JP7436477B2 - ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質医薬組成物およびその使用 - Google Patents

Description

優先権主張

本出願は、２０１８年１１月９日に出願された特許出願２０１８１１３２８３２６．１の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。

本開示は医薬調製物の分野に属し、特に、ＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域融合タンパク質を含む医薬組成物、および医薬品としてのその使用に関する。

本明細書の記載は、本開示に関連する背景情報を提供するに過ぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。

腫瘍処置中は化学療法による毒性が高いことが認識されており、化学療法は薬剤耐性の癌細胞の生成につながる可能性がある。腫瘍の生存および成長に関連する過剰発現または過剰活性化されたタンパク質を標的とする標的療法を用いたとしても、該標的療法の標的となる経路への依存性を減少または回避するように変異した癌細胞が依然として存在し、それらの癌細胞は他の経路を介して生存する。

近年、腫瘍免疫療法が注目されており、腫瘍処置の分野で注目されている。このような治療法の際立った利点は、薬剤耐性を生み出すことがますます困難になることである。腫瘍免疫療法は、主に免疫学的原理および方法を用いて、腫瘍細胞の免疫原性とエフェクター細胞殺傷に対する感受性を向上させ、生物における抗腫瘍免疫応答を刺激および増強する。腫瘍免疫療法は、免疫細胞およびエフェクター分子を宿主に注入することを含み、これら２つは免疫系と協力して腫瘍を殺し、生物における腫瘍成長を抑制する。

Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＰＤ－１）は、ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞に発現している。ＰＤ－１には、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ‐Ｌ１）とＰＤ‐Ｌ２の２つのリガンドがある。ＰＤ－Ｌ１はＴ細胞上の受容体ＰＤ－１と相互作用し、免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている。ＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現は、多くのヒト腫瘍組織で検出することができる。腫瘍部位の微小環境は腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することができ、発現したＰＤ－Ｌ１は腫瘍形成および成長に寄与し、抗腫瘍Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の阻害剤はＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックし、負の調節シグナルをブロックし、Ｔ細胞活性を回復させ、免疫応答を増強する。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とした免疫調節は、腫瘍抑制にとって非常に重要である。

トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）は、細胞の増殖および分化を調節するＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する。ＴＧＦ－βは、２つのタイプＩおよび２つのタイプＩＩ膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼ受容体からなるヘテロ四量体受容体複合体を介してシグナルを伝達する。

ＴＧＦ－βは多機能サイトカインであり、細胞依存的またはバックグラウンド依存的に腫瘍抑制効果または腫瘍促進効果を発揮する。ＴＧＦ－βの腫瘍抑制効果は、複数の遺伝子の発現を誘導する能力に依存する。腫瘍の発生中に変異またはエピジェネティックな修飾が導入されると、癌細胞はＴＧＦ－βの抑制効果に徐々に耐性を示し、最終的に腫瘍の発生につながる。

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路をブロックすることで、腫瘍転移を減少させることができることが研究で明らかになっている。乳癌細胞株のＴＧＦ－βシグナル伝達経路がトランケートされたＳｍａｄ２／３陰性変異体によって抑制されると、腫瘍細胞の転移能力が抑制されることが見出された。結腸癌マイクロサテライトの不安定性の研究から、ＴＧＦ－βＲＩＩの不活性変異は転移を減少させ、患者の術後生存率を増加させることが明らかになった。しかしながら、一般的に、臨床処置においてＴＧＦ－βシグナル伝達経路の抑制物質を単独で投与した場合、その効果は弱い。これは、おそらく、ＴＧＦ－βが主に腫瘍細胞で異常発現しているのに対し、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の抑制物質のみでは腫瘍を標的にすることは困難であり、その結果、抑制物質の有効性またはバイオアベイラビリティが低いためである。

したがって、腫瘍微小環境におけるＴＧＦ－βの標的化および中和化に基づいて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を抑制することで、Ｔ細胞の活性を回復させ、免疫応答を増強し、腫瘍形成および発生の抑制効果をより効果的に向上させることができる。

本出願人の以前のＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０４３２０（公開番号ＷＯ２０１７０８４４９５）は、ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。抗体／ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、ＷＯ２００６０７４４５１Ａ２、ＷＯ２００９１５２６１０Ａ１、ＷＯ２０１１１０９７８９Ａ２、ＷＯ２０１３１６４６９４Ａ１、ＷＯ２０１４１６４４２７Ａ１、ＷＯ２０１５０７７５４０Ａ２、ＷＯ９３０９２２８Ａ１、ＷＯ９４０９８１５Ａ１、ＷＯ２０１５０７７５４０Ａ２、ＷＯ２０１５１１８１７５Ａ２などで現在公開されている。これらの中で、メルク社（Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－β二機能性融合タンパク質Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ Ａｌｆａ（ＷＯ２０１５１１８１７５、Ｍ７８２４、ＦＰ１７０２２としても知られている）を開示している。現在、Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ Ａｌｆａは、胃癌、肺癌、食道癌、ＮＳＣＬＣ、胆道癌などの腫瘍性疾患の臨床段階にある。しかしながら、先行技術における抗体医薬品は、高分子量、複雑な構造のために不安定になり、劣化、重合または望ましくない化学修飾の発生を受けやすくなる。投与に適した抗体を作製し、保管およびその後の使用の間の安定性を維持し、より良好な効果を発揮するために、抗体医薬品の安定した調製に関する研究は特に重要である。

本開示は、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βＲＩＩ融合タンパク質を含む医薬組成物を提供し、これは、製造および投与をより助長し、性能においてより安定している；該医薬組成物は、
ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、および
緩衝液
を含み、
前記緩衝液は、ヒスチジン塩緩衝液、コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記緩衝液はクエン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、前記ヒスチジン塩緩衝液はヒスチジン－塩酸緩衝液であり、前記コハク酸緩衝液はコハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液であり、前記クエン酸緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である；いくつかの実施形態では、前記緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌ～約７０ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ～７０ｍｇ／ｍｌである。ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度の非限定的な例は、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３５ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約５５ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約６５ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌを含む。

