AABBAABBAABB…”, “AABAABAABAAB…”, “AAABAAABAAAB…”, “AAABBBAAABBB…” ou “ABCABCABCABC…” etc.
[00247] O tipo de modificações contidas no motivo alternante pode ser igual ou diferente. Por exemplo, se A, B, C, D representam cada um tipo de modificação no nucleotídeo, o padrão alternante, ou seja, modificações a cada dois nucleotídeos, podem ser iguais, mas cada uma da fita sense ou fita antisense pode ser selecionada dentre diversas possibilidades de modificações dentro do motivo alternante tais como “ABABAB…”, “ACACAC…” “BDBDBD…” ou “CDCDCD…” etc.
[00248] Em uma modalidade, o agente RNAi da invenção compreende uma mudança no padrão de modificação para o motivo alternante na fita sense em relação ao padrão de modificação para o motivo alternante da fita antisense. A mudança pode ser tal que o grupo modificado de nucleotídeos da fita sense corresponde a um grupo modificado diferentemente de nucleotídeos da fita antisense e vice-versa. Por exemplo, a fita sense quando emparelhada com a fita antisense no duplex do dsRNA, o motivo alternante na fita sense pode começar com “ABABAB” a partir de 5’-3’ da fita e o motivo alternante na fita antisense pode começar com “BABABA” a partir de 5’-3’da fita dentro da região duplex. Como outro exemplo, o motivo alternante na fita
86 / 395 sense pode começar com “AABBAABB” a partir de 5’-3’ da fita e o motivo alternante na fita antisense pode começar com “BBAABBAA” a partir de 5’- 3’ da fita dentro da região duplex, de modo que há uma mudança completa ou parcial dos padrões de modificação entre a fita sense e a fita antisense.
[00249] Em uma modalidade, o agente RNAi compreende o padrão do motivo alternante da modificação 2’-O-metila e da modificação 2’-F na fita sense inicialmente tem uma mudança em relação ao padrão do motivo alternante da modificação 2’-O-metila e modificação 2’-F modificação na fita antisense inicialmente, ou seja, o nucleotídeo modificado com 2’-O-metila na fita sense emparelha a base com um nucleotídeo modificado com 2’-F na fita antisense e vice-versa. A posição 1 da fita sense pode começar com a modificação 2’-F e a posição 1 da fita antisense pode começar com a modificação 2’- O-metila.
[00250] A introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos à fita sense e/ou à fita antisense interrompe o padrão de modificação inicial presente na fita sense e/ou fita antisense. Essa interrupção do padrão de modificação da fita sense e/ou antisense pela introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos à fita sense e/ou antisense intensifica surpreendentemente a atividade de silenciamento gênico do gene alvo.
[00251] Em uma modalidade, quando o motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos é introduzido em qualquer uma das fitas, a modificação do nucleotídeo seguinte ao motivo é uma modificação diferente da modificação do motivo. Por exemplo, a porção da sequência contendo o motivo é “…NaYYYNb…”, onde “Y” representa a modificação do motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e “Na” e “Nb” representam uma modificação ao nucleotídeo seguinte ao motivo “YYY” que é diferente da modificação de Y, e em que Na e Nb podem ser
87 / 395 modificações iguais diferentes. Alternativamente, Na e/ou Nb podem estar presentes ou ausentes quando há uma modificação na forma de asa presente.
[00252] O agente RNAi pode compreender ainda pelo menos uma ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos. A modificação ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos pode ocorrer em qualquer nucleotídeo da fita sense ou da fita antisense ou em ambas as fitas em qualquer posição da fita. Por exemplo, a modificação da ligação entre nucleotídeos pode ocorrer em todo nucleotídeo na fita sense e/ou na fita antisense; cada modificação da ligação entre nucleotídeos pode ocorrer em padrão alternante na fita sense e/ou fita antisense; ou a fita sense ou fita antisense pode conter ambas as modificações de ligação entre nucleotídeos em padrão alternante. O padrão alternante da modificação da ligação entre nucleotídeos na fita sense pode ser igual ou diferente daquele da fita antisense, e o padrão alternante da modificação da ligação entre nucleotídeos na fita sense pode ter uma mudança em relação ao padrão alternante da modificação da ligação entre nucleotídeos na fita antisense. Em uma modalidade, um agente de RNAi de fita dupla compreende 6-8 ligações fosforotioato entre nucleotídeos. Em uma modalidade, a fita antisense compreende duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos no terminal 5’ e duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos no terminal 3’, e a fita sense compreende pelo menos duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos no terminal 5’ ou no terminal 3’.
[00253] Em uma modalidade, o RNAi compreende uma modificação de ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos na região da saliência. Por exemplo, a região da saliência pode conter dois nucleotídeos tendo uma ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre os dois nucleotídeos. Modificações na ligação entre nucleotídeos também podem ser feitas para ligar os nucleotídeos salientes com os nucleotídeos terminais pareados dentro da região duplex. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos os nucleotídeos da
88 / 395 saliência podem ser unidos através de ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos e, opcionalmente, pode haver ligações fosforotioato ou metilfosfonato adicionais entre nucleotídeos ligando o nucleotídeo da saliência com um nucleotídeo pareado que está ao lado do nucleotídeo saliente. Por exemplo, pode haver pelo menos duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dos dois três nucleotídeos são nucleotídeos salientes, e o terceiro é um nucleotídeo pareado ao lado do nucleotídeo da saliência. Esses três nucleotídeos terminais podem estar na extremidade 3’ da fita antisense, na extremidade 3’ da fita sense, na extremidade 5’ da fita antisense e/ou na extremidade 5’ da fita antisense.
[00254] Em uma modalidade, a saliência com 2 nucleotídeos é na extremidade 3’ da fita antisense, e há duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são nucleotídeos salientes, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo pareado ao lado do nucleotídeo da saliência. Opcionalmente, o agente RNAi pode ter adicionalmente duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais na extremidade 5’ da fita sense e na extremidade 5’ da fita antisense.
[00255] Em uma modalidade, o agente RNAi compreende erro(s) de emparelhamento com o alvo, dentro do duplex, ou combinações dos mesmos. O erro de emparelhamento pode ocorrer na região saliente ou na região duplex. O par de bases pode ser classificado com base na sua propensão para promover a dissociação ou fusão (p. ex., na energia livre de associação ou dissociação de um emparelhamento em particular, a abordagem mais simples é examinar os pares de par em par, embora a análise do vizinho próximo ou semelhante também possa ser utilizada). Em termos de promover dissociação: A:U é preferido em relação a G:C; G:U é preferido em relação a G:C; e I:C é preferido em relação G:C (I=inosina). Erros de emparelhamento, p. ex., emparelhamentos não canônicos ou outros não canônicos (como descritos em
89 / 395 outro lugar neste documento) são preferidos em relação aos emparelhamentos canônicos (A:T, A:U, G:C); e emparelhamentos que incluem uma base universal são preferidos em relação aos emparelhamentos canônicos.
[00256] Em uma modalidade, o agente RNAi compreende pelo menos um dentre os primeiros 1, 2, 3, 4, ou 5 pares de base dentro das regiões duplex a partir da extremidade 5’ da fita antisense independentemente selecionado dentro o grupo de: A:U, G:U, I:C e pares com erros de emparelhamento, p. ex., emparelhamentos não canônicos ou outros não canônicos ou emparelhamentos que incluem uma base universal, para promover a dissociação da fita antisense na extremidade 5’ do duplex.
[00257] Em uma modalidade, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ na fita antisense é selecionado a partir do grupo que consiste em A, dA, dU, U e dT. Alternativamente, pelo menos dentro o primeiro 1, 2 ou 3 par de bases dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ da fita antisense é um par de bases AU. Por exemplo, o primeiro par de bases dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ da fita antisense é um par de bases AU.
[00258] Em outra modalidade, o nucleotídeo na extremidade 3’ da fita sense é desoxi-timina (dT). Em outra modalidade, o nucleotídeo na extremidade 3’ da fita antisense é desoxi-timina (dT). Em uma modalidade, há uma sequência curta de nucleotídeos desoxi-timina, por exemplo, dois nucleotídeos dT na extremidade 3’ da fita sense e/ou antisense.
[00259] Em uma modalidade, a sequência da fita sense pode ser representada pela fórmula (I): 5’ np-Na-(XXX )i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ )j-Na-nq 3’ (I) em que: i e j são, cada um, independentemente 0 ou 1; p e q são, cada um, independentemente 0-6; cada Na representa independentemente uma sequência
90 / 395 oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados; cada np e nq representam independentemente um nucleotídeo saliente; em que Nb e Y não têm a mesma modificação; e XXX, YYY e ZZZ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. De preferência, YYY é todo de nucleotídeos modificados com 2’-F.
[00260] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreendem modificações de padrão alternante.
[00261] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre perto ou no sítio de clivagem da fita sense. Por exemplo, quando o agente RNAi tem uma região duplex de 17-23 nucleotídeos de comprimento, o motivo YYY pode ocorrer em ou nas vizinhanças do sítio de clivagem (p. ex.: pode ocorrer nas posições 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ou 11, 12, 13) da fita sense, a contagem iniciando desde o 1o nucleotídeo, a partir da extremidade 5’; ou, opcionalmente, a contagem iniciando no 1o nucleotídeo pareado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’.
[00262] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0, ou i é 0 e j é 1, ou i e j são ambos 1. A fita sense pode, portanto, ser representada pelas fórmulas seguintes: 5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib); 5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic); ou 5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id).
[00263] Quando a fita sense é representada pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-
91 / 395 4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2- 15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00264] Quando a fita sense é representada como fórmula (Ic), Nb representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2- 15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00265] Quando a fita sense é representada como fórmula (Id), cada Nb representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. De preferência, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Cada Na pode representar independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2- 15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00266] Cada X, Y e Z podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.
[00267] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e a fita sense pode ser representada pela fórmula: 5’ np-Na-YYY-na-nq 3’ (Ia).
[00268] Quando a fita sense é representada pela fórmula (Ia), cada Na pode representar independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00269] Em uma modalidade, a sequência da fita antisense do RNAi pode ser representada pela fórmula (II): 5’ nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’ 3’ (II) em que: k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; p’ e q’ são, cada um, independentemente 0-6; cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada
92 / 395 sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados; cada np’ e nq’ representam independentemente um nucleotídeo saliente; em que Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação; e X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00270] Em uma modalidade, o Na’ e/ou Nb’ compreendem modificações de padrão alternante.
[00271] O motivo Y’Y’Y’ ocorre perto ou no sítio de clivagem da fita antisense. Por exemplo, quando o agente RNAi tem uma região duplex de 17- 23 nucleotídeos de comprimento, o motivo Y’Y’Y’ pode ocorrer nas posições 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 ; ou 13, 14, 15 da fita antisense, com a contagem iniciando desde o 1o nucleotídeo, a partir da extremidade 5’; ou opcionalmente, a contagem iniciando no 1o nucleotídeo pareado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’. De preferência, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12, 13.
[00272] Em uma modalidade, o motivo Y’Y’Y’ é todo de nucleotídeos modificados com 2’-OMe.
[00273] Em uma modalidade, k é 1 e l é 0, ou k é 0 e l é 1, ou k e l são ambos 1.
[00274] A fita antisense pode, portanto, ser representada pelas fórmulas seguintes: 5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb); 5’ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc); ou 5’ nq’-Na’- Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId).
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[00275] Quando a fita antisense é representada pela fórmula (IIb), Nb’ representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2- 15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00276] Quando a fita antisense é representada como fórmula (IIc), Nb’ representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2- 15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00277] Quando a fita antisense é representada como fórmula (IId), cada Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. De preferência, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00278] Em outras modalidades, k é 0 e l é 0 e a fita antisense pode ser representada pela fórmula: 5’ np’-Na’-Y’Y’Y’-na’-nq’ 3’ (Ia).
[00279] Quando a fita antisense é representada como fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00280] Cada X’, Y’ e Z’ podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.
[00281] Cada nucleotídeo da fita sense e da fita antisense pode ser modificada independentemente com LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2’- metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’-hidroxila ou 2’-fluoro. Por exemplo, cada nucleotídeo da fita sense e da fita antisense é modificado independentemente com 2’-O-metila ou 2’-fluoro. Cada X, Y, Z, X’, Y’ e Z’,
94 / 395 em particular, pode representar uma modificação 2’-O-metila ou uma modificação 2’-fluoro.
[00282] Em uma modalidade, a fita sense do agente RNAi pode conter o motivo YYY nas posições 9, 10 e 11 posições da fita quando a região duplex tem 21 nt, a contagem iniciando desde o 1o nucleotídeo a partir da extremidade 5’, ou opcionalmente, a contagem iniciando no 1o nucleotídeo pareado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’; e Y representa uma modificação 2’-F. A fita sense pode conter adicionalmente um motivo XXX ou motivos ZZZ como modificações na forma de asa na extremidade oposta da região duplex; e cada XXX e ZZZ representa independentemente uma modificação 2’-OMe ou uma modificação 2’-F.
[00283] Em uma modalidade, a fita antisense pode conter o motivo Y’Y’Y’ nas posições 11, 12, 13 da fita, a contagem iniciando desde o 1o nucleotídeo a partir da extremidade 5’, ou opcionalmente, a contagem iniciando no 1o nucleotídeo pareado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’; e Y’ representa uma modificação 2’-O-metila. A fita antisense pode conter ainda um motivo X’X’X’ ou motivos Z’Z’Z’ como modificações na forma de asa na extremidade oposta da região duplex; e cada X’X’X’ e Z’Z’Z’ representa independentemente uma modificação 2’-OMe ou uma modificação 2’-F.
[00284] A fita sense representada por qualquer uma das formulas (Ia), (Ib), (Ic) e (Id) acima forma um duplex com uma fita antisense sendo representada por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) e (IId), respectivamente.
[00285] Consequentemente, os agentes RNAi para uso nos métodos da invenção podem compreender uma fita sense e uma fita antisense, cada fita tendo 14 a 30 nucleotídeos, o duplex RNAi representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-na-(XXX)i-nb-YYY-Nb -(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-
95 / 395 Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; p, p’, q e q’ são, cada um, independentemente 0-6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados; em que cada np’, np, nq’ e nq, os quais podem, cada um, estar presentes ou não, representa independentemente um nucleotídeo saliente; e XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00286] Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou i e j são ambos 0; ou i e j são ambos 1. Em outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou k e l são ambos 0; ou k e l são ambos 1.
[00287] Combinações exemplares da fita sense e da fita antisense que formam um duplex de RNAi incluem as fórmulas abaixo:
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[00288] Quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00289] Quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1-10, 1-7, 1-5 ou 1-4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00290] Quando o agente RNAi é representado como fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00291] Quando o agente RNAi é representada como fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’, Nb e Nb’ compreende independentemente modificações de padrão alternante.
[00292] Cada X, Y e Z nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId) pode ser igual ou diferente um do outro.
[00293] Quando o agente RNAi é representado pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Y pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Y’ nucleotídeos. Alternativamente,
97 / 395 pelo menos dois dos nucleotídeos Y formam pares de bases com os nucleotídeos Y’ correspondentes; ou todos os três nucleotídeos Y formam pares de bases com os nucleotídeos Y’ correspondentes.
[00294] Quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIIb) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Z’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Z formam pares de bases com os nucleotídeos Z’ correspondentes; ou todos os três nucleotídeos Z formam pares de bases com os nucleotídeos Z’ correspondentes.
[00295] Quando o agente RNAi é representado como fórmula (IIIc) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos X pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos X’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos X formam pares de bases com os nucleotídeos X’ correspondentes; ou todos os três nucleotídeos X formam pares de bases com os nucleotídeos X’ correspondentes.
[00296] Em uma modalidade, a modificação no nucleotídeo Y é diferente da modificação no nucleotídeo Y’, a modificação no nucleotídeo Z é diferente da modificação no nucleotídeo Z’ e/ou a modificação no nucleotídeo X é diferente da modificação no nucleotídeo X’.
[00297] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00298] Em uma modalidade, quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações em Na são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro. Em outra modalidade, quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações em Na são modificações 2’-O-metila ou 2’- fluoro e np’>0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato. Em ainda outra modalidade, quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações em Na são
98 / 395 modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro, np’>0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato e a fita sense é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker (descrito abaixo) ramificado bivalente ou trivalente. Em outra modalidade, quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações em Na são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro, np’>0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato e a fita sense é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado bivalente ou trivalente.
[00299] Em uma modalidade, quando o agente RNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações em Na são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro, np’>0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato, a fita sense compreende pelo menos uma ligação fosforotioato e a fita sense é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado bivalente ou trivalente.
[00300] Em uma modalidade, o agente RNAi é um multímero contendo pelo menos dois duplex representados pelas fórmulas (III0. (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), em que os duplex são conectados por um linker. O linker pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o múltimero compreende ainda um ligante. Cada um dos duplex pode atingir o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplex pode atingir o mesmo gene em dois sítios alvos diferentes.
[00301] Em uma modalidade, o agente RNAi é um multímero contendo três, quatro, cinco, seis ou mais duplex representados pelas fórmulas (III0. (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), em que os duplex são conectados por um linker. O linker pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o múltimero compreende ainda um ligante. Cada um dos duplex pode atingir o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplex pode atingir o
99 / 395 mesmo gene em dois sítios alvos diferentes.
[00302] Em uma modalidade, dois agentes RNAi, representados pelas fórmulas (III0. (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), são ligados um ao outro na extremidade 5’, e uma ou ambas as extremidades são conjugadas opcionalmente a um ligante. Cada um dos agentes pode atingir o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplex pode atingir o mesmo gene em dois sítios alvos diferentes.
[00303] Em certas modalidades, um agente RNAi da invenção pode conter um número baixo de nucleotídeos contendo uma modificação 2’- fluoro, p. ex., 10 ou menos nucleotídeos com modificação 2’-fluoro. Por exemplo, o agente RNAi pode conter 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro. Em uma modalidade específica, o agente RNAi da invenção contém 10 nucleotídeos com uma modificação 2’- fluoro, p. ex., 4 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro na fita sense e 6 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro na fita antisense. Em outra modalidade específica, o agente RNAi da invenção contém 6 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro, p. ex., 4 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro na fita sense e 2 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro na fita antisense.
[00304] Em outras modalidades, um agente RNAi da invenção pode conter um número ultra baixo de nucleotídeos contendo uma modificação 2’- fluoro, p. ex., 2 ou menos nucleotídeos contendo uma modificação 2’-fluoro. Por exemplo, o agente RNAi pode conter 2, 1 ou 0 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro. Em uma modalidade específica, o agente RNAi pode conter 2 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro, p. ex., 0 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro na fita sense e 2 nucleotídeos com uma modificação 2’-fluoro na fita antisense.
[00305] Várias publicações descrevem agentes RNAi multiméricos que podem ser usados nos métodos da invenção. Tais publicações incluem
100 / 395 WO2007/091269, Patente U.S. No 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 e WO2011/031520, cujos conteúdos são aqui incorporado por referência.
[00306] Como descrito mais detalhadamente abaixo, o agente RNAi que contém conjugações de um ou mais porções carboidrato com um agente RNAi pode otimizar uma ou mais propriedades do agente RNAi. Em muitos casos, a porção carboidrato será anexada a uma subunidade modificada do agente RNAi. Por exemplo, o açúcar ribose de uma ou mais subunidades de ribonucleotídeos de um agente dsRNA pode ser substituído por outra porção, p. ex., um carreador não carboidrato (de preferência cíclico) ao qual é anexada um ligante carboidrato. Uma subunidade de ribonucleotídeos, na qual o açúcar ribose da subunidade foi assim substituído, é aqui referido como uma subunidade com modificação por substituição da ribose (RRMS). Um carreador cíclico pode ser um sistema de anel carbocíclicos, ou seja, todos os átomos do anel são átomos de carbono, ou um sistema de anel heterocíclico, ou seja, um ou mais átomos do anel podem ser um heteroátomo, p. ex., nitrogênio, oxigênio, enxofre. O carreador cíclico pode ser um sistema de anel monocíclico ou pode conter dois ou mais anéis, p. ex. anéis fundidos. O carreador cíclico pode ser um sistema de anel totalmente saturado, ou pode conter uma ou mais ligações duplas.
[00307] O ligante pode ser anexado ao polinucleotídeo através de um carreador. Os carreadores incluem (i) pelo menos um “ponto de ligação à cadeia principal”, de preferência dois “pontos de ligação à cadeia principal” e (ii) pelo menos um “ponto de ligação tethering (para amarração)”. Um “ponto de ligação à cadeia principal”, neste relatório descritivo, refere-se a um grupo funcional, p. ex., um grupo hidroxila ou, geralmente, uma ligação disponível e que é adequada para incorporação do carreador na cadeia principal, p. ex., o fosfato, o fosfato modificado, p. ex., cadeia principal contendo enxofre de um ácido ribonucleico. Um “ponto de ligação tethering” (TAP), em algumas
101 / 395 modalidades, refere-se a um átomo constituinte do anel do carreador cíclico, p. ex., um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que fornece um ponto de ligação à cadeia principal), que conecta uma porção selecionada. A porção pode ser, p. ex., um carboidrato, p. ex., um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo e polissacarídeo. Opcionalmente, a porção selecionada é conectada por um tether (tirante) ao carreador cíclico. Assim, o carreador cíclico frequentemente incluirá um grupo funcional, p. ex., um grupo amino ou, geralmente, fornecerá uma ligação que é adequada para incorporação ou tethering de outra entidade química, p. ex., um ligante ao anel constituinte.
[00308] Os agentes RNAi podem ser conjugados a um ligante através de um carreador, em que o carreador pode ser um grupo cíclico ou grupo acíclico; de preferência, o grupo cíclico é selecionado dentre pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila e decalina; de preferência, o grupo acíclico é selecionado dentre cadeia principal de serinol e cadeia principal de dietanolamina.
[00309] Em outra modalidade da invenção, um agente iRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense, cada uma com 14 a 40 nucleotídeos. O agente RNAi pode ser representado pela fórmula (L):
[00310] Na fórmula (L), B1, B2, B3, B1’, B2’, B3’ e B4’ são cada um independentemente um nucleotídeo contendo uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em 2’-O-alquila, alcóxi 2’-substituído, alquila 2’-
102 / 395 substituído, 2’-halo, ENA e BNA/LNA. Em certas modalidades, B1, B2, B3, B1’, B2’, B3’ e B4’ contêm cada um modificações 2’-OMe. Em certas modalidades, Em certas modalidades, B1, B2, B3, B1’, B2’, B3’ e B4’ contêm cada um modificações2’-OMe ou 2’-F. Em certas modalidades, pelo menos um dentre B1, B2, B3, B1’, B2’, B3’ e B4’ contém uma modificação 2’-O-N-etilacetamido (2’-O-NMA).
[00311] C1 é um nucleotídeo termicamente desestabilizador, colocado em um local oposto à região semente da fita antisense (ou seja, nas posições 2-8 da extremidade 5’ da fita antisense). Por exemplo, C1 está em uma posição na fita sense que emparelha com um nucleotídeo nas posições 2-8 da extremidade 5’ da fita sense. O nucleotídeo C1 carrega a modificação termicamente desestabilizadora que pode incluir uma modificação abásica; erro de emparelhamento com o nucleotídeo oposto no duplex; e modificação no açúcar tal como modificação 2’-desóxi ou nucleotídeo acíclico, p. ex., ácidos nucleicos não bloqueados (UMA) ou ácido nucleico com glicerol (GNA). Em certas modalidades, C1 possui uma modificação termicamente desestabilizadora selecionada a partir do grupo que consiste em: 1) erro de emparelhamento com o nucleotídeo oposto na fita antisense; ii) modificação abásica selecionada a partir do grupo que consiste em: e iii) modificação no açúcar selecionada a partir do grupo que consiste em: 2’-desóxi e
103 / 395 , em que B é uma nucleobase modificada ou não modificada, R1 e R2 são independentemente H, halogênio, OR3 ou alquila; e R3 é H, alquila, cicloalquila, arila, arilalquila, heteroarila ou açúcar. Em certas modalidades, a modificação termicamente desestabilizadora em C1 é um erro de emparelhamento selecionado a partir do grupo que consiste em G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T e U:T; e opcionalmente, pelo menos uma nucleobase no par do erro de emparelhamento é uma nucleobase 2’-desoxi. Em um exemplo, a modificação termicamente desestabilizadora em C1 é GNA ou
[00312] T1, T1’, T2’ e T3’ representam, cada um, independentemente um nucleotídeo compreendendo uma modificação que fornece ao nucleotídeo um volume estérico que é igual ou inferior ao volume estérico de uma modificação 2’-OMe. Volume estérico refere-se à soma de efeitos estéricos de uma modificação. Métodos para determinar os efeitos estéricos de uma modificação de um nucleotídeo são conhecidos pelo técnico no assunto. A modificação pode ser na posição 2’ de um açúcar ribose do nucleotídeo, ou uma modificação a um nucleotídeo não ribose, nucleotídeo acíclico, ou a cadeia principal do nucleotídeo que é semelhante ou equivalente à posição 2’ position do açúcar ribose, e fornece ao nucleotídeo um volume estérico que é inferior ou igual ao volume estérico de uma modificação 2’-OMe. Por exemplo, T1, T1’, T2’ e T3’ são, cada um, independentemente selecionados dentre DNA, RNA, LNA, 2’-F e 2’-F-5’-metila. Em certas modalidades, T1 é DNA. Em certas modalidades, T1’ é DNA, RNA ou LNA. Em certas modalidades, T2’ é DNA ou RNA. Em certas modalidades, T3’ é DNA ou
104 / 395 RNA.
[00313] n1, n3 e q1 têm independentemente 4 a 15 nucleotídeos de comprimento.
[00314] n5, q3 e q7 têm independentemente 1-6 nucleotídeos de comprimento.
[00315] n4, q2 e q6 têm independentemente 1-3 nucleotídeos de comprimento; alternativamente, n4 é 0.
[00316] q5 tem independentemente 0-10 nucleotídeos de comprimento.
[00317] n2 e q4 têm independentemente 0-3 nucleotídeos de comprimento.
[00318] Alternativamente, n4 tem 0-3 nucleotídeos de comprimento.
[00319] Em certas modalidades, n4 pode ser 0. Em um exemplo, n4 é 0, e q2 e q6 são 1. Em outro exemplo, n4 é 0, e q2 e q6 são 1, com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos na posição 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00320] Em certas modalidades, n4, q2 e q6 são 1.
[00321] Em certas modalidades, n2, n4, q2, q4 e q6 são 1.
[00322] Em certas modalidades, C1 está na posição 14-17 da extremidade 5’ da fita sense, quando a fita sense tem 19-22 nucleotídeos de comprimento, e n4 é 1. Em certas modalidades, C1 está na posição 15 da extremidade 5’ da fita sense
[00323] Em certas modalidades, T3’ inicia na posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T3’ está na posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q6 é igual a 1.
[00324] Em certas modalidades, T1’ inicia na posição 14 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T1’ está na posição 14 a
105 / 395 partir da extremidade 5’ da fita antisense e q2 é igual a 1.
[00325] Em uma modalidade exemplar, T3’ inicia desde a posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e T1’ inicia desde a posição 14 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T3’ inicia desde a posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q6 é igual a 1, e T1’ inicia desde a posição 14 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q2 é igual a 1.
[00326] Em certas modalidades, T1’ e T3’ são separados por 11 nucleotídeos de comprimento (ou seja, não contando os nucleotídeos de T1’ e T3’).
[00327] Em certas modalidades, T1’ está na posição 14 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T1’ está na posição 14 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q2 é igual a 1, e a modificação na posição 2’ ou em posições em uma cadeia principal sem ribose, acíclica ou que que fornece menos volume estérico do que uma ribose 2’-OMe.
[00328] Em certas modalidades, T3’ está na posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T3’ está na posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q6 é igual a 1, e a modificação na 2’ position ou em posições em uma cadeia principal sem ribose, acíclica ou que fornece volume estérico inferior ou igual ao de uma ribose 2’-OMe.
[00329] Em certas modalidades, T1 está no sítio de clivagem da fita sense. Em um exemplo, T1 está na posição 11 a partir da extremidade 5’ da fita sense, quando a fita sense tem 19-22 nucleotídeos de comprimento e n2 é
1. Em uma modalidade exemplar, T1 está no sítio de clivagem da fita sense na posição 11 a partir da extremidade 5’ da fita sense, quando a fita sense tem 19-22 nucleotídeos de comprimento e n2 é 1, Em certas modalidades, T2’ inicia na posição 6 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T2’ está nas posições 6-10 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q4 é 1.
106 / 395
[00330] Em uma modalidade exemplar, T1 está no sítio de clivagem da fita sense, por exemplo, na posição 11 a partir da extremidade 5’ da fita sense, quando a fita sense tem 19-22 nucleotídeos de comprimento e n2 é 1; T1’ está na posição 14 a partir da extremidade 5’ da fita antisense, e q2 é igual a 1, e a modificação a T1’ é na posição 2’ de um açúcar ribose ou em posições em uma cadeia principal sem ribose, acíclica ou que fornece menos volume estérico do que uma ribose 2’-OMe; T2’ está nas posições 6-10 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q4 é 1; e T3’ está na posição 2 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q6 é igual a 1, e a modificação a T3’ é na posição 2’ ou em posições em uma cadeia principal sem ribose, acíclica ou que fornece volume estérico inferior ou igual ao de uma ribose 2’-OMe.
[00331] Em certas modalidades, T2’ inicia na posição 8 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T2’ inicia na posição 8 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q4 é 2.
[00332] Em certas modalidades, T2’ inicia na posição 9 a partir da extremidade 5’ da fita antisense. Em um exemplo, T2’ está na posição 9 a partir da extremidade 5’ da fita antisense e q4 é 1.
[00333] Em certas modalidades, B1’ é 2’-OMe ou 2’-F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 1, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 6, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00334] Em certas modalidades, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’- OMe ou 2’-F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 1, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 6, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos
107 / 395 dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00335] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1.
[00336] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00337] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 6, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 7, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1.
[00338] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 6, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 7, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense),
108 / 395 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00339] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 1, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 6, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1.
[00340] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 1, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 6, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00341] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 5, T2’ é 2’-F, q4 é 1, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; opcionalmente com pelo menos 2 TT adicionais na extremidade 3’ da fita antisense.
[00342] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 5, T2’ é 2’-F, q4 é 1, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; opcionalmente com pelo menos 2 TT adicionais na extremidade 3’ da fita
109 / 395 antisense; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00343] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1.
[00344] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’).
[00345] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1.
[00346] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas
110 / 395 modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00347] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1.
[00348] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense).
[00349] O agente RNAi pode compreender um grupo contendo fósforo na extremidade 5’ da fita sense ou da fita antisense. O grupo contendo fósforo na extremidade 5’ pode ser fosfato na extremidade 5’ (5’-P), fosforotioato na extremidade 5’ (5’-PS), fosforoditioato na extremidade 5’ (5’-PS2), vinilfosfonato na extremidade 5’ (5’-VP), metilfosfonato na extremidade 5’ (MePhos) ou 5’-desoxi-5’-C-malonila ( ). Quando o um grupo contendo fósforo na extremidade 5’ é vinilfosfonato na extremidade 5’ (5’-VP), o 5’-VP pode ser isômero 5’-E-VP ( ou seja, trans-vinilfosfato,
111 / 395 ), isômero 5’-Z-VP ( ou seja, cis-vinilfosfato, ), ou misturas dos mesmos.
[00350] Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um grupo contendo fósforo na extremidade 5’ da fita sense. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um grupo contendo fósforo na extremidade 5’ da fita antisense.
[00351] Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-P. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-P na fita antisense.
[00352] Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-PS. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-PS na fita antisense.
[00353] Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’- VP. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-VP na fita antisense. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-E-VP na fita antisense. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’- Z-VP na fita antisense.
[00354] Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’- PS2. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-PS2 na fita antisense.
[00355] Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’- PS2. Em certas modalidades, o agente RNAi compreende um 5’-desoxi-5’-C- malonila na fita antisense.
[00356] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O
112 / 395 agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00357] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00358] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’-E-VP, 5’-Z- VP ou uma combinação dos mesmos.
[00359] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00360] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00361] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1
113 / 395 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00362] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00363] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’- E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00364] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das
114 / 395 posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00365] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00366] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00367] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente dsRNA também compreende 5’-PS.
[00368] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente
115 / 395 RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’-E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00369] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00370] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00371] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00372] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas
116 / 395 modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00373] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’-E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00374] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00375] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições
117 / 395 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00376] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00377] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00378] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’-E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00379] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente dsRNA de RNA também compreende 5’-PS2.
[00380] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2,
118 / 395 B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00381] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00382] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00383] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e
119 / 395 duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’- E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00384] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00385] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00386] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-P.
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[00387] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00388] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’-E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00389] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00390] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1. O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00391] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das
121 / 395 posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-P.
[00392] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS.
[00393] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-VP. O 5’-VP pode ser 5’- E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos.
[00394] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas
122 / 395 modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS2.
[00395] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila.
[00396] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-P e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-P está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00397] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2,
123 / 395 B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00398] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-VP (p. ex., a 5’-E-VP, 5’- Z-VP ou uma combinação dos mesmos), e um ligante de direcionamento.
[00399] Em certas modalidades, o 5’-VP está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00400] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense),
124 / 395 duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS2 e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS2 está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00401] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-desoxi-5’-C- malonila está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00402] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi
125 / 395 também compreende 5’-P e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-P está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00403] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-PS e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00404] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-VP (p. ex., a 5’-E-VP, 5’-Z-VP ou uma combinação dos mesmos) e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’- VP está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00405] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F,
126 / 395 n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-PS2 e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS2 está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00406] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-OMe e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-desoxi-5’-C-malonila está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00407] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições
127 / 395 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-P e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-P está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00408] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00409] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita
128 / 395 antisense). O agente RNAi também compreende 5’-VP (p. ex., a 5’-E-VP, 5’- Z-VP ou uma combinação dos mesmos) e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-VP está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00410] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS2 e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS2 está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00411] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, T2’ é 2’-F, q4 é 2, B3’ é 2’-OMe ou 2’-F, q5 é 5, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-desoxi-5’-C- malonila está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de
129 / 395 direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00412] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-P e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-P está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00413] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00414] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’-
130 / 395 OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-VP (p. ex., a 5’-E-VP, 5’- Z-VP ou uma combinação dos mesmos) e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-VP está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00415] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-PS2 e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-PS2 está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00416] Em certas modalidades, B1 é 2’-OMe ou 2’-F, n1 é 8, T1 é 2’F, n2 é 3, B2 é 2’-OMe, n3 é 7, n4 é 0, B3 é 2’-OMe, n5 é 3, B1’ é 2’-OMe ou 2’- F, q1 é 9, T1’ é 2’-F, q2 é 1, B2’ é 2’-OMe ou 2’-F, q3 é 4, q4 é 0, B3’ é 2’- OMe ou 2’-F, q5 é 7, T3’ é 2’-F, q6 é 1, B4’ é 2’-F e q7 é 1; com duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 1-5 da fita sense (contando a partir da extremidade 5’ da fita sense), duas
131 / 395 modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação fosforotioato entre nucleotídeos dentro das posições 18-23 da fita antisense (contando a partir da extremidade 5’ da fita antisense). O agente RNAi também compreende 5’-desoxi-5’-C-malonila e um ligante de direcionamento. Em certas modalidades, o 5’-desoxi-5’-C- malonila está na extremidade 5’ da fita antisense, e o ligante de direcionamento está na extremidade 3’ da fita sense.
[00417] Em uma modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; e (iii) modificações 2’-F nas posições 1, 3, 5, 7, 9 a 11, 13, 17, 19 e 21, e modificações 2’-OMe nas posições 2, 4, 6, 8, 12, 14 a 16, 18 e 20 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3, 5, 9, 11 a 13, 15, 17, 19, 21 e 23, modificações 2’F nas posições 2, 4, 6 a 8, 10, 14, 16, 18, 20 e 22 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes dsRNA têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense, e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
132 / 395
[00418] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-F nas posições 1, 3, 5, 7, 9 a 11, 13, 15, 17, 19 e 21, e modificações 2’-OMe nas posições 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18 e 20 (contando a partir da extremidade 5’); e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 13, 15, 17, 19 e 21 a 23, modificações 2’F nas posições 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, e 20 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00419] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo:
133 / 395 (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1 a 6, 8, 10 e 12 a 21, modificações 2’-F nas posições 7 e 9 e um desoxinucleotídeo (p. ex., dT) na posição 11 (contando a partir da extremidade 5’); e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 a 23 e modificações 2’-F nas posições 2, 4 a 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00420] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através
134 / 395 de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1 a 6, 8, 10, 12, 14 e 16 a 21 e modificações 2’-F nas posições 7, 9, 11, 13 e 15; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 a 23, e modificações 2’-F nas posições 2 a 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00421] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1 a 9 e 12 a 21 e modificações 2’-F nas posições 10 e 11; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1
135 / 395 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 13, 15, 17, 19 e 21 a 23 e modificações 2’-F nas posições 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 e 20 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00422] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-F nas posições 1, 3, 5, 7, 9 a 11 e 13 e modificações 2’-OMe nas posições 2, 4, 6, 8, 12 e 14 a 21; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo:
136 / 395 (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3, 5 a 7, 9, 11 a 13, 15, 17 a 19 e 21 a 23 e modificações 2’-F nas posições 2, 4, 8, 10, 14, 16 e 20 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agente RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense, e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00423] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 15, 17 e 19 a 21 e modificações 2’-F nas posições 3, 5, 7, 9 a 11, 13, 16 e 18; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 25 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 4, 6, 7, 9, 11 a 13, 15, 17 e 19 a 23, modificações 2’-F nas posições 2, 3, 5, 8, 10, 14, 16 e 18 e
137 / 395 desoxinucleotídeos (p. ex., dT) nas posições 24 e 25 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de quatro nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00424] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1 a 6, 8 e 12 a 21 e modificações 2’-F nas posições 7 e 9 a 11; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3 a 5, 7, 8, 10 a 13, 15 e 17 a 23 e modificações 2’-F nas posições 2, 6, 9, 14 e 16 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das
138 / 395 posições 21 e 22 e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00425] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1 a 6, 8 e 12 a 21 e modificações 2’-F nas posições 7 e 9 a 11; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3 a 5, 7, 10 a 13, 15 e 17 a 23 e modificações 2’-F nas posições 2, 6, 8, 9, 14 e 16 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 21 e 22, e entre os nucleotídeos das posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense, e uma extremidade cega na
139 / 395 extremidade 5’ da fita antisense.
[00426] Em outra modalidade em particular, um agente RNAi da presente invenção compreende: (a) uma fita sense tendo: (i) um comprimento de 19 nucleotídeos; (ii) um ligante ASGPR anexado à extremidade 3’, em que o dito ligante ASGPR compreende três derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado trivalente; (iii) modificações 2’-OMe nas posições 1 a 4, 6 e 10 a 19 e modificações 2’-F nas posições 5 e 7 a 9; e (iv) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2 e entre os nucleotídeos das posições 2 e 3 (contando a partir da extremidade 5’); e (b) uma fita antisense tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) modificações 2’-OMe nas posições 1, 3 a 5, 7, 10 a 13, 15 e 17 a 21 e modificações 2’-F nas posições 2, 6, 8, 9, 14 e 16 (contando a partir da extremidade 5’); e (iii) ligações fosforotioato entre os nucleotídeos das posições 1 e 2, entre os nucleotídeos das posições 2 e 3, entre os nucleotídeos das posições 19 e 20 e entre os nucleotídeos das posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5’); em que os agentes RNAi têm uma saliência de dois nucleotídeos na extremidade 3’ da fita antisense e uma extremidade cega na extremidade 5’ da fita antisense.
[00427] Em certas modalidades, o iRNA para uso nos métodos da invenção é um agente selecionado dentre os agentes listados nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13. Em uma modalidade, o agente é AD-288917. Em outra
140 / 395 modalidade, o agente é AD-288996. Em outra modalidade, o agente é AD-
413639. Em uma modalidade, o agente é AD-413644. Em outra modalidade, o agente é AD-413669. Esses agentes podem compreender ainda um ligante. IV. iRNAs conjugados a Ligantes
[00428] Outra modificação do RNA de um iRNA da invenção envolve ligar quimicamente ao RNA um ou mais ligantes, porções ou conjugados que intensificam a atividade, a distribuição celular ou a absorção celular do iRNA. Tais porções incluem, entre outras, porções lipídicas tais como uma porção colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6553- 6556), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060), um tioéter, p. ex., beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309; Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3:2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538), uma cadeia alifática, p. ex., dodecanodiol ou resíduos undecila (Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J, 10:1111-1118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75:49-54), um fosfolipídio, p. ex., di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2- di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18:3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651- 3654), uma porção palmitila (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta,1264:229-237) ou uma porçãon octadecilamina ou hexilamino- carboniloxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937).
[00429] Em uma modalidade, um ligante altera a distribuição, direcionamento ou vida útil de um agente iRNA no qual está incorporado. Em modalidades preferidas, um ligante aumenta a afinidade por um alvo
141 / 395 selecionado, p. ex., molécula, célula ou tipo celular, compartimento, p. ex., um compartimento celular ou orgânico, tecido, órgão região do corpo, em comparação, p. ex., a uma espécie sem tal ligante. Ligantes preferidos não farão parte de emparelhamento de duplex em um ácido nucleico duplex.
[00430] Os ligantes pode incluir uma substância natural, tal como um proteína (p. ex., albumina sérica humana (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou globulina); carboidrato (p. ex., um dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina, N-acetilglicosamina, N- acetilgalactosamina ou ácido hialurônico); ou um lipídio. O ligante pode também ser uma molécula recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, p. ex., um poliaminoácido. Os exemplos de poliaminoácidos incluem polilisina (PLL), poli ácido L-aspártico, poli ácido L-glutâmico, ácido amínico, copolímero de estireno-anidrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactídeo-co-glicolídeo), copolímero de éter divinílico-anidrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenoglicol (PEG), álcool polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2- etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida ou polifosfazina. Os exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimético, poliamina dendrímero, arginina, amidina, protamina, lipídio catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina ou peptídeo alfa-helicoidal.
[00431] Os ligantes podem também incluir grupos de direcionamento, p. ex., um agente de direcionamento para uma célula ou tecido, p. ex., uma lectina, glicoproteína, lipídio ou proteína, p. ex., um anticorpo, que se liga a um tipo específico de célula, tal como uma célula renal. Um grupo de direcionamento pode ser uma tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensoativa, carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-
142 / 395 glicosamina-manose multivalente, fucose multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídio, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina ou um peptídeo RGD ou mimético de peptídeo RGD.
[00432] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercaladores (p. ex., acridinas), reticulantes (p. ex., psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (p. ex., fenazina, dihidrofenazina), endonucleases artificiais (p. ex., EDTA), moléculas lipofílicas, p. ex., colesterol, ácido cólico, ácido acético adamantano, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico dimetoxitritila ou fenoxazina) e peptídeos conjugados (p. ex., Antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ex., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituído, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ex., biotina), facilitadores de transporte/absorção (p. ex., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (p. ex., imidazol, bisimidazol, histamina, agrupamentos de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complexos Eu3+ de tetra-azamacrociclos), dinitrofenila, HRP ou AP.
[00433] Os ligantes podem ser proteínas, p. ex., glicoproteínas ou peptídeos, p. ex., moléculas tendo uma afinidade específica por um co-ligante, ou anticorpos, p. ex., um anticorpo que se liga a um tipo celular especificado, tal como uma célula hepática. Os ligantes pode também incluir hormônios e receptores hormonais. Pode igualmente incluir espécies não peptídicas, tais como lipídios, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-a N-acetil-glicosamina-manose
143 / 395 multivalente ou fucose multivalente. O ligante pode ser, por exemplo, a lipopolissacarídeo, um ativador de p38 MAP quinase ou um ativador de NF- κB.
[00434] O ligante ser uma substância, p. ex., um fármaco, que pode aumentar a absorção do agente iRNA pela célula, por exemplo, ao romper o citoesqueleto da célula, p. ex., ao romper os microtúbulos da célula, microflamentos e/ou filamentos intermediários. O fármaco pode ser, por exemplo, táxon, vincristina, vimblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolídeo, latrunculina A, faloidina, swinholídeo A, indanocina ou mioservina.
[00435] Em algumas modalidades, um ligante anexado a um iRNA, como aqui descrito, atua como um modulador farmacêutico (modulador PK). Os moduladores PK incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídio, peptídeos, agentes de ligação a proteínas, PEG, vitaminas etc. Os moduladores PK exemplares incluem, entre outros, colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicerídeos, diacilglicerídeo, fosfolipídios, esfingolipídios, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina etc. Oligonucleotídeos que compreendem diversas ligações fosforotioato são também conhecidos por se ligarem à proteína sérica, assim, oligonucleotídeos curtos, p. ex., oligonucleotídeos com aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas ligações fosforotioato na cadeira principal são também acessíveis para a presente invenção as ligantes (p. ex., como ligantes moduladores PK). Além disso, aptâmeros que se ligam a componentes séricos (p. ex., proteínas séricas) são também adequados para uso como ligantes moduladores PK nas modalidades aqui descritas.
[00436] Oligonucleotídeos conjugados a ligantes da invenção podem ser sintetizados pelo uso de um oligonucleotídeo que carrega uma funcionalidade reativa pendente, tal como aquele derivado do acoplamento de uma molécula de ligação ao oligonucleotídeo (descrita abaixo). Esse
144 / 395 oligonucleotídeo reativo pode ser reagido diretamente com ligantes disponíveis comercialmente, ligantes que são sintetizados portadores de qualquer um de uma variedade de grupos protetores ou ligantes que têm uma porção de ligação anexada ao mesmos.
[00437] Os oligonucleotídeos usados nos conjugados da presente invenção podem ser preparados de modo conveniente e rotineiro através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para tal síntese é vendido por diversos fornecedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Qualquer outro meio para tal síntese conhecido na técnica pode ser além de ou alternativamente empregado. É igualmente conhecido o uso de técnicas semelhantes para preparar outros oligonucleotídeos, tais como os derivados com fosforotioatos e alquilados.
[00438] Nos oligonucleotídeos conjugados ao ligante e molécula de ligante carregando nucleosídeos ligados de sequência específica da presente invenção, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado utilizando precursores padrão dos nucleotídeos ou nucleosídeos, ou precursores conjugados dos nucleotídeos ou nucleosídeos que já carregam a porção de ligação, precursores do conjugado ligante-nucleotídeo ou nucleosídeo que já carregam a molécula do ligante ou blocos de construção não carregando o ligante do nucleosídeo.
[00439] Quando se usam precursores do conjugado ao nucleotídeo que já carregam uma porção de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados de sequência específica é tipicamente concluída, e a molécula do ligante é então reagida com a porção de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado ao ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleosídeos ligados da presente invenção são sintetizados por um sintetizador automático usando fosforamiditas derivadas de conjugados ligante-nucleosídeo além das fosforamiditas padrão e fosforamiditas não padrão que estão disponíveis comercialmente e são usadas rotineiramente na síntese de oligonucleotídeos.
145 / 395 A. Lipídios conjugados
[00440] Em uma modalidade, o ligante ou conjugado é um lipídio ou uma molécula à base de lipídio. Tal lipídio ou molécula à base de lipídio de preferência liga-se a uma proteína sérica, p. ex., albumina sérica humana (HSA). Um ligante que se liga à HSA permite a distribuição do conjugado a um tecido alvo, p. ex., um tecido alvo não renal do corpo. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células do parênquima hepático. Outras moléculas que se ligam à HSA podem igualmente ser usadas como ligantes. Por exemplo, pode-se usar neproxina ou aspirina. Um lipídio ou ligante à base de lipídio pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar o direcionamento ou transporte para uma célula alvo ou membrana celular e/ou (c) ser usado para ajustar a ligação a uma proteína sérica, p. ex., HSA.
[00441] Um ligante à base de lipídio pode ser usado para inibir, p. ex., controlar a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo, um lipídio ou ligante à base de lipídio que se liga à HSA mais fortemente será menos propenso a ser direcionado para o rim e, portanto, menos propenso a ser depurado do corpo. Um lipídio ou ligante à base de lipídio que se liga à HSA menos fortemente pode ser usado para direcionar o conjugado para o rim.
[00442] Em uma modalidade preferida, o ligante à base de lipídio liga- se à HSA. De preferência, liga-se à HSA com uma afinidade suficiente de modo que o conjugado venha a ser preferivelmente distribuído para um tecido que não renal. No entanto, prefere-se que a afinidade não seja tão forte que a ligação HSA-ligante não possa ser revertida.
[00443] Em outra modalidade preferida, o ligante à base de lipídio liga- se à HSA fracamente ou nem mesmo se liga, tal que o conjugado venha a ser preferivelmente distribuído para o rim. Outras porções que direcionam para células renais podem ser utilizadas igualmente no lugar ou além do ligante à base de lipídio.
146 / 395
[00444] Em outro aspecto, o ligante é uma porção, p. ex., uma vitamina, que é absorvida por uma célula alvo, p. ex., uma célula em proliferação. Essas são especialmente úteis para tratar transtornos caracterizados por proliferação celular indesejada, p. ex., do tipo maligno ou não maligno, p. ex., células de câncer. As vitaminas exemplares incluem vitamina A, E e K. Outras vitaminas exemplares incluem as vitaminas B, p. ex., ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidos por células alvo tais como células hepáticas. Estão incluídas também HSA e lipoproteína de baixa densidade (LDL). B. Agentes de permeação celular
[00445] Em outro aspecto, o ligante é um agente de permeação celular, de preferência um agente de permeação celular helicoidal. De preferência, o agente é anfipático. Um agente exemplar é um peptídeo tal como Tat ou Antennapedia. Se for um peptídeo, o agente pode ser modificado, incluindo com peptidilmiméticos, invertômeros ou ligações não peptídicas ou pseudopeptídicas, e o uso de D-aminoácidos. O agente helicoidal é preferivelmente um agente alfa-helicoidal, o qual possui preferivelmente uma fase lipofílica e uma lipofóbica.
[00446] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético (também aqui referido como oligopeptidomimético) é uma molécula capaz de dobrar-se em uma estrutura tridimensional definida semelhante à de um peptídeo natural. A ligação de peptídeos e peptidomiméticos aos agentes iRNA pode afetar a distribuição farmacocinética do iRNA, tal como intensificar o reconhecimento e a absorção celular. A porção de peptídeo ou peptidomimético pode ter aproximadamente 5-50 aminoácidos de comprimento, p. ex., aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento.
[00447] Um peptídeo ou peptidomimético pode ser, por exemplo, um
147 / 395 peptídeo de permeação celular, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático ou peptídeo hidrofóbico (p. ex., consistindo primariamente em Tyr, Trp ou Phe). A porção peptídica pode ser um peptídeo dendrímero, peptídeo impedido ou peptídeo reticulado. Em outra alternativa, a porção peptídica pode incluir uma sequência de translocação através da membrana hidrofóbica (MTS). Um peptídeo exemplar contendo MTS hidrofóbica é RFGF tendo a sequência de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 2977). Um análogo de RFGF (p. ex., sequência de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:2978) contendo uma MTS hidrofóbica pode igualmente ser uma porção de direcionamento. A porção peptídica pode ser um peptídeo de “entrega”, o qual pode carregar moléculas polares grandes, incluindo peptídeos, oligonucleotídeos e proteína, através de membranas celulares. Por exemplo, sequências da proteína Tat do HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 2979) e a proteína Antennapedia da Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 2980) demonstraram ser capazes de funcionar como peptídeos de entrega. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, tal como um peptídeo identificado em uma biblioteca de expressão em fagos ou uma biblioteca combinatória um composto um bead (microesfera) (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Os exemplos de peptídeo ou peptidomimético presos a um agente dsRNA por intermédio de uma unidade monomérica incorporada para fins de direcionamento celular é peptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) ou mímico de RGD. Uma porção peptídica pode variar no comprimento de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. As porções peptídicas podem ter uma modificação estrutural, tal como para aumentar a estabilidade ou direcionar propriedades conformacionais. Qualquer uma das modificações estruturais descritas abaixo pode ser utilizada.
[00448] Um peptídeo RGD para uso nas composições e métodos da
148 / 395 invenção pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, p. ex., glicosilado ou metilado, para facilitar o direcionamento para tecido(s) específico(s). Peptídeos e peptidomiméticos contendo RGD podem incluir D-aminoácidos, bem como mímicos RDG sintéticos. Além de RGD, é possível usar outras porções que visam o ligante integrina. Os conjugados preferidos desse ligante visam PECAM-1 ou VEGF.
[00449] Um “peptídeo de permeação celular” é capaz de permear uma célula, p. ex., uma célula microbiana, tal como uma célula bacteriana ou de fungo, ou uma célula de mamífero, tal como uma célula humana. Um peptídeo com permeação em célula microbiana pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (p. ex., LL-37 ou Ceropina P1), um peptídeo contendo ligação dissulfeto (p. ex., α-defensina, β-defensina ou bactenecina) ou um peptídeo contendo somente um ou dois aminoácidos dominantes (p. ex., PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação celular pode também incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação celular pode ser um peptídeo anfipático bipartite, tal como MPG, que é derivado do domínio peptídico de fusão de gp41 do HIV e o NLS do grande antígeno T do SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003). C. Carboidratos conjugados
[00450] Em algumas modalidades das composições e métodos da invenção, um oligonucleotídeo de iRNA compreende ainda um carboidrato. o iRNA conjugado a carboidratos são vantajosos para a entrega in vivo de ácidos nucleicos, bem como de composições adequadas para uso terapêutico in vivo, como aqui descrito. Neste relatório descritivo, “carboidrato” refere-se a um composto que é ou um carboidrato per se formado por uma ou mais unidades de monossacarídeo tendo pelo menos 6 átomos de carbono (o qual pode ser linear, ramificado ou cíclico) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto tendo como
149 / 395 parte do mesmo uma porção de carboidrato composto por uma ou mais unidades de monossacarídeo, cada uma tendo pelo menos seis átomos de carbono (o qual pode ser linear, ramificado ou cíclico), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono. Os carboidratos representativos incluem os açúcares (mono-, di-, tri- e oligossacarídeos contendo aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades do monossacarídeo), e polissacarídeos tais como amido, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeo. Monossacarídeos específicos incluem açúcares C5 e superiores (p. ex., C5, C6, C7 ou C8); di- e trissacarídeos incluem açúcares tendo duas ou três unidades de monossacarídeo (p. ex., C5, C6, C7 ou C8).
[00451] Em uma modalidade, um carboidrato conjugado para uso nas composições e métodos da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN
O HO OH O O H H
HO O N N O AcHN
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O Fórmula II,
HO HO HO O HO O O O O N HO HO H HO O HO O O O O O N HO HO H O O HO O HO O O O
O N H Fórmula III,
150 / 395
OH HO O HO O O
O NHAc
OH HO N O HO O O
O NHAc Fórmula IV,
OH HO O HO O
O NHAc
O OH HO O O HO O
O NHAc Fórmula V,
HO OH O H
HO O N NHAc O
HO OH O
HO O NH NHAc O Fórmula VI,
HO OH O HO O
O HO OH NHAc
O HO O
O NHAc HO OH O
O
HO O NHAc Fórmula VII, BzO OBz
O BzO BzO BzO OBz O OAc
O O BzO AcO BzO O O Fórmula VIII,
151 / 395
HO OH O O H O N O
HO N AcHN H
O HO OH O O O H N O
HO N AcHN H
O HO OH O O O H O N
HO N O AcHN H Fórmula IX,
HO OH O O O O
HO O N AcHN H
HO OH O O O O O
HO O N AcHN H
O O HO OH O O O
HO O N O AcHN H Fórmula X, PO3
O OH HO O HO
O PO3 O O
O N O OH H HO O HO O
O O O O3P O N
H O OH O O HO O HO O O O
O Fórmula XI,
N
H PO3
O OH HO O HO H H
O N N O PO3
O OH O HO O HO O H H
O N N O PO3
O OH O O O HO O HO O N N O
H H O Fórmula XII,
152 / 395
HO OH O O H O N O
HO N AcHN H O
HO OH O O O H
HO N O AcHN N
H O HO OH O O H O O N
HO N O AcHN H Fórmula XIII, Fórmula XIV, Fórmula XV, Fórmula XVI, Fórmula XVII, Fórmula XVIII,
153 / 395 Fórmula XIX, Fórmula XX, Fórmula XXI, Fórmula XXII,
OH O HO O
HO NHAc
O X Y O N N
H O Fórmula XXIII;
OH HO O
HO O NHAc
O H
O Y P O n
O N N
H O , em que Y é O ou S e n é 3 -6 (Fórmula XXIV);
154 / 395
Y O P O
O H O n
N NH O OH HO O
HO O NHAc , em que Y é O ou S e n é 3-6 (Fórmula XXV);
X O OH O N OH O Y OH O
O NHAc Fórmula XXVI;
O OH O N X HO O OP
HO O O O NHAc OH
O N X HO O OP
HO O O O NHAc OH
O N HO O OH
HO NHAc
O , em que X é O ou S (Fórmula XXVII);
155 / 395
Fórmula XXVIII; Fórmula XXIX;
Fórmula XXX;
156 / 395 Fórmula XXXI; e Fórmula XXXII; Fórmula XXXIII.
Fórmula XXXIV.
[00452] Em outra modalidade, um carboidrato conjugado para uso nas composições e métodos da invenção é um monossacarídeo. Em uma modalidade, o monossacarídeo é uma N-acetilgalactosamina, tal como
157 / 395
HO OH O H H
HO O N N O AcHN
O HO OH O O H H
HO O N N O AcHN
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O Fórmula II.
[00453] Outra carboidrato conjugado representativo para uso nas modalidades aqui descrita inclui, entre outros:
HO OH O O O O
HO O N AcHN H
HO OH O O O O O O O
HO O N N O O AcHN H H
O O XO HO OH O O O Y O O N
HO O N O H AcHN H NH N
N O O O O O N
H (Fórmula XXXVI), quando um dentre X ou Y é um oligonucleotídeo e o outro é um hidrogênio.
[00454] Em certas modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc é anexado a um agente iRNA da invenção via um linker monovalente. Em algumas modalidades, o GalNAc ou derivado de GalNAc é anexado a um agente iRNA da invenção via um linker bivalente. Em ainda outras modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc é anexado a um agente iRNA da invenção via um linker trivalente.
[00455] Em uma modalidade, os agentes iRNA de fita dupla da invenção compreendem um GalNAc ou derivado de GalNAc anexado ao agente iRNA, p. ex., na extremidade 3’ ou da fita sense de um agente dsRNA como aqui descrito. Em outra modalidade, os agentes iRNA de fita dupla da
158 / 395 invenção compreendem uma pluralidade (p. ex., 2, 3, 4, 5, ou 6) de GalNAc ou derivados de GalNAc, cada um anexado independentemente a uma pluralidade de nucleotídeos do agente RNAi de fita dupla através de uma pluralidade de linkers monovalentes.
[00456] Em algumas modalidades, por exemplo, quando as duas fitas de um agente iRNA da invenção fazem parte de uma molécula conectada por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da outra respectiva fita, formando uma alça tipo grampo de cabelo (hairpin) compreendendo uma pluralidade de nucleotídeos não pareados, cada nucleotídeo não pareado dentro da alça hairpin pode compreender independentemente um GalNAc ou derivado de GalNAc anexado via um linker monovalente.
[00457] Em algumas modalidades, o carboidrato conjugado compreende ainda um ou mais ligantes adicionais como descritos acima, tal como, entre outros, um modulador PK e/ou um peptídeo de permeação celular.
[00458] Carboidratos conjugados adicionais (e linkers) adequado para uso na presente invenção incluem aqueles descritos na Publicações PCT Nos WO 2014/179620 e WO 2014/179627, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. D. Linkers
[00459] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante aqui descrito pode ser anexado a um oligonucleotídeo de iRNA com vários linkers que podem ser cliváveis ou não cliváveis.
[00460] O termo “linker” ou “grupo de ligação” significa uma porção orgânica que conecta duas partes de um composto, p. ex., liga covalentemente duas partes de um composto. Os linkers compreendem tipicamente uma ligação direta ou um átomo, tal como de oxigênio ou enxofre, uma unidade tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tal
159 / 395 como, entre outros, alquila substituído ou não substituído, alquenila substituído ou não substituído, alquinila substituído ou não substituído, arilalquila, arilalquenila, arilalquinila, heteroarilalquila, heteroarilalquenila, heteroarilalquinila, heterociclilalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquinila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalquenila, alquilarilalquila, alquilarilalquenila, alquilarilalquinila, alquenilarilalquila, alquenilarilalquenila, alquenilarilalquinila, alquinilarilalquila, alquinilarilalquenila, alquinilarilalquinila, alquilheteroarilalquila, alquilheteroarilalquenila, alquilheteroarilalquinila, alquenil-heteroarilalquila, alquenil-heteroarilalquenila, alquenil- heteroarilalquinila, alquinil-heteroarilalquila, alquinil-heteroarilalquenila, alquinil-heteroarilalquinila, alquilheterociclilalquila, alquilheterociclilalquenila, alquilhererociclilalquinila, alquenil- heterociclilalquila, alquenil-heterociclilalquenila, alquenil- heterociclilalquinila, alquinil-heterociclilalquila, alquinil- heterociclilalquenila, alquinil-heterociclilalquinila, alquilarila, alquenilarila, alquinilarila, alquilheteroarila, alquenil-heteroarila, alquinilhereroarila, nos quais um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arila substituído ou não substituído, heteroarila substituído ou não substituído, heterocíclico substituído ou não substituído; onde R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o linker tem aproximadamente 1-24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5- 24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-17 ou 8-16 átomos.
[00461] Um grupo de ligação clivável é aquele que é suficientemente estável fora da célula, mas que, quando da entrada em uma célula alvo, é clivado para liberar as duas partes que o linker está mantendo junto. Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos cerca de 10 vezes, 20, vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais rápido em
160 / 395 uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (a qual pode ser, p. ex., selecionada para simular ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um indivíduo, ou sob uma segunda condição de referência (a qual pode ser, p. ex., selecionada para simular ou representar condições encontradas no sangue ou soro).
[00462] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, p. ex., pH, potencial redox ou a presença de moléculas degradantes. Em geral, os agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados em níveis ou atividades maior do que no soro ou sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos em particular ou sem especificidade por substrato, incluindo, p. ex., enzimas oxidantes ou redutoras ou agentes redutores tais como mercaptanos, presentes em células, que podem degradar um grupo de ligação redox clivável por redução; esterases; endossomos ou agentes capazes de criar um ambiente ácido, p. ex., aqueles que resultam em pH igual ou inferior a cinco; enzimas capazes de hidrolisar ou degradar grupo de ligação ácido clivável atuando como um ácido em geral, peptidases (que podem específicas para substrato) e fosfatases.
[00463] Um grupo com ligação clivável, tal como uma ligação dissulfeto pode ser suscetível ao pH. O pH do soro humano é 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente menor, variando de aproximadamente 7,1-7,3. Endossomos têm um pH mais ácido, na faixa de 5,5-6,0, e o pH de lisossomos é ainda mais ácido, por volta de 5,0. Alguns linkers terá um grupo de ligação clivável que é clivado em um pH preferido, liberando, assim, um lipídio catiônico dentro da células, no compartimento desejado da célula.
[00464] Um linker pode incluir um grupo de ligação clivável que pode ser clivado por uma enzima em particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em linker depende da célula a ser atingida. Por exemplo, um ligante direcionado para o fígado pode ser ligado a um lipídio catiônico
161 / 395 através de um linker que inclui um grupo éster. As células hepáticas são ricas em esterases e, portanto, o linker será clivado com mais eficiência em células hepáticas do que em tipos de células que não são ricas em esterases. Outros tipos de células ricas em esterases incluem células do pulmão, da córtex renal e dos testículos.
[00465] Os linkers que contêm ligações peptídicas podem ser usados quando o direcionamento é para tipos celulares ricos em peptidases, tais como células hepáticas e sinoviócitos.
[00466] Em geral, a adequação de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente degradante (ou condição) para clivar o grupo de ligação candidato. Será igualmente desejável testar a capacidade do grupo de ligação clivável candidato resistir à clivagem no soro ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim, é possível determinar a suscetibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, em que primeira é selecionada para ser indicativa de clivagem em uma célula alvo, e a segunda é selecionada para ser indicativa de clivagem em outros tecidos ou líquidos biológicos, p. ex., sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sistemas livres de células, em células, em cultura celular, em órgão ou cultura de tecido ou em animais inteiros. Pode ser útil efetuar as avaliações iniciais em condições sem células ou de cultura e confirmar por avaliações adicionais em animais inteiros. Em modalidades preferidas, compostos candidatos úteis são clivados pelo menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido em células (ou sob condições in vitro selecionadas para simular condições intracelulares) em comparação ao sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para simular condições extracelular). i. grupos de ligação cliváveis redox
[00467] Em uma modalidade, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação clivável redox que é clivado quando da redução ou oxidação. Um
162 / 395 exemplo de grupo de ligação clivável por redução é um grupo de ligação dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um grupo de ligação clivável candidato é um “grupo de ligação clivável por redução” adequado ou, por exemplo, se é adequado para uso com uma porção iRNA em particular e um agente de direcionamento em particular, os métodos aqui descritos podem ser examinados. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outros agentes redutores, usando reagentes conhecidos na técnica, simulando a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, p. ex., uma célula alvo. Os candidatos podem também ser avaliados sob condições que são selecionadas para simular as condições do sangue ou soro. Em uma modalidades, compostos candidatos são clivados em, no máximo, aproximadamente 10% no sangue. Em outras modalidades, compostos candidatos úteis são degradados pelo menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para simular condições intracelulares) em comparação ao sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para simular condições extracelular). A taxa de clivagem de compostos candidatos pode ser determinada por ensaios padrão da cinética de enzimas sob condições escolhidas para simular o meio intracelular media e comparada a condições escolhidas para simular o meio extracelular. ii. Grupos de ligação cliváveis à base de fosfato
[00468] Em outra modalidade, um linker clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de fosfato. Um grupo de ligação clivável à base de fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que cliva grupos fosfato em células são enzimas tais como fosfatases em células. Exemplos de grupos de ligação à base de fosfato são -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, - S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S- P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-
163 / 395 P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. As modalidades preferidas são -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, - O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O- P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, - O-P(S)(H)-S-. Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima. iii. Grupos de ligação cliváveis ácidos
[00469] Em outra modalidade, um linker clivável compreende um grupo de ligação clivável ácido. Um grupo de ligação clivável ácido é um grupo de ligação que é clivado sob condições ácidas. Em modalidades preferidas, grupos de ligação cliváveis ácidos são clivados em ácido com pH próximo ou inferior a 6,5 (p. ex., próximo ou inferior a 6,0; 5,75; 5,5; 5,25, 5,0), ou por agentes tais como enzimas capazes de atuar como um ácido geral. Em uma célula, organelas específicas com pH baixo, tais como endossomos e lisossomos, podem proporcionar um ambiente para clivagem de grupos de ligação cliváveis ácidos. Os exemplos de grupos de ligação cliváveis ácidos incluem, entre outros, hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Os grupos cliváveis ácidos podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O, ou -OC(O). Uma modalidade preferida é quando o carbono anexado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído ou grupo alquila terciário tal como dimetila, pentila ou t-butila. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima. iv. Grupos de ligação à base de éster
[00470] Em outra modalidade, um linker clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de éster. Um grupo de ligação clivável à base de éster é clivado por enzimas tais como esterases e amidases em células. Os exemplos de grupo de ligação clivável à base de éster incluem, entre outros, ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Os grupos de ligação
164 / 395 cliváveis à base de éster têm a fórmula geral -C(O)O- ou -OC(O)-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima. v. Grupos de clivagem à base de peptídeo
[00471] Em ainda outra modalidade, um linker clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de peptídeo. Um grupo de ligação clivável à base de peptídeo é clivado por enzimas tais como peptidases e proteases em células. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para produzir oligopeptídeos (p. ex., dipeptídeos, tripeptídeos etc.) e polipeptídeos. Os grupos cliváveis à base de peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquinileno. Uma ligação peptídica é um tipo especial de ligação amida formada entre aminoácidos para produzir peptídeos e proteínas. O grupo clivável à base de peptídeo limita-se, em geral, à ligação peptídica (ou seja, a ligação amida) formada entre aminoácidos que resulta em peptídeos e proteínas e não inclui o grupo funcional amida inteiro. Os grupos de ligação cliváveis à base de peptídeos têm a fórmula geral -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- , onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[00472] Em uma modalidade, um iRNA da invenção é conjugado a um carboidrato através de um linker. Exemplos não limitantes de iRNA e carboidrato conjugados com linkers da composições e métodos da invenção incluem, entre outros:
165 / 395 (Fórmula XXXVII),
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O
HO O N N O AcHN
O
H H (Fórmula XXXVIII),
HO OH O O H O N O
HO N XO AcHN H O
HO OH OY O O O H N O H N
HO N O N O AcHN N H x y
H O O HO OH x = 1-30
O O H O O N y = 1-15
HO N O AcHN H (Fórmula XXXIX),
HO OH O O H O N O
HO N AcHN H O XO
HO OH OY O O O N O H H H
HO N O N O N AcHN N N O O H O O H x O y
HO OH O O H O x = 1-30 O N y = 1-15
HO N O AcHN H (Fórmula XL),
HO OH O O H O N O
HO N XO AcHN H O
OY HO OH N O O H O H H N
HO N O N S S O AcHN N O y H O O x HO OH x = 0-30
O O H O O y = 1-15
N
HO N O AcHN H (Fórmula XLI),
166 / 395
HO OH O O H O N O
HO N XO AcHN H O
OY HO OH N O O H O H H N
HO N O N S S O AcHN N zO y H O O x HO OH x = 0-30 O O H O y = 1-15
O N HO N O z = 1-20 AcHN H (Fórmula XLII),
HO OH O O H O N O
HO N XO AcHN H O
OY HO OH N O O H O H H N
HO N O N O S S O AcHN N O y H O x zO
O HO OH x = 1-30 O O H O y = 1-15
O N HO N O z = 1-20 AcHN H (Fórmula XLIII) e
HO OH O O H O N O
HO N XO AcHN H O
HO OH OY O H N O H H N O O S S O
HO N O N O AcHN N zO y H O x
O HO OH x = 1-30 O O H O y = 1-15
O N HO N O z = 1-20 AcHN H (Fórmula XLIV), quando um dentre X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00473] Em certas modalidades das composições e métodos da invenção, um ligante é um ou mais derivados de GalNAc (N- acetilgalactosamina) anexados através de um linker ramificado bivalente ou trivalente.
[00474] Em uma modalidade, um dsRNA da invenção é conjugados a um linker ramificado bivalente ou trivalente selecionado dentre o grupo de estruturas mostradas em qualquer uma das fórmulas (XLV) - (XLVI):
167 / 395 Fórmula XXXXV Fórmula XLVI Fórmula XLVII Fórmula XLVIII em que: q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam 0-20 independentemente para cada ocorrência, e em que a unidade repetida pode ser igual ou diferente; P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C são, cada um, independentemente para cada ocorrência, ausentes, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ou CH2O; Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C são independentemente para cada ocorrência ausentes, alquileno, alquileno substituído, em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais dentre O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R’’), C≡C ou C(O); R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C são, cada um, independentemente para cada ocorrência ausentes, NH, O, S, CH2, C(O)O,
O HO
H C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, N ,
O S S S S N S S
N H , , , ou heterociclila;
168 / 395 L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B e L5C representam o ligante; ou seja, cada um independentemente para cada ocorrência um monossacarídeo (tal como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo; e Ra é H ou cadeia lateral de aminoácido. A conjugação com derivados trivalentes de GalNAc é especialmente útil quando agentes RNAi são utilizados para inibição da expressão de gene alvo, tais como aqueles de fórmula (XLIX): P5A-Q5A-R5A T5A-L5A q5A P5B-Q5B-R5B T5B-L5B q5B P5C-Q5C-R5C T5C-L5C q5C Fórmula (XLIX) Formula (VII) , em que L5A, L5B e L5C representam um monossacarídeo, tal como derivado de GalNAc.
[00475] Exemplos de grupos adequados de linker ramificado bivalente e trivalente conjugando derivados de GalNAc incluem, entre outros, as estruturas mencionadas acima como fórmulas II, VII, XI, X, e XIII.
[00476] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem, entre outras, as Patentes U.S. Nos 4 828 979; 4 948 882; 5 218 105; 5 525 465; 5 541 313; 5 545 730; 5 552 538; 5 578 717 5 580 731; 5 591 584; 5 109 124; 5 118 802; 5 138 045; 5 414 077; 5 486 603; 5 512 439; 5 578 718; 5 608 046; 4 587 044; 4 605 735; 4 667 025; 4 762 779; 4 789 737; 4 824 941; 4 835 263; 4 876 335; 4 904 582; 4 958 013; 5 082 830; 5 112 963; 5 214 136; 5 082 830; 5 112 963; 5 214 136; 5 245 022; 5 254 469; 5 258 506; 5 262 536; 5 272 250; 5 292 873; 5 317 098; 5 371 241 5 391 723; 5 416 203 5 451 463; 5 510 475; 5 512 667; 5 514 785; 5 565 552; 5 567 810; 5 574 142; 5 585 481; 5 587 371; 5 595 726; 5 597 696; 5 599 923; 5 599 928 e 5 688 941; 6 294 664; 6 320 017; 6 576 752; 6 783 931; 6 900 297; 7 037 646; 8 106 022, cujos conteúdos são aqui incorporados, em
169 / 395 sua totalidade, por referência neste documento.