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度は、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌである。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記緩衝液のｐＨ値は、約５．０～約７．５、好ましくは約６．０～約６．５、任意に約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、より好ましくは約６．２である。

いくつかの実施形態では、前記緩衝液のｐＨ値は、５．０～７．５、または６．０～６．５、好ましくは６．０、６．１、６．２、６．３、６．４または６．５、より好ましくは６．２である。

代替の実施形態では、前記緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約２０ｍＭである；その非限定的な例は、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭを含む。

いくつかの実施形態では、前記緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ～２０ｍＭである；いくつかの実施形態では、前記緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭである。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物は糖類も含む。本開示における「糖類」は、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖類、非還元糖類などを含む、従来の化合物／組成物（ＣＨ_２Ｏ）_ｎまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、前記糖類は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、デキストラン、グリセロール、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メリトリオース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどからなる群から選択される。好ましい糖類は非還元二糖類であり、より好ましくはトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースである。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記糖類の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌである；非限定的な例は、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは８０ｍｇ／ｍｌを含む。

いくつかの実施形態では、前記糖類の濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは６０ｍｇ／ｍｌ～９０ｍｇ／ｍｌである；いくつかの実施形態では、前記糖類の濃度は、約６０ｍｇ／ｍｌ、約６５ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約８５ｍｇ／ｍｌまたは約９０ｍｇ／ｍｌである。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物は界面活性剤をさらに含み、当該界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリヒドロキシアルキレン、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル－スルホベタイン、ミリスチル－スルホベタイン、リノレイル－スルホベタイン、ステアリル－スルホベタイン、ラウリル－サルコシン、ミリスチル－サルコシン、リノレイル－サルコシン、ステアリル－サルコシン、リノレイル－ベタイン、ミリスチル－ベタイン、セチル－ベタイン、ラウレルアミドプロピル－ベタイン、コカミドプロピル－ベタイン、リノールアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ベタイン、パルミタミドプロピル－ベタイン、イソステアリルアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ジメチルアミン、パルマミドプロピル－ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル、ナトリウムメチルオレイルタウレート、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールの共重合体等からなる群から選択され得る。好ましい界面活性剤はポリソルベート８０またはポリソルベート２０であり、より好ましくはポリソルベート８０である。

別の代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記界面活性剤の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、前記界面活性剤の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態では、前記界面活性剤の濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌまたは０．８ｍｇ／ｍｌ、より具体的には０．４ｍｇ／ｍｌである。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物は、
（ａ）約０．５ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、（ｂ）約５ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸緩衝液、（ｃ）約５０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌのスクロース、および（ｄ）約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含み、好ましくは前記医薬組成物のｐＨは約５．０～約７．５であり、より好ましくは約６．０～約６．５である。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物は、
０．５ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、
５ｍＭ～３０ｍＭのクエン酸緩衝液、
５０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌのスクロース、および
０．１ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む；
好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは５．０～７．５、より好ましくは６．０～６．５である。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物は、
（ａ）約３０ｍｇ／ｍｌ～約７０ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、（ｂ）約５ｍＭ～約２０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、（ｃ）約６０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および（ｄ）約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む；
好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは約６．０～約６．５である。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物は、
３０ｍｇ／ｍｌ～７０ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、
５ｍＭ～２０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、
６０ｍｇ／ｍｌ～９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および
０．４ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む；
前記医薬組成物のｐＨは約６．０～約６．５である。

代替の実施形態では、前記医薬組成物は、
（ａ）約５０ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、（ｂ）約１０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、（ｃ）約８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および（ｄ）約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含み、前記医薬組成物のｐＨは好ましくは約６．２である。

代替の実施形態では、前記医薬組成物は、
５０ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、
１０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、
８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および
０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む；
好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは約６．２である。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、一般式（Ｉ）：
として示される。
（式中、
ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤは、ＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外領域のトランケート型であり、
Ａｂは、ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
Ｌは、リンカー配列である。）

代替の実施形態では、上記の医薬組成物における前記リンカー配列は、（Ｇ_４Ｓ）_ｘＧであり、ここで、ｘは３～６の整数である。代替の実施形態では、ｘは、３、４、５または６、好ましくは４である。

代替の実施形態では、前記ＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外領域のトランケート型は、アミノ末端（Ｎ末端とも呼ばれる）に最大２６個の連続するアミノ酸残基の欠失を有するＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（配列番号１４として示される）の配列である。いくつかの実施形態では、前記ＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外領域のトランケート型は、Ｎ末端に１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個の連続するアミノ酸残基の欠失を有するＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインの配列である。いくつかの実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤの配列は、配列番号１４、１５、１６または１７として示され、好ましくは配列番号１５として示されるる。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号１、配列番号２および配列番号３としてそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ならびに
配列番号４、配列番号５および配列番号６としてそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号１、配列番号１０および配列番号３としてそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ならびに
配列番号４、配列番号５および配列番号６としてそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号７として示される重鎖可変領域、および
配列番号８として示される軽鎖可変領域；
を含むか、または
配列番号９として示される重鎖可変領域、および
配列番号１１として示される軽鎖可変領域
を含む。

代替の実施形態では、上記の医薬組成物中の前記ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号１２として示されるか、または配列番号１２として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有し；前記ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１３として示されるか、または配列番号１３として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。

上記の医薬組成物の代替の実施形態では、前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質において、前記ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤは、リンカー配列を介して前記ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合している。

いくつかの実施形態では、前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、
・ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤに融合した前記ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖によって形成される融合ペプチドであって、その配列は配列番号２３として示されるか、または配列番号２３として示される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、融合ペプチドと、
・前記ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖であって、その配列は配列番号１３として示されるか、または配列番号１３として示される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、軽鎖
を含む。

他の実施形態では、前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、
・ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤに融合した前記ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖によって形成される融合ペプチドであって、その配列は配列番号２４として示されるか、または配列番号２４として示される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、融合ペプチドと、
・前記ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖であって、その配列は配列番号１３として示されるか、または配列番号１３として示される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、軽鎖
を含む。

本開示はまた、上記の医薬組成物の調製方法であって、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を緩衝液と接触させるステップ、例えば、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質のストック溶液に対して緩衝液置換を行うステップ、を含む調製方法を提供し、前記緩衝液は好ましくはクエン酸緩衝液であり、より好ましくはクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液であり、前記緩衝液の濃度は好ましくは約５ｍＭ～約２０ｍＭであり、その非限定的な例は、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭを含み、前記緩衝液のｐＨは約６．０～約６．５であり、その非限定的な例は、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、好ましくは６．２を含む。代替の実施形態では、前記緩衝液の濃度は５ｍＭ～２０ｍＭであり、その非限定的な例は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭを含む；前記緩衝液のｐＨは６．０～６．５であり、その非限定的な例は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、好ましくは約６．２を含む。

本開示はまた、上記の医薬組成物の調製方法であって、前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を緩衝液と接触させるステップの後に、得られた溶液にスクロースおよびポリソルベート８０を添加するステップ（２つの間に優先順位はない）と、次いで前記緩衝液で体積を調整するステップとをさらに含む、調製方法を提供し、前記緩衝液溶液の濃度は好ましくは約５ｍＭ～約２０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ～２０ｍＭであり、その非限定的な例は、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭを含み、前記緩衝液のｐＨは約６．０～約６．５であり、その非限定的な例は、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５を含む。

本開示はまた、上記の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物の調製方法を提供する。

代替の実施形態では、上記のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物の調製方法であって、前記凍結乾燥は当技術分野で既知の方法、例えば、限定されるものではないが予備凍結、一次乾燥および二次乾燥を含むステップに従って行われる。当業者は、本開示における医薬組成物から水を除去するための任意の方法が本開示に適用可能であることを理解する。

本開示はまた、上記の凍結乾燥調製物を調製するための方法によって調製される、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物を提供する。

本開示はまた、再構成されて上記の医薬組成物を形成することができる、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物を提供する。

いくつかの実施形態では、前記凍結乾燥調製物は２℃～８℃で、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、または少なくとも２４ヶ月間安定であり得る。いくつかの実施形態では、前記凍結乾燥調製物は４０℃で、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、または少なくとも２８日間安定であり得る。

本開示はまた、上記のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物を再構成することによって得られる、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む再構成溶液を提供する。

本開示はまた、上記のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む再構成溶液の調製方法であって、上記の凍結乾燥調製物を再構成するステップを含み、再構成に使用される溶液は、限定されるものではないが、注射用水、生理食塩水またはグルコース溶液、好ましくは注射用水を含む。

本開示はさらに、本開示による医薬組成物と、容器とを含む、製造品またはキットを提供する。

いくつかの実施形態では、前記容器は、ガラス瓶、例えば限定されるものではないが中性ホウケイ酸ガラスバイアルで作られた注入瓶である。

本開示はまた、容器を含む製造品であって、当該容器は上記の医薬組成物、またはその凍結乾燥調製物、またはその凍結乾燥調製物の再構成溶液を含む、製造品を提供する。

本開示はまた、医薬品の調製における、以下から選択されるいずれか１つの使用を提供する：上記の医薬組成物、またはその凍結乾燥調製物、またはその凍結乾燥調製物の再構成溶液、または製造品；前記医薬品は、腫瘍細胞の増殖または転移の疾患または障害を処置または抑制するために使用される。

いくつかの実施形態では、前記疾患または障害は腫瘍である。

いくつかの実施形態では、前記疾患または障害は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、上咽頭癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群からなる群から選択される。

本開示はまた、癌細胞の増殖または転移に関連する疾患または障害を処置または抑制するための方法であって、治療有効量の上記の医薬組成物、または凍結乾燥調製物、または再構成溶液、または製造品を、必要とする対象に与えることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、０．１ｍｇ～３０００ｍｇの上記のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、医薬組成物、または凍結乾燥調製物、または再構成溶液、または製造品を含む、単位用量の組成物を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記疾患または障害は腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記疾患または障害は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、上咽頭癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群からなる群から選択される。

本発明はまた、癌細胞の増殖または転移に関連する疾患または障害を処置または抑制するための、上記のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、医薬組成物、または凍結乾燥調製物、または再構成溶液、または製造品を提供する。いくつかの実施形態では、前記疾患または障害は腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記疾患または障害は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、上咽頭癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群からなる群から選択される。

当業者には周知のように、本開示に記載されているさまざまな実施形態の特徴の１つ、いくつか、またはすべてをさらに組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成することができる。本開示の上記の実施形態および組み合わせによって得られる他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。

融合タンパク質の構造を示す概略図。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＴＧＦ－β１への融合タンパク質の結合を示す結果。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＴＧＦ－β１への融合タンパク質の結合を示す結果。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＰＤ－Ｌ１への融合タンパク質の結合を示す結果。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの融合タンパク質によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路ブロッキングの検出を示す結果。 融合タンパク質は、用量依存的にｐＳＭＡＤ３レポーターのＴＧＦβ誘導活性を抑制する。 融合タンパク質のすべてのサンプルは、活性化Ｔリンパ球によるサイトカインＩＦＮ－γの分泌を増強する。 腫瘍保持マウスの腫瘍重量に対する融合タンパク質の効果。

用語

本開示をより容易に理解するために、特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。

「緩衝液」とは、酸－塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に耐えられる溶液を指す。ｐＨを適切な範囲内に制御することができる緩衝液の例には、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、シュウ酸塩、乳酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩およびグリシルグリシンが含まれる。

「ヒスチジン塩緩衝液」とは、ヒスチジンラジカルイオンを含む緩衝液である。ヒスチジン塩緩衝液の例には、ヒスチジン－塩酸塩、ヒスチジン－酢酸塩、ヒスチジン－リン酸塩、ヒスチジン－硫酸塩など、好ましくはヒスチジン－塩酸塩緩衝液が含まれる。ヒスチジン－塩酸塩緩衝液は、ヒスチジンおよび塩酸から調製される。