[00477] Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam modificadas de modo uniforme e, de fato, mais de uma das modificações mencionadas acima pode ser incorporada em um composto único ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um iRNA. A presente invenção também inclui compostos de iRNA que são compostos quiméricos.
[00478] Compostos “quiméricos” de iRNA compostos ou “quimeras”, no contexto dessa invenção, são compostos de iRNA, de preferência dsRNAs, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada um composta ao menos por um unidade de monômero, ou seja, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Esses iRNAs contêm tipicamente ao menos uma região na qual o RNA é modificado de modo a conferir ao iRNA resistência aumentada à degradação por nucleases, absorção celular aumentada e/ou afinidade de ligação aumentada pelo ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir como substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, RNase H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um duplex RNA:DNA. A ativação de RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA alvo, reforçando assim em grande medida a eficiência da inibição pelo iRNA da expressão gênica. Consequentemente, resultados comparáveis podem ser frequentemente obtidos com iRNAs mais curtos quando são usados dsRNAs quiméricos, em comparação a dsRNAs desoxi-fosforotioato que hibridizam com a mesma região alvo. A clivagem do RNA alvo pode ser detectada rotineiramente por eletroforese em gel e, se necessário, técnicas associadas de hibridização de ácido nucleico conhecidas no assunto.
[00479] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Diversas moléculas de não ligante foram conjugadas a iRNAs a fim de intensificar a atividade, a distribuição celular ou a absorção celular do iRNA, e procedimentos para realizar tais conjugações estão
170 / 395 disponíveis na literatura científica. Tais porções não ligantes incluíam porções lipídicas, tais como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), a tioéter, p. ex., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, p. ex., dodecanodiol ou resíduos undecila (Saison- Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídio, p. ex., di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleosides, 1995, 14:969), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), uma porção palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229) ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonil- oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA conjugados foram listadas acima. Os protocolos típicos de conjugação envolvem a síntese de um RNAs com um linker amino em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é então reagido com a molécula que está sendo conjugada usando reagentes apropriados de acoplamento ou ativação. A reação de conjugação pode ser realizada com o RNA ainda ligado ao suporte sólido ou após a clivagem do RNA em fase de solução. A purificação do conjugado de RNA por HPLC tipicamente dá origem ao conjugado puro. IV. Entrega de um iRNA da invenção
[00480] A entrega de um iRNA da invenção a uma célula, p. ex., uma
171 / 395 célula em um indivíduo, tal como um humano (p. ex., um indivíduo com necessidade do mesmo, tal como um indivíduo com um transtorno do metabolismo lipídico) pode ser conseguida por diversas maneiras diferentes. Por exemplo, a entrega pode ser realizada colocando uma célula em contato com um iRNA da invenção seja in vitro ou in vivo. A entrega in vivo pode também ser realizada diretamente administrando uma composição compreendendo um iRNA, p. ex., um dsRNA, a um indivíduo. Alternativamente, a entrega in vivo pode ser realizada indiretamente administrando um ou mais vetores que codificam e direcionam a expressão do iRNA. Essas alternativas são discutidas mais detalhadamente abaixo.
[00481] Em geral, qualquer método para entrega de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para uso com um iRNA da invenção (ver, p. ex., Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 e WO94/02595, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). Para entrega in vivo, fatores a considerar visando a entrega de um molécula de iRNA incluem, por exemplo, estabilidade biológica da molécula entregue, prevenção de efeitos não específicos e acúmulo da molécula entregue no tecido alvo. Os non efeitos não específicos de um iRNA podem ser minimizados por administração local, por exemplo, por injeção direta ou implantação em um tecido ou a administração tópica do preparado. A administração local a um sítio de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente a tecidos sistêmicos que podem, do contrário, ser lesados pelo agente ou que podem degradar o agente e permite que seja administrada uma dose total menor da molécula iRNA. Diversos estudos mostraram o knockdown (silenciamento gênico) bem sucedido de produtos gênicos quando um iRNA é administrado localmente. Por exemplo, a entrega intraocular de um dsRNA de VEGF por injeção intravítrea em macacos Cynomolgus (Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138) e injeções abaixo da retina em camundongos (Reich, SJ.
172 / 395 et al. (2003) Mol.
Vis. 9:210-216) demonstraram ambas prevenir a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada à idade.
Além disso, a injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume do tumor (Pille, J. et al. (2005) Mol.
Ther. 11:267-274) e pode prolongar a sobrevida de camundongos portadores do tumor (Kim, WJ. et al., (2006) Mol.
Ther. 14:343-350; Li, S. et al., (2007) Mol.
Ther. 15:515-523). A interferência por RNA também mostrou sucesso com a entrega local ao SNC por injeção direta (Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005) J.
Neurophysiol. 93:594-602) e aos pulmões por administração intranasal (Howard, KA. et al., (2006) Mol.
Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J.
Biol.
Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat.
Med. 11:50-55). Para administração de um iRNA por via sistêmica no tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou, alternativamente, entre usando um sistema de liberação de fármacos; ambos os métodos atuam prevenindo a degradação rápida do dsRNA por endo e exonucleases in vivo.
A modificação do RNA ou o veículo farmacêutico pode igualmente permitir o direcionamento da composição de iRNA para o tecido alvo e evitar efeitos indesejáveis fora do alvo.
Moléculas de iRNA podem ser modificadas por conjugação química a grupos lipofílicos, tais como colesterol, para intensificar a absorção celular e prevenir a degradação.
Por exemplo, um iRNA direcionado contra ApoB conjugada a uma porção lipofílica de colesterol foi injetado por via sistêmica em camundongos e resultou em knockdown do mRNA de apoB no fígado e no jejuno (Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178). A conjugação de um iRNA a um aptâmero demonstrou inibir o crescimento tumoral e mediou a regressão do tumor em um modelo de câncer de próstata em camundongo (McNamara, JO.
173 / 395 et al., (2006) Nat.
Biotechnol. 24:1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o iRNA pode ser entrega por meio de sistemas de liberação de fármaco, tais como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomas ou um sistema catiônico de liberação.
Sistemas catiônicos de liberação com carga positiva facilitam a ligação de uma molécula de iRNA (com carga negativa) e também intensificam as interações na membrana celular carregada negativamente para permitir a absorção eficiente de um iRNA pela célula.
Lipídios, dendrímeros ou polímeros catiônicos podem ser ligados a um iRNA, ou induzidos a formar uma vesícula ou micela (ver, p. ex., Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encapsula um iRNA.
A formação de vesículas ou micelas previnem mais a degradação do iRNA quando administradas sistemicamente.
Métodos para produção e administração de complexos catiônicos de iRNA são bem conhecidos por qualquer técnico no assunto (ver, p. ex., Sorensen, DR., et al. (2003) J.
Mol.
Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin.
Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al., (2007) J.
Hypertens. 25:197-205, que são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). Alguns exemplos não limitantes de sistemas de liberação de fármacos, úteis para entrega sistêmica de iRNAs incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra), Oligofectamine, “solid nucleic acid lipid particles” (Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J.
Oncol. 26:1087-1091), polietilenoimina (Bonnet ME. et al., (2008) Pharm.
Res.
Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J.
Biomed.
Biotechnol. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol.
Pharm. 3:472- 487) e poliamidoaminas (Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem.
Soc.
Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm.
Res. 16:1799-1804). Em algumas modalidades, um iRNA forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica.
Métodos para administração e composições
174 / 395 farmacêuticas de iRNAs e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente U.S. No 7 427 605, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência. A. iRNAs da invenção, codificados por vetor
[00482] iRNA direcionados para o gene HSD17B13 podem ser expressos a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (ver, p. ex., Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicação Internacional PCT No WO 00/22113, Conrad, Publicação Internacional PCT No WO 00/22114, e Conrad, Patente U.S. No 6 054 299). A expressão pode ser transitória (na ordem de horas a semanas) ou sustentada (semanas a meses ou mais longa), dependendo da construção específica usada e o tecido ou tipo celular alvo. Esses transgenes podem ser introduzidos como uma construção linear, um plasmídeo circular ou um vetor viral, o qual pode ser um vetor integrante ou não integrante. O transgene pode também ser construído para permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossomal (Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292).
[00483] A fita individual ou as fitas de um iRNA podem ser transcritas a partir de um promotor em um vetor de expressão. Quando duas fitas separadas devem ser expressas para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser co-introduzidos (p. ex., por transfecção ou infecção) em uma célula alvo. Alternativamente, cada fita individual de um dsRNA pode ser transcrita por promotores, ambos os quais localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso como polinucleotídeos repetidos invertidos unidos por uma sequência polinucleotídica de tal modo que o dsRNA tenha uma estrutura de haste e alça.
[00484] Vetores de expressão de iRNA são geralmente plasmídeos de ou vetores virais. Vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, de preferência aqueles compatíveis com células de vertebrados podem ser
175 / 395 usados na produção de construções recombinantes para a expressão de um iRNA como aqui descrito. Vetores de expressão em células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e disponibilizados por diversos fornecedores comerciais. Tipicamente, tais vetores fornecidos contêm sítios de restrição para inserção do segmento desejado de ácido nucleico. A entrega de vetores expressando iRNA pode ser sistêmica, tal como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração a células alvo explantadas do paciente, seguida pela reintrodução no paciente ou por qualquer outro meio que permita a introdução em uma célula alvo desejada.
[00485] Os sistemas de vetor viral que podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos incluem, entre outros, (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo, entre outros, vetores lentivirais, vírus da leucemia murina de Moloney etc.; (c) vetores de vírus adenoassociados; (d) vetores de vírus herpes simples; (e) vetores de SV 40; (f) vetores de poliomavírus; (g) vetores de papilomavírus; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de vírus da varíola tais como orthopox, p. ex., vetores do vírus vaccinia ou avipox, p. ex., varíola de canários ou varíola de aves domésticas; e (j) um adenovírus auxiliar dependente ou gutless. Vírus com defeito na replicação podem também ser vantajosos. Vetores diferentes serão ou não incorporados no genoma das células. As construções podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, a construção pode ser incorporada em vetores capazes de replicação epissomal, p. ex., vetores de EPV e EBV. As construções para a expressão recombinante de um iRNA requererá geralmente elementos reguladores, p. ex., promotores, reforçadores etc., para assegurar a expressão do iRNA nas células alvo. Outros aspectos a considerar para vetores e construções são conhecidos na técnica. V. Composições farmacêuticas da invenção
[00486] A presente invenção também inclui composições
176 / 395 farmacêuticas e formulações que incluem os iRNAs da invenção. Consequentemente, em uma modalidade, são providas composições farmacêuticas compreendendo um agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) que inibe a expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, tal como uma célula hepática, em que o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1, e a dita fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:7; e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1, e a dita fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:7.
[00487] Em outra modalidade, são providas composições farmacêuticas compreendendo um agente dsRNA que inibe a expressão de 17β-Hidroxiesteroide desidrogenases (HSD17B13) em uma célula, tal como uma célula hepática, em que o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense, a fita antisense compreendendo uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13; e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense, a fita antisense compreendendo uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
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[00488] As composições farmacêuticas contendo o iRNA da invenção são úteis para o tratamento de uma doença ou transtorno associado com a expressão ou atividade de um gene HSD17B13, p. ex., uma doença fibro- inflamatória crônica.
[00489] Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de liberação. Um exemplo é composições que são formuladas para administração sistêmica via liberação parenteral, p. ex., por liberação intravenosa (IV), intramuscular (IM) ou para subcutânea. Outro exemplo é composições que são formuladas para liberação direta no fígado, p. ex., por infusão no fígado, tal como infusão contínua por bomba. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em doses suficientes para inibir a expressão de um gene HSD17B13. Em geral, uma dose adequada de um iRNA da invenção estará na faixa entre aproximadamente 0,01 e 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do recipiente ao dia, em geral, na faixa entre aproximadamente 1 e 50 mg por quilograma de peso corporal ao dia. Tipicamente, uma dose adequada de um iRNA da invenção estará na faixa entre aproximadamente 0,1 mg/kg e 5,0 mg/kg, de preferência entre aproximadamente 0,3 mg/kg e 3,0 mg/kg.
[00490] Um esquema de doses repetidas pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica de iRNA regularmente, tal como entre em dias alternados a uma vez ao ano. Em certas modalidades, o iRNA é administrado aproximadamente uma vez por semana, uma vez a cada 7-10 dias, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 5 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 7 semanas, uma vez a cada 8 semanas, uma vez a cada 9 semanas, uma vez a cada 10 semanas, uma vez a cada 11 semanas, uma vez a cada 12 semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 2 meses, uma vez a cada 3 meses (uma vez por trimestre), uma vez a cada 4 meses, uma vez a cada 5 meses ou uma vez a cada 6 meses.
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[00491] Depois de um esquema inicial de tratamento, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência.
[00492] O técnico no assunto apreciará que certos fatores podem influenciar a dose e o horário requerido para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, entre outros, a gravidade da doença ou transtorno, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou a idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um tratamento único ou uma série de tratamentos. Estimativas de doses eficazes e meia-vidas in vivo para os iRNAs individuais abrangidos pela invenção podem ser efetuadas por meio de metodologias convencionais ou com base em testes in vivo utilizando um modelo animal adequado, conforme descrito em outro lugar do presente.
[00493] Avanços na genética de camundongos gerou inúmeros modelos de camundongo para o estudo de várias doenças humanas, tais como uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13 que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13. Tais modelos podem ser usados para testes in vivo de iRNA, bem como para determinar uma dose terapeuticamente eficaz. Tais modelos podem ser usados para testes in vivo de iRNA, bem como para determinar uma dose terapeuticamente eficaz. Modelos adequados de camundongos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, camundongos e ratos alimentados com uma dieta rica em gordura (HFD; também referida como dieta Ocidental), dieta deficiente em metionina-colina (MCD) ou uma dieta rica em gordura (15%), rica em colesterol (1%) (HFHC), um camundongo obeso (ob/ob) contendo uma mutação no gene obese (ob) (Wiegman et al., (2003) Diabetes, 52:1081- 1089); um camundongo contendo knockdown homozigoto de um receptor de LDL (camundongo LDLR -/-; Ishibashi et al., (1993) J Clin Invest 92(2):883- 893); modelo de camundongo com arteriosclerose induzida por dieta (Ishida
179 / 395 et al., (1991) J. Lipid. Res., 32:559-568); modelo de camundongo com knockout (inativação) heterozigoto de lipoproteína lipase (Weistock et al., (1995) J. Clin. Invest. 96(6):2555-2568); camundongos e ratos alimentados com uma dieta deficiente em colina, L-aminoácidos definidos e rica em gordura (CDAHFD) (Matsumoto et al. (2013) Int. J. Exp. Path. 94:93-103); camundongos e ratos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura trans e colesterol (HTF-C) (Clapper et al. (2013) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 305:G483-G495); camundongos e ratos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura, alto teor de colesterol e sais biliares (HF/HC/BS) (Matsuzawa et al. (2007) Hepatology 46:1392-1403); e camundongos e ratos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura + frutose (30%) e água (Softic et al. (2018) J. Clin. Invest. 128(1)-85-96).
[00494] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de diversas maneira dependendo se é desejado tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (p. ex., por um adesivo transdérmico), pulmonar, p. ex., por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdérmica, p. ex., através de um dispositivo implantado; ou intracraniana, p. ex., por administração intraparenquimatosa, intratecal ou intraventricular.
[00495] O iRNA pode ser entregue de maneira a atingir uma determinada célula ou tecido, tal como o fígado (p. ex., os hepatócitos do fígado).
[00496] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção são adequadas para administração intramuscular a um indivíduo. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas da invenção são adequadas para administração intravenosa a um indivíduo. Em algumas modalidades da
180 / 395 invenção, as composições farmacêuticas da invenção são adequadas para administração subcutânea a um indivíduo, p. ex., usando uma agulha 29g ou 30g.
[00497] As composições farmacêuticas da invenção pode incluir um agente RNAi da invenção em uma solução não tamponada, tal como solução salina ou água, ou em uma solução tampão, tal como uma solução tampão compreendendo acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos.
[00498] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção, p. ex., tais quais as composições adequadas para administração subcutânea, compreendem um agente RNAi da invenção em solução salina com tampão fosfato (PBS). As concentrações adequadas de PBS incluem, por exemplo, PBS 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 3,5 mM, 4 mM, 4,5 mM, 5 mM, 6,5 mM, 7 mM, 7,5 mM, 9 mM, 8,5 mM, 9 mM, 9,5 mM ou aproximadamente 10 mM. Em uma modalidade da invenção, uma composição farmacêutica da invenção compreende um agente RNAi da invenção dissolvido em uma solução com PBS aproximadamente 5 mM PS (p. ex., NaH2PO4 0,64 mM, Na2HPO4 4,36 mM, NaCl 85 mM). Valores intermediários às faixas e valores mencionados acima também se destinam a fazer parte desta invenção. Além disso, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores mencionados acima como limites superior e/ou inferior destinam-se a ser incluídas.
[00499] O pH das composições farmacêuticas da invenção pode ser entre aproximadamente 5,0 e 8,0, entre aproximadamente 5,5 e 8,0, entre aproximadamente 6,0 e 8,0, entre aproximadamente 6,5 e 8,0, entre aproximadamente 7,0 e 8,0, entre aproximadamente 5,0 e 7,5, entre aproximadamente 5,5 e 7,5, entre aproximadamente 6,0 e 7,5, entre aproximadamente 6,5 e 7,5, entre aproximadamente 5,0 e 7,2, entre aproximadamente 5,25 e 7,2, entre aproximadamente 5,5 e 7,2, entre
181 / 395 aproximadamente 5,75 e 7,2, entre aproximadamente 6,0 e 7,2, entre aproximadamente 6,5 e 7,2 ou entre aproximadamente 6,8 e 7,2. Faixas e valores intermediários às faixas e valores mencionados acima também se destinam a fazer parte desta invenção.
[00500] A osmolalidade das composições farmacêuticas da invenção pode ser adequada para administração subcutânea, tal qual, no máximo, 400 mOsm/kg, p. ex., entre 50 e 400 mOsm/kg, entre 75 e 400 mOsm/kg, entre 100 e 400 mOsm/kg, entre 125 e 400 mOsm/kg, entre 150 e 400 mOsm/kg, entre 175 e 400 mOsm/kg, entre 200 e 400 mOsm/kg, entre 250 e 400 mOsm/kg, entre 300 e 400 mOsm/kg, entre 50 e 375 mOsm/kg, entre 75 e 375 mOsm/kg, entre 100 e 375 mOsm/kg, entre 125 e 375 mOsm/kg, entre 150 e 375 mOsm/kg, entre 175 e 375 mOsm/kg, entre 200 e 375 mOsm/kg, entre 250 e 375 mOsm/kg, entre 300 e 375 mOsm/kg, entre 50 e 350 mOsm/kg, entre 75 e 350 mOsm/kg, entre 100 e 350 mOsm/kg, entre 125 e 350 mOsm/kg, entre 150 e 350 mOsm/kg, entre 175 e 350 mOsm/kg, entre 200 e 350 mOsm/kg, entre 250 e 350 mOsm/kg, entre 50 e 325 mOsm/kg, entre 75 e 325 mOsm/kg, entre 100 e 325 mOsm/kg, entre 125 e 325 mOsm/kg, entre 150 e 325 mOsm/kg, entre 175 e 325 mOsm/kg, entre 200 e 325 mOsm/kg, entre 250 e 325 mOsm/kg, entre 300 e 325 mOsm/kg, entre 300 e 350 mOsm/kg, entre 50 e 300 mOsm/kg, entre 75 e 300 mOsm/kg, entre 100 e 300 mOsm/kg, entre 125 e 300 mOsm/kg, entre 150 e 300 mOsm/kg, entre 175 e 300 mOsm/kg, entre 200 e 300 mOsm/kg, entre 250 e 300, entre 50 e 250 mOsm/kg, entre 75 e 250 mOsm/kg, entre 100 e 250 mOsm/kg, entre 125 e 250 mOsm/kg, entre 150 e 250 mOsm/kg, entre 175 e 350 mOsm/kg, entre 200 e 250 mOsm/kg, p. ex., aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 295, 300, 305, 310, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380,
182 / 395 385, 390, 395 ou aproximadamente 400 mOsm/kg. Faixas e valores intermediários às faixas e valores mencionados acima também se destinam a fazer parte desta invenção.
[00501] As composições farmacêuticas da invenção, compreendendo os agentes RNAi da invenção, podem estar presentes em um frasco que contém aproximadamente 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9 ou aproximadamente 2,0 mL da composição farmacêutica. A concentração dos agentes RNAi nas composições farmacêuticas da invenção pode ser aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 130, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 230, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 330, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 430, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 475, 480, 485, 490, 495 ou aproximadamente 500 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração dos agentes RNAi na composições farmacêuticas da invenção é aproximadamente 100 mg/mL. Valores intermediários às faixas e valores mencionados acima também se destinam a fazer parte desta invenção.
[00502] As composições farmacêuticas da invenção podem compreender um agente dsRNA da invenção em forma de ácido livre. Em outras modalidades da invenção, as composições farmacêuticas da invenção podem compreender um agente dsRNA da invenção em forma de sal, tal como uma forma de sal de sódio. Em certas modalidades, quando os agentes dsRNA da invenção estão na forma de sal de sódio, íons sódio estão presentes no agente como contraíons de substancialmente todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato presentes no agente. Agentes nos quais substancialmente todas as ligações fosfodiéster e/ou fosforotioato têm um contraíon sódio não incluem mais de 5, 4, 3, 2, ou 1 ligações fosfodiéster e/ou fosforotioato sem um contraíon sódio. Em algumas modalidades, quando os agentes dsRNA da
183 / 395 invenção estão na forma de sal de sódio, íons sódio estão presentes no agente como contraíons de todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato presentes no agente.
[00503] As composições farmacêuticas e formulações para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e semelhantes podem também ser úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas nas quais os iRNAs apresentados na invenção estão em mistura com um agente de liberação tópica tal como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Os lipídios e lipossomas adequados incluem neutros (p. ex., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearoilfosfatidil colina) negativos (p. ex., dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiônicos (p. ex., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). iRNAs apresentados na invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomas ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomos catiônicos. Alternativamente, iRNAs podem ser complexados com lipídios, em particular com lipídios catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem, entre outros, ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1- monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um alquil C1-20 éster (p. ex., isopropilmiristato IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Formulações tópicas são descritas detalhadamente na Patente U.S. No 6 747 014, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
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[00504] A. Formulações de iRNA compreendendo montagens moleculares membranosas
[00505] Um iRNA para uso nas composições e métodos da invenção podem ser formulado para entrada em uma montagem molecular membranosa, p. ex., um lipossoma ou uma micela. Existem muitas estruturas organizadas de tensoativos além de microemulsões que foram estudadas e usadas para a formulação de fármacos. Essas incluem monocamadas, micelas, bicamadas e vesículas. Vesículas, tais como lipossomas, têm atraído grande interesse por causa da sua especificidade e a duração de ação que oferecem do ponto de vista de liberação de fármacos. Na presente invenção, o termo “lipossoma” significa uma vesícula composta por lipídios anfifílicos dispostos em uma bicamada ou bicamadas esféricas.
[00506] Os lipossomas incluem vesículas unilamelares ou multilamelares que possuem uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição (p. ex., iRNA) a ser entregue. O material lipofílico isola a porção aquosa de um exterior aquoso, o qual tipicamente não inclui a composição de iRNA, embora possa incluir em alguns exemplos. Os lipossomas catiônicos possuem a vantagem de serem capazes de se fundir à parede celular. Os lipossomas não catiônicos, embora não sejam capazes de fundir tão eficientemente com a parede celular, são absorvidos por macrófagos in vivo.
[00507] Para que atravessem a pele intacta de mamíferos, as vesículas lipídicas precisam passar através de diversos poros finos, cada um com diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Portanto, é desejável usar um lipossoma com alto grau de deformação e capaz de passar através de tais poros finos.
[00508] Os lipossomas são úteis para a transferência e entrega de ingredientes ativos ao sítio de ação. Pelo fato de sua membrana ser estruturalmente semelhante às membranas biológicas, quando lipossomas são
185 / 395 aplicados a um tecido, os lipossomas começam a se fundir com as membranas celulares, e a fusão do lipossoma e a célula prossegue, o conteúdo do lipossoma é esvaziado para dentro da célula onde o agente ativo pode atuar.
[00509] As formulações de lipossomas têm sido o foco de investigação intensa como o modo de entrega para muitos fármacos. Há evidência crescente de que, para administração tópica, os lipossomas apresentam diversas vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzidos relacionados à alta absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo aumentado do fármaco administrado no alvo desejado e a capacidade para administrar uma grande variedade de fármacos, hidrofílicos e hidrofóbicos, dentro da pele.
[00510] Diversos relatos detalharam a capacidade dos lipossomas para entregar agentes, incluindo DNA de alto peso molecular, dentro da pele. Compostos incluindo analgésicos, anticorpos, hormônios e DNAs de alto peso molecular foram administrados à pele. A maioria das aplicações resultou no direcionamento para epiderme superior.
[00511] Um lipossoma contendo um agente iRNA pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente de modo que micelas se formem com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um lipídio catiônico anfipático ou lipídio conjugado. O detergente pode ter uma concentração crítica alta de micelas e ser não aniônico. Detergentes exemplares incluem colato, CHAPS, octilglicosídeo, desoxicolato e lauroil sarcosina. O preparado do agente iRNA é então adicionado às micelas que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos no lipídio interagem com o agente iRNA e condensem em volta do agente iRNA para formar um lipossoma. Depois da condensação, o detergente é removido, p. ex., por diálise, para produzir um preparado lisossomal do agente iRNA.
[00512] Se necessário, um composto carreador que auxilie na
186 / 395 condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, p. ex., por adição controlada. Por exemplo, o composto carreador pode ser um polímero que não seja um ácido nucleico (p. ex., espermina ou espermidina). O pH pode também ser ajustado para favorecer a condensação.
[00513] Métodos para produzir veículos estáveis para entrega de polinucleotídeos, os quais incorporam um complexo polinucleotídeo/lipídio catiônico como componentes estruturais do veículo de entrega, são descritos mais detalhadamente em, p. ex., WO 96/37194, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. A formação de lipossomas pode também incluir um ou mais aspectos de métodos exemplares descritos em Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; Patente U.S. No 4 897 355; Patente U.S. No 5 171 678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; e Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. As técnicas comumente usadas para preparar agregados lipídicos de tamanho apropriado para uso como veículos de entrega incluem sonicação e congelamento- descongelamento mais extrusão (ver, p. ex., Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Microfluidização pode ser utilizada quando agregados consistentemente pequenos (50 a 200 nm) e relativamente uniformes são desejados (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Esses métodos são rapidamente adaptados para o acondicionamento de preparados do agente iRNA em lipossomas.
[00514] Os lipossomas enquadram-se em duas classes amplas. Os lipossomas catiônicos são lipossomas de carga positiva que interagem com as moléculas de DNA carregadas positivamente e formam um complexo estável. O complexo DNA/lipossoma de carga positiva liga-se à superfície celular de carga negativa e é internalizado em um endossoma. Devido ao pH ácido
187 / 395 dentro do endossoma, os lipossomas rompem-se, liberando seu conteúdo no citoplasma da célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[00515] Lipossomas que são sensíveis ao pH ou de carga negativa, encapsulam em vez de formar um complexo com o DNA. Como a carga do DNA e do lipídio são semelhantes, ocorre repulsão em vez de formação de complexo. Não obstante, algum DNA é encapsulado dentro do interior aquoso desses lipossomas. Lipossomas sensíveis ao pH têm sido utilizado para entregar DNA que codifica o gene da timidina quinase a monocamadas celulares em cultura. A expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[00516] Um tipo importante de composição lipossomal inclui outros fosfolipídios que não derivados naturalmente de fosfatidilcolina . Composições de lipossomas neutros, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Composições de lipossomas aniônicos geralmente são formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto lipossomas fusogênicos aniônicos são formados primariamente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formado a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídio e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00517] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomas em células in vitro e in vivo incluem as Patentes U.S. Nos 5 283 185 e 5 171 678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem.32:7143, 1993; e Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
[00518] Sistemas lipossomais não iônicos foram também examinados
188 / 395 para determinar a sua utilidade na entrega de fármacos à pele, especialmente sistemas compreendendo um tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo NovasomeTM I (gliceril dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e NovasomeTM II (gliceril diestearato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para liberar ciclosporina-A na derme da pele de camundongo. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossomais não iônicos eram eficazes em facilitar o depósito de ciclosporina-A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
[00519] Lipossomas também incluem lipossomas “estericamente estabilizados”, um termo que, neste relatório descritivo, refere-se a lipossomas compreendendo um ou mais lipídios especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em vidas úteis circulantes aumentadas em relação aos lipossomas sem tais lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles nos quais parte da porção lipídica formadora da vesícula do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolipídeos, tais como monosialogangliosídeo GM1 ou (B) deriva-se com um ou mais polímeros hidrofílicos, tais como uma porção polietilenoglicol (PEG). Enquanto sem a intenção de vincular-se a qualquer teoria em particular, acredita-se na técnica que, pelo menos para lipossomas estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina ou lipídios derivados com PEG, a meia-vida aumentada na circulação desses lipossomas estericamente estabilizados deriva de uma absorção reduzida pelas células do sistema retículo-endotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[00520] Vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolipídios são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relataram a capacidade do monosialogangliosídeo GM1, galactocerebrosídeo sulfato e fosfatidilinositol melhorarem a meia-vida no
189 / 395 sangue dos lipossomas. Esses achados foram expostos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). A Patente U.S. No 4 837 028 e WO 88/04924, ambas concedidas a Allen et al., descrevem lipossomas que compreendem (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo GM1 ou um éster de galactocerebrosídeo sulfato. A Patente U.S. No 5 543 152 (Webb et al.) descreve lipossomas que compreendem esfingomielina. Lipossomas que compreendem 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina são descritos em WO 97/13499 (Lim et al).
[00521] Em algumas modalidades, são usados lipossomas catiônicos. Os lipossomas catiônicos possuem a vantagem de ser capaz de se fundirem à membrana celular. Lipossomas não catiônicos, embora não sejam capazes de fundirem-se tão eficientemente com a membrana plasmática, são absorvidos por macrófagos in vivo e podem ser usados para entregar agentes iRNA a macrófagos.
[00522] Vantagens adicionais dos lipossomas incluem: lipossomas obtidos a partir de fosfolipídios naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; lipossomas podem incorporar uma grande variedade de fármacos solúveis em água e em lipídios; lipossomas podem proteger iRNAs encapsulados em seus compartimentos internos de metabolismo e degradação (Rosoff, em “Pharmaceutical Dosage Forms”, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). As considerações importantes na preparação de formulações de lipossoma são a carga superficial do lipídio, o tamanho de vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
[00523] Um lipídio catiônico sintético com carga positiva, cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), pode ser usado para formar pequenos lipossomas que interagem espontaneamente com ácido nucleico para formar complexos lipídio-ácido nucleico que são capazes de se fundir com os lipídios de carga negativa das membranas celulares de células de cultura de tecido, resultando na entrega do agente iRNA (ver, p. ex.,
190 / 395 Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 e Patente U.S. No 4 897 355 para uma descrição de DOTMA e seu uso com DNA).
[00524] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3- (trimetilamônia)propano (DOTAP) pode ser usado em combinação com um fosfolipídio para formar vesículas pela complexação com DNA. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) é um agente eficaz para a entrega de ácidos nucleicos altamente aniônicos em células vivas de cultura celular que compreendem lipossomas de DOTMA com carga positiva, os quais interagem espontaneamente com polinucleotídeos de carga negativa para formar complexos. Quando lipossomas de carga positiva suficientes são usados, a carga final nos complexos resultantes é também positiva. Complexos carregados positivamente preparados dessa maneira ligam-se espontaneamente a superfícies celulares de carga negativa, fundem-se com a membrana plasmática e entregam eficientemente ácidos nucleicos funcionais para, por exemplo, células de cultura de tecido. Outro lipídio catiônico disponível comercialmente, 1,2-bis(oleoiloxi)-3,3-(trimetilamônia)propano (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difere de DOTMA pelo fato de que as porções oleoíla são unidas por ligações éster, em vez de éter.
[00525] Outros compostos relatados de lipídio catiônico incluem aqueles que foram conjugados a uma variedade de porções incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada a um de dois tipos de lipídios e inclui compostos tais como 5-carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) e dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermil-amida (“DPPES”) (ver, p. ex., Patente U.S. No 5 171 678).
[00526] Outra lipídio catiônico conjugado inclui a derivação do lipídio com colesterol (“DC-Chol”) que foi formulado em lipossomas em combinação com DOPE (ver, Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res.
191 / 395 Commun. 179:280, 1991). Lipopolilisina, produzida conjugando polilisina a DOPE, foi relatada como eficaz para transfecção na presença de soro (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para certas linhagens celulares, é dito que esses lipossomas contendo lipídios catiônicos conjugados exibem menor toxicidade e que proporcionam transfecção mais eficiente do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos de lipídios catiônicos disponíveis comercialmente incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) e Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Mariland). Outros lipídios catiônicos adequados para a entrega de oligonucleotídeos são descritos em WO 98/39359 e WO 96/37194.
[00527] As formulações lipossomais são especialmente adequadas para administração tópica, e os lipossomas apresentam diversas vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzidos relacionados à alta absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo aumentado do fármaco administrado no alvo desejado e a capacidade para administrar o agente iRNA na pele. Em algumas implementações, são usados lipossomas para entrega do agente iRNA a células da epiderme e também para intensificar a penetração do agente iRNA em tecidos dérmicos, p. ex., na pele. Por exemplo, os lipossomas podem ser aplicados topicamente. A entrega tópica de fármacos formulados como lipossomas à pele foi documentada (ver, p. ex., Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol.2,405-410 e du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276.1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. e Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[00528] Sistemas lipossomais não iônicos foram também examinados para determinar a sua utilidade na entrega de fármacos à pele, especialmente
192 / 395 sistemas compreendendo um tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo NovasomeTM I (gliceril dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e NovasomeTM II (gliceril diestearato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para liberar um fármaco na derme da pele de camundongos. Tais formulações com o agente iRNA são úteis para tratar uma doença dermatológica.
[00529] Lipossomas que incluem iRNA podem ter alto grau de deformação. Tal deformabilidade pode permitir que os lipossomas penetrem através de poros que são menores que o raio médio do lipossoma. Por exemplo, transferossomas são um tipo de lipossomas deformáveis. Transferossomas podem ser produzidos adicionando ativadores da borda superficial, normalmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Transferossomas que incluem iRNAs podem ser entregues, por exemplo, por via subcutânea por infecção a fim de entregar os iRNAs a queratinócitos na pele. Para que cruzem a pele intacta de mamíferos, as vesículas lipídicas precisam passar através de diversos poros finos, cada um com diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Além disso, devido às propriedades lipídicas, esses transferossomas podem se otimizar (adaptáveis à forma de poros, p. ex., na pele), se reparar e podem frequentemente atingir seus alvos sem fragmentar e, muitas vezes, se carregarem.
[00530] Outras formulações acessíveis à presente invenção são descritas em WO 2008/042973.
[00531] Os transferossomas são ainda outro tipo de lipossomas e são agregados lipídicos altamente deformáveis e candidatos atraentes para veículos para liberação de fármacos. Os transferossomas podem ser descritos como gotículas lipídicas tão altamente deformáveis que são facilmente capazes de penetrar através de poros que são menores do que a gotícula. Os transferossomas são adaptáveis ao ambiente no qual são usados, p. ex., se
193 / 395 otimizam (adaptáveis à forma de poros na pele), se reparam, frequentemente atingem seus alvos sem fragmentar e, muitas vezes, se carregam. Para produzir transferossomas, é possível adicionar ativadores da borda superficial, normalmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Transferossomas têm sido utilizados para entregar albumina sérica à pele. a entrega mediada por transferossoma de albumina sérica demonstrou ser eficaz em uma injeção subcutânea de uma solução contendo albumina sérica.
[00532] Os tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A maneira mais comum de classificar e ordenar as propriedades dos muitos diferentes tipos de tensoativos, tanto naturais como sintéticos, é pelo uso do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como a “cabeça”) fornece o meio mais útil para classificar os diferentes tensoativos usados em formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[00533] Se a molécula do tensoativo não é ionizada, este é classificado como tensoativo não iônico. Os tensoativos não iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e podem ser usados em uma grande faixa de valores do pH. Em geral, os seus valores de HLB variam de 2 a aproximadamente 18 dependendo da sua estrutura. Os tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos tais como ésteres de etilenoglicol, ésteres de propilenoglicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose e ésteres etoxilados. Alcanolamidas não iônicos e éteres, tais como etoxilados de álcoois graxos, álcoois propoxilados e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados estão também incluídos nessa classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativos não iônicos.
[00534] Se a molécula do tensoativo tiver uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Os
194 / 395 tensoativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sabões, acil lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tais como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tais como alquil benzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de tensoativos aniônicos são os alquil sulfatos e os sabões.
[00535] Se a molécula do tensoativo tiver uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Os tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usados dessa classe.
[00536] Se a molécula do tensoativo tiver a capacidade para carregar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Os tensoativos anfotéricos incluem derivados do ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[00537] O uso de tensoativos em produtos farmacológicos, formulações e em emulsões foi revisado (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[00538] O iRNA para uso nos métodos da invenção pode também ser fornecido em formulações micelares. “Micelas” são aqui definidas como um tipo particular de montagem molecular na qual moléculas anfipáticas, dispostas em uma estrutura esférica de tal modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas são direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa em volta. O arranjo inverso existe se o ambiente for hidrofóbico.
[00539] Uma formulação micelar mista, adequada para entrega através de membranas transdérmicas, pode ser preparada misturando uma solução aquosa de iRNA, um alquil C8 a C22 sulfato de metal alcalino e compostos formadores de micela. Compostos exemplares formadores de micela incluem
195 / 395 lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido láctico, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, monooleína, monooleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula noturna, mentol, trihidroxi-oxo-colanil-glicina e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e análogos dos mesmos, alquil éteres de polidocanol e análogos dos mesmos, quenodesoxicolato, desoxicolato e misturas dos mesmos. Os compostos formadores de micelas podem ser adicionados ao mesmo tempo ou depois da adição do alquil sulfato de metal alcalino. Micelas mistas se formarão com substancialmente qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas com mistura vigorosa para que sejam fornecidas micelas de tamanho menor.
[00540] Em um método, é preparada uma primeira composição micelar que contém o RNAi e pelo menos o alquil sulfato de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos formadores de micelas para formar uma composição micelar mista. Em outro método, a composição micelar é preparada misturando o RNAi, o alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um dos compostos formadores de micelas, seguido pela adição dos demais compostos formadores de micelas, com mistura vigorosa.
[00541] Fenol ou m-cresol pode ser adicionado à composição micelar mista para estabilizar a formulação e proteger contra o crescimento bacteriano. Alternativamente, fenol ou m-cresol pode ser adicionado com os ingredientes formadores de micelas. Um agente isotônico, tal como glicerina, pode também ser adicionado após a formação da composição micelar mista.
[00542] Para a entrega da formulação micelar em spray, a formulação pode ser colocada em um dispensador de aerossóis, e o dispersador é carregado com um propelente. O propelente, que está sob pressão, está em
196 / 395 forma líquida no dispensador. As proporções dos ingredientes são ajustadas de modo que a fase aquosa e de propelente se tornem uma, ou seja, há uma fase. Se houver duas fases, é necessário agitar o dispensador antes de dispensar uma porção do conteúdo, p. ex., através de uma válvula medidora. A dose dispensada de agente farmacêutico é propelida desde a válvula medidora em um spray fino.
[00543] Os propelentes podem incluir clorofluorocarbonetos contendo hidrogênio, fluorocarbonetos contendo hidrogênio, éter dimetílico e éter dietílico. Em certas modalidades, HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano) pode ser usado.
[00544] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas por experimentação relativamente direta. Para absorção através das cavidades orais, é frequentemente desejável aumentar, p. ex., pelo menos dobrar ou triplicar a dose para administração através de injeção ou administração através do trato gastrointestinal. B. Partículas lipídicas
[00545] iRNAs, p. ex., agentes dsRNA da invenção podem ser totalmente encapsulados em uma formulação lipídica, p. ex., uma LNP, ou outra partícula ácido nucleico-lipídio.
[00546] Neste relatório descritivo, o termo “LNP” refere-se a uma partícula ácido nucleico-lipídio estável. LNPs tipicamente contêm um lipídio catiônico, um lipídio não catiônico e um lipídio que impede a agregação da partícula (p. ex., um conjugado PEG-lipídio). LNPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem vidas úteis ampliadas na circulação após injeção intravenosa (i.v.) e acumulam-se em sítios distais (p. ex., sítios fisicamente separados do local de administração). Neste relatório descritivo, o termo “SPLP” refere-se a uma partícula ácido nucleico-lipídio que compreende DNA plasmidial encapsulado dentro de uma vesícula lipídica. LNPs incluem “pSPLP”, os quais incluem um complexo agente condensador-
197 / 395 ácido nucleico encapsulado como apresentado na Publicação PCT No WO 00/03683. As partículas da presente invenção tipicamente têm um diâmetro médio entre aproximadamente 50 nm e 150 nm, mais tipicamente entre aproximadamente 60 nm e 130 nm, mais tipicamente entre aproximadamente 70 nm e 110 nm, mais tipicamente entre aproximadamente 70 nm e 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Além disso, os ácidos nucleicos quando presentes nas partículas ácido nucleico-lipídio da presente invenção são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. Partículas ácido nucleico-lipídio e o método para sua preparação são descritos em, p. ex., Patentes U.S. Nos 5 976 567; 5 981 501; 6 534 484; 6 586 410; 6 815 432; e Publicação PCT No WO 96/40964.
[00547] Em certas modalidades, a razão lipídio/fármaco (razão massa/massa) (p. ex., razão lipídio/dsRNA) estará na faixa entre aproximadamente 1:1 e 50:1, entre aproximadamente 1:1 e 25:1, entre aproximadamente 3:1 e 15:1, entre aproximadamente 4:1 e 10:1, entre aproximadamente 5:1 e 9:1 ou entre aproximadamente 6:1 e 9:1. Faixas intermediárias às faixas mencionadas acima são também contempladas como parte da invenção.
[00548] O lipídio catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N,N-diestearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(I-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(I-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-Dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), l,2- Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2- Dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleioxi- 3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-
198 / 395 Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), 1,2- Dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano, sal cloreto (DLin-TMA.Cl), 1,2- Dilinoleoil-3-trimetilaminopropano, sal cloreto (DLin-TAP.Cl), 1,2- Dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) ou 3-(N,N- Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2- propanodiol (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), l,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou análogos dos mesmos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca- 9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila (MC3), 1,1’-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiyl)didodecan-2-ol (Tech G1) ou uma mistura dos mesmos. O lipídio catiônico pode compreender entre aproximadamente 20% mol e 50% mol ou aproximadamente 40% mol do lipídio total presente na partícula.
[00549] Em certas modalidades, o composto 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano pode ser usado para preparar nanopartículas de lipídio-siRNA. A síntese de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]- dioxolano é descrita no Pedido de Patente dos Estados Unidos Provisório Número 61/107 998, depositado em 23 de outubro de 2008, aqui incorporado por referência.
[00550] Em certas modalidades, a partícula lipídio-siRNA inclui 2,2- Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano 40%: DSPC 10%: Colesterol 40%: PEG-C-DOMG 10% (por cento molar) com tamanho de partícula de 63,0 ± 20 nm e razão siRNA/lipídio de 0,027.
[00551] O lipídio não catiônico pode ser um lipídio aniônico ou um lipídio neutro incluindo, entre outros, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC),
199 / 395 dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)- ciclohexano-l-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16- O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol ou uma mistura dos mesmos. O lipídio não catiônico pode ser entre 5% mol e 90% mol, aproximadamente 10% mol ou aproximadamente 58% mol, se colesterol estiver incluído, do lipídio total presente na partícula.
[00552] O lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um polietilenoglicol (PEG)-lipídio incluindo, entre outros, PEG-diacilglicerol (DAG), PEG-dialquiloxipropila (DAA), PEG-fosfolipídio, PEG-ceramida (Cer) ou uma mistura dos mesmos. O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, PEG-dilauriloxipropila (Ci2), PEG-dimiristiloxipropila (Ci4), PEG-dipalmitiloxipropila (Ci6) ou PEG-diesteariloxipropila (C]8). O lipídio conjugado que impede a agregação de partículas pode ser de 0% mol a aproximadamente 20% mol ou aproximadamente 2% mol do lipídio total presente na partícula.
[00553] Em algumas modalidades, a partícula ácido nucleico-lipídio inclui ainda colesterol, p. ex., entre aproximadamente 10% mol e 60% mol ou aproximadamente 48% mol do lipídio total presente na partícula. LNP01
[00554] Em certas modalidades, o lipidoide ND98∙4HCl (PM 1487) (ver, Pedido de Patente U.S. No 12/056,230, depositado em 26 de março de 2008, aqui incorporado por referência), Colesterol (Sigma-Aldrich) e PEG- Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) podem ser usados para preparar nanopartículas de lipídio-dsRNA (p. ex., partículas LNP01). Soluções estoque
200 / 395 de cada um em etanol podem ser preparadas como segue: ND98, 133 mg/mL; Colesterol, 25 mg/mL, PEG-Ceramida C16, 100 mg/mL. As soluções estoque de ND98, Colesterol e PEG-Ceramida podem ser então combinadas em, p. ex., razão molar 42:48:10. A solução de lipídios combinados pode ser misturada com dsRNA aquoso (p. ex., em acetato de sódio, pH 5) de tal modo que a concentração final de etanol seja entre aproximadamente 35-45% e a concentração final de acetato de sódio, aproximadamente 100-300 mM. As nanopartículas de lipídio-dsRNA tipicamente formam-se espontaneamente mediante mistura. Dependendo da distribuição desejada do tamanho de partículas, a mistura resultante de nanopartículas pode ser extrudada através de uma membrana de policarbonato (p. ex., corte de 100 nm) usando, por exemplo, uma extrusora Thermobarrel, tal como a Extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, a etapa de extrusão pode ser omitida. A remoção do etanol e a troca simultânea de tampão pode ser realizada, por exemplo, por diálise ou filtração em fluxo tangencial. O tampão pode ser trocado com, por exemplo, solução salina com tampão fosfato (PBS) em pH próximo a 7, p. ex., aproximadamente pH 6,9, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,1, aproximadamente pH 7,2, aproximadamente pH 7,3 ou aproximadamente pH 7,4.
H O N O H H N N N N N N H O N O O N
H H ND98 Isômero ND98 Isomer I I Fórmula 1
[00555] Formulações de LNP01 são descritas, p. ex., na Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 2008/042973, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
[00556] Formulações exemplares adicionais de lipídio-dsRNA são
201 / 395 fornecidas na tabela seguinte.
Tabela A: Formulações lipídicas exemplares Conjugado lipídio catiônico/lipídio não Lipídio catiônico catiônico/colesterol/PEG-lipídio Razão lipídio:siRNA DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA l,2-Dilinoleniloxi-N,N- SNALP (57,1/7,1/34,4/1,4) dimetilaminopropano (DLinDMA) lipídio:siRNA ~ 7:1 XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- S-XTC 57,1/7,1/34,4/1,4 [1,3]-dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 7:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- LNP05 57,5/7,5/31,5/3,5 [1,3]-dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 6:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- LNP06 57,5/7,5/31,5/3,5 [1,3]-dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 11:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- LNP07 60/7,5/31/1,5, [1,3]-dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 6:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- LNP08 60/7,5/31/1,5, [1,3]-dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 11:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- LNP09 50/10/38,5/1,5 [1,3]-dioxolano (XTC) Lipídio:siRNA 10:1 (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2- di((9Z,12Z)-octadeca-9,12- ALN100/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP10 dienil)tetrahidro-3aH- 50/10/38,5/1,5 ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina Lipídio:siRNA 10:1 (ALN100) 4-(dimetilamino)butanoato de MC-3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP11 (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta- 50/10/38,5/1,5 6,9,28,31-tetraen-19-ila (MC3) Lipídio:siRNA 10:1 1,1’-(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2- C12-200/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP12 hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1- 50/10/38,5/1,5 il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (C12- Lipídio:siRNA 10:1 200) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP13 XTC 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 33:1 MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP14 MC3 40/15/40/5 Lipídio:siRNA: 11:1 MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DSG/GalNAc- PEG-DSG LNP15 MC3 50/10/35/4,5/0,5 Lipídio:siRNA: 11:1 MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP16 MC3 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 7:1 MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DSG LNP17 MC3 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 10:1 MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP18 MC3 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 12:1
202 / 395 Conjugado lipídio catiônico/lipídio não Lipídio catiônico catiônico/colesterol/PEG-lipídio Razão lipídio:siRNA MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG LNP19 MC3 50/10/35/5 Lipídio:siRNA: 8:1 MC3/DSPC/Colesterol/PEG-DPG LNP20 MC3 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 10:1 C12-200/DSPC/Colesterol/PEG-DSG LNP21 C12-200 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 7:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DSG LNP22 XTC 50/10/38,5/1,5 Lipídio:siRNA: 10:1 DSPC: diestearoilfosfatidilcolina DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG ou PEG-C14) (PEG com massa molar média de 2000) PEG-DSG: PEG-diestiril glicerol (C18-PEG, ou PEG-C18) (PEG com massa molar média de 2000) PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG com massa molar média de 2000)
[00557] Formulações compreendendo SNALP (l,2-Dilinoleniloxi-N,N- dimetilaminopropano (DLinDMA)) são descritas na Publicação Internacional No. WO2009/127060, depositada em 15 de abril de 2009, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
[00558] Formulações compreendendo XTC são descritas, p. ex., no Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/148 366, depositado em 29 de janeiro de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/156 851, depositado em 02 de março de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/185 712, depositado em 10 de junho de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/228 373, depositado em 24 de julho de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/239 686, depositado em 03 de setembro de 2009, e Pedido de Patente Internacional No PCT/US2010/022614, depositado em 29 de janeiro de 2010, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.
[00559] Formulações compreendendo MC3 são descritas, p. ex., em Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/244 834, depositado em 22 de setembro de 2009, Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/185 800, depositado em 10 de junho de 2009 e Pedido de Patente Internacional No PCT/US10/28224, depositado em 10 de junho de 2010, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.
[00560] Formulações compreendendo ALNY-100 são descritas, p. ex.,
203 / 395 Pedido de Patente Internacional No PCT/US09/63933, depositado em 10 de novembro de 2009, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
[00561] Formulações compreendendo C12-200 são descritas em Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/175 770, depositado em 05 de maio de 2009 e Pedido de Patente Internacional No PCT/US10/33777, depositado em 05 de maio de 2010, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.
[00562] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. Em algumas modalidades, as formulações orais são aquelas nas quais dsRNAs apresentados na invenção são administrados em conjunto com um ou mais tensoativos promotores de penetração e quelantes. Os tensoativos adequados incluem ácidos graxos e/ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos biliares e/ou sais dos mesmos. Ácidos/sais biliares adequados incluem ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glicólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sódio e glicodihidrofusidato de sódio. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, um acilcarnitina, um acilcolina ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos (p. ex., sódio). Em algumas modalidades, são usadas combinações de promotores de penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos/sais biliares. Uma combinação exemplar é o sal de sódio de ácido
204 / 395 láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros promotores de penetração incluem polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. Os DsRNAs apresentados na invenção podem ser entregues por via oral, em forma granular, incluindo partículas secas por atomização ou complexadas para formar micro ou nanopartículas. Agentes complexantes de DsRNA incluem poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas com DEAE, polulanos, celuloses e amidos. Agentes complexantes adequados incluem quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, poli- histidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (p. ex., p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrano, polimetilacrilato, poli-hexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(DL-ácido láctico-co-glicólico (PLGA), alginato e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas detalhadamente na Patente U.S. 6,887 906, Publicação U.S. No 20030027780 e Patente U.S. No 6 747 014, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.
[00563] Composições e formulações para administração parenteral, intraparenquimatosa (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intra-hepática podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, entre outros, promotores de penetração, compostos carreadores e outros veículos farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes.
[00564] As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, entre outras, soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Essas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes
205 / 395 que incluem, entre outros, líquidos pré-formados, sólidos auto emulsificantes e semissólidos auto emulsificantes. São especialmente preferidas as formulações direcionadas ao fígado durante o tratamento de transtornos hepáticos tais como carcinoma hepático.
[00565] As formulações farmacêuticas da presente invenção, as quais podem ser convenientemente apresentadas em forma de dose unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de fazer com que os ingredientes ativos se associem com o(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas fazendo com que os ingredientes ativos se associem de modo uniforme e íntimo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos, ou ambos e então, se necessário, moldando o produto.
[00566] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma de muitas formas farmacêuticas possíveis, tais como, entre outras, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. As composições da presente invenção podem também ser formuladas como suspensões em meio aquoso, não aquoso ou misto. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode conter também estabilizantes.
[00567] Muitos lipossomas compreendendo lipídios derivados com um ou mais polímeros hidrofílicos, e métodos para preparação dos mesmos, são conhecidos na técnica. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) descreveram lipossomas compreendendo um detergente não iônico, 2C1215G, que contém uma porção PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) observaram que o revestimento hidrofílico de partículas de poliestireno com glicóis poliméricos resulta em meias-vidas no sangue significativamente
206 / 395 aumentadas. Fosfolipídios sintéticos modificados pelo acoplamento de grupos carboxílicos de polialquileno glicóis (p. ex., PEG) são descritos por Sears (Patentes U.S. Nos 4 426 330 e 4 534 899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) descreveram experimentos demonstrando que lipossomas que compreendem fosfatidiletanolamina (PE) derivada com PEG ou PEG- estearato aumentaram significativamente a meia-vida de circulação no sangue. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) ampliaram tais observações para outros fosfolipídios derivados com PEG, p. ex., DSPE-PEG, formados a partir da combinação de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) e PEG. Lipossomas com porções PEG ligadas covalentemente na sua superfície externa são descritos na Patente Europeia No EP 0 445 131 B1 e WO 90/04384 concedida a Fisher. Composições de lipossomas contendo 1-20 mol por cento de PE derivado com PEG, e métodos de uso dos mesmos, são descritos por Woodle et al. (Patentes U.S. Nos 5 013 556 e 5 356 633) e Martin et al. (Patente U.S. No 5 213 804 e Patente Europeia No EP 0 496 813 B1). Lipossomas compreendendo diversos outros conjugados de lipídio-polímero são expostos em WO 91/05545 e Patente U.S. No 5 225 212 (ambos concedidos a Martin et al.) e em WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Lipossomas compreendendo lipídios de ceramida modificados com PEG são descritos em WO 96/10391 (Choi et al). A Patente U.S. No 5 540 935 (Miyazaki et al.) e a Patente U.S. No 5 556 948 (Tagawa et al.) descrevem lipossomas contendo PEG que podem ser derivados mais com porções funcionais nas suas superfícies.
[00568] Diversos lipossomas compreendendo ácidos nucleicos são conhecidos na técnica. WO 96/40062, concedida a Thierry et al., descreve métodos para encapsulação de ácidos nucleicos de alto peso molecular. A Patente U.S. No 5 264 221, concedida a Tagawa et al., expõe lipossomas ligados a proteínas e afirma que o conteúdo de tais lipossomas pode incluir um dsRNA. Patente U.S. No 5 665 710, concedida a Rahman et al., descreve
207 / 395 certos métodos para encapsulação de oligodesoxinucleotídeos em lipossomas. WO 97/04787, concedida a Love et al., descreve lipossomas compreendendo dsRNAs direcionados para o gene raf. C. Formulações adicionais i. Emulsões
[00569] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são sistemas tipicamente heterogêneos de um líquido disperse em outro na forma de gotículas, normalmente com diâmetro acima de 0,1 µm (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos que compreendem duas fases líquidas imiscíveis misturas intimamente e dispersas uma na outra. Em geral, as emulsões podem ser da variedade água em óleo (w/o) ou a óleo em água (o/w). Quando uma fase aquosa é dividida finamente em e dispersa como gotículas minúsculas em uma fase oleosa volumosa, a composição resultante é denominada emulsão água em óleo (w/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é dividida finamente em e dispersa como gotículas minúsculas em uma fase aquosa volumosa, a composição resultante é denominada emulsão óleo em água (o/w). As emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas, e o fármaco ativo que podem estar presente como uma solução em fase aquosa, fase oleosa ou
208 / 395 por si mesmo como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos, tais como emulsificantes, estabilizantes, corantes e antioxidantes podem também estar presentes em emulsões se necessário. As emulsões farmacêuticas podem também ser emulsões múltiplas que são compostas por mais de duas fases, tais como, por exemplo, no caso de emulsões óleo em água em óleo (o/w/o) e água em óleo em água (w/o/w). Tais formulações complexas frequentemente oferecem certas vantagens que as emulsões binárias simples não o fazem. As emulsões múltiplas nas quais gotículas oleosas individuais de uma emulsão o/w envolvem pequenas gotículas de água constituem uma emulsão w/o/w. Do mesmo modo, um sistema de gotículas oleosas envolvidas em glóbulos de água estabilizados em uma fase oleosa contínua fornece uma emulsão o/w/o.
[00570] As emulsões são caracterizadas por pouco ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Com frequência, a fase dispersa ou descontínua da emulsão está bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nessa forma por meio de emulsificantes ou a viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases de pomadas e cremes no estilo de emulsão. Outros meios para estabilizar emulsões implica no uso de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer uma das fases da emulsão. Os emulsificantes podem ser classificados amplamente em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes naturais, bases de absorção e sólidos finamente dispersos (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[00571] Os tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes de superfície ativa, demostraram ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revisados na literatura (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical
209 / 395 Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Os tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e uma hidrofóbica. A relação da natureza hidrofílica para a hidrofóbica do tensoativo foi denominada o equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta de valor para classificar e selecionar tensoativos na preparação de formulações. Os tensoativos podem ser classificados em classes diferentes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
[00572] Os emulsificantes naturais usados em formulações em emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, lecitina e acácia. As bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas de tal modo que podem absorver água para formar emulsões w/o ainda retêm as suas consistências semissólidas, tais como lanolina anidra e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos também podem ser utilizados como bons emulsificantes, especialmente em combinação com tensoativos e em preparados viscosos. Esses incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansivas, tais como bentonita, attapulgita, hectorita, caulim, montmorillonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmento, e sólidos não polares tais como carbono ou triestearato de glicerila.
210 / 395
[00573] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes também está incluída em formulações em emulsão e contribui para as propriedades das emulsões. Esses incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[00574] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas naturais e polímeros sintéticos, tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma karaya e tragacanta), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose), e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose e polímeros de carboxivinila). Esses dispersam ou expandem em água para formar soluções coloidais que estabilizam emulsões ao formarem películas interfaciais fortes em volta das gotículas na fase dispersa e ao aumentarem a viscosidade da fase externa.
[00575] Como as emulsões frequentemente contêm diversos ingredientes, tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem apoiar facilmente o crescimento de micróbios, essas formulações muitas vezes incorporam conservantes. Os conservantes comumente usados incluídos em formulações em emulsão incluem metilparabeno, propilparabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres do ácido p-hidroxibenzoico e ácido bórico. Antioxidantes são também comumente adicionados a formulações em emulsão para impedir a deterioração da formulação. Os antioxidantes usados podem ser sequestradores (scavenger) de radicais livres, tais como tocoferóis, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores
211 / 395 tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e antioxidantes sinérgicos tais como ácido cítrico, ácido tartárico e lecitina.
[00576] A aplicação de formulações em emulsão através de vias dermatológicas, orais e parenterais e métodos para a sua fabricação foram revisados na literatura (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Formulações em emulsão para liberação oral têm sido amplamente utilizadas por causa da facilidade de formulação, bem como a eficácia de um ponto de vista de absorção e disponibilidade (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Laxantes à base de óleo mineral, vitaminais solúveis em óleo e preparados nutritivos com alto teor de gordura estão entre os materiais que têm sido comumente administrados por via oral como emulsões o/w. ii. Microemulsões
[00577] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de iRNAs e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifílico que é uma única solução líquida opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Rosoff,
212 / 395 em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Tipicamente, as microemulsões são sistemas que são preparados primeiramente dispersando um óleo em uma solução tensoativa aquosa e, depois, adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool com comprimento de cadeia intermediário para formar um sistema transparente. Portanto, as microemulsões têm sido também descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente claras de dois líquidos imiscíveis que são estabilizados por películas interfaciais de moléculas com superfície ativa (Leung and Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polímeros and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215). As microemulsões são preparadas comumente através de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, co-tensoativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água em óleo (w/o) ou óleo em água (o/w) depende das propriedades do óleo e do tensoativo usados e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidrocarbonetos das moléculas do tensoativo (Schott, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
[00578] A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fases foi extensamente estudada e produziu um conhecimento abrangente, para o técnico no assunto, do modo como formular microemulsões (ver, p. ex., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Quando comparadas às emulsões convencionais, as
213 / 395 microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fármacos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que são formadas espontaneamente.
[00579] Os tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, entre outros, tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij 96, oleil éteres de polioxietileno, ésteres de ácidos graxos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), isoladamente ou em combinação com co-tensoativos. O co- tensoativo, normalmente um álcool de cadeia curta como etanol, 1-propanol e 1-butanol, tem como função aumentar a fluidez interfacial ao penetrar na película do tensoativo e, consequentemente, criar uma película desordenada por causa do espaço vazio gerado entre as moléculas do tensoativo. As microemulsões podem, no entanto, ser preparadas sem o uso de co- tensoativos e são conhecidos sistemas de microemulsão sem álcool autoemulsificantes na técnica. A fase aquosa pode ser tipicamente, entre outros, água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propilenoglicóis e derivados de etilenoglicol. A fase oleosa pode incluir, entre outros, materiais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di, e tri-glicerídeos de cadeia média (C8- C12), ésteres de ácidos graxos de glicerila polioxietoxilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolizados, glicerídeos C8-C10 poliglicolizados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00580] As microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista de solubilização de fármacos e aumento da absorção de fármacos. Microemulsões à base de lipídios (tanto o/w como w/o) foram propostas para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (ver, p.
214 / 395 ex., as Patentes U.S. Nos 6 191 105; 7 063 860; 7 070 802; 7 157 099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões oferecem como vantagens solubilização melhorada de fármacos, proteção do fármaco contra hidrólise enzimática, possível aumento da absorção do fármaco devido às alterações induzidas pelo tensoativo na fluidez e permeabilidade através da membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral em relação a formas farmacêuticas sólidas, potência clínica melhorada e toxicidade diminuída (ver, p. ex., as Patentes U.S. Nos 6 191 105; 7 063 860; 7 070 802; 7 157 099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Com frequência, as microemulsões podem formar-se espontaneamente quando seus componentes são reunidos à temperatura ambiente. Isso pode ser especialmente vantajoso quando se formulam fármacos termossensíveis, peptídeos ou iRNAs. As microemulsões têm sido também eficazes na entrega transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. Prevê-se que as composições e formulações em microemulsão da presente invenção venham a facilitar a absorção sistêmica aumentada de iRNAs e ácidos nucleicos a partir do trato gastrointestinal, bem como melhorar a absorção celular local de iRNAs e ácidos nucleicos.
[00581] As microemulsões da presente invenção podem também conter outros componentes e aditivos tais como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol e promotores de penetração para melhorar as propriedades da formulação e intensificar a absorção dos iRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Os promotores de penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencentes a um de cinco amplas categorias - tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não tensoativos não quelantes (Lee et al., Critical Reviews in
215 / 395 Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uma dessas classes foi discutida acima. iii. Micropartículas
[00582] Um agente RNAi da invenção pode ser incorporado em uma partícula, p. ex., uma micropartícula. As micropartículas podem ser produzidas por secagem por atomização, mas podem também ser produzidas por outros métodos incluindo liofilização, evaporação, secagem em leito fluido, secagem a vácuo ou uma combinação dessas técnicas. iv. Promotores de penetração
[00583] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários promotores de penetração para efetuar a entrega eficiente de ácidos nucleicos, especialmente iRNAs, à pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução em formas ionizadas e não ionizadas. No entanto, normalmente fármacos solúveis somente em lipídios ou lipofílicos cruzam rapidamente as membranas celulares. Foi descoberto que mesmo fármacos não lipofílicos são capazes de cruzar as membranas celulares se a membrana a ser cruzada é tratada com um promotor de penetração. Além de ajudar na difusão de fármacos não lipofílicos através das membranas celulares, os promotores de penetração também intensificam a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00584] Os promotores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma de cinco categorias amplas, ou seja, tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não tensoativos não quelantes (ver, p. ex., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada uma das classes mencionadas acima de promotores de penetração é descrita abaixo mais detalhadamente.
[00585] Os tensoativos (ou “agentes de superfície ativa”) são entidades químicas que, quando dissolvidos em uma solução aquosa, reduzem a tensão
216 / 395 superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outros líquidos, com o resultado de que a absorção de iRNAs através da mucosa é intensificada. Além de sais biliares e ácidos graxos, esses promotores de penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, polioxietileno-9- lauril éter e polioxietileno-20-cetil éter) (ver, p. ex., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); e emulsões perfluoroquímicas, tais como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[00586] Vários ácidos graxos e seus derivados que atuam como promotores de penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, 1- monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, alquil C1-20 ésteres dos mesmos (p. ex., metila, isopropila e t- butila), e mono- e di-glicerídeos dos mesmos (ou seja, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato etc.) (ver, p. ex., Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1- 33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[00587] O função fisiológica da bile inclui facilitar a dispersão e absorção de lipídios e vitaminas solúveis em gordura (ver, p. ex., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como promotores de penetração. Assim, o
217 / 395 termo “sais biliares” inclui qualquer um dos componentes naturais da bile, bem como qualquer um de seus derivados sintéticos. Os sais biliares adequados incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido dehidrocólico (dehidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodihidrofusidato de sódio e polioxietileno-9-lauril éter (POE) (ver, p. ex., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 em: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579- 583).
[00588] Agentes quelantes, como usados em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução formando complexos com os mesmos, com o resultado de que a absorção de iRNAs através da mucosa é intensificada. Em relação ao seu uso como promotores de penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicional de também servir como inibidores de DNase, pois as DNA nucleases mais caracterizadas requerem um íon de metal bivalente para catálise e são, assim, inibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes adequados incluem, entre outros, etilenodiaminetetracetato dissódico (EDTA), ácido cítrico,
218 / 395 salicilatos (p. ex., salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato), derivados N-acila de colágeno, laureth-9 e derivados N-amino acila de beta- dicetonas (enaminas) (ver, p. ex., Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00589] Neste relatório descritivo, compostos não tensoativos não quelantes que promovem a penetração podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensoativos, mas que, não obstante, intensificam a absorção de iRNAs através da mucosa alimentar (ver, p. ex., Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Essa classe de promotores de penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados 1-alquil- e 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroides tais como diclofenaco de sódio, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00590] Agentes que intensificam a captação de iRNAs em nível celular podem também ser adicionados às composições farmacêuticas e outras da presente invenção. Por exemplo, lipídio catiônicos, tais como lipofectina (Junichi et al, Patente U.S. No 5 705 188), derivados catiônicos de glicerol e moléculas policatiônicas, tais como polilisina (Lollo et al., Pedido de Patente PCT WO 97/30731), são também conhecidos por intensificarem a absorção celular de dsRNAs. Exemplos de reagentes de transfecção disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX
219 / 395 (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 Transfection Reagent (Roche; Grenzacherstrasse, Suíça), DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Grenzacherstrasse, Suíça), DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Grenzacherstrasse, Suíça) ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suíça), Transfectam® Reagent (Promega; Madison, WI), TransFast™ Transfection Reagent (Promega; Madison, WI), Tfx™-20 Reagent (Promega; Madison, WI), Tfx™-50 Reagent (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marselha, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marselha, França), TransPassª D1 Transfection Reagent (New England Biolabs; Ipswich, MA, EUA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EUA), PerFectin Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, EUA), NeuroPORTER Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, EUA), GenePORTER Transfection reagent (Genlantis; San Diego, CA, EUA), GenePORTER 2 Transfection reagent (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Cytofectin Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, EUA), BaculoPORTER Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, EUA), TroganPORTER™ transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, USA ), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA) ou HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EUA), entre outros.
[00591] Outros agentes podem ser utilizados para intensificar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis tais como etilenoglicol e propilenoglicol, pirróis tais como 2-pirrol, azonas e terpenos tais como limoneno e mentona. v. Carreadores
220 / 395
[00592] Certas composições da presente invenção também incorporam compostos carreadores na formulação. Neste relatório descritivo, “composto carreador” ou “carreador” pode referir-se a um ácido nucleico, ou análogo do mesmo, que é inerte (ou seja, não possui atividade biológica per se), mas que é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo atividade biológica, por exemplo, ao degradar o ácido nucleico biologicamente ativo ou promover sua retirada da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto carreador, tipicamente com excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperado no fígado, no rim ou em outros reservatórios extracirculatórios, supostamente devido à competição entre o composto carreador e o ácido nucleico por um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando este é coadministrado com um ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4’isotiociano-estilbeno-2,2’-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183. vi. Excipientes
[00593] Ao contrário de um composto carreador, um “veículo (carrier) farmacêutico” ou “excipiente” é um solvente, agente de suspensão farmaceuticamente aceitável ou outro veículo farmacologicamente inerte para entrega de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com modo de administração planejado em mente, de modo a fornecer o volume desejado, consistência etc., quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Os veículos farmacêuticos típicos incluem, entre outras, agentes de ligação (p. ex., amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose etc.); materiais de
221 / 395 preenchimento (p. ex., lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio etc.); lubrificantes (p. ex., estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietilenoglicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio etc.); desintegrantes (p. ex., amido, amido glicolato de sódio etc.); e agentes umectantes (p. ex., lauril sulfato de sódio etc.).
[00594] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis, adequados para administração não parenteral, que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos, podem também ser usados para formular as composições da presente invenção. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, entre outros, água, soluções salinas, álcoois, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.
[00595] As formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases oleosas líquidas ou sólidas. As soluções podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis, adequados para administração não parenteral, que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos podem ser utilizados.
[00596] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, entre outros, água, soluções salinas, álcoois, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes. vi. Outros componentes
[00597] As composições da presente invenção podem conter adicionalmente outros componentes adjuvantes convencionalmente
222 / 395 encontrados em composições farmacêuticas, em seus níveis de utilização estabelecido na técnica. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais compatíveis, farmaceuticamente ativos, tais como, por exemplo, antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti- inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis para formular fisicamente de várias formas farmacêuticas das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. No entanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, p. ex., lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não interagem prejudicialmente com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00598] Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódico, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes.
[00599] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas apresentados na invenção incluem (a) um ou mais compostos de iRNA e (b) um ou mais agentes que atuam por um mecanismo não de RNAi e que são úteis no tratamento de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13. Exemplos de tais agentes incluem, entre outros: piridoxina, um inibidor da ACE (inibidores da enzima conversora de angiotensina), p. ex., benazepril (Lotensin); um antagonista de receptores de angiotensina II (ARB) (p. ex., losartana potássica, tal como Cozaar® da Merck & Co.), p. ex., Candesartana (Atacand); um inibidor de
223 / 395 HMG-CoA redutase (p. ex., uma estatina); agentes de ligação ao cálcio, p. ex., fosfato de celulose sódica (Calcibind); diuréticos, p. ex., diuréticos de tiazida, tais como hidroclorotiazida (Microzide); um sensibilizador de insulina, tal como o agonista de PPARγ pioglitazona, um agonista de glp-1r, como liraglutatida, vitamina E, um inibidor de SGLT2, um inibidor de DPPIV, e transplante de rim/fígado; ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.
[00600] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, p. ex., para determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e este pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Compostos que exibem índices terapêuticos elevados são preferidos.
[00601] Os dados obtidos de ensaios em culturas celulares e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dose de composições aqui apresentadas na invenção situa-se, geralmente, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dose pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma farmacêutica empregada e a vida de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios em cultura celular. Um dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma faixa de concentração plasmática circulante do composto ou, quando apropriado, do produto polipeptídico de uma sequência alvo (p. ex., alcançando uma concentração diminuída do polipeptídeo) que inclui a IC50 (ou seja, a concentração do composto em teste que alcança a metade da inibição máxima dos sintomas), conforme determinada em cultura celular. Tais informações podem ser usadas
224 / 395 para determinar com mais precisão doses úteis em humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
[00602] Além da sua administração, como discutido acima, os iRNAs apresentados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados pela expressão de HSD17B13. Em qualquer caso, o médico administrador pode ajustar a quantidade e o momento da administração de iRNA tendo por base os resultados observados usando medidas padrão de eficácia conhecidas na técnica ou aqui descritas. Síntese de lipídios catiônicos:
[00603] Qualquer um dos compostos, p. ex., lipídios catiônicos e semelhantes, usados na partículas ácido nucleico-lipídio apresentadas na invenção, pode ser preparado por técnicas conhecidas de síntese orgânica. Todos os substituintes são como definidos abaixo a menos que indicado o contrário.