「クエン酸緩衝液」とは、クエン酸ラジカルイオンを含む緩衝液である。クエン酸緩衝液の例には、クエン酸－クエン酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸カリウム、クエン酸－クエン酸カルシウム、クエン酸－クエン酸マグネシウムなどが含まれる。好ましいクエン酸緩衝液は、クエン酸－クエン酸ナトリウムである。

「コハク酸緩衝液」とは、コハク酸ラジカルイオンを含む緩衝液である。コハク酸緩衝液の例には、コハク酸－コハク酸ナトリウム、コハク酸－コハク酸カリウム、コハク酸－コハク酸カルシウムなどが含まれる。好ましいコハク酸緩衝液は、コハク酸－コハク酸ナトリウムである。

「リン酸緩衝液」とは、リン酸ラジカルイオンを含む緩衝液である。リン酸緩衝液の例には、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウムなどが含まれる。好ましいリン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。

「酢酸緩衝液」とは、酢酸ラジカルイオンを含む緩衝液である。酢酸緩衝液の例には、酢酸－酢酸ナトリウム、酢酸ヒスチジン、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどが含まれる。好ましい酢酸緩衝液は、酢酸－酢酸ナトリウムである。

「医薬組成物」とは、本明細書に記載の１つ以上の化合物またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグと、生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤などの他の化学成分とを含む混合物を指す。医薬組成物の目的は、活性成分抗体の安定性を維持し、生物への投与を促進し、生物学的活性を発揮するように活性成分の吸収を促進することである。本明細書で使用される「医薬組成物」および「調製物」は、相互に排他的ではない。

特に明記しない限り、本開示に記載の医薬組成物の溶液形態に言及する場合、その中の溶媒は水である。

「凍結乾燥調製物」とは、液体または溶液形態の医薬組成物を凍結乾燥するステップ（例えば、真空凍結乾燥ステップ）、または液体または溶液形態の調製物を凍結乾燥するステップの後に得られる調製物または医薬組成物を指す。

本開示で使用される「約」または「およそ」という用語は、その値が当技術分野の当業者によって決定された特定の値の許容誤差範囲内にあり、その値はどのように測定または決定されるか（すなわち、測定システムの限界）に部分的に依存することを意味する。例えば、当技術分野における「約」または「およそ」は、１未満または１超の標準偏差を指す。あるいは、「約」または「およそ」または「実質的に含む」は、最大２０％の範囲を指す。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスの場合、この用語は、その値の最大１０倍または最大５倍を意味する。特に明記しない限り、本開示で使用される「約ＸＸ」または「およそＸＸ」または「実質的にＸＸを含む」の意味は、特定の値「ＸＸ」の許容誤差範囲内の値（値「ＸＸ」自体、ならびに当技術分野の一般的な当業者によって決定されたその値の許容誤差範囲内の値を含む）を指す。

本開示に記載の医薬組成物は、安定した効果を達成することができる：ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質またはその医薬組成物は、保管後、物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を実質的に保持する；好ましくは、医薬組成物は、保管後、物理的および化学的安定性ならびにその生物学的活性を実質的に保持する。保管寿命は、一般に、医薬組成物の所定の保管寿命に基づいて決定される。現在、活性成分の安定性を測定するための多くの分析技術が存在し、所与の温度で所与の期間保管した後の安定性を測定することができる。

抗体またはタンパク質の安定な医薬調製物は、以下の条件下で有意な変化が観察されない調製物である：冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、より好ましくは１年間、さらにより好ましくは最大２年の保管。さらに、安定な液体調製物には、ある温度（２５℃を含む）で１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間保管した後、または４０℃で２８日間保管した後に所望の特性を示す液体調製物が含まれる。

安定性の典型的な許容基準は次のとおりである：ＳＥＣ－ＨＰＬＣで測定した場合、通常は約１０％以下、好ましくは約５％以下の活性成分（タンパク質、抗体など）が劣化される。目視検査により、医薬調製物は、淡黄色のほぼ無色、透明または無色の液体、または透明からわずかに乳白色、または淡黄色のほぼ無色の透明な液体である。調製物の濃度、ｐＨおよび浸透圧の変化は±１０％以下である。約１０％以下、好ましくは約５％以下のトランケーションが一般に観察される。通常約１０％以下、好ましくは約５％以下の凝集体が形成される。

抗体が、色および／または透明度の目視検査、またはＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって、凝集、沈殿および／または変性の有意な増加を示さない場合、医薬調製物中の活性成分は、「その物理的安定性を保持している」と見なされる。タンパク質のコンホメーションの変化は、（タンパク質の三次構造を決定する）蛍光分光法および（タンパク質の二次構造を決定する）ＦＴＩＲ分光法によって評価することができる。

医薬調製物中の活性成分（例えば、タンパク質または抗体）は、その活性成分（例えば、タンパク質または抗体）が有意な化学変化を示さない場合、「その化学的安定性を保持している」と見なされる。化学的に変化した形態のタンパク質または抗体を検出および定量化することによって、化学的安定性を評価することができる。タンパク質の化学構造の変化をしばしばもたらす劣化プロセスには、加水分解またはトランケーション（サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの方法によって評価される）、酸化（質量分析またはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチドマッピングなどの方法によって評価される）、脱アミド化（イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸含有量の測定などの方法によって評価される）、および異性化（イソアスパラギン酸含有量の測定、ペプチドマッピングなどによって評価される）が含まれる。

活性成分（例えば、タンパク質または抗体）が、所与の期間、医薬製剤が調製されるときの生物学的活性の所定の範囲内の生物学的活性を示す場合、該活性成分（例えば、タンパク質または抗体）は、医薬調製物中で「その生物学的安定性を保持している」。活性成分（例えば、タンパク質または抗体）の生物学的活性は、例えば、抗原結合アッセイによって決定することができる。

本開示で使用される場合、アミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３， ３５５８頁（１９６８年）に記載されているとおりである。

本開示で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン、すなわち、鎖間ジスルフィド結合によって接続された２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖によって形成される４ペプチド鎖構造を指す。

本開示において、本開示に記載される抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそれらのバリアントを含む軽鎖定常領域をさらに含む。

本開示において、本開示に記載される抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントを含む重鎖定常領域をさらに含む。

抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端では、約１１０アミノ酸の領域が大きく異なり、可変領域（Ｆｖ領域）として知られている；Ｃ末端のアミノ酸配列は比較的安定であり、定常領域として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、比較的保存された配列を有する４つのＦＲ領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られ、抗体の特異性を決定する。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域から構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に次のように配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。３つの軽鎖ＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す；３つの重鎖ＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指す。本明細書の抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域におけるＣＤＲ領域アミノ酸残基の番号および位置は、既知のＫａｂａｔ番号付け基準（ＬＣＤＲ１－３、ＨＣＤＲ１－３）に準拠するか、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付け基準に準拠する；Ｋａｂａｔ番号付け基準（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州を参照）、およびＣｈｏｔｈｉａ番号付け基準（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７年）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８頁を参照）。

本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。

本開示で使用される場合、「抗体またはその結合フラグメント」または「機能的フラグメント」とは、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに抗原に結合するＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントを指す。Ｆｖフラグメントはすべての抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントであり、Ｆｖフラグメントは重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むが、定常領域を含まない。一般に、Ｆｖ抗体は、抗原結合に必要な構造を形成するために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。また、異なるリンカーを使用して、２つの抗体の可変領域を接続して、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれるポリペプチド鎖を形成することができる。本開示で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１との結合」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１と相互作用する能力を意味する。本開示で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、標的抗原を認識して該抗原に特異的に結合する、抗体上またはその抗原結合フラグメント上の不連続または連続した三次元部位を指す。

本開示における「マウス抗体」という用語は、当該分野の知識および技能に従って調製された抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を指す。調製中に、試験対象はＰＤ－Ｌ１抗原を注入され、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマが単離される。

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト（マウスなど）抗体によって誘導される免疫応答を軽減するために、非ヒト（マウスなど）抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合することによって形成される抗体である。キメラ抗体を確立するために、特定のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、次いで、可変領域の遺伝子をハイブリドーマ細胞からクローニングし、次いで、ヒト抗体の定常領域の遺伝子を必要に応じてクローニングし、非ヒト（マウスなど）抗体可変領域の遺伝子をヒト定常領域の遺伝子とライゲーションして、ヒトベクターに挿入することができるキメラ遺伝子を形成し、キメラ抗体分子を最終的に真核生物または原核生物の産業システムで発現させる。本開示の好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ、λ鎖またはそのバリアントに由来する軽鎖定常領域をさらに含む。ＰＤ－Ｌ１キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントに由来する重鎖定常領域をさらに含む。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントに由来する重鎖定常領域から選択され得、好ましくは、ヒトＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはアミノ酸変異によりＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）を伴わないＩｇＧ４に由来する重鎖定常領域を含む。

ＣＤＲ移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体可変領域フレームワークに移植された非ヒト（マウスなど）ＣＤＲ配列によって生成される抗体、すなわち、ヒト生殖細胞系列抗体フレームワークの異なるタイプの配列から生成される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量の非ヒト（マウスなど）成分を有するキメラ抗体によって誘導される強力な抗抗体応答（ａｎｔｉ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を克服する。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列をカバーする公開されたＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）、およびＫａｂａｔ， ＥＡ ｅｔ ａｌ． １９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版において見出すことができる。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域フレームワークは、活性を維持するための最小限の復帰変異に供される。本開示のヒト化抗体は、ＣＤＲ親和性成熟の目的でファージディスプレイによってさらに得られるヒト化抗体も指す。

本開示で使用される場合、「ＡＤＣＣ」という用語、すなわち抗体依存性細胞介在性細胞傷害は、抗体によってコーティングされた標的細胞を、その抗体のＦｃセグメントを認識することによって直接殺傷するＦｃ受容体を発現する細胞を指す。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントを改変（修飾）することによって低減または排除され得る。改変（修飾）とは、抗体重鎖定常領域の変異、例えば、ＩｇＧ１におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ；またはＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異からなる群から選択される変異を指す。

本開示で使用される場合、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの配列間の類似性の程度を示す。本開示における配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％であり、好ましくは少なくとも９５％である。非限定的な例には、限定されるものではないが、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が含まれる。２つの配列間の同一性パーセントの比較および決定は、アメリカ国立生物工学情報センターのウェブサイトから利用可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定を使用して達成することができる。

「ＴＧＦ－β受容体ＩＩ」または「ＴＧＦβＲＩＩ」または「トランスフォーミング成長因子β受容体ＩＩ」という用語は、細胞表面受容体がそれを介して細胞内シグナル伝達経路を誘発する結合リガンド（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を含むが、これらに限定されない）を指す。

「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＣＤ２７４およびＢ７Ｈ１としても知られるｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １を指す。ＰＤ－Ｌ１は、２９０アミノ酸のタンパク質であり、細胞外ＩｇＶ様およびＩｇＣ様ドメイン（全長ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸１９～２３９）、膜貫通ドメイン、および約３０アミノ酸の細胞内ドメインを有する。ＰＤ－Ｌ１は、抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞など）、ならびに造血および非造血細胞（血管内皮細胞、膵島、免疫特権部位など）などの多くの細胞で恒常的に発現している。ＰＤ－Ｌ１は、さまざまな腫瘍およびウイルス感染細胞にも発現しており、免疫抑制環境におけるメンバーである（Ｒｉｂａｓ ２０１２年、ＮＥＪＭ ３６６：２５１７－２５１９頁）。ＰＤ－Ｌ１は、２つのＴ細胞共抑制物質（ＰＤ－１およびＢ７－１）の一方に結合する。