[00604] “Alquila” significa um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia linear ou ramificada, não cíclico ou cíclico contendo de 1 a 24 átomos de carbono. Alquilas saturados de cadeia linear representativos incluem metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n-hexila e semelhantes; enquanto alquilas saturados ramificados incluem isopropila, sec-butila, isobutila, terc- butila, isopentila e semelhantes. Alquilas cíclicos saturados representativos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila e semelhantes; enquanto alquilas cíclicos insaturados incluem ciclopentenila e ciclohexenila e semelhantes.
[00605] “Alquenila” significa um alquila, como definido acima, contendo pelo menos uma ligação dupla entre átomos adjacentes de carbono. Alquenilas incluem isômeros cis e trans. Alquenilas representativos de cadeia linear e ramificada incluem etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila,
225 / 395 2,3-dimetil-2-butenila e semelhantes.
[00606] “Alquinila” significa qualquer alquila ou alquenila, como definido acima, que contém adicionalmente pelo menos uma ligação tripla entre carbonos adjacentes. Alquinilas representativos de cadeia linear e ramificada incluem acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2- pentinila, 3-metil-1-butinila e semelhantes.
[00607] “Acila” significa qualquer alquila, alquenila ou alquinila, em que o carbono no ponto de ligação é substituído por um grupo oxo, como definido abaixo. Por exemplo, -C(=O)alquila, -C(=O)alquenila e - C(=O)alquinila são grupos acila.
[00608] “Heterociclo” significa um anel heterocíclico monocíclico de 5 a 7 membros ou bicíclico de 7 a 10 membros, o qual é saturado, insaturado ou aromático e que contém de 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre, e em que os heteroátomos nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados, e o heteroátomo nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos nos quais qualquer um dos heterociclos acima são fundidos a um anel benzeno. O heterociclo pode ser ligado através de qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Os heterociclos incluem heteroarilas como definidos abaixo. Os heterociclos incluem morfolinila, pirrolidinonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamila, oxiranila, oxetanila, tetrahidrofuranila, tetrahidropiranila, tetrahidropiridinila, tetrahidroprimidinila, tetrahidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila, tetrahidropirimidinila, tetrahidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila e semelhantes.
[00609] Os termos “alquila opcionalmente substituído”, “alquenila opcionalmente substituído”, “alquinila opcionalmente substituído”, “acila opcionalmente substituído” e “heterociclo opcionalmente substituído” significam que, quando substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por um substituinte. No caso de um substituinte oxo (=O), dois
226 / 395 átomos de hidrogênio são substituídos. A esse respeito, os substituintes incluem oxo, halogênio, heterociclo, -CN, -ORx, -nRxRy, -nRxC(=O)Ry, - nRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy, em que n é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são iguais ou diferentes e independentemente hidrogênio, alquila ou heterociclo, e cada um dos ditos substituintes alquila e heterociclo podem ser ainda substituídos com um ou mais dentre oxo, halogênio, -OH, -CN, alquila, -ORx, heterociclo, -nRxRy, -nRxC(=O)Ry, - nRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy.
[00610] “Halogênio” significa flúor, cloro, bromo e iodo.
[00611] Em algumas modalidades, os métodos apresentados na invenção podem requerer o uso de grupos protetores. A metodologia de grupos protetores é bem conhecida pelos técnicos no assunto (ver, por exemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley- Interscience, New York City, 1999). Resumidamente, grupos protetores dentro do contexto desta invenção são qualquer grupo que reduz ou elimina a reatividade indesejada de um grupo funcional. Um grupo protetor pode ser adicionado a um grupo funcional para mascarar sua reatividade durante certas reações e, a seguir, removido para revelar o grupo funcional original. Em algumas modalidades, um “grupo protetor de álcool” é usado. Um “grupo protetor de álcool” é qualquer grupo que diminui ou elimina a reatividade indesejada de um grupo funcional álcool. Os grupos protetores podem ser adicionados e removidos por meio de técnicas bem conhecidas no campo. Síntese de Fórmula A:
[00612] Em certas modalidades, as partículas ácido nucleico-lipídio apresentadas na invenção são formuladas usando um lipídio catiônico de fórmula A:
227 / 395 , onde R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, podendo cada um ser opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior, ou R3 e R4 podem ser considerados juntos e formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído heterocíclico. Em algumas modalidades, o lipídio catiônico é XTC (2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). Em geral, o lipídio de fórmula A acima pode ser produzido pelos Esquemas de Reação 1 ou 2 a seguir, em que todos os substituintes são como definidos acima a menos que indicado o contrário. Esquema 1 Fórmula A
[00613] O Lipídio A, em que R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, podendo cada um ser opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior ou R3 e R4 podem ser considerados juntos e formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, pode ser preparado de acordo com o Esquema 1. A cetona 1 e o brometo 2 podem ser adquiridos ou preparados de acordo com métodos conhecidos por qualquer técnico no assunto. A reação de 1 e 2 produz o cetal 3. O tratamento do cetal 3 com a amina 4 produz lipídios de fórmula A. Os lipídios de fórmula A
228 / 395 podem ser convertidos no sal de amônio correspondente com um sal orgânico de fórmula 5, onde X é um contraíon aniônico selecionado dentre halogênio, hidróxido, fosfato, sulfato ou semelhantes. Esquema 2
[00614] Alternativamente, o material de partida cetona 1 pode ser preparado de acordo com o Esquema 2. O reagente de Grignard 6 e o cianeto 7 podem ser adquiridos ou preparados de acordo com métodos conhecidos por qualquer técnico o assunto. A reação de 6 e 7 produz a cetona 1. A conversão da cetona 1 nos lipídios correspondentes de fórmula A é como descrita no Esquema 1. Síntese de MC3:
[00615] A preparação de DLin-M-C3-DMA (ou seja, 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila) foi como segue. Uma solução de (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g), cloridrato do ácido 4-N,N- dimetilaminobutírico (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61g) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,53 g) em diclorometano (5 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi Lavada com ácido clorídrico, seguido por bicarbonato de sódio aquoso diluído. As frações orgânicas foram secas com sulfato de magnésio anidro, filtradas e o solvente removido em um rotovap. O resíduo foi passado para baixo de uma coluna de sílica gel (20 g) usando um gradiente de eluição
229 / 395 metanol 1-5%/diclorometano. As frações contendo o produto purificado foram combinadas e o solvente removido, produzindo um óleo incolor (0,54 g). Síntese de ALNY-100:
[00616] A síntese do cetal 519 [ALNY-100] foi realizada usando o Esquema 3 seguinte: Síntese de 515:
[00617] A uma suspensão agitada de LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) em 200 mL de THF anidro em um RBF de duas bocas (1L), adicionou-se lentamente uma solução de 514 (10 g, 0,04926 mol) em 70 mL de THF a 0 ºC sob atmosfera de nitrogênio. Depois de concluída a adição, a mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e, a seguir, aquecida ao refluxo por 4 horas. O progresso da reação foi monitorado por TLC. Depois de concluída a reação (por TLC), a mistura foi resfriada até 0 ºC e interrompida pela adição cuidadosa de solução saturada de Na2SO4. A mistura de reação foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente e filtrada. O resíduo foi lavado bem com THF. O filtrado e as lavagens foram misturados e diluídos com 400 mL de dioxano e 26 mL de HCl concentrado, e agitados por 20 minutos à temperatura ambiente. As volatilidades foram removidas sob vácuo para fornecer o sal cloridrato de 515 como um sólido branco. Rendimento: 7,12 g. RMN 1H (DMSO, 400 MHz): δ= 9,34 (largo, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H). Síntese de 516:
[00618] A uma solução agitada do composto 515 em 100 mL de DCM
230 / 395 seco em um RBF com duas bocas de 250 mL, adicionou-se NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) e resfriou-se até 0 ºC sob atmosfera de nitrogênio. Após uma adição lenta de N-(benziloxi-carboniloxi)-succinimida (20 g, 0,08007 mol) em 50 mL de DCM seco, a mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente. Depois de concluída a reação, (2-3 horas por TLC), a mistura foi lavada sucessivamente com solução de HCl 1N (1 x 100 mL) e solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL). A camada orgânica foi então seca com Na2SO4 anidro, e o solvente foi evaporado, fornecendo material bruto que foi purificado por cromatografia em sílica gel para obter 516 como uma massa pegajosa. Rendimento: 11g (89%). RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ = 7,36-7,27 (m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (br., 1H) 2,74 (s, 3H), 2,60(m, 2H), 2,30-2,25 (m, 2H). LC-MS [M+H] -232,3 (96,94%). Síntese de 517A e 517B:
[00619] O ciclopenteno 516 (5 g, 0,02164 mol) foi dissolvido em uma solução de 220 mL de acetona e água (10:1) em um RBF com uma única boca de 500 mL, e a este foi adicionado N-óxido de N-metil-morfolina (7,6 g, 0,06492 mol), seguido por 4,2 mL de solução 7,6% de OsO4 (0,275 g, 0,00108 mol) em terc-butanol à temperatura ambiente. Depois de concluída a reação (~ 3 horas), a misture foi interrompida com a adição de Na2SO3 sólido, e a mistura resultante foi agitada por 1,5 hora à temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM (300 mL) e lavada com água (2 x 100 mL), seguida por solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL), água (1 x 30 mL) e finalmente com salmoura (1x 50 mL). A fase orgânica foi seca com Na2SO4 e o solvente, removido a vácuo. A purificação por cromatografia em coluna de sílica gel do material bruto forneceu uma mistura de diastereoisômeros, os quais foram separados por HPLC preparativa. Rendimento: - 6 g 517A bruto - Pico-1 (sólido branco), 5,13 g (96%). RMN 1H (DMSO, 400 MHz): δ= 7,39-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2H), 3,94-3,93 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 1,72- 1,67 (m, 4H),
231 / 395 LC-MS - [M+H]-266,3. [M+NH4 +]-283,5 presentes, HPLC-97,86%. Estereoquímica confirmada por raio-X. Síntese de 518:
[00620] Usando um procedimento análogo àquele descrito para a síntese do composto 505, o composto 518 (1,2 g, 41%) foi obtido como um óleo incolor. RMN 1H (CDCl3, 400MHz): δ= 7,35-7,33 (m, 4H), 7,30-7,27 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 8H), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m,1H), 4,58-4,57 (m,2H), 2,78-2,74 (m,7H), 2,06-2,00 (m,8H), 1,96-1,91 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (br m, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65%.
[00621] Procedimento geral para a síntese de Composto 519: Uma solução do composto 518 (1 eq.) em hexano (15 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução gelada de LAH em THF (1 M, 2 eq.). Depois de concluída a adição, a mistura foi aquecida a 40 ºC ao longo de 0,5 hora, então, resfriada novamente com um banho de gelo. A mistura foi cuidadosamente hidrolisada com Na2SO4 aquoso saturado, a seguir, filtrada através de Celite® e reduzida a um óleo. A cromatografia em coluna forneceu o 519 puro (1,3 g, 68%), o qual foi obtido como um óleo incolor. RMN 13C = 130,2; 130,1 (x2); 127,9 (x3); 112,3; 79,3; 64,4; 44,7; 38,3; 35,4; 31,5; 29,9 (x2); 29,7; 29,6 (x2); 29,5 (x3); 29,3 (x2); 27,2 (x3); 25,6; 24,5; 23,3; 226; 14,1; Electrospray MS (+ve): Peso molecular de C44H80NO2 (M + H)+ Calculado 654,6, Encontrado 654,6.
[00622] Formulações preparadas pelo método padrão ou o sem extrusão podem ser caracterizadas de maneiras semelhantes. Por exemplo, as formulações são caracterizadas tipicamente por inspeção visual. Elas devem ser soluções esbranquiçadas translúcidas, livres de agregados ou sedimento. O tamanho de partículas e a distribuição do tamanho de partículas de nanopartículas lipídicas podem ser medidos por espalhamento de luz, usando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). As partículas devem ter cerca de 20-300 nm, tal como 40-100 nm de tamanho. A
232 / 395 distribuição do tamanho de partículas deve ser unimodal. A concentração de dsRNA total na formulação, bem como a fração encapsulada, é estimada usando um ensaio de exclusão com corante. Uma amostra do dsRNA formulado pode ser incubado com um corante que se liga a RNA, tal como RiboGreen® (Molecular Probes) na presença ou ausência de um tensoativo que rompe a formulação, p. ex., Triton-X100 0,5%. O dsRNA total na formulação pode ser determinado pelo sinal da amostra sample contendo o tensoativo, em relação a uma curva padrão. A fração encapsulada é determinada subtraindo o teor de dsRNA “livre” (conforme medido pelo sinal na ausência de tensoativo) do teor de dsRNA total. O percentual de dsRNA encapsulado é tipicamente >85%. Para formulação em SNALP, o tamanho de partícula é pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 110 nm e pelo menos 120 nm. Tipicamente, a faixa adequada é aproximadamente entre pelo menos 50 nm e pelo menos 110 nm, aproximadamente entre pelo menos pelo menos 60 nm e pelo menos 100 nm ou aproximadamente entre pelo menos 80 nm e pelo menos 90 nm. VI. Métodos da invenção
[00623] A presente invenção também provê métodos para utilização de um iRNA da invenção e/ou uma composição da invenção para reduzir e/ou inibir a expressão de HSD17B13 em uma célula, tal como uma célula em um indivíduo, p. ex., um hepatócito. Os métodos incluem colocar a célula em contato com um agente RNAi ou composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA da invenção. Em algumas modalidades, a célula é mantida por um tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA de um gene HSD17B13.
[00624] A presente invenção também provê métodos para utilização de um iRNA da invenção e/ou uma composição da invenção e um agente iRNA direcionado para um gene Domínio de Fosfolipase tipo Patatina-3 (PNPLA3)
233 / 395 e/ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA direcionado para PNPLA3 para reduzir e/ou inibir a expressão de HSD17B13 em uma célula, tal como uma célula em um indivíduo, p. ex., um hepatócito.
[00625] Além disso, a presente invenção provê métodos para inibição do acúmulo e/ou expansão de gotículas de lipídios em uma célula, tal como uma célula in um indivíduo, p. ex., um hepatócito. Os métodos incluem colocar a célula em contato com um agente RNAi ou composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA da invenção e um agente iRNA direcionado para um gene PNPLA3 e/ou composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA direcionado para PNPLA3. Em algumas modalidades, a célula é mantida por um tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA de um gene HSD17B13 e de um gene PNPLA3.
[00626] A redução na expressão gênica pode ser avaliada por qualquer um dos métodos conhecido na técnica. Por exemplo, um redução na expressão de HSD17B13 pode ser determinada medindo-se o nível de expressão do mRNA de HSD17B13 por métodos rotineiros para qualquer técnico no assunto, p. ex., Northern blotting, qRT-PCR; medindo-se o nível proteico de HSD17B13 por métodos rotineiros para qualquer técnico no assunto, tais como Western blotting, técnicas imunológicas. Uma redução na expressão de HSD17B13 pode também ser avaliada indiretamente medindo-se uma diminuição na atividade biológica de HSD17B13, p. ex., uma diminuição na atividade enzimática de HSD17B13 e/ou uma diminuição em um ou mais dentre um lipídio, um triglicerídeo, colesterol (incluindo LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C e colesterol total) ou de ácidos graxos livres em uma amostra de plasma ou tecido, e/ou uma redução no acúmulo de gordura e/ou expansão de gotículas de lipídios no fígado.
[00627] Agentes adequados direcionados para um gene PNPLA3 são descritos em, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No: 2017/0340661,
234 / 395 cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00628] Nos métodos da invenção, a célula pode ser colocada em contato in vitro ou in vivo, ou seja, a célula pode estar dentro de um indivíduo.
[00629] Uma célula adequada para o tratamento usando os métodos da invenção pode ser qualquer célula que expressa um gene HSD17B13 (e, em algumas modalidades, um gene PNPLA3). Uma célula adequada para uso nos métodos da invenção pode ser uma célula de mamíferos, p. ex., uma célula de primata (tal como uma célula humana ou uma célula de primata não humano, p. ex., uma célula de macaco ou de chimpanzé), uma célula não de primata (tal como uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de camelo, uma célula de lhama, uma célula de cavalo, uma célula de cabra, uma célula de coelho, uma célula de ovelha, uma célula de hamster, cobaia, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de leão, uma célula de tigre, uma célula de urso ou uma célula de búfalo,), uma célula de ave (p. ex., uma célula de pato ou de ganso) ou uma célula de baleia. Em uma modalidade, a célula é uma célula humana, p. ex., uma célula de fígado humano.
[00630] A expressão de HSD17B13 é inibida na célula em pelo menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou aproximadamente 100%. In modalidades preferidas, a expressão de HSD17B13 é inibida em pelo menos 20%.
[00631] Em alguma modalidade, a expressão de PNPLA3 é também inibida na célula em pelo menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,
235 / 395 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou aproximadamente 100%. In modalidades preferidas, a expressão de PNPLA3 é inibida em pelo menos 20%.
[00632] Em uma modalidade, os métodos in vivo da invenção pode incluir administrar a um indivíduo uma composição contendo um iRNA, em que o iRNA inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene HSD17B13 do mamífero a ser tratado.
[00633] Em outra modalidade, os métodos in vivo da invenção pode incluir administrar a um indivíduo uma composição contendo um primeiro agente iRNA e um segundo agente iRNA, em que o primeiro iRNA inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene HSD17B13 do mamífero a ser tratado e o segundo iRNA inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene PNPLA3 do mamífero a ser tratado.
[00634] Quando o organismo a ser tratado é um mamífero, tal como um humano, a composição pode ser administrada por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, entre outros, via oral, intraperitoneal, ou parenteral, incluindo administração intracraniana (p. ex., intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, pelas vias aéreas (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa. Em certas modalidades, as composições são administradas por injeção subcutânea.
[00635] Em algumas modalidades, a administração é por uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o iRNA de maneira constante ao longo de um período prolongado de tempo. Assim, uma injeção
236 / 395 de depósito pode reduzir a frequência de administração necessária para obter um efeito desejado, p. ex., uma inibição desejada de HSD17B13, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção de depósito pode também proporcionar concentrações séricas mais constantes. Injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferidas, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.
[00636] Em algumas modalidades, a administração é por uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba implantada cirurgicamente. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica implantada por via subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosas, subcutâneas, arteriais ou epidurais. Em modalidades preferidas, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba implantada cirurgicamente que libera o iRNA no fígado.
[00637] Um iRNA da invenção pode estar presente em uma composição farmacêutica, tal como uma solução tampão adequada. A solução tampão pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a solução tampão é solução salina com tampão fosfato (PBS). O pH e a osmolaridade da solução tampão contendo o iRNA podem ser ajustados tal que esta seja adequada para administração a um indivíduo.
[00638] Alternativamente, um iRNA da invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica, tal como uma formulação lipossomal de dsRNA.
[00639] O modo de administração pode ser escolhido com base em se é desejado tratamento local ou sistêmico e com base na área a ser tratada. A via e o local de administração podem ser escolhidos para reforçar o direcionamento.
237 / 395
[00640] Em um aspecto, a presente invenção também provê métodos para inibição da expressão de um gene HSD17B13 em um mamífero. Os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição compreendendo a dsRNA direcionado a um gene HSD17B13 em uma célula do mamífero, inibindo, assim, a expressão do gene HSD17B13 na célula.
[00641] Em alguma modalidade, os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição compreendendo um dsRNA direcionado a um gene HSD17B13 em uma célula do mamífero, inibindo, assim, expressão do gene HSD17B13 na célula. Em outra modalidade, os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição farmacêutica compreendendo um agente dsRNA direcionado a um gene HSD17B13 em uma célula do mamífero.
[00642] Em outro aspecto, a presente invenção provê o uso de um agente iRNA ou de uma composição farmacêutica da invenção para inibição da expressão de um gene HSD17B13 em um mamífero.
[00643] Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê o uso de um agente iRNA da invenção direcionado para um gene HSD17B13 ou uma composição farmacêutica compreendendo tal agente na produção de um medicamento para inibição da expressão de um gene HSD17B13 em um mamífero.
[00644] Em outro aspecto, a presente invenção também provê métodos para inibição da expressão de um gene HSD17B13 e um gene PNPLA3 em um mamífero. Os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição compreendendo um dsRNA direcionado para um gene HSD17B13 em uma célula do mamífero e uma composição compreendendo um dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 em uma célula do mamífero, inibindo, assim, a expressão do gene HSD17B13 e do gene PNPLA3 na célula. Em uma modalidade, os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição farmacêutica compreendendo um agente dsRNA direcionado
238 / 395 para um gene HSD17B13 e um gene PNPLA3 em uma célula do mamífero.
[00645] Em um aspecto, a presente invenção provê o uso de um agente iRNA ou de uma composição farmacêutica da invenção, e um dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo tal agente para inibição da expressão de um gene HSD17B13 e um gene PNPLA3 em um mamífero.
[00646] Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê o uso de um agente iRNA da invenção direcionado para um gene HSD17B13 ou uma composição farmacêutica compreendendo tal agente, e um dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo tal agente na produção de um medicamento para inibição da expressão de um gene HSD17B13 e de um gene PNPLA3 em um mamífero.
[00647] A redução na expressão do gene pode ser avaliada por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica e por métodos, p. ex., qRT- PCR, aqui descritos. A redução na produção de proteína pode ser avaliada por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica e por métodos, p. ex., ELISA, atividade enzimática, aqui descritos.
[00648] A presente invenção também provê métodos terapêuticos e profiláticos, os quais incluem administrar a um indivíduo portador ou propenso a desenvolver uma doença, transtorno ou condição associado a fígado gorduroso, os agente iRNA, composições farmacêuticas compreendendo um agente iRNA ou vetores compreendendo um iRNA da invenção.
[00649] Em um aspecto, a presente invenção provê métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., uma doença associada com HSD17B13.
[00650] Os métodos de tratamento (e usos) da invenção incluem administrar ao indivíduo, p. ex., um humano, uma quantidade
239 / 395 terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13 ou uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13, tratando, assim, o indivíduo.
[00651] Em um aspecto, a invenção provê métodos para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., uma doença fibro- inflamatória crônica. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz do agente dsRNA ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA, prevenindo, assim, pelo menos um sintoma no indivíduo.
[00652] Em uma modalidade, uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13 é uma doença hepática fibro-inflamatória crônica. Exemplos não limitantes de doenças hepáticas fibro-inflamatórias crônicas incluem câncer, p. ex., carcinoma hepatocelular, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose do fígado, inflamação do fígado, necrose hepatocelular, fibrose hepática e doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).
[00653] A presente invenção também provê métodos terapêuticos e profiláticos, os quais incluem administrar a um indivíduo portador ou propenso a desenvolver uma doença, transtorno ou condição associado a fígado gorduroso, os agente iRNA, composições farmacêuticas compreendendo um agente iRNA ou vetores compreendendo um iRNA da invenção e um agente iRNA direcionado para PNPLA3, composições farmacêuticas compreendendo tal agente iRNA ou vetores compreendendo tal iRNA.
[00654] A presente invenção também provê o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente iRNA da invenção ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13 para tratar um indivíduo, p. ex., um indivíduo que se
240 / 395 beneficiaria de uma redução e/ou inibição da expressão de HDS17B13, p. ex., uma doença associada com HSD17B13, p. ex., uma doença fibro-inflamatória crônica.
[00655] Em outro aspecto, a presente invenção provê o uso de um agente iRNA, p. ex., um dsRNA, da invenção direcionado para um gene HSD17B13 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA direcionado para um gene HSD17B13 na produção de um medicamento para o tratamento de um indivíduo, p. ex., um indivíduo que se beneficiaria de a redução e/ou inibição da expressão de HDS17B13, p. ex., uma doença associada com HSD17B13.
[00656] A presente invenção também provê o uso de uma quantidade profilaticamente eficaz de um agente iRNA da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13 para prevenir pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., uma doença fibro-inflamatória crônica.
[00657] Em outro aspecto, a presente invenção provê o uso de um agente iRNA, p. ex., um dsRNA, da invenção direcionado para um gene HSD17B13 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA direcionado para um gene HSD17B13 na produção de um medicamento para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., a doença fibro-inflamatória crônica.
[00658] Em um aspecto, a presente invenção também provê o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente iRNA da invenção ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13 em combinação com um dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo tal agente para o tratamento de um indivíduo, p. ex., um indivíduo que se
241 / 395 beneficiaria de uma redução e/ou inibição da expressão de HDS17B13, p. ex., uma doença associada com HSD17B13, p. ex., uma doença fibro-inflamatória crônica.
[00659] Em um aspecto, a presente invenção também provê o uso de um agente iRNA, p. ex., um dsRNA, da invenção direcionado para um gene HSD17B13 ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA direcionado para um gene HSD17B13 em combinação com um dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica compreendendo tal agente para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., uma doença fibro-inflamatória crônica.
[00660] Os métodos combinados da invenção para tratar um indivíduo, p. ex., um humano, portador de uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13, tal como uma doença hepática fibro-inflamatória crônica, p. ex., NASH, são úteis para tratar tais indivíduos, pois o silenciamento de PNPLA3 diminui a esteatose (ou seja, gordura no fígado) enquanto o silenciamento de HSD17B13 diminui a inflamação e fibrose. Por exemplo, estudos de associação genômica ampla demonstraram que o silenciamento de PNPLA3 e HSD17B13 exercem um efeito aditivo para diminuir a patologia de NASH. De fato, foi verificado que um alelo protetor de perda de função de HSD17B13 estava associado com prevalência menor de NASH em indivíduos com alelos patogênicos de PNPLA3. Em indivíduos portadores de alelos de PNPLA3 do tipo selvagem têm risco menor de NASH e a presença adicionada de alelos de perda de função de HSD17B13 conferiu proteção ainda maior.
[00661] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção provê métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., uma doença associada com HSD17B13, tal como uma doença hepática fibro-inflamatória crônica (p. ex., câncer, p. ex., carcinoma hepatocelular, esteato-hepatite não
242 / 395 alcoólica (NASH), cirrose do fígado, inflamação do fígado, necrose hepatocelular, fibrose hepática e doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Em uma modalidade, a doença hepática fibro-inflamatória crônica é NASH.
[00662] Os métodos de tratamento combinado (e usos) da invenção incluem administrar ao indivíduo, p. ex., um humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13 ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13, e de um agente dsRNA que inibe a expressão de PNPLA3 ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de PNPLA3, tratando, assim, o indivíduo.
[00663] Em um aspecto, a invenção provê métodos para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de um transtorno que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13, p. ex., uma doença fibro- inflamatória crônica, p. ex., NASH. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz do agente dsRNA ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de HSD17B13, e de um agente dsRNA que inibe a expressão de PNPLA3 ou de uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA que inibe a expressão de PNPLA3, prevenindo, assim, pelo menos um sintoma no indivíduo.
[00664] Em uma modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica a variação I148M do gene domínio de fosfolipase tipo patatina-3 (PNPLA3). Em outra modalidade, o indivíduo é homozigoto para o gene que codifica a variação I148M de PNPLA3. Em uma modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica a variação I144M do gene domínio de fosfolipase tipo patatina-3 (PNPLA3). Em outra modalidade, o indivíduo é homozigoto para o gene que codifica a variação I144M de PNPLA3. Em uma modalidade, o indivíduo é homozigoto para o gene que codifica uma proteína
243 / 395 HSD17B13 funcional. Em outra modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica uma proteína HSD17B13 funcional. Em ainda outra modalidade, o indivíduo é heterozigoto para o gene que codifica uma proteína HSD17B13 funcional e um gene que codifica uma variante de perda de função de HSD17B13. Em outra modalidade, o indivíduo não é portador da variante HSD17B13 rs72613567.
[00665] Em certas modalidades da invenção, os métodos podem incluir identificar um indivíduo que se beneficiaria de redução na expressão de HSD17B13. Os métodos incluem geralmente determinar se uma amostra do indivíduo compreende ou não um ácido nucleico que codifica a variante Ile148Met de PNPLA3 ou uma variante Ile144Met de PNPLA3. Os métodos podem incluir também classificar um indivíduo como candidato para tratar ou inibir uma doença hepática pela inibição da expressão de aHSD17B13, determinando se uma amostra do indivíduo compreende ou não um primeiro ácido nucleico que codifica uma proteína PNPLA3 compreendendo uma variação I148M e um segundo ácido nucleico que codifica uma proteína HSD17B13 funcional, e/ou uma proteína PNPLA3 compreendendo uma variação I148M e uma proteína HSD17B13 funcional, e classificar o indivíduo como candidato para tratar ou inibir uma doença hepática por inibição de HSD17B13 quando ambos, o primeiro e o segundo ácido nucleico, são detectados e/ou quando ambas as proteínas são detectadas.
[00666] A variante Ile148Met de PNPLA3 ou a variante Ile144Met de PNPLA3 podem ser qualquer uma das variantes Ile148Met de PNPLA3 e variantes Ile144Met de PNPLA3 aqui descritas. A variante Ile148Met de PNPLA3 ou a variante Ile144Met de PNPLA3 pode ser detectada por qualquer meio adequado, tal como ensaio ELISA, RT-PCR, sequenciamento.
[00667] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda determinar se o indivíduo é homozigoto ou heterozigoto para a variante Ile148Met de PNPLA3 ou a variante Ile144Met de PNPLA3. Em algumas
244 / 395 modalidades, o indivíduo é homozigoto para a variante Ile148Met de PNPLA3 ou a variante Ile144Met de PNPLA3. Em algumas modalidades, o indivíduo é heterozigoto para a variante Ile148Met de PNPLA3 ou a variante Ile144Met de PNPLA3. Em algumas modalidades, o indivíduo é homozigoto para a variante Ile148Met de PNPLA3. Em algumas modalidades, o indivíduo é heterozigoto para a variante Ile148Met de PNPLA3. Em algumas modalidades, o indivíduo é homozigoto para a variante Ile144Met de PNPLA3. Em algumas modalidades, o indivíduo é heterozigoto para a variante Ile144Met de PNPLA3.
[00668] Em algumas modalidades, o indivíduo não compreende quaisquer genes que codificam variações de perda de função na proteína HSD17B13. Acredita-se que variações de perda de função na proteína HSD17B13, incluindo aquelas aqui descritas e no Pedido de Patente U.S. Provisório No de Série 62/570 985, depositado em 11 de outubro de 2017, confiram um efeito protetor contra doença hepática e acredita-se ainda que esse efeito protetor é intensificado na presença de da variação Ile148M de PNPLA3.
[00669] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda determinar se o indivíduo é obeso. Em algumas modalidades, um indivíduo é obeso se o seu índice de massa corporal (IMC) for acima de 30 kg/m2 . A obesidade pode ser uma característica de um indivíduo portador ou em risco de desenvolver uma doença hepática. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda determinar se o indivíduo tem um fígado gorduroso. Um fígado gorduroso pode ser uma característica de um indivíduo portador ou em risco de desenvolver uma doença hepática. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda determinar se o indivíduo é obeso e tem um fígado gorduroso.
[00670] Neste relatório descritivo, “doença hepática gordurosa não alcoólica”, usado alternadamente com o termo “NAFLD”, refere-se a uma
245 / 395 doença definida pela presença de esteatose macrovascular na presença de menos de 20 gramas de ingestão de álcool ao dia. NAFLD é a doença hepática mais comum nos Estados Unidos, e está comumente associada com resistência à insulina/diabetes mellitus tipo 2 e obesidade. NAFLD manifesta- se por esteatose, esteato-hepatite, cirrose e, às vezes, carcinoma hepatocelular. Para uma revisão sobre NAFLD, ver Tolman and Dalpiaz (2007) Ther. Clin. Risk. Manag., 3(6):1153-1163 cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00671] Neste relatório descritivo, os termos “esteatose”, “esteatose hepática” e “doença hepática gordurosa” referem-se ao acúmulo de triglicerídeos e outras gorduras nas células do fígado.
[00672] Neste relatório descritivo, o termo “esteato-hepatite não alcoólica” ou “NASH” refere-se à inflamação e lesão no fígado causados por um acúmulo de gordura no fígado. NASH faz parte de um grupo de condições denominadas doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). NASH assemelha-se à doença hepática alcoólica, mas ocorre em pessoas que bebem pouco ou não bebem álcool. A principal característica em NASH é gordura no fígado, acompanhada por inflamação e lesão. A maioria das pessoas com NASH sente-se bem e não estão cientes de que têm um problema no fígado. Não obstante, NASH pode ser grave e pode levar à cirrose, na qual o fígado apresenta lesões permanentes e não é mais capaz de funcionar devidamente. Normalmente, NASH é suspeitada inicialmente em uma pessoa em quem se verifica elevações em provas hepáticas incluídas em painéis rotineiros de exames de sangue, tais como alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST). Quando uma avaliação mais aprofundada não mostra motivo aparente para doença hepática (tais como medicamentos, hepatite viral ou uso excessivo de álcool) e quando estudos radiográficos ou de imagem do fígado mostram gordura, suspeita-se de NASH. O único recurso para comprovar um diagnóstico de NASH e separá-la do fígado gorduroso simples
246 / 395 é uma biópsia do fígado.
[00673] Neste relatório descritivo, o termo “cirrose”, definido histologicamente, é um processo hepático difuso caracterizado por fibrose e conversão da arquitetura normal do fígado em nódulos estruturalmente anormais.
[00674] Neste relatório descritivo, o termo “lipídio sérico” refere-se a qualquer lipídio importante presente no sangue. Lipídios séricos podem estar presentes no sangue seja em forma livre ou como parte de um complexo proteico, p. ex., um complexo de lipoproteína. Exemplos não limitantes de lipídios séricos podem incluir triglicerídeos (TG), colesterol, tal como colesterol total (TC), colesterol-lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), colesterol-lipoproteína de alta densidade (HDL-C), colesterol-lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL-C) e colesterol-lipoproteína de densidade intermediária (IDL-C).
[00675] Em uma modalidade, um indivíduo que se beneficiaria da redução da expressão de HSD17B13 (e, em algumas modalidades, PNPLA3) é, por exemplo, um indivíduo com diabetes tipo 2 e pré-diabetes ou obesidade; um indivíduo com níveis elevados de gordura no sangue, tal como colesterol, ou com pressão arterial alta; um indivíduo com certos transtornos metabólicos, incluindo síndrome metabólica; um indivíduo com perda de peso rápida; um indivíduo com certas infecções, tais como hepatite C infecciosa, ou um indivíduo que foi exposto a algumas toxinas. Em uma modalidade, um indivíduo que se beneficiaria da redução da expressão de HSD17B13 (e, em algumas modalidades, PNPLA3) é, por exemplo, um indivíduo na meia-idade ou mais idoso; um indivíduo que é hispânico, branco não hispânico ou afro- americano; um indivíduo que toma certos fármacos, tais como corticosteroides e fármacos antineoplásicos.
[00676] Nos métodos (e usos) da invenção que compreendem administrar a um indivíduo um primeiro agente dsRNA direcionado para
247 / 395 HSD17B13 e um segundo agente dsRNA direcionado para PNPLA3, o primeiro e o segundo agente dsRNA podem ser formulado na mesma composição ou em composições diferentes e podem ser administrados ao indivíduo na mesma composição ou em composições separadas.
[00677] Em uma modalidade, um “iRNA” para uso nos métodos da invenção é um “agente RNAi de duplo direcionamento”. O termo “agente RNAi de duplo direcionamento” refere-se a uma molécula que compreende um primeiro agente dsRNA compreendendo um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura duplex que compreende duas fitas de ácido nucleico antiparalelas e substancialmente complementares, referidas como tendo orientação “sense” e “antisense” no que diz respeito a um primeiro RNA alvo, ou seja, um gene HSD17B13, ligada covalentemente a uma molécula que compreende um segundo agente dsRNA compreendendo um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura duplex que compreende duas fitas de ácido nucleico antiparalelas e substancialmente complementares, referidas como tendo orientação “sense” e “antisense” no que diz respeito a um segundo RNA alvo RNA, ou seja, um gene PNPLA3. Em algumas modalidades da invenção, um agente RNAi de duplo direcionamento desencadeia a degradação do primeiro e do segundo RNA alvo, p. ex., mRNAs, através de um mecanismo de silenciamento gênico pós- transcricional, referido no presente como interferência por RNA ou RNAi.
[00678] O agente dsRNA pode ser administrado ao indivíduo a uma dose entre aproximadamente 0,1 mg/kg e 50 mg/kg. Tipicamente, uma dose adequada estará na faixa entre aproximadamente 0,1 mg/kg e 5,0 mg/kg, de preferência entre aproximadamente 0,3 mg/kg e 3,0 mg/kg.
[00679] O iRNA pode ser administrado por infusão intravenosa ao longo de um período de tempo, regularmente. Em certas modalidades, depois de um esquema de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência.
248 / 395
[00680] A administração do iRNA pode reduzir os níveis de HSD17B13, p. ex., em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos aproximadamente 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou pelo menos aproximadamente 99% ou mais. Em uma modalidade preferida, a administração do iRNA pode reduzir os níveis de HSD17B13, p. ex., em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos 20%.
[00681] A administração do iRNA pode reduzir os níveis de PNPLA3, p. ex., em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos aproximadamente 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou pelo menos aproximadamente 99% ou mais. Em uma modalidade preferida, administração do iRNA pode reduzir os níveis de PNPLA3, p. ex., em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos 20%.
[00682] Antes da administração de uma dose completa do iRNA, os pacientes podem receber uma dose menor, tal como 5% de reação na infusão, e monitorados quanto a efeitos adversos, tal como uma reação alérgica. Em outro exemplo, o paciente pode ser monitorado quando efeitos imunoestimuladores indesejados, tais como níveis aumentados de citocinas (p. ex., TNF-alfa ou INF-alfa).
[00683] Alternativamente, o iRNA pode ser administrado por via
249 / 395 subcutânea, ou seja, por injeção subcutânea. Uma ou mais injeções podem ser usadas para entregar a dose diária desejada de iRNA a um indivíduo. As injeções podem ser repetidas ao longo de um período de tempo. A administração pode ser repetida regularmente. Em certas modalidades, após um esquema de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência. Um esquema de doses repetidas pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica de iRNA regularmente, tal como em dias alternados ou uma vez ao ano. Em certas modalidades, o iRNA é administrado aproximadamente uma vez por semana, uma vez a cada 7-10 dias, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 5 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 7 semanas, uma vez a cada 8 semanas, uma vez a cada 9 semanas, uma vez a cada 10 semanas, uma vez a cada 11 semanas, uma vez a cada 12 semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 2 meses, uma vez a cada 3 meses, uma vez por trimestre), uma vez a cada 4 meses, uma vez a cada 5 meses ou uma vez a cada 6 meses.
[00684] Em uma modalidade, o método inclui administrar uma composição aqui apresentada, tal que a expressão do gene HSD17B13 alvo seja diminuída, tal como por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 horas, 28, 32 ou aproximadamente 36 horas. Em uma modalidade, a expressão de do gene HSD17B13 alvo é diminuída por uma duração prolongada, p. ex., pelo menos aproximadamente dois, três, quatro dias ou mais, p. ex., aproximadamente uma semana, duas semanas, três semanas ou quatro semanas ou mais.
[00685] Em outra modalidade, o método inclui administrar uma composição aqui apresentada, tal que a expressão do gene PNPLA3 alvo seja diminuída, tal como por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 horas, 28, 32 ou aproximadamente 36 horas. Em uma modalidade, a expressão do gene PNPLA3 alvo é diminuída por uma duração prolongada, p.
250 / 395 ex., pelo menos aproximadamente dois, três, quatro dias ou mais, p. ex., aproximadamente uma semana, duas semanas, três semanas ou quatro semanas ou mais.
[00686] De preferência, o iRNAs útil para os métodos e composições aqui apresentados atinge especificamente RNAs (primários ou procesados) do gene HSD17B13 alvo (e, em algumas modalidades, um gene PNPLA3). Composições e métodos para inibição da expressão desses genes usando iRNAs podem ser preparadas e realizados como aqui descrito.
[00687] A administração do dsRNA de acordo com os métodos da invenção pode resultar em uma redução da gravidade, sinais, sintomas e/ou marcadores de tais doenças ou transtornos em um paciente com um transtorno do metabolismo lipídico. Por “redução”, neste contexto, entende-se uma diminuição estatisticamente significante em tal nível. A redução pode ser, por exemplo, de pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100%.
[00688] A eficácia do tratamento ou prevenção de doença podem ser avaliadas, por exemplo, medindo-se progressão da doença, remissão da doença, gravidade de sintomas, redução na dor, qualidade de vida, dose de um medicamento requerido para manter um efeito do tratamento, nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável adequado para uma dada doença em tratamento ou pretendida para prevenção. O técnico no assunto é capaz de monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de um transtorno do metabolismo lipídico pode ser avaliada, por exemplo, por monitoramento periódico dos níveis de um ou mais lipídios séricos, p. ex., níveis de triglicerídeos. Comparações das últimas leituras com as leituras iniciais fornecem a um médico uma indicação se o tratamento é eficaz. O técnico no assunto é capaz de monitorar a eficácia
251 / 395 do tratamento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um iRNA ou composição farmacêutica do mesmo, “eficaz contra” um transtorno do metabolismo lipídico indica que a administração de maneira clinicamente adequada resulta em um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significante de pacientes, tais como uma melhora de sintomas, uma cura, uma redução na doença, extensão da vida, melhora na qualidade de vida ou outro efeito em geral reconhecido como positivo por médicos familiarizados com o tratamento de transtornos do metabolismo lipídico e das causas relacionadas.
[00689] Um efeito do tratamento ou preventivo é evidente quando há uma melhora estatisticamente significante em um ou mais parâmetros do estado de doença, ou por não haver agravamento nem o desenvolvimento de sintomas quando estes seriam do contrário previstos. Como um exemplo, uma variação favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável da doença e, de preferência, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais podem ser indicativos de tratamento eficaz. A eficácia para um dado fármaco de iRNA ou formulação daquele fármaco pode também ser avaliada usando um modelo animal experimental para a dada doença conforme conhecido na técnica.
[00690] A invenção provê ainda métodos para o uso de um agente iRNA ou de uma composição farmacêutica da invenção, p. ex., para tratar um indivíduo que se beneficiaria de redução e/ou inibição da expressão de HDS17B13 ou de HSD17B13, p. ex., um indivíduo com uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13, em combinação com outros agentes farmacêuticos e/ou outro métodos terapêuticos, p. ex., com agentes farmacêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente empregados para tratar esses transtornos. Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para o uso
252 / 395 de um agente iRNA ou de uma composição farmacêutica da invenção e um agente iRNA direcionado para PNPLA3, p. ex., para tratar um indivíduo que se beneficiaria de redução e/ou inibição da expressão de HDS17B13 e da expressão de PNPLA3, p. ex., um indivíduo com uma doença, transtorno ou condição associado com HSD17B13 (p. ex., NASH), em combinação com combinação com outros agentes farmacêuticos e/ou outro métodos terapêuticos, p. ex., com agentes farmacêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, such as, por exemplo, tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente empregados para tratar esses transtornos. Por exemplo, em certas modalidades, um agente iRNA ou composição farmacêutica da invenção é administrado em combinação com, p. ex., piridoxina, um inibidor da ACE (inibidores da enzima conversora de angiotensina), p. ex., agentes benazepril para diminuir a pressão arterial, p. ex., diuréticos, bloqueadores-beta, inibidores da ACE, bloqueadores do receptor de angiotensina II, bloqueadores dos canais de cálcio, bloqueadores- alfa, antagonistas de receptores alfa-2, bloqueadores alfa e beta combinados, agonistas centrais, inibidores adrenérgicos periféricos e vasodilatadores; ou agentes para diminuir o colesterol, p. ex., estatinas, inibidores seletivos da absorção de colesterol, resinas; terapias redutoras de lipídios; sensibilizadores de insula, tais como agonista de PPARγ pioglitazona; agonistas de glp-1r, tais como liraglutatida; vitamina E; inibidores de SGLT2; ou inibidores de DPPIV; ou a combinação de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade, um agente iRNA ou composição farmacêutica da invenção é administrado em combinação com um agente que inibe a expressão e/ou atividade de um gene da superfamília do membro 2 da proteína transmembrana 6 (TM6SF2), p. ex., um agente RNAi que inibe a expressão de um gene TM6SF2.
[00691] O agente iRNA e um agente terapêutico adicional e/ou tratamento podem ser administrados ao mesmo tempo e/ou na mesma
253 / 395 combinação, p. ex., por via subcutânea, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em momentos separados e/ou por outro método conhecido na técnica ou aqui descrito. VII. Kits
[00692] A presente invenção também provê kits para realização de qualquer um dos métodos da invenção. Tais kits incluem um ou mais agentes RNAi e instruções para uso, p. ex., instruções para inibir a expressão de um HSD17B13 em uma célula, colocando a célula em contato com um agente RNAi ou composição farmacêutica da invenção em uma quantidade eficaz para inibir a expressão do HSD17B13. Os kits podem compreender ainda, opcionalmente, meios para colocar a célula em contato com o agente RNAi (p. ex., um dispositivo de injeção), ou meios para medir a inibição de HSD17B13 (p. ex., meios para medir a inibição do mRNA de HSD17B13 e/ou da proteína HSD17B13). Tais meios para medir a inibição de HSD17B13 podem compreender um meio para obter uma amostra de um indivíduo, tal como, p. ex., uma amostra de plasma. Os kits da invenção podem compreender ainda, opcionalmente, meios para administrar o(s) agente(s) RNAi a um indivíduo ou meios para determinar a quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz.
[00693] A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido pelo técnico no assunto ao qual pertence esta invenção. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou para testes dos iRNAs e métodos apresentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionados acima são aqui incorporados, em sua totalidade por referência. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo
254 / 395 definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos somente e não se destinam a ser limitativos.
EXEMPLOS Exemplo 1. Desenho, síntese e seleção do iRNA
[00694] Esse Exemplo descreve métodos para o desenho, a síntese e a seleção de agentes iRNA de HSD17B13. Fonte de reagentes
[00695] Quando a fonte de um reagente não é especificamente fornecida, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular com um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular. Bioinformática
[00696] Um conjunto de siRNAs direcionados para o gene hidroxiesteroide 17-beta desidrogenase 13 humano (HSD17B13; NCBI refseqID NM_178135.4 humano; NCBI GeneID: 345275), bem como o ortólogo de HSD17B13 para a espécie de toxicologia, macaco Cynomolgus: XM_005555367.2 foi projetado usando os scripts personalizados R e Python. Todos os desenhos do siRNA tinham uma combinação perfeita com o transcrito de HSD17B13 humano e um subconjunto de combinações perfeitas ou quase perfeitas com o ortólogo do cynomolgus. O mRNA humano NM_178135 REFSEQ, versão 4, tem um comprimento de 2397 bases. A justificativa e o método para o conjunto de desenhos de siRNA são como segue: A eficácia prevista para cada siRNA de 23mer potencial da posição 10 até a extremidade foi determinada com um modelo de floresta aleatória, derivado da medição direta do knockdown (silenciamento) do mRNA de diversos milhares de desenhos distintos de siRNA direcionados para um conjunto diverso de genes de vertebrados. Para cada fita do siRNA, usou-se um script Python personalizado em uma busca de força bruta para medir o número e as posições dos erros de emparelhamento (mismatches) entre o
255 / 395 siRNA e todos os alinhamentos potenciais no transcriptoma humano. Foi dado peso extra aos erros de emparelhamento na região semente, aqui definida como as posições 2-9 do oligonucleotídeo antisense, bem como ao sítio de clivagem do siRNA, aqui definido como as posições 10-11 do oligonucleotídeo antisense. O peso relativo dos erros de emparelhamento foi 2,8; 1,2; 1, para erros de emparelhamento na semente, sítio de clivagem e outras posições até a posição 19 antisense. Os erros de emparelhamento na primeira posição foram ignorados. Uma pontuação da especificidade foi calculada para cada fita, somando o valor de cada erro de emparelhamento ponderado. Foi dada preferência aos siRNAs cuja pontuação antisense em humano e macaco Cynomolgus era >= 2 e a eficácia prevista foi >= 50% de knockdown.
[00697] Uma lista detalhada de sequências nucleotídicas não modificadas das sequências de fita sense e fita antisense é mostrada na Tabela
2.
[00698] Uma lista detalhada de sequências nucleotídicas modificadas das sequências de fita sense e fita antisense é mostrada na Tabela 3.
[00699] Rastreamento in vitro em Cos-7 (vetor psiCHECK2-Luciferase duplo), Hepatócitos Humanos Primários e Hepatócitos Primários Cynomolgus Cultura celular e transfecções:
[00700] Cos-7 (ATCC) foram transfectadas adicionando 5 µL do vetor HSD17B13 psiCHECK2 (Blue Heron Biotechnology) 1 ng/µL, diluído em Opti-MEM, 4,9 µL de Opti-MEM mais 0,1 µL de Lipofectamine 2000 por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. no 11668-019) a 5 µL de duplex de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos. Trinta e cinco µL de meio de Eagle modificado por Dulbecco (ThermoFisher) contendo ~5 x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 48 horas, seguido por medições da luciferase de Vagalume
256 / 395 (controle de transfecção) e Renilla (fundida à sequência alvo). Experimentos de dose única foram realizados a 50nM.
[00701] Hepatócitos Humanos Primários (BioIVT) foram transfectados adicionando 4,9 µL de Opti-MEM mais 0,1 µL de RNAiMAX por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. no 13778-150) a 5 µL de duplex de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos. Firthy [sic] µL de meio de plaqueamento InVitroGRO CP (BioIVT) contendo ~15 x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 48 horas antes da purificação do RNA. Experimentos de dose única foram realizados a 50nM.
[00702] Hepatócitos Primários Cynomolgus (BioIVT) foram transfectados adicionando 4,9 µL de Opti-MEM mais 0,1 µL de RNAiMAX por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. no 13778-150) a 5 µL de duplex de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos. Firthy [sic] µL de meio de plaqueamento InVitroGRO CP (BioIVT) contendo ~15 x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. Células foram incubadas por 48 horas antes da purificação do RNA. Experimentos de dose única foram realizados a 50nM. Isolamento do RNA Total com o kit de Isolamento de mRNA DYNABEADS:
[00703] O RNA foi isolado por meio de um protocolo automático em uma plataforma BioTek-EL406 usando DYNABEADs (Invitrogen, cat. no 61012). Resumidamente, 70 µL de Tampão de Lise/Ligação e 10 µL de tampão de lise contendo 3 µL de microesferas magnéticas foram adicionados à placa com as células. As placas foram incubadas em um agitador eletromagnético por 10 minutos à temperatura ambiente e, a seguir, as microesferas magnéticas foram capturadas e o sobrenadante, removido. RNA ligado às microesferas foi então lavado duas vezes com 150 µL do Tampão de
257 / 395 Lavagem A e uma vez com o Tampão de Lavagem B. As microesferas foram então lavadas com 150 µL do Tampão de Eluição, recapturadas e o sobrenadante removido. Síntese de cDNA usando o kit ABI de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat. no 368813):
[00704] Dez µL de uma mistura master contendo 1µL de 10X Tampão, 0,4 µL de 25X dNTPs, 1µL de 10x primers Random, 0,5 µL de transcriptase reversa, 0,5 µL de inibidor de RNase e 6,6 µL de H2O por reação foram adicionados ao RNA isolado acima. As placas foram fechadas com vedação, misturadas e incubadas em um agitador eletromagnético por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido por 2 horas a 37 ºC. PCR em tempo real:
[00705] Dois µl de cDNA e 5 µL da mistura máster da sonda Lightciclor 480 (Roche Cat. no 04887301001) foram adicionados a 0,5 µL de sonda TaqMan de GAPDH humano (4326317E) e 0,5 µL de sonda de HSD17B13 Humano (Hs01068199_m1, Thermo) ou 0,5 µL de GAPDH Cyno (personalizado) e 0,5 µL de sonda de HSD17B13 Cyno (Mf02888851_m1, Thermo) por poço em uma placa de 384 poços (Roche cat. no 04887301001). A PCR em tempo real foi realizada em um sistema de PCR em Tempo Real LightCycler480 (Roche). Cada duplex foi testado ao menos duas vezes e os dados foram normalizados para células transfectadas com um siRNA controle não direcionado. Para calcular a expressão relativa (fold change), dados em tempo real foram analisados pelo método de ΔΔCt e normalizados contra ensaios realizados com células transfectadas com um siRNA controle não direcionado.
[00706] A Tabela 4 mostra os resultados de um rastreamento de dose única a 50 nM em células Cos-7 (Vetor psiCHECK2 duplo-luciferase) transfectadas com os agentes iRNA indicados. Os dados são expressos em percentual restante da mensagem em relação a células não tratadas.
258 / 395
[00707] A Tabela 5 mostra os resultados de um rastreamento de dose única a 50 nM em Hepatócitos Humanos Primários transfectados com os agentes iRNA indicados. Os dados são expressos em percentual restante da mensagem em relação a células não tratadas.