本開示の「ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合タンパク質」は、当技術分野において記載されている任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、市販されているＰＤ－Ｌ１抗体であり得るか、または文献に開示されており、限定されるものではないが、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＵＳ２０１４３４１９１７、ＵＳ２０１３００３４５５９、ＵＳ８７７９１０８を参照）などを含む。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。抗体フラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、抗原結合活性を有するＦ（ａｂ’）_２フラグメント、ならびに抗原に結合するＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントが含まれる。

本開示のＰＤ－Ｌ１抗体の例示的な調製プロセスとして、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０４３２０（公開番号ＷＯ２０１７０８４４９５）において公開されており、ＰＤ－Ｌ１抗体は、以下に記載されるような重鎖可変領域中のＣＤＲの配列を含む：

代替の実施形態では、Ｘ_１はＨまたはＧから選択され、Ｘ_２はＧまたはＦから選択される。

別の実施形態では、本開示の例示的なＰＤ－Ｌ１抗体は、以下に記載されるような軽鎖可変領域のＣＤＲ配列をさらに含む：

別の実施形態では、上記のＣＤＲ領域はＣＤＲ移植戦略によってヒト化され、ヒト化軽鎖テンプレートのＦＲはＩＧＫＶ７－３＊０１およびｈｊｋ２．１であり、ヒト化重鎖テンプレートのＦＲはＩＧＨＶ１－４６＊０１およびｈｊｈ６．１であり、ヒト化可変領域配列は以下のとおりである：

ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域：

配列番号７、ここでＸ_１はＨまたはＧから選択され、Ｘ_２はＧまたはＦから選択される。

ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域：

注：順序はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、イタリック部分はＦＲ配列を表し、下線部分はＣＤＲ配列を表す（ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付け基準に基づいて決定および表示される）。

別の実施形態では、本開示のヒト化抗体の復帰変異の設計が行われ、設計された復帰変異が以下の表１に示されている：

表１．復帰変異の設計

注：例えば、Ｙ９１Ｆは、天然番号付けに従って、位置９１におけるＹからＦへの復帰変異を示す。「移植された」は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ配列に移植されることを示す。

表１に示す重鎖および軽鎖のさまざまな変異の組み合わせによって、新しいヒト化抗体を得ることができる。

本開示の別の態様において、ヒト化クローンを構築するための実施形態は、以下のように提供される：

プライマーを設計し、各ヒト化抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲにより構築した後、（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒに挿入して相同組換えを行い、全長抗体発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。

１．プライマー設計
オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．２）（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を用いて、組換えに必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫ（５’－３０ｂｐ シグナルペプチド＋ＶＨ／ＶＫ＋３０ｂｐ ＣＨ１／ＣＬ－３’）の合成用の複数のプライマーを設計した。

２．フラグメントスプライシング
ＴａＫａＲａのＰｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのマニュアルに従って、上記で設計したプライマーを使用して、組換えに必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫを、２ステップＰＣＲ増幅によって得た。

３．（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒの構築および酵素消化
配列と制限部位との間の特有の特徴を認識するＢｓｍＢＩなどのいくつかの特別な制限エンドヌクレアーゼを使用して、（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒを設計および構築した。ベクターをＢｓｍＢＩを使用して消化した後、消化したフラグメントをゲルを用いて抽出し、使用のために保存した。

４．発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒの組換え構築
組換えに必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫと、ＢｓｍＢＩで消化された（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒを、３：１の比率でＤＨ５Ｈコンピテント細胞に添加し、氷上にて０℃で３０分間インキュベートし、４２℃で９０秒間熱ショックを与え、５倍量のＬＢ培地を添加し、３７℃で４５分間インキュベートした後、ＬＢ－Ａｍｐプレート上にプレーティングし、３７度で一晩培養した。配列決定のために単一のクローンを拾い上げ、目的のクローンを得た。

５．本実施例の設計に従ってプラスミドを構築した後、精製タンパク質を発現させ、得られたタンパク質の親和性をＳＰＲ実施例に記載の検出により測定した。

６．最後に、ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓに対するヒト化復帰変異変異体またはハイブリドーマ抗体の親和性をＢＩＡＣＯＲＥによって測定した。ヒト化復帰変異部位およびスクリーニングから得られた配列の組み合わせは以下のとおりである：

ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域：
ここで、ＨＣＤＲ２はＲＩＧＰＮＳＧＦＴＳＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１０）に示すとおりである。すなわち、配列番号７のＸ_１はＧであり、配列番号７のＸ_２はＦである；

ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域：
配列番号１１

注：順序はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、イタリック部分はＦＲ配列を表し、下線部分はＣＤＲ配列を表す（ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付け基準に基づいて決定および表示される）。

本開示の別の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１ヒトＩｇＧ４タイプ抗体を構築および発現するための実施形態が提供され、さらに、融合タンパク質の構築に使用されるＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。ＰＤ－Ｌ１抗体はまた、本開示の試験例においてコントロール分子として使用され得る。

ＰＤ－Ｌ１は活性化Ｔ細胞でも発現されるので、野生型ＩｇＧ１定常領域の使用は、（ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどの）Ｆｃ媒介性効果を引き起こすことができ、その結果、活性化Ｔ細胞が減少する可能性がある。本開示は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなしの抗体を得るために変異ＩｇＧ４を選択した。親和性成熟によって得られたクローンはＩｇＧ４タイプに変換され、ＩｇＧ４のコアヒンジ領域はＳ２２８Ｐ変異（配列番号１２の天然配列における位置２２７に対応する）を含む。Ｆ２３４Ａ（配列番号１２の天然配列における位置２３３に対応する）およびＬ２３５Ａ変異（配列番号１２の天然配列における位置２３４に対応する）がさらに導入された（ｍＡｂｓ ４：３， ３１０－３１８頁；２０１２年５月／６月）。同時に、（ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインを連結するために使用される）リンカーペプチドが導入されたときに抗体重鎖のＣ末端で生じる切断を回避するために、ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖の末端位置のＫが、融合タンパク質の安定性を高めるようにＡ（配列番号１２の天然配列におけるの最後の位置に対応する）にさらに変異された。融合タンパク質の構築に使用される本開示のＰＤ－Ｌ１抗体の配列は、以下のとおりである：

ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖：ＩｇＧ４（ＡＡ）（Ｓ２２８Ｐ）

注：下線部分は重鎖可変領域配列であり、下線なし部分は重鎖定常領域配列である（イタリック体の部分は変異部位である）；

ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖：

注：下線部分は軽鎖可変領域配列であり、下線なし部分は軽鎖定常領域配列である。

本開示で使用される場合、本開示に記載される融合タンパク質は、ＤＮＡ組換え技術を介して２つの遺伝子を共発現することによって得られるタンパク質産物である。抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は当技術分野で周知であり、（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、第５－８章および第１５章において）見出すことができる。例えば、マウスをヒトＰＤ－Ｌ１またはそのフラグメントで免疫化し、次いで、得られた抗体を当技術分野で周知の従来の方法を使用することによって、再生し、精製し、そしてアミノ酸配列について配列決定することができる。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを１つ以上のヒトＦＲに移植するように操作される。ＭＯＥソフトウェアを用いてＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞系列のデータベースに対してアラインメントすることにより、ヒトフレームワーク生殖細胞系列配列をＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、２００１年、ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から入手することができる。

本開示の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、既知の方法を使用して調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングして、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。次いで、操作された免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトすることができる。当技術分野で知られているより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位において、抗体のグリコシル化をもたらす。安定なクローンは、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体の発現によって得ることができる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生のために無血清培養培地で増殖させることができる。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、該培地は、適合性のある緩衝液で平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＧセファロースＦＦカラムにロードされ得る。カラムは洗浄され、非特異的結合成分が除去される。結合した抗体をｐＨグラジエントによって溶出し、抗体画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出して収集する。抗体は、一般的な技術を使用して濾過および濃縮することができる。可溶性の凝集体および多量体は、サイズ排除またはイオン交換を含む一般的な技術によって効果的に除去することができる。生成物は、例えば－７０℃で直ちに凍結するか、または凍結乾燥することができる。

本開示の「免疫調節分子」は、癌細胞の免疫寛容を弱めるために使用され得る。本開示は、融合タンパク質における免疫調節分子として、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインのトランケート型を使用する。「ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）」は、リガンドＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β３に高い親和性で結合する。ＴＧＦ－βＲＩＩ／ＴＧＦ－β複合体はＴＧＦ－βＲＩを動員して、シグナル伝達複合体を形成する（Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９年；５９：１２７３－７頁）。ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外のＮ末端からの１３６アミノ酸残基のペプチドであり、その例示的な例が配列番号１４に示されている。ＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β３に結合することができる、約１３６アミノ酸の長さで、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインに由来する他のバリアントも、本開示のＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインに属する。本開示は、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインのＮ末端連続トランケート型の構造および機能がトランケートされていない分子のそれよりも安定であることを見出した。ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインのＮ末端非トランケート型（配列番号１４のアミノ酸１～１３６として示されるポリペプチド）を含む融合タンパク質は破壊されやすい。特に、Ｎ末端から２６個未満の連続したアミノ酸がトランケートされたＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインはより安定である；好ましくはＮ末端から１４～２６個、より好ましくはＮ末端から１４～２１個の連続したアミノ酸がトランケートされたＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインはより高い発現レベルを有する；最も好ましくは１９または２１個の連続したアミノ酸がトランケートされる。

「ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質」という用語は、ＴＧＦ－β受容体を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８６４５１（ＷＯ２０１８２０５９８５Ａ１）に記載のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質である。ＷＯ２０１８２０５９８５Ａ１の全内容は、本開示に完全に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン融合タンパク質（ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップ）であり、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは融合タンパク質の免疫調節分子部分として機能し、ＰＤ－Ｌ１抗体は融合タンパク質の標的化部分として機能し、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（例えば、配列番号１４、１５、１６または１７として示される）は、リンカー配列（例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ＸＧ、ｘは３～６である）によってＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端（カルボキシル末端としても知られる）に接続されて融合配列を形成し、当該融合配列は鎖間ジスルフィド結合を介してＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖に接続されて、最終的にＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップ融合タンパク質を形成し、その構造が図１に示されている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、本開示の実施例１の表２に記載されている融合タンパク質である。

「リンカー」または「リンカー配列」という用語は、通常はある程度の柔軟性を有し、タンパク質ドメインを接続するために使用される接続ペプチド配列を指し、リンカーの使用はタンパク質ドメインの本来の機能の喪失をもたらさない。本開示のいくつかの実施形態では、リンカー配列は（Ｇ_４Ｓ）_ｘＧであり、ここでｘは３～６であり、例えば、リンカー配列は（Ｇ_４Ｓ）_３Ｇ、（Ｇ_４Ｓ）_４Ｇ、（Ｇ_４Ｓ）_５Ｇまたは（Ｇ_４Ｓ）_６Ｇなどのポリペプチドである。

「保存的改変（修飾）」または「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、タンパク質中のアミノ酸を類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖コンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指し、そのような変更はタンパク質の生物学的活性を変えることなく頻繁に行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， ２２４頁（第４版）を参照）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換が生物学的活性を破壊する可能性は低い。

「任意の」または「任意に」とは、後に続く出来事または状況が発生する可能性があるが、必ずしも発生するとは限らないことを意味し、その記載には、出来事または状況が発生する場合と発生しない場合が含まれる。例えば、「任意に、１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在し得るが、必ずしも存在するとは限らないことを意味する。

「投与」、「投与すること」および「処置」とは、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または生体液に適用される場合、外因性の医薬品、治療用薬剤、診断用薬剤または組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器または生体液への接触を指す。「投与」、「投与すること」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、および実験方法を指すことができる。細胞の処置（処理）は、試薬を細胞と接触させること、ならびに流体が細胞と接触している場合に試薬を該流体と接触させることを包含する。「投与」、「投与すること」および「処置」は、例えば、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞による、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの処置およびｅｘ ｖｉｖｏでの処置も意味する。「投与」または「処置」は、ヒト、獣医、または研究対象に適用される場合、研究および診断用途に対する治療的処置、予防的または予防的手段（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ）を指す。