[00708] A Tabela 6 mostra os resultados de um rastreamento de dose única a 50 nM em Hepatócitos Primários Cynomolgus transfectados os agentes iRNA indicados. Os dados são expressos em percentual restante da mensagem em relação a células não tratadas. Tabela 1: Abreviações de monômeros de nucleotídeo usados na representação de sequências de ácidos nucleicos
[00709] Será entendido que esses monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, são mutualmente ligados por ligações 5’-3’-fosfodiester. Abreviação Nucleotídeo(s) A Adenosina-3’-fosfato Ab beta-L-adenosina-3’-fosfato Abs beta-L-adenosina-3’-fosforotioato Af 2’-fluoroadenosina-3’-fosfato Afs 2’-fluoroadenosina-3’-fosforotioato As adenosina-3’-fosforotioato C citidina-3’-fosfato Cb beta-L-citidina-3’-fosfato Cbs beta-L-citidina-3’-fosforotioato Cf 2’-fluorocitidina-3’-fosfato Cfs 2’-fluorocitidina-3’-fosforotioato Cs citidina-3’-fosforotioato G guanosina-3’-fosfato Gb beta-L-guanosina-3’-fosfato Gbs beta-L-guanosina-3’-fosforotioato Gf 2’-fluoroguanosina-3’-fosfato Gfs 2’-fluoroguanosina-3’-fosforotioato Gs guanosina-3’-fosforotioato T 5’-metiluridina-3’-fosfato Tf 2’-fluoro-5-metiluridina-3’-fosfato Tfs 2’-fluoro-5-metiluridina-3’-fosforotioato Ts 5-metiluridina-3’-fosforotioato U Uridina-3’-fosfato Uf 2’-fluorouridina-3’-fosfato Ufs 2’-fluorouridina-3’-fosforotioato Us uridina-3’-fosforotioato N qualquer nucleotídeo (G, A, C, T ou U) a 2’-O-metiladenosina-3’-fosfato as 2’-O-metiladenosina-3’-fosforotioato c 2’-O-metilcitidina-3’-fosfato cs 2’-O-metilcitidina-3’-fosforotioato g 2’-O-metilguanosina-3’-fosfato gs 2’-O-metilguanosina-3’-fosforotioato
259 / 395 Abreviação Nucleotídeo(s) t 2’-O-metil-5-metiluridina-3’-fosfato ts 2’-O-metil-5-metiluridina-3’-fosforotioato u 2’-O-metiluridina-3’-fosfato us 2’-O-metiluridina-3’-fosforotioato s Ligação fosforotioato L96 N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol P Fosfato VP Vinil-fosfato dA 2’-desoxiadenosina-3’-fosfato dAs 2’-desoxiadenosina-3’-fosforotioato dC 2’-desoxicitidina-3’-fosfato dCs 2’-desoxicitidina-3’-fosforotioato dG 2’-desoxiguanosina-3’-fosfato dGs 2’-desoxiguanosina-3’-fosforotioato dT 2’-desoxitimidina-3’-fosfato dTs 2’-desoxitimidina-3’-fosforotioato dU 2’-desoxiuridina dUs 2’-desoxiuridina-3’-fosforotioato Y34 2-hidroximetil-tetrahidrofurano-4-metoxi-3-fosfato (2’-OMe furanose abásico) Y44 DNA abásico invertido (2-hidroximetil-tetrahidrofurano-5-fosfato) (Agn) Ácido nucleico adenosina-glicol (GNA) (Cgn) Ácido nucleico citidina-glicol (GNA) (Ggn) Ácido nucleico guanosina-glicol (GNA) (Tgn) Ácido nucleico timidina-glicol (GNA) Isômero S (Aam) 2’-O-(N-metilacetamida)adenosina-3’-fosfato (Aams) 2’-O-(N-metilacetamida)adenosina-3’-fosforotioato (Gam) 2’-O-(N-metilacetamida)guanosina-3’-fosfato (Gams) 2’-O-(N-metilacetamida)guanosina-3’-fosforotioato (Tam) 2’-O-(N-metilacetamida)timidina-3’-fosfato (Tams) 2’-O-(N-metilacetamida)timidina-3’-fosforotioato (Aeo) 2’-O-metoxietiladenosina-3’-fosfato (Aeos) 2’-O-metoxietiladenosina-3’-fosforotioato (Geo) 2’-O-metoxietilguanosina-3’-fosfato (Geos) 2’-O-metoxietilguanosina-3’-fosforotioato (Teo) 2’-O-metoxietil-5-metiluridina-3’-fosfato (Teos) 2’-O-metoxietil-5-metiluridina-3’-fosforotioato (m5Ceo) 2’-O-metoxietil-5-metilcitidina-3’-fosfato (m5Ceos) 2’-O-metoxietil-5-metilcitidina-3’-fosforotioato (A3m) 3’-O-metiladenosina-2’-fosfato (A3mx) 3’-O-metil-xilofuranosiladenosina-2’-fosfato (G3m) 3’-O-metilguanosina-2’-fosfato (G3mx) 3’-O-metil-xilofuranosilguanosina-2’-fosfato (C3m) 3’-O-metilcitidina-2’-fosfato (C3mx) 3’-O-metil-xilofuranosilcitidina-2’-fosfato (U3m) 3’-O-metiluridina-2’-fosfato U3mx) 3’-O-metil-xilofuranosiluridina-2’-fosfato (m5Cam) 2’-O-(N-metilacetamida)-5-metilcitidina-3’-fosfato (m5Cams) 2’-O-(N-metilacetamida)-5-metilcitidina-3’-fosforotioato (Chd) 2’-O-hexadecil-citidina-3’-fosfato (Chds) 2’-O-hexadecil-citidina-3’-fosforotioato (Uhd) 2’-O-hexadecil-uridina-3’-fosfato (Uhds) 2’-O-hexadecil-uridina-3’-fosforotioato (pshe) Hidroxietilfosforotioato 1 A estrutura química de L96 é como segue:
260 / 395 trans-4-hidroxiprolinol
Sítio de conjugação GalNAc triantenário
Tirante C12 – ácido dicarboxílico
Tabela 2. Sequências não modificadas de HSD17B13 Nome do SEQ ID Intervalo em SEQ ID Intervalo em Sequência da fita sense 5’ para 3’ Sequência da fita antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4
CAGUACCUCCUCCCUAGGAC AGUCCUAGGGAGGAGGUACUG AD-238911.1 3003 4-24 3299 2-24
U UC
AGUACCUCCUCCCUAGGACU UAGUCCUAGGGAGGAGGUACU AD-238912.1 3004 5-25 3300 3-25
A GU
GUACCUCCUCCCUAGGACUA UUAGUCCUAGGGAGGAGGUAC AD-238913.1 3005 6-26 3301 4-26
A UG
ACUACACAAGGACUGAACCA UUGGUUCAGUCCUUGUGUAGU AD-238929.1 3006 22-42 3302 20-42
A CC
CUACACAAGGACUGAACCAG UCUGGUUCAGUCCUUGUGUAG AD-238930.1 3007 23-43 3303 21-43
A UC
ACACAAGGACUGAACCAGA UUUCUGGUUCAGUCCUUGUGU AD-238932.1 3008 25-45 3304 23-45
AA AG
CAGAGCAAAGCCAUGAACA UAUGUUCAUGGCUUUGCUCUG AD-238960.1 3009 54-74 3305 52-74
UA UC 261 / 395
UCAUCCUAGAAAUCCUUCUG UCAGAAGGAUUUCUAGGAUGA AD-238979.1 3010 73-93 3306 71-93
A UG
UCCUUCUGCUUCUGAUCACC UGGUGAUCAGAAGCAGAAGGA AD-238991.1 3011 85-105 3307 83-105
A UU
CCAUCAUCUACUCCUACUUG UCAAGUAGGAGUAGAUGAUGG AD-239009.1 3012 103-123 3308 101-123
A UG
UCUACUCCUACUUGGAGUCG ACGACUCCAAGUAGGAGUAGA AD-239015.1 3013 109-129 3309 107-129
U UG
CUACUCCUACUUGGAGUCGU AACGACUCCAAGUAGGAGUAG AD-239016.1 3014 110-130 3310 108-130
U AU
UACUCCUACUUGGAGUCGU UAACGACUCCAAGUAGGAGUA AD-239017.1 3015 111-131 3311 109-131
UA GA
ACUCCUACUUGGAGUCGUU UCAACGACUCCAAGUAGGAGU AD-239018.1 3016 112-132 3312 110-132
GA AG
CUCCUACUUGGAGUCGUUG ACCAACGACUCCAAGUAGGAG AD-239019.1 3017 113-133 3313 111-133
GU UA
UCCUACUUGGAGUCGUUGG UACCAACGACUCCAAGUAGGA AD-239020.1 3018 114-134 3314 112-134
UA GU
GUCGUUGGUGAAGUUUUUC AUGAAAAACUUCACCAACGAC AD-239031.1 3019 125-145 3315 123-145
AU UC
GAGAUUGUUCUCAUUACUG UCCAGUAAUGAGAACAAUCUC AD-239062.1 3020 174-194 3316 172-194
GA CC
UUGUUCUCAUUACUGGAGC UAGCUCCAGUAAUGAGAACAA AD-239066.1 3021 178-198 3317 176-198
UA UC
GCAGACUACUUAUGAAUUU UCAAAUUCAUAAGUAGUCUGC AD-239103.1 3022 215-235 3318 213-235
GA CU
ACUUAUGAAUUUGCAAAAC UCGUUUUGCAAAUUCAUAAGU AD-239110.1 3023 222-242 3319 220-242
GA AG
AUUUGCAAAACGACAGAGC AUGCUCUGUCGUUUUGCAAAU AD-239118.1 3024 230-250 3320 228-250
AU UC
UUUGCAAAACGACAGAGCA UAUGCUCUGUCGUUUUGCAAA AD-239119.1 3025 231-251 3321 229-251
UA UU
CAGAGCAUAUUGGUUCUGU UCACAGAACCAAUAUGCUCUG AD-239131.1 3026 243-263 3322 241-263
GA UC
AGAGCAUAUUGGUUCUGUG UCCACAGAACCAAUAUGCUCU AD-239132.1 3027 244-264 3323 242-264
GA GU
GAGCAUAUUGGUUCUGUGG UCCCACAGAACCAAUAUGCUC AD-239133.1 3028 245-265 3324 243-265
GA UG 262 / 395
CUGUGGGAUAUUAAUAAGC UCGCUUAUUAAUAUCCCACAG AD-239146.1 3029 258-278 3325 256-278
GA AA
AUUAAUAAGCGCGGUGUGG UUCCACACCGCGCUUAUUAAU AD-239155.1 3030 267-287 3326 265-287
AA AU
UUAAUAAGCGCGGUGUGGA UCUCCACACCGCGCUUAUUAA AD-239156.1 3031 268-288 3327 266-288
GA UA
AAACUGCAGCUGAGUGCCG UUCGGCACUCAGCUGCAGUUU AD-239177.1 3032 289-309 3328 287-309
AA CC
AACUGCAGCUGAGUGCCGA UUUCGGCACUCAGCUGCAGUU AD-239178.1 3033 290-310 3329 288-310
AA UC
ACUGCAGCUGAGUGCCGAA UUUUCGGCACUCAGCUGCAGU AD-239179.1 3034 291-311 3330 289-311
AA UU
CUGCAGCUGAGUGCCGAAA GUUUUCGGCACUCAGCUGCAG AD-239180.1 3035 292-312 3331 290-312
AC UU
UGCAGCUGAGUGCCGAAAA AGUUUUCGGCACUCAGCUGCA AD-239181.1 3036 293-313 3332 291-313
CU GU
GCAGCUGAGUGCCGAAAAC UAGUUUUCGGCACUCAGCUGC AD-239182.1 3037 294-314 3333 292-314
UA AG
CAGCUGAGUGCCGAAAACU UUAGUUUUCGGCACUCAGCUG AD-239183.1 3038 295-315 3334 293-315
AA CA
GCUGAGUGCCGAAAACUAG UCCUAGUUUUCGGCACUCAGC AD-239185.1 3039 297-317 3335 295-317
GA UG
CUGAGUGCCGAAAACUAGG UGCCUAGUUUUCGGCACUCAG AD-239186.1 3040 298-318 3336 296-318
CA CU
UGAGUGCCGAAAACUAGGC ACGCCUAGUUUUCGGCACUCA AD-239187.1 3041 299-319 3337 297-319
GU GC
GAGUGCCGAAAACUAGGCG UACGCCUAGUUUUCGGCACUC AD-239188.1 3042 300-320 3338 298-320
UA AG
AGUGCCGAAAACUAGGCGU UGACGCCUAGUUUUCGGCACU AD-239189.1 3043 301-321 3339 299-321
CA CA
GUGCCGAAAACUAGGCGUC UUGACGCCUAGUUUUCGGCAC AD-239190.1 3044 302-322 3340 300-322
AA UC
UGCCGAAAACUAGGCGUCAC AGUGACGCCUAGUUUUCGGCA AD-239191.1 3045 303-323 3341 301-323
U CU
GCCGAAAACUAGGCGUCACU UAGUGACGCCUAGUUUUCGGC AD-239192.1 3046 304-324 3342 302-324
A AC
CCGAAAACUAGGCGUCACUG UCAGUGACGCCUAGUUUUCGG AD-239193.1 3047 305-325 3343 303-325
A CA 263 / 395
CGAAAACUAGGCGUCACUGC UGCAGUGACGCCUAGUUUUCG AD-239194.1 3048 306-326 3344 304-326
A GC
AAAACUAGGCGUCACUGCGC UGCGCAGUGACGCCUAGUUUU AD-239196.1 3049 308-328 3345 306-328
A CG
AACUAGGCGUCACUGCGCAU UAUGCGCAGUGACGCCUAGUU AD-239198.1 3050 310-330 3346 308-330
A UU
ACUAGGCGUCACUGCGCAUG UCAUGCGCAGUGACGCCUAGU AD-239199.1 3051 311-331 3347 309-331
A UU
GGCGUCACUGCGCAUGCGUA AUACGCAUGCGCAGUGACGCC AD-239203.1 3052 315-335 3348 313-335
U UA
GCAUGCGUAUGUGGUAGAC UAGUCUACCACAUACGCAUGC AD-239214.1 3053 326-346 3349 324-346
UA GC
CAUGCGUAUGUGGUAGACU UCAGUCUACCACAUACGCAUG AD-239215.1 3054 327-347 3350 325-347
GA CG
AACAGAGAAGAGAUCUAUC UCGAUAGAUCUCUUCUCUGUU AD-239239.1 3055 351-371 3351 349-371
GA GC
ACAGAGAAGAGAUCUAUCG AGCGAUAGAUCUCUUCUCUGU AD-239240.1 3056 352-372 3352 350-372
CU UG
CAGAGAAGAGAUCUAUCGC UAGCGAUAGAUCUCUUCUCUG AD-239241.1 3057 353-373 3353 351-373
UA UU
AGAGAAGAGAUCUAUCGCU AGAGCGAUAGAUCUCUUCUCU AD-239242.1 3058 354-374 3354 352-374
CU GU
GAGAAGAGAUCUAUCGCUC UAGAGCGAUAGAUCUCUUCUC AD-239243.1 3059 355-375 3355 353-375
UA UG
GAAGAGAUCUAUCGCUCUC UAGAGAGCGAUAGAUCUCUUC AD-239245.1 3060 357-377 3356 355-377
UA UC
AAGAGAUCUAUCGCUCUCU UUAGAGAGCGAUAGAUCUCUU AD-239246.1 3061 358-378 3357 356-378
AA CU
AGAGAUCUAUCGCUCUCUA UUUAGAGAGCGAUAGAUCUCU AD-239247.1 3062 359-379 3358 357-379
AA UC
GAUCUAUCGCUCUCUAAAUC UGAUUUAGAGAGCGAUAGAUC AD-239250.1 3063 362-382 3359 360-382
A UC
AUCUAUCGCUCUCUAAAUCA UUGAUUUAGAGAGCGAUAGAU AD-239251.1 3064 363-383 3360 361-383
A CU
CUAUCGCUCUCUAAAUCAGG ACCUGAUUUAGAGAGCGAUAG AD-239253.1 3065 365-385 3361 363-385
U AU
UAUCGCUCUCUAAAUCAGG UACCUGAUUUAGAGAGCGAUA AD-239254.1 3066 366-386 3362 364-386
UA GA 264 / 395
AUCGCUCUCUAAAUCAGGU UCACCUGAUUUAGAGAGCGAU AD-239255.1 3067 367-387 3363 365-387
GA AG
GAUGUAACAAUCGUGGUGA AUUCACCACGAUUGUUACAUC AD-239290.1 3068 402-422 3364 400-422
AU AC
AUGUAACAAUCGUGGUGAA UAUUCACCACGAUUGUUACAU AD-239291.1 3069 403-423 3365 401-423
UA CA
UGUAACAAUCGUGGUGAAU UUAUUCACCACGAUUGUUACA AD-239292.1 3070 404-424 3366 402-424
AA UC
GUAACAAUCGUGGUGAAUA AUUAUUCACCACGAUUGUUAC AD-239293.1 3071 405-425 3367 403-425
AU AU
GGUGAAUAAUGCUGGGACA ACUGUCCCAGCAUUAUUCACC AD-239304.1 3072 416-436 3368 414-436
GU AC
AUGCUGGGACAGUAUAUCC UUGGAUAUACUGUCCCAGCAU AD-239312.1 3073 424-444 3369 422-444
AA UA
UGCUGGGACAGUAUAUCCA UCUGGAUAUACUGUCCCAGCA AD-239313.1 3074 425-445 3370 423-445
GA UU
GCUGGGACAGUAUAUCCAG UGCUGGAUAUACUGUCCCAGC AD-239314.1 3075 426-446 3371 424-446
CA AU
UGGGACAGUAUAUCCAGCC UCGGCUGGAUAUACUGUCCCA AD-239316.1 3076 428-448 3372 426-448
GA GC
GGGACAGUAUAUCCAGCCG AUCGGCUGGAUAUACUGUCCC AD-239317.1 3077 429-449 3373 427-449
AU AG
GGACAGUAUAUCCAGCCGA UAUCGGCUGGAUAUACUGUCC AD-239318.1 3078 430-450 3374 428-450
UA CA
CAGUAUAUCCAGCCGAUCUU UAAGAUCGGCUGGAUAUACUG AD-239321.1 3079 433-453 3375 431-453
A UC
GCCGAUCUUCUCAGCACCAA UUUGGUGCUGAGAAGAUCGGC AD-239332.1 3080 444-464 3376 442-464
A UG
UCUUCUCAGCACCAAGGAUG UCAUCCUUGGUGCUGAGAAGA AD-239337.1 3081 449-469 3377 447-469
A UC
CCAAGGAUGAAGAGAUUAC UGGUAAUCUCUUCAUCCUUGG AD-239348.1 3082 460-480 3378 458-480
CA UG
AUUACCAAGACAUUUGAGG UACCUCAAAUGUCUUGGUAAU AD-239362.1 3083 474-494 3379 472-494
UA CU
CCAAGACAUUUGAGGUCAA UGUUGACCUCAAAUGUCUUGG AD-239366.1 3084 478-498 3380 476-498
CA UA
AAGACAUUUGAGGUCAACA UAUGUUGACCUCAAAUGUCUU AD-239368.1 3085 480-500 3381 478-500
UA GG 265 / 395
CAUUUGAGGUCAACAUCCU UUAGGAUGUUGACCUCAAAUG AD-239372.1 3086 484-504 3382 482-504
AA UC
AUUUGAGGUCAACAUCCUA UCUAGGAUGUUGACCUCAAAU AD-239373.1 3087 485-505 3383 483-505
GA GU
GGUCAACAUCCUAGGACAU AAAUGUCCUAGGAUGUUGACC AD-239379.1 3088 491-511 3384 489-511
UU UC
GUCAACAUCCUAGGACAUU AAAAUGUCCUAGGAUGUUGAC AD-239380.1 3089 492-512 3385 490-512
UU CU
UCCUAGGACAUUUUUGGAU UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGA AD-239387.1 3090 499-519 3386 497-519
CA UG
UUUUUGGAUCACAAAAGCA AGUGCUUUUGUGAUCCAAAAA AD-239397.1 3091 509-529 3387 507-529
CU UG
AAGCACUUCUUCCAUCGAUG UCAUCGAUGGAAGAAGUGCUU AD-239411.1 3092 523-543 3388 521-543
A UU
AGCACUUCUUCCAUCGAUGA AUCAUCGAUGGAAGAAGUGCU AD-239412.1 3093 524-544 3389 522-544
U UU
AUGGAGAGAAAUCAUGGCC UUGGCCAUGAUUUCUCUCCAU AD-239431.1 3094 543-563 3390 541-563
AA CA
GGAGAGAAAUCAUGGCCAC AUGUGGCCAUGAUUUCUCUCC AD-239433.1 3095 545-565 3391 543-565
AU AU
GAGAAAUCAUGGCCACAUC ACGAUGUGGCCAUGAUUUCUC AD-239436.1 3096 548-568 3392 546-568
GU UC
AGAAAUCAUGGCCACAUCG UACGAUGUGGCCAUGAUUUCU AD-239437.1 3097 549-569 3393 547-569
UA CU
GAAAUCAUGGCCACAUCGUC UGACGAUGUGGCCAUGAUUUC AD-239438.1 3098 550-570 3394 548-570
A UC
AAAUCAUGGCCACAUCGUCA UUGACGAUGUGGCCAUGAUUU AD-239439.1 3099 551-571 3395 549-571
A CU
ACAUCGUCACAGUGGCUUCA UUGAAGCCACUGUGACGAUGU AD-239450.1 3100 562-582 3396 560-582
A GG
CAUCGUCACAGUGGCUUCAG ACUGAAGCCACUGUGACGAUG AD-239451.1 3101 563-583 3397 561-583
U UG
AUCGUCACAGUGGCUUCAG UACUGAAGCCACUGUGACGAU AD-239452.1 3102 564-584 3398 562-584
UA GU
UCGUCACAGUGGCUUCAGU ACACUGAAGCCACUGUGACGA AD-239453.1 3103 565-585 3399 563-585
GU UG
CGGCCACGAAGGGAUUCCUU UAAGGAAUCCCUUCGUGGCCG AD-239475.1 3104 587-607 3400 585-607
A CA 266 / 395
GGCCACGAAGGGAUUCCUU UUAAGGAAUCCCUUCGUGGCC AD-239476.1 3105 588-608 3401 586-608
AA GC
CCACGAAGGGAUUCCUUACC AGGUAAGGAAUCCCUUCGUGG AD-239478.1 3106 590-610 3402 588-610
U CC
CACGAAGGGAUUCCUUACCU UAGGUAAGGAAUCCCUUCGUG AD-239479.1 3107 591-611 3403 589-611
A GC
ACGAAGGGAUUCCUUACCUC UGAGGUAAGGAAUCCCUUCGU AD-239480.1 3108 592-612 3404 590-612
A GG
GAAGGGAUUCCUUACCUCA UAUGAGGUAAGGAAUCCCUUC AD-239482.1 3109 594-614 3405 592-614
UA GU
AAGGGAUUCCUUACCUCAUC UGAUGAGGUAAGGAAUCCCUU AD-239483.1 3110 595-615 3406 593-615
A CG
CAUCCCAUAUUGUUCCAGCA UUGCUGGAACAAUAUGGGAUG AD-239499.1 3111 611-631 3407 609-631
A AG
GUUCCAGCAAAUUUGCCGCU UAGCGGCAAAUUUGCUGGAAC AD-239510.1 3112 622-642 3408 620-642
A AA
AUUUGCCGCUGUUGGCUUU UGAAAGCCAACAGCGGCAAAU AD-239520.1 3113 632-652 3409 630-652
CA UU
UUUGCCGCUGUUGGCUUUC UUGAAAGCCAACAGCGGCAAA AD-239521.1 3114 633-653 3410 631-653
AA UU
UUGCCGCUGUUGGCUUUCAC UGUGAAAGCCAACAGCGGCAA AD-239522.1 3115 634-654 3411 632-654
A AU
GCUUUCACAGAGGUCUGAC AUGUCAGACCUCUGUGAAAGC AD-239534.1 3116 646-666 3412 644-666
AU CA
CACAGAGGUCUGACAUCAG UUCUGAUGUCAGACCUCUGUG AD-239539.1 3117 651-671 3413 649-671
AA AA
AGGUCUGACAUCAGAACUU UGAAGUUCUGAUGUCAGACCU AD-239544.1 3118 656-676 3414 654-676
CA CU
GCCUUGGGAAAAACUGGUA UAUACCAGUUUUUCCCAAGGC AD-239566.1 3119 678-698 3415 676-698
UA CU
ACUGGUAUCAAAACCUCAU ACAUGAGGUUUUGAUACCAGU AD-239578.1 3120 690-710 3416 688-710
GU UU
CUGGUAUCAAAACCUCAUG UACAUGAGGUUUUGAUACCAG AD-239579.1 3121 691-711 3417 689-711
UA UU
UUUGUGAAUACUGGGUUCA UGUGAACCCAGUAUUCACAAA AD-239611.1 3122 723-743 3418 721-743
CA AA
UUGUGAAUACUGGGUUCAC UGGUGAACCCAGUAUUCACAA AD-239612.1 3123 724-744 3419 722-744
CA AA 267 / 395
UGUGAAUACUGGGUUCACC UUGGUGAACCCAGUAUUCACA AD-239613.1 3124 725-745 3420 723-745
AA AA
AAUACUGGGUUCACCAAAA AUUUUUGGUGAACCCAGUAUU AD-239617.1 3125 729-749 3421 727-749
AU CA
AUACUGGGUUCACCAAAAA UAUUUUUGGUGAACCCAGUAU AD-239618.1 3126 730-750 3422 728-750
UA UC
UCCAAGCACAAGAUUAUGG UGCCAUAAUCUUGUGCUUGGA AD-239637.1 3127 749-769 3423 747-769
CA UU
AGCACAAGAUUAUGGCCUG UACAGGCCAUAAUCUUGUGCU AD-239641.1 3128 753-773 3424 751-773
UA UG
GCACAAGAUUAUGGCCUGU AUACAGGCCAUAAUCUUGUGC AD-239642.1 3129 754-774 3425 752-774
AU UU
CACAAGAUUAUGGCCUGUA AAUACAGGCCAUAAUCUUGUG AD-239643.1 3130 755-775 3426 753-775
UU CU
CAAGAUUAUGGCCUGUAUU UCAAUACAGGCCAUAAUCUUG AD-239645.1 3131 757-777 3427 755-777
GA UG
AGAUUAUGGCCUGUAUUGG UUCCAAUACAGGCCAUAAUCU AD-239647.1 3132 759-779 3428 757-779
AA UG
AUUAUGGCCUGUAUUGGAG UUCUCCAAUACAGGCCAUAAU AD-239649.1 3133 761-781 3429 759-781
AA CU
UUAUGGCCUGUAUUGGAGA UGUCUCCAAUACAGGCCAUAA AD-239650.1 3134 762-782 3430 760-782
CA UC
UGGCCUGUAUUGGAGACAG AUCUGUCUCCAAUACAGGCCA AD-239653.1 3135 765-785 3431 763-785
AU UA
GGCCUGUAUUGGAGACAGA UAUCUGUCUCCAAUACAGGCC AD-239654.1 3136 766-786 3432 764-786
UA AU
UUGGAGACAGAUGAAGUCG UACGACUUCAUCUGUCUCCAA AD-239662.1 3137 774-794 3433 772-794
UA UA
ACAGAUGAAGUCGUAAGAA ACUUCUUACGACUUCAUCUGU AD-239668.1 3138 780-800 3434 778-800
GU CU
CAGAUGAAGUCGUAAGAAG UACUUCUUACGACUUCAUCUG AD-239669.1 3139 781-801 3435 779-801
UA UC
AGAUGAAGUCGUAAGAAGU AGACUUCUUACGACUUCAUCU AD-239670.1 3140 782-802 3436 780-802
CU GU
GAUGAAGUCGUAAGAAGUC UAGACUUCUUACGACUUCAUC AD-239671.1 3141 783-803 3437 781-803
UA UG
GAAGUCGUAAGAAGUCUGA UAUCAGACUUCUUACGACUUC AD-239674.1 3142 786-806 3438 784-806
UA AU 268 / 395
AGUCGUAAGAAGUCUGAUA UCUAUCAGACUUCUUACGACU AD-239676.1 3143 788-808 3439 786-808
GA UC
UAAGAAGUCUGAUAGAUGG UUCCAUCUAUCAGACUUCUUA AD-239681.1 3144 793-813 3440 791-813
AA CG
AAGAAGUCUGAUAGAUGGA AUUCCAUCUAUCAGACUUCUU AD-239682.1 3145 794-814 3441 792-814
AU AC
GAAGUCUGAUAGAUGGAAU UUAUUCCAUCUAUCAGACUUC AD-239684.1 3146 796-816 3442 794-816
AA UU
AAGUCUGAUAGAUGGAAUA AGUAUUCCAUCUAUCAGACUU AD-239685.1 3147 797-817 3443 795-817
CU CU
UGGAAUACUUACCAAUAAG UUCUUAUUGGUAAGUAUUCCA AD-239697.1 3148 809-829 3444 807-829
AA UC
AAUGAUUUUUGUUCCAUCG UACGAUGGAACAAAAAUCAUU AD-239713.1 3149 830-850 3445 828-850
UA UU
AUGAUUUUUGUUCCAUCGU AUACGAUGGAACAAAAAUCAU AD-239714.1 3150 831-851 3446 829-851
AU UU
AUUUUUGUUCCAUCGUAUA UAUAUACGAUGGAACAAAAAU AD-239717.1 3151 834-854 3447 832-854
UA CA
UUGUUCCAUCGUAUAUCAA UAUUGAUAUACGAUGGAACAA AD-239721.1 3152 838-858 3448 836-858
UA AA
GUUCCAUCGUAUAUCAAUA UAUAUUGAUAUACGAUGGAAC AD-239723.1 3153 840-860 3449 838-860
UA AA
UUCCAUCGUAUAUCAAUAU AGAUAUUGAUAUACGAUGGAA AD-239724.1 3154 841-861 3450 839-861
CU CA
UCCAUCGUAUAUCAAUAUC AAGAUAUUGAUAUACGAUGGA AD-239725.1 3155 842-862 3451 840-862
UU AC
CCAUCGUAUAUCAAUAUCU AAAGAUAUUGAUAUACGAUGG AD-239726.1 3156 843-863 3452 841-863
UU AA
ACAGAAGUUUCUUCCUGAA UGUUCAGGAAGAAACUUCUGU AD-239755.1 3157 872-892 3453 870-892
CA AG
AGAAGUUUCUUCCUGAACG UGCGUUCAGGAAGAAACUUCU AD-239757.1 3158 874-894 3454 872-894
CA GU
AAGUUUCUUCCUGAACGCGC UGCGCGUUCAGGAAGAAACUU AD-239759.1 3159 876-896 3455 874-896
A CU
GUUUCUUCCUGAACGCGCCU UAGGCGCGUUCAGGAAGAAAC AD-239761.1 3160 878-898 3456 876-898
A UU
UCUUCCUGAACGCGCCUCAG UCUGAGGCGCGUUCAGGAAGA AD-239764.1 3161 881-901 3457 879-901
A AA 269 / 395
CCUCAGCGAUUUUAAAUCG UACGAUUUAAAAUCGCUGAGG AD-239778.1 3162 895-915 3458 893-915
UA CG
CUCAGCGAUUUUAAAUCGU AUACGAUUUAAAAUCGCUGAG AD-239779.1 3163 896-916 3459 894-916
AU GC
UCAGCGAUUUUAAAUCGUA UAUACGAUUUAAAAUCGCUGA AD-239780.1 3164 897-917 3460 895-917
UA GG
CAGCGAUUUUAAAUCGUAU UCAUACGAUUUAAAAUCGCUG AD-239781.1 3165 898-918 3461 896-918
GA AG
AGCGAUUUUAAAUCGUAUG UGCAUACGAUUUAAAAUCGCU AD-239782.1 3166 899-919 3462 897-919
CA GA
GCGAUUUUAAAUCGUAUGC UUGCAUACGAUUUAAAAUCGC AD-239783.1 3167 900-920 3463 898-920
AA UG
CGAUUUUAAAUCGUAUGCA UCUGCAUACGAUUUAAAAUCG AD-239784.1 3168 901-921 3464 899-921
GA CU
GAUUUUAAAUCGUAUGCAG UUCUGCAUACGAUUUAAAAUC AD-239785.1 3169 902-922 3465 900-922
AA GC
AUUUUAAAUCGUAUGCAGA AUUCUGCAUACGAUUUAAAAU AD-239786.1 3170 903-923 3466 901-923
AU CG
UUUUAAAUCGUAUGCAGAA UAUUCUGCAUACGAUUUAAAA AD-239787.1 3171 904-924 3467 902-924
UA UC
AAAUCGUAUGCAGAAUAUU UGAAUAUUCUGCAUACGAUUU AD-239791.1 3172 908-928 3468 906-928
CA AA
AUCGUAUGCAGAAUAUUCA AUUGAAUAUUCUGCAUACGAU AD-239793.1 3173 910-930 3469 908-930
AU UU
UAUUCAAUUUGAAGCAGUG ACCACUGCUUCAAAUUGAAUA AD-239806.1 3174 923-943 3470 921-943
GU UU
GAAUAAAUAAGCUCCAGCC UUGGCUGGAGCUUAUUUAUUC AD-239839.1 3175 967-987 3471 965-987
AA AU
AAUAAAUAAGCUCCAGCCA UCUGGCUGGAGCUUAUUUAUU AD-239840.1 3176 968-988 3472 966-988
GA CA
AGCCAGAGAUGUAUGCAUG AUCAUGCAUACAUCUCUGGCU AD-239854.1 3177 982-1002 3473 980-1002
AU GG
GCCAGAGAUGUAUGCAUGA UAUCAUGCAUACAUCUCUGGC AD-239855.1 3178 983-1003 3474 981-1003
UA UG
AUAUGAAUAGUUUCGAAUC UUGAUUCGAAACUAUUCAUAU AD-239876.1 3179 1007-1027 3475 1005-1027
AA CA
UAUGAAUAGUUUCGAAUCA AUUGAUUCGAAACUAUUCAUA AD-239877.1 3180 1008-1028 3476 1006-1028
AU UC 270 / 395
AAUAGUUUCGAAUCAAUGC UAGCAUUGAUUCGAAACUAUU AD-239881.1 3181 1012-1032 3477 1010-1032
UA CA
UUCAGUCCUGAUAAUAUUA UUUAAUAUUAUCAGGACUGAA AD-239905.1 3182 1054-1074 3478 1052-1074
AA AA
AAAAACAUUGGUUUGGCAC UAGUGCCAAACCAAUGUUUUU AD-239914.1 3183 1072-1092 3479 1070-1092
UA AA
AAAACAUUGGUUUGGCACU UUAGUGCCAAACCAAUGUUUU AD-239915.1 3184 1073-1093 3480 1071-1093
AA UA
GUCAAACGAACAAGAUUAA AAUUAAUCUUGUUCGUUUGAC AD-239941.1 3185 1099-1119 3481 1097-1119
UU UG
AAACGAACAAGAUUAAUUA UGUAAUUAAUCUUGUUCGUUU AD-239944.1 3186 1102-1122 3482 1100-1122
CA GA
AACGAACAAGAUUAAUUAC AGGUAAUUAAUCUUGUUCGUU AD-239945.1 3187 1103-1123 3483 1101-1123
CU UG
ACGAACAAGAUUAAUUACC UAGGUAAUUAAUCUUGUUCGU AD-239946.1 3188 1104-1124 3484 1102-1124
UA UU
CGAACAAGAUUAAUUACCU ACAGGUAAUUAAUCUUGUUCG AD-239947.1 3189 1105-1125 3485 1103-1125
GU UU
UCUCAAGAAUAUUUACGUA ACUACGUAAAUAUUCUUGAGA AD-239977.1 3190 1135-1155 3486 1133-1155
GU AA
UCAAGAAUAUUUACGUAGU AAACUACGUAAAUAUUCUUGA AD-239979.1 3191 1137-1157 3487 1135-1157
UU GA
CAAGAAUAUUUACGUAGUU AAAACUACGUAAAUAUUCUUG AD-239980.1 3192 1138-1158 3488 1136-1158
UU AG
UUUCAUAGGUCUGUUUUUC AGGAAAAACAGACCUAUGAAA AD-239998.1 3193 1157-1177 3489 1155-1177
CU AA
UUCAUGCCUCUUAAAAACU UAAGUUUUUAAGAGGCAUGAA AD-240019.1 3194 1178-1198 3490 1176-1198
UA AG
AAAAACUUCUGUGCUUACA UAUGUAAGCACAGAAGUUUUU AD-240031.1 3195 1190-1210 3491 1188-1210
UA AA
AAAACUUCUGUGCUUACAU UUAUGUAAGCACAGAAGUUUU AD-240032.1 3196 1191-1211 3492 1189-1211
AA UA
AAACUUCUGUGCUUACAUA UUUAUGUAAGCACAGAAGUUU AD-240033.1 3197 1192-1212 3493 1190-1212
AA UU
UUUUUCCAUUUAAAGGUGG UUCCACCUUUAAAUGGAAAAA AD-240064.1 3198 1245-1265 3494 1243-1265
AA UA
CUACCUCCCUAAAAGUAAAU UAUUUACUUUUAGGGAGGUAG AD-240090.1 3199 1271-1291 3495 1269-1291
A CU 271 / 395
UACCUCCCUAAAAGUAAAU UUAUUUACUUUUAGGGAGGUA AD-240091.1 3200 1272-1292 3496 1270-1292
AA GC
UACAAAGAGAACUUAUUUA UGUAAAUAAGUUCUCUUUGUA AD-240108.1 3201 1290-1310 3497 1288-1310
CA UU
AACUUAUUUACACAGGGAA UCUUCCCUGUGUAAAUAAGUU AD-240117.1 3202 1299-1319 3498 1297-1319
GA CU
UUACACAGGGAAGGUUUAA UCUUAAACCUUCCCUGUGUAA AD-240124.1 3203 1306-1326 3499 1304-1326
GA AU
UACACAGGGAAGGUUUAAG UUCUUAAACCUUCCCUGUGUA AD-240125.1 3204 1307-1327 3500 1305-1327
AA AA
ACACAGGGAAGGUUUAAGA AGUCUUAAACCUUCCCUGUGU AD-240126.1 3205 1308-1328 3501 1306-1328
CU AA
AGGUUUAAGACUGUUCAAG UACUUGAACAGUCUUAAACCU AD-240135.1 3206 1317-1337 3502 1315-1337
UA UC
UUUAAGACUGUUCAAGUAG UGCUACUUGAACAGUCUUAAA AD-240138.1 3207 1320-1340 3503 1318-1340
CA CC
UAAGACUGUUCAAGUAGCA AAUGCUACUUGAACAGUCUUA AD-240140.1 3208 1322-1342 3504 1320-1342
UU AA
AGACUGUUCAAGUAGCAUU UGAAUGCUACUUGAACAGUCU AD-240142.1 3209 1324-1344 3505 1322-1344
CA UA
CUGUUCAAGUAGCAUUCCA AUUGGAAUGCUACUUGAACAG AD-240145.1 3210 1327-1347 3506 1325-1347
AU UC
GUUCAAGUAGCAUUCCAAU AGAUUGGAAUGCUACUUGAAC AD-240147.1 3211 1329-1349 3507 1327-1349
CU AG
UUCAAGUAGCAUUCCAAUC UAGAUUGGAAUGCUACUUGAA AD-240148.1 3212 1330-1350 3508 1328-1350
UA CA
UAGCAUUCCAAUCUGUAGCC UGGCUACAGAUUGGAAUGCUA AD-240154.1 3213 1336-1356 3509 1334-1356
A CU
AGCAUUCCAAUCUGUAGCCA AUGGCUACAGAUUGGAAUGCU AD-240155.1 3214 1337-1357 3510 1335-1357
U AC
GCAUUCCAAUCUGUAGCCAU UAUGGCUACAGAUUGGAAUGC AD-240156.1 3215 1338-1358 3511 1336-1358
A UA
GCCAUGCCACAGAAUAUCAA UUUGAUAUUCUGUGGCAUGGC AD-240171.1 3216 1353-1373 3512 1351-1373
A UA
CCAUGCCACAGAAUAUCAAC UGUUGAUAUUCUGUGGCAUGG AD-240172.1 3217 1354-1374 3513 1352-1374
A CU
AAGAACACAGAAUGAGUGC UUGCACUCAUUCUGUGUUCUU AD-240192.1 3218 1374-1394 3514 1372-1394
AA GU 272 / 395
GUUUCAGCAGGCAGCUUUA UAUAAAGCUGCCUGCUGAAAC AD-240227.1 3219 1409-1429 3515 1407-1429
UA UU
UUUCAGCAGGCAGCUUUAU AGAUAAAGCUGCCUGCUGAAA AD-240228.1 3220 1410-1430 3516 1408-1430
CU CU
GCAGCUUUAUCUCAACCUGG UCCAGGUUGAGAUAAAGCUGC AD-240237.1 3221 1419-1439 3517 1417-1439
A CU
AUCUCAACCUGGACAUAUU AAAAUAUGUCCAGGUUGAGAU AD-240245.1 3222 1427-1447 3518 1425-1447
UU AA
AUUUGAAAGAUUUCCCUAG UGCUAGGGAAAUCUUUCAAAU AD-240276.1 3223 1458-1478 3519 1456-1478
CA GC
UUGAAAGAUUUCCCUAGCC UAGGCUAGGGAAAUCUUUCAA AD-240278.1 3224 1460-1480 3520 1458-1480
UA AU
UGAAAGAUUUCCCUAGCCUC AGAGGCUAGGGAAAUCUUUCA AD-240279.1 3225 1461-1481 3521 1459-1481
U AA
GAAAGAUUUCCCUAGCCUCU AAGAGGCUAGGGAAAUCUUUC AD-240280.1 3226 1462-1482 3522 1460-1482
U AA
CAUUAGCCCAAAACGGUGCA UUGCACCGUUUUGGGCUAAUG AD-240308.1 3227 1490-1510 3523 1488-1510
A AA
AUUAGCCCAAAACGGUGCA UUUGCACCGUUUUGGGCUAAU AD-240309.1 3228 1491-1511 3524 1489-1511
AA GA
UUAGCCCAAAACGGUGCAAC AGUUGCACCGUUUUGGGCUAA AD-240310.1 3229 1492-1512 3525 1490-1512
U UG
UAGCCCAAAACGGUGCAACU UAGUUGCACCGUUUUGGGCUA AD-240311.1 3230 1493-1513 3526 1491-1513
A AU
AGCCCAAAACGGUGCAACUC AGAGUUGCACCGUUUUGGGCU AD-240312.1 3231 1494-1514 3527 1492-1514
U AA
GCCCAAAACGGUGCAACUCU UAGAGUUGCACCGUUUUGGGC AD-240313.1 3232 1495-1515 3528 1493-1515
A UA
CCAAAACGGUGCAACUCUAU AAUAGAGUUGCACCGUUUUGG AD-240315.1 3233 1497-1517 3529 1495-1517
U GC
AAAACGGUGCAACUCUAUU AGAAUAGAGUUGCACCGUUUU AD-240317.1 3234 1499-1519 3530 1497-1519
CU GG
AAACGGUGCAACUCUAUUC UAGAAUAGAGUUGCACCGUUU AD-240318.1 3235 1500-1520 3531 1498-1520
UA UG
AACGGUGCAACUCUAUUCU UCAGAAUAGAGUUGCACCGUU AD-240319.1 3236 1501-1521 3532 1499-1521
GA UU
GGUGCAACUCUAUUCUGGA AGUCCAGAAUAGAGUUGCACC AD-240322.1 3237 1504-1524 3533 1502-1524
CU GU 273 / 395
UGCAACUCUAUUCUGGACU AAAGUCCAGAAUAGAGUUGCA AD-240324.1 3238 1506-1526 3534 1504-1526
UU CC
CAACUCUAUUCUGGACUUU AUAAAGUCCAGAAUAGAGUUG AD-240326.1 3239 1508-1528 3535 1506-1528
AU CA
AACUCUAUUCUGGACUUUA AAUAAAGUCCAGAAUAGAGUU AD-240327.1 3240 1509-1529 3536 1507-1529
UU GC
AUUCUGGACUUUAUUACUU UCAAGUAAUAAAGUCCAGAAU AD-240333.1 3241 1515-1535 3537 1513-1535
GA AG
UGUAUAACUCUGAAGUCCA UGUGGACUUCAGAGUUAUACA AD-240364.1 3242 1546-1566 3538 1544-1566
CA GA
GUAUAACUCUGAAGUCCACC UGGUGGACUUCAGAGUUAUAC AD-240365.1 3243 1547-1567 3539 1545-1567
A AG
GAAGUCCACCAAAAGUGGA UGUCCACUUUUGGUGGACUUC AD-240375.1 3244 1557-1577 3540 1555-1577
CA AG
GUCCACCAAAAGUGGACCCU UAGGGUCCACUUUUGGUGGAC AD-240378.1 3245 1560-1580 3541 1558-1580
A UU
CACCAAAAGUGGACCCUCUA AUAGAGGGUCCACUUUUGGUG AD-240381.1 3246 1563-1583 3542 1561-1583
U GA
ACCAAAAGUGGACCCUCUAU UAUAGAGGGUCCACUUUUGGU AD-240382.1 3247 1564-1584 3543 1562-1584
A GG
CCAAAAGUGGACCCUCUAUA AUAUAGAGGGUCCACUUUUGG AD-240383.1 3248 1565-1585 3544 1563-1585
U UG
AAAAGUGGACCCUCUAUAU AAAUAUAGAGGGUCCACUUUU AD-240385.1 3249 1567-1587 3545 1565-1587
UU GG
AAAGUGGACCCUCUAUAUU UAAAUAUAGAGGGUCCACUUU AD-240386.1 3250 1568-1588 3546 1566-1588
UA UG
AAGUGGACCCUCUAUAUUU UGAAAUAUAGAGGGUCCACUU AD-240387.1 3251 1569-1589 3547 1567-1589
CA UU
AUACAUUAUGAAAGGUGAC UGGUCACCUUUCAUAAUGUAU AD-240419.1 3252 1612-1632 3548 1610-1632
CA CU
UACAUUAUGAAAGGUGACC UCGGUCACCUUUCAUAAUGUA AD-240420.1 3253 1613-1633 3549 1611-1633
GA UC
ACAUUAUGAAAGGUGACCG UUCGGUCACCUUUCAUAAUGU AD-240421.1 3254 1614-1634 3550 1612-1634
AA AU
CAUUAUGAAAGGUGACCGA AGUCGGUCACCUUUCAUAAUG AD-240422.1 3255 1615-1635 3551 1613-1635
CU UA
AUUAUGAAAGGUGACCGAC UAGUCGGUCACCUUUCAUAAU AD-240423.1 3256 1616-1636 3552 1614-1636
UA GU 274 / 395
AGGUGACCGACUCUAUUUU UUAAAAUAGAGUCGGUCACCU AD-240431.1 3257 1624-1644 3553 1622-1644
AA UU
AUCUCAGAAUUUUAAGUUC UAGAACUUAAAAUUCUGAGAU AD-240446.1 3258 1645-1665 3554 1643-1665
UA UU
CUUUCAUAUAUCCUUGGUCC UGGACCAAGGAUAUAUGAAAG AD-240474.1 3259 1699-1719 3555 1697-1719
A CA
UUUCAUAUAUCCUUGGUCCC UGGGACCAAGGAUAUAUGAAA AD-240475.1 3260 1700-1720 3556 1698-1720
A GC
UUCAUAUAUCCUUGGUCCCA UUGGGACCAAGGAUAUAUGAA AD-240476.1 3261 1701-1721 3557 1699-1721
A AG
GUCCCAGAGAUGUUUAGAC UUGUCUAAACAUCUCUGGGAC AD-240490.1 3262 1715-1735 3558 1713-1735
AA CA
CAGAGAUGUUUAGACAAUU AAAAUUGUCUAAACAUCUCUG AD-240494.1 3263 1719-1739 3559 1717-1739
UU GG
AGAGAUGUUUAGACAAUUU UAAAAUUGUCUAAACAUCUCU AD-240495.1 3264 1720-1740 3560 1718-1740
UA GG
GUUUAGACAAUUUUAGGCU UGAGCCUAAAAUUGUCUAAAC AD-240501.1 3265 1726-1746 3561 1724-1746
CA AU
UUUAGACAAUUUUAGGCUC UUGAGCCUAAAAUUGUCUAAA AD-240502.1 3266 1727-1747 3562 1725-1747
AA CA
UUAGACAAUUUUAGGCUCA UUUGAGCCUAAAAUUGUCUAA AD-240503.1 3267 1728-1748 3563 1726-1748
AA AC
UAGACAAUUUUAGGCUCAA UUUUGAGCCUAAAAUUGUCUA AD-240504.1 3268 1729-1749 3564 1727-1749
AA AA
AGACAAUUUUAGGCUCAAA UUUUUGAGCCUAAAAUUGUCU AD-240505.1 3269 1730-1750 3565 1728-1750
AA AA
ACAAUUUUAGGCUCAAAAA AAUUUUUGAGCCUAAAAUUGU AD-240507.1 3270 1732-1752 3566 1730-1752
UU CU
UUUAGGCUCAAAAAUUAAA UCUUUAAUUUUUGAGCCUAAA AD-240512.1 3271 1737-1757 3567 1735-1757
GA AU
UUAGGCUCAAAAAUUAAAG AGCUUUAAUUUUUGAGCCUAA AD-240513.1 3272 1738-1758 3568 1736-1758
CU AA
UAGGCUCAAAAAUUAAAGC UAGCUUUAAUUUUUGAGCCUA AD-240514.1 3273 1739-1759 3569 1737-1759
UA AA
CAGGAAAAGGAACUGUACU UCAGUACAGUUCCUUUUCCUG AD-240538.1 3274 1763-1783 3570 1761-1783
GA UG
GGAAAAGGAACUGUACUGG AGCCAGUACAGUUCCUUUUCC AD-240540.1 3275 1765-1785 3571 1763-1785
CU UG 275 / 395
AAAAGGAACUGUACUGGCU AUAGCCAGUACAGUUCCUUUU AD-240542.1 3276 1767-1787 3572 1765-1787
AU CC
AGGAACUGUACUGGCUAUU UUAAUAGCCAGUACAGUUCCU AD-240545.1 3277 1770-1790 3573 1768-1790
AA UU
GGAACUGUACUGGCUAUUA UGUAAUAGCCAGUACAGUUCC AD-240546.1 3278 1771-1791 3574 1769-1791
CA UU
UAAUCCGACUCCCACUACAU UAUGUAGUGGGAGUCGGAUUA AD-240779.1 3279 2181-2201 3575 2179-2201
A UU
UCCGACUCCCACUACAUCAA UUUGAUGUAGUGGGAGUCGGA AD-240782.1 3280 2184-2204 3576 2182-2204
A UU
CUCCCACUACAUCAAGACUA UUAGUCUUGAUGUAGUGGGAG AD-240787.1 3281 2189-2209 3577 2187-2209
A UC
UCCCACUACAUCAAGACUAA AUUAGUCUUGAUGUAGUGGGA AD-240788.1 3282 2190-2210 3578 2188-2210
U GU
CCCACUACAUCAAGACUAAU UAUUAGUCUUGAUGUAGUGGG AD-240789.1 3283 2191-2211 3579 2189-2211
A AG
CCACUACAUCAAGACUAAUC AGAUUAGUCUUGAUGUAGUGG AD-240790.1 3284 2192-2212 3580 2190-2212
U GA
ACUACAUCAAGACUAAUCU UAAGAUUAGUCUUGAUGUAGU AD-240792.1 3285 2194-2214 3581 2192-2214
UA GG
CUACAUCAAGACUAAUCUU ACAAGAUUAGUCUUGAUGUAG AD-240793.1 3286 2195-2215 3582 2193-2215
GU UG
UACAUCAAGACUAAUCUUG AACAAGAUUAGUCUUGAUGUA AD-240794.1 3287 2196-2216 3583 2194-2216
UU GU
ACAUCAAGACUAAUCUUGU AAACAAGAUUAGUCUUGAUGU AD-240795.1 3288 2197-2217 3584 2195-2217
UU AG
GUAUUAUAGAAUGCUUUUG UGCAAAAGCAUUCUAUAAUAC AD-240826.1 3289 2234-2254 3585 2232-2254
CA AU
UAUAGAAUGCUUUUGCAUG UCCAUGCAAAAGCAUUCUAUA AD-240830.1 3290 2238-2258 3586 2236-2258
GA AU
AGAAUGCUUUUGCAUGGAC UAGUCCAUGCAAAAGCAUUCU AD-240833.1 3291 2241-2261 3587 2239-2261
UA AU
GAAUGCUUUUGCAUGGACU AUAGUCCAUGCAAAAGCAUUC AD-240834.1 3292 2242-2262 3588 2240-2262
AU UA
UGCUUUUGCAUGGACUAUC AGGAUAGUCCAUGCAAAAGCA AD-240837.1 3293 2245-2265 3589 2243-2265
CU UU
CUUUUGCAUGGACUAUCCUC AGAGGAUAGUCCAUGCAAAAG AD-240839.1 3294 2247-2267 3590 2245-2267
U CA 276 / 395
UGCAUGGACUAUCCUCUUG AACAAGAGGAUAGUCCAUGCA AD-240843.1 3295 2251-2271 3591 2249-2271
UU AA
GCAUGGACUAUCCUCUUGU AAACAAGAGGAUAGUCCAUGC AD-240844.1 3296 2252-2272 3592 2250-2272
UU AA
AAAUAACCUCUUGUAGUUA UAUAACUACAAGAGGUUAUUU AD-240871.1 3297 2349-2369 3593 2347-2369
UA UU
AACCUCUUGUAGUUAUAAA AUUUUAUAACUACAAGAGGUU AD-240875.1 3298 2353-2373 3594 2351-2373
AU AU
Tabela 3. Sequências modificadas de HSD17B13
SEQ Nome do SEQ ID Sequência 5’ para 3’ da fita SEQ ID ID Sequência 5’ para 3’ da fita sense Sequência do mRNA alvo duplex NO: sense NO: NO: csasguacCfuCfCfUfcccuaggacu asGfsuccUfaGfGfgaggAfgGfuacug GACAGUACCUCCUCCCUAGG AD-238911.1 3595 3891 4187 L96 susc ACU asgsuaccUfcCfUfCfccuaggacua usAfsgucCfuAfGfggagGfaGfguacu ACAGUACCUCCUCCCUAGGA AD-238912.1 3596 3892 4188 L96 sgsu CUA gsusaccuCfcUfCfCfcuaggacuaa usUfsaguCfcUfAfgggaGfgAfgguac CAGUACCUCCUCCCUAGGAC AD-238913.1 3597 3893 4189 L96 susg UAC ascsuacaCfaAfGfGfacugaaccaa usUfsgguUfcAfGfuccuUfgUfguag GGACUACACAAGGACUGAAC AD-238929.1 3598 3894 4190 L96 uscsc CAG csusacacAfaGfGfAfcugaaccaga usCfsuggUfuCfAfguccUfuGfuguag GACUACACAAGGACUGAACC AD-238930.1 3599 3895 4191 L96 susc AGA ascsacaaGfgAfCfUfgaaccagaaa usUfsucuGfgUfUfcaguCfcUfugugu CUACACAAGGACUGAACCAG AD-238932.1 3600 3896 4192 L96 sasg AAG csasgagcAfaAfGfCfcaugaacaua usAfsuguUfcAfUfggcuUfuGfcucu GACAGAGCAAAGCCAUGAAC 277 / 395 AD-238960.1 3601 3897 4193 L96 gsusc AUC uscsauccUfaGfAfAfauccuucuga usCfsagaAfgGfAfuuucUfaGfgauga CAUCAUCCUAGAAAUCCUUC AD-238979.1 3602 3898 4194 L96 susg UGC uscscuucUfgCfUfUfcugaucacca usGfsgugAfuCfAfgaagCfaGfaagga AAUCCUUCUGCUUCUGAUCA AD-238991.1 3603 3899 4195 L96 susu CCA cscsaucaUfcUfAfCfuccuacuuga usCfsaagUfaGfGfaguaGfaUfgaugg CACCAUCAUCUACUCCUACU AD-239009.1 3604 3900 4196 L96 susg UGG uscsuacuCfcUfAfCfuuggagucg asCfsgacUfcCfAfaguaGfgAfguaga CAUCUACUCCUACUUGGAGU AD-239015.1 3605 3901 4197 uL96 susg CGU csusacucCfuAfCfUfuggagucgu asAfscgaCfuCfCfaaguAfgGfaguag AUCUACUCCUACUUGGAGUC AD-239016.1 3606 3902 4198 uL96 sasu GUU usascuccUfaCfUfUfggagucguu usAfsacgAfcUfCfcaagUfaGfgagua UCUACUCCUACUUGGAGUCG AD-239017.1 3607 3903 4199 aL96 sgsa UUG ascsuccuAfcUfUfGfgagucguug usCfsaacGfaCfUfccaaGfuAfggagu CUACUCCUACUUGGAGUCGU AD-239018.1 3608 3904 4200 aL96 sasg UGG csusccuaCfuUfGfGfagucguugg asCfscaaCfgAfCfuccaAfgUfaggags UACUCCUACUUGGAGUCGUU AD-239019.1 3609 3905 4201 uL96 usa GGU uscscuacUfuGfGfAfgucguuggu usAfsccaAfcGfAfcuccAfaGfuagga ACUCCUACUUGGAGUCGUUG AD-239020.1 3610 3906 4202 aL96 sgsu GUG gsuscguuGfgUfGfAfaguuuuuca asUfsgaaAfaAfCfuucaCfcAfacgacs GAGUCGUUGGUGAAGUUUU AD-239031.1 3611 3907 4203 uL96 usc UCAU gsasgauuGfuUfCfUfcauuacugg usCfscagUfaAfUfgagaAfcAfaucuc GGGAGAUUGUUCUCAUUACU AD-239062.1 3612 3908 4204 aL96 scsc GGA ususguucUfcAfUfUfacuggagcu usAfsgcuCfcAfGfuaauGfaGfaacaa GAUUGUUCUCAUUACUGGAG AD-239066.1 3613 3909 4205 aL96 susc CUG gscsagacUfaCfUfUfaugaauuuga usCfsaaaUfuCfAfuaagUfaGfucugc AGGCAGACUACUUAUGAAUU AD-239103.1 3614 3910 4206 L96 scsu UGC ascsuuauGfaAfUfUfugcaaaacga usCfsguuUfuGfCfaaauUfcAfuaagu CUACUUAUGAAUUUGCAAAA AD-239110.1 3615 3911 4207 L96 sasg CGA asusuugcAfaAfAfCfgacagagcau asUfsgcuCfuGfUfcguuUfuGfcaaau GAAUUUGCAAAACGACAGAG AD-239118.1 3616 3912 4208 L96 susc CAU ususugcaAfaAfCfGfacagagcaua usAfsugcUfcUfGfucguUfuUfgcaaa AAUUUGCAAAACGACAGAGC AD-239119.1 3617 3913 4209 L96 susu AUA csasgagcAfuAfUfUfgguucugug usCfsacaGfaAfCfcaauAfuGfcucug GACAGAGCAUAUUGGUUCUG AD-239131.1 3618 3914 4210 aL96 susc UGG asgsagcaUfaUfUfGfguucugugg usCfscacAfgAfAfccaaUfaUfgcucu ACAGAGCAUAUUGGUUCUGU AD-239132.1 3619 3915 4211 aL96 sgsu GGG gsasgcauAfuUfGfGfuucuguggg usCfsccaCfaGfAfaccaAfuAfugcucs CAGAGCAUAUUGGUUCUGUG AD-239133.1 3620 3916 4212 aL96 usg GGA
278 / 395 csusguggGfaUfAfUfuaauaagcg usCfsgcuUfaUfUfaauaUfcCfcacags UUCUGUGGGAUAUUAAUAA AD-239146.1 3621 3917 4213 aL96 asa GCGC asusuaauAfaGfCfGfcggugugga usUfsccaCfaCfCfgcgcUfuAfuuaau AUAUUAAUAAGCGCGGUGUG AD-239155.1 3622 3918 4214 aL96 sasu GAG ususaauaAfgCfGfCfgguguggag usCfsuccAfcAfCfcgcgCfuUfauuaa UAUUAAUAAGCGCGGUGUGG AD-239156.1 3623 3919 4215 aL96 susa AGG asasacugCfaGfCfUfgagugccgaa usUfscggCfaCfUfcagcUfgCfaguuu GGAAACUGCAGCUGAGUGCC AD-239177.1 3624 3920 4216 L96 scsc GAA asascugcAfgCfUfGfagugccgaaa usUfsucgGfcAfCfucagCfuGfcaguu GAAACUGCAGCUGAGUGCCG AD-239178.1 3625 3921 4217 L96 susc AAA ascsugcaGfcUfGfAfgugccgaaaa usUfsuucGfgCfAfcucaGfcUfgcagu AAACUGCAGCUGAGUGCCGA AD-239179.1 3626 3922 4218 L96 susu AAA csusgcagCfuGfAfGfugccgaaaac gsUfsuuuCfgGfCfacucAfgCfugcag AACUGCAGCUGAGUGCCGAA AD-239180.1 3627 3923 4219 L96 susu AAC usgscagcUfgAfGfUfgccgaaaacu asGfsuuuUfcGfGfcacuCfaGfcugca ACUGCAGCUGAGUGCCGAAA AD-239181.1 3628 3924 4220 L96 sgsu ACU gscsagcuGfaGfUfGfccgaaaacua usAfsguuUfuCfGfgcacUfcAfgcugc CUGCAGCUGAGUGCCGAAAA AD-239182.1 3629 3925 4221 L96 sasg CUA csasgcugAfgUfGfCfcgaaaacuaa usUfsaguUfuUfCfggcaCfuCfagcug UGCAGCUGAGUGCCGAAAAC AD-239183.1 3630 3926 4222 L96 scsa UAG gscsugagUfgCfCfGfaaaacuagga usCfscuaGfuUfUfucggCfaCfucagc CAGCUGAGUGCCGAAAACUA AD-239185.1 3631 3927 4223 L96 susg GGC csusgaguGfcCfGfAfaaacuaggca usGfsccuAfgUfUfuucgGfcAfcucag AGCUGAGUGCCGAAAACUAG AD-239186.1 3632 3928 4224 L96 scsu GCG usgsagugCfcGfAfAfaacuaggcg asCfsgccUfaGfUfuuucGfgCfacuca GCUGAGUGCCGAAAACUAGG AD-239187.1 3633 3929 4225 uL96 sgsc CGU gsasgugcCfgAfAfAfacuaggcgu usAfscgcCfuAfGfuuuuCfgGfcacuc CUGAGUGCCGAAAACUAGGC AD-239188.1 3634 3930 4226 aL96 sasg GUC asgsugccGfaAfAfAfcuaggcguc usGfsacgCfcUfAfguuuUfcGfgcacu UGAGUGCCGAAAACUAGGCG AD-239189.1 3635 3931 4227 aL96 scsa UCA gsusgccgAfaAfAfCfuaggcguca usUfsgacGfcCfUfaguuUfuCfggcac GAGUGCCGAAAACUAGGCGU AD-239190.1 3636 3932 4228 aL96 susc CAC usgsccgaAfaAfCfUfaggcgucacu asGfsugaCfgCfCfuaguUfuUfcggca AGUGCCGAAAACUAGGCGUC AD-239191.1 3637 3933 4229 L96 scsu ACU gscscgaaAfaCfUfAfggcgucacua usAfsgugAfcGfCfcuagUfuUfucggc GUGCCGAAAACUAGGCGUCA AD-239192.1 3638 3934 4230 L96 sasc CUG cscsgaaaAfcUfAfGfgcgucacuga usCfsaguGfaCfGfccuaGfuUfuucgg UGCCGAAAACUAGGCGUCAC AD-239193.1 3639 3935 4231 L96 scsa UGC
279 / 395 csgsaaaaCfuAfGfGfcgucacugca usGfscagUfgAfCfgccuAfgUfuuucg GCCGAAAACUAGGCGUCACU AD-239194.1 3640 3936 4232 L96 sgsc GCG asasaacuAfgGfCfGfucacugcgca usGfscgcAfgUfGfacgcCfuAfguuuu CGAAAACUAGGCGUCACUGC AD-239196.1 3641 3937 4233 L96 scsg GCA asascuagGfcGfUfCfacugcgcaua usAfsugcGfcAfGfugacGfcCfuaguu AAAACUAGGCGUCACUGCGC AD-239198.1 3642 3938 4234 L96 susu AUG ascsuaggCfgUfCfAfcugcgcauga usCfsaugCfgCfAfgugaCfgCfcuagu AAACUAGGCGUCACUGCGCA AD-239199.1 3643 3939 4235 L96 susu UGC gsgscgucAfcUfGfCfgcaugcgua asUfsacgCfaUfGfcgcaGfuGfacgccs UAGGCGUCACUGCGCAUGCG AD-239203.1 3644 3940 4236 uL96 usa UAU gscsaugcGfuAfUfGfugguagacu usAfsgucUfaCfCfacauAfcGfcaugc GCGCAUGCGUAUGUGGUAGA AD-239214.1 3645 3941 4237 aL96 sgsc CUG csasugcgUfaUfGfUfgguagacug usCfsaguCfuAfCfcacaUfaCfgcaugs CGCAUGCGUAUGUGGUAGAC AD-239215.1 3646 3942 4238 aL96 csg UGC asascagaGfaAfGfAfgaucuaucga usCfsgauAfgAfUfcucuUfcUfcuguu GCAACAGAGAAGAGAUCUAU AD-239239.1 3647 3943 4239 L96 sgsc CGC ascsagagAfaGfAfGfaucuaucgcu asGfscgaUfaGfAfucucUfuCfucugu CAACAGAGAAGAGAUCUAUC AD-239240.1 3648 3944 4240 L96 susg GCU csasgagaAfgAfGfAfucuaucgcu usAfsgcgAfuAfGfaucuCfuUfcucug AACAGAGAAGAGAUCUAUCG AD-239241.1 3649 3945 4241 aL96 susu CUC asgsagaaGfaGfAfUfcuaucgcucu asGfsagcGfaUfAfgaucUfcUfucucu ACAGAGAAGAGAUCUAUCGC AD-239242.1 3650 3946 4242 L96 sgsu UCU gsasgaagAfgAfUfCfuaucgcucu usAfsgagCfgAfUfagauCfuCfuucuc CAGAGAAGAGAUCUAUCGCU AD-239243.1 3651 3947 4243 aL96 susg CUC gsasagagAfuCfUfAfucgcucucu usAfsgagAfgCfGfauagAfuCfucuuc GAGAAGAGAUCUAUCGCUCU AD-239245.1 3652 3948 4244 aL96 susc CUA asasgagaUfcUfAfUfcgcucucuaa usUfsagaGfaGfCfgauaGfaUfcucuu AGAAGAGAUCUAUCGCUCUC AD-239246.1 3653 3949 4245 L96 scsu UAA asgsagauCfuAfUfCfgcucucuaaa usUfsuagAfgAfGfcgauAfgAfucucu GAAGAGAUCUAUCGCUCUCU AD-239247.1 3654 3950 4246 L96 susc AAA gsasucuaUfcGfCfUfcucuaaauca usGfsauuUfaGfAfgagcGfaUfagauc GAGAUCUAUCGCUCUCUAAA AD-239250.1 3655 3951 4247 L96 susc UCA asuscuauCfgCfUfCfucuaaaucaa usUfsgauUfuAfGfagagCfgAfuagau AGAUCUAUCGCUCUCUAAAU AD-239251.1 3656 3952 4248 L96 scsu CAG csusaucgCfuCfUfCfuaaaucaggu asCfscugAfuUfUfagagAfgCfgauag AUCUAUCGCUCUCUAAAUCA AD-239253.1 3657 3953 4249 L96 sasu GGU usasucgcUfcUfCfUfaaaucaggua usAfsccuGfaUfUfuagaGfaGfcgaua UCUAUCGCUCUCUAAAUCAG AD-239254.1 3658 3954 4250 L96 sgsa GUG
280 / 395 asuscgcuCfuCfUfAfaaucagguga usCfsaccUfgAfUfuuagAfgAfgcgau CUAUCGCUCUCUAAAUCAGG AD-239255.1 3659 3955 4251 L96 sasg UGA gsasuguaAfcAfAfUfcguggugaa asUfsucaCfcAfCfgauuGfuUfacauc GUGAUGUAACAAUCGUGGUG AD-239290.1 3660 3956 4252 uL96 sasc AAU asusguaaCfaAfUfCfguggugaau usAfsuucAfcCfAfcgauUfgUfuacau UGAUGUAACAAUCGUGGUGA AD-239291.1 3661 3957 4253 aL96 scsa AUA usgsuaacAfaUfCfGfuggugaaua usUfsauuCfaCfCfacgaUfuGfuuaca GAUGUAACAAUCGUGGUGAA AD-239292.1 3662 3958 4254 aL96 susc UAA gsusaacaAfuCfGfUfggugaauaa asUfsuauUfcAfCfcacgAfuUfguuac AUGUAACAAUCGUGGUGAAU AD-239293.1 3663 3959 4255 uL96 sasu AAU gsgsugaaUfaAfUfGfcugggacag asCfsuguCfcCfAfgcauUfaUfucaccs GUGGUGAAUAAUGCUGGGAC AD-239304.1 3664 3960 4256 uL96 asc AGU asusgcugGfgAfCfAfguauaucca usUfsggaUfaUfAfcuguCfcCfagcau UAAUGCUGGGACAGUAUAUC AD-239312.1 3665 3961 4257 aL96 susa CAG usgscuggGfaCfAfGfuauauccag usCfsuggAfuAfUfacugUfcCfcagca AAUGCUGGGACAGUAUAUCC AD-239313.1 3666 3962 4258 aL96 susu AGC gscsugggAfcAfGfUfauauccagc usGfscugGfaUfAfuacuGfuCfccagc AUGCUGGGACAGUAUAUCCA AD-239314.1 3667 3963 4259 aL96 sasu GCC usgsggacAfgUfAfUfauccagccg usCfsggcUfgGfAfuauaCfuGfuccca GCUGGGACAGUAUAUCCAGC AD-239316.1 3668 3964 4260 aL96 sgsc CGA gsgsgacaGfuAfUfAfuccagccga asUfscggCfuGfGfauauAfcUfguccc CUGGGACAGUAUAUCCAGCC AD-239317.1 3669 3965 4261 uL96 sasg GAU gsgsacagUfaUfAfUfccagccgaua usAfsucgGfcUfGfgauaUfaCfugucc UGGGACAGUAUAUCCAGCCG AD-239318.1 3670 3966 4262 L96 scsa AUC csasguauAfuCfCfAfgccgaucuua usAfsagaUfcGfGfcuggAfuAfuacug GACAGUAUAUCCAGCCGAUC AD-239321.1 3671 3967 4263 L96 susc UUC gscscgauCfuUfCfUfcagcaccaaa usUfsuggUfgCfUfgagaAfgAfucggc CAGCCGAUCUUCUCAGCACC AD-239332.1 3672 3968 4264 L96 susg AAG uscsuucuCfaGfCfAfccaaggauga usCfsaucCfuUfGfgugcUfgAfgaaga GAUCUUCUCAGCACCAAGGA AD-239337.1 3673 3969 4265 L96 susc UGA cscsaaggAfuGfAfAfgagauuacca usGfsguaAfuCfUfcuucAfuCfcuugg CACCAAGGAUGAAGAGAUUA AD-239348.1 3674 3970 4266 L96 susg CCA asusuaccAfaGfAfCfauuugaggu usAfsccuCfaAfAfugucUfuGfguaau AGAUUACCAAGACAUUUGAG AD-239362.1 3675 3971 4267 aL96 scsu GUC cscsaagaCfaUfUfUfgaggucaaca usGfsuugAfcCfUfcaaaUfgUfcuugg UACCAAGACAUUUGAGGUCA AD-239366.1 3676 3972 4268 L96 susa ACA asasgacaUfuUfGfAfggucaacaua usAfsuguUfgAfCfcucaAfaUfgucuu CCAAGACAUUUGAGGUCAAC AD-239368.1 3677 3973 4269 L96 sgsg AUC
281 / 395 csasuuugAfgGfUfCfaacauccuaa usUfsaggAfuGfUfugacCfuCfaaaug GACAUUUGAGGUCAACAUCC AD-239372.1 3678 3974 4270 L96 susc UAG asusuugaGfgUfCfAfacauccuaga usCfsuagGfaUfGfuugaCfcUfcaaau ACAUUUGAGGUCAACAUCCU AD-239373.1 3679 3975 4271 L96 sgsu AGG gsgsucaaCfaUfCfCfuaggacauuu asAfsaugUfcCfUfaggaUfgUfugacc GAGGUCAACAUCCUAGGACA AD-239379.1 3680 3976 4272 L96 susc UUU gsuscaacAfuCfCfUfaggacauuuu asAfsaauGfuCfCfuaggAfuGfuugac AGGUCAACAUCCUAGGACAU AD-239380.1 3681 3977 4273 L96 scsu UUU uscscuagGfaCfAfUfuuuuggauc usGfsaucCfaAfAfaaugUfcCfuagga CAUCCUAGGACAUUUUUGGA AD-239387.1 3682 3978 4274 aL96 susg UCA ususuuugGfaUfCfAfcaaaagcacu asGfsugcUfuUfUfgugaUfcCfaaaaa CAUUUUUGGAUCACAAAAGC AD-239397.1 3683 3979 4275 L96 susg ACU asasgcacUfuCfUfUfccaucgauga usCfsaucGfaUfGfgaagAfaGfugcuu AAAAGCACUUCUUCCAUCGA AD-239411.1 3684 3980 4276 L96 susu UGA asgscacuUfcUfUfCfcaucgaugau asUfscauCfgAfUfggaaGfaAfgugcu AAAGCACUUCUUCCAUCGAU AD-239412.1 3685 3981 4277 L96 susu GAU asusggagAfgAfAfAfucauggcca usUfsggcCfaUfGfauuuCfuCfuccau UGAUGGAGAGAAAUCAUGGC AD-239431.1 3686 3982 4278 aL96 scsa CAC gsgsagagAfaAfUfCfauggccacau asUfsgugGfcCfAfugauUfuCfucucc AUGGAGAGAAAUCAUGGCCA AD-239433.1 3687 3983 4279 L96 sasu CAU gsasgaaaUfcAfUfGfgccacaucgu asCfsgauGfuGfGfccauGfaUfuucuc GAGAGAAAUCAUGGCCACAU AD-239436.1 3688 3984 4280 L96 susc CGU asgsaaauCfaUfGfGfccacaucgua usAfscgaUfgUfGfgccaUfgAfuuucu AGAGAAAUCAUGGCCACAUC AD-239437.1 3689 3985 4281 L96 scsu GUC gsasaaucAfuGfGfCfcacaucguca usGfsacgAfuGfUfggccAfuGfauuuc GAGAAAUCAUGGCCACAUCG AD-239438.1 3690 3986 4282 L96 susc UCA asasaucaUfgGfCfCfacaucgucaa usUfsgacGfaUfGfuggcCfaUfgauuu AGAAAUCAUGGCCACAUCGU AD-239439.1 3691 3987 4283 L96 scsu CAC ascsaucgUfcAfCfAfguggcuucaa usUfsgaaGfcCfAfcuguGfaCfgaugu CCACAUCGUCACAGUGGCUU AD-239450.1 3692 3988 4284 L96 sgsg CAG csasucguCfaCfAfGfuggcuucag asCfsugaAfgCfCfacugUfgAfcgaug CACAUCGUCACAGUGGCUUC AD-239451.1 3693 3989 4285 uL96 susg AGU asuscgucAfcAfGfUfggcuucagu usAfscugAfaGfCfcacuGfuGfacgau ACAUCGUCACAGUGGCUUCA AD-239452.1 3694 3990 4286 aL96 sgsu GUG uscsgucaCfaGfUfGfgcuucagug asCfsacuGfaAfGfccacUfgUfgacgas CAUCGUCACAGUGGCUUCAG AD-239453.1 3695 3991 4287 uL96 usg UGU csgsgccaCfgAfAfGfggauuccuu usAfsaggAfaUfCfccuuCfgUfggccg UGCGGCCACGAAGGGAUUCC AD-239475.1 3696 3992 4288 aL96 scsa UUA
282 / 395 gsgsccacGfaAfGfGfgauuccuuaa usUfsaagGfaAfUfcccuUfcGfuggcc GCGGCCACGAAGGGAUUCCU AD-239476.1 3697 3993 4289 L96 sgsc UAC cscsacgaAfgGfGfAfuuccuuaccu asGfsguaAfgGfAfauccCfuUfcgugg GGCCACGAAGGGAUUCCUUA AD-239478.1 3698 3994 4290 L96 scsc CCU csascgaaGfgGfAfUfuccuuaccua usAfsgguAfaGfGfaaucCfcUfucgug GCCACGAAGGGAUUCCUUAC AD-239479.1 3699 3995 4291 L96 sgsc CUC ascsgaagGfgAfUfUfccuuaccuca usGfsaggUfaAfGfgaauCfcCfuucgu CCACGAAGGGAUUCCUUACC AD-239480.1 3700 3996 4292 L96 sgsg UCA gsasagggAfuUfCfCfuuaccucaua usAfsugaGfgUfAfaggaAfuCfccuuc ACGAAGGGAUUCCUUACCUC AD-239482.1 3701 3997 4293 L96 sgsu AUC asasgggaUfuCfCfUfuaccucauca usGfsaugAfgGfUfaaggAfaUfcccuu CGAAGGGAUUCCUUACCUCA AD-239483.1 3702 3998 4294 L96 scsg UCC csasucccAfuAfUfUfguuccagcaa usUfsgcuGfgAfAfcaauAfuGfggaug CUCAUCCCAUAUUGUUCCAG AD-239499.1 3703 3999 4295 L96 sasg CAA gsusuccaGfcAfAfAfuuugccgcu usAfsgcgGfcAfAfauuuGfcUfggaac UUGUUCCAGCAAAUUUGCCG AD-239510.1 3704 4000 4296 aL96 sasa CUG asusuugcCfgCfUfGfuuggcuuuc usGfsaaaGfcCfAfacagCfgGfcaaaus AAAUUUGCCGCUGUUGGCUU AD-239520.1 3705 4001 4297 aL96 usu UCA ususugccGfcUfGfUfuggcuuuca usUfsgaaAfgCfCfaacaGfcGfgcaaas AAUUUGCCGCUGUUGGCUUU AD-239521.1 3706 4002 4298 aL96 usu CAC ususgccgCfuGfUfUfggcuuucac usGfsugaAfaGfCfcaacAfgCfggcaa AUUUGCCGCUGUUGGCUUUC AD-239522.1 3707 4003 4299 aL96 sasu ACA gscsuuucAfcAfGfAfggucugaca asUfsgucAfgAfCfcucuGfuGfaaagc UGGCUUUCACAGAGGUCUGA AD-239534.1 3708 4004 4300 uL96 scsa CAU csascagaGfgUfCfUfgacaucagaa usUfscugAfuGfUfcagaCfcUfcugug UUCACAGAGGUCUGACAUCA AD-239539.1 3709 4005 4301 L96 sasa GAA asgsgucuGfaCfAfUfcagaacuuca usGfsaagUfuCfUfgaugUfcAfgaccu AGAGGUCUGACAUCAGAACU AD-239544.1 3710 4006 4302 L96 scsu UCA gscscuugGfgAfAfAfaacugguau usAfsuacCfaGfUfuuuuCfcCfaaggc AGGCCUUGGGAAAAACUGGU AD-239566.1 3711 4007 4303 aL96 scsu AUC ascsugguAfuCfAfAfaaccucaug asCfsaugAfgGfUfuuugAfuAfccagu AAACUGGUAUCAAAACCUCA AD-239578.1 3712 4008 4304 uL96 susu UGU csusgguaUfcAfAfAfaccucaugu usAfscauGfaGfGfuuuuGfaUfaccag AACUGGUAUCAAAACCUCAU AD-239579.1 3713 4009 4305 aL96 susu GUC ususugugAfaUfAfCfuggguucac usGfsugaAfcCfCfaguaUfuCfacaaas UUUUUGUGAAUACUGGGUUC AD-239611.1 3714 4010 4306 aL96 asa ACC ususgugaAfuAfCfUfggguucacc usGfsgugAfaCfCfcaguAfuUfcacaa UUUUGUGAAUACUGGGUUCA AD-239612.1 3715 4011 4307 aL96 sasa CCA
283 / 395 usgsugaaUfaCfUfGfgguucaccaa usUfsgguGfaAfCfccagUfaUfucaca UUUGUGAAUACUGGGUUCAC AD-239613.1 3716 4012 4308 L96 sasa CAA asasuacuGfgGfUfUfcaccaaaaau asUfsuuuUfgGfUfgaacCfcAfguauu UGAAUACUGGGUUCACCAAA AD-239617.1 3717 4013 4309 L96 scsa AAU asusacugGfgUfUfCfaccaaaaaua usAfsuuuUfuGfGfugaaCfcCfaguau GAAUACUGGGUUCACCAAAA AD-239618.1 3718 4014 4310 L96 susc AUC uscscaagCfaCfAfAfgauuauggca usGfsccaUfaAfUfcuugUfgCfuugga AAUCCAAGCACAAGAUUAUG AD-239637.1 3719 4015 4311 L96 susu GCC asgscacaAfgAfUfUfauggccugu usAfscagGfcCfAfuaauCfuUfgugcu CAAGCACAAGAUUAUGGCCU AD-239641.1 3720 4016 4312 aL96 susg GUA gscsacaaGfaUfUfAfuggccugua asUfsacaGfgCfCfauaaUfcUfugugc AAGCACAAGAUUAUGGCCUG AD-239642.1 3721 4017 4313 uL96 susu UAU csascaagAfuUfAfUfggccuguau asAfsuacAfgGfCfcauaAfuCfuugug AGCACAAGAUUAUGGCCUGU AD-239643.1 3722 4018 4314 uL96 scsu AUU csasagauUfaUfGfGfccuguauug usCfsaauAfcAfGfgccaUfaAfucuug CACAAGAUUAUGGCCUGUAU AD-239645.1 3723 4019 4315 aL96 susg UGG asgsauuaUfgGfCfCfuguauugga usUfsccaAfuAfCfaggcCfaUfaaucu CAAGAUUAUGGCCUGUAUUG AD-239647.1 3724 4020 4316 aL96 susg GAG asusuaugGfcCfUfGfuauuggaga usUfscucCfaAfUfacagGfcCfauaaus AGAUUAUGGCCUGUAUUGGA AD-239649.1 3725 4021 4317 aL96 csu GAC ususauggCfcUfGfUfauuggagac usGfsucuCfcAfAfuacaGfgCfcauaa GAUUAUGGCCUGUAUUGGAG AD-239650.1 3726 4022 4318 aL96 susc ACA usgsgccuGfuAfUfUfggagacaga asUfscugUfcUfCfcaauAfcAfggcca UAUGGCCUGUAUUGGAGACA AD-239653.1 3727 4023 4319 uL96 susa GAU gsgsccugUfaUfUfGfgagacagau usAfsucuGfuCfUfccaaUfaCfaggcc AUGGCCUGUAUUGGAGACAG AD-239654.1 3728 4024 4320 aL96 sasu AUG ususggagAfcAfGfAfugaagucgu usAfscgaCfuUfCfaucuGfuCfuccaa UAUUGGAGACAGAUGAAGUC AD-239662.1 3729 4025 4321 aL96 susa GUA ascsagauGfaAfGfUfcguaagaagu asCfsuucUfuAfCfgacuUfcAfucugu AGACAGAUGAAGUCGUAAGA AD-239668.1 3730 4026 4322 L96 scsu AGU csasgaugAfaGfUfCfguaagaagua usAfscuuCfuUfAfcgacUfuCfaucug GACAGAUGAAGUCGUAAGAA AD-239669.1 3731 4027 4323 L96 susc GUC asgsaugaAfgUfCfGfuaagaaguc asGfsacuUfcUfUfacgaCfuUfcaucu ACAGAUGAAGUCGUAAGAAG AD-239670.1 3732 4028 4324 uL96 sgsu UCU gsasugaaGfuCfGfUfaagaagucua usAfsgacUfuCfUfuacgAfcUfucauc CAGAUGAAGUCGUAAGAAGU AD-239671.1 3733 4029 4325 L96 susg CUG gsasagucGfuAfAfGfaagucugau usAfsucaGfaCfUfucuuAfcGfacuuc AUGAAGUCGUAAGAAGUCUG AD-239674.1 3734 4030 4326 aL96 sasu AUA
284 / 395 asgsucguAfaGfAfAfgucugauag usCfsuauCfaGfAfcuucUfuAfcgacu GAAGUCGUAAGAAGUCUGAU AD-239676.1 3735 4031 4327 aL96 susc AGA usasagaaGfuCfUfGfauagauggaa usUfsccaUfcUfAfucagAfcUfucuua CGUAAGAAGUCUGAUAGAUG AD-239681.1 3736 4032 4328 L96 scsg GAA asasgaagUfcUfGfAfuagauggaa asUfsuccAfuCfUfaucaGfaCfuucuu GUAAGAAGUCUGAUAGAUG AD-239682.1 3737 4033 4329 uL96 sasc GAAU gsasagucUfgAfUfAfgauggaaua usUfsauuCfcAfUfcuauCfaGfacuuc AAGAAGUCUGAUAGAUGGA AD-239684.1 3738 4034 4330 aL96 susu AUAC asasgucuGfaUfAfGfauggaauac asGfsuauUfcCfAfucuaUfcAfgacuu AGAAGUCUGAUAGAUGGAA AD-239685.1 3739 4035 4331 uL96 scsu UACU usgsgaauAfcUfUfAfccaauaagaa usUfscuuAfuUfGfguaaGfuAfuucca GAUGGAAUACUUACCAAUAA AD-239697.1 3740 4036 4332 L96 susc GAA asasugauUfuUfUfGfuuccaucgu usAfscgaUfgGfAfacaaAfaAfucauu AAAAUGAUUUUUGUUCCAUC AD-239713.1 3741 4037 4333 aL96 susu GUA asusgauuUfuUfGfUfuccaucgua asUfsacgAfuGfGfaacaAfaAfaucau AAAUGAUUUUUGUUCCAUCG AD-239714.1 3742 4038 4334 uL96 susu UAU asusuuuuGfuUfCfCfaucguauau usAfsuauAfcGfAfuggaAfcAfaaaau UGAUUUUUGUUCCAUCGUAU AD-239717.1 3743 4039 4335 aL96 scsa AUC ususguucCfaUfCfGfuauaucaaua usAfsuugAfuAfUfacgaUfgGfaacaa UUUUGUUCCAUCGUAUAUCA AD-239721.1 3744 4040 4336 L96 sasa AUA gsusuccaUfcGfUfAfuaucaauaua usAfsuauUfgAfUfauacGfaUfggaac UUGUUCCAUCGUAUAUCAAU AD-239723.1 3745 4041 4337 L96 sasa AUC ususccauCfgUfAfUfaucaauaucu asGfsauaUfuGfAfuauaCfgAfuggaa UGUUCCAUCGUAUAUCAAUA AD-239724.1 3746 4042 4338 L96 scsa UCU uscscaucGfuAfUfAfucaauaucu asAfsgauAfuUfGfauauAfcGfaugga GUUCCAUCGUAUAUCAAUAU AD-239725.1 3747 4043 4339 uL96 sasc CUU cscsaucgUfaUfAfUfcaauaucuuu asAfsagaUfaUfUfgauaUfaCfgaugg UUCCAUCGUAUAUCAAUAUC AD-239726.1 3748 4044 4340 L96 sasa UUU ascsagaaGfuUfUfCfuuccugaaca usGfsuucAfgGfAfagaaAfcUfucugu CUACAGAAGUUUCUUCCUGA AD-239755.1 3749 4045 4341 L96 sasg ACG asgsaaguUfuCfUfUfccugaacgca usGfscguUfcAfGfgaagAfaAfcuucu ACAGAAGUUUCUUCCUGAAC AD-239757.1 3750 4046 4342 L96 sgsu GCG asasguuuCfuUfCfCfugaacgcgca usGfscgcGfuUfCfaggaAfgAfaacuu AGAAGUUUCUUCCUGAACGC AD-239759.1 3751 4047 4343 L96 scsu GCC gsusuucuUfcCfUfGfaacgcgccua usAfsggcGfcGfUfucagGfaAfgaaac AAGUUUCUUCCUGAACGCGC AD-239761.1 3752 4048 4344 L96 susu CUC uscsuuccUfgAfAfCfgcgccucaga usCfsugaGfgCfGfcguuCfaGfgaaga UUUCUUCCUGAACGCGCCUC AD-239764.1 3753 4049 4345 L96 sasa AGC
285 / 395 cscsucagCfgAfUfUfuuaaaucgua usAfscgaUfuUfAfaaauCfgCfugagg CGCCUCAGCGAUUUUAAAUC AD-239778.1 3754 4050 4346 L96 scsg GUA csuscagcGfaUfUfUfuaaaucguau asUfsacgAfuUfUfaaaaUfcGfcugag GCCUCAGCGAUUUUAAAUCG AD-239779.1 3755 4051 4347 L96 sgsc UAU uscsagcgAfuUfUfUfaaaucguau usAfsuacGfaUfUfuaaaAfuCfgcuga CCUCAGCGAUUUUAAAUCGU AD-239780.1 3756 4052 4348 aL96 sgsg AUG csasgcgaUfuUfUfAfaaucguaug usCfsauaCfgAfUfuuaaAfaUfcgcug CUCAGCGAUUUUAAAUCGUA AD-239781.1 3757 4053 4349 aL96 sasg UGC asgscgauUfuUfAfAfaucguaugc usGfscauAfcGfAfuuuaAfaAfucgcu UCAGCGAUUUUAAAUCGUAU AD-239782.1 3758 4054 4350 aL96 sgsa GCA gscsgauuUfuAfAfAfucguaugca usUfsgcaUfaCfGfauuuAfaAfaucgc CAGCGAUUUUAAAUCGUAUG AD-239783.1 3759 4055 4351 aL96 susg CAG csgsauuuUfaAfAfUfcguaugcag usCfsugcAfuAfCfgauuUfaAfaaucg AGCGAUUUUAAAUCGUAUGC AD-239784.1 3760 4056 4352 aL96 scsu AGA gsasuuuuAfaAfUfCfguaugcaga usUfscugCfaUfAfcgauUfuAfaaauc GCGAUUUUAAAUCGUAUGCA AD-239785.1 3761 4057 4353 aL96 sgsc GAA asusuuuaAfaUfCfGfuaugcagaa asUfsucuGfcAfUfacgaUfuUfaaaau CGAUUUUAAAUCGUAUGCAG AD-239786.1 3762 4058 4354 uL96 scsg AAU ususuuaaAfuCfGfUfaugcagaau usAfsuucUfgCfAfuacgAfuUfuaaaa GAUUUUAAAUCGUAUGCAGA AD-239787.1 3763 4059 4355 aL96 susc AUA asasaucgUfaUfGfCfagaauauuca usGfsaauAfuUfCfugcaUfaCfgauuu UUAAAUCGUAUGCAGAAUAU AD-239791.1 3764 4060 4356 L96 sasa UCA asuscguaUfgCfAfGfaauauucaau asUfsugaAfuAfUfucugCfaUfacgau AAAUCGUAUGCAGAAUAUUC AD-239793.1 3765 4061 4357 L96 susu AAU usasuucaAfuUfUfGfaagcagugg asCfscacUfgCfUfucaaAfuUfgaauas AAUAUUCAAUUUGAAGCAGU AD-239806.1 3766 4062 4358 uL96 usu GGU gsasauaaAfuAfAfGfcuccagccaa usUfsggcUfgGfAfgcuuAfuUfuauu AUGAAUAAAUAAGCUCCAGC AD-239839.1 3767 4063 4359 L96 csasu CAG asasuaaaUfaAfGfCfuccagccaga usCfsuggCfuGfGfagcuUfaUfuuauu UGAAUAAAUAAGCUCCAGCC AD-239840.1 3768 4064 4360 L96 scsa AGA asgsccagAfgAfUfGfuaugcauga asUfscauGfcAfUfacauCfuCfuggcu CCAGCCAGAGAUGUAUGCAU AD-239854.1 3769 4065 4361 uL96 sgsg GAU gscscagaGfaUfGfUfaugcaugaua usAfsucaUfgCfAfuacaUfcUfcuggc CAGCCAGAGAUGUAUGCAUG AD-239855.1 3770 4066 4362 L96 susg AUA asusaugaAfuAfGfUfuucgaauca usUfsgauUfcGfAfaacuAfuUfcauau UGAUAUGAAUAGUUUCGAA AD-239876.1 3771 4067 4363 aL96 scsa UCAA usasugaaUfaGfUfUfucgaaucaau asUfsugaUfuCfGfaaacUfaUfucaua GAUAUGAAUAGUUUCGAAUC AD-239877.1 3772 4068 4364 L96 susc AAU
286 / 395 asasuaguUfuCfGfAfaucaaugcua usAfsgcaUfuGfAfuucgAfaAfcuauu UGAAUAGUUUCGAAUCAAUG AD-239881.1 3773 4069 4365 L96 scsa CUG ususcaguCfcUfGfAfuaauauuaaa usUfsuaaUfaUfUfaucaGfgAfcugaa UUUUCAGUCCUGAUAAUAUU AD-239905.1 3774 4070 4366 L96 sasa AAA asasaaacAfuUfGfGfuuuggcacua usAfsgugCfcAfAfaccaAfuGfuuuuu UUAAAAACAUUGGUUUGGCA AD-239914.1 3775 4071 4367 L96 sasa CUA asasaacaUfuGfGfUfuuggcacuaa usUfsaguGfcCfAfaaccAfaUfguuuu UAAAAACAUUGGUUUGGCAC AD-239915.1 3776 4072 4368 L96 susa UAG gsuscaaaCfgAfAfCfaagauuaauu asAfsuuaAfuCfUfuguuCfgUfuugac CAGUCAAACGAACAAGAUUA AD-239941.1 3777 4073 4369 L96 susg AUU asasacgaAfcAfAfGfauuaauuaca usGfsuaaUfuAfAfucuuGfuUfcguu UCAAACGAACAAGAUUAAUU AD-239944.1 3778 4074 4370 L96 usgsa ACC asascgaaCfaAfGfAfuuaauuaccu asGfsguaAfuUfAfaucuUfgUfucguu CAAACGAACAAGAUUAAUUA AD-239945.1 3779 4075 4371 L96 susg CCU ascsgaacAfaGfAfUfuaauuaccua usAfsgguAfaUfUfaaucUfuGfuucgu AAACGAACAAGAUUAAUUAC AD-239946.1 3780 4076 4372 L96 susu CUG csgsaacaAfgAfUfUfaauuaccugu asCfsaggUfaAfUfuaauCfuUfguucg AACGAACAAGAUUAAUUACC AD-239947.1 3781 4077 4373 L96 susu UGU uscsucaaGfaAfUfAfuuuacguag asCfsuacGfuAfAfauauUfcUfugaga UUUCUCAAGAAUAUUUACGU AD-239977.1 3782 4078 4374 uL96 sasa AGU uscsaagaAfuAfUfUfuacguaguu asAfsacuAfcGfUfaaauAfuUfcuuga UCUCAAGAAUAUUUACGUAG AD-239979.1 3783 4079 4375 uL96 sgsa UUU csasagaaUfaUfUfUfacguaguuu asAfsaacUfaCfGfuaaaUfaUfucuug CUCAAGAAUAUUUACGUAGU AD-239980.1 3784 4080 4376 uL96 sasg UUU ususucauAfgGfUfCfuguuuuucc asGfsgaaAfaAfCfagacCfuAfugaaas UUUUUCAUAGGUCUGUUUUU AD-239998.1 3785 4081 4377 uL96 asa CCU ususcaugCfcUfCfUfuaaaaacuua usAfsaguUfuUfUfaagaGfgCfaugaa CUUUCAUGCCUCUUAAAAAC AD-240019.1 3786 4082 4378 L96 sasg UUC asasaaacUfuCfUfGfugcuuacaua usAfsuguAfaGfCfacagAfaGfuuuuu UUAAAAACUUCUGUGCUUAC AD-240031.1 3787 4083 4379 L96 sasa AUA asasaacuUfcUfGfUfgcuuacauaa usUfsaugUfaAfGfcacaGfaAfguuuu UAAAAACUUCUGUGCUUACA AD-240032.1 3788 4084 4380 L96 susa UAA asasacuuCfuGfUfGfcuuacauaaa usUfsuauGfuAfAfgcacAfgAfaguuu AAAAACUUCUGUGCUUACAU AD-240033.1 3789 4085 4381 L96 susu AAA ususuuucCfaUfUfUfaaaggugga usUfsccaCfcUfUfuaaaUfgGfaaaaas UAUUUUUCCAUUUAAAGGUG AD-240064.1 3790 4086 4382 aL96 usa GAC csusaccuCfcCfUfAfaaaguaaaua usAfsuuuAfcUfUfuuagGfgAfggua AGCUACCUCCCUAAAAGUAA AD-240090.1 3791 4087 4383 L96 gscsu AUA
287 / 395 usasccucCfcUfAfAfaaguaaauaa usUfsauuUfaCfUfuuuaGfgGfaggua GCUACCUCCCUAAAAGUAAA AD-240091.1 3792 4088 4384 L96 sgsc UAC usascaaaGfaGfAfAfcuuauuuaca usGfsuaaAfuAfAfguucUfcUfuugua AAUACAAAGAGAACUUAUUU AD-240108.1 3793 4089 4385 L96 susu ACA asascuuaUfuUfAfCfacagggaaga usCfsuucCfcUfGfuguaAfaUfaaguu AGAACUUAUUUACACAGGGA AD-240117.1 3794 4090 4386 L96 scsu AGG ususacacAfgGfGfAfagguuuaag usCfsuuaAfaCfCfuuccCfuGfuguaa AUUUACACAGGGAAGGUUUA AD-240124.1 3795 4091 4387 aL96 sasu AGA usascacaGfgGfAfAfgguuuaaga usUfscuuAfaAfCfcuucCfcUfgugua UUUACACAGGGAAGGUUUAA AD-240125.1 3796 4092 4388 aL96 sasa GAC ascsacagGfgAfAfGfguuuaagac asGfsucuUfaAfAfccuuCfcCfugugu UUACACAGGGAAGGUUUAAG AD-240126.1 3797 4093 4389 uL96 sasa ACU asgsguuuAfaGfAfCfuguucaagu usAfscuuGfaAfCfagucUfuAfaaccu GAAGGUUUAAGACUGUUCAA AD-240135.1 3798 4094 4390 aL96 susc GUA ususuaagAfcUfGfUfucaaguagc usGfscuaCfuUfGfaacaGfuCfuuaaa GGUUUAAGACUGUUCAAGUA AD-240138.1 3799 4095 4391 aL96 scsc GCA usasagacUfgUfUfCfaaguagcauu asAfsugcUfaCfUfugaaCfaGfucuua UUUAAGACUGUUCAAGUAGC AD-240140.1 3800 4096 4392 L96 sasa AUU asgsacugUfuCfAfAfguagcauuc usGfsaauGfcUfAfcuugAfaCfagucu UAAGACUGUUCAAGUAGCAU AD-240142.1 3801 4097 4393 aL96 susa UCC csusguucAfaGfUfAfgcauuccaa asUfsuggAfaUfGfcuacUfuGfaacag GACUGUUCAAGUAGCAUUCC AD-240145.1 3802 4098 4394 uL96 susc AAU gsusucaaGfuAfGfCfauuccaaucu asGfsauuGfgAfAfugcuAfcUfugaac CUGUUCAAGUAGCAUUCCAA AD-240147.1 3803 4099 4395 L96 sasg UCU ususcaagUfaGfCfAfuuccaaucua usAfsgauUfgGfAfaugcUfaCfuugaa UGUUCAAGUAGCAUUCCAAU AD-240148.1 3804 4100 4396 L96 scsa CUG usasgcauUfcCfAfAfucuguagcca usGfsgcuAfcAfGfauugGfaAfugcua AGUAGCAUUCCAAUCUGUAG AD-240154.1 3805 4101 4397 L96 scsu CCA asgscauuCfcAfAfUfcuguagccau asUfsggcUfaCfAfgauuGfgAfaugcu GUAGCAUUCCAAUCUGUAGC AD-240155.1 3806 4102 4398 L96 sasc CAU gscsauucCfaAfUfCfuguagccaua usAfsuggCfuAfCfagauUfgGfaaugc UAGCAUUCCAAUCUGUAGCC AD-240156.1 3807 4103 4399 L96 susa AUG gscscaugCfcAfCfAfgaauaucaaa usUfsugaUfaUfUfcuguGfgCfauggc UAGCCAUGCCACAGAAUAUC AD-240171.1 3808 4104 4400 L96 susa AAC cscsaugcCfaCfAfGfaauaucaaca usGfsuugAfuAfUfucugUfgGfcaug AGCCAUGCCACAGAAUAUCA AD-240172.1 3809 4105 4401 L96 gscsu ACA asasgaacAfcAfGfAfaugagugcaa usUfsgcaCfuCfAfuucuGfuGfuucuu ACAAGAACACAGAAUGAGUG AD-240192.1 3810 4106 4402 L96 sgsu CAC
288 / 395 gsusuucaGfcAfGfGfcagcuuuau usAfsuaaAfgCfUfgccuGfcUfgaaac AAGUUUCAGCAGGCAGCUUU AD-240227.1 3811 4107 4403 aL96 susu AUC ususucagCfaGfGfCfagcuuuauc asGfsauaAfaGfCfugccUfgCfugaaa AGUUUCAGCAGGCAGCUUUA AD-240228.1 3812 4108 4404 uL96 scsu UCU gscsagcuUfuAfUfCfucaaccugga usCfscagGfuUfGfagauAfaAfgcugc AGGCAGCUUUAUCUCAACCU AD-240237.1 3813 4109 4405 L96 scsu GGA asuscucaAfcCfUfGfgacauauuuu asAfsaauAfuGfUfccagGfuUfgagau UUAUCUCAACCUGGACAUAU AD-240245.1 3814 4110 4406 L96 sasa UUU asusuugaAfaGfAfUfuucccuagc usGfscuaGfgGfAfaaucUfuUfcaaau GCAUUUGAAAGAUUUCCCUA AD-240276.1 3815 4111 4407 aL96 sgsc GCC ususgaaaGfaUfUfUfcccuagccua usAfsggcUfaGfGfgaaaUfcUfuucaa AUUUGAAAGAUUUCCCUAGC AD-240278.1 3816 4112 4408 L96 sasu CUC usgsaaagAfuUfUfCfccuagccucu asGfsaggCfuAfGfggaaAfuCfuuuca UUUGAAAGAUUUCCCUAGCC AD-240279.1 3817 4113 4409 L96 sasa UCU gsasaagaUfuUfCfCfcuagccucuu asAfsgagGfcUfAfgggaAfaUfcuuuc UUGAAAGAUUUCCCUAGCCU AD-240280.1 3818 4114 4410 L96 sasa CUU csasuuagCfcCfAfAfaacggugcaa usUfsgcaCfcGfUfuuugGfgCfuaaug UUCAUUAGCCCAAAACGGUG AD-240308.1 3819 4115 4411 L96 sasa CAA asusuagcCfcAfAfAfacggugcaaa usUfsugcAfcCfGfuuuuGfgGfcuaau UCAUUAGCCCAAAACGGUGC AD-240309.1 3820 4116 4412 L96 sgsa AAC ususagccCfaAfAfAfcggugcaacu asGfsuugCfaCfCfguuuUfgGfgcuaa CAUUAGCCCAAAACGGUGCA AD-240310.1 3821 4117 4413 L96 susg ACU usasgcccAfaAfAfCfggugcaacua usAfsguuGfcAfCfcguuUfuGfggcua AUUAGCCCAAAACGGUGCAA AD-240311.1 3822 4118 4414 L96 sasu CUC asgscccaAfaAfCfGfgugcaacucu asGfsaguUfgCfAfccguUfuUfgggcu UUAGCCCAAAACGGUGCAAC AD-240312.1 3823 4119 4415 L96 sasa UCU gscsccaaAfaCfGfGfugcaacucua usAfsgagUfuGfCfaccgUfuUfugggc UAGCCCAAAACGGUGCAACU AD-240313.1 3824 4120 4416 L96 susa CUA cscsaaaaCfgGfUfGfcaacucuauu asAfsuagAfgUfUfgcacCfgUfuuugg GCCCAAAACGGUGCAACUCU AD-240315.1 3825 4121 4417 L96 sgsc AUU asasaacgGfuGfCfAfacucuauucu asGfsaauAfgAfGfuugcAfcCfguuuu CCAAAACGGUGCAACUCUAU AD-240317.1 3826 4122 4418 L96 sgsg UCU asasacggUfgCfAfAfcucuauucua usAfsgaaUfaGfAfguugCfaCfcguuu CAAAACGGUGCAACUCUAUU AD-240318.1 3827 4123 4419 L96 susg CUG asascgguGfcAfAfCfucuauucug usCfsagaAfuAfGfaguuGfcAfccguu AAAACGGUGCAACUCUAUUC AD-240319.1 3828 4124 4420 aL96 susu UGG gsgsugcaAfcUfCfUfauucuggac asGfsuccAfgAfAfuagaGfuUfgcacc ACGGUGCAACUCUAUUCUGG AD-240322.1 3829 4125 4421 uL96 sgsu ACU
289 / 395 usgscaacUfcUfAfUfucuggacuu asAfsaguCfcAfGfaauaGfaGfuugca GGUGCAACUCUAUUCUGGAC AD-240324.1 3830 4126 4422 uL96 scsc UUU csasacucUfaUfUfCfuggacuuuau asUfsaaaGfuCfCfagaaUfaGfaguug UGCAACUCUAUUCUGGACUU AD-240326.1 3831 4127 4423 L96 scsa UAU asascucuAfuUfCfUfggacuuuau asAfsuaaAfgUfCfcagaAfuAfgaguu GCAACUCUAUUCUGGACUUU AD-240327.1 3832 4128 4424 uL96 sgsc AUU asusucugGfaCfUfUfuauuacuug usCfsaagUfaAfUfaaagUfcCfagaaus CUAUUCUGGACUUUAUUACU AD-240333.1 3833 4129 4425 aL96 asg UGA usgsuauaAfcUfCfUfgaaguccaca usGfsuggAfcUfUfcagaGfuUfauaca UCUGUAUAACUCUGAAGUCC AD-240364.1 3834 4130 4426 L96 sgsa ACC gsusauaaCfuCfUfGfaaguccacca usGfsgugGfaCfUfucagAfgUfuauac CUGUAUAACUCUGAAGUCCA AD-240365.1 3835 4131 4427 L96 sasg CCA gsasagucCfaCfCfAfaaaguggaca usGfsuccAfcUfUfuuggUfgGfacuuc CUGAAGUCCACCAAAAGUGG AD-240375.1 3836 4132 4428 L96 sasg ACC gsusccacCfaAfAfAfguggacccua usAfsgggUfcCfAfcuuuUfgGfuggac AAGUCCACCAAAAGUGGACC AD-240378.1 3837 4133 4429 L96 susu CUC csasccaaAfaGfUfGfgacccucuau asUfsagaGfgGfUfccacUfuUfuggug UCCACCAAAAGUGGACCCUC AD-240381.1 3838 4134 4430 L96 sgsa UAU ascscaaaAfgUfGfGfacccucuaua usAfsuagAfgGfGfuccaCfuUfuuggu CCACCAAAAGUGGACCCUCU AD-240382.1 3839 4135 4431 L96 sgsg AUA cscsaaaaGfuGfGfAfcccucuauau asUfsauaGfaGfGfguccAfcUfuuugg CACCAAAAGUGGACCCUCUA AD-240383.1 3840 4136 4432 L96 susg UAU asasaaguGfgAfCfCfcucuauauuu asAfsauaUfaGfAfggguCfcAfcuuuu CCAAAAGUGGACCCUCUAUA AD-240385.1 3841 4137 4433 L96 sgsg UUU asasagugGfaCfCfCfucuauauuua usAfsaauAfuAfGfagggUfcCfacuuu CAAAAGUGGACCCUCUAUAU AD-240386.1 3842 4138 4434 L96 susg UUC asasguggAfcCfCfUfcuauauuuca usGfsaaaUfaUfAfgaggGfuCfcacuu AAAAGUGGACCCUCUAUAUU AD-240387.1 3843 4139 4435 L96 susu UCC asusacauUfaUfGfAfaaggugacca usGfsgucAfcCfUfuucaUfaAfuguau AGAUACAUUAUGAAAGGUG AD-240419.1 3844 4140 4436 L96 scsu ACCG usascauuAfuGfAfAfaggugaccg usCfsgguCfaCfCfuuucAfuAfaugua GAUACAUUAUGAAAGGUGAC AD-240420.1 3845 4141 4437 aL96 susc CGA ascsauuaUfgAfAfAfggugaccga usUfscggUfcAfCfcuuuCfaUfaaugu AUACAUUAUGAAAGGUGACC AD-240421.1 3846 4142 4438 aL96 sasu GAC csasuuauGfaAfAfGfgugaccgac asGfsucgGfuCfAfccuuUfcAfuaaug UACAUUAUGAAAGGUGACCG AD-240422.1 3847 4143 4439 uL96 susa ACU asusuaugAfaAfGfGfugaccgacu usAfsgucGfgUfCfaccuUfuCfauaau ACAUUAUGAAAGGUGACCGA AD-240423.1 3848 4144 4440 aL96 sgsu CUC
290 / 395 asgsgugaCfcGfAfCfucuauuuua usUfsaaaAfuAfGfagucGfgUfcaccu AAAGGUGACCGACUCUAUUU AD-240431.1 3849 4145 4441 aL96 susu UAA asuscucaGfaAfUfUfuuaaguucu usAfsgaaCfuUfAfaaauUfcUfgagau AAAUCUCAGAAUUUUAAGUU AD-240446.1 3850 4146 4442 aL96 susu CUA csusuucaUfaUfAfUfccuuggucc usGfsgacCfaAfGfgauaUfaUfgaaag UGCUUUCAUAUAUCCUUGGU AD-240474.1 3851 4147 4443 aL96 scsa CCC ususucauAfuAfUfCfcuugguccc usGfsggaCfcAfAfggauAfuAfugaaa GCUUUCAUAUAUCCUUGGUC AD-240475.1 3852 4148 4444 aL96 sgsc CCA ususcauaUfaUfCfCfuuggucccaa usUfsgggAfcCfAfaggaUfaUfaugaa CUUUCAUAUAUCCUUGGUCC AD-240476.1 3853 4149 4445 L96 sasg CAG gsuscccaGfaGfAfUfguuuagacaa usUfsgucUfaAfAfcaucUfcUfgggac UGGUCCCAGAGAUGUUUAGA AD-240490.1 3854 4150 4446 L96 scsa CAA csasgagaUfgUfUfUfagacaauuu asAfsaauUfgUfCfuaaaCfaUfcucug CCCAGAGAUGUUUAGACAAU AD-240494.1 3855 4151 4447 uL96 sgsg UUU asgsagauGfuUfUfAfgacaauuuu usAfsaaaUfuGfUfcuaaAfcAfucucu CCAGAGAUGUUUAGACAAUU AD-240495.1 3856 4152 4448 aL96 sgsg UUA gsusuuagAfcAfAfUfuuuaggcuc usGfsagcCfuAfAfaauuGfuCfuaaac AUGUUUAGACAAUUUUAGGC AD-240501.1 3857 4153 4449 aL96 sasu UCA ususuagaCfaAfUfUfuuaggcuca usUfsgagCfcUfAfaaauUfgUfcuaaa UGUUUAGACAAUUUUAGGCU AD-240502.1 3858 4154 4450 aL96 scsa CAA ususagacAfaUfUfUfuaggcucaaa usUfsugaGfcCfUfaaaaUfuGfucuaa GUUUAGACAAUUUUAGGCUC AD-240503.1 3859 4155 4451 L96 sasc AAA usasgacaAfuUfUfUfaggcucaaaa usUfsuugAfgCfCfuaaaAfuUfgucua UUUAGACAAUUUUAGGCUCA AD-240504.1 3860 4156 4452 L96 sasa AAA asgsacaaUfuUfUfAfggcucaaaaa usUfsuuuGfaGfCfcuaaAfaUfugucu UUAGACAAUUUUAGGCUCAA AD-240505.1 3861 4157 4453 L96 sasa AAA ascsaauuUfuAfGfGfcucaaaaauu asAfsuuuUfuGfAfgccuAfaAfauugu AGACAAUUUUAGGCUCAAAA AD-240507.1 3862 4158 4454 L96 scsu AUU ususuaggCfuCfAfAfaaauuaaaga usCfsuuuAfaUfUfuuugAfgCfcuaaa AUUUUAGGCUCAAAAAUUAA AD-240512.1 3863 4159 4455 L96 sasu AGC ususaggcUfcAfAfAfaauuaaagc asGfscuuUfaAfUfuuuuGfaGfccuaa UUUUAGGCUCAAAAAUUAAA AD-240513.1 3864 4160 4456 uL96 sasa GCU usasggcuCfaAfAfAfauuaaagcua usAfsgcuUfuAfAfuuuuUfgAfgccu UUUAGGCUCAAAAAUUAAAG AD-240514.1 3865 4161 4457 L96 asasa CUA csasggaaAfaGfGfAfacuguacuga usCfsaguAfcAfGfuuccUfuUfuccug CACAGGAAAAGGAACUGUAC AD-240538.1 3866 4162 4458 L96 susg UGG gsgsaaaaGfgAfAfCfuguacuggc asGfsccaGfuAfCfaguuCfcUfuuucc CAGGAAAAGGAACUGUACUG AD-240540.1 3867 4163 4459 uL96 susg GCU
291 / 395 asasaaggAfaCfUfGfuacuggcuau asUfsagcCfaGfUfacagUfuCfcuuuu GGAAAAGGAACUGUACUGGC AD-240542.1 3868 4164 4460 L96 scsc UAU asgsgaacUfgUfAfCfuggcuauua usUfsaauAfgCfCfaguaCfaGfuuccu AAAGGAACUGUACUGGCUAU AD-240545.1 3869 4165 4461 aL96 susu UAC gsgsaacuGfuAfCfUfggcuauuac usGfsuaaUfaGfCfcaguAfcAfguucc AAGGAACUGUACUGGCUAUU AD-240546.1 3870 4166 4462 aL96 susu ACA usasauccGfaCfUfCfccacuacaua usAfsuguAfgUfGfggagUfcGfgauu AAUAAUCCGACUCCCACUAC AD-240779.1 3871 4167 4463 L96 asusu AUC uscscgacUfcCfCfAfcuacaucaaa usUfsugaUfgUfAfguggGfaGfucgg AAUCCGACUCCCACUACAUC AD-240782.1 3872 4168 4464 L96 asusu AAG csuscccaCfuAfCfAfucaagacuaa usUfsaguCfuUfGfauguAfgUfggga GACUCCCACUACAUCAAGAC AD-240787.1 3873 4169 4465 L96 gsusc UAA uscsccacUfaCfAfUfcaagacuaau asUfsuagUfcUfUfgaugUfaGfuggga ACUCCCACUACAUCAAGACU AD-240788.1 3874 4170 4466 L96 sgsu AAU cscscacuAfcAfUfCfaagacuaaua usAfsuuaGfuCfUfugauGfuAfgugg CUCCCACUACAUCAAGACUA AD-240789.1 3875 4171 4467 L96 gsasg AUC cscsacuaCfaUfCfAfagacuaaucu asGfsauuAfgUfCfuugaUfgUfagugg UCCCACUACAUCAAGACUAA AD-240790.1 3876 4172 4468 L96 sgsa UCU ascsuacaUfcAfAfGfacuaaucuua usAfsagaUfuAfGfucuuGfaUfguagu CCACUACAUCAAGACUAAUC AD-240792.1 3877 4173 4469 L96 sgsg UUG csusacauCfaAfGfAfcuaaucuugu asCfsaagAfuUfAfgucuUfgAfuguag CACUACAUCAAGACUAAUCU AD-240793.1 3878 4174 4470 L96 susg UGU usascaucAfaGfAfCfuaaucuugu asAfscaaGfaUfUfagucUfuGfaugua ACUACAUCAAGACUAAUCUU AD-240794.1 3879 4175 4471 uL96 sgsu GUU ascsaucaAfgAfCfUfaaucuuguu asAfsacaAfgAfUfuaguCfuUfgaugu CUACAUCAAGACUAAUCUUG AD-240795.1 3880 4176 4472 uL96 sasg UUU gsusauuaUfaGfAfAfugcuuuugc usGfscaaAfaGfCfauucUfaUfaauacs AUGUAUUAUAGAAUGCUUU AD-240826.1 3881 4177 4473 aL96 asu UGCA usasuagaAfuGfCfUfuuugcaugg usCfscauGfcAfAfaagcAfuUfcuaua AUUAUAGAAUGCUUUUGCAU AD-240830.1 3882 4178 4474 aL96 sasu GGA asgsaaugCfuUfUfUfgcauggacu usAfsgucCfaUfGfcaaaAfgCfauucu AUAGAAUGCUUUUGCAUGGA AD-240833.1 3883 4179 4475 aL96 sasu CUA gsasaugcUfuUfUfGfcauggacua asUfsaguCfcAfUfgcaaAfaGfcauuc UAGAAUGCUUUUGCAUGGAC AD-240834.1 3884 4180 4476 uL96 susa UAU usgscuuuUfgCfAfUfggacuaucc asGfsgauAfgUfCfcaugCfaAfaagca AAUGCUUUUGCAUGGACUAU AD-240837.1 3885 4181 4477 uL96 susu CCU csusuuugCfaUfGfGfacuauccuc asGfsaggAfuAfGfuccaUfgCfaaaag UGCUUUUGCAUGGACUAUCC AD-240839.1 3886 4182 4478 uL96 scsa UCU
292 / 395 usgscaugGfaCfUfAfuccucuugu asAfscaaGfaGfGfauagUfcCfaugcas UUUGCAUGGACUAUCCUCUU AD-240843.1 3887 4183 4479 uL96 asa GUU gscsauggAfcUfAfUfccucuuguu asAfsacaAfgAfGfgauaGfuCfcaugc UUGCAUGGACUAUCCUCUUG AD-240844.1 3888 4184 4480 uL96 sasa UUU asasauaaCfcUfCfUfuguaguuaua usAfsuaaCfuAfCfaagaGfgUfuauuu AAAAAUAACCUCUUGUAGUU AD-240871.1 3889 4185 4481 L96 susu AUA asasccucUfuGfUfAfguuauaaaau asUfsuuuAfuAfAfcuacAfaGfagguu AUAACCUCUUGUAGUUAUAA AD-240875.1 3890 4186 4482 L96 sasu AAU
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Tabela 4. Rastreamento de HSD17B13 in vitro 50 nM em Cos-7 (vetor Dual- Luciferase psiCHECK2) Nome do duplex % da mensagem humana restante 50nM STDEV 50 nM AD-238911.1 56,0 9,0 AD-238912.1 103,7 14,5 AD-238913.1 51,6 9,4 AD-238929.1 51,8 10,1 AD-238930.1 63,6 6,7 AD-238932.1 53,7 10,3 AD-238960.1 35,1 3,6 AD-238979.1 25,6 4,7 AD-238991.1 31,8 2,0 AD-239009.1 81,1 15,9 AD-239015.1 94,7 11,3 AD-239016.1 63,8 4,5 AD-239017.1 45,4 9,9 AD-239018.1 68,7 10,7 AD-239019.1 36,9 7,4 AD-239020.1 52,7 5,1 AD-239031.1 19,4 2,5 AD-239062.1 33,5 6,4 AD-239066.1 45,5 3,8 AD-239103.1 12,8 1,3 AD-239110.1 14,0 2,1 AD-239118.1 57,0 8,6 AD-239119.1 38,6 1,6 AD-239131.1 65,9 9,1 AD-239132.1 39,4 13,4 AD-239133.1 31,7 3,2 AD-239146.1 13,5 1,6 AD-239155.1 27,5 1,9 AD-239156.1 81,1 12,5 AD-239177.1 27,7 5,2 AD-239178.1 60,6 7,0 AD-239179.1 42,9 8,4 AD-239180.1 83,8 16,0 AD-239181.1 43,2 8,0 AD-239182.1 34,0 5,5 AD-239183.1 24,3 3,1 AD-239185.1 82,9 12,6 AD-239186.1 89,0 9,8 AD-239187.1 85,1 18,1 AD-239188.1 64,5 3,0 AD-239189.1 70,7 8,9 AD-239190.1 91,9 7,9 AD-239191.1 58,9 10,3 AD-239192.1 60,7 17,3 AD-239193.1 61,9 8,1 AD-239194.1 74,4 6,2 AD-239196.1 94,7 17,1 AD-239198.1 100,9 22,5 AD-239199.1 47,3 12,8 AD-239203.1 40,4 2,3 AD-239214.1 33,3 6,2 AD-239215.1 38,9 8,4
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AD-239239.1 53,4 7,2 AD-239240.1 27,8 1,8 AD-239241.1 51,4 11,1 AD-239242.1 17,8 2,1 AD-239243.1 54,1 12,2 AD-239245.1 51,6 9,6 AD-239246.1 21,8 4,1 AD-239247.1 30,9 5,0 AD-239250.1 54,2 8,4 AD-239251.1 15,9 6,0 AD-239253.1 22,4 5,0 AD-239254.1 47,2 15,2 AD-239255.1 49,1 5,7 AD-239290.1 31,4 8,3 AD-239291.1 27,9 8,6 AD-239292.1 30,2 4,2 AD-239293.1 51,8 16,1 AD-239304.1 61,4 11,8 AD-239312.1 99,1 12,9 AD-239313.1 95,8 5,0 AD-239314.1 84,2 4,7 AD-239316.1 52,2 2,2 AD-239317.1 27,7 4,6 AD-239318.1 33,6 8,4 AD-239321.1 37,5 3,1 AD-239332.1 28,5 5,9 AD-239337.1 52,0 17,0 AD-239348.1 26,0 4,3 AD-239362.1 49,7 7,9 AD-239366.1 68,4 10,0 AD-239368.1 26,9 3,5 AD-239372.1 48,0 6,3 AD-239373.1 50,8 12,0 AD-239379.1 21,5 6,9 AD-239380.1 18,1 3,2 AD-239387.1 16,6 1,6 AD-239397.1 15,3 2,3 AD-239411.1 46,6 12,2 AD-239412.1 76,0 19,4 AD-239431.1 60,2 8,3 AD-239433.1 58,5 11,7 AD-239436.1 77,6 5,7 AD-239437.1 46,9 6,2 AD-239438.1 89,3 27,8 AD-239439.1 61,7 13,6 AD-239450.1 67,4 4,5 AD-239451.1 38,9 7,3 AD-239452.1 84,0 17,0 AD-239453.1 69,1 4,1 AD-239475.1 77,3 13,1 AD-239476.1 67,4 15,1 AD-239478.1 79,3 6,2 AD-239479.1 58,0 4,6 AD-239480.1 26,6 2,8 AD-239482.1 24,3 5,8 AD-239483.1 39,7 8,7 AD-239499.1 53,4 11,4
295 / 395
AD-239510.1 64,1 7,5 AD-239520.1 21,1 3,2 AD-239521.1 26,4 7,7 AD-239522.1 34,2 4,4 AD-239534.1 64,5 14,1 AD-239539.1 68,8 10,5 AD-239544.1 48,5 10,2 AD-239566.1 43,3 5,3 AD-239578.1 19,3 1,8 AD-239579.1 67,0 7,5 AD-239611.1 43,1 10,0 AD-239612.1 54,7 2,8 AD-239613.1 69,7 12,4 AD-239617.1 108,1 8,3 AD-239618.1 32,5 8,9 AD-239637.1 29,8 7,2 AD-239641.1 52,6 8,7 AD-239642.1 11,4 2,0 AD-239643.1 17,2 5,2 AD-239645.1 30,5 8,5 AD-239647.1 33,6 4,5 AD-239649.1 38,4 2,2 AD-239650.1 79,5 16,5 AD-239653.1 42,8 7,3 AD-239654.1 74,4 7,0 AD-239662.1 26,8 7,9 AD-239668.1 27,3 3,8 AD-239669.1 27,7 6,0 AD-239670.1 23,1 3,0 AD-239671.1 21,1 7,9 AD-239674.1 16,4 4,9 AD-239676.1 31,3 6,6 AD-239681.1 19,4 5,5 AD-239682.1 39,9 2,9 AD-239684.1 56,3 9,9 AD-239685.1 29,4 6,0 AD-239697.1 26,9 2,2 AD-239713.1 28,4 4,6 AD-239714.1 10,4 1,1 AD-239717.1 18,3 1,5 AD-239721.1 14,4 3,7 AD-239723.1 54,7 4,1 AD-239724.1 18,5 4,7 AD-239725.1 27,2 7,2 AD-239726.1 29,8 4,7 AD-239755.1 14,3 11,2 AD-239757.1 36,0 4,1 AD-239759.1 23,8 5,5 AD-239761.1 73,7 8,8 AD-239764.1 91,7 7,8 AD-239778.1 25,3 8,7 AD-239779.1 20,0 4,1 AD-239780.1 28,9 7,3 AD-239781.1 14,1 3,5 AD-239782.1 22,3 3,8 AD-239783.1 10,1 1,7 AD-239784.1 16,6 5,5
296 / 395
AD-239785.1 15,0 3,4 AD-239786.1 11,9 0,8 AD-239787.1 8,6 2,1 AD-239791.1 15,8 2,3 AD-239793.1 9,9 0,5 AD-239806.1 33,1 11,4 AD-239839.1 40,2 8,9 AD-239840.1 47,9 5,6 AD-239854.1 27,8 9,0 AD-239855.1 16,6 1,4 AD-239876.1 25,6 10,2 AD-239877.1 8,9 0,9 AD-239881.1 11,1 2,7 AD-239905.1 18,2 1,8 AD-239914.1 28,2 4,6 AD-239915.1 37,4 8,6 AD-239941.1 18,0 6,7 AD-239944.1 35,4 5,9 AD-239945.1 18,5 2,6 AD-239946.1 19,5 6,6 AD-239947.1 17,5 4,3 AD-239977.1 13,7 2,7 AD-239979.1 12,5 3,8 AD-239980.1 12,9 2,6 AD-239998.1 32,1 2,1 AD-240019.1 25,1 3,2 AD-240031.1 12,4 2,4 AD-240032.1 30,6 3,2 AD-240033.1 30,8 1,5 AD-240064.1 19,6 4,1 AD-240090.1 96,3 8,5 AD-240091.1 53,6 4,7 AD-240108.1 29,4 1,9 AD-240117.1 85,3 10,6 AD-240124.1 78,2 7,7 AD-240125.1 82,3 17,8 AD-240126.1 56,2 2,0 AD-240135.1 33,4 13,3 AD-240138.1 35,3 4,7 AD-240140.1 12,7 3,5 AD-240142.1 15,9 3,9 AD-240145.1 15,1 1,1 AD-240147.1 24,6 3,7 AD-240148.1 18,9 4,5 AD-240154.1 62,0 4,5 AD-240155.1 24,9 5,6 AD-240156.1 22,8 5,7 AD-240171.1 28,6 5,1 AD-240172.1 36,6 5,3 AD-240192.1 32,6 3,8 AD-240227.1 54,8 10,6 AD-240228.1 51,8 10,9 AD-240237.1 44,2 10,9 AD-240245.1 85,3 14,5 AD-240276.1 27,6 5,2 AD-240278.1 16,7 2,8 AD-240279.1 16,6 7,6
297 / 395
AD-240280.1 13,2 3,3 AD-240308.1 40,6 5,6 AD-240309.1 59,7 8,3 AD-240310.1 43,0 15,0 AD-240311.1 85,9 12,1 AD-240312.1 58,6 8,7 AD-240313.1 32,1 2,0 AD-240315.1 36,0 6,5 AD-240317.1 28,0 1,8 AD-240318.1 18,9 2,2 AD-240319.1 49,2 4,4 AD-240322.1 47,2 7,2 AD-240324.1 31,4 1,6 AD-240326.1 21,3 3,6 AD-240327.1 24,9 5,4 AD-240333.1 12,0 2,4 AD-240364.1 57,4 7,4 AD-240365.1 92,1 2,3 AD-240375.1 97,7 21,7 AD-240378.1 41,5 5,6 AD-240381.1 22,4 7,1 AD-240382.1 22,5 5,9 AD-240383.1 27,0 3,2 AD-240385.1 23,2 4,1 AD-240386.1 29,9 3,4 AD-240387.1 45,7 5,2 AD-240419.1 76,4 17,2 AD-240420.1 50,1 8,4 AD-240421.1 40,9 6,3 AD-240422.1 44,9 11,0 AD-240423.1 30,4 6,5 AD-240431.1 28,7 3,5 AD-240446.1 13,9 1,7 AD-240474.1 41,8 5,0 AD-240475.1 70,9 15,3 AD-240476.1 15,7 3,4 AD-240490.1 27,9 6,3 AD-240494.1 13,8 4,5 AD-240495.1 19,6 0,9 AD-240501.1 47,6 5,9 AD-240502.1 18,7 3,8 AD-240503.1 19,6 7,0 AD-240504.1 17,2 2,6 AD-240505.1 18,3 3,4 AD-240507.1 23,8 3,3 AD-240512.1 24,6 2,4 AD-240513.1 70,6 9,0 AD-240514.1 22,4 3,1 AD-240538.1 40,7 4,2 AD-240540.1 46,7 8,3 AD-240542.1 21,1 4,0 AD-240545.1 26,7 4,4 AD-240546.1 35,2 3,1 AD-240779.1 31,2 4,4 AD-240782.1 27,9 2,8 AD-240787.1 27,4 4,6 AD-240788.1 16,9 3,9
298 / 395
AD-240789.1 32,5 2,9 AD-240790.1 18,9 5,1 AD-240792.1 28,4 9,9 AD-240793.1 22,4 1,9 AD-240794.1 13,9 1,1 AD-240795.1 25,9 5,2 AD-240826.1 15,2 1,9 AD-240830.1 32,1 7,2 AD-240833.1 25,1 5,0 AD-240834.1 15,3 3,1 AD-240837.1 29,2 5,8 AD-240839.1 14,3 2,6 AD-240843.1 8,4 1,7 AD-240844.1 33,8 8,1 AD-240871.1 18,9 3,2 AD-240875.1 18,0 1,6
Tabela 5. Rastreamento de HSD17B13 in vitro 50 nM em hepatócitos humanos primários Nome do duplex % da mensagem humana restante 50 nM STDEV 50 nM AD-238911.1 116,8 40,6 AD-238912.1 83,9 15,4 AD-238913.1 96,3 14,1 AD-238929.1 82,9 14,7 AD-238930.1 86,4 6,6 AD-238932.1 72,4 23,3 AD-238960.1 64,8 28,2 AD-238979.1 48,1 25,1 AD-238991.1 31,3 7,3 AD-239009.1 34,1 9,3 AD-239015.1 90,4 15,8 AD-239016.1 51,7 13,0 AD-239017.1 31,8 10,1 AD-239018.1 75,5 16,0 AD-239019.1 56,0 22,6 AD-239020.1 59,9 19,3 AD-239031.1 46,6 17,3 AD-239062.1 61,9 21,9 AD-239066.1 61,1 17,3 AD-239103.1 41,0 21,7 AD-239110.1 31,8 7,7 AD-239118.1 48,3 3,7 AD-239119.1 56,2 12,7 AD-239131.1 75,2 18,1 AD-239132.1 90,1 34,9 AD-239133.1 52,0 10,7 AD-239146.1 72,1 35,4 AD-239155.1 39,1 9,8 AD-239156.1 79,3 24,4 AD-239177.1 55,1 15,6 AD-239178.1 72,0 21,4 AD-239179.1 57,8 10,5 AD-239180.1 36,3 8,4 AD-239181.1 60,6 19,7 AD-239182.1 42,4 6,4 AD-239183.1 29,3 13,1
299 / 395
AD-239185.1 68,4 21,1 AD-239186.1 87,7 23,4 AD-239187.1 83,2 14,4 AD-239188.1 54,2 13,2 AD-239189.1 74,5 31,3 AD-239190.1 57,4 3,5 AD-239191.1 49,8 21,9 AD-239192.1 33,9 13,5 AD-239193.1 96,3 36,6 AD-239194.1 63,1 18,3 AD-239196.1 43,5 11,6 AD-239198.1 93,8 8,0 AD-239199.1 44,2 21,5 AD-239203.1 68,2 19,0 AD-239214.1 40,3 8,3 AD-239215.1 71,6 25,3 AD-239239.1 53,9 32,4 AD-239240.1 23,8 6,5 AD-239241.1 56,2 10,0 AD-239242.1 46,0 15,0 AD-239243.1 97,6 73,4 AD-239245.1 84,7 9,2 AD-239246.1 37,6 11,2 AD-239247.1 36,5 15,9 AD-239250.1 34,1 6,8 AD-239251.1 19,3 3,7 AD-239253.1 26,3 6,9 AD-239254.1 52,5 13,7 AD-239255.1 52,8 18,1 AD-239290.1 46,3 30,0 AD-239291.1 53,1 25,1 AD-239292.1 49,8 18,6 AD-239293.1 49,5 15,6 AD-239304.1 32,9 10,3 AD-239312.1 83,1 13,5 AD-239313.1 57,4 16,5 AD-239314.1 85,7 13,7 AD-239316.1 50,9 32,4 AD-239317.1 28,0 3,5 AD-239318.1 64,4 26,9 AD-239321.1 34,8 6,9 AD-239332.1 42,0 13,9 AD-239337.1 29,1 11,0 AD-239348.1 22,5 10,5 AD-239362.1 67,8 29,4 AD-239366.1 67,1 26,2 AD-239368.1 41,2 17,8 AD-239372.1 46,4 6,0 AD-239373.1 27,8 4,1 AD-239379.1 19,4 5,7 AD-239380.1 26,5 9,0 AD-239387.1 30,5 14,6 AD-239397.1 18,9 5,4 AD-239411.1 41,8 17,0 AD-239412.1 79,2 22,8 AD-239431.1 39,5 15,3 AD-239433.1 36,9 12,1
300 / 395
AD-239436.1 101,1 17,3 AD-239437.1 37,6 20,8 AD-239438.1 54,0 9,7 AD-239439.1 31,8 6,5 AD-239450.1 67,0 22,6 AD-239451.1 42,4 15,3 AD-239452.1 57,4 3,0 AD-239453.1 45,9 5,9 AD-239475.1 27,2 5,0 AD-239476.1 41,4 16,7 AD-239478.1 38,7 5,7 AD-239479.1 44,0 19,6 AD-239480.1 49,2 10,7 AD-239482.1 31,6 9,4 AD-239483.1 37,5 8,3 AD-239499.1 56,0 12,2 AD-239510.1 51,1 20,1 AD-239520.1 26,5 15,5 AD-239521.1 33,4 19,0 AD-239522.1 36,2 18,2 AD-239534.1 30,7 17,4 AD-239539.1 76,9 31,7 AD-239544.1 21,3 10,9 AD-239566.1 39,1 8,1 AD-239578.1 19,9 12,4 AD-239579.1 24,7 6,7 AD-239611.1 38,8 34,7 AD-239612.1 60,9 15,4 AD-239613.1 76,4 15,6 AD-239617.1 186,1 52,1 AD-239618.1 32,0 5,2 AD-239637.1 22,8 2,8 AD-239641.1 35,9 14,0 AD-239642.1 31,5 28,5 AD-239643.1 12,0 1,7 AD-239645.1 29,6 11,6 AD-239647.1 24,9 7,3 AD-239649.1 35,0 4,2 AD-239650.1 51,2 3,7 AD-239653.1 48,8 26,5 AD-239654.1 105,2 35,2 AD-239662.1 27,5 12,0 AD-239668.1 31,5 9,1 AD-239669.1 42,4 24,3 AD-239670.1 53,3 17,1 AD-239671.1 26,2 11,1 AD-239674.1 17,3 9,5 AD-239676.1 42,1 13,1 AD-239681.1 24,9 11,4 AD-239682.1 12,7 4,5 AD-239684.1 15,2 1,4 AD-239685.1 24,9 6,1 AD-239697.1 15,1 6,2 AD-239713.1 24,6 7,4 AD-239714.1 23,6 18,1 AD-239717.1 36,6 33,7 AD-239721.1 7,3 3,4
301 / 395
AD-239723.1 47,2 12,1 AD-239724.1 29,1 7,8 AD-239725.1 17,7 15,4 AD-239726.1 45,9 13,2 AD-239755.1 19,0 4,6 AD-239757.1 28,6 3,2 AD-239759.1 10,7 3,3 AD-239761.1 60,2 11,2 AD-239764.1 56,4 15,6 AD-239778.1 45,9 32,9 AD-239779.1 18,2 12,0 AD-239780.1 34,5 22,1 AD-239781.1 30,1 16,8 AD-239782.1 37,3 12,4 AD-239783.1 13,0 6,8 AD-239784.1 43,1 14,0 AD-239785.1 9,9 8,9 AD-239786.1 16,9 10,0 AD-239787.1 15,9 9,3 AD-239791.1 11,7 5,4 AD-239793.1 11,1 3,2 AD-239806.1 29,4 13,5 AD-239839.1 60,6 13,8 AD-239840.1 36,7 23,2 AD-239854.1 39,0 20,3 AD-239855.1 31,6 5,2 AD-239876.1 34,6 10,8 AD-239877.1 35,8 21,8 AD-239881.1 47,0 11,9 AD-239905.1 36,6 8,2 AD-239914.1 30,4 13,9 AD-239915.1 51,3 25,7 AD-239941.1 111,8 60,8 AD-239944.1 63,6 23,9 AD-239945.1 58,6 23,0 AD-239946.1 65,3 28,6 AD-239947.1 77,7 16,6 AD-239977.1 54,5 16,5 AD-239979.1 61,4 14,4 AD-239980.1 87,8 41,2 AD-239998.1 54,8 14,7 AD-240019.1 76,7 23,6 AD-240031.1 63,1 18,5 AD-240032.1 51,6 13,5 AD-240033.1 69,7 41,4 AD-240064.1 81,0 32,4 AD-240090.1 145,8 80,6 AD-240091.1 75,2 17,1 AD-240108.1 62,2 18,9 AD-240117.1 54,4 2,3 AD-240124.1 63,3 25,7 AD-240125.1 68,6 18,1 AD-240126.1 77,4 10,9 AD-240135.1 64,9 33,1 AD-240138.1 59,3 17,7 AD-240140.1 65,2 21,2 AD-240142.1 42,9 6,6
302 / 395
AD-240145.1 58,2 10,2 AD-240147.1 56,7 14,3 AD-240148.1 35,0 12,2 AD-240154.1 39,2 19,5 AD-240155.1 57,2 22,1 AD-240156.1 71,9 28,3 AD-240171.1 66,4 22,8 AD-240172.1 50,4 12,9 AD-240192.1 43,5 3,8 AD-240227.1 62,1 19,7 AD-240228.1 50,6 12,7 AD-240237.1 67,2 9,5 AD-240245.1 99,3 21,4 AD-240276.1 49,9 16,6 AD-240278.1 31,8 6,1 AD-240279.1 46,2 2,4 AD-240280.1 68,4 16,4 AD-240308.1 72,7 15,4 AD-240309.1 85,8 2,0 AD-240310.1 58,9 16,1 AD-240311.1 74,2 21,0 AD-240312.1 83,3 7,3 AD-240313.1 70,4 15,1 AD-240315.1 66,1 7,6 AD-240317.1 52,0 11,1 AD-240318.1 65,1 24,1 AD-240319.1 38,8 7,7 AD-240322.1 69,9 10,1 AD-240324.1 79,6 37,5 AD-240326.1 29,8 3,0 AD-240327.1 62,6 11,3 AD-240333.1 60,3 31,5 AD-240364.1 81,0 16,8 AD-240365.1 104,1 31,5 AD-240375.1 111,2 18,0 AD-240378.1 85,1 33,8 AD-240381.1 87,8 18,3 AD-240382.1 51,9 9,5 AD-240383.1 45,6 13,2 AD-240385.1 53,5 6,6 AD-240386.1 63,3 6,8 AD-240387.1 75,8 26,0 AD-240419.1 81,2 11,1 AD-240420.1 69,3 32,6 AD-240421.1 93,8 17,0 AD-240422.1 75,6 38,5 AD-240423.1 75,7 14,1 AD-240431.1 53,2 2,4 AD-240446.1 93,2 30,6 AD-240474.1 74,7 22,8 AD-240475.1 74,4 29,5 AD-240476.1 37,2 2,4 AD-240490.1 82,0 34,8 AD-240494.1 62,3 14,1 AD-240495.1 102,5 39,4 AD-240501.1 33,9 4,9 AD-240502.1 40,6 5,7
303 / 395
AD-240503.1 63,4 31,4 AD-240504.1 55,0 7,7 AD-240505.1 73,0 22,1 AD-240507.1 68,3 23,1 AD-240512.1 55,0 19,6 AD-240513.1 54,9 14,8 AD-240514.1 33,8 16,7 AD-240538.1 51,3 13,3 AD-240540.1 72,1 11,2 AD-240542.1 60,0 9,0 AD-240545.1 45,9 23,8 AD-240546.1 46,2 18,4 AD-240779.1 64,8 22,4 AD-240782.1 77,7 20,3 AD-240787.1 59,6 16,9 AD-240788.1 54,2 12,0 AD-240789.1 58,9 24,6 AD-240790.1 54,0 14,7 AD-240792.1 67,2 9,2 AD-240793.1 54,9 14,6 AD-240794.1 69,3 18,8 AD-240795.1 34,5 7,2 AD-240826.1 56,5 16,8 AD-240830.1 63,7 14,4 AD-240833.1 84,9 28,4 AD-240834.1 50,2 15,1 AD-240837.1 46,3 16,3 AD-240839.1 54,9 18,4 AD-240843.1 46,4 13,9 AD-240844.1 38,2 10,3 AD-240871.1 92,8 35,8 AD-240875.1 72,0 13,2
Tabela 6. Rastreamento de HSD17B13 in vitro 50 nM em hepatócitos primários de Cynomolgus Nome do duplex % da mensagem restante de Cyno 50 nM STDEV 50 nM AD-238911.1 81,2 8,9 AD-238912.1 87,5 6,8 AD-238913.1 62,3 4,1 AD-238929.1 67,1 22,3 AD-238930.1 42,1 4,0 AD-238932.1 54,8 12,2 AD-238960.1 24,6 5,2 AD-238979.1 11,1 7,5 AD-238991.1 30,8 6,2 AD-239009.1 11,4 1,1 AD-239015.1 21,2 3,0 AD-239016.1 7,2 1,4 AD-239017.1 8,9 1,8 AD-239018.1 39,2 4,6 AD-239019.1 22,0 5,5 AD-239020.1 8,8 2,8 AD-239031.1 19,5 7,5 AD-239062.1 20,6 5,6 AD-239066.1 75,5 16,3 AD-239103.1 88,4 33,4
304 / 395
AD-239110.1 11,2 3,0 AD-239118.1 23,1 6,3 AD-239119.1 23,4 4,2 AD-239131.1 98,9 9,0 AD-239132.1 86,0 18,5 AD-239133.1 24,3 8,7 AD-239146.1 11,4 2,8 AD-239155.1 39,4 21,3 AD-239156.1 52,8 11,0 AD-239177.1 23,1 6,7 AD-239178.1 46,3 4,6 AD-239179.1 40,3 8,7 AD-239180.1 21,8 6,2 AD-239181.1 45,5 5,9 AD-239182.1 17,7 3,8 AD-239183.1 10,6 1,5 AD-239185.1 55,9 7,2 AD-239186.1 77,7 13,0 AD-239187.1 61,1 6,8 AD-239188.1 41,0 1,5 AD-239189.1 11,6 2,1 AD-239190.1 48,8 7,9 AD-239191.1 9,0 4,1 AD-239192.1 35,0 12,1 AD-239193.1 68,1 4,9 AD-239194.1 26,7 1,7 AD-239196.1 56,6 10,2 AD-239198.1 80,5 11,0 AD-239199.1 32,8 4,6 AD-239203.1 36,9 6,3 AD-239214.1 15,3 2,7 AD-239215.1 28,9 6,5 AD-239239.1 17,0 2,8 AD-239240.1 15,6 4,4 AD-239241.1 16,8 9,9 AD-239242.1 16,5 5,9 AD-239243.1 13,3 4,2 AD-239245.1 13,7 2,9 AD-239246.1 12,9 8,2 AD-239247.1 18,0 6,5 AD-239250.1 49,8 6,5 AD-239251.1 6,8 0,5 AD-239253.1 11,5 3,8 AD-239254.1 47,4 4,6 AD-239255.1 16,4 7,2 AD-239290.1 75,5 25,9 AD-239291.1 92,3 27,1 AD-239292.1 9,8 2,7 AD-239293.1 46,8 6,3 AD-239304.1 30,7 8,9 AD-239312.1 15,0 3,2 AD-239313.1 8,7 2,4 AD-239314.1 100,1 18,8 AD-239316.1 40,0 9,5 AD-239317.1 12,3 2,0 AD-239318.1 9,3 1,8 AD-239321.1 9,2 2,4
305 / 395
AD-239332.1 48,0 12,4 AD-239337.1 15,4 7,5 AD-239348.1 21,1 6,0 AD-239362.1 75,3 6,7 AD-239366.1 30,7 11,1 AD-239368.1 24,6 6,2 AD-239372.1 45,5 2,7 AD-239373.1 33,3 7,5 AD-239379.1 8,1 2,6 AD-239380.1 7,2 1,1 AD-239387.1 36,2 5,3 AD-239397.1 12,3 3,4 AD-239411.1 31,6 10,7 AD-239412.1 59,5 7,0 AD-239431.1 13,2 7,9 AD-239433.1 33,0 10,1 AD-239436.1 71,5 14,7 AD-239437.1 10,4 2,6 AD-239438.1 12,3 2,7 AD-239439.1 79,2 11,8 AD-239450.1 61,3 2,2 AD-239451.1 29,7 8,7 AD-239452.1 78,7 17,3 AD-239453.1 38,5 10,6 AD-239475.1 11,4 2,2 AD-239476.1 39,5 6,9 AD-239478.1 59,3 9,4 AD-239479.1 14,7 3,6 AD-239480.1 31,6 6,6 AD-239482.1 13,7 3,3 AD-239483.1 14,1 3,8 AD-239499.1 111,5 13,7 AD-239510.1 16,0 4,0 AD-239520.1 11,3 5,2 AD-239521.1 19,8 3,7 AD-239522.1 12,5 3,8 AD-239534.1 31,1 8,4 AD-239539.1 9,3 3,5 AD-239544.1 24,0 3,2 AD-239566.1 11,9 7,0 AD-239578.1 25,7 5,5 AD-239579.1 28,1 5,9 AD-239611.1 37,4 7,8 AD-239612.1 36,2 8,4 AD-239613.1 13,5 3,3 AD-239617.1 46,2 9,3 AD-239618.1 15,9 1,2 AD-239637.1 33,6 13,4 AD-239641.1 42,3 7,4 AD-239642.1 34,4 5,7 AD-239643.1 9,7 2,0 AD-239645.1 16,1 3,4 AD-239647.1 19,0 4,0 AD-239649.1 70,4 6,0 AD-239650.1 65,8 12,5 AD-239653.1 16,4 3,6 AD-239654.1 18,3 6,5
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AD-239662.1 8,4 4,1 AD-239668.1 13,2 4,2 AD-239669.1 53,6 14,0 AD-239670.1 14,4 3,6 AD-239671.1 12,1 2,9 AD-239674.1 14,8 4,0 AD-239676.1 20,9 4,8 AD-239681.1 9,4 0,6 AD-239682.1 8,9 1,3 AD-239684.1 12,0 2,9 AD-239685.1 10,8 3,7 AD-239697.1 11,8 3,3 AD-239713.1 11,4 1,8 AD-239714.1 7,8 2,8 AD-239717.1 10,4 1,5 AD-239721.1 27,2 6,4 AD-239723.1 81,2 14,9 AD-239724.1 11,0 3,7 AD-239725.1 24,1 3,0 AD-239726.1 27,3 7,7 AD-239755.1 7,8 3,3 AD-239757.1 30,3 3,4 AD-239759.1 6,7 1,7 AD-239761.1 49,7 11,8 AD-239764.1 53,5 11,4 AD-239778.1 26,8 7,8 AD-239779.1 63,3 20,5 AD-239780.1 85,5 17,8 AD-239781.1 26,4 6,0 AD-239782.1 22,6 6,7 AD-239783.1 9,7 1,9 AD-239784.1 20,2 3,8 AD-239785.1 23,6 6,7 AD-239786.1 38,3 6,1 AD-239787.1 27,6 2,5 AD-239791.1 17,8 2,1 AD-239793.1 6,8 1,2 AD-239806.1 27,8 2,9 AD-239839.1 11,9 5,6 AD-239840.1 10,3 1,8 AD-239854.1 58,6 8,9 AD-239855.1 23,3 9,3 AD-239876.1 42,8 20,3 AD-239877.1 30,6 10,4 AD-239881.1 53,4 5,5 AD-239905.1 50,1 17,6 AD-239914.1 37,3 5,2 AD-239915.1 34,8 5,7 AD-239941.1 66,8 14,1 AD-239944.1 117,7 12,5 AD-239945.1 23,2 2,7 AD-239946.1 14,0 5,9 AD-239947.1 25,8 1,6 AD-239977.1 27,3 4,4 AD-239979.1 25,5 4,8 AD-239980.1 35,5 6,4 AD-239998.1 32,7 4,0
307 / 395
AD-240019.1 17,9 2,6 AD-240031.1 15,3 1,9 AD-240032.1 23,4 2,4 AD-240033.1 22,2 3,7 AD-240064.1 47,1 5,2 AD-240090.1 25,7 5,9 AD-240091.1 31,4 8,2 AD-240108.1 118,3 27,0 AD-240117.1 56,6 5,6 AD-240124.1 43,5 8,1 AD-240125.1 54,0 6,8 AD-240126.1 30,7 7,0 AD-240135.1 14,7 0,8 AD-240138.1 36,6 13,8 AD-240140.1 33,6 10,9 AD-240142.1 19,4 4,7 AD-240145.1 27,6 9,1 AD-240147.1 18,1 3,4 AD-240148.1 9,0 1,7 AD-240154.1 23,0 1,0 AD-240155.1 18,2 1,7 AD-240156.1 15,1 2,2 AD-240171.1 29,9 6,9 AD-240172.1 31,9 8,0 AD-240192.1 39,7 5,7 AD-240227.1 71,4 15,6 AD-240228.1 35,8 22,3 AD-240237.1 43,3 17,3 AD-240245.1 41,5 5,1 AD-240276.1 20,6 4,4 AD-240278.1 11,6 1,8 AD-240279.1 20,1 0,5 AD-240280.1 51,0 9,5 AD-240308.1 80,5 19,3 AD-240309.1 63,5 10,3 AD-240310.1 45,2 10,3 AD-240311.1 42,6 14,8 AD-240312.1 22,3 1,3 AD-240313.1 21,6 4,5 AD-240315.1 26,4 8,2 AD-240317.1 17,8 3,6 AD-240318.1 20,5 2,5 AD-240319.1 23,5 6,5 AD-240322.1 37,5 2,7 AD-240324.1 37,1 13,9 AD-240326.1 11,2 3,4 AD-240327.1 28,7 4,0 AD-240333.1 32,0 5,8 AD-240364.1 34,1 13,5 AD-240365.1 58,8 18,7 AD-240375.1 86,7 17,8 AD-240378.1 49,8 14,8 AD-240381.1 56,0 12,0 AD-240382.1 35,7 7,9 AD-240383.1 27,5 5,5 AD-240385.1 15,8 2,0 AD-240386.1 18,7 2,0
308 / 395 AD-240387.1 33,3 13,0 AD-240419.1 32,8 4,2 AD-240420.1 31,5 4,5 AD-240421.1 21,5 4,7 AD-240422.1 19,9 4,6 AD-240423.1 13,1 2,3 AD-240431.1 16,1 3,3 AD-240446.1 16,6 3,5 AD-240474.1 28,7 10,8 AD-240475.1 32,7 11,9 AD-240476.1 11,0 1,8 AD-240490.1 38,5 5,6 AD-240494.1 37,3 14,0 AD-240495.1 17,4 4,6 AD-240501.1 29,5 6,7 AD-240502.1 16,3 1,2 AD-240503.1 12,4 2,5 AD-240504.1 15,6 4,4 AD-240505.1 44,8 15,3 AD-240507.1 47,0 12,7 AD-240512.1 31,9 3,9 AD-240513.1 44,2 3,8 AD-240514.1 13,0 2,4 AD-240538.1 35,5 6,4 AD-240540.1 40,0 12,4 AD-240542.1 65,6 15,4 AD-240545.1 18,7 2,3 AD-240546.1 32,4 5,0 AD-240779.1 33,8 8,0 AD-240782.1 33,6 7,3 AD-240787.1 35,4 3,4 AD-240788.1 12,5 1,3 AD-240789.1 42,6 8,0 AD-240790.1 21,9 2,1 AD-240792.1 22,0 2,8 AD-240793.1 22,7 3,7 AD-240794.1 37,5 9,5 AD-240795.1 18,9 1,9 AD-240826.1 38,9 6,9 AD-240830.1 32,9 2,4 AD-240833.1 41,6 9,4 AD-240834.1 17,2 3,6 AD-240837.1 42,1 7,9 AD-240839.1 18,4 3,7 AD-240843.1 17,1 5,9 AD-240844.1 19,8 3,8 AD-240871.1 16,2 2,1 AD-240875.1 48,1 27,7 Exemplo 2. Desenho, síntese e seleção do iRNA
[00710] Esse Exemplo descreve métodos para o desenho, a síntese e a seleção de agentes adicionais do iRNA de HSD17B13. Bioinformática
309 / 395
[00711] Um conjunto de siRNAs direcionados para o gene hidroxiesteroide 17-beta desidrogenase 13 humano (HSD17B13; NCBI refseqID NM_178135.4 humano; NCBI GeneID: 345275), bem como o ortólogo de HSD17B13 para a espécie de toxicologia, macaco Cynomolgus: XM_005555367.2 foi projetado usando os scripts personalizados R e Python. Todos os desenhos do siRNA mostraram uma combinação perfeita com o transcrito do HSD17B13 humano e um subconjunto de combinações perfeitas ou quase perfeitas com o ortólogo do macaco Cynomolgus. o mRNA humano NM_178135 REFSEQ, versão 4, tem 2397 bases de comprimento. A justificativa e o método para o conjunto de desenhos de siRNA são como segue: A eficácia prevista para cada siRNA de 23mer potencial da posição 10 até a extremidade foi determinada com um modelo de floresta aleatória, derivado da medição direta do knockdown (silenciamento) do mRNA de diversos milhares de desenhos distintos de siRNA direcionados para um conjunto diverso de genes de vertebrados. Para cada fita do siRNA, usou-se um script Python personalizado em uma busca de força bruta para medir o número e as posições dos erros de emparelhamento (mismatches) entre o siRNA e todos os alinhamentos potenciais no transcriptoma humano. Foi dado peso extra aos erros de emparelhamento na região semente, aqui definida como as posições 2-9 do oligonucleotídeo antisense, bem como ao sítio de clivagem do siRNA, aqui definido como as posições 10-11 do oligonucleotídeo antisense. O peso relativo dos erros de emparelhamento foi 2,8; 1,2; 1, para erros de emparelhamento na semente, sítio de clivagem e outras posições até a posição 19 antisense. Os erros de emparelhamento na primeira posição foram ignorados. Uma pontuação da especificidade foi calculada para cada fita, somando o valor de cada erro de emparelhamento ponderado. Foi dada preferência aos siRNAs cuja pontuação antisense em humano e macaco Cynomolgus era >= 2 e a eficácia prevista foi >= 50% de knockdown.
[00712] Rastreamento in vitro com Cos-7 (vetor psiCHECK2-Luciferase
310 / 395 duplo de HSD17B13 humano) e hepatócitos primários de Cynomolgus Ensaio Dual-Glo® de Luciferase
[00713] Células Cos-7 (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas até próximo da confluência a 37 ºC em atmosfera de CO2 5% CO2 em DMEM (ATCC) suplementado com FBS 10%, antes de serem liberadas da placa por tripsinização. Foram realizados experimentos de múltiplas doses a 10 nM e 0,1 nM. A transfecção de siRNA e plasmídeo de psiCHECK2-HSD17B13 (NM_178135 clonado nos sítios XhoI-NotI) foi realizada, adicionando 5 µL de duplex de siRNA e 5 µL (5ng) do plasmídeo psiCHECK2-HSD17B13 por poço, juntamente com 4,9 µL de Opti-MEM mais 0,1 µL de Lipofectamine 2000 por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. no 13778-150) e, a seguir, incubação à temperatura ambiente por 15 minutos. A mistura foi então adicionada às células que foram ressuspensas em 35 µL de meio completo fresco. As células transfectadas foram incubadas a 37 ºC em atmosfera de CO2 5%.
[00714] Após quarenta e oito horas, os siRNAs e o plasmídeo psiCHECK2- HSD17B13 foram transfectados; A luciferase de vagalume (controle da transfecção) e de Renilla (fundida à sequência alvo de HSD17B13) foram medidas. Primeiramente, o meio foi removido das células. Depois, a atividade da luciferase de vagalume foi medida adicionando-se 20 µL do Reagente Dual-Glo® Luciferase, o mesmo volume do meio de cultura, a cada poço e misturando. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 30 minutes antes que a luminescência (500 nm) fosse medida em um Spectramax (Molecular Devices) para detectar o sinal da luciferase de vagalume. 20 µL do reagente Dual-Glo® Stop & Glo® à temperatura ambiente foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas por 10-15 minutos antes que a luminescência fosse medida novamente para determinar o sinal da luciferase de Renilla. O Reagente Dual-Glo® Stop & Glo® interrompeu o sinal da luciferase de vagalume e manteve a luminescência para a reação da luciferase de Renilla. A atividade do siRNA foi determinada normalizando o sinal
311 / 395 de Renilla (HSD17B13) ao sinal de Vagalume (controle) dentro de cada poço. A magnitude da atividade do siRNA foi então avaliada em relação a células que foram transfectadas com o mesmo vetor, mas que não foram tratadas com o siRNA ou foram tratadas com um siRNA não direcionado. Todas as transfecções foram realizadas com n=2 ou maior. Cultura celular e transfecções
[00715] Hepatócitos Primários de Cynomolgus (Bioreclamation/IVT) foram transfectados adicionando 4,9 µL de Opti-MEM mais 0,1 µL de RNAiMAX por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. no 13778-150) a 5 µL de duplex de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de SiRNA, em uma placa com 384 poços, e incubando a placa à temperatura ambiente por 15 minutos. 40 µL de meio de plaqueamento InVitroGRO CP (Bioreclamation/IVT), contendo ~5 x103 células então adicionadas à mistura dos siRNA. As células foram incubadas por 48 horas antes da purificação do RNA. Foram realizados experimentos de múltiplas doses a 10 nM e 0,1 nM. Isolamento do RNA Total com o kit de Isolamento de mRNA DYNABEADS
[00716] O RNA foi isolado por meio de um protocolo automático em uma plataforma BioTek-EL406 usando DYNABEADs (Invitrogen, cat. no 61012). Resumidamente, 70 µL de Tampão de Lise/Ligação e 10 µL de tampão de lise contendo 3 µL de microesferas magnéticas foram adicionados à placa com as células. As placas foram incubadas em um agitador eletromagnético por 10 minutos à temperatura ambiente e, a seguir, as microesferas magnéticas foram capturadas e o sobrenadante, removido. RNA ligado às microesferas foi então lavado duas vezes com 150 µL do Tampão de Lavagem A e uma vez com o Tampão de Lavagem B. As microesferas foram então lavadas com 150 µL do Tampão de Eluição, recapturadas e o sobrenadante removido. Síntese de cDNA usando o kit ABI de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Foster
312 / 395 City, CA, Cat. no 368813)
[00717] 10 µL de uma mistura master contendo 1µL de 10X Tampão, 0,4 µL de 25X dNTPs, 1µL de 10x primers Random, 0,5 µL de transcriptase reversa, 0,5 µL de inibidor de RNase e 6,6 µL de H2O por reação foram adicionados ao RNA isolado acima. As placas foram fechadas com vedação, misturadas e incubadas em um agitador eletromagnético por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido por 2 horas a 37 ºC. PCR em tempo real
[00718] 2 µL de cDNA foram adicionados a uma mistura master contendo 0,5 µL da sonda TaqMan de GAPDH Cyno (primer forward: 5’- GCATCCTGGGCTACACTGA-3’ (SEQ ID NO: 4483), primer reverse: 5’- TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3’ (SEQ ID NO: 4484), sonda: 5’HEX- CCAGGTGGTCTCCTCC-3’BHQ-1 (SEQ ID NO: 4485)) e 0,5 µL de sonda de HSD17B13 de Cynomolgus (Mf02888851_m1) e 5 µL mistura máster da sonda Lightcycler 480 (Roche Cat. no 04887301001) por poço em uma placa com 384 poços (Roche cat. no 04887301001). A PCR em tempo real foi realizada em um sistema de PCR em Tempo Real LightCycler480 (Roche). Cada duplex foi testado ao menos duas vezes e os dados foram normalizados para células transfectadas com um siRNA controle não direcionado. Para calcular a expressão relativa (fold change), dados em tempo real foram analisados pelo método de ΔΔCt e normalizados contra ensaios realizados com células transfectadas com um siRNA controle não direcionado. Resultados
[00719] A Tabela 7 fornece sequências modificadas de HSD17B13 ELF7 GNA7. A Tabela 8 fornece sequências não modificadas de HSD17B13 ELF7 GNA7. Os resultados do rastreamento in vitro das sequências modificadas de HSD17B13 ELF7 GNA7 10 nM em Cos-7 e hepatócitos primários de Cynomolgus estão resumidos na Tabela 9.
313 / 395
[00720] Do mesmo modo, a Tabela 10 fornece sequências modificadas de DNA de HSD17B13 NonF. A Tabela 11 fornece sequências não modificadas de DNA de HSD17B13 NonF. Na Tabela 12, são mostrados os resultados do rastreamento in vitro das sequências modificadas de DNA de HSD17B13 NonF DNA 10 nM em Cos-7 e hepatócitos primários de Cynomolgus. “NonF” indica que esses agentes de RNAi são desprovidos de modificações com flúor.
Tabela 7. Sequência modificada de HSD17B13 ELF7 GNA7* Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asgsuaccUfcCfUfCfccuaggacua usAfsgucc(Tgn)agggagGfaGfguac 302 ACAGUACCUCCUCCCUAGGA 602
286958.1 L96 2981 usgsu CUA AD- uscscuucUfgCfUfUfcugaucacca usGfsguga(Tgn)cagaagCfaGfaagg 303 AAUCCUUCUGCUUCUGAUCA 603
287001.1 L96 2982 asusu CCA AD- csasucauCfuAfCfUfccuacuugga usCfscaag(Tgn)aggaguAfgAfugau 304 ACCAUCAUCUACUCCUACUU 604
287012.1 L96 2983 gsgsu GGA AD- uscsuacuCfcUfAfCfuuggagucg asCfsgacu(Cgn)caaguaGfgAfguag 305 CAUCUACUCCUACUUGGAGU 605
287014.1 uL96 2984 asusg CGU AD- csusacucCfuAfCfUfuggagucgu asAfscgac(Tgn)ccaaguAfgGfagua 306 AUCUACUCCUACUUGGAGUC 606
287015.1 uL96 2985 gsasu GUU AD- gsusaccuCfcUfCfCfcuaggacuau asUfsaguc(Cgn)uagggaGfgAfggua 307 CAGUACCUCCUCCCUAGGAC 607
287017.1 L96 2986 csusg UAC AD- ascsacaaGfgAfCfUfgaaccagaau asUfsucug(Ggn)uucaguCfcUfugug 308 CUACACAAGGACUGAACCAG 608
287026.1 L96 2987 usasg AAG 314 / 395 AD- ascscaucAfuCfUfAfcuccuacuuu asAfsagua(Ggn)gaguagAfuGfaugg 309 UCACCAUCAUCUACUCCUAC 609
287059.1 L96 2988 usgsa UUG AD- cscsaucaUfcUfAfCfuccuacuugu asCfsaagu(Agn)ggaguaGfaUfgaug 310 CACCAUCAUCUACUCCUACU 610
287060.1 L96 2989 gsusg UGG AD- asuscaucUfaCfUfCfcuacuuggau asUfsccaa(Ggn)uaggagUfaGfauga 311 CCAUCAUCUACUCCUACUUG 611
287061.1 L96 2990 usgsg GAG AD- csasucuaCfuCfCfUfacuuggagu asAfscucc(Agn)aguaggAfgUfagau 312 AUCAUCUACUCCUACUUGGA 612
287062.1 uL96 2991 gsasu GUC AD- usascuccUfaCfUfUfggagucguu asAfsacga(Cgn)uccaagUfaGfgagu 313 UCUACUCCUACUUGGAGUCG 613
287064.1 uL96 2992 asgsa UUG AD- ascsuccuAfcUfUfGfgagucguug asCfsaacg(Agn)cuccaaGfuAfggag 314 CUACUCCUACUUGGAGUCGU 614
287065.1 uL96 2993 usasg UGG AD- csusccuaCfuUfGfGfagucguugg asCfscaac(Ggn)acuccaAfgUfaggag 315 UACUCCUACUUGGAGUCGU 615
287066.1 uL96 2994 susa UGGU AD- uscscuacUfuGfGfAfgucguuggu asAfsccaa(Cgn)gacuccAfaGfuagga 316 ACUCCUACUUGGAGUCGUU 616
287126.1 uL96 2995 sgsu GGUG AD- asascugcAfgCfUfGfagugccgaaa usUfsucgg(Cgn)acucagCfuGfcagu 317 GAAACUGCAGCUGAGUGCC 617
287200.1 L96 2996 ususc GAAA AD- ascsugcaGfcUfGfAfgugccgaaaa usUfsuucg(Ggn)cacucaGfcUfgcag 318 AAACUGCAGCUGAGUGCCG 618
287201.1 L96 2997 ususu AAAA
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- usgscagcUfgAfGfUfgccgaaaac asGfsuuuu(Cgn)ggcacuCfaGfcugc 319 ACUGCAGCUGAGUGCCGAA 619
287202.1 uL96 2998 asgsu AACU AD- gscsagcuGfaGfUfGfccgaaaacua usAfsguuu(Tgn)cggcacUfcAfgcug 320 CUGCAGCUGAGUGCCGAAA 620
287203.1 L96 2999 csasg ACUA AD- asgsugccGfaAfAfAfcuaggcguc usGfsacgc(Cgn)uaguuuUfcGfgcac 321 UGAGUGCCGAAAACUAGGC 621
287205.1 aL96 3000 uscsa GUCA AD- usgsccgaAfaAfCfUfaggcgucac asGfsugac(Ggn)ccuaguUfuUfcggc 322 AGUGCCGAAAACUAGGCGU 622
287206.1 uL96 3001 ascsu CACU AD- csusguggGfaUfAfUfuaauaagcg asCfsgcuu(Agn)uuaauaUfcCfcaca 323 UUCUGUGGGAUAUUAAUAA 623
287227.1 uL96 3002 gsasa GCGC AD- csusgcagCfuGfAfGfugccgaaaa 24 asUfsuuuc(Ggn)gcacucAfgCfugca 324 AACUGCAGCUGAGUGCCGA 624
287246.1 uL96 gsusu AAAC AD- csasgcugAfgUfGfCfcgaaaacuau 25 asUfsaguu(Tgn)ucggcaCfuCfagcu 325 UGCAGCUGAGUGCCGAAAA 625
287247.1 L96 gscsa CUAG AD- asgscugaGfuGfCfCfgaaaacuagu 26 asCfsuagu(Tgn)uucggcAfcUfcagc 326 GCAGCUGAGUGCCGAAAAC 626
287248.1 L96 usgsc UAGG 315 / 395 AD- gscsugagUfgCfCfGfaaaacuagg 27 asCfscuag(Tgn)uuucggCfaCfucagc 327 CAGCUGAGUGCCGAAAACU 627
287249.1 uL96 susg AGGC AD- csusgaguGfcCfGfAfaaacuaggc 28 asGfsccua(Ggn)uuuucgGfcAfcuca 328 AGCUGAGUGCCGAAAACUA 628
287250.1 uL96 gscsu GGCG AD- gsasgugcCfgAfAfAfacuaggcgu 29 asAfscgcc(Tgn)aguuuuCfgGfcacu 329 CUGAGUGCCGAAAACUAGG 629
287251.1 uL96 csasg CGUC AD- gsusgccgAfaAfAfCfuaggcguca 30 asUfsgacg(Cgn)cuaguuUfuCfggca 330 GAGUGCCGAAAACUAGGCG 630
287252.1 uL96 csusc UCAC AD- gscscgaaAfaCfUfAfggcgucacu 31 asAfsguga(Cgn)gccuagUfuUfucgg 331 GUGCCGAAAACUAGGCGUC 631
287253.1 uL96 csasc ACUG AD- cscsgaaaAfcUfAfGfgcgucacug 32 asCfsagug(Agn)cgccuaGfuUfuucg 332 UGCCGAAAACUAGGCGUCAC 632
287254.1 uL96 gscsa UGC AD- ascsuaggCfgUfCfAfcugcgcaug 33 asCfsaugc(Ggn)cagugaCfgCfcuag 333 AAACUAGGCGUCACUGCGCA 633
287258.1 uL96 ususu UGC AD- gsasucuaUfcGfCfUfcucuaaauca 34 usGfsauuu(Agn)gagagcGfaUfagau 334 GAGAUCUAUCGCUCUCUAA 634
287287.1 L96 csusc AUCA AD- csusaucgCfuCfUfCfuaaaucaggu 35 asCfscuga(Tgn)uuagagAfgCfgaua 335 AUCUAUCGCUCUCUAAAUCA 635
287288.1 L96 gsasu GGU AD- asuscgcuCfuCfUfAfaaucaggug 36 usCfsaccu(Ggn)auuuagAfgAfgcga 336 CUAUCGCUCUCUAAAUCAGG 636
287289.1 aL96 usasg UGA
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- uscsgcucUfcUfAfAfaucagguga 37 usUfscacc(Tgn)gauuuaGfaGfagcg 337 UAUCGCUCUCUAAAUCAGG 637
287290.1 aL96 asusa UGAA AD- uscsucuaAfaUfCfAfggugaagaa 38 usUfsucuu(Cgn)accugaUfuUfagag 338 GCUCUCUAAAUCAGGUGAA 638
287293.1 aL96 asgsc GAAA AD- gsusggugAfaUfAfAfugcugggac 39 usGfsuccc(Agn)gcauuaUfuCfacca 339 UCGUGGUGAAUAAUGCUGG 639
287316.1 aL96 csgsa GACA AD- gsasauaaUfgCfUfGfggacaguau 40 usAfsuacu(Ggn)ucccagCfaUfuauu 340 GUGAAUAAUGCUGGGACAG 640
287320.1 aL96 csasc UAUA AD- asasuaauGfcUfGfGfgacaguaua 41 asUfsauac(Tgn)gucccaGfcAfuuau 341 UGAAUAAUGCUGGGACAGU 641
287321.1 uL96 uscsa AUAU AD- gsgsgacaGfuAfUfAfuccagccga 42 asUfscggc(Tgn)ggauauAfcUfgucc 342 CUGGGACAGUAUAUCCAGCC 642
287324.1 uL96 csasg GAU AD- gsascaguAfuAfUfCfcagccgauc 43 asGfsaucg(Ggn)cuggauAfuAfcugu 343 GGGACAGUAUAUCCAGCCG 643
287325.1 uL96 cscsc AUCU AD- ascsaguaUfaUfCfCfagccgaucuu 44 asAfsgauc(Ggn)gcuggaUfaUfacug 344 GGACAGUAUAUCCAGCCGA 644
287326.1 L96 uscsc UCUU 316 / 395 AD- asgsuauaUfcCfAfGfccgaucuuc 45 asGfsaaga(Tgn)cggcugGfaUfauac 345 ACAGUAUAUCCAGCCGAUCU 645
287327.1 uL96 usgsu UCU AD- asuscuauCfgCfUfCfucuaaaucau 46 asUfsgauu(Tgn)agagagCfgAfuaga 346 AGAUCUAUCGCUCUCUAAA 646
287344.1 L96 uscsu UCAG AD- usasucgcUfcUfCfUfaaaucaggu 47 asAfsccug(Agn)uuuagaGfaGfcgau 347 UCUAUCGCUCUCUAAAUCAG 647
287346.1 uL96 asgsa GUG AD- csgscucuCfuAfAfAfucaggugaa 48 asUfsucac(Cgn)ugauuuAfgAfgagc 348 AUCGCUCUCUAAAUCAGGU 648
287347.1 uL96 gsasu GAAG AD- csgsugguGfaAfUfAfaugcuggga 49 asUfsccca(Ggn)cauuauUfcAfccacg 349 AUCGUGGUGAAUAAUGCUG 649
287366.1 uL96 sasu GGAC AD- usgsgugaAfuAfAfUfgcugggaca 50 asUfsgucc(Cgn)agcauuAfuUfcacc 350 CGUGGUGAAUAAUGCUGGG 650
287367.1 uL96 ascsg ACAG AD- asusgcugGfgAfCfAfguauaucca 51 asUfsggau(Agn)uacuguCfcCfagca 351 UAAUGCUGGGACAGUAUAU 651
287370.1 uL96 ususa CCAG AD- usgscuggGfaCfAfGfuauauccag 52 asCfsugga(Tgn)auacugUfcCfcagca 352 AAUGCUGGGACAGUAUAUC 652
287371.1 uL96 susu CAGC AD- gscsugggAfcAfGfUfauauccagc 53 asGfscugg(Agn)uauacuGfuCfccag 353 AUGCUGGGACAGUAUAUCC 653
287372.1 uL96 csasu AGCC AD- csusgggaCfaGfUfAfuauccagcc 54 asGfsgcug(Ggn)auauacUfgUfccca 354 UGCUGGGACAGUAUAUCCA 654
287373.1 uL96 gscsa GCCG
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- gsgsacagUfaUfAfUfccagccgau 55 asAfsucgg(Cgn)uggauaUfaCfuguc 355 UGGGACAGUAUAUCCAGCC 655
287374.1 uL96 cscsa GAUC AD- csasguauAfuCfCfAfgccgaucuu 56 asAfsagau(Cgn)ggcuggAfuAfuacu 356 GACAGUAUAUCCAGCCGAUC 656
287375.1 uL96 gsusc UUC AD- cscsaaggAfuGfAfAfgagauuacc 57 usGfsguaa(Tgn)cucuucAfuCfcuug 357 CACCAAGGAUGAAGAGAUU 657
287391.1 aL96 gsusg ACCA AD- csasaggaUfgAfAfGfagauuaccaa 58 usUfsggua(Agn)ucucuuCfaUfccuu 358 ACCAAGGAUGAAGAGAUUA 658
287392.1 L96 gsgsu CCAA AD- ususugagGfuCfAfAfcauccuagg 59 usCfscuag(Ggn)auguugAfcCfucaa 359 CAUUUGAGGUCAACAUCCU 659
287406.1 aL96 asusg AGGA AD- usgsagguCfaAfCfAfuccuaggac 60 usGfsuccu(Agn)ggauguUfgAfccuc 360 UUUGAGGUCAACAUCCUAG 660
287407.1 aL96 asasa GACA AD- gsasggucAfaCfAfUfccuaggaca 61 asUfsgucc(Tgn)aggaugUfuGfaccu 361 UUGAGGUCAACAUCCUAGG 661
287408.1 uL96 csasa ACAU AD- gsgsucaaCfaUfCfCfuaggacauuu 62 asAfsaugu(Cgn)cuaggaUfgUfugac 362 GAGGUCAACAUCCUAGGAC 662
287410.1 L96 csusc AUUU 317 / 395 AD- gsuscaacAfuCfCfUfaggacauuu 63 asAfsaaug(Tgn)ccuaggAfuGfuuga 363 AGGUCAACAUCCUAGGACA 663
287411.1 uL96 cscsu UUUU AD- ascsauccUfaGfGfAfcauuuuugg 64 usCfscaaa(Agn)auguccUfaGfgaug 364 CAACAUCCUAGGACAUUUU 664
287413.1 aL96 ususg UGGA AD- csasuccuAfgGfAfCfauuuuugga 65 asUfsccaa(Agn)aaugucCfuAfggau 365 AACAUCCUAGGACAUUUUU 665
287414.1 uL96 gsusu GGAU AD- uscscuagGfaCfAfUfuuuuggauc 66 usGfsaucc(Agn)aaaaugUfcCfuagg 366 CAUCCUAGGACAUUUUUGG 666
287415.1 aL96 asusg AUCA AD- asgsgacaUfuUfUfUfggaucacaaa 67 usUfsugug(Agn)uccaaaAfaUfgucc 367 CUAGGACAUUUUUGGAUCA 667
287418.1 L96 usasg CAAA AD- gsgsacauUfuUfUfGfgaucacaaaa 68 usUfsuugu(Ggn)auccaaAfaAfuguc 368 UAGGACAUUUUUGGAUCAC 668
287419.1 L96 csusa AAAA AD- ususuuugGfaUfCfAfcaaaagcac 69 asGfsugcu(Tgn)uugugaUfcCfaaaa 369 CAUUUUUGGAUCACAAAAG 669
287421.1 uL96 asusg CACU AD- usgsgaucAfcAfAfAfagcacuucu 70 asAfsgaag(Tgn)gcuuuuGfuGfaucc 370 UUUGGAUCACAAAAGCACU 670
287424.1 uL96 asasa UCUU AD- csasaaagCfaCfUfUfcuuccaucga 71 usCfsgaug(Ggn)aagaagUfgCfuuuu 371 CACAAAAGCACUUCUUCCAU 671
287427.1 L96 gsusg CGA AD- asasaagcAfcUfUfCfuuccaucgau 72 asUfscgau(Ggn)gaagaaGfuGfcuuu 372 ACAAAAGCACUUCUUCCAUC 672
287428.1 L96 usgsu GAU
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asasgcacUfuCfUfUfccaucgauga 73 usCfsaucg(Agn)uggaagAfaGfugcu 373 AAAAGCACUUCUUCCAUCGA 673
287429.1 L96 ususu UGA AD- asgscacuUfcUfUfCfcaucgaugau 74 asUfscauc(Ggn)auggaaGfaAfgugc 374 AAAGCACUUCUUCCAUCGAU 674
287430.1 L96 ususu GAU AD- gsgsagagAfaAfUfCfauggccaca 75 asUfsgugg(Cgn)caugauUfuCfucuc 375 AUGGAGAGAAAUCAUGGCC 675
287441.1 uL96 csasu ACAU AD- ascscaagGfaUfGfAfagagauuacu 76 asGfsuaau(Cgn)ucuucaUfcCfuugg 376 GCACCAAGGAUGAAGAGAU 676
287453.1 L96 usgsc UACC AD- asgsacauUfuGfAfGfgucaacauc 77 asGfsaugu(Tgn)gaccucAfaAfuguc 377 CAAGACAUUUGAGGUCAAC 677
287462.1 uL96 ususg AUCC AD- csasuuugAfgGfUfCfaacauccua 78 asUfsagga(Tgn)guugacCfuCfaaau 378 GACAUUUGAGGUCAACAUC 678
287463.1 uL96 gsusc CUAG AD- asusuugaGfgUfCfAfacauccuag 79 asCfsuagg(Agn)uguugaCfcUfcaaa 379 ACAUUUGAGGUCAACAUCC 679
287464.1 uL96 usgsu UAGG AD- ususgaggUfcAfAfCfauccuagga 80 asUfsccua(Ggn)gauguuGfaCfcuca 380 AUUUGAGGUCAACAUCCUA 680
287465.1 uL96 asasu GGAC 318 / 395 AD- csasacauCfcUfAfGfgacauuuuu 81 csAfsaaaa(Tgn)guccuaGfgAfuguu 381 GUCAACAUCCUAGGACAUU 681
287466.1 gL96 gsasc UUUG AD- asascaucCfuAfGfGfacauuuuug 82 asCfsaaaa(Agn)uguccuAfgGfaugu 382 UCAACAUCCUAGGACAUUU 682
287467.1 uL96 usgsa UUGG AD- asusccuaGfgAfCfAfuuuuuggau 83 asAfsucca(Agn)aaauguCfcUfagga 383 ACAUCCUAGGACAUUUUUG 683
287468.1 uL96 usgsu GAUC AD- cscsuaggAfcAfUfUfuuuggauca 84 asUfsgauc(Cgn)aaaaauGfuCfcuag 384 AUCCUAGGACAUUUUUGGA 684
287469.1 uL96 gsasu UCAC AD- gsascauuUfuUfGfGfaucacaaaau 85 asUfsuuug(Tgn)gauccaAfaAfaugu 385 AGGACAUUUUUGGAUCACA 685
287470.1 L96 cscsu AAAG AD- gsgsaucaCfaAfAfAfgcacuucuu 86 asAfsagaa(Ggn)ugcuuuUfgUfgauc 386 UUGGAUCACAAAAGCACUU 686
287474.1 uL96 csasa CUUC AD- csascaaaAfgCfAfCfuucuuccauu 87 asAfsugga(Agn)gaagugCfuUfuugu 387 AUCACAAAAGCACUUCUUCC 687
287476.1 L96 gsasu AUC AD- ascsaaaaGfcAfCfUfucuuccaucu 88 asGfsaugg(Agn)agaaguGfcUfuuug 388 UCACAAAAGCACUUCUUCCA 688
287477.1 L96 usgsa UCG AD- asasagcaCfuUfCfUfuccaucgauu 89 asAfsucga(Tgn)ggaagaAfgUfgcuu 389 CAAAAGCACUUCUUCCAUCG 689
287478.1 L96 ususg AUG AD- gscsacuuCfuUfCfCfaucgaugau 90 asAfsucau(Cgn)gauggaAfgAfagug 390 AAGCACUUCUUCCAUCGAUG 690
287479.1 uL96 csusu AUG
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asgsaaauCfaUfGfGfccacaucguu 91 asAfscgau(Ggn)uggccaUfgAfuuuc 391 AGAGAAAUCAUGGCCACAU 691
287491.1 L96 uscsu CGUC AD- asasaucaUfgGfCfCfacaucgucau 92 asUfsgacg(Agn)uguggcCfaUfgauu 392 AGAAAUCAUGGCCACAUCG 692
287492.1 L96 uscsu UCAC AD- ususccuuAfcCfUfCfaucccauauu 93 asAfsuaug(Ggn)gaugagGfuAfagga 393 GAUUCCUUACCUCAUCCCAU 693
287517.1 L96 asusc AUU AD- ascscucaUfcCfCfAfuauuguucca 94 usGfsgaac(Agn)auauggGfaUfgagg 394 UUACCUCAUCCCAUAUUGUU 694
287520.1 L96 usasa CCA AD- uscsauccCfaUfAfUfuguuccagca 95 usGfscugg(Agn)acaauaUfgGfgaug 395 CCUCAUCCCAUAUUGUUCCA 695
287521.1 L96 asgsg GCA AD- csasucccAfuAfUfUfguuccagcaa 96 usUfsgcug(Ggn)aacaauAfuGfggau 396 CUCAUCCCAUAUUGUUCCAG 696
287522.1 L96 gsasg CAA AD- uscsccauAfuUfGfUfuccagcaaau 97 asUfsuugc(Tgn)ggaacaAfuAfuggg 397 CAUCCCAUAUUGUUCCAGCA 697
287524.1 L96 asusg AAU AD- cscscauaUfuGfUfUfccagcaaauu 98 asAfsuuug(Cgn)uggaacAfaUfaugg 398 AUCCCAUAUUGUUCCAGCAA 698
287525.1 L96 gsasu AUU 319 / 395 AD- usgsuuggCfuUfUfCfacagagguc 99 asGfsaccu(Cgn)ugugaaAfgCfcaaca 399 GCUGUUGGCUUUCACAGAG 699
287537.1 uL96 sgsc GUCU AD- gsgscuuuCfaCfAfGfaggucugac 100 usGfsucag(Agn)ccucugUfgAfaagc 400 UUGGCUUUCACAGAGGUCU 700
287539.1 aL96 csasa GACA AD- gscsuuucAfcAfGfAfggucugaca 101 asUfsguca(Ggn)accucuGfuGfaaag 401 UGGCUUUCACAGAGGUCUG 701
287540.1 uL96 cscsa ACAU AD- csascagaGfgUfCfUfgacaucagaa 102 usUfscuga(Tgn)gucagaCfcUfcugu 402 UUCACAGAGGUCUGACAUC 702
287543.1 L96 gsasa AGAA AD- asgsgucuGfaCfAfUfcagaacuuca 103 usGfsaagu(Tgn)cugaugUfcAfgacc 403 AGAGGUCUGACAUCAGAAC 703
287546.1 L96 uscsu UUCA AD- uscscuuaCfcUfCfAfucccauauuu 104 asAfsauau(Ggn)ggaugaGfgUfaagg 404 AUUCCUUACCUCAUCCCAUA 704
287568.1 L96 asasu UUG AD- ususcacaGfaGfGfUfcugacaucau 105 asUfsgaug(Tgn)cagaccUfcUfguga 405 CUUUCACAGAGGUCUGACA 705
287591.1 L96 asasg UCAG AD- ususgggaAfaAfAfCfugguaucaa 106 usUfsugau(Agn)ccaguuUfuUfccca 406 CCUUGGGAAAAACUGGUAU 706
287610.1 aL96 asgsg CAAA AD- ascsugguAfuCfAfAfaaccucaug 107 asCfsauga(Ggn)guuuugAfuAfccag 407 AAACUGGUAUCAAAACCUC 707
287615.1 uL96 ususu AUGU AD- usgsguauCfaAfAfAfccucauguc 108 asGfsacau(Ggn)agguuuUfgAfuacc 408 ACUGGUAUCAAAACCUCAU 708
287616.1 uL96 asgsu GUCU
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- csuscugcCfcAfGfUfuuuugugaa 109 asUfsucac(Agn)aaaacuGfgGfcaga 409 GUCUCUGCCCAGUUUUUGU 709
287627.1 uL96 gsasc GAAU AD- ususuuugUfgAfAfUfacuggguuc 110 usGfsaacc(Cgn)aguauuCfaCfaaaaa 410 AGUUUUUGUGAAUACUGGG 710
287632.1 aL96 scsu UUCA AD- ususgugaAfuAfCfUfggguucacc 111 usGfsguga(Agn)cccaguAfuUfcaca 411 UUUUGUGAAUACUGGGUUC 711
287633.1 aL96 asasa ACCA AD- usgsugaaUfaCfUfGfgguucacca 112 usUfsggug(Agn)acccagUfaUfucac 412 UUUGUGAAUACUGGGUUCA 712
287634.1 aL96 asasa CCAA AD- usgsaauaCfuGfGfGfuucaccaaaa 113 usUfsuugg(Tgn)gaacccAfgUfauuc 413 UGUGAAUACUGGGUUCACC 713
287636.1 L96 ascsa AAAA AD- gsasauacUfgGfGfUfucaccaaaaa 114 usUfsuuug(Ggn)ugaaccCfaGfuauu 414 GUGAAUACUGGGUUCACCA 714
287637.1 L96 csasc AAAA AD- asasuacuGfgGfUfUfcaccaaaaau 115 asUfsuuuu(Ggn)gugaacCfcAfguau 415 UGAAUACUGGGUUCACCAA 715
287638.1 L96 uscsa AAAU AD- asasaaauCfcAfAfGfcacaagauua 116 usAfsaucu(Tgn)gugcuuGfgAfuuuu 416 CCAAAAAUCCAAGCACAAGA 716
287647.1 L96 usgsg UUA 320 / 395 AD- asasaaucCfaAfGfCfacaagauuau 117 asUfsaauc(Tgn)ugugcuUfgGfauuu 417 CAAAAAUCCAAGCACAAGA 717
287648.1 L96 ususg UUAU AD- asgscacaAfgAfUfUfauggccugu 118 usAfscagg(Cgn)cauaauCfuUfgugc 418 CAAGCACAAGAUUAUGGCC 718
287651.1 aL96 ususg UGUA AD- gscsacaaGfaUfUfAfuggccugua 119 asUfsacag(Ggn)ccauaaUfcUfugug 419 AAGCACAAGAUUAUGGCCU 719
287652.1 uL96 csusu GUAU AD- csascaagAfuUfAfUfggccuguau 120 asAfsuaca(Ggn)gccauaAfuCfuugu 420 AGCACAAGAUUAUGGCCUG 720
287653.1 uL96 gscsu UAUU AD- asasgauuAfuGfGfCfcuguauugg 121 usCfscaau(Agn)caggccAfuAfaucu 421 ACAAGAUUAUGGCCUGUAU 721
287654.1 aL96 usgsu UGGA AD- gsasuuauGfgCfCfUfguauuggag 122 usCfsucca(Agn)uacaggCfcAfuaau 422 AAGAUUAUGGCCUGUAUUG 722
287655.1 aL96 csusu GAGA AD- ususauggCfcUfGfUfauuggagac 123 usGfsucuc(Cgn)aauacaGfgCfcauaa 423 GAUUAUGGCCUGUAUUGGA 723
287656.1 aL96 susc GACA AD- usgsgccuGfuAfUfUfggagacaga 124 asUfscugu(Cgn)uccaauAfcAfggcc 424 UAUGGCCUGUAUUGGAGAC 724
287658.1 uL96 asusa AGAU AD- gscscuguAfuUfGfGfagacagaug 125 usCfsaucu(Ggn)ucuccaAfuAfcagg 425 UGGCCUGUAUUGGAGACAG 725
287659.1 aL96 cscsa AUGA AD- csusgguaUfcAfAfAfaccucaugu 126 asAfscaug(Agn)gguuuuGfaUfacca 426 AACUGGUAUCAAAACCUCA 726
287679.1 uL96 gsusu UGUC
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- gsgsuaucAfaAfAfCfcucaugucu 127 asAfsgaca(Tgn)gagguuUfuGfauac 427 CUGGUAUCAAAACCUCAUG 727
287680.1 uL96 csasg UCUC AD- uscsaaaaCfcUfCfAfugucucugcu 128 asGfscaga(Ggn)acaugaGfgUfuuug 428 UAUCAAAACCUCAUGUCUCU 728
287683.1 L96 asusa GCC AD- cscscaguUfuUfUfGfugaauacug 129 asCfsagua(Tgn)ucacaaAfaAfcuggg 429 UGCCCAGUUUUUGUGAAUA 729
287690.1 uL96 scsa CUGG AD- ususuuguGfaAfUfAfcuggguuca 130 asUfsgaac(Cgn)caguauUfcAfcaaaa 430 GUUUUUGUGAAUACUGGGU 730
287693.1 uL96 sasc UCAC AD- ususugugAfaUfAfCfuggguucac 131 asGfsugaa(Cgn)ccaguaUfuCfacaaa 431 UUUUUGUGAAUACUGGGUU 731
287694.1 uL96 sasa CACC AD- asusacugGfgUfUfCfaccaaaaauu 132 asAfsuuuu(Tgn)ggugaaCfcCfagua 432 GAAUACUGGGUUCACCAAA 732
287695.1 L96 ususc AAUC AD- usascuggGfuUfCfAfccaaaaaucu 133 asGfsauuu(Tgn)uggugaAfcCfcagu 433 AAUACUGGGUUCACCAAAA 733
287696.1 L96 asusu AUCC AD- csasccaaAfaAfUfCfcaagcacaau 134 asUfsugug(Cgn)uuggauUfuUfugg 434 UUCACCAAAAAUCCAAGCAC 734
287700.1 L96 ugsasa AAG 321 / 395 AD- asasauccAfaGfCfAfcaagauuauu 135 asAfsuaau(Cgn)uugugcUfuGfgauu 435 AAAAAUCCAAGCACAAGAU 735
287701.1 L96 ususu UAUG AD- asasuccaAfgCfAfCfaagauuaugu 136 asCfsauaa(Tgn)cuugugCfuUfggau 436 AAAAUCCAAGCACAAGAUU 736
287702.1 L96 ususu AUGG AD- asusccaaGfcAfCfAfagauuaugg 137 asCfscaua(Agn)ucuuguGfcUfugga 437 AAAUCCAAGCACAAGAUUA 737
287703.1 uL96 ususu UGGC AD- uscscaagCfaCfAfAfgauuauggc 138 asGfsccau(Agn)aucuugUfgCfuugg 438 AAUCCAAGCACAAGAUUAU 738
287704.1 uL96 asusu GGCC AD- ascsaagaUfuAfUfGfgccuguauu 139 asAfsauac(Agn)ggccauAfaUfcuug 439 GCACAAGAUUAUGGCCUGU 739
287706.1 uL96 usgsc AUUG AD- csasagauUfaUfGfGfccuguauug 140 asCfsaaua(Cgn)aggccaUfaAfucuu 440 CACAAGAUUAUGGCCUGUA 740
287707.1 uL96 gsusg UUGG AD- asusuaugGfcCfUfGfuauuggaga 141 asUfscucc(Agn)auacagGfcCfauaau 441 AGAUUAUGGCCUGUAUUGG 741
287709.1 uL96 scsu AGAC AD- gsgsccugUfaUfUfGfgagacagau 142 asAfsucug(Tgn)cuccaaUfaCfaggcc 442 AUGGCCUGUAUUGGAGACA 742
287711.1 uL96 sasu GAUG AD- gsusaagaAfgUfCfUfgauagaugg 143 usCfscauc(Tgn)aucagaCfuUfcuuac 443 UCGUAAGAAGUCUGAUAGA 743
287724.1 aL96 sgsa UGGA AD- usasagaaGfuCfUfGfauagaugga 144 usUfsccau(Cgn)uaucagAfcUfucuu 444 CGUAAGAAGUCUGAUAGAU 744
287725.1 aL96 ascsg GGAA
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asasgaagUfcUfGfAfuagauggaa 145 asUfsucca(Tgn)cuaucaGfaCfuucuu 445 GUAAGAAGUCUGAUAGAUG 745
287726.1 uL96 sasc GAAU AD- asgsaaguCfuGfAfUfagauggaau 146 usAfsuucc(Agn)ucuaucAfgAfcuuc 446 UAAGAAGUCUGAUAGAUGG 746
287727.1 aL96 ususa AAUA AD- asasgucuGfaUfAfGfauggaauac 147 asGfsuauu(Cgn)caucuaUfcAfgacu 447 AGAAGUCUGAUAGAUGGAA 747
287728.1 uL96 uscsu UACU AD- asgsauggAfaUfAfCfuuaccaauaa 148 usUfsauug(Ggn)uaaguaUfuCfcauc 448 AUAGAUGGAAUACUUACCA 748
287735.1 L96 usasu AUAA AD- asusggaaUfaCfUfUfaccaauaaga 149 usCfsuuau(Tgn)gguaagUfaUfucca 449 AGAUGGAAUACUUACCAAU 749
287736.1 L96 uscsu AAGA AD- usgsgaauAfcUfUfAfccaauaagaa 150 usUfscuua(Tgn)ugguaaGfuAfuucc 450 GAUGGAAUACUUACCAAUA 750
287737.1 L96 asusc AGAA AD- gsgsaauaCfuUfAfCfcaauaagaaa 151 usUfsucuu(Agn)uugguaAfgUfauuc 451 AUGGAAUACUUACCAAUAA 751
287738.1 L96 csasu GAAA AD- gsasauacUfuAfCfCfaauaagaaaa 152 usUfsuucu(Tgn)auugguAfaGfuauu 452 UGGAAUACUUACCAAUAAG 752
287739.1 L96 cscsa AAAA 322 / 395 AD- asasuacuUfaCfCfAfauaagaaaau 153 asUfsuuuc(Tgn)uauuggUfaAfguau 453 GGAAUACUUACCAAUAAGA 753
287740.1 L96 uscsc AAAU AD- ususucuuCfcUfGfAfacgcgccuc 154 usGfsaggc(Ggn)cguucaGfgAfagaa 454 AGUUUCUUCCUGAACGCGCC 754
287778.1 aL96 ascsu UCA AD- gsasuuuuAfaAfUfCfguaugcaga 155 usUfscugc(Agn)uacgauUfuAfaaau 455 GCGAUUUUAAAUCGUAUGC 755
287793.1 aL96 csgsc AGAA AD- ususuuaaAfuCfGfUfaugcagaau 156 usAfsuucu(Ggn)cauacgAfuUfuaaa 456 GAUUUUAAAUCGUAUGCAG 756
287795.1 aL96 asusc AAUA AD- asasaucgUfaUfGfCfagaauauuca 157 usGfsaaua(Tgn)ucugcaUfaCfgauu 457 UUAAAUCGUAUGCAGAAUA 757
287798.1 L96 usasa UUCA AD- asuscguaUfgCfAfGfaauauucaa 158 asUfsugaa(Tgn)auucugCfaUfacga 458 AAAUCGUAUGCAGAAUAUU 758
287800.1 uL96 ususu CAAU AD- uscsguauGfcAfGfAfauauucaau 159 asAfsuuga(Agn)uauucuGfcAfuacg 459 AAUCGUAUGCAGAAUAUUC 759
287801.1 uL96 asusu AAUU AD- csgsuaugCfaGfAfAfuauucaauu 160 asAfsauug(Agn)auauucUfgCfauac 460 AUCGUAUGCAGAAUAUUCA 760
287802.1 uL96 gsasu AUUU AD- asusgcagAfaUfAfUfucaauuuga 161 usUfscaaa(Tgn)ugaauaUfuCfugca 461 GUAUGCAGAAUAUUCAAUU 761
287804.1 aL96 usasc UGAA AD- gsasagucUfgAfUfAfgauggaaua 162 asUfsauuc(Cgn)aucuauCfaGfacuu 462 AAGAAGUCUGAUAGAUGGA 762
287810.1 uL96 csusu AUAC
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- uscsugauAfgAfUfGfgaauacuua 163 asUfsaagu(Agn)uuccauCfuAfucag 463 AGUCUGAUAGAUGGAAUAC 763
287811.1 uL96 ascsu UUAC AD- gsasuggaAfuAfCfUfuaccaauaa 164 asUfsuauu(Ggn)guaaguAfuUfccau 464 UAGAUGGAAUACUUACCAA 764
287813.1 uL96 csusa UAAG AD- ascsagaaGfuUfUfCfuuccugaacu 165 asGfsuuca(Ggn)gaagaaAfcUfucug 465 CUACAGAAGUUUCUUCCUG 765
287837.1 L96 usasg AACG AD- asgsaaguUfuCfUfUfccugaacgc 166 asGfscguu(Cgn)aggaagAfaAfcuuc 466 ACAGAAGUUUCUUCCUGAA 766
287839.1 uL96 usgsu CGCG AD- asasguuuCfuUfCfCfugaacgcgc 167 asGfscgcg(Tgn)ucaggaAfgAfaacu 467 AGAAGUUUCUUCCUGAACG 767
287841.1 uL96 uscsu CGCC AD- gsusuucuUfcCfUfGfaacgcgccu 168 asAfsggcg(Cgn)guucagGfaAfgaaa 468 AAGUUUCUUCCUGAACGCGC 768
287842.1 uL96 csusu CUC AD- uscsuuccUfgAfAfCfgcgccucag 169 asCfsugag(Ggn)cgcguuCfaGfgaag 469 UUUCUUCCUGAACGCGCCUC 769
287844.1 uL96 asasa AGC AD- gscsagaaUfaUfUfCfaauuugaag 170 asCfsuuca(Agn)auugaaUfaUfucug 470 AUGCAGAAUAUUCAAUUUG 770
287854.1 uL96 csasu AAGC 323 / 395 AD- asasuauuCfaAfUfUfugaagcagu 171 asAfscugc(Tgn)ucaaauUfgAfauau 471 AGAAUAUUCAAUUUGAAGC 771
287856.1 uL96 uscsu AGUG AD- usasuucaAfuUfUfGfaagcagugg 172 asCfscacu(Ggn)cuucaaAfuUfgaau 472 AAUAUUCAAUUUGAAGCAG 772
287857.1 uL96 asusu UGGU AD- gsasuguaUfgCfAfUfgauaaugau 173 usAfsucau(Tgn)aucaugCfaUfacauc 473 GAGAUGUAUGCAUGAUAAU 773
287893.1 aL96 susc GAUA AD- csasaugcUfgCfAfAfagcuuuauu 174 asAfsauaa(Agn)gcuuugCfaGfcauu 474 AUCAAUGCUGCAAAGCUUU 774
287917.1 uL96 gsasu AUUU AD- asasagcuUfuAfUfUfucacauuuu 175 asAfsaaau(Ggn)ugaaauAfaAfgcuu 475 GCAAAGCUUUAUUUCACAU 775
287924.1 uL96 usgsc UUUU AD- asasuuugAfaGfCfAfgugguuggc 176 asGfsccaa(Cgn)cacugcUfuCfaaauu 476 UCAAUUUGAAGCAGUGGUU 776
287934.1 uL96 sgsa GGCC AD- asasugcuGfcAfAfAfgcuuuauuu 177 gsAfsaaua(Agn)agcuuuGfcAfgcau 477 UCAAUGCUGCAAAGCUUUA 777
287969.1 cL96 usgsa UUUC AD- usgscugcAfaAfGfCfuuuauuuca 178 asUfsgaaa(Tgn)aaagcuUfuGfcagca 478 AAUGCUGCAAAGCUUUAUU 778
287970.1 uL96 susu UCAC AD- asasaaacAfuUfGfGfuuuggcacu 179 usAfsgugc(Cgn)aaaccaAfuGfuuuu 479 UUAAAAACAUUGGUUUGGC 779
287982.1 aL96 usasa ACUA AD- asgsauuaAfuUfAfCfcugucuucc 180 asGfsgaag(Agn)cagguaAfuUfaauc 480 CAAGAUUAAUUACCUGUCU 780
288005.1 uL96 ususg UCCU
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asusuaauUfaCfCfUfgucuuccug 181 asCfsagga(Agn)gacaggUfaAfuuaa 481 AGAUUAAUUACCUGUCUUC 781
288006.1 uL96 uscsu CUGU AD- usasauuaCfcUfGfUfcuuccuguu 182 asAfsacag(Ggn)aagacaGfgUfaauu 482 AUUAAUUACCUGUCUUCCU 782
288008.1 uL96 asasu GUUU AD- usasccugUfcUfUfCfcuguuucuc 183 usGfsagaa(Agn)caggaaGfaCfaggu 483 AUUACCUGUCUUCCUGUUUC 783
288010.1 aL96 asasu UCA AD- ascscuguCfuUfCfCfuguuucuca 184 usUfsgaga(Agn)acaggaAfgAfcagg 484 UUACCUGUCUUCCUGUUUCU 784
288011.1 aL96 usasa CAA AD- uscsuuccUfgUfUfUfcucaagaau 185 usAfsuucu(Tgn)gagaaaCfaGfgaag 485 UGUCUUCCUGUUUCUCAAG 785
288015.1 aL96 ascsa AAUA AD- ususuuccUfuUfCfAfugccucuua 186 usUfsaaga(Ggn)gcaugaAfaGfgaaa 486 GUUUUUCCUUUCAUGCCUCU 786
288046.1 aL96 asasc UAA AD- uscscuuuCfaUfGfCfcucuuaaaaa 187 usUfsuuua(Agn)gaggcaUfgAfaagg 487 UUUCCUUUCAUGCCUCUUAA 787
288049.1 L96 asasa AAA AD- csusuucaUfgCfCfUfcuuaaaaacu 188 asGfsuuuu(Tgn)aagaggCfaUfgaaa 488 UCCUUUCAUGCCUCUUAAAA 788
288050.1 L96 gsgsa ACU 324 / 395 AD- asasaacaUfuGfGfUfuuggcacua 189 asUfsagug(Cgn)caaaccAfaUfguuu 489 UAAAAACAUUGGUUUGGCA 789
288076.1 uL96 ususa CUAG AD- gsasuuaaUfuAfCfCfugucuuccu 190 asAfsggaa(Ggn)acagguAfaUfuaau 490 AAGAUUAAUUACCUGUCUU 790
288092.1 uL96 csusu CCUG AD- ususaccuGfuCfUfUfccuguuucu 191 asAfsgaaa(Cgn)aggaagAfcAfggua 491 AAUUACCUGUCUUCCUGUU 791
288094.1 uL96 asusu UCUC AD- cscsugucUfuCfCfUfguuucucaa 192 asUfsugag(Agn)aacaggAfaGfacag 492 UACCUGUCUUCCUGUUUCUC 792
288095.1 uL96 gsusa AAG AD- gsgsucugUfuUfUfUfccuuucaug 193 asCfsauga(Agn)aggaaaAfaCfagacc 493 UAGGUCUGUUUUUCCUUUC 793
288108.1 uL96 susa AUGC AD- gsuscuguUfuUfUfCfcuuucaugc 194 asGfscaug(Agn)aaggaaAfaAfcaga 494 AGGUCUGUUUUUCCUUUCA 794
288109.1 uL96 cscsu UGCC AD- ususauuuAfcAfCfAfgggaagguu 195 asAfsaccu(Tgn)cccuguGfuAfaauaa 495 ACUUAUUUACACAGGGAAG 795
288173.1 uL96 sgsu GUUU AD- usasuuuaCfaCfAfGfggaagguuu 196 usAfsaacc(Tgn)ucccugUfgUfaaaua 496 CUUAUUUACACAGGGAAGG 796
288174.1 aL96 sasg UUUA AD- ususacacAfgGfGfAfagguuuaag 197 usCfsuuaa(Agn)ccuuccCfuGfugua 497 AUUUACACAGGGAAGGUUU 797
288176.1 aL96 asasu AAGA AD- ascsacagGfgAfAfGfguuuaagac 198 asGfsucuu(Agn)aaccuuCfcCfugug 498 UUACACAGGGAAGGUUUAA 798
288177.1 uL96 usasa GACU
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- gsgsgaagGfuUfUfAfagacuguuc 199 usGfsaaca(Ggn)ucuuaaAfcCfuucc 499 CAGGGAAGGUUUAAGACUG 799
288180.1 aL96 csusg UUCA AD- gsgsaaggUfuUfAfAfgacuguuca 200 usUfsgaac(Agn)gucuuaAfaCfcuuc 500 AGGGAAGGUUUAAGACUGU 800
288181.1 aL96 cscsu UCAA AD- asgsguuuAfaGfAfCfuguucaagu 201 usAfscuug(Agn)acagucUfuAfaacc 501 GAAGGUUUAAGACUGUUCA 801
288183.1 aL96 ususc AGUA AD- ususuaagAfcUfGfUfucaaguagc 202 usGfscuac(Tgn)ugaacaGfuCfuuaaa 502 GGUUUAAGACUGUUCAAGU 802
288184.1 aL96 scsc AGCA AD- usasagacUfgUfUfCfaaguagcau 203 asAfsugcu(Agn)cuugaaCfaGfucuu 503 UUUAAGACUGUUCAAGUAG 803
288186.1 uL96 asasa CAUU AD- gsascuguUfcAfAfGfuagcauucc 204 usGfsgaau(Ggn)cuacuuGfaAfcagu 504 AAGACUGUUCAAGUAGCAU 804
288187.1 aL96 csusu UCCA AD- ascsuguuCfaAfGfUfagcauuccaa 205 usUfsggaa(Tgn)gcuacuUfgAfacag 505 AGACUGUUCAAGUAGCAUU 805
288188.1 L96 uscsu CCAA AD- csusguucAfaGfUfAfgcauuccaa 206 asUfsugga(Agn)ugcuacUfuGfaaca 506 GACUGUUCAAGUAGCAUUC 806
288189.1 uL96 gsusc CAAU 325 / 395 AD- gsusucaaGfuAfGfCfauuccaauc 207 asGfsauug(Ggn)aaugcuAfcUfugaa 507 CUGUUCAAGUAGCAUUCCA 807
288190.1 uL96 csasg AUCU AD- csasaguaGfcAfUfUfccaaucugua 208 usAfscaga(Tgn)uggaauGfcUfacuu 508 UUCAAGUAGCAUUCCAAUC 808
288192.1 L96 gsasa UGUA AD- usasgcauUfcCfAfAfucuguagcc 209 usGfsgcua(Cgn)agauugGfaAfugcu 509 AGUAGCAUUCCAAUCUGUA 809
288193.1 aL96 ascsu GCCA AD- asgscauuCfcAfAfUfcuguagcca 210 asUfsggcu(Agn)cagauuGfgAfaugc 510 GUAGCAUUCCAAUCUGUAG 810
288194.1 uL96 usasc CCAU AD- asascuuaUfuUfAfCfacagggaag 211 asCfsuucc(Cgn)uguguaAfaUfaagu 511 AGAACUUAUUUACACAGGG 811
288227.1 uL96 uscsu AAGG AD- usascacaGfgGfAfAfgguuuaaga 212 asUfscuua(Agn)accuucCfcUfgugu 512 UUUACACAGGGAAGGUUUA 812
288229.1 uL96 asasa AGAC AD- csascaggGfaAfGfGfuuuaagacu 213 asAfsgucu(Tgn)aaaccuUfcCfcugu 513 UACACAGGGAAGGUUUAAG 813
288230.1 uL96 gsusa ACUG AD- asgsggaaGfgUfUfUfaagacuguu 214 asAfsacag(Tgn)cuuaaaCfcUfucccu 514 ACAGGGAAGGUUUAAGACU 814
288231.1 uL96 sgsu GUUC AD- gsasagguUfuAfAfGfacuguucaa 215 asUfsugaa(Cgn)agucuuAfaAfccuu 515 GGGAAGGUUUAAGACUGUU 815
288232.1 uL96 cscsc CAAG AD- gsgsuuuaAfgAfCfUfguucaagua 216 asUfsacuu(Ggn)aacaguCfuUfaaacc 516 AAGGUUUAAGACUGUUCAA 816
288233.1 uL96 susu GUAG
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asasgacuGfuUfCfAfaguagcauu 217 asAfsaugc(Tgn)acuugaAfcAfgucu 517 UUAAGACUGUUCAAGUAGC 817
288235.1 uL96 usasa AUUC AD- asgsacugUfuCfAfAfguagcauuc 218 asGfsaaug(Cgn)uacuugAfaCfaguc 518 UAAGACUGUUCAAGUAGCA 818
288236.1 uL96 ususa UUCC AD- usgsuucaAfgUfAfGfcauuccaau 219 asAfsuugg(Agn)augcuaCfuUfgaac 519 ACUGUUCAAGUAGCAUUCC 819
288237.1 uL96 asgsu AAUC AD- ususcaagUfaGfCfAfuuccaaucu 220 asAfsgauu(Ggn)gaaugcUfaCfuuga 520 UGUUCAAGUAGCAUUCCAA 820
288238.1 uL96 ascsa UCUG AD- gscsagcuUfuAfUfCfucaaccugg 221 usCfscagg(Tgn)ugagauAfaAfgcug 521 AGGCAGCUUUAUCUCAACCU 821
288290.1 aL96 cscsu GGA AD- asgscauuUfgAfAfAfgauuucccu 222 usAfsggga(Agn)aucuuuCfaAfaugc 522 UCAGCAUUUGAAAGAUUUC 822
288316.1 aL96 usgsa CCUA AD- usgsaaagAfuUfUfCfccuagccuc 223 asGfsaggc(Tgn)agggaaAfuCfuuuc 523 UUUGAAAGAUUUCCCUAGC 823
288318.1 uL96 asasa CUCU AD- gsasaagaUfuUfCfCfcuagccucuu 224 asAfsgagg(Cgn)uagggaAfaUfcuuu 524 UUGAAAGAUUUCCCUAGCC 824
288319.1 L96 csasa UCUU 326 / 395 AD- ususcccuAfgCfCfUfcuuccuuuu 225 asAfsaaag(Ggn)aagaggCfuAfggga 525 AUUUCCCUAGCCUCUUCCUU 825
288324.1 uL96 asasu UUU AD- asasgaacAfcAfGfAfaugagugca 226 asUfsgcac(Tgn)cauucuGfuGfuucu 526 ACAAGAACACAGAAUGAGU 826
288337.1 uL96 usgsu GCAC AD- gsasacacAfgAfAfUfgagugcaca 227 asUfsgugc(Agn)cucauuCfuGfuguu 527 AAGAACACAGAAUGAGUGC 827
288338.1 uL96 csusu ACAG AD- asascacaGfaAfUfGfagugcacagu 228 asCfsugug(Cgn)acucauUfcUfgugu 528 AGAACACAGAAUGAGUGCA 828
288339.1 L96 uscsu CAGC AD- csasgaauGfaGfUfGfcacagcuaau 229 asUfsuagc(Tgn)gugcacUfcAfuucu 529 CACAGAAUGAGUGCACAGC 829
288340.1 L96 gsusg UAAG AD- gsasaugaGfuGfCfAfcagcuaaga 230 asUfscuua(Ggn)cugugcAfcUfcauu 530 CAGAAUGAGUGCACAGCUA 830
288341.1 uL96 csusg AGAG AD- ususcagcAfuUfUfGfaaagauuuc 231 asGfsaaau(Cgn)uuucaaAfuGfcuga 531 GAUUCAGCAUUUGAAAGAU 831
288366.1 uL96 asusc UUCC AD- csasuuugAfaAfGfAfuuucccuag 232 asCfsuagg(Ggn)aaaucuUfuCfaaau 532 AGCAUUUGAAAGAUUUCCC 832
288369.1 uL96 gscsu UAGC AD- asusuugaAfaGfAfUfuucccuagc 233 asGfscuag(Ggn)gaaaucUfuUfcaaa 533 GCAUUUGAAAGAUUUCCCU 833
288370.1 uL96 usgsc AGCC AD- asasaacgGfuGfCfAfacucuauucu 234 asGfsaaua(Ggn)aguugcAfcCfguuu 534 CCAAAACGGUGCAACUCUAU 834
288391.1 L96 usgsg UCU
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- gsgsugcaAfcUfCfUfauucuggac 235 asGfsucca(Ggn)aauagaGfuUfgcac 535 ACGGUGCAACUCUAUUCUG 835
288393.1 uL96 csgsu GACU AD- gsusgcaaCfuCfUfAfuucuggacu 236 asAfsgucc(Agn)gaauagAfgUfugca 536 CGGUGCAACUCUAUUCUGG 836
288394.1 uL96 cscsg ACUU AD- usgscaacUfcUfAfUfucuggacuu 237 asAfsaguc(Cgn)agaauaGfaGfuugc 537 GGUGCAACUCUAUUCUGGA 837
288395.1 uL96 ascsc CUUU AD- gscsaacuCfuAfUfUfcuggacuuu 238 usAfsaagu(Cgn)cagaauAfgAfguug 538 GUGCAACUCUAUUCUGGAC 838
288396.1 aL96 csasc UUUA AD- csasacucUfaUfUfCfuggacuuua 239 asUfsaaag(Tgn)ccagaaUfaGfaguug 539 UGCAACUCUAUUCUGGACU 839
288397.1 uL96 scsa UUAU AD- asascucuAfuUfCfUfggacuuuau 240 asAfsuaaa(Ggn)uccagaAfuAfgagu 540 GCAACUCUAUUCUGGACUU 840
288398.1 uL96 usgsc UAUU AD- asusucugGfaCfUfUfuauuacuug 241 usCfsaagu(Agn)auaaagUfcCfagaa 541 CUAUUCUGGACUUUAUUAC 841
288402.1 aL96 usasg UUGA AD- asgsuccaCfcAfAfAfaguggacccu 242 asGfsgguc(Cgn)acuuuuGfgUfggac 542 GAAGUCCACCAAAAGUGGA 842
288427.1 L96 ususc CCCU 327 / 395 AD- csasccaaAfaGfUfGfgacccucuau 243 asUfsagag(Ggn)guccacUfuUfuggu 543 UCCACCAAAAGUGGACCCUC 843
288430.1 L96 gsgsa UAU AD- ascscaaaAfgUfGfGfacccucuaua 244 usAfsuaga(Ggn)gguccaCfuUfuugg 544 CCACCAAAAGUGGACCCUCU 844
288431.1 L96 usgsg AUA AD- cscsaaaaGfuGfGfAfcccucuauau 245 asUfsauag(Agn)ggguccAfcUfuuug 545 CACCAAAAGUGGACCCUCUA 845
288432.1 L96 gsusg UAU AD- csasaaagUfgGfAfCfccucuauauu 246 asAfsuaua(Ggn)agggucCfaCfuuuu 546 ACCAAAAGUGGACCCUCUAU 846
288433.1 L96 gsgsu AUU AD- asasaaguGfgAfCfCfcucuauauu 247 asAfsauau(Agn)gaggguCfcAfcuuu 547 CCAAAAGUGGACCCUCUAUA 847
288434.1 uL96 usgsg UUU AD- asasacggUfgCfAfAfcucuauucu 248 asAfsgaau(Agn)gaguugCfaCfcguu 548 CAAAACGGUGCAACUCUAU 848
288466.1 uL96 ususg UCUG AD- asascgguGfcAfAfCfucuauucug 249 asCfsagaa(Tgn)agaguuGfcAfccgu 549 AAAACGGUGCAACUCUAUU 849
288467.1 uL96 ususu CUGG AD- usasuucuGfgAfCfUfuuauuacuu 250 asAfsagua(Agn)uaaaguCfcAfgaau 550 UCUAUUCUGGACUUUAUUA 850
288470.1 uL96 asgsa CUUG AD- asasagugGfaCfCfCfucuauauuuc 251 gsAfsaaua(Tgn)agagggUfcCfacuu 551 CAAAAGUGGACCCUCUAUA 851
288491.1 L96 ususg UUUC AD- asasguggAfcCfCfUfcuauauuuc 252 asGfsaaau(Agn)uagaggGfuCfcacu 552 AAAAGUGGACCCUCUAUAU 852
288492.1 uL96 ususu UUCC
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asusguuuAfgAfCfAfauuuuaggc 253 asGfsccua(Agn)aauuguCfuAfaaca 553 AGAUGUUUAGACAAUUUUA 853
288561.1 uL96 uscsu GGCU AD- gsusuuagAfcAfAfUfuuuaggcuc 254 usGfsagcc(Tgn)aaaauuGfuCfuaaac 554 AUGUUUAGACAAUUUUAGG 854
288562.1 aL96 sasu CUCA AD- ususuagaCfaAfUfUfuuaggcuca 255 usUfsgagc(Cgn)uaaaauUfgUfcuaa 555 UGUUUAGACAAUUUUAGGC 855
288563.1 aL96 ascsa UCAA AD- ususagacAfaUfUfUfuaggcucaa 256 usUfsugag(Cgn)cuaaaaUfuGfucua 556 GUUUAGACAAUUUUAGGCU 856
288564.1 aL96 asasc CAAA AD- usasgacaAfuUfUfUfaggcucaaaa 257 usUfsuuga(Ggn)ccuaaaAfuUfgucu 557 UUUAGACAAUUUUAGGCUC 857
288565.1 L96 asasa AAAA AD- asgsacaaUfuUfUfAfggcucaaaaa 258 usUfsuuug(Agn)gccuaaAfaUfuguc 558 UUAGACAAUUUUAGGCUCA 858
288566.1 L96 usasa AAAA AD- gsascaauUfuUfAfGfgcucaaaaau 259 asUfsuuuu(Ggn)agccuaAfaAfuugu 559 UAGACAAUUUUAGGCUCAA 859
288567.1 L96 csusa AAAU AD- ususaggcUfcAfAfAfaauuaaagc 260 asGfscuuu(Agn)auuuuuGfaGfccua 560 UUUUAGGCUCAAAAAUUAA 860
288572.1 uL96 asasa AGCU 328 / 395 AD- usasggcuCfaAfAfAfauuaaagcu 261 usAfsgcuu(Tgn)aauuuuUfgAfgccu 561 UUUAGGCUCAAAAAUUAAA 861
288573.1 aL96 asasa GCUA AD- asgsgcucAfaAfAfAfuuaaagcua 262 usUfsagcu(Tgn)uaauuuUfuGfagcc 562 UUAGGCUCAAAAAUUAAAG 862
288574.1 aL96 usasa CUAA AD- gscsucaaAfaAfUfUfaaagcuaaca 263 usGfsuuag(Cgn)uuuaauUfuUfugag 563 AGGCUCAAAAAUUAAAGCU 863
288575.1 L96 cscsu AACA AD- uscsaaaaAfuUfAfAfagcuaacaca 264 usGfsuguu(Agn)gcuuuaAfuUfuuu 564 GCUCAAAAAUUAAAGCUAA 864
288576.1 L96 gasgsc CACA AD- ususcauaUfaUfCfCfuugguccca 265 asUfsggga(Cgn)caaggaUfaUfauga 565 CUUUCAUAUAUCCUUGGUCC 865
288613.1 uL96 asasg CAG AD- gsasuguuUfaGfAfCfaauuuuagg 266 asCfscuaa(Agn)auugucUfaAfacau 566 GAGAUGUUUAGACAAUUUU 866
288620.1 uL96 csusc AGGC AD- gsgscucaAfaAfAfUfuaaagcuaa 267 asUfsuagc(Tgn)uuaauuUfuUfgagc 567 UAGGCUCAAAAAUUAAAGC 867
288624.1 uL96 csusa UAAC AD- csuscaaaAfaUfUfAfaagcuaacau 268 asUfsguua(Ggn)cuuuaaUfuUfuuga 568 GGCUCAAAAAUUAAAGCUA 868
288625.1 L96 gscsc ACAC AD- csasaaaaUfuAfAfAfgcuaacacau 269 asUfsgugu(Tgn)agcuuuAfaUfuuuu 569 CUCAAAAAUUAAAGCUAAC 869
288626.1 L96 gsasg ACAG AD- asasauuaAfaGfCfUfaacacaggaa 270 usUfsccug(Tgn)guuagcUfuUfaauu 570 AAAAAUUAAAGCUAACACA 870
288628.1 L96 ususu GGAA
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- usasacacAfgGfAfAfaaggaacug 271 asCfsaguu(Cgn)cuuuucCfuGfuguu 571 GCUAACACAGGAAAAGGAA 871
288634.1 uL96 asgsc CUGU AD- gsgsaaaaGfgAfAfCfuguacuggc 272 asGfsccag(Tgn)acaguuCfcUfuuucc 572 CAGGAAAAGGAACUGUACU 872
288637.1 uL96 susg GGCU AD- asasaaggAfaCfUfGfuacuggcua 273 asUfsagcc(Agn)guacagUfuCfcuuu 573 GGAAAAGGAACUGUACUGG 873
288639.1 uL96 uscsc CUAU AD- gsgsaacuGfuAfCfUfggcuauuac 274 usGfsuaau(Agn)gccaguAfcAfguuc 574 AAGGAACUGUACUGGCUAU 874
288642.1 aL96 csusu UACA AD- csasggaaAfaGfGfAfacuguacug 275 asCfsagua(Cgn)aguuccUfuUfuccu 575 CACAGGAAAAGGAACUGUA 875
288696.1 uL96 gsusg CUGG AD- asgsgaacUfgUfAfCfuggcuauua 276 asUfsaaua(Ggn)ccaguaCfaGfuucc 576 AAAGGAACUGUACUGGCUA 876
288698.1 uL96 ususu UUAC AD- csuscccaCfuAfCfAfucaagacuaa 277 usUfsaguc(Tgn)ugauguAfgUfggga 577 GACUCCCACUACAUCAAGAC 877
288912.1 L96 gsusc UAA AD- uscsccacUfaCfAfUfcaagacuaau 278 asUfsuagu(Cgn)uugaugUfaGfuggg 578 ACUCCCACUACAUCAAGACU 878
288913.1 L96 asgsu AAU 329 / 395 AD- cscsacuaCfaUfCfAfagacuaaucu 279 asGfsauua(Ggn)ucuugaUfgUfagug 579 UCCCACUACAUCAAGACUAA 879
288914.1 L96 gsgsa UCU AD- csascuacAfuCfAfAfgacuaaucuu 280 asAfsgauu(Agn)gucuugAfuGfuagu 580 CCCACUACAUCAAGACUAAU 880
288915.1 L96 gsgsg CUU AD- csusacauCfaAfGfAfcuaaucuug 281 asCfsaaga(Tgn)uagucuUfgAfugua 581 CACUACAUCAAGACUAAUCU 881
288916.1 uL96 gsusg UGU AD- usascaucAfaGfAfCfuaaucuugu 282 asAfscaag(Agn)uuagucUfuGfaugu 582 ACUACAUCAAGACUAAUCU 882
288917.1 uL96 asgsu UGUU AD- ascsaucaAfgAfCfUfaaucuuguu 283 asAfsacaa(Ggn)auuaguCfuUfgaug 583 CUACAUCAAGACUAAUCUU 883
288918.1 uL96 usasg GUUU AD- gsusguuuUfuCfAfCfauguauuau 284 usAfsuaau(Agn)caugugAfaAfaaca 584 GUGUGUUUUUCACAUGUAU 884
288933.1 aL96 csasc UAUA AD- uscsacauGfuAfUfUfauagaaugc 285 asGfscauu(Cgn)uauaauAfcAfugug 585 UUUCACAUGUAUUAUAGAA 885
288937.1 uL96 asasa UGCU AD- csascaugUfaUfUfAfuagaaugcu 286 asAfsgcau(Tgn)cuauaaUfaCfaugu 586 UUCACAUGUAUUAUAGAAU 886
288938.1 uL96 gsasa GCUU AD- gsusauuaUfaGfAfAfugcuuuugc 287 usGfscaaa(Agn)gcauucUfaUfaaua 587 AUGUAUUAUAGAAUGCUUU 887
288941.1 aL96 csasu UGCA AD- usasuagaAfuGfCfUfuuugcaugg 288 usCfscaug(Cgn)aaaagcAfuUfcuau 588 AUUAUAGAAUGCUUUUGCA 888
288943.1 aL96 asasu UGGA
Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência do mRNA alvo 5’ para SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NO: 3’ NO: AD- asgsaaugCfuUfUfUfgcauggacu 289 usAfsgucc(Agn)ugcaaaAfgCfauuc 589 AUAGAAUGCUUUUGCAUGG 889
288945.1 aL96 usasu ACUA AD- gsasaugcUfuUfUfGfcauggacua 290 asUfsaguc(Cgn)augcaaAfaGfcauu 590 UAGAAUGCUUUUGCAUGGA 890
288946.1 uL96 csusa CUAU AD- usgscuuuUfgCfAfUfggacuaucc 291 asGfsgaua(Ggn)uccaugCfaAfaagc 591 AAUGCUUUUGCAUGGACUA 891
288947.1 uL96 asusu UCCU AD- csusuuugCfaUfGfGfacuauccuc 292 asGfsagga(Tgn)aguccaUfgCfaaaag 592 UGCUUUUGCAUGGACUAUC 892
288948.1 uL96 scsa CUCU AD- ususgcauGfgAfCfUfauccucuug 293 asCfsaaga(Ggn)gauaguCfcAfugca 593 UUUUGCAUGGACUAUCCUC 893
288950.1 uL96 asasa UUGU AD- usgscaugGfaCfUfAfuccucuugu 294 asAfscaag(Agn)ggauagUfcCfaugc 594 UUUGCAUGGACUAUCCUCU 894
288951.1 uL96 asasa UGUU AD- gscsauggAfcUfAfUfccucuuguu 295 asAfsacaa(Ggn)aggauaGfuCfcaug 595 UUGCAUGGACUAUCCUCUU 895
288952.1 uL96 csasa GUUU AD- gsgsacuaUfcCfUfCfuuguuuuua 296 asUfsaaaa(Agn)caagagGfaUfagucc 596 AUGGACUAUCCUCUUGUUU 896
288956.1 uL96 sasu UUAU 330 / 395 AD- gsascuauCfcUfCfUfuguuuuuau 297 asAfsuaaa(Agn)acaagaGfgAfuagu 597 UGGACUAUCCUCUUGUUUU 897
288957.1 uL96 cscsa UAUU AD- csusauccUfcUfUfGfuuuuuauua 298 usUfsaaua(Agn)aaacaaGfaGfgaua 598 GACUAUCCUCUUGUUUUUA 898
288959.1 aL96 gsusc UUAA AD- cscscacuAfcAfUfCfaagacuaauu 299 asAfsuuag(Tgn)cuugauGfuAfgugg 599 CUCCCACUACAUCAAGACUA 899
288981.1 L96 gsasg AUC AD- ascsuacaUfcAfAfGfacuaaucuuu 300 asAfsagau(Tgn)agucuuGfaUfguag 600 CCACUACAUCAAGACUAAUC 900
288982.1 L96 usgsg UUG AD- asusgcuuUfuGfCfAfuggacuauc 301 asGfsauag(Tgn)ccaugcAfaAfagcau 601 GAAUGCUUUUGCAUGGACU 901
288996.1 uL96 susc AUCC * Alvo: HSD17B13
Tabela 8. Sequência não modificada de HSD17B13 ELF7 GNA7* Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-286958.1 AGUACCUCCUCCCUAGGACU 902 5-25 UAGUCCTAGGGAGGAGGUACUG 1202 3-25
A U AD-287001.1 UCCUUCUGCUUCUGAUCACC 903 85-105 UGGUGATCAGAAGCAGAAGGAU 1203 83-105
A U AD-287012.1 CAUCAUCUACUCCUACUUGG 904 104-124 UCCAAGTAGGAGUAGAUGAUGG 1204 102-124
A U AD-287015.1 CUACUCCUACUUGGAGUCGU 906 110-130 AACGACTCCAAGUAGGAGUAGA 1206 108-130
U U AD-287017.1 GUACCUCCUCCCUAGGACUA 907 6-26 AUAGUCCUAGGGAGGAGGUACU 1207 4-26
U G AD-287026.1 ACACAAGGACUGAACCAGAA 908 25-45 AUUCUGGUUCAGUCCUUGUGUA 1208 23-45
U G AD-287059.1 ACCAUCAUCUACUCCUACUU 909 102-122 AAAGUAGGAGUAGAUGAUGGUG 1209 100-122 331 / 395
U A AD-287060.1 CCAUCAUCUACUCCUACUUG 910 103-123 ACAAGUAGGAGUAGAUGAUGGU 1210 101-123
U G AD-287061.1 AUCAUCUACUCCUACUUGGA 911 105-125 AUCCAAGUAGGAGUAGAUGAUG 1211 103-125
U G AD-287062.1 CAUCUACUCCUACUUGGAGU 912 107-127 AACUCCAAGUAGGAGUAGAUGA 1212 105-127
U U AD-287064.1 UACUCCUACUUGGAGUCGUU 913 111-131 AAACGACUCCAAGUAGGAGUAG 1213 109-131
U A AD-287065.1 ACUCCUACUUGGAGUCGUUG 914 112-132 ACAACGACUCCAAGUAGGAGUA 1214 110-132
U G AD-287126.1 UCCUACUUGGAGUCGUUGG 916 114-134 AACCAACGACUCCAAGUAGGAG 1216 112-134
UU U AD-287203.1 GCAGCUGAGUGCCGAAAACU 920 294-314 UAGUUUTCGGCACUCAGCUGCA 1220 292-314
A G AD-287227.1 CUGUGGGAUAUUAAUAAGC 923 258-278 ACGCUUAUUAAUAUCCCACAGA 1223 256-278
GU A AD-287246.1 CUGCAGCUGAGUGCCGAAAA 924 292-312 AUUUUCGGCACUCAGCUGCAGU 1224 290-312
U U AD-287247.1 CAGCUGAGUGCCGAAAACUA 925 295-315 AUAGUUTUCGGCACUCAGCUGC 1225 293-315
U A
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287248.1 AGCUGAGUGCCGAAAACUA 926 296-316 ACUAGUTUUCGGCACUCAGCUG 1226 294-316
GU C AD-287249.1 GCUGAGUGCCGAAAACUAG 927 297-317 ACCUAGTUUUCGGCACUCAGCU 1227 295-317
GU G AD-287250.1 CUGAGUGCCGAAAACUAGGC 928 298-318 AGCCUAGUUUUCGGCACUCAGC 1228 296-318
U U AD-287251.1 GAGUGCCGAAAACUAGGCG 929 300-320 AACGCCTAGUUUUCGGCACUCA 1229 298-320
UU G AD-287252.1 GUGCCGAAAACUAGGCGUCA 930 302-322 AUGACGCCUAGUUUUCGGCACU 1230 300-322
U C AD-287253.1 GCCGAAAACUAGGCGUCACU 931 304-324 AAGUGACGCCUAGUUUUCGGCA 1231 302-324
U C AD-287254.1 CCGAAAACUAGGCGUCACUG 932 305-325 ACAGUGACGCCUAGUUUUCGGC 1232 303-325
U A AD-287258.1 ACUAGGCGUCACUGCGCAUG 933 311-331 ACAUGCGCAGUGACGCCUAGUU 1233 309-331 332 / 395
U U AD-287288.1 CUAUCGCUCUCUAAAUCAGG 935 365-385 ACCUGATUUAGAGAGCGAUAGA 1235 363-385
U U AD-287290.1 UCGCUCUCUAAAUCAGGUGA 937 368-388 UUCACCTGAUUUAGAGAGCGAU 1237 366-388
A A AD-287293.1 UCUCUAAAUCAGGUGAAGA 938 372-392 UUUCUUCACCUGAUUUAGAGAG 1238 370-392
AA C AD-287316.1 GUGGUGAAUAAUGCUGGGA 939 414-434 UGUCCCAGCAUUAUUCACCACG 1239 412-434
CA A AD-287320.1 GAAUAAUGCUGGGACAGUA 940 419-439 UAUACUGUCCCAGCAUUAUUCA 1240 417-439
UA C AD-287321.1 AAUAAUGCUGGGACAGUAU 941 420-440 AUAUACTGUCCCAGCAUUAUUC 1241 418-440
AU A AD-287324.1 GGGACAGUAUAUCCAGCCGA 942 429-449 AUCGGCTGGAUAUACUGUCCCA 1242 427-449
U G AD-287325.1 GACAGUAUAUCCAGCCGAUC 943 431-451 AGAUCGGCUGGAUAUACUGUCC 1243 429-451
U C AD-287326.1 ACAGUAUAUCCAGCCGAUCU 944 432-452 AAGAUCGGCUGGAUAUACUGUC 1244 430-452
U C AD-287327.1 AGUAUAUCCAGCCGAUCUUC 945 434-454 AGAAGATCGGCUGGAUAUACUG 1245 432-454
U U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287344.1 AUCUAUCGCUCUCUAAAUCA 946 363-383 AUGAUUTAGAGAGCGAUAGAUC 1246 361-383
U U AD-287346.1 UAUCGCUCUCUAAAUCAGGU 947 366-386 AACCUGAUUUAGAGAGCGAUAG 1247 364-386
U A AD-287347.1 CGCUCUCUAAAUCAGGUGAA 948 369-389 AUUCACCUGAUUUAGAGAGCGA 1248 367-389
U U AD-287366.1 CGUGGUGAAUAAUGCUGGG 949 413-433 AUCCCAGCAUUAUUCACCACGA 1249 411-433
AU U AD-287367.1 UGGUGAAUAAUGCUGGGAC 950 415-435 AUGUCCCAGCAUUAUUCACCAC 1250 413-435
AU G AD-287370.1 AUGCUGGGACAGUAUAUCC 951 424-444 AUGGAUAUACUGUCCCAGCAUU 1251 422-444
AU A AD-287371.1 UGCUGGGACAGUAUAUCCA 952 425-445 ACUGGATAUACUGUCCCAGCAU 1252 423-445
GU U AD-287372.1 GCUGGGACAGUAUAUCCAGC 953 426-446 AGCUGGAUAUACUGUCCCAGCA 1253 424-446 333 / 395
U U AD-287373.1 CUGGGACAGUAUAUCCAGCC 954 427-447 AGGCUGGAUAUACUGUCCCAGC 1254 425-447
U A AD-287374.1 GGACAGUAUAUCCAGCCGAU 955 430-450 AAUCGGCUGGAUAUACUGUCCC 1255 428-450
U A AD-287375.1 CAGUAUAUCCAGCCGAUCUU 956 433-453 AAAGAUCGGCUGGAUAUACUGU 1256 431-453
U C AD-287391.1 CCAAGGAUGAAGAGAUUAC 957 460-480 UGGUAATCUCUUCAUCCUUGGU 1257 458-480
CA G AD-287406.1 UUUGAGGUCAACAUCCUAG 959 486-506 UCCUAGGAUGUUGACCUCAAAU 1259 484-506
GA G AD-287407.1 UGAGGUCAACAUCCUAGGAC 960 488-508 UGUCCUAGGAUGUUGACCUCAA 1260 486-508
A A AD-287408.1 GAGGUCAACAUCCUAGGACA 961 489-509 AUGUCCTAGGAUGUUGACCUCA 1261 487-509
U A AD-287411.1 GUCAACAUCCUAGGACAUUU 963 492-512 AAAAUGTCCUAGGAUGUUGACC 1263 490-512
U U AD-287413.1 ACAUCCUAGGACAUUUUUG 964 496-516 UCCAAAAAUGUCCUAGGAUGUU 1264 494-516
GA G AD-287414.1 CAUCCUAGGACAUUUUUGG 965 497-517 AUCCAAAAAUGUCCUAGGAUGU 1265 495-517
AU U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287418.1 AGGACAUUUUUGGAUCACA 967 503-523 UUUGUGAUCCAAAAAUGUCCUA 1267 501-523
AA G AD-287419.1 GGACAUUUUUGGAUCACAA 968 504-524 UUUUGUGAUCCAAAAAUGUCCU 1268 502-524
AA A AD-287421.1 UUUUUGGAUCACAAAAGCA 969 509-529 AGUGCUTUUGUGAUCCAAAAAU 1269 507-529
CU G AD-287424.1 UGGAUCACAAAAGCACUUCU 970 513-533 AAGAAGTGCUUUUGUGAUCCAA 1270 511-533
U A AD-287427.1 CAAAAGCACUUCUUCCAUCG 971 520-540 UCGAUGGAAGAAGUGCUUUUGU 1271 518-540
A G AD-287428.1 AAAAGCACUUCUUCCAUCGA 972 521-541 AUCGAUGGAAGAAGUGCUUUUG 1272 519-541
U U AD-287453.1 ACCAAGGAUGAAGAGAUUA 976 459-479 AGUAAUCUCUUCAUCCUUGGUG 1276 457-479
CU C AD-287462.1 AGACAUUUGAGGUCAACAU 977 481-501 AGAUGUTGACCUCAAAUGUCUU 1277 479-501 334 / 395
CU G AD-287463.1 CAUUUGAGGUCAACAUCCUA 978 484-504 AUAGGATGUUGACCUCAAAUGU 1278 482-504
U C AD-287464.1 AUUUGAGGUCAACAUCCUA 979 485-505 ACUAGGAUGUUGACCUCAAAUG 1279 483-505
GU U AD-287465.1 UUGAGGUCAACAUCCUAGG 980 487-507 AUCCUAGGAUGUUGACCUCAAA 1280 485-507
AU U AD-287466.1 CAACAUCCUAGGACAUUUUU 981 494-514 CAAAAATGUCCUAGGAUGUUGA 1281 492-514
G C AD-287467.1 AACAUCCUAGGACAUUUUU 982 495-515 ACAAAAAUGUCCUAGGAUGUUG 1282 493-515
GU A AD-287468.1 AUCCUAGGACAUUUUUGGA 983 498-518 AAUCCAAAAAUGUCCUAGGAUG 1283 496-518
UU U AD-287469.1 CCUAGGACAUUUUUGGAUC 984 500-520 AUGAUCCAAAAAUGUCCUAGGA 1284 498-520
AU U AD-287470.1 GACAUUUUUGGAUCACAAA 985 505-525 AUUUUGTGAUCCAAAAAUGUCC 1285 503-525
AU U AD-287474.1 GGAUCACAAAAGCACUUCUU 986 514-534 AAAGAAGUGCUUUUGUGAUCCA 1286 512-534
U A AD-287476.1 CACAAAAGCACUUCUUCCAU 987 518-538 AAUGGAAGAAGUGCUUUUGUGA 1287 516-538
U U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287477.1 ACAAAAGCACUUCUUCCAUC 988 519-539 AGAUGGAAGAAGUGCUUUUGUG 1288 517-539
U A AD-287478.1 AAAGCACUUCUUCCAUCGAU 989 522-542 AAUCGATGGAAGAAGUGCUUUU 1289 520-542
U G AD-287479.1 GCACUUCUUCCAUCGAUGAU 990 525-545 AAUCAUCGAUGGAAGAAGUGCU 1290 523-545
U U AD-287491.1 AGAAAUCAUGGCCACAUCGU 991 549-569 AACGAUGUGGCCAUGAUUUCUC 1291 547-569
U U AD-287492.1 AAAUCAUGGCCACAUCGUCA 992 551-571 AUGACGAUGUGGCCAUGAUUUC 1292 549-571
U U AD-287517.1 UUCCUUACCUCAUCCCAUAU 993 601-621 AAUAUGGGAUGAGGUAAGGAAU 1293 599-621
U C AD-287520.1 ACCUCAUCCCAUAUUGUUCC 994 607-627 UGGAACAAUAUGGGAUGAGGUA 1294 605-627
A A AD-287521.1 UCAUCCCAUAUUGUUCCAGC 995 610-630 UGCUGGAACAAUAUGGGAUGAG 1295 608-630 335 / 395
A G AD-287524.1 UCCCAUAUUGUUCCAGCAAA 997 613-633 AUUUGCTGGAACAAUAUGGGAU 1297 611-633
U G AD-287525.1 CCCAUAUUGUUCCAGCAAAU 998 614-634 AAUUUGCUGGAACAAUAUGGGA 1298 612-634
U U AD-287537.1 UGUUGGCUUUCACAGAGGU 999 641-661 AGACCUCUGUGAAAGCCAACAG 1299 639-661
CU C AD-287539.1 GGCUUUCACAGAGGUCUGAC 1000 645-665 UGUCAGACCUCUGUGAAAGCCA 1300 643-665
A A AD-287543.1 CACAGAGGUCUGACAUCAGA 1002 651-671 UUCUGATGUCAGACCUCUGUGA 1302 649-671
A A AD-287546.1 AGGUCUGACAUCAGAACUUC 1003 656-676 UGAAGUTCUGAUGUCAGACCUC 1303 654-676
A U AD-287568.1 UCCUUACCUCAUCCCAUAUU 1004 602-622 AAAUAUGGGAUGAGGUAAGGAA 1304 600-622
U U AD-287591.1 UUCACAGAGGUCUGACAUCA 1005 649-669 AUGAUGTCAGACCUCUGUGAAA 1305 647-669
U G AD-287610.1 UUGGGAAAAACUGGUAUCA 1006 681-701 UUUGAUACCAGUUUUUCCCAAG 1306 679-701
AA G AD-287616.1 UGGUAUCAAAACCUCAUGUC 1008 692-712 AGACAUGAGGUUUUGAUACCAG 1308 690-712
U U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287627.1 CUCUGCCCAGUUUUUGUGAA 1009 711-731 AUUCACAAAAACUGGGCAGAGA 1309 709-731
U C AD-287632.1 UUUUUGUGAAUACUGGGUU 1010 721-741 UGAACCCAGUAUUCACAAAAAC 1310 719-741
CA U AD-287636.1 UGAAUACUGGGUUCACCAA 1013 727-747 UUUUGGTGAACCCAGUAUUCAC 1313 725-747
AA A AD-287637.1 GAAUACUGGGUUCACCAAA 1014 728-748 UUUUUGGUGAACCCAGUAUUCA 1314 726-748
AA C AD-287647.1 AAAAAUCCAAGCACAAGAU 1016 744-764 UAAUCUTGUGCUUGGAUUUUUG 1316 742-764
UA G AD-287648.1 AAAAUCCAAGCACAAGAUU 1017 745-765 AUAAUCTUGUGCUUGGAUUUUU 1317 743-765
AU G AD-287654.1 AAGAUUAUGGCCUGUAUUG 1021 758-778 UCCAAUACAGGCCAUAAUCUUG 1321 756-778
GA U AD-287655.1 GAUUAUGGCCUGUAUUGGA 1022 760-780 UCUCCAAUACAGGCCAUAAUCU 1322 758-780 336 / 395
GA U AD-287659.1 GCCUGUAUUGGAGACAGAU 1025 767-787 UCAUCUGUCUCCAAUACAGGCC 1325 765-787
GA A AD-287679.1 CUGGUAUCAAAACCUCAUGU 1026 691-711 AACAUGAGGUUUUGAUACCAGU 1326 689-711
U U AD-287680.1 GGUAUCAAAACCUCAUGUCU 1027 693-713 AAGACATGAGGUUUUGAUACCA 1327 691-713
U G AD-287683.1 UCAAAACCUCAUGUCUCUGC 1028 697-717 AGCAGAGACAUGAGGUUUUGAU 1328 695-717
U A AD-287690.1 CCCAGUUUUUGUGAAUACU 1029 716-736 ACAGUATUCACAAAAACUGGGC 1329 714-736
GU A AD-287693.1 UUUUGUGAAUACUGGGUUC 1030 722-742 AUGAACCCAGUAUUCACAAAAA 1330 720-742
AU C AD-287694.1 UUUGUGAAUACUGGGUUCA 1031 723-743 AGUGAACCCAGUAUUCACAAAA 1331 721-743
CU A AD-287695.1 AUACUGGGUUCACCAAAAA 1032 730-750 AAUUUUTGGUGAACCCAGUAUU 1332 728-750
UU C AD-287696.1 UACUGGGUUCACCAAAAAUC 1033 731-751 AGAUUUTUGGUGAACCCAGUAU 1333 729-751
U U AD-287700.1 CACCAAAAAUCCAAGCACAA 1034 740-760 AUUGUGCUUGGAUUUUUGGUGA 1334 738-760
U A
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287701.1 AAAUCCAAGCACAAGAUUA 1035 746-766 AAUAAUCUUGUGCUUGGAUUUU 1335 744-766
UU U AD-287702.1 AAUCCAAGCACAAGAUUAU 1036 747-767 ACAUAATCUUGUGCUUGGAUUU 1336 745-767
GU U AD-287703.1 AUCCAAGCACAAGAUUAUG 1037 748-768 ACCAUAAUCUUGUGCUUGGAUU 1337 746-768
GU U AD-287704.1 UCCAAGCACAAGAUUAUGGC 1038 749-769 AGCCAUAAUCUUGUGCUUGGAU 1338 747-769
U U AD-287706.1 ACAAGAUUAUGGCCUGUAU 1039 756-776 AAAUACAGGCCAUAAUCUUGUG 1339 754-776
UU C AD-287707.1 CAAGAUUAUGGCCUGUAUU 1040 757-777 ACAAUACAGGCCAUAAUCUUGU 1340 755-777
GU G AD-287709.1 AUUAUGGCCUGUAUUGGAG 1041 761-781 AUCUCCAAUACAGGCCAUAAUC 1341 759-781
AU U AD-287711.1 GGCCUGUAUUGGAGACAGA 1042 766-786 AAUCUGTCUCCAAUACAGGCCA 1342 764-786 337 / 395
UU U AD-287724.1 GUAAGAAGUCUGAUAGAUG 1043 792-812 UCCAUCTAUCAGACUUCUUACG 1343 790-812
GA A AD-287726.1 AAGAAGUCUGAUAGAUGGA 1045 794-814 AUUCCATCUAUCAGACUUCUUA 1345 792-814
AU C AD-287727.1 AGAAGUCUGAUAGAUGGAA 1046 795-815 UAUUCCAUCUAUCAGACUUCUU 1346 793-815
UA A AD-287735.1 AGAUGGAAUACUUACCAAU 1048 806-826 UUAUUGGUAAGUAUUCCAUCUA 1348 804-826
AA U AD-287736.1 AUGGAAUACUUACCAAUAA 1049 808-828 UCUUAUTGGUAAGUAUUCCAUC 1349 806-828
GA U AD-287737.1 UGGAAUACUUACCAAUAAG 1050 809-829 UUCUUATUGGUAAGUAUUCCAU 1350 807-829
AA C AD-287738.1 GGAAUACUUACCAAUAAGA 1051 810-830 UUUCUUAUUGGUAAGUAUUCCA 1351 808-830
AA U AD-287739.1 GAAUACUUACCAAUAAGAA 1052 811-831 UUUUCUTAUUGGUAAGUAUUCC 1352 809-831
AA A AD-287740.1 AAUACUUACCAAUAAGAAA 1053 812-832 AUUUUCTUAUUGGUAAGUAUUC 1353 810-832
AU C AD-287778.1 UUUCUUCCUGAACGCGCCUC 1054 879-899 UGAGGCGCGUUCAGGAAGAAAC 1354 877-899
A U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287798.1 AAAUCGUAUGCAGAAUAUU 1057 908-928 UGAAUATUCUGCAUACGAUUUA 1357 906-928
CA A AD-287800.1 AUCGUAUGCAGAAUAUUCA 1058 910-930 AUUGAATAUUCUGCAUACGAUU 1358 908-930
AU U AD-287801.1 UCGUAUGCAGAAUAUUCAA 1059 911-931 AAUUGAAUAUUCUGCAUACGAU 1359 909-931
UU U AD-287802.1 CGUAUGCAGAAUAUUCAAU 1060 912-932 AAAUUGAAUAUUCUGCAUACGA 1360 910-932
UU U AD-287804.1 AUGCAGAAUAUUCAAUUUG 1061 915-935 UUCAAATUGAAUAUUCUGCAUA 1361 913-935
AA C AD-287810.1 GAAGUCUGAUAGAUGGAAU 1062 796-816 AUAUUCCAUCUAUCAGACUUCU 1362 794-816
AU U AD-287811.1 UCUGAUAGAUGGAAUACUU 1063 800-820 AUAAGUAUUCCAUCUAUCAGAC 1363 798-820
AU U AD-287813.1 GAUGGAAUACUUACCAAUA 1064 807-827 AUUAUUGGUAAGUAUUCCAUCU 1364 805-827 338 / 395
AU A AD-287837.1 ACAGAAGUUUCUUCCUGAAC 1065 872-892 AGUUCAGGAAGAAACUUCUGUA 1365 870-892
U G AD-287839.1 AGAAGUUUCUUCCUGAACGC 1066 874-894 AGCGUUCAGGAAGAAACUUCUG 1366 872-894
U U AD-287841.1 AAGUUUCUUCCUGAACGCGC 1067 876-896 AGCGCGTUCAGGAAGAAACUUC 1367 874-896
U U AD-287842.1 GUUUCUUCCUGAACGCGCCU 1068 878-898 AAGGCGCGUUCAGGAAGAAACU 1368 876-898
U U AD-287844.1 UCUUCCUGAACGCGCCUCAG 1069 881-901 ACUGAGGCGCGUUCAGGAAGAA 1369 879-901
U A AD-287854.1 GCAGAAUAUUCAAUUUGAA 1070 917-937 ACUUCAAAUUGAAUAUUCUGCA 1370 915-937
GU U AD-287856.1 AAUAUUCAAUUUGAAGCAG 1071 921-941 AACUGCTUCAAAUUGAAUAUUC 1371 919-941
UU U AD-287893.1 GAUGUAUGCAUGAUAAUGA 1073 989-1009 UAUCAUTAUCAUGCAUACAUCU 1373 987-1009
UA C AD-287917.1 CAAUGCUGCAAAGCUUUAU 1074 1025-1045 AAAUAAAGCUUUGCAGCAUUGA 1374 1023-1045
UU U AD-287924.1 AAAGCUUUAUUUCACAUUU 1075 1034-1054 AAAAAUGUGAAAUAAAGCUUUG 1375 1032-1054
UU C
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-287934.1 AAUUUGAAGCAGUGGUUGG 1076 928-948 AGCCAACCACUGCUUCAAAUUG 1376 926-948
CU A AD-287969.1 AAUGCUGCAAAGCUUUAUU 1077 1026-1046 GAAAUAAAGCUUUGCAGCAUUG 1377 1024-1046
UC A AD-287970.1 UGCUGCAAAGCUUUAUUUC 1078 1028-1048 AUGAAATAAAGCUUUGCAGCAU 1378 1026-1048
AU U AD-288005.1 AGAUUAAUUACCUGUCUUCC 1080 1111-1131 AGGAAGACAGGUAAUUAAUCUU 1380 1109-1131
U G AD-288006.1 AUUAAUUACCUGUCUUCCUG 1081 1113-1133 ACAGGAAGACAGGUAAUUAAUC 1381 1111-1133
U U AD-288008.1 UAAUUACCUGUCUUCCUGUU 1082 1115-1135 AAACAGGAAGACAGGUAAUUAA 1382 1113-1135
U U AD-288010.1 UACCUGUCUUCCUGUUUCUC 1083 1119-1139 UGAGAAACAGGAAGACAGGUAA 1383 1117-1139
A U AD-288011.1 ACCUGUCUUCCUGUUUCUCA 1084 1120-1140 UUGAGAAACAGGAAGACAGGUA 1384 1118-1140 339 / 395
A A AD-288015.1 UCUUCCUGUUUCUCAAGAAU 1085 1125-1145 UAUUCUTGAGAAACAGGAAGAC 1385 1123-1145
A A AD-288046.1 UUUUCCUUUCAUGCCUCUUA 1086 1171-1191 UUAAGAGGCAUGAAAGGAAAAA 1386 1169-1191
A C AD-288049.1 UCCUUUCAUGCCUCUUAAAA 1087 1174-1194 UUUUUAAGAGGCAUGAAAGGAA 1387 1172-1194
A A AD-288050.1 CUUUCAUGCCUCUUAAAAAC 1088 1176-1196 AGUUUUTAAGAGGCAUGAAAGG 1388 1174-1196
U A AD-288076.1 AAAACAUUGGUUUGGCACU 1089 1073-1093 AUAGUGCCAAACCAAUGUUUUU 1389 1071-1093
AU A AD-288092.1 GAUUAAUUACCUGUCUUCCU 1090 1112-1132 AAGGAAGACAGGUAAUUAAUCU 1390 1110-1132
U U AD-288094.1 UUACCUGUCUUCCUGUUUCU 1091 1118-1138 AAGAAACAGGAAGACAGGUAAU 1391 1116-1138
U U AD-288095.1 CCUGUCUUCCUGUUUCUCAA 1092 1121-1141 AUUGAGAAACAGGAAGACAGGU 1392 1119-1141
U A AD-288108.1 GGUCUGUUUUUCCUUUCAU 1093 1164-1184 ACAUGAAAGGAAAAACAGACCU 1393 1162-1184
GU A AD-288109.1 GUCUGUUUUUCCUUUCAUGC 1094 1165-1185 AGCAUGAAAGGAAAAACAGACC 1394 1163-1185
U U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-288173.1 UUAUUUACACAGGGAAGGU 1095 1302-1322 AAACCUTCCCUGUGUAAAUAAG 1395 1300-1322
UU U AD-288174.1 UAUUUACACAGGGAAGGUU 1096 1303-1323 UAAACCTUCCCUGUGUAAAUAA 1396 1301-1323
UA G AD-288180.1 GGGAAGGUUUAAGACUGUU 1099 1313-1333 UGAACAGUCUUAAACCUUCCCU 1399 1311-1333
CA G AD-288181.1 GGAAGGUUUAAGACUGUUC 1100 1314-1334 UUGAACAGUCUUAAACCUUCCC 1400 1312-1334
AA U AD-288184.1 UUUAAGACUGUUCAAGUAG 1102 1320-1340 UGCUACTUGAACAGUCUUAAAC 1402 1318-1340
CA C AD-288187.1 GACUGUUCAAGUAGCAUUCC 1104 1325-1345 UGGAAUGCUACUUGAACAGUCU 1404 1323-1345
A U AD-288188.1 ACUGUUCAAGUAGCAUUCCA 1105 1326-1346 UUGGAATGCUACUUGAACAGUC 1405 1324-1346
A U AD-288192.1 CAAGUAGCAUUCCAAUCUGU 1108 1332-1352 UACAGATUGGAAUGCUACUUGA 1408 1330-1352 340 / 395
A A AD-288227.1 AACUUAUUUACACAGGGAA 1111 1299-1319 ACUUCCCUGUGUAAAUAAGUUC 1411 1297-1319
GU U AD-288229.1 UACACAGGGAAGGUUUAAG 1112 1307-1327 AUCUUAAACCUUCCCUGUGUAA 1412 1305-1327
AU A AD-288230.1 CACAGGGAAGGUUUAAGAC 1113 1309-1329 AAGUCUTAAACCUUCCCUGUGU 1413 1307-1329
UU A AD-288231.1 AGGGAAGGUUUAAGACUGU 1114 1312-1332 AAACAGTCUUAAACCUUCCCUG 1414 1310-1332
UU U AD-288232.1 GAAGGUUUAAGACUGUUCA 1115 1315-1335 AUUGAACAGUCUUAAACCUUCC 1415 1313-1335
AU C AD-288233.1 GGUUUAAGACUGUUCAAGU 1116 1318-1338 AUACUUGAACAGUCUUAAACCU 1416 1316-1338
AU U AD-288235.1 AAGACUGUUCAAGUAGCAU 1117 1323-1343 AAAUGCTACUUGAACAGUCUUA 1417 1321-1343
UU A AD-288236.1 AGACUGUUCAAGUAGCAUU 1118 1324-1344 AGAAUGCUACUUGAACAGUCUU 1418 1322-1344
CU A AD-288237.1 UGUUCAAGUAGCAUUCCAA 1119 1328-1348 AAUUGGAAUGCUACUUGAACAG 1419 1326-1348
UU U AD-288238.1 UUCAAGUAGCAUUCCAAUCU 1120 1330-1350 AAGAUUGGAAUGCUACUUGAAC 1420 1328-1350
U A
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-288290.1 GCAGCUUUAUCUCAACCUGG 1121 1419-1439 UCCAGGTUGAGAUAAAGCUGCC 1421 1417-1439
A U AD-288316.1 AGCAUUUGAAAGAUUUCCC 1122 1455-1475 UAGGGAAAUCUUUCAAAUGCUG 1422 1453-1475
UA A AD-288318.1 UGAAAGAUUUCCCUAGCCUC 1123 1461-1481 AGAGGCTAGGGAAAUCUUUCAA 1423 1459-1481
U A AD-288324.1 UUCCCUAGCCUCUUCCUUUU 1125 1469-1489 AAAAAGGAAGAGGCUAGGGAAA 1425 1467-1489
U U AD-288337.1 AAGAACACAGAAUGAGUGC 1126 1374-1394 AUGCACTCAUUCUGUGUUCUUG 1426 1372-1394
AU U AD-288338.1 GAACACAGAAUGAGUGCAC 1127 1376-1396 AUGUGCACUCAUUCUGUGUUCU 1427 1374-1396
AU U AD-288339.1 AACACAGAAUGAGUGCACA 1128 1377-1397 ACUGUGCACUCAUUCUGUGUUC 1428 1375-1397
GU U AD-288340.1 CAGAAUGAGUGCACAGCUA 1129 1381-1401 AUUAGCTGUGCACUCAUUCUGU 1429 1379-1401 341 / 395
AU G AD-288341.1 GAAUGAGUGCACAGCUAAG 1130 1383-1403 AUCUUAGCUGUGCACUCAUUCU 1430 1381-1403
AU G AD-288366.1 UUCAGCAUUUGAAAGAUUU 1131 1452-1472 AGAAAUCUUUCAAAUGCUGAAU 1431 1450-1472
CU C AD-288369.1 CAUUUGAAAGAUUUCCCUA 1132 1457-1477 ACUAGGGAAAUCUUUCAAAUGC 1432 1455-1477
GU U AD-288370.1 AUUUGAAAGAUUUCCCUAG 1133 1458-1478 AGCUAGGGAAAUCUUUCAAAUG 1433 1456-1478
CU C AD-288394.1 GUGCAACUCUAUUCUGGACU 1136 1505-1525 AAGUCCAGAAUAGAGUUGCACC 1436 1503-1525
U G AD-288396.1 GCAACUCUAUUCUGGACUUU 1138 1507-1527 UAAAGUCCAGAAUAGAGUUGCA 1438 1505-1527
A C AD-288397.1 CAACUCUAUUCUGGACUUUA 1139 1508-1528 AUAAAGTCCAGAAUAGAGUUGC 1439 1506-1528
U A AD-288427.1 AGUCCACCAAAAGUGGACCC 1142 1559-1579 AGGGUCCACUUUUGGUGGACUU 1442 1557-1579
U C AD-288466.1 AAACGGUGCAACUCUAUUCU 1148 1500-1520 AAGAAUAGAGUUGCACCGUUUU 1448 1498-1520
U G AD-288467.1 AACGGUGCAACUCUAUUCUG 1149 1501-1521 ACAGAATAGAGUUGCACCGUUU 1449 1499-1521
U U
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-288470.1 UAUUCUGGACUUUAUUACU 1150 1514-1534 AAAGUAAUAAAGUCCAGAAUAG 1450 1512-1534
UU A AD-288491.1 AAAGUGGACCCUCUAUAUU 1151 1568-1588 GAAAUATAGAGGGUCCACUUUU 1451 1566-1588
UC G AD-288492.1 AAGUGGACCCUCUAUAUUUC 1152 1569-1589 AGAAAUAUAGAGGGUCCACUUU 1452 1567-1589
U U AD-288561.1 AUGUUUAGACAAUUUUAGG 1153 1724-1744 AGCCUAAAAUUGUCUAAACAUC 1453 1722-1744
CU U AD-288562.1 GUUUAGACAAUUUUAGGCU 1154 1726-1746 UGAGCCTAAAAUUGUCUAAACA 1454 1724-1746
CA U AD-288567.1 GACAAUUUUAGGCUCAAAA 1159 1731-1751 AUUUUUGAGCCUAAAAUUGUCU 1459 1729-1751
AU A AD-288573.1 UAGGCUCAAAAAUUAAAGC 1161 1739-1759 UAGCUUTAAUUUUUGAGCCUAA 1461 1737-1759
UA A AD-288574.1 AGGCUCAAAAAUUAAAGCU 1162 1740-1760 UUAGCUTUAAUUUUUGAGCCUA 1462 1738-1760 342 / 395
AA A AD-288575.1 GCUCAAAAAUUAAAGCUAA 1163 1742-1762 UGUUAGCUUUAAUUUUUGAGCC 1463 1740-1762
CA U AD-288576.1 UCAAAAAUUAAAGCUAACA 1164 1744-1764 UGUGUUAGCUUUAAUUUUUGAG 1464 1742-1764
CA C AD-288613.1 UUCAUAUAUCCUUGGUCCCA 1165 1701-1721 AUGGGACCAAGGAUAUAUGAAA 1465 1699-1721
U G AD-288620.1 GAUGUUUAGACAAUUUUAG 1166 1723-1743 ACCUAAAAUUGUCUAAACAUCU 1466 1721-1743
GU C AD-288624.1 GGCUCAAAAAUUAAAGCUA 1167 1741-1761 AUUAGCTUUAAUUUUUGAGCCU 1467 1739-1761
AU A AD-288625.1 CUCAAAAAUUAAAGCUAAC 1168 1743-1763 AUGUUAGCUUUAAUUUUUGAGC 1468 1741-1763
AU C AD-288626.1 CAAAAAUUAAAGCUAACAC 1169 1745-1765 AUGUGUTAGCUUUAAUUUUUGA 1469 1743-1765
AU G AD-288628.1 AAAUUAAAGCUAACACAGG 1170 1748-1768 UUCCUGTGUUAGCUUUAAUUUU 1470 1746-1768
AA U AD-288634.1 UAACACAGGAAAAGGAACU 1171 1758-1778 ACAGUUCCUUUUCCUGUGUUAG 1471 1756-1778
GU C AD-288637.1 GGAAAAGGAACUGUACUGG 1172 1765-1785 AGCCAGTACAGUUCCUUUUCCU 1472 1763-1785
CU G
Nome do SEQ ID Posição em SEQ ID Posição em Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ duplex NO: NM_178135.4 NO: NM_178135.4 AD-288696.1 CAGGAAAAGGAACUGUACU 1175 1763-1783 ACAGUACAGUUCCUUUUCCUGU 1475 1761-1783
GU G AD-288698.1 AGGAACUGUACUGGCUAUU 1176 1770-1790 AUAAUAGCCAGUACAGUUCCUU 1476 1768-1790
AU U AD-288912.1 CUCCCACUACAUCAAGACUA 1177 2189-2209 UUAGUCTUGAUGUAGUGGGAGU 1477 2187-2209
A C AD-288915.1 CACUACAUCAAGACUAAUCU 1180 2193-2213 AAGAUUAGUCUUGAUGUAGUGG 1480 2191-2213
U G AD-288916.1 CUACAUCAAGACUAAUCUUG 1181 2195-2215 ACAAGATUAGUCUUGAUGUAGU 1481 2193-2215
U G AD-288933.1 GUGUUUUUCACAUGUAUUA 1184 2221-2241 UAUAAUACAUGUGAAAAACACA 1484 2219-2241
UA C AD-288937.1 UCACAUGUAUUAUAGAAUG 1185 2228-2248 AGCAUUCUAUAAUACAUGUGAA 1485 2226-2248
CU A AD-288938.1 CACAUGUAUUAUAGAAUGC 1186 2229-2249 AAGCAUTCUAUAAUACAUGUGA 1486 2227-2249 343 / 395
UU A AD-288948.1 CUUUUGCAUGGACUAUCCUC 1192 2247-2267 AGAGGATAGUCCAUGCAAAAGC 1492 2245-2267
U A AD-288950.1 UUGCAUGGACUAUCCUCUUG 1193 2250-2270 ACAAGAGGAUAGUCCAUGCAAA 1493 2248-2270
U A AD-288956.1 GGACUAUCCUCUUGUUUUU 1196 2256-2276 AUAAAAACAAGAGGAUAGUCCA 1496 2254-2276
AU U AD-288957.1 GACUAUCCUCUUGUUUUUA 1197 2257-2277 AAUAAAAACAAGAGGAUAGUCC 1497 2255-2277
UU A AD-288959.1 CUAUCCUCUUGUUUUUAUU 1198 2259-2279 UUAAUAAAAACAAGAGGAUAGU 1498 2257-2279
AA C AD-288981.1 CCCACUACAUCAAGACUAAU 1199 2191-2211 AAUUAGTCUUGAUGUAGUGGGA 1499 2189-2211
U G AD-288982.1 ACUACAUCAAGACUAAUCUU 1200 2194-2214 AAAGAUTAGUCUUGAUGUAGUG 1500 2192-2214
U G AD-288996.1 AUGCUUUUGCAUGGACUAU 1201 2244-2264 AGAUAGTCCAUGCAAAAGCAUU 1501 2242-2264
CU C * Alvo: HSD17B13
344 / 395
Tabela 9. Rastreamento in vitro de HSD17B13 ELF7 GNA7 10 nM em Cos-7 (Vetor psiCHECK2-Luciferase duplo humano) e hepatócitos primários de Cynomolgus % restante da % restante da % restante da % restante da Nome do duplex mensagem humana mensagem humana mensagem de Cyno mensagem de Cyno 10 nM 0,1 nM 10 nM 0,1 nM AD-286958.1 108,7 111,4 84,5 99,1 AD-287001.1 84,8 98,4 14,7 81,4 AD-287012.1 88,6 110 97,1 88,8 AD-287014.1 95,2 105,8 116,5 102,3 AD-287015.1 65,4 93,8 14,5 80,3 AD-287017.1 98,5 94,9 91,6 96,2 AD-287026.1 31,9 91 44,8 73,6 AD-287059.1 76,9 117,2 70 94,4 AD-287060.1 101,6 97,9 71,1 97,8 AD-287061.1 94,6 92,8 60,5 96,4 AD-287062.1 90,8 97,7 67,1 113,1 AD-287064.1 97 92,5 75 98,2 AD-287065.1 92,2 98,2 74,4 98 AD-287066.1 98,5 96,4 27 99,3 AD-287126.1 95,6 99,9 19,1 93,5 AD-287200.1 98,7 126,7 91,5 95,3 AD-287201.1 38,7 101,6 88,6 100,6 AD-287202.1 74,5 97,2 88,7 100,7 AD-287203.1 72,9 98,7 50,3 87,1 AD-287205.1 72,8 98 40 96,9 AD-287206.1 62,7 112,9 19,6 88,4 AD-287227.1 64,3 95 34,2 95,1 AD-287246.1 58,1 97,5 20,8 72,4 AD-287247.1 76,2 95,9 84,8 115,1 AD-287248.1 65,5 110,9 55 92 AD-287249.1 90,1 107,8 126,6 113,4 AD-287250.1 76,9 113,2 96,2 95,6 AD-287251.1 35,8 92,3 53,5 93,7 AD-287252.1 57,7 89 32,7 101,4 AD-287253.1 76,1 95 74,1 92,6 AD-287254.1 104,7 124 89,5 100,5 AD-287258.1 91,4 107,8 44,9 98,1 AD-287287.1 55,2 96,5 65,7 104,4 AD-287288.1 53,1 96,9 36 108,3 AD-287289.1 77,3 98,1 57,5 97,8 AD-287290.1 23,5 103,2 55,3 82,8 AD-287293.1 46,6 89,5 88,6 102,2 AD-287316.1 78,6 82,4 34,1 92,4 AD-287320.1 86,2 88,8 105,8 97,9 AD-287321.1 86 108,2 81,3 91 AD-287324.1 72,7 113,6 34,3 107,8 AD-287325.1 78,4 104,6 85,2 86,2 AD-287326.1 39,2 95,1 17,3 73,3 AD-287327.1 91,7 95,2 99,6 90,4 AD-287344.1 13,6 81,4 14,4 58,3 AD-287346.1 115,2 122,2 96,5 103,1 AD-287347.1 43,3 89,6 26,3 86,7 AD-287366.1 53 98,4 36,1 90,1 AD-287367.1 102,8 99,3 98,4 93,3 AD-287370.1 107,7 106,7 102,1 93,8
345 / 395 % restante da % restante da % restante da % restante da Nome do duplex mensagem humana mensagem humana mensagem de Cyno mensagem de Cyno 10 nM 0,1 nM 10 nM 0,1 nM AD-287371.1 79,2 107 81,6 93,5 AD-287372.1 101,8 103,2 94,4 108,4 AD-287373.1 67,5 85,9 28,7 89,6 AD-287374.1 60,7 103,2 63,2 83,2 AD-287375.1 96 101 85,3 98 AD-287391.1 28,3 92 26,4 95,3 AD-287392.1 33,8 100,9 31,4 90,8 AD-287406.1 93,2 106,5 54,1 96,2 AD-287407.1 47,5 86,1 23,6 72,2 AD-287408.1 63,1 90,3 47,1 98,2 AD-287410.1 32,5 87,6 10,9 80,2 AD-287411.1 21,6 87,3 10 69,1 AD-287413.1 87,4 98,2 72,7 89,9 AD-287414.1 100,6 97,3 100,2 98,6 AD-287415.1 20,2 88,9 9,7 68,8 AD-287418.1 13,3 88,8 45,9 66,6 AD-287419.1 54,6 99,7 58,7 88 AD-287421.1 27,4 94,7 7,4 66,2 AD-287424.1 33,4 98 40,6 87,6 AD-287427.1 67,9 106,6 24,2 75,8 AD-287428.1 79,1 94,5 22,3 84,7 AD-287429.1 99,5 98,2 53,8 94,7 AD-287430.1 101,9 104 88,3 103,9 AD-287441.1 62,8 104 61,1 103,6 AD-287453.1 19,9 91,5 12,5 70,3 AD-287462.1 44,1 90,3 85,1 93,1 AD-287463.1 93,9 99,9 78,3 100,4 AD-287464.1 113 107,9 51,5 110,6 AD-287465.1 86,6 99 80,4 101,5 AD-287466.1 89,9 96,4 106,2 109,7 AD-287467.1 85,2 100,4 82,2 107,9 AD-287468.1 36,6 102,8 13,7 92,4 AD-287469.1 67,5 93,6 88,5 107,8 AD-287470.1 30 111,3 24,9 68,2 AD-287474.1 61,6 103,1 55,4 93,3 AD-287476.1 33,2 120,5 29,2 52 AD-287477.1 62,3 90,6 38,2 81,3 AD-287478.1 44 86,3 6,1 52,5 AD-287479.1 89,8 95,8 53 95,1 AD-287491.1 63,1 108,1 75,7 92,2 AD-287492.1 70,8 92,9 93,6 97,1 AD-287517.1 75,2 93,3 98 99,5 AD-287520.1 73,9 97,9 96,2 101,9 AD-287521.1 50,1 94,6 70,2 98,7 AD-287522.1 88,9 109,4 83,4 91,8 AD-287524.1 14,4 111,5 31,1 65,9 AD-287525.1 71,6 104,4 88,6 103,8 AD-287537.1 51,6 110,5 20,5 84,7 AD-287539.1 47,9 115,9 27,9 78,5 AD-287540.1 74,9 105,1 19,6 86,2 AD-287543.1 47,6 95,3 12,7 93,3 AD-287546.1 65,7 102,8 6,8 59 AD-287568.1 74,8 104,6 56,7 100,7 AD-287591.1 40 100,8 12,7 65,1 AD-287610.1 33,3 78,1 32,3 66,4 AD-287615.1 24,4 104,8 12,5 68,7
346 / 395 % restante da % restante da % restante da % restante da Nome do duplex mensagem humana mensagem humana mensagem de Cyno mensagem de Cyno 10 nM 0,1 nM 10 nM 0,1 nM AD-287616.1 15,7 102 16,1 63,6 AD-287627.1 81,3 92,3 111,8 94,5 AD-287632.1 93,9 93,1 88,9 106,9 AD-287633.1 106,4 91,9 68,4 122,6 AD-287634.1 82,3 114,7 78,7 94,5 AD-287636.1 21,8 97,7 18,9 56,5 AD-287637.1 27,6 92,3 22,8 91,4 AD-287638.1 99 101,2 101,6 98,1 AD-287647.1 74,2 108,2 74,5 94,3 AD-287648.1 12,9 92,8 29,8 61 AD-287651.1 66,5 100,6 92,8 106,4 AD-287652.1 12,8 79,5 11,5 66,2 AD-287653.1 18,9 69,8 17,9 87,7 AD-287654.1 87,5 101 75,4 91,4 AD-287655.1 61,6 101,7 88,3 98 AD-287656.1 91,7 122,5 86,4 97,9 AD-287658.1 78,1 118,7 45 89,4 AD-287659.1 37 100,9 22,1 87,2 AD-287679.1 55,4 93,6 24,4 85,1 AD-287680.1 14,3 114,1 17,4 35,8 AD-287683.1 59 94,1 33,3 87,5 AD-287690.1 81,2 144,4 49,9 93,5 AD-287693.1 68,7 125,5 85,8 100,5 AD-287694.1 100,2 111,7 87,8 101,8 AD-287695.1 88,4 110,2 89,2 106,1 AD-287696.1 13,8 78,3 12 63,6 AD-287700.1 15,6 97 22,9 82,3 AD-287701.1 46,1 95 108,7 109,1 AD-287702.1 80,1 112,2 80,1 93,9 AD-287703.1 70,1 102,6 92,2 105,5 AD-287704.1 38,2 113,8 25,4 95,5 AD-287706.1 94,3 105 96,1 97,8 AD-287707.1 82,6 114,2 103,2 106,7 AD-287709.1 78,2 93,8 89,9 103,9 AD-287711.1 23,1 76,9 15,5 88,1 AD-287724.1 54,2 94,9 100,4 97,6 AD-287725.1 83,1 116,3 61,8 101,3 AD-287726.1 20,8 77,6 15,5 70,6 AD-287727.1 33,6 111 27,9 57,1 AD-287728.1 28,8 107 11,2 76,6 AD-287735.1 13,2 92,7 9,6 25,6 AD-287736.1 60,7 111 26,9 83,8 AD-287737.1 71,3 98,7 42,5 105,1 AD-287738.1 31,3 114,3 21,8 87,8 AD-287739.1 22,5 101,9 55 72 AD-287740.1 16,3 73,5 19 55,7 AD-287778.1 82,4 113,7 66,4 90,9 AD-287793.1 47,8 91,5 84,1 92,9 AD-287795.1 32,9 99,6 54,4 102,2 AD-287798.1 48,8 98,3 18,5 90,5 AD-287800.1 59,4 96,3 58,7 95,1 AD-287801.1 17,7 140,3 16,1 71,4 AD-287802.1 5,6 82,9 17 27,8 AD-287804.1 14,7 77,5 14,3 70,3 AD-287810.1 53,9 98,6 72,5 100,1 AD-287811.1 64,5 106 33,9 90,2
347 / 395 % restante da % restante da % restante da % restante da Nome do duplex mensagem humana mensagem humana mensagem de Cyno mensagem de Cyno 10 nM 0,1 nM 10 nM 0,1 nM AD-287813.1 35,9 114,4 17,9 91,4 AD-287837.1 11,6 66 9,3 58 AD-287839.1 95,3 106,1 60 136,1 AD-287841.1 13,4 98,7 22,9 46,4 AD-287842.1 94,6 89,9 106,1 97,5 AD-287844.1 87,4 161,1 74 88,1 AD-287854.1 32,4 103,1 25,2 82,8 AD-287856.1 16,9 99,3 32,4 64,5 AD-287857.1 88 99,4 64,7 106,2 AD-287893.1 17,2 94,7 58,7 93,2 AD-287917.1 30,5 114,1 60 69,4 AD-287924.1 52,3 85,6 75,3 86,5 AD-287934.1 48,5 91,3 39,4 96,8 AD-287969.1 100,3 96,7 77,9 105,5 AD-287970.1 15,4 88,3 43 87,6 AD-287982.1 73,8 87,6 26,7 56,3 AD-288005.1 23,6 92,4 69,9 88,4 AD-288006.1 28,8 91,1 52,8 95,3 AD-288008.1 62,6 111,1 52 97,5 AD-288010.1 66,8 116,2 66,1 102 AD-288011.1 11,7 78 45,2 54,5 AD-288015.1 27,1 111,4 66,6 61 AD-288046.1 12,2 72,4 20,7 53,5 AD-288049.1 44,9 104,5 68,6 77,3 AD-288050.1 32,2 120,1 41,8 70,6 AD-288076.1 43,1 109,1 24,2 66,4 AD-288092.1 10,9 106,6 58,5 113,2 AD-288094.1 66,8 92,3 90,4 91,6 AD-288095.1 16,2 92,4 39 55,5 AD-288108.1 53,3 122,8 49,1 96,7 AD-288109.1 39,8 114,6 51 90,4 AD-288173.1 19,3 110,7 58,8 81,1 AD-288174.1 39 90,1 71,8 88,7 AD-288176.1 135,9 92,9 102,6 106 AD-288177.1 91,4 99,7 57,2 99,5 AD-288180.1 34,5 110 68 82 AD-288181.1 19,9 116,4 34,6 74,9 AD-288183.1 38,2 96,5 20,5 84,6 AD-288184.1 43,4 95 28,9 84,1 AD-288186.1 63,9 107,4 60,7 88 AD-288187.1 22,9 113,8 53 84,5 AD-288188.1 16,3 77,6 23,4 60,5 AD-288189.1 47,2 104,1 22,4 49,3 AD-288190.1 21,5 81,3 22,8 58,1 AD-288192.1 71,7 112,4 76,6 93,6 AD-288193.1 62,5 118,5 34 72,8 AD-288194.1 66,7 96,6 31,2 87,1 AD-288227.1 86,5 85,7 113,1 103,6 AD-288229.1 104,6 103,1 73,7 88,6 AD-288230.1 32,5 122,3 29,7 75,1 AD-288231.1 19 100,2 46,5 72,1 AD-288232.1 66,9 95,5 97 95,2 AD-288233.1 26,2 108 21,1 68,6 AD-288235.1 7,4 79,8 39,3 52,6 AD-288236.1 18,1 78,8 21,5 51,6 AD-288237.1 59,8 133,8 37,3 72,6
348 / 395 % restante da % restante da % restante da % restante da Nome do duplex mensagem humana mensagem humana mensagem de Cyno mensagem de Cyno 10 nM 0,1 nM 10 nM 0,1 nM AD-288238.1 10,4 57,4 21,3 58,1 AD-288290.1 68,9 108,4 29,8 90,7 AD-288316.1 38 98,2 42,2 61,8 AD-288318.1 37,6 99,4 25,3 66 AD-288319.1 23,7 93,5 44,4 90,4 AD-288324.1 56,4 146,7 51,7 81,8 AD-288337.1 24,7 94,5 30 78 AD-288338.1 34,8 95,6 46,9 68,3 AD-288339.1 67,3 86,5 78,5 94 AD-288340.1 19,5 114,6 29,5 51,7 AD-288341.1 23,1 88,9 48,8 75,7 AD-288366.1 34,6 160,9 42,9 91,4 AD-288369.1 16,4 120,9 28,2 77,4 AD-288370.1 15,1 73,8 26,8 89,1 AD-288391.1 30,1 84 21,2 64,5 AD-288393.1 56 96,6 41,8 101,9 AD-288394.1 20,1 107 48,5 75,6 AD-288395.1 64 94,8 53,7 101 AD-288396.1 86 94,3 100,2 90,7 AD-288397.1 28,3 83,9 33,9 83,9 AD-288398.1 63,4 108,8 87,6 91,7 AD-288402.1 60,1 103,7 37 89,3 AD-288427.1 110,8 95,6 89,8 97,2 AD-288430.1 94,7 118,3 85,2 92,7 AD-288431.1 87,4 94,7 106,5 94,5 AD-288432.1 39 112,5 81,6 88,7 AD-288433.1 100,7 113 107,9 92,4 AD-288434.1 104,8 99,6 87,5 102,3 AD-288466.1 65 99,1 77,1 100 AD-288467.1 99,4 99,8 64,9 98,6 AD-288470.1 30,7 97,7 82,9 83,8 AD-288491.1 82,6 98,5 69,8 90,6 AD-288492.1 77 98,1 84,5 106,6 AD-288561.1 54,5 92,2 102,4 103,6 AD-288562.1 35,9 91,8 32,2 89,5 AD-288563.1 18,7 79,9 29,9 69,1 AD-288564.1 24,5 68,1 38,3 80,9 AD-288565.1 47,1 97,6 53,9 83,8 AD-288566.1 33,7 89,8 30,5 64,6 AD-288567.1 75,7 92,5 101,7 99,7 AD-288572.1 93,2 97,6 92 110,6 AD-288573.1 51,9 95 46,3 86,1 AD-288574.1 12,6 79,8 25,8 54,3 AD-288575.1 51,2 116,2 61,7 76,2 AD-288576.1 26,9 98 51,7 75 AD-288613.1 36 92,1 103,9 113,2 AD-288620.1 62,8 94,8 107 88,5 AD-288624.1 26,8 101,4 32,2 66,8 AD-288625.1 16,4 99,3 40,5 73,2 AD-288626.1 34,7 100,9 30,1 70,8 AD-288628.1 32,7 85,2 35,1 80,2 AD-288634.1 89,6 92,6 77 90,6 AD-288637.1 44,5 93,6 42,1 104 AD-288639.1 43,7 112 20,6 46,7 AD-288642.1 42,2 99,6 25,2 69,8 AD-288696.1 52,8 101,5 31,1 88
349 / 395 % restante da % restante da % restante da % restante da Nome do duplex mensagem humana mensagem humana mensagem de Cyno mensagem de Cyno 10 nM 0,1 nM 10 nM 0,1 nM AD-288698.1 16,3 75,6 21 58,9 AD-288912.1 21,1 83,4 23,2 56,1 AD-288913.1 28,5 88 26,7 65,9 AD-288914.1 16,1 77,7 23,1 56,1 AD-288915.1 17,7 92,8 33,9 73,6 AD-288916.1 16,1 91,1 24 75,5 AD-288917.1 15,1 59,6 31 77 AD-288918.1 23,6 85,2 35,2 98,8 AD-288933.1 24,9 78,9 62,9 78,8 AD-288937.1 74,3 103,3 51,6 89,9 AD-288938.1 28,2 105,7 42,9 92,7 AD-288941.1 33,1 100 44,9 114,1 AD-288943.1 69,7 97,2 49,1 89 AD-288945.1 25,1 83,4 26,1 64,4 AD-288946.1 54 89,5 45,5 82,9 AD-288947.1 26,7 97,6 26,6 76,9 AD-288948.1 18,2 93,6 24,7 67,6 AD-288950.1 24,3 103,4 31,8 89,7 AD-288951.1 18,9 85,3 29,7 96,5 AD-288952.1 98,1 103,2 85,4 92,9 AD-288956.1 30,5 104 53 84,5 AD-288957.1 23,4 88,8 57,9 85,2 AD-288959.1 21,5 82,5 45,7 64,4 AD-288981.1 63,2 101,9 26,6 73,5 AD-288982.1 82,9 103,7 50,2 88,4 AD-288996.1 11,6 70,8 39,3 70,3
Tabela 10. Sequência modificada de DNA de HSD17B13 NonF*
SEQ Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ sequência do mRNA alvo 5’ para 3’ ID duplex NO: NO: NO: AD- ascsacaaggdAcdTgaaccagaau asdTsucdTgdGuucadGudCcuugugu CUACACAAGGACUGAACCAG 1502 1797 2092
291929.1 L96 sasg AAG AD- ascsaaggacdTgdAaccagaagga usdCscudTcdTgguudCadGuccuugu ACACAAGGACUGAACCAGAA 1503 1798 2093
291931.1 L96 sgsu GGA AD- uscscuucugdCudTcugaucacca usdGsgudGadTcagadAgdCagaagga AAUCCUUCUGCUUCUGAUCA 1504 1799 2094
291988.1 L96 susu CCA AD- csusgcuucudGadTcaccaucauu asdAsugdAudGgugadTcdAgaagcag UUCUGCUUCUGAUCACCAUC 1505 1800 2095
291993.1 L96 sasa AUC AD- uscsugaucadCcdAucaucuacuu asdAsgudAgdAugaudGgdTgaucaga CUUCUGAUCACCAUCAUCUA 1506 1801 2096
291998.1 L96 sasg CUC AD- ascscaucaudCudAcuccuacuuu asdAsagdTadGgagudAgdAugauggu UCACCAUCAUCUACUCCUAC 1507 1802 2097
292005.1 L96 sgsa UUG AD- cscsaucaucdTadCuccuacuugu asdCsaadGudAggagdTadGaugaugg CACCAUCAUCUACUCCUACU 350 / 395 1508 1803 2098
292006.1 L96 susg UGG AD- csasucaucudAcdTccuacuugga usdCscadAgdTaggadGudAgaugaug ACCAUCAUCUACUCCUACUU 1509 1804 2099
292007.1 L96 sgsu GGA AD- asuscaucuadCudCcuacuuggau asdTsccdAadGuaggdAgdTagaugau CCAUCAUCUACUCCUACUUG 1510 1805 2100
292008.1 L96 sgsg GAG AD- csasucuacudCcdTacuuggaguu asdAscudCcdAaguadGgdAguagaug AUCAUCUACUCCUACUUGGA 1511 1806 2101
292010.1 L96 sasu GUC AD- uscsuacuccdTadCuuggagucgu asdCsgadCudCcaagdTadGgaguagas CAUCUACUCCUACUUGGAGU 1512 1807 2102
292012.1 L96 usg CGU AD- csusacuccudAcdTuggagucguu asdAscgdAcdTccaadGudAggaguag AUCUACUCCUACUUGGAGUC 1513 1808 2103
292013.1 L96 sasu GUU AD- usascuccuadCudTggagucguuu asdAsacdGadCuccadAgdTaggagua UCUACUCCUACUUGGAGUCG 1514 1809 2104
292014.1 L96 sgsa UUG AD- ascsuccuacdTudGgagucguugu asdCsaadCgdAcuccdAadGuaggagu CUACUCCUACUUGGAGUCGU 1515 1810 2105
292015.1 L96 sasg UGG AD- csusccuacudTgdGagucguuggu asdCscadAcdGacucdCadAguaggag UACUCCUACUUGGAGUCGUU 1516 1811 2106
292016.1 L96 susa GGU AD- uscscuacuudGgdAgucguuggu asdAsccdAadCgacudCcdAaguagga ACUCCUACUUGGAGUCGUUG 1517 1812 2107
292017.1 uL96 sgsu GUG AD- gsuscguuggdTgdAaguuuuuca asdTsgadAadAacuudCadCcaacgacs GAGUCGUUGGUGAAGUUUUU 1518 1813 2108
292028.1 uL96 usc CAU
SEQ Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ sequência do mRNA alvo 5’ para 3’ ID duplex NO: NO: NO: AD- ususgguucudGudGggauauuaa asdTsuadAudAucccdAcdAgaaccaas UAUUGGUUCUGUGGGAUAUU 1519 1814 2109
292137.1 uL96 usa AAU AD- gsusucugugdGgdAuauuaauaa asdTsuadTudAauaudCcdCacagaacs UGGUUCUGUGGGAUAUUAAU 1520 1815 2110
292140.1 uL96 csa AAG AD- csusgugggadTadTuaauaagcgu asdCsgcdTudAuuaadTadTcccacags UUCUGUGGGAUAUUAAUAAG 1521 1816 2111
292143.1 L96 asa CGC AD- gscsugagugdCcdGaaaacuaggu asdCscudAgdTuuucdGgdCacucagc CAGCUGAGUGCCGAAAACUA 1522 1817 2112
292182.1 L96 susg GGC AD- csusgagugcdCgdAaaacuaggcu asdGsccdTadGuuuudCgdGcacucag AGCUGAGUGCCGAAAACUAG 1523 1818 2113
292183.1 L96 scsu GCG AD- gsasgugccgdAadAacuaggcguu asdAscgdCcdTaguudTudCggcacucs CUGAGUGCCGAAAACUAGGC 1524 1819 2114
292185.1 L96 asg GUC AD- asgsugccgadAadAcuaggcguca usdGsacdGcdCuagudTudTcggcacu UGAGUGCCGAAAACUAGGCG 1525 1820 2115
292186.1 L96 scsa UCA AD- gsusgccgaadAadCuaggcgucau asdTsgadCgdCcuagdTudTucggcacs GAGUGCCGAAAACUAGGCGU 351 / 395 1526 1821 2116
292187.1 L96 usc CAC AD- usgsccgaaadAcdTaggcgucacu asdGsugdAcdGccuadGudTuucggca AGUGCCGAAAACUAGGCGUC 1527 1822 2117
292188.1 L96 scsu ACU AD- gscscgaaaadCudAggcgucacuu asdAsgudGadCgccudAgdTuuucggc GUGCCGAAAACUAGGCGUCA 1528 1823 2118
292189.1 L96 sasc CUG AD- cscsgaaaacdTadGgcgucacugu asdCsagdTgdAcgccdTadGuuuucgg UGCCGAAAACUAGGCGUCAC 1529 1824 2119
292190.1 L96 scsa UGC AD- csasgagaagdAgdAucuaucgcuu asdAsgcdGadTagaudCudCuucucug AACAGAGAAGAGAUCUAUCG 1530 1825 2120
292238.1 L96 susu CUC AD- asgsagaucudAudCgcucucuaaa usdTsuadGadGagcgdAudAgaucucu GAAGAGAUCUAUCGCUCUCU 1531 1826 2121
292244.1 L96 susc AAA AD- gsasgaucuadTcdGcucucuaaau asdTsuudAgdAgagcdGadTagaucuc AAGAGAUCUAUCGCUCUCUA 1532 1827 2122
292245.1 L96 susu AAU AD- gsasucuaucdGcdTcucuaaauca usdGsaudTudAgagadGcdGauagauc GAGAUCUAUCGCUCUCUAAA 1533 1828 2123
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292248.1 L96 csu CAG AD- csusaucgcudCudCuaaaucaggu asdCscudGadTuuagdAgdAgcgauag AUCUAUCGCUCUCUAAAUCA 1535 1830 2125
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292696.1 L96 scsa AAA AD- asasuacuuadCcdAauaagaaaau asdTsuudTcdTuauudGgdTaaguauus GGAAUACUUACCAAUAAGAA 1643 1938 2233
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293562.1 L96 usa AAU AD- ususaggcucdAadAaauuaaagcu asdGscudTudAauuudTudGagccuaa UUUUAGGCUCAAAAAUUAAA 1752 2047 2342
293569.1 L96 sasa GCU
SEQ Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ sequência do mRNA alvo 5’ para 3’ ID duplex NO: NO: NO: AD- usasggcucadAadAauuaaagcua usdAsgcdTudTaauudTudTgagccuas UUUAGGCUCAAAAAUUAAAG 1753 2048 2343
293570.1 L96 asa CUA AD- asgsgcucaadAadAuuaaagcuaa usdTsagdCudTuaaudTudTugagccus UUAGGCUCAAAAAUUAAAGC 1754 2049 2344
293571.1 L96 asa UAA AD- gsgscucaaadAadTuaaagcuaau asdTsuadGcdTuuaadTudTuugagccs UAGGCUCAAAAAUUAAAGCU 1755 2050 2345
293572.1 L96 usa AAC AD- gscsucaaaadAudTaaagcuaaca usdGsuudAgdCuuuadAudTuuugag AGGCUCAAAAAUUAAAGCUA 1756 2051 2346
293573.1 L96 cscsu ACA AD- csuscaaaaadTudAaagcuaacau asdTsgudTadGcuuudAadTuuuugag GGCUCAAAAAUUAAAGCUAA 1757 2052 2347
293574.1 L96 scsc CAC AD- uscsaaaaaudTadAagcuaacaca usdGsugdTudAgcuudTadAuuuuuga GCUCAAAAAUUAAAGCUAAC 1758 2053 2348
293575.1 L96 sgsc ACA AD- csasaaaauudAadAgcuaacacau asdTsgudGudTagcudTudAauuuuug CUCAAAAAUUAAAGCUAACA 1759 2054 2349
293576.1 L96 sasg CAG AD- asasauuaaadGcdTaacacaggaa usdTsccdTgdTguuadGcdTuuaauuus AAAAAUUAAAGCUAACACAG 364 / 395 1760 2055 2350
293579.1 L96 usu GAA AD- asgscuaacadCadGgaaaaggaau asdTsucdCudTuuccdTgdTguuagcus AAAGCUAACACAGGAAAAGG 1761 2056 2351
293586.1 L96 usu AAC AD- usasacacagdGadAaaggaacugu asdCsagdTudCcuuudTcdCuguguua GCUAACACAGGAAAAGGAAC 1762 2057 2352
293589.1 L96 sgsc UGU AD- csascaggaadAadGgaacuguacu asdGsuadCadGuuccdTudTuccugug AACACAGGAAAAGGAACUGU 1763 2058 2353
293592.1 L96 susu ACU AD- csasggaaaadGgdAacuguacugu asdCsagdTadCaguudCcdTuuuccugs CACAGGAAAAGGAACUGUAC 1764 2059 2354
293594.1 L96 usg UGG AD- asgsgaacugdTadCuggcuauuau asdTsaadTadGccagdTadCaguuccus AAAGGAACUGUACUGGCUAU 1765 2060 2355
293601.1 L96 usu UAC AD- gsgsaacugudAcdTggcuauuaca usdGsuadAudAgccadGudAcaguucc AAGGAACUGUACUGGCUAUU 1766 2061 2356
293602.1 L96 susu ACA AD- csgsacucccdAcdTacaucaagau asdTscudTgdAuguadGudGggagucg UCCGACUCCCACUACAUCAA 1767 2062 2357
293872.1 L96 sgsa GAC AD- csuscccacudAcdAucaagacuaa usdTsagdTcdTugaudGudAgugggag GACUCCCACUACAUCAAGAC 1768 2063 2358
293875.1 L96 susc UAA AD- uscsccacuadCadTcaagacuaau asdTsuadGudCuugadTgdTaguggga ACUCCCACUACAUCAAGACU 1769 2064 2359
293876.1 L96 sgsu AAU AD- cscscacuacdAudCaagacuaauu asdAsuudAgdTcuugdAudGuagugg CUCCCACUACAUCAAGACUA 1770 2065 2360
293877.1 L96 gsasg AUC
SEQ Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ sequência do mRNA alvo 5’ para 3’ ID duplex NO: NO: NO: AD- cscsacuacadTcdAagacuaaucu asdGsaudTadGucuudGadTguagugg UCCCACUACAUCAAGACUAA 1771 2066 2361
293878.1 L96 sgsa UCU AD- csascuacaudCadAgacuaaucuu asdAsgadTudAgucudTgdAuguagug CCCACUACAUCAAGACUAAU 1772 2067 2362
293879.1 L96 sgsg CUU AD- ascsuacaucdAadGacuaaucuuu asdAsagdAudTagucdTudGauguagu CCACUACAUCAAGACUAAUC 1773 2068 2363
293880.1 L96 sgsg UUG AD- csusacaucadAgdAcuaaucuugu asdCsaadGadTuagudCudTgauguag CACUACAUCAAGACUAAUCU 1774 2069 2364
293881.1 L96 susg UGU AD- usascaucaadGadCuaaucuuguu asdAscadAgdAuuagdTcdTugaugua ACUACAUCAAGACUAAUCUU 1775 2070 2365
293882.1 L96 sgsu GUU AD- ascsaucaagdAcdTaaucuuguuu asdAsacdAadGauuadGudCuugaugu CUACAUCAAGACUAAUCUUG 1776 2071 2366
293883.1 L96 sasg UUU AD- ususgugugudTudTucacauguau asdTsacdAudGugaadAadAcacacaas UUUUGUGUGUUUUUCACAUG 1777 2072 2367
293898.1 L96 asa UAU AD- gsusguuuuudCadCauguauuaua usdAsuadAudAcaugdTgdAaaaacac GUGUGUUUUUCACAUGUAUU 365 / 395 1778 2073 2368
293902.1 L96 sasc AUA AD- uscsacaugudAudTauagaaugcu asdGscadTudCuauadAudAcauguga UUUCACAUGUAUUAUAGAAU 1779 2074 2369
293909.1 L96 sasa GCU AD- csascauguadTudAuagaaugcuu asdAsgcdAudTcuaudAadTacaugug UUCACAUGUAUUAUAGAAUG 1780 2075 2370
293910.1 L96 sasa CUU AD- usgsuauuaudAgdAaugcuuuug asdCsaadAadGcauudCudAuaauaca CAUGUAUUAUAGAAUGCUUU 1781 2076 2371
293914.1 uL96 susg UGC AD- gsusauuauadGadAugcuuuugca usdGscadAadAgcaudTcdTauaauacs AUGUAUUAUAGAAUGCUUUU 1782 2077 2372
293915.1 L96 asu GCA AD- usasuagaaudGcdTuuugcaugga usdCscadTgdCaaaadGcdAuucuauas AUUAUAGAAUGCUUUUGCAU 1783 2078 2373
293919.1 L96 asu GGA AD- asgsaaugcudTudTgcauggacua usdAsgudCcdAugcadAadAgcauucu AUAGAAUGCUUUUGCAUGGA 1784 2079 2374
293922.1 L96 sasu CUA AD- gsasaugcuudTudGcauggacuau asdTsagdTcdCaugcdAadAagcauucs UAGAAUGCUUUUGCAUGGAC 1785 2080 2375
293923.1 L96 usa UAU AD- asusgcuuuudGcdAuggacuaucu asdGsaudAgdTccaudGcdAaaagcau GAAUGCUUUUGCAUGGACUA 1786 2081 2376
293925.1 L96 susc UCC AD- csusuuugcadTgdGacuauccucu asdGsagdGadTagucdCadTgcaaaags UGCUUUUGCAUGGACUAUCC 1787 2082 2377
293928.1 L96 csa UCU AD- ususgcauggdAcdTauccucuugu asdCsaadGadGgauadGudCcaugcaa UUUUGCAUGGACUAUCCUCU 1788 2083 2378
293931.1 L96 sasa UGU
SEQ Nome do SEQ ID SEQ ID Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ sequência do mRNA alvo 5’ para 3’ ID duplex NO: NO: NO: AD- usgscauggadCudAuccucuuguu asdAscadAgdAggaudAgdTccaugca UUUGCAUGGACUAUCCUCUU 1789 2084 2379
293932.1 L96 sasa GUU AD- gscsauggacdTadTccucuuguuu asdAsacdAadGaggadTadGuccaugc UUGCAUGGACUAUCCUCUUG 1790 2085 2380
293933.1 L96 sasa UUU AD- csasuggacudAudCcucuuguuuu asdAsaadCadAgaggdAudAguccaug UGCAUGGACUAUCCUCUUGU 1791 2086 2381
293934.1 L96 scsa UUU AD- asusggacuadTcdCucuuguuuuu asdAsaadAcdAagagdGadTaguccau GCAUGGACUAUCCUCUUGUU 1792 2087 2382
293935.1 L96 sgsc UUU AD- usgsgacuaudCcdTcuuguuuuua usdAsaadAadCaagadGgdAuagucca CAUGGACUAUCCUCUUGUUU 1793 2088 2383
293936.1 L96 susg UUA AD- gsgsacuaucdCudCuuguuuuuau asdTsaadAadAcaagdAgdGauagucc AUGGACUAUCCUCUUGUUUU 1794 2089 2384
293937.1 L96 sasu UAU AD- gsascuauccdTcdTuguuuuuauu asdAsuadAadAacaadGadGgauaguc UGGACUAUCCUCUUGUUUUU 1795 2090 2385
293938.1 L96 scsa AUU AD- csusauccucdTudGuuuuuauuaa usdTsaadTadAaaacdAadGaggauags GACUAUCCUCUUGUUUUUAU 366 / 395 1796 2091 2386
293940.1 L96 usc UAA * Alvo: HSD17B13
Tabela 11. Sequência não modificada de DNA de HSD17B13 NonF*
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
ACACAAGGACTGAACCAGA ATUCTGGUUCAGUCCUUGUGU AD-291929.1 2387 25-45 2682 23-45
AU AG
ACAAGGACTGAACCAGAAG UCCUTCTGGUUCAGUCCUUGU AD-291931.1 2388 27-47 2683 25-47
GA GU
UCCUUCUGCUTCUGAUCAC UGGUGATCAGAAGCAGAAGG AD-291988.1 2389 85-105 2684 83-105
CA AUU
CUGCUUCUGATCACCAUCA AAUGAUGGUGATCAGAAGCA AD-291993.1 2390 90-110 2685 88-110
UU GAA
UCUGAUCACCAUCAUCUAC AAGUAGAUGAUGGTGAUCAG AD-291998.1 2391 95-115 2686 93-115
UU AAG
ACCAUCAUCUACUCCUACU AAAGTAGGAGUAGAUGAUGG AD-292005.1 2392 102-122 2687 100-122
UU UGA
CCAUCAUCTACUCCUACUU ACAAGUAGGAGTAGAUGAUG 367 / 395 AD-292006.1 2393 103-123 2688 101-123
GU GUG
CAUCAUCUACTCCUACUUG UCCAAGTAGGAGUAGAUGAU AD-292007.1 2394 104-124 2689 102-124
GA GGU
AUCAUCUACUCCUACUUGG ATCCAAGUAGGAGTAGAUGAU AD-292008.1 2395 105-125 2690 103-125
AU GG
CAUCUACUCCTACUUGGAG AACUCCAAGUAGGAGUAGAU AD-292010.1 2396 107-127 2691 105-127
UU GAU
UCUACUCCTACUUGGAGUC ACGACUCCAAGTAGGAGUAGA AD-292012.1 2397 109-129 2692 107-129
GU UG
CUACUCCUACTUGGAGUCG AACGACTCCAAGUAGGAGUAG AD-292013.1 2398 110-130 2693 108-130
UU AU
UACUCCUACUTGGAGUCGU AAACGACUCCAAGTAGGAGUA AD-292014.1 2399 111-131 2694 109-131
UU GA
ACUCCUACTUGGAGUCGUU ACAACGACUCCAAGUAGGAGU AD-292015.1 2400 112-132 2695 110-132
GU AG
UCCUACUUGGAGUCGUUGG AACCAACGACUCCAAGUAGGA AD-292017.1 2402 114-134 2697 112-134
UU GU
GUCGUUGGTGAAGUUUUUC ATGAAAAACUUCACCAACGAC AD-292028.1 2403 125-145 2698 123-145
AU UC
UUGGUUCUGUGGGAUAUUA ATUAAUAUCCCACAGAACCAA AD-292137.1 2404 252-272 2699 250-272
AU UA
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
GUUCUGUGGGAUAUUAAUA ATUATUAAUAUCCCACAGAAC AD-292140.1 2405 255-275 2700 253-275
AU CA
CUGUGGGATATUAAUAAGC ACGCTUAUUAATATCCCACAG AD-292143.1 2406 258-278 2701 256-278
GU AA
GCUGAGUGCCGAAAACUAG ACCUAGTUUUCGGCACUCAGC AD-292182.1 2407 297-317 2702 295-317
GU UG
CUGAGUGCCGAAAACUAGG AGCCTAGUUUUCGGCACUCAG AD-292183.1 2408 298-318 2703 296-318
CU CU
GAGUGCCGAAAACUAGGCG AACGCCTAGUUTUCGGCACUC AD-292185.1 2409 300-320 2704 298-320
UU AG
AGUGCCGAAAACUAGGCGU UGACGCCUAGUTUTCGGCACU AD-292186.1 2410 301-321 2705 299-321
CA CA
GUGCCGAAAACUAGGCGUC ATGACGCCUAGTUTUCGGCAC AD-292187.1 2411 302-322 2706 300-322
AU UC
UGCCGAAAACTAGGCGUCA AGUGACGCCUAGUTUUCGGCA 368 / 395 AD-292188.1 2412 303-323 2707 301-323
CU CU
GCCGAAAACUAGGCGUCAC AAGUGACGCCUAGTUUUCGGC AD-292189.1 2413 304-324 2708 302-324
UU AC
CCGAAAACTAGGCGUCACU ACAGTGACGCCTAGUUUUCGG AD-292190.1 2414 305-325 2709 303-325
GU CA
CAGAGAAGAGAUCUAUCGC AAGCGATAGAUCUCUUCUCUG AD-292238.1 2415 353-373 2710 351-373
UU UU
AGAGAUCUAUCGCUCUCUA UTUAGAGAGCGAUAGAUCUCU AD-292244.1 2416 359-379 2711 357-379
AA UC
GAGAUCUATCGCUCUCUAA ATUUAGAGAGCGATAGAUCUC AD-292245.1 2417 360-380 2712 358-380
AU UU
GAUCUAUCGCTCUCUAAAU UGAUTUAGAGAGCGAUAGAU AD-292247.1 2418 362-382 2713 360-382
CA CUC
AUCUAUCGCUCUCUAAAUC ATGATUTAGAGAGCGAUAGAU AD-292248.1 2419 363-383 2714 361-383
AU CU
CUAUCGCUCUCUAAAUCAG ACCUGATUUAGAGAGCGAUAG AD-292250.1 2420 365-385 2715 363-385
GU AU
UAUCGCUCTCTAAAUCAGG AACCTGAUUUAGAGAGCGAUA AD-292251.1 2421 366-386 2716 364-386
UU GA
UCGCUCUCTAAAUCAGGUG UTCACCTGAUUTAGAGAGCGA AD-292253.1 2423 368-388 2718 366-388
AA UA
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
CGCUCUCUAAAUCAGGUGA ATUCACCUGAUTUAGAGAGCG AD-292254.1 2424 369-389 2719 367-389
AU AU
UCUCUAAATCAGGUGAAGA UTUCTUCACCUGATUUAGAGA AD-292257.1 2425 372-392 2720 370-392
AA GC
AUGCUGGGACAGUAUAUCC ATGGAUAUACUGUCCCAGCAU AD-292309.1 2426 424-444 2721 422-444
AU UA
UGCUGGGACAGUAUAUCCA ACUGGATAUACTGTCCCAGCA AD-292310.1 2427 425-445 2722 423-445
GU UU
GGACAGUATATCCAGCCGA AAUCGGCUGGATATACUGUCC AD-292315.1 2428 430-450 2723 428-450
UU CA
CAGUAUAUCCAGCCGAUCU AAAGAUCGGCUGGAUAUACU AD-292318.1 2429 433-453 2724 431-453
UU GUC
ACCAAGGATGAAGAGAUUA AGUAAUCUCUUCATCCUUGGU AD-292344.1 2430 459-479 2725 457-479
CU GC
CCAAGGAUGAAGAGAUUAC UGGUAATCUCUTCAUCCUUGG 369 / 395 AD-292345.1 2431 460-480 2726 458-480
CA UG
CAAGGAUGAAGAGAUUACC UTGGTAAUCUCTUCAUCCUUG AD-292346.1 2432 461-481 2727 459-481
AA GU
CCAAGACATUTGAGGUCAA UGUUGACCUCAAATGUCUUGG AD-292363.1 2433 478-498 2728 476-498
CA UA
AGACAUUUGAGGUCAACAU AGAUGUTGACCTCAAAUGUCU AD-292366.1 2434 481-501 2729 479-501
CU UG
GACAUUUGAGGUCAACAUC AGGATGTUGACCUCAAAUGUC AD-292367.1 2435 482-502 2730 480-502
CU UU
CAUUUGAGGUCAACAUCCU ATAGGATGUUGACCUCAAAUG AD-292369.1 2436 484-504 2731 482-504
AU UC
AUUUGAGGTCAACAUCCUA ACUAGGAUGUUGACCUCAAA AD-292370.1 2437 485-505 2732 483-505
GU UGU
UUUGAGGUCAACAUCCUAG UCCUAGGAUGUTGACCUCAAA AD-292371.1 2438 486-506 2733 484-506
GA UG
UGAGGUCAACAUCCUAGGA UGUCCUAGGAUGUTGACCUCA AD-292373.1 2439 488-508 2734 486-508
CA AA
GAGGUCAACATCCUAGGAC ATGUCCTAGGATGTUGACCUC AD-292374.1 2440 489-509 2735 487-509
AU AA
GGUCAACATCCUAGGACAU AAAUGUCCUAGGATGUUGACC AD-292376.1 2441 491-511 2736 489-511
UU UC
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
GUCAACAUCCTAGGACAUU AAAATGTCCUAGGAUGUUGAC AD-292377.1 2442 492-512 2737 490-512
UU CU
CAACAUCCTAGGACAUUUU CAAAAATGUCCTAGGAUGUUG AD-292379.1 2443 494-514 2738 492-514
UG AC
AACAUCCUAGGACAUUUUU ACAAAAAUGUCCUAGGAUGU AD-292380.1 2444 495-515 2739 493-515
GU UGA
ACAUCCUAGGACAUUUUUG UCCAAAAAUGUCCTAGGAUGU AD-292381.1 2445 496-516 2740 494-516
GA UG
CAUCCUAGGACAUUUUUGG ATCCAAAAAUGTCCUAGGAUG AD-292382.1 2446 497-517 2741 495-517
AU UU
AUCCUAGGACAUUUUUGGA AAUCCAAAAAUGUCCUAGGA AD-292383.1 2447 498-518 2742 496-518
UU UGU
UCCUAGGACATUUUUGGAU UGAUCCAAAAATGTCCUAGGA AD-292384.1 2448 499-519 2743 497-519
CA UG
CCUAGGACAUTUUUGGAUC ATGATCCAAAAAUGUCCUAGG 370 / 395 AD-292385.1 2449 500-520 2744 498-520
AU AU
AGGACAUUTUTGGAUCACA UTUGTGAUCCAAAAAUGUCCU AD-292388.1 2450 503-523 2745 501-523
AA AG
GGACAUUUTUGGAUCACAA UTUUGUGAUCCAAAAAUGUCC AD-292389.1 2451 504-524 2746 502-524
AA UA
GACAUUUUTGGAUCACAAA ATUUTGTGAUCCAAAAAUGUC AD-292390.1 2452 505-525 2747 503-525
AU CU
UUUUUGGATCACAAAAGCA AGUGCUTUUGUGATCCAAAAA AD-292394.1 2453 509-529 2748 507-529
CU UG
UUGGAUCACAAAAGCACUU AGAAGUGCUUUTGTGAUCCAA AD-292397.1 2454 512-532 2749 510-532
CU AA
UGGAUCACAAAAGCACUUC AAGAAGTGCUUTUGUGAUCCA AD-292398.1 2455 513-533 2750 511-533
UU AA
GGAUCACAAAAGCACUUCU AAAGAAGUGCUTUTGUGAUCC AD-292399.1 2456 514-534 2751 512-534
UU AA
CACAAAAGCACUUCUUCCA AAUGGAAGAAGTGCUUUUGU AD-292403.1 2457 518-538 2752 516-538
UU GAU
ACAAAAGCACTUCUUCCAU AGAUGGAAGAAGUGCUUUUG AD-292404.1 2458 519-539 2753 517-539
CU UGA
CAAAAGCACUTCUUCCAUC UCGATGGAAGAAGTGCUUUUG AD-292405.1 2459 520-540 2754 518-540
GA UG
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AAAAGCACTUCUUCCAUCG ATCGAUGGAAGAAGUGCUUU AD-292406.1 2460 521-541 2755 519-541
AU UGU
AAAGCACUTCTUCCAUCGA AAUCGATGGAAGAAGUGCUU AD-292407.1 2461 522-542 2756 520-542
UU UUG
AGCACUUCTUCCAUCGAUG ATCATCGAUGGAAGAAGUGCU AD-292409.1 2463 524-544 2758 522-544
AU UU
GCACUUCUTCCAUCGAUGA AAUCAUCGAUGGAAGAAGUG AD-292410.1 2464 525-545 2759 523-545
UU CUU
AGAAAUCATGGCCACAUCG AACGAUGUGGCCATGAUUUCU AD-292434.1 2465 549-569 2760 547-569
UU CU
UUCCUUACCUCAUCCCAUA AAUATGGGAUGAGGUAAGGA AD-292486.1 2466 601-621 2761 599-621
UU AUC
UCCUUACCTCAUCCCAUAU AAAUAUGGGAUGAGGUAAGG AD-292487.1 2467 602-622 2762 600-622
UU AAU
ACCUCAUCCCAUAUUGUUC UGGAACAAUAUGGGAUGAGG 371 / 395 AD-292492.1 2468 607-627 2763 605-627
CA UAA
UCAUCCCATATUGUUCCAG UGCUGGAACAATATGGGAUGA AD-292495.1 2469 610-630 2764 608-630
CA GG
UCCCAUAUTGTUCCAGCAA ATUUGCTGGAACAAUAUGGGA AD-292498.1 2470 613-633 2765 611-633
AU UG
CCCAUAUUGUTCCAGCAAA AAUUTGCUGGAACAAUAUGG AD-292499.1 2471 614-634 2766 612-634
UU GAU
UGUUGGCUTUCACAGAGGU AGACCUCUGUGAAAGCCAACA AD-292526.1 2472 641-661 2767 639-661
CU GC
GCUUUCACAGAGGUCUGAC ATGUCAGACCUCUGUGAAAGC AD-292531.1 2473 646-666 2768 644-666
AU CA
UUCACAGAGGTCUGACAUC ATGATGTCAGACCTCUGUGAA AD-292534.1 2474 649-669 2769 647-669
AU AG
CACAGAGGTCTGACAUCAG UTCUGATGUCAGACCUCUGUG AD-292536.1 2475 651-671 2770 649-671
AA AA
AGGUCUGACATCAGAACUU UGAAGUTCUGATGTCAGACCU AD-292541.1 2476 656-676 2771 654-676
CA CU
UUGGGAAAAACUGGUAUCA UTUGAUACCAGTUTUUCCCAA AD-292566.1 2477 681-701 2772 679-701
AA GG
AACUGGUATCAAAACCUCA AAUGAGGUUUUGATACCAGU AD-292574.1 2478 689-709 2773 687-709
UU UUU
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
ACUGGUAUCAAAACCUCAU ACAUGAGGUUUTGAUACCAGU AD-292575.1 2479 690-710 2774 688-710
GU UU
CUGGUAUCAAAACCUCAUG AACATGAGGUUTUGAUACCAG AD-292576.1 2480 691-711 2775 689-711
UU UU
UGGUAUCAAAACCUCAUGU AGACAUGAGGUTUTGAUACCA AD-292577.1 2481 692-712 2776 690-712
CU GU
GGUAUCAAAACCUCAUGUC AAGACATGAGGTUTUGAUACC AD-292578.1 2482 693-713 2777 691-713
UU AG
GUAUCAAAACCUCAUGUCU AGAGACAUGAGGUTUUGAUA AD-292579.1 2483 694-714 2778 692-714
CU CCA
UCAAAACCTCAUGUCUCUG AGCAGAGACAUGAGGUUUUG AD-292582.1 2484 697-717 2779 695-717
CU AUA
CUCUGCCCAGTUUUUGUGA ATUCACAAAAACUGGGCAGAG AD-292596.1 2485 711-731 2780 709-731
AU AC
CCCAGUUUTUGUGAAUACU ACAGTATUCACAAAAACUGGG 372 / 395 AD-292601.1 2486 716-736 2781 714-736
GU CA
UUUUUGUGAATACUGGGUU UGAACCCAGUATUCACAAAAA AD-292606.1 2487 721-741 2782 719-741
CA CU
UUUUGUGAAUACUGGGUUC ATGAACCCAGUAUTCACAAAA AD-292607.1 2488 722-742 2783 720-742
AU AC
UGUGAAUACUGGGUUCACC UTGGTGAACCCAGTAUUCACA AD-292610.1 2489 725-745 2784 723-745
AA AA
UGAAUACUGGGUUCACCAA UTUUGGTGAACCCAGUAUUCA AD-292612.1 2490 727-747 2785 725-747
AA CA
GAAUACUGGGTUCACCAAA UTUUTGGUGAACCCAGUAUUC AD-292613.1 2491 728-748 2786 726-748
AA AC
AAUACUGGGUTCACCAAAA ATUUTUGGUGAACCCAGUAUU AD-292614.1 2492 729-749 2787 727-749
AU CA
AUACUGGGTUCACCAAAAA AAUUTUTGGUGAACCCAGUAU AD-292615.1 2493 730-750 2788 728-750
UU UC
UACUGGGUTCACCAAAAAU AGAUTUTUGGUGAACCCAGUA AD-292616.1 2494 731-751 2789 729-751
CU UU
UCACCAAAAATCCAAGCAC UTGUGCTUGGATUTUUGGUGA AD-292624.1 2495 739-759 2790 737-759
AA AC
CACCAAAAAUCCAAGCACA ATUGTGCUUGGAUTUUUGGUG AD-292625.1 2496 740-760 2791 738-760
AU AA
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AAAAAUCCAAGCACAAGAU UAAUCUTGUGCTUGGAUUUUU AD-292629.1 2497 744-764 2792 742-764
UA GG
AAAAUCCAAGCACAAGAUU ATAATCTUGUGCUTGGAUUUU AD-292630.1 2498 745-765 2793 743-765
AU UG
AAAUCCAAGCACAAGAUUA AAUAAUCUUGUGCTUGGAUU AD-292631.1 2499 746-766 2794 744-766
UU UUU
UCCAAGCACAAGAUUAUGG AGCCAUAAUCUTGTGCUUGGA AD-292634.1 2500 749-769 2795 747-769
CU UU
GCACAAGATUAUGGCCUGU ATACAGGCCAUAATCUUGUGC AD-292639.1 2502 754-774 2797 752-774
AU UU
CACAAGAUTATGGCCUGUA AAUACAGGCCATAAUCUUGUG AD-292640.1 2503 755-775 2798 753-775
UU CU
ACAAGAUUAUGGCCUGUAU AAAUACAGGCCAUAAUCUUG AD-292641.1 2504 756-776 2799 754-776
UU UGC
CAAGAUUATGGCCUGUAUU ACAATACAGGCCATAAUCUUG 373 / 395 AD-292642.1 2505 757-777 2800 755-777
GU UG
AUUAUGGCCUGUAUUGGAG ATCUCCAAUACAGGCCAUAAU AD-292646.1 2506 761-781 2801 759-781
AU CU
UGGCCUGUAUTGGAGACAG ATCUGUCUCCAAUACAGGCCA AD-292650.1 2507 765-785 2802 763-785
AU UA
GGCCUGUATUGGAGACAGA AAUCTGTCUCCAATACAGGCC AD-292651.1 2508 766-786 2803 764-786
UU AU
GCCUGUAUTGGAGACAGAU UCAUCUGUCUCCAAUACAGGC AD-292652.1 2509 767-787 2804 765-787
GA CA
AGAUGAAGTCGUAAGAAGU AGACTUCUUACGACUUCAUCU AD-292667.1 2510 782-802 2805 780-802
CU GU
GAUGAAGUCGTAAGAAGUC AAGACUTCUUACGACUUCAUC AD-292668.1 2511 783-803 2806 781-803
UU UG
GAAGUCGUAAGAAGUCUGA UAUCAGACUUCTUACGACUUC AD-292671.1 2512 786-806 2807 784-806
UA AU
AGUCGUAAGAAGUCUGAUA UCUATCAGACUTCTUACGACU AD-292673.1 2513 788-808 2808 786-808
GA UC
GUAAGAAGTCTGAUAGAUG UCCATCTAUCAGACUUCUUAC AD-292677.1 2514 792-812 2809 790-812
GA GA
UAAGAAGUCUGAUAGAUGG UTCCAUCUAUCAGACUUCUUA AD-292678.1 2515 793-813 2810 791-813
AA CG
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AAGAAGUCTGAUAGAUGGA ATUCCATCUAUCAGACUUCUU AD-292679.1 2516 794-814 2811 792-814
AU AC
AGAAGUCUGATAGAUGGAA UAUUCCAUCUATCAGACUUCU AD-292680.1 2517 795-815 2812 793-815
UA UA
GAAGUCUGAUAGAUGGAAU ATAUTCCAUCUAUCAGACUUC AD-292681.1 2518 796-816 2813 794-816
AU UU
AAGUCUGATAGAUGGAAUA AGUATUCCAUCTATCAGACUU AD-292682.1 2519 797-817 2814 795-817
CU CU
GUCUGAUAGATGGAAUACU UAAGTATUCCATCTAUCAGAC AD-292684.1 2520 799-819 2815 797-819
UA UU
UCUGAUAGAUGGAAUACUU ATAAGUAUUCCAUCUAUCAGA AD-292685.1 2521 800-820 2816 798-820
AU CU
AGAUGGAATACUUACCAAU UTAUTGGUAAGTATUCCAUCU AD-292691.1 2522 806-826 2817 804-826
AA AU
GAUGGAAUACTUACCAAUA ATUATUGGUAAGUAUUCCAUC 374 / 395 AD-292692.1 2523 807-827 2818 805-827
AU UA
AUGGAAUACUTACCAAUAA UCUUAUTGGUAAGTAUUCCAU AD-292693.1 2524 808-828 2819 806-828
GA CU
UGGAAUACTUACCAAUAAG UTCUTATUGGUAAGUAUUCCA AD-292694.1 2525 809-829 2820 807-829
AA UC
GGAAUACUTACCAAUAAGA UTUCTUAUUGGTAAGUAUUCC AD-292695.1 2526 810-830 2821 808-830
AA AU
GAAUACUUACCAAUAAGAA UTUUCUTAUUGGUAAGUAUUC AD-292696.1 2527 811-831 2822 809-831
AA CA
AAUACUUACCAAUAAGAAA ATUUTCTUAUUGGTAAGUAUU AD-292697.1 2528 812-832 2823 810-832
AU CC
GUUCCAUCGUAUAUCAAUA AAUATUGAUAUACGAUGGAA AD-292725.1 2529 840-860 2824 838-860
UU CAA
UUCCAUCGTATAUCAAUAU AGAUAUTGAUATACGAUGGAA AD-292726.1 2530 841-861 2825 839-861
CU CA
UCCAUCGUAUAUCAAUAUC AAGATATUGAUAUACGAUGGA AD-292727.1 2531 842-862 2826 840-862
UU AC
CCAUCGUATATCAAUAUCU AAAGAUAUUGATATACGAUGG AD-292728.1 2532 843-863 2827 841-863
UU AA
ACAGAAGUTUCUUCCUGAA AGUUCAGGAAGAAACUUCUG AD-292757.1 2533 872-892 2828 870-892
CU UAG
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AGAAGUUUCUTCCUGAACG AGCGTUCAGGAAGAAACUUCU AD-292759.1 2534 874-894 2829 872-894
CU GU
AAGUUUCUTCCUGAACGCG AGCGCGTUCAGGAAGAAACUU AD-292761.1 2535 876-896 2830 874-896
CU CU
UCUUCCUGAACGCGCCUCA ACUGAGGCGCGTUCAGGAAGA AD-292766.1 2536 881-901 2831 879-901
GU AA
GAUUUUAAAUCGUAUGCAG UTCUGCAUACGAUTUAAAAUC AD-292787.1 2537 902-922 2832 900-922
AA GC
AUUUUAAATCGUAUGCAGA ATUCTGCAUACGATUUAAAAU AD-292788.1 2538 903-923 2833 901-923
AU CG
AAAUCGUATGCAGAAUAUU UGAATATUCUGCATACGAUUU AD-292793.1 2540 908-928 2835 906-928
CA AA
AUCGUAUGCAGAAUAUUCA ATUGAATAUUCTGCAUACGAU AD-292795.1 2541 910-930 2836 908-930
AU UU
UCGUAUGCAGAAUAUUCAA AAUUGAAUAUUCUGCAUACG 375 / 395 AD-292796.1 2542 911-931 2837 909-931
UU AUU
CGUAUGCAGAAUAUUCAAU AAAUTGAAUAUTCTGCAUACG AD-292797.1 2543 912-932 2838 910-932
UU AU
AUGCAGAATATUCAAUUUG UTCAAATUGAATATUCUGCAU AD-292800.1 2544 915-935 2839 913-935
AA AC
GCAGAAUATUCAAUUUGAA ACUUCAAAUUGAATAUUCUGC AD-292802.1 2545 917-937 2840 915-937
GU AU
AAUAUUCAAUTUGAAGCAG AACUGCTUCAAAUTGAAUAUU AD-292806.1 2546 921-941 2841 919-941
UU CU
GAUGUAUGCATGAUAAUGA UAUCAUTAUCATGCAUACAUC AD-292870.1 2548 989-1009 2843 987-1009
UA UC
AAUAGUUUCGAAUCAAUGC AAGCAUTGAUUCGAAACUAUU AD-292893.1 2549 1012-1032 2844 1010-1032
UU CA
CAAUGCUGCAAAGCUUUAU AAAUAAAGCUUTGCAGCAUUG AD-292906.1 2550 1025-1045 2845 1023-1045
UU AU
AAAGCUUUAUTUCACAUUU AAAAAUGUGAAAUAAAGCUU AD-292915.1 2551 1034-1054 2846 1032-1054
UU UGC
AAAACAUUGGTUUGGCACU ATAGTGCCAAACCAAUGUUUU AD-292936.1 2553 1073-1093 2848 1071-1093
AU UA
ACGAACAAGATUAAUUACC AAGGTAAUUAATCTUGUUCGU AD-292967.1 2554 1104-1124 2849 1102-1124
UU UU
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AACAAGAUTAAUUACCUGU AGACAGGUAAUTAAUCUUGU AD-292970.1 2555 1107-1127 2850 1105-1127
CU UCG
AGAUUAAUTACCUGUCUUC AGGAAGACAGGTAAUUAAUC AD-292974.1 2556 1111-1131 2851 1109-1131
CU UUG
GAUUAAUUACCUGUCUUCC AAGGAAGACAGGUAAUUAAU AD-292975.1 2557 1112-1132 2852 1110-1132
UU CUU
UAAUUACCTGTCUUCCUGU AAACAGGAAGACAGGUAAUU AD-292978.1 2558 1115-1135 2853 1113-1135
UU AAU
AAUUACCUGUCUUCCUGUU GAAACAGGAAGACAGGUAAU AD-292979.1 2559 1116-1136 2854 1114-1136
UC UAA
AUUACCUGTCTUCCUGUUU AGAAACAGGAAGACAGGUAA AD-292980.1 2560 1117-1137 2855 1115-1137
CU UUA
UUACCUGUCUTCCUGUUUC AAGAAACAGGAAGACAGGUA AD-292981.1 2561 1118-1138 2856 1116-1138
UU AUU
UACCUGUCTUCCUGUUUCU UGAGAAACAGGAAGACAGGU 376 / 395 AD-292982.1 2562 1119-1139 2857 1117-1139
CA AAU
ACCUGUCUTCCUGUUUCUC UTGAGAAACAGGAAGACAGG AD-292983.1 2563 1120-1140 2858 1118-1140
AA UAA
CCUGUCUUCCTGUUUCUCA ATUGAGAAACAGGAAGACAG AD-292984.1 2564 1121-1141 2859 1119-1141
AU GUA
GGUCUGUUTUTCCUUUCAU ACAUGAAAGGAAAAACAGAC AD-293027.1 2565 1164-1184 2860 1162-1184
GU CUA
GUCUGUUUTUCCUUUCAUG AGCATGAAAGGAAAAACAGAC AD-293028.1 2566 1165-1185 2861 1163-1185
CU CU
UUUUCCUUTCAUGCCUCUU UTAAGAGGCAUGAAAGGAAA AD-293034.1 2567 1171-1191 2862 1169-1191
AA AAC
UCCUUUCATGCCUCUUAAA UTUUTAAGAGGCATGAAAGGA AD-293037.1 2568 1174-1194 2863 1172-1194
AA AA
CUUUCAUGCCTCUUAAAAA AGUUTUTAAGAGGCAUGAAAG AD-293039.1 2569 1176-1196 2864 1174-1196
CU GA
UUUUUCCATUTAAAGGUGG ATCCACCUUUAAATGGAAAAA AD-293099.1 2570 1245-1265 2865 1243-1265
AU UA
AACUUAUUTACACAGGGAA ACUUCCCUGUGTAAAUAAGUU AD-293153.1 2571 1299-1319 2866 1297-1319
GU CU
UUAUUUACACAGGGAAGGU AAACCUTCCCUGUGUAAAUAA AD-293156.1 2572 1302-1322 2867 1300-1322
UU GU
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
ACACAGGGAAGGUUUAAGA AGUCTUAAACCTUCCCUGUGU AD-293162.1 2573 1308-1328 2868 1306-1328
CU AA
CACAGGGAAGGUUUAAGAC AAGUCUTAAACCUTCCCUGUG AD-293163.1 2574 1309-1329 2869 1307-1329
UU UA
AGGGAAGGTUTAAGACUGU AAACAGTCUUAAACCUUCCCU AD-293166.1 2575 1312-1332 2870 1310-1332
UU GU
GGGAAGGUTUAAGACUGUU UGAACAGUCUUAAACCUUCCC AD-293167.1 2576 1313-1333 2871 1311-1333
CA UG
GGAAGGUUTAAGACUGUUC UTGAACAGUCUTAAACCUUCC AD-293168.1 2577 1314-1334 2872 1312-1334
AA CU
GAAGGUUUAAGACUGUUCA ATUGAACAGUCTUAAACCUUC AD-293169.1 2578 1315-1335 2873 1313-1335
AU CC
AAGGUUUAAGACUGUUCAA ACUUGAACAGUCUTAAACCUU AD-293170.1 2579 1316-1336 2874 1314-1336
GU CC
AGGUUUAAGACUGUUCAAG UACUTGAACAGTCTUAAACCU 377 / 395 AD-293171.1 2580 1317-1337 2875 1315-1337
UA UC
GGUUUAAGACTGUUCAAGU ATACTUGAACAGUCUUAAACC AD-293172.1 2581 1318-1338 2876 1316-1338
AU UU
UUUAAGACTGTUCAAGUAG UGCUACTUGAACAGUCUUAAA AD-293174.1 2582 1320-1340 2877 1318-1340
CA CC
AAGACUGUTCAAGUAGCAU AAAUGCTACUUGAACAGUCUU AD-293177.1 2584 1323-1343 2879 1321-1343
UU AA
AGACUGUUCAAGUAGCAUU AGAATGCUACUTGAACAGUCU AD-293178.1 2585 1324-1344 2880 1322-1344
CU UA
GACUGUUCAAGUAGCAUUC UGGAAUGCUACTUGAACAGUC AD-293179.1 2586 1325-1345 2881 1323-1345
CA UU
ACUGUUCAAGTAGCAUUCC UTGGAATGCUACUTGAACAGU AD-293180.1 2587 1326-1346 2882 1324-1346
AA CU
CUGUUCAAGUAGCAUUCCA ATUGGAAUGCUACTUGAACAG AD-293181.1 2588 1327-1347 2883 1325-1347
AU UC
UGUUCAAGTAGCAUUCCAA AAUUGGAAUGCTACUUGAACA AD-293182.1 2589 1328-1348 2884 1326-1348
UU GU
GUUCAAGUAGCAUUCCAAU AGAUTGGAAUGCUACUUGAAC AD-293183.1 2590 1329-1349 2885 1327-1349
CU AG
UUCAAGUAGCAUUCCAAUC AAGATUGGAAUGCTACUUGAA AD-293184.1 2591 1330-1350 2886 1328-1350
UU CA
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
CAAGUAGCAUTCCAAUCUG UACAGATUGGAAUGCUACUUG AD-293186.1 2592 1332-1352 2887 1330-1352
UA AA
AAGUAGCATUCCAAUCUGU ATACAGAUUGGAATGCUACUU AD-293187.1 2593 1333-1353 2888 1331-1353
AU GA
AGCAUUCCAATCUGUAGCC ATGGCUACAGATUGGAAUGCU AD-293191.1 2594 1337-1357 2889 1335-1357
AU AC
GAAUAUCAACAAGAACACA UCUGTGTUCUUGUTGAUAUUC AD-293218.1 2595 1364-1384 2890 1362-1384
GA UG
AAGAACACAGAAUGAGUGC ATGCACTCAUUCUGUGUUCUU AD-293228.1 2596 1374-1394 2891 1372-1394
AU GU
GAACACAGAATGAGUGCAC ATGUGCACUCATUCUGUGUUC AD-293230.1 2597 1376-1396 2892 1374-1396
AU UU
AACACAGAAUGAGUGCACA ACUGTGCACUCAUTCUGUGUU AD-293231.1 2598 1377-1397 2893 1375-1397
GU CU
CAGAAUGAGUGCACAGCUA ATUAGCTGUGCACTCAUUCUG 378 / 395 AD-293235.1 2599 1381-1401 2894 1379-1401
AU UG
AGGCAGCUTUAUCUCAACC AAGGTUGAGAUAAAGCUGCCU AD-293271.1 2600 1417-1437 2895 1415-1437
UU GC
GCAGCUUUAUCUCAACCUG UCCAGGTUGAGAUAAAGCUGC AD-293273.1 2601 1419-1439 2896 1417-1439
GA CU
UUCAGCAUTUGAAAGAUUU AGAAAUCUUUCAAAUGCUGA AD-293306.1 2602 1452-1472 2897 1450-1472
CU AUC
AGCAUUUGAAAGAUUUCCC UAGGGAAAUCUTUCAAAUGCU AD-293309.1 2603 1455-1475 2898 1453-1475
UA GA
CAUUUGAAAGAUUUCCCUA ACUAGGGAAAUCUTUCAAAUG AD-293311.1 2604 1457-1477 2899 1455-1477
GU CU
AUUUGAAAGATUUCCCUAG AGCUAGGGAAATCTUUCAAAU AD-293312.1 2605 1458-1478 2900 1456-1478
CU GC
UGAAAGAUTUCCCUAGCCU AGAGGCTAGGGAAAUCUUUCA AD-293315.1 2606 1461-1481 2901 1459-1481
CU AA
UUCCCUAGCCTCUUCCUUU AAAAAGGAAGAGGCUAGGGA AD-293323.1 2608 1469-1489 2903 1467-1489
UU AAU
AAAACGGUGCAACUCUAUU AGAATAGAGUUGCACCGUUUU AD-293353.1 2609 1499-1519 2904 1497-1519
CU GG
AAACGGUGCAACUCUAUUC AAGAAUAGAGUTGCACCGUUU AD-293354.1 2610 1500-1520 2905 1498-1520
UU UG
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AACGGUGCAACUCUAUUCU ACAGAATAGAGTUGCACCGUU AD-293355.1 2611 1501-1521 2906 1499-1521
GU UU
GUGCAACUCUAUUCUGGAC AAGUCCAGAAUAGAGUUGCA AD-293359.1 2613 1505-1525 2908 1503-1525
UU CCG
UGCAACUCTATUCUGGACU AAAGTCCAGAATAGAGUUGCA AD-293360.1 2614 1506-1526 2909 1504-1526
UU CC
GCAACUCUAUTCUGGACUU UAAAGUCCAGAAUAGAGUUG AD-293361.1 2615 1507-1527 2910 1505-1527
UA CAC
CAACUCUATUCUGGACUUU ATAAAGTCCAGAATAGAGUUG AD-293362.1 2616 1508-1528 2911 1506-1528
AU CA
ACUCUAUUCUGGACUUUAU UAAUAAAGUCCAGAAUAGAG AD-293364.1 2618 1510-1530 2913 1508-1530
UA UUG
CUCUAUUCTGGACUUUAUU ATAATAAAGUCCAGAAUAGAG AD-293365.1 2619 1511-1531 2914 1509-1531
AU UU
UAUUCUGGACTUUAUUACU AAAGTAAUAAAGUCCAGAAU 379 / 395 AD-293368.1 2620 1514-1534 2915 1512-1534
UU AGA
AUUCUGGACUTUAUUACUU UCAAGUAAUAAAGTCCAGAAU AD-293369.1 2621 1515-1535 2916 1513-1535
GA AG
UUCUGGACTUTAUUACUUG ATCAAGTAAUAAAGUCCAGAA AD-293370.1 2622 1516-1536 2917 1514-1536
AU UA
UGAAGUCCACCAAAAGUGG ATCCACTUUUGGUGGACUUCA AD-293410.1 2623 1556-1576 2918 1554-1576
AU GA
CCAAAAGUGGACCCUCUAU ATAUAGAGGGUCCACUUUUGG AD-293419.1 2624 1565-1585 2919 1563-1585
AU UG
CAAAAGUGGACCCUCUAUA AAUATAGAGGGTCCACUUUUG AD-293420.1 2625 1566-1586 2920 1564-1586
UU GU
AAAGUGGACCCUCUAUAUU GAAATATAGAGGGTCCACUUU AD-293422.1 2626 1568-1588 2921 1566-1588
UC UG
AAGUGGACCCTCUAUAUUU AGAAAUAUAGAGGGUCCACU AD-293423.1 2627 1569-1589 2922 1567-1589
CU UUU
CUUUCAUATATCCUUGGUC AGGACCAAGGATATAUGAAAG AD-293530.1 2628 1699-1719 2923 1697-1719
CU CA
UUCAUAUATCCUUGGUCCC ATGGGACCAAGGATAUAUGAA AD-293532.1 2629 1701-1721 2924 1699-1721
AU AG
GAUGUUUAGACAAUUUUAG ACCUAAAAUUGTCTAAACAUC AD-293554.1 2630 1723-1743 2925 1721-1743
GU UC
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
AUGUUUAGACAAUUUUAGG AGCCTAAAAUUGUCUAAACAU AD-293555.1 2631 1724-1744 2926 1722-1744
CU CU
GUUUAGACAATUUUAGGCU UGAGCCTAAAATUGUCUAAAC AD-293557.1 2632 1726-1746 2927 1724-1746
CA AU
UUUAGACAAUTUUAGGCUC UTGAGCCUAAAAUTGUCUAAA AD-293558.1 2633 1727-1747 2928 1725-1747
AA CA
UUAGACAATUTUAGGCUCA UTUGAGCCUAAAATUGUCUAA AD-293559.1 2634 1728-1748 2929 1726-1748
AA AC
UAGACAAUTUTAGGCUCAA UTUUGAGCCUAAAAUUGUCUA AD-293560.1 2635 1729-1749 2930 1727-1749
AA AA
GACAAUUUTAGGCUCAAAA ATUUTUGAGCCTAAAAUUGUC AD-293562.1 2636 1731-1751 2931 1729-1751
AU UA
UUAGGCUCAAAAAUUAAAG AGCUTUAAUUUTUGAGCCUAA AD-293569.1 2637 1738-1758 2932 1736-1758
CU AA
UAGGCUCAAAAAUUAAAGC UAGCTUTAAUUTUTGAGCCUA 380 / 395 AD-293570.1 2638 1739-1759 2933 1737-1759
UA AA
AGGCUCAAAAAUUAAAGCU UTAGCUTUAAUTUTUGAGCCU AD-293571.1 2639 1740-1760 2934 1738-1760
AA AA
GGCUCAAAAATUAAAGCUA ATUAGCTUUAATUTUUGAGCC AD-293572.1 2640 1741-1761 2935 1739-1761
AU UA
GCUCAAAAAUTAAAGCUAA UGUUAGCUUUAAUTUUUGAG AD-293573.1 2641 1742-1762 2936 1740-1762
CA CCU
CUCAAAAATUAAAGCUAAC ATGUTAGCUUUAATUUUUGAG AD-293574.1 2642 1743-1763 2937 1741-1763
AU CC
UCAAAAAUTAAAGCUAACA UGUGTUAGCUUTAAUUUUUGA AD-293575.1 2643 1744-1764 2938 1742-1764
CA GC
CAAAAAUUAAAGCUAACAC ATGUGUTAGCUTUAAUUUUUG AD-293576.1 2644 1745-1765 2939 1743-1765
AU AG
AAAUUAAAGCTAACACAGG UTCCTGTGUUAGCTUUAAUUU AD-293579.1 2645 1748-1768 2940 1746-1768
AA UU
AGCUAACACAGGAAAAGGA ATUCCUTUUCCTGTGUUAGCU AD-293586.1 2646 1755-1775 2941 1753-1775
AU UU
UAACACAGGAAAAGGAACU ACAGTUCCUUUTCCUGUGUUA AD-293589.1 2647 1758-1778 2942 1756-1778
GU GC
CACAGGAAAAGGAACUGUA AGUACAGUUCCTUTUCCUGUG AD-293592.1 2648 1761-1781 2943 1759-1781
CU UU
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
CAGGAAAAGGAACUGUACU ACAGTACAGUUCCTUUUCCUG AD-293594.1 2649 1763-1783 2944 1761-1783
GU UG
AGGAACUGTACUGGCUAUU ATAATAGCCAGTACAGUUCCU AD-293601.1 2650 1770-1790 2945 1768-1790
AU UU
CGACUCCCACTACAUCAAG ATCUTGAUGUAGUGGGAGUCG AD-293872.1 2652 2186-2206 2947 2184-2206
AU GA
CUCCCACUACAUCAAGACU UTAGTCTUGAUGUAGUGGGAG AD-293875.1 2653 2189-2209 2948 2187-2209
AA UC
UCCCACUACATCAAGACUA ATUAGUCUUGATGTAGUGGGA AD-293876.1 2654 2190-2210 2949 2188-2210
AU GU
CCCACUACAUCAAGACUAA AAUUAGTCUUGAUGUAGUGG AD-293877.1 2655 2191-2211 2950 2189-2211
UU GAG
CCACUACATCAAGACUAAU AGAUTAGUCUUGATGUAGUGG AD-293878.1 2656 2192-2212 2951 2190-2212
CU GA
CACUACAUCAAGACUAAUC AAGATUAGUCUTGAUGUAGUG 381 / 395 AD-293879.1 2657 2193-2213 2952 2191-2213
UU GG
ACUACAUCAAGACUAAUCU AAAGAUTAGUCTUGAUGUAGU AD-293880.1 2658 2194-2214 2953 2192-2214
UU GG
CUACAUCAAGACUAAUCUU ACAAGATUAGUCUTGAUGUAG AD-293881.1 2659 2195-2215 2954 2193-2215
GU UG
UACAUCAAGACUAAUCUUG AACAAGAUUAGTCTUGAUGUA AD-293882.1 2660 2196-2216 2955 2194-2216
UU GU
UUGUGUGUTUTUCACAUGU ATACAUGUGAAAAACACACAA AD-293898.1 2662 2217-2237 2957 2215-2237
AU AA
GUGUUUUUCACAUGUAUUA UAUAAUACAUGTGAAAAACAC AD-293902.1 2663 2221-2241 2958 2219-2241
UA AC
UCACAUGUAUTAUAGAAUG AGCATUCUAUAAUACAUGUGA AD-293909.1 2664 2228-2248 2959 2226-2248
CU AA
CACAUGUATUAUAGAAUGC AAGCAUTCUAUAATACAUGUG AD-293910.1 2665 2229-2249 2960 2227-2249
UU AA
UGUAUUAUAGAAUGCUUUU ACAAAAGCAUUCUAUAAUAC AD-293914.1 2666 2233-2253 2961 2231-2253
GU AUG
GUAUUAUAGAAUGCUUUUG UGCAAAAGCAUTCTAUAAUAC AD-293915.1 2667 2234-2254 2962 2232-2254
CA AU
UAUAGAAUGCTUUUGCAUG UCCATGCAAAAGCAUUCUAUA AD-293919.1 2668 2238-2258 2963 2236-2258
GA AU
SEQ SEQ ID Posição em Intervalo em Nome do duplex Sequência sense 5’ para 3’ Sequência antisense 5’ para 3’ ID NO: NM_178135.4 NM_178135.4 NO:
GAAUGCUUTUGCAUGGACU ATAGTCCAUGCAAAAGCAUUC AD-293923.1 2670 2242-2262 2965 2240-2262
AU UA
AUGCUUUUGCAUGGACUAU AGAUAGTCCAUGCAAAAGCAU AD-293925.1 2671 2244-2264 2966 2242-2264
CU UC
CUUUUGCATGGACUAUCCU AGAGGATAGUCCATGCAAAAG AD-293928.1 2672 2247-2267 2967 2245-2267
CU CA
UUGCAUGGACTAUCCUCUU ACAAGAGGAUAGUCCAUGCA AD-293931.1 2673 2250-2270 2968 2248-2270
GU AAA
UGCAUGGACUAUCCUCUUG AACAAGAGGAUAGTCCAUGCA AD-293932.1 2674 2251-2271 2969 2249-2271
UU AA
GCAUGGACTATCCUCUUGU AAACAAGAGGATAGUCCAUGC AD-293933.1 2675 2252-2272 2970 2250-2272
UU AA
CAUGGACUAUCCUCUUGUU AAAACAAGAGGAUAGUCCAU AD-293934.1 2676 2253-2273 2971 2251-2273
UU GCA
AUGGACUATCCUCUUGUUU AAAAACAAGAGGATAGUCCAU 382 / 395 AD-293935.1 2677 2254-2274 2972 2252-2274
UU GC
UGGACUAUCCTCUUGUUUU UAAAAACAAGAGGAUAGUCC AD-293936.1 2678 2255-2275 2973 2253-2275
UA AUG
GGACUAUCCUCUUGUUUUU ATAAAAACAAGAGGAUAGUCC AD-293937.1 2679 2256-2276 2974 2254-2276
AU AU
GACUAUCCTCTUGUUUUUA AAUAAAAACAAGAGGAUAGU AD-293938.1 2680 2257-2277 2975 2255-2277
UU CCA
CUAUCCUCTUGUUUUUAUU UTAATAAAAACAAGAGGAUAG AD-293940.1 2681 2259-2279 2976 2257-2279
AA UC * Alvo: HSD17B13
Tabela 12. Rastreamento in vitro de DNA de HSD17B13 10 nM em Cos-7 (Vetor psiCHECK2-Luciferase duplo humano) e hepatócitos primários de Cynomolgus Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-291929.1 71,9 80,9 83,6 83,4 AD-291931.1 110,8 84,8 100,1 97,8 AD-291988.1 78,0 104,0 65,3 97,3 AD-291993.1 102,1 100,5 78,9 69,1 AD-291998.1 81,6 97,4 26,3 60,9 AD-292005.1 101,3 93,7 69,2 74,9 AD-292006.1 45,7 93,2 58,7 81,7 AD-292007.1 130,7 101,5 62,4 100,0 AD-292008.1 99,4 102,4 63,7 91,3 AD-292010.1 72,6 87,1 49,5 95,8 AD-292012.1 79,5 83,6 86,8 86,3
383 / 395 AD-292013.1 61,3 94,1 45,2 83,9 AD-292014.1 50,0 87,4 40,0 40,1 AD-292015.1 44,9 88,2 31,6 78,8 AD-292016.1 52,6 84,2 48,2 90,8 AD-292017.1 43,8 86,8 54,8 96,7 AD-292028.1 77,4 88,2 107,2 91,5 AD-292137.1 96,9 83,6 105,7 103,9 AD-292140.1 30,6 95,0 26,3 59,0 AD-292143.1 38,4 79,3 33,9 85,3 AD-292182.1 127,2 99,8 91,8 71,1 AD-292183.1 95,2 91,8 102,5 87,6 AD-292185.1 50,6 91,7 74,5 93,3 AD-292186.1 48,6 95,0 81,3 85,6 AD-292187.1 90,1 89,5 82,7 95,5 AD-292188.1 53,1 99,0 42,5 81,8 AD-292189.1 103,9 78,7 73,2 104,0 AD-292190.1 67,5 81,6 105,5 81,9 AD-292238.1 40,6 86,1 71,7 86,6 AD-292244.1 92,8 78,7 116,0 91,8 AD-292245.1 62,2 75,2 55,5 97,0 AD-292247.1 51,0 84,4 63,4 87,5
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-292248.1 77,4 104,3 51,0 94,8 AD-292250.1 31,0 85,4 44,9 92,2 AD-292251.1 45,7 91,0 74,1 90,6 AD-292252.1 60,0 83,4 88,6 102,1 AD-292253.1 29,1 121,4 35,3 75,7 AD-292254.1 50,1 94,7 32,3 62,3 AD-292257.1 54,9 96,3 57,6 84,8 AD-292309.1 93,2 108,1 93,4 87,1 AD-292310.1 94,4 101,0 87,9 101,6 AD-292315.1 86,1 88,8 62,9 90,8 AD-292318.1 67,1 105,0 85,3 85,5 AD-292344.1 36,1 91,7 33,0 53,0 AD-292345.1 68,5 88,1 81,9 106,0 AD-292346.1 38,8 80,4 63,7 66,2 AD-292363.1 85,2 76,8 96,0 101,8
384 / 395 AD-292366.1 75,3 82,9 100,2 107,5 AD-292367.1 86,9 70,2 97,0 113,8 AD-292369.1 96,6 88,6 91,3 91,6 AD-292370.1 44,8 84,8 59,7 88,9 AD-292371.1 47,1 76,8 78,3 96,3 AD-292373.1 83,4 79,9 32,3 128,5 AD-292374.1 126,7 92,9 78,8 98,5 AD-292376.1 63,8 89,3 73,9 87,3 AD-292377.1 47,5 79,9 49,7 77,6 AD-292379.1 92,9 99,8 99,0 86,5 AD-292380.1 69,1 82,6 46,5 70,2 AD-292381.1 30,1 73,4 58,1 95,4 AD-292382.1 42,1 86,7 87,3 97,4 AD-292383.1 18,7 69,7 47,1 41,7 AD-292384.1 27,4 83,2 36,6 83,8 AD-292385.1 59,5 107,0 51,1 115,1 AD-292388.1 33,9 80,2 37,4 51,4 AD-292389.1 54,9 90,8 79,0 92,4 AD-292390.1 43,4 81,4 49,8 82,4 AD-292394.1 20,8 74,8 56,3 57,0 AD-292397.1 87,6 80,3 56,8 79,6
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-292398.1 25,3 84,3 21,9 56,5 AD-292399.1 43,1 84,4 26,6 61,1 AD-292403.1 75,2 91,7 19,6 59,7 AD-292404.1 99,9 89,7 68,5 70,8 AD-292405.1 65,8 93,2 39,0 49,5 AD-292406.1 77,3 70,4 89,7 96,8 AD-292407.1 47,4 91,5 64,1 50,3 AD-292408.1 67,3 102,5 72,1 89,8 AD-292409.1 47,3 84,2 88,6 91,7 AD-292410.1 90,3 89,2 50,5 94,3 AD-292434.1 109,2 85,6 97,7 118,1 AD-292486.1 87,6 93,4 81,4 70,9 AD-292487.1 71,1 91,4 83,5 101,3 AD-292492.1 55,7 89,0 83,1 104,7 AD-292495.1 74,2 87,6 39,8 89,4
385 / 395 AD-292498.1 59,5 94,1 48,3 102,0 AD-292499.1 40,6 95,4 36,7 69,9 AD-292526.1 82,6 90,8 66,4 71,7 AD-292531.1 95,5 81,2 100,4 110,5 AD-292534.1 78,2 88,3 60,2 76,1 AD-292536.1 55,9 90,9 43,0 82,7 AD-292541.1 88,3 74,4 27,8 41,9 AD-292566.1 19,9 72,5 13,2 52,6 AD-292574.1 24,4 71,6 26,1 73,5 AD-292575.1 65,6 81,9 77,2 81,2 AD-292576.1 16,5 80,7 28,5 43,3 AD-292577.1 43,3 95,8 25,8 68,5 AD-292578.1 23,4 58,8 15,6 68,8 AD-292579.1 39,4 80,5 18,5 81,3 AD-292582.1 53,7 89,0 56,3 96,1 AD-292596.1 71,7 90,7 34,6 78,4 AD-292601.1 80,9 103,8 83,1 101,7 AD-292606.1 72,8 93,1 71,1 110,5 AD-292607.1 64,0 94,9 96,3 81,4 AD-292610.1 76,6 83,1 88,3 90,3 AD-292612.1 52,9 81,4 66,2 81,5
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-292613.1 27,9 79,6 53,3 96,2 AD-292614.1 51,4 92,8 87,1 96,4 AD-292615.1 75,1 88,2 92,9 108,1 AD-292616.1 73,9 90,6 90,3 85,7 AD-292624.1 54,2 97,1 59,3 99,4 AD-292625.1 28,1 83,1 22,7 73,4 AD-292629.1 25,7 80,1 49,1 63,6 AD-292630.1 26,4 99,1 31,1 47,4 AD-292631.1 53,9 70,9 84,9 103,8 AD-292634.1 74,5 92,9 89,3 82,6 AD-292638.1 50,1 88,5 74,8 79,7 AD-292639.1 73,9 86,3 62,4 85,5 AD-292640.1 17,0 71,2 49,7 48,3 AD-292641.1 55,1 100,4 70,5 92,6 AD-292642.1 29,7 93,0 50,8 81,0
386 / 395 AD-292646.1 41,7 95,5 79,8 92,7 AD-292650.1 85,5 84,2 104,5 95,4 AD-292651.1 44,4 94,8 72,9 84,0 AD-292652.1 78,7 85,1 73,9 97,5 AD-292667.1 91,8 83,0 108,4 95,8 AD-292668.1 24,5 61,0 95,9 83,9 AD-292671.1 18,8 61,8 42,5 93,0 AD-292673.1 41,0 77,7 35,8 79,4 AD-292677.1 73,0 74,0 111,0 90,7 AD-292678.1 60,3 90,4 56,9 95,8 AD-292679.1 45,0 74,8 45,1 72,5 AD-292680.1 42,9 89,4 22,9 44,0 AD-292681.1 56,4 99,9 94,6 105,1 AD-292682.1 63,9 84,7 64,0 64,5 AD-292684.1 24,2 81,8 16,2 88,1 AD-292685.1 55,6 89,3 40,6 81,3 AD-292691.1 27,0 82,0 27,8 59,7 AD-292692.1 56,9 76,9 57,8 85,9 AD-292693.1 24,3 76,9 16,6 47,8 AD-292694.1 26,5 84,2 61,0 91,0 AD-292695.1 35,8 82,1 24,0 62,8
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-292696.1 32,5 87,4 27,5 60,8 AD-292697.1 51,8 79,1 33,8 57,3 AD-292725.1 49,1 61,8 101,5 90,3 AD-292726.1 41,3 71,5 81,7 90,6 AD-292727.1 64,4 82,9 78,5 96,0 AD-292728.1 54,9 65,4 96,9 121,5 AD-292757.1 38,0 71,0 53,7 72,0 AD-292759.1 93,8 89,4 89,7 82,5 AD-292761.1 47,1 97,8 29,0 84,6 AD-292766.1 139,5 89,6 92,1 105,5 AD-292787.1 57,9 77,4 79,6 95,3 AD-292788.1 23,2 88,1 75,5 85,9 AD-292789.1 14,8 78,8 47,7 73,0 AD-292793.1 16,8 62,8 16,1 33,1 AD-292795.1 14,3 57,5 53,5 43,0
387 / 395 AD-292796.1 22,7 56,2 18,2 71,8 AD-292797.1 5,6 28,2 10,4 17,0 AD-292800.1 9,6 58,3 12,8 25,3 AD-292802.1 13,0 70,4 18,8 60,5 AD-292806.1 14,9 63,8 9,9 39,7 AD-292808.1 76,4 90,2 64,5 85,2 AD-292870.1 11,8 42,5 33,1 50,4 AD-292893.1 19,5 60,5 126,3 95,7 AD-292906.1 26,3 32,8 39,7 80,9 AD-292915.1 19,4 49,0 41,4 38,1 AD-292935.1 73,8 82,0 42,3 64,3 AD-292936.1 60,6 74,3 51,1 53,1 AD-292967.1 11,4 46,8 51,2 89,8 AD-292970.1 17,0 58,6 48,2 87,4 AD-292974.1 23,3 72,1 68,3 78,4 AD-292975.1 22,3 80,7 52,6 79,2 AD-292978.1 23,6 77,6 29,9 74,0 AD-292979.1 50,5 84,9 54,2 97,1 AD-292980.1 36,4 107,7 42,5 91,0 AD-292981.1 67,7 79,8 76,1 107,9 AD-292982.1 27,1 76,5 42,7 74,1
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-292983.1 21,5 71,3 39,1 77,3 AD-292984.1 24,2 73,5 36,2 69,6 AD-293027.1 37,3 82,5 41,7 86,2 AD-293028.1 59,8 81,3 64,4 92,3 AD-293034.1 30,5 89,4 40,2 54,5 AD-293037.1 45,8 77,7 42,3 81,9 AD-293039.1 25,3 76,7 37,8 49,6 AD-293099.1 47,1 87,8 50,8 77,5 AD-293153.1 71,0 85,3 75,2 104,1 AD-293156.1 38,3 93,0 46,6 131,7 AD-293162.1 53,5 82,3 65,5 99,4 AD-293163.1 36,1 84,2 74,8 96,1 AD-293166.1 55,4 86,7 56,3 79,2 AD-293167.1 69,9 94,9 52,4 63,0 AD-293168.1 68,5 77,5 62,5 74,1
388 / 395 AD-293169.1 62,0 89,4 51,6 98,0 AD-293170.1 27,7 93,7 39,6 64,8 AD-293171.1 14,1 67,7 42,0 36,4 AD-293172.1 63,2 82,8 64,9 88,2 AD-293174.1 19,3 95,6 50,2 68,6 AD-293176.1 20,5 63,7 36,4 40,1 AD-293177.1 21,4 93,0 31,5 44,8 AD-293178.1 24,3 73,6 70,8 75,4 AD-293179.1 52,5 78,7 51,1 85,3 AD-293180.1 34,0 91,7 60,7 71,5 AD-293181.1 58,7 107,6 35,6 78,0 AD-293182.1 16,9 60,5 39,5 45,0 AD-293183.1 31,4 78,1 74,7 83,4 AD-293184.1 25,6 58,7 59,7 50,9 AD-293186.1 48,4 78,2 41,4 73,5 AD-293187.1 41,7 78,8 50,4 84,9 AD-293191.1 56,1 103,5 72,3 84,1 AD-293218.1 36,6 67,3 44,9 69,3 AD-293228.1 83,7 92,4 84,0 74,2 AD-293230.1 76,4 95,3 76,2 67,1 AD-293231.1 57,6 83,2 56,3 101,8
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-293235.1 56,7 97,6 99,6 86,3 AD-293271.1 112,7 85,7 85,7 110,6 AD-293273.1 60,2 92,6 38,6 89,9 AD-293306.1 33,9 90,2 42,6 70,4 AD-293309.1 28,6 68,9 33,4 58,9 AD-293311.1 13,4 66,4 28,2 41,2 AD-293312.1 21,7 88,7 46,9 92,5 AD-293315.1 29,4 88,6 50,1 82,0 AD-293316.1 32,7 75,3 40,2 67,0 AD-293323.1 85,3 103,1 49,1 91,3 AD-293353.1 64,0 76,6 83,0 84,7 AD-293354.1 50,9 79,2 64,5 84,5 AD-293355.1 78,0 110,8 76,0 88,7 AD-293358.1 46,0 106,3 91,5 98,3 AD-293359.1 77,0 73,5 74,2 82,4
389 / 395 AD-293360.1 75,9 104,8 56,5 88,2 AD-293361.1 73,4 87,3 72,7 86,0 AD-293362.1 38,3 81,1 75,0 84,3 AD-293363.1 35,2 72,6 78,9 79,4 AD-293364.1 83,5 86,1 80,9 74,2 AD-293365.1 55,0 88,5 69,3 114,8 AD-293368.1 19,6 50,5 40,7 66,8 AD-293369.1 14,3 63,5 38,5 63,5 AD-293370.1 93,8 84,2 99,4 112,0 AD-293410.1 99,6 81,5 111,6 112,2 AD-293419.1 84,8 89,5 88,7 66,7 AD-293420.1 65,4 89,3 72,7 75,8 AD-293422.1 55,1 104,1 99,0 97,0 AD-293423.1 58,8 75,0 82,0 101,6 AD-293530.1 33,5 86,1 54,2 103,1 AD-293532.1 42,7 95,8 84,4 91,4 AD-293554.1 63,0 84,0 106,1 100,8 AD-293555.1 49,0 87,7 85,4 110,5 AD-293557.1 34,8 90,9 42,7 71,2 AD-293558.1 34,0 63,5 56,9 62,9 AD-293559.1 23,4 53,8 52,4 48,2
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-293560.1 23,8 75,6 45,8 46,4 AD-293562.1 54,3 67,3 45,0 68,8 AD-293569.1 54,2 99,4 144,4 123,6 AD-293570.1 43,8 106,2 66,9 67,3 AD-293571.1 17,8 67,2 45,3 58,4 AD-293572.1 25,4 78,2 43,2 52,5 AD-293573.1 33,1 88,7 43,2 61,4 AD-293574.1 89,3 84,3 70,6 94,1 AD-293575.1 50,3 80,2 50,3 73,4 AD-293576.1 47,3 88,6 42,2 69,7 AD-293579.1 37,0 88,6 43,0 78,7 AD-293586.1 109,6 101,6 69,8 111,1 AD-293589.1 66,1 82,7 86,4 104,3 AD-293592.1 54,7 84,6 63,6 95,7 AD-293594.1 41,8 82,8 53,7 80,9
390 / 395 AD-293601.1 40,1 80,8 69,9 68,9 AD-293602.1 78,8 77,2 75,2 72,3 AD-293872.1 89,1 88,4 106,8 116,8 AD-293875.1 74,4 78,5 78,7 84,3 AD-293876.1 25,1 68,3 70,4 61,4 AD-293877.1 26,8 77,7 35,9 50,4 AD-293878.1 13,3 80,2 75,0 64,2 AD-293879.1 34,1 59,4 45,2 54,3 AD-293880.1 19,0 80,8 59,2 55,4 AD-293881.1 16,3 78,2 38,7 49,0 AD-293882.1 11,9 39,5 33,7 47,3 AD-293883.1 8,9 58,7 50,9 34,1 AD-293898.1 23,0 64,6 41,5 76,4 AD-293902.1 16,0 53,9 43,3 56,9 AD-293909.1 75,9 112,6 74,2 91,0 AD-293910.1 32,6 89,6 54,3 79,9 AD-293914.1 35,0 88,0 52,9 72,0 AD-293915.1 22,7 87,0 39,4 82,5 AD-293919.1 31,8 79,6 59,5 84,2 AD-293922.1 53,2 96,2 37,0 65,9 AD-293923.1 48,5 76,0 77,7 99,7
Nome do duplex % restante da mensagem % restante da mensagem % restante da mensagem de % restante da mensagem de humana 10 nM humana 0,1 nM Cyno 10nM Cyno 0,1 nM AD-293925.1 31,1 81,9 53,0 87,7 AD-293928.1 29,4 73,5 68,8 95,5 AD-293931.1 27,5 85,4 52,5 79,1 AD-293932.1 14,2 61,7 55,5 65,7 AD-293933.1 49,1 80,3 42,1 74,9 AD-293934.1 30,9 79,7 46,1 87,7 AD-293935.1 48,7 79,1 68,3 70,8 AD-293936.1 55,0 84,6 45,8 90,3 AD-293937.1 29,6 80,1 58,5 83,9 AD-293938.1 24,7 67,9 58,4 94,8 AD-293940.1 17,7 61,9 51,9 69,0
391 / 395
392 / 395 Exemplo 3: Identificação de uma mutação perda de função que protege contra
NASH
[00721] Esteato-hepatite não alcoólica (NASH) é uma doença progressiva caracterizada por acúmulo de gordura hepática e inflamação que podem levar à cirrose. Prevê-se que NASH seja o fator mais importante para o transplante de fígado em 2020. A mortalidade relacionada ao fígado aumenta exponencialmente com a progressão da fibrose.
[00722] Uma variante de splicing (rs72613567:TA) no HSD17B13 resulta em uma proteína instável e truncada com atividade enzimática reduzida contra substratos esteroides e, assim, representa uma variante de perda de função no HSD17B13. HSD17B13:rs72613567:TA foi associada com alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) séricas reduzidas de modo reprodutível e conforme representado na Figura 1. Essa variante está associada com risco significativamente reduzido de doença hepática alcoólica e não alcoólica, cirrose e carcinoma hepatocelular de maneira dependente da dosagem do alelo.
[00723] HSD17B13, expresso em hepatócitos é, portanto, um alvo atraente para o tratamento de NASH e outras doenças crônicas do fígado usando agentes de dsRNA que inibem a expressão de HSD17B13 e imitam a variante de perda de função rs72613567:TA. Exemplo 4: Eficácia in vivo de agentes de dsRNA direcionados para HSD17B13 A. Eficácia de siRNA com reatividade cruzada humano/NHP contra HSD17B13 humano expresso ectopicamente em camundongos
[00724] Camundongos (n=3/grupo) foram injetados com um vírus adenoassociado (AAV) que expressava HSD17B13 humano. Quatorze dias depois da injeção do AAV, os camundongos receberam uma dose única de 3 mg/kg de AD-288917 por via subcutânea. Despois depois da administração, a expressão de HSD17B13 humano no fígado foi determinada por RT-qPCR e
393 / 395 normalizada contra a expressão de HSD17B13 humano de animais controle injetados com PBS. Como representado na Figura 2A, uma dose única de AD- 288917 inibe efetivamente a expressão de HSD17B13 humano. B. Eficácia de siRNA com reatividade cruzada humano/NHP contra HSD17B13 endógeno em primatas não humanos
[00725] Macacos Cynomolgus (n=3/grupo) receberam uma dose única de 3 mg/kg de AD-288917 por via subcutânea. Vinte e um dias depois da administração do Duplex 1, a expressão de HSD17B13 endógeno foi determinada em biópsias de fígado por RT-qPCR e normalizada contra a expressão de HSD17B13 endógeno de animais controle injetados com PBS. Como representado na Figura 2B, uma dose única de AD-288917 inibe efetivamente a expressão de HSD17B13 endógeno. Exemplo 5: Eficácia in vivo de agentes de dsRNA direcionados para HSD17B13
[00726] Macacos Cynomolgus (n=3/grupo) receberam uma dose única de 3 mg/kg ou uma dose única de 10 mg/kg por via subcutânea de um agente listado na Tabela 13. Vinte e um dias depois da administração do Duplex 1, a expressão de HSD17B13 endógeno foi determinada em biópsias de fígado (lobo esquerdo e direito) por RT-qPCR e normalizada contra a expressão de HSD17B13 endógeno de animais controle injetados com PBS. Como mostrado na Tabela 14, uma dose única de 3 mg/kg ou 10 mg/kg de todos os agentes testados inibiram efetivamente a expressão de HSD17B13 endógeno. Tabela 14 3 mg/kg 10 mg/kg Lobo Grupos (n=3/grupo) Lobo Média Lobo Lobo Média esquerd direito E+D esquerdo direito E+D o AD-288917 AVG 0,58 0,58 0,58 0,25 0,26 0.25 AD-288917 SEM 0,26 0,26 0,26 0,01 0,05 0.03 AD-288996 AVG 0,28 0,18 0,23 0,11 0,11 0.11 AD-288996 SEM 0,08 0,09 0,07 0,06 0,05 0.05 AD-413639 AVG 0,35 0,34 0,34 0,14 0,13 0.13 AD-413639 SEM 0,16 0,11 0,13 0,07 0,06 0.06 AD-413644 AVG 0,33 0,30 0,32 0,10 0,11 0.11 AD-413644 SEM 0,13 0,09 0,10 0,02 0,03 0.02 AD-413669 AVG 0,33 0,23 0,28 0,23 0,20 0.21
394 / 395 AD-413669 SEM 0,09 0,07 0,08 0,11 0,10 0.10 PBS (controle) 1,06 1,02 1,04
AVG PBS (controle) SEM 0,26 0,20 0,23 Os resultados representam a expressão de HSD17B13 (Expressão relativa (fold change) versus grupo controle)
Tabela 13 ID do SEQ ID SEQ ID Duplex Fita Sequência modificada (5’-3’) NO: Sequência não modificada (5’-3’) NO: sense usascaucAfaGfAfCfuaaucuuguuL96 4486 UACAUCAAGACUAAUCUUGUU 4496 AD-288917 antisense asAfscaag(Agn)uuagucUfuGfauguasgsu 4487 AACAAGAUUAGUCUUGAUGUAGU 4497 sense asusgcuuUfuGfCfAfuggacuaucuL96 4488 AUGCUUUUGCAUGGACUAUCU 4498 AD-288996 antisense asGfsauag(Tgn)ccaugcAfaAfagcaususc 4489 AGAUAGTCCAUGCAAAAGCAUUC 4499 sense csgsuaugCfaGfAfAfuauucaauuuL96 4490 CGUAUGCAGAAUAUUCAAUUU 4500 AD-413639 antisense asAfsauuGf(Agn)auauucUfgCfauacgsasu 4491 AAAUUGAAUAUUCUGCAUACGAU 4501 sense csgsuaugCfaGfAfAfuauucaauuuL96 4492 CGUAUGCAGAAUAUUCAAUUU 4502 AD-413644 antisense asAfsaUfuGf(Agn)auauUfcUfgCfaUfaCfgsasu 4493 AAAUUGAAUAUUCUGCAUACGAU 4503 sense csusacauCfaAfGfAfcuaaucuuguL96 4494 CUACAUCAAGACUAAUCUUGU 4504 AD-413669 antisense asCfsaaga(Tgn)uaguCfuUfgAfuguagsusg 4495 ACAAGATUAGUCUUGAUGUAGUG 4505
395 / 395

Claims (118)

1 / 27 REIVINDICAÇÕES
1. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:8 ou 9.
2. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o dito agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a dita fita antisense compreende uma região de complementaridade com um mRNA que codifica HSD17B13 e compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
3. Agente dsRNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito agente dsRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
4. Agente dsRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação.
5. Agente dsRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
6. Agente dsRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que substancialmente todos os
2 / 27 nucleotídeos da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
7. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente de RNA de fita dupla compreende uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais de 3 nucleotídeos da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:8 ou 9, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados e em que a fita sense é conjugada a um ligante anexado à terminação 3’.
8. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação.
9. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
10. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos da fita sense e todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
11. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato
3 / 27 de que pelo menos um dos ditos nucleotídeos modificados é selecionado a partir do grupo que consiste em um desoxinucleotídeo, um desoxinucleotídeo de timina (dT) no terminal 3’, um nucleotídeo 2’-O-metila modificado, um nucleotídeo 2’-flúor modificado, um nucleotídeo 2’-desoxi modificado, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo de conformação restringida, um nucleotídeo com etila restrito, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo 2’-amino modificado, um nucleotídeo 2’-O-alila modificado, um nucleotídeo 2’-C-alquila modificado, um nucleotídeo 2’- hidroxila modificado, um nucleotídeo 2’-metoxietila modificado, um nucleotídeo 2’-O-alquila modificado, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, um nucleotídeo compreendendo base não natural, um nucleotídeo modificado com tetra-hidropirano, um nucleotídeo modificado com 1,5-anidrohexitol, um nucleotídeo modificado com ciclo-hexenila, um nucleotídeo compreendendo um grupo fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo compreendendo um 5’-fosfato, um nucleotídeo compreendendo um mimético 5’-fosfato, um nucleotídeo modificado com glicol, um nucleotídeo modificado com 2 a O- (N-metilacetamida) e combinações dos mesmos.
12. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as modificações nos nucleotídeos são modificações 2’-O-metila e/ou 2’-fluoro.
13. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento.
14. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem 19 a 30 nucleotídeos de comprimento.
4 / 27
15. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem 19 a 25 nucleotídeos de comprimento.
16. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.
17. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que cada fita não tem mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.
18. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que cada fita tem independentemente 19 a 30 nucleotídeos de comprimento.
19. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que cada fita tem independentemente 19 a 25 nucleotídeos de comprimento.
20. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que cada fita tem independentemente 1 a 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.
21. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo.
22. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
23. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 1 a 11 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante.
5 / 27
24. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ligante é conjugado à extremidade 3’ da fita sense do agente dsRNA.
25. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 24, caracterizado pelo fato de que o ligante é um derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc).
26. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ligante é:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN
O
HO OH
O
O H H
HO O N N O AcHN
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O .
27. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA é conjugado ao ligante conforme mostrado no desenho esquemático seguinte: 3'
O
O P X
OH
O
N
HO OH
O H H O
HO O N N O AcHN O
HO OH O
O H H H
O N N O N
HO AcHN O O O O
HO OH
O
HO O N N O AcHN H H
O e em que X é O ou S.
28. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o X é O.
6 / 27
29. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade compreende qualquer uma das sequências antisense em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
30. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o dito agente dsRNA compreende uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a dita fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o dito agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q e q’ são cada um independentemente 0 a 6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica que compreende 0 a 25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica que compreende 0 a 10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; cada np, np’, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam
7 / 27 cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante.
31. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que i é 0; j é 0; i é 1; j é 1; i e j são ambos 0; ou i e j são ambos 1.
32. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que k é 0; l é 0; k é 1; l é 1; k e l são ambos 0; ou k e l são ambos 1.
33. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que XXX é complementar a X’X’X’, YYY é complementar a Y’Y’Y’ e ZZZ é complementar a Z’Z’Z’.
34. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o motivo YYY ocorre perto ou no sítio de clivagem da fita sense.
35. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12 e 13 da fita antisense a partir da extremidade 5’.
36. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIa): sense: 5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’ (IIIa).
37. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fórmula (III)
8 / 27 é representada pela fórmula (IIIb): sense: 5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’ 5’ (IIIb) em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1 a 5 nucleotídeos modificados.
38. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIc): sense: 5’ np-Na–XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-X’X’X’-Nb’- Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’ (IIIc) em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1 a 5 nucleotídeos modificados.
39. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que fórmula (III) é representada pela fórmula (IIId): sense: 5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-X’X’X’- Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’- Na’- nq’ 5’ (IIId) em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 1 a 5 nucleotídeos modificados e cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2 a 10 nucleotídeos modificados.
40. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento.
41. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem 19 a 30 nucleotídeos de
9 / 27 comprimento.
42. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem 19 a 25 nucleotídeos de comprimento.
43. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade tem 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.
44. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 43, caracterizado pelo fato de que cada fita não tem mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.
45. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 43, caracterizado pelo fato de que cada fita tem independentemente 19 a 30 nucleotídeos de comprimento.
46. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 45, caracterizado pelo fato de que as modificações nos nucleotídeos são selecionadas a partir do grupo que consiste em LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-alquila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’-fluoro, 2’-O-metila, 2’-desoxi, 2’-hidroxila e combinações dos mesmos.
47. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as modificações nos nucleotídeos são modificações 2’-O-metila e/ou 2’-fluoro.
48. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 46, caracterizado pelo fato de que o Y’ é um nucleotídeo modificado com 2’-O-metila ou 2’-flouro.
49. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 48, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 1
10 / 27 nucleotídeo.
50. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 49, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
51. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 50, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende ainda pelo menos uma ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos.
52. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos é na terminação 3’ de uma fita.
53. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a dita fita é a fita antisense.
54. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a dita fita é a fita sense.
55. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos é na terminação 5’ de uma fita.
56. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a dita fita é a fita antisense.
57. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a dita fita é a fita sense.
11 / 27
58. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a ligação fosforotioato ou metilfosfonato entre nucleotídeos é em ambas as terminações 5’ e 3’ de uma fita.
59. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o par de bases na posição 1 da extremidade 5’ da fita antisense do duplex é um par de bases AU.
60. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que p’>0.
61. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que p’=2.
62. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que q’=0, p=0, q=0 e p’ nucleotídeos salientes são complementares ao mRNA alvo.
63. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que q’=0, p=0, q=0 e p’ nucleotídeos salientes não são complementares ao mRNA alvo.
64. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fita sense tem, no total, 21 nucleotídeos e a fita antisense tem, no total, 23 nucleotídeos.
65. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato.
66. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que todos os np’ são ligados a nucleotídeos vizinhos por ligações fosforotioato.
67. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que todos os
12 / 27 nucleotídeos da fita sense e todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação.
68. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 67, caracterizado pelo fato de que o ligante é conjugado à extremidade 3’ da fita sense do agente dsRNA.
69. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ou mais derivados de N-acetilgalactosamina (GalNAc) anexados através de um linker (elemento de ligação) ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
70. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o ligante é:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN
O
HO OH
O
O H H
HO O N N O AcHN
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O .
71. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA é conjugado ao ligante como mostrado no desenho esquemático seguinte:
13 / 27 3'
O
O P X
OH
O
N
HO OH
O H H O
HO O N N O AcHN O
HO OH O
O H H H
O N N O N
HO AcHN O O O O
HO OH
O
HO O N N O AcHN H H
O e em que X é O ou S.
72. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o X é O.
73. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q e q’ são cada um independentemente 0 a 6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência
14 / 27 oligonucleotídica compreendendo 0 a 10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; cada np, np’, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes representa independentemente um nucleotídeo saliente; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, sendo que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante.
74. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q e q’ são cada um independentemente 0 a 6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato;
15 / 27 cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, sendo que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações on Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante.
75. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes,
16 / 27 representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q e q’ são cada um independentemente 0 a 6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante, sendo que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
76. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III):
17 / 27 sense: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l- Na’-nq’ 5’ (III) em que: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; cada np, nq e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q e q’ são cada um independentemente 0 a 6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 10 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; em que a fita sense compreende pelo menos uma ligação fosforotioato; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante, sendo que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
18 / 27
77. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense complementar a uma fita antisense, em que a fita antisense compreende uma região complementar a uma parte de um mRNA que codifica HSD17B13, em que cada fita tem entre aproximadamente 14 e 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente dsRNA é representado pela fórmula (III): sense: 5’ np-Na-YYY-na-nq 3’ antisense: 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’ (IIIa) em que: cada np, nq, e nq’, os quais podem ou não estar presentes, representa independentemente um nucleotídeo saliente; p, q, e q’ são cada um independentemente 0 a 6; np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por uma ligação fosforotioato; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 25 nucleotídeos, os quais são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de modo diferente; YYY e Y’Y’Y’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro; em que a fita sense compreende pelo menos uma ligação fosforotioato; e em que a fita sense é conjugada a pelo menos um ligante, sendo que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
19 / 27
78. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 ou 2 e a fita antisense compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos não diferindo em mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8 ou 9, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em modificação 2’-O-metila e modificação 2’-fluoro, em que a fita sense compreende duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em modificação 2’-O-metila e modificação 2’-fluoro, em que a fita antisense compreende duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 5’ e duas ligações fosforotioato entre nucleotídeos na terminação 3’ e em que a fita sense é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um linker ramificado monovalente, bivalente ou trivalente na terminação 3’.
79. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos da fita sense e todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados.
80. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de
20 / 27 acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 30 e 73 a 79 caracterizado pelo fato de que a região de complementaridade compreende qualquer uma das sequências antisense listadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
81. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, caracterizado pelo fato de que a fita sense e a fita antisense compreendem sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos de qualquer um dos agentes listados em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13.
82. Célula, caracterizada pelo fato de que contém o agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81.
83. Vetor, caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos uma fita do agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81.
84. Composição farmacêutica para inibição da expressão do gene de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases Tipo 13 (HSD17B13), caracterizada pelo fato de que compreende o agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81.
85. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o agente é formulado em uma solução não tamponada.
86. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que a solução não tamponada é solução salina ou água.
87. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o agente é formulado com uma solução tampão.
88. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação
21 / 27 87, caracterizada pelo fato de que a dita solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos.
89. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo fato de que a solução tampão é solução salina com tampão fosfato (PBS).
90. Método para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o método compreende colocar a célula em contato com o agente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, inibindo, assim, a expressão de HSD17B13 na célula.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a dita célula está dentro de um indivíduo.
92. Método de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
93. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 92, caracterizado pelo fato de que a expressão de HSD17B13 é inibida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou até abaixo do nível de detecção da expressão de HSD17B13.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o humano sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13.
95. Método de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13 é uma doença hepática fibro-inflamatória crônica.
96. Método de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que a doença hepática fibro-inflamatória crônica está associada com o acúmulo e/ou a expansão de gotículas de lipídios no fígado.
97. Método de acordo com a reivindicação 95, caracterizado
22 / 27 pelo fato de que a doença hepática fibro-inflamatória crônica é selecionada a partir do grupo que consiste em inflamação do fígado, fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco e necrose hepatocelular.
98. Método para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, inibindo, assim, a expressão de HSD17B13 no dito indivíduo.
99. Método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13), caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, tratando, assim, o indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13.
100. Método para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria da redução na expressão de um gene 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13), caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz do agente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 34 a 39, prevenindo, assim, pelo menos um sintoma em um indivíduo
23 / 27 portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria da redução na expressão de um gene HSD17B13.
101. Método para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica em um indivíduo portador de esteatose, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, reduzindo, assim, o risco de desenvolver doença hepática crônica no indivíduo portador de esteatose.
102. Método para inibição da progressão de esteatose para esteato-hepatite em um indivíduo que sofre de esteatose, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, inibindo, assim, a progressão de esteatose para esteato-hepatite no indivíduo.
103. Método para inibição do acúmulo de gotículas de lipídios no fígado de um indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13), caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, e de um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica que compreende um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3, inibindo, assim, o acúmulo de gordura no fígado do indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13.
104. Método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a 17β-hidroxiesteroide
24 / 27 desidrogenases tipo 13 (HSD17B13), caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, e de um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica que compreende um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3, tratando, assim, o indivíduo que sofre de uma doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13.
105. Método para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria da redução na expressão de um gene 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13), caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz do agente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, e de um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica que compreende um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3, prevenindo, assim, pelo menos um sintoma em um indivíduo portador de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria da redução na expressão de um gene HSD17B13.
106. Método para redução do risco de desenvolver doença hepática crônica em um indivíduo portador de esteatose, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dsRNA definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, e de um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica que compreende um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3, reduzindo, assim, o risco de desenvolver doença hepática crônica no indivíduo portador de esteatose.
25 / 27
107. Método para inibição da progressão de esteatose para esteato-hepatite em um indivíduo que sofre de esteatose, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dsRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 81, ou de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 84 a 89, e de um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3 ou uma composição farmacêutica que compreende um agente dsRNA direcionado para um gene PNPLA3, inibindo, assim, a progressão de esteatose para esteato-hepatite no indivíduo.
108. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 107, caracterizado pelo fato de que a administração do agente dsRNA ou da composição farmacêutica ao indivíduo provoca uma diminuição na atividade enzimática de HSD17B13, uma diminuição no acúmulo de proteína HSD17B13, uma diminuição na atividade enzimática de PNPLA3, uma diminuição uma diminuição no acúmulo de proteína PNPLA3 e/ou uma diminuição no acúmulo de gordura e/ou expansão de gotículas de lipídios no fígado de um indivíduo.
109. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 99 a 108, caracterizado pelo fato de que a doença, transtorno ou condição associado a HSD17B13 é uma doença hepática fibro-inflamatória crônica.
110. Método de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que a doença hepática fibro-inflamatória crônica está associada com o acúmulo e/ou a expansão de gotículas de lipídios no fígado.
111. Método de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que a doença hepática fibro-inflamatória crônica é selecionada a partir do grupo que consiste em acúmulo de gordura no fígado, inflamação do fígado, fibrose hepática, doença do fígado gorduroso (esteatose), esteato- hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), cirrose do fígado, esteato-hepatite alcoólica (ASH), doenças
26 / 27 hepáticas alcoólicas (ALD), cirrose associada ao HCV, lesão hepática induzida por fármaco e necrose hepatocelular.
112. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a doença hepática fibro-inflamatória crônica é esteato- hepatite não alcoólica (NASH).
113. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 112, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é obeso.
114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 113, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um agente terapêutico adicional ao indivíduo.
115. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 114, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA é administrado ao indivíduo em uma dose entre aproximadamente 0,01 mg/kg e 10 mg/kg ou entre aproximadamente 0,5 mg/kg e 50 mg/kg.
116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 115, caracterizado pelo fato de que o agente é administrado ao indivíduo por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea.
117. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 116, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar o nível de HSD17B13 no indivíduo.
118. Agente de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de 17β-hidroxiesteroide desidrogenases tipo 13 (HSD17B13) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o agente dsRNA compreende uma fita sense e uma fita antisense formando uma região de fita dupla, em que a fita sense compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer um dos agentes em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13 e a fita antisense compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer um dos agentes em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 7, 8, 10, 11 ou 13, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e
27 / 27 substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense são nucleotídeos modificados e em que o agente dsRNA é conjugada a um ligante.
Descrição Doença hepática alcoólica
Cirrose alcoólica
Petição 870200116601, de 14/09/2020, pág. 441/448 Doença hepática não alcoólica
Cirrose não alcoólica
Carcinoma hepatocelular 1/2
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