「処置する」とは、本開示の組成物などの治療用薬剤を、該薬剤が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有する対象に、内部的にまたは外部的に投与することを意味する。典型的には、薬剤は、処置される対象または集団における１つ以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与され、臨床的に測定可能な程度で、そのような症状の退行を誘発するか、そのような症状の進行を予防する。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用薬剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、対象の病状、年齢および体重、ならびに対象において所望の反応を誘発する薬剤の能力などの因子に応じて変動し得る。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練した医療提供者が通常使用する任意の臨床測定によって評価することができる。本開示の一実施形態（例えば、処置方法または製造品）は、すべての対象において標的疾患症状を軽減するのに有効ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニー（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）によるＵ検定、クラスカル－ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定、およびウィルコクソン検定などの当技術分野で既知の任意の統計的試験によって決定される統計的に有意な数の対象において、標的疾患症状を軽減するはずである。

「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を包含する。有効量は、診断を可能または容易にするのに十分な量も意味する。特定の対象または獣医学的対象についての有効量は、処置される状態、対象の総合的な健康状態、投与の経路および用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る。有効量は、重大な副作用または毒性効果を回避する最大投与量または投与プロトコルであり得る。

「Ｔｍ値」とは、タンパク質に熱変性が起こる温度、すなわち、タンパク質の半分がアンフォールドする（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）温度を指す。このとき、タンパク質の空間構造は破壊される。したがって、Ｔｍ値が高いほど、タンパク質の熱安定性が高い。

「置換」とは、抗体タンパク質を溶解する溶媒系の置換を指す。例えば、抗体タンパク質を含む高塩または高張溶媒系は、安定な調製物用の緩衝系に対する物理的操作を使用して置換され、その結果、抗体タンパク質は安定な調製物中に存在することができる。物理的操作には、限定されるものではないが、限外濾過、透析、または遠心分離後の再構成が含まれる。

発明の詳細な説明

以下、実施例、試験例または調製例を参照して、本開示をさらに説明する。しかしながら、実施例、試験例または調製例は、例示のみを目的としており、本開示の範囲はそれに限定されない。

本開示の実施例、試験例または調製例において、特定の条件が記載されていない場合、それらは、一般に、従来の条件下で、または材料もしくは製品の製造業者によって提案された条件下で行われる。試薬の供給源が具体的に示されていない場合、その試薬は市販の従来の試薬である。

実施例１：融合タンパク質ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップのクローニングおよび発現

ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（配列番号１４の全長またはトランケート型）を融合タンパク質における免疫調節分子の部分として使用し、ＰＤ－Ｌ１抗体を融合タンパク質の標的化部分として使用して、ＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン融合タンパク質（ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップ）を形成した。

驚くべきことに、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインのトランケート型は比較的安定であり、特にそのＮ末端から２６アミノ酸未満をトランケーションした後はより安定であり、好ましくは、より高い発現レベルおよびより安定な構造が、Ｎ末端から１４～２６個のアミノ酸をトランケーションした後に、より好ましくはＮ末端から１４～２１個の連続したアミノ酸をトランケーションした後に、より好ましくはＮ末端から１４、１９または２１個の連続したアミノ酸をトランケーションした後に得られることが見出された。

本開示におけるＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインおよびそのトランケート型の非限定的な例の配列は、以下のとおりである：

ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（１－１３６）

Ｎ末端に１９アミノ酸のトランケーションまたは欠失を有するＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（２０－１３６）

Ｎ末端に２１アミノ酸のトランケーションまたは欠失を有するＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（２２－１３６）
配列番号１６

Ｎ末端に１４アミノ酸のトランケーションまたは欠失を有するＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（１５－１３６）

一例として、本開示のＰＤ－Ｌ１抗体（重鎖が配列番号１２に示され、軽鎖が配列番号１３に示されるＰＤ－Ｌ１抗体）の重鎖Ｃ末端アミノ酸を、相同組換え技術によって、リンカー（Ｇ_４Ｓ）_ｘＧ（ｘは３～６である）により、さまざまな長さのＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインにライゲーションし、ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖と一緒に２９３発現系で従来の方法で発現させ、そして得られた融合タンパク質を表２に示す：

表２．ＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインの融合タンパク質

注：Ａｂは、本開示のＰＤ－Ｌ１抗体（配列番号１２として示され重鎖、および配列番号１３として示される軽鎖）を表す；配列説明中のＥＣＤ（ｎ－１３６）は、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインの全長またはトランケート型を表す；ｎは、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインのトランケーション後のアミノ酸の開始番号を表す。本開示の融合タンパク質の構造を図１に示す；Ｎ１９Ａは、全長ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（配列番号１４）の位置１９のアミノ酸がＮからＡに変異していることを示す。

ＰＤ－Ｌ１抗体をコードするヌクレオチド配列、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびリンカータンパク質フラグメント（（Ｇ_４Ｓ）_ｘＧ）のヌクレオチド配列は、当技術分野における従来の技術によって得られた。ＰＤ－Ｌ１抗体のＣ末端ヌクレオチドを相同組換え技術によって、リンカータンパク質を介して、長さの異なるＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインのＮ末端ヌクレオチドにライゲーションし、次いで、Ｐｈｒ－ＢｓｍｂＩベクターにクローニングした。組換えＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップを２９３細胞で発現させ、実施例２に記載のように精製した。精製したタンパク質は、以下の例の実験において使用することができる。

実施例２：ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップ融合タンパク質の精製

細胞培養培地を高速遠心分離し、上清を回収し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製の第１ステップを行った。クロマトグラフィー媒体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＦｃと相互作用する誘導フィラー（例えば、ＧＥのＭａｂｓｅｌｅｃｔ）である。平衡化緩衝液は、１×ＰＢＳ（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４）であった。５×カラム容量で平衡化した後、細胞上清を結合のためにロードし、サンプルが１分間以上カラム上に残るように流速を制御した。サンプルをロードした後、Ａ２８０ ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、カラムを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、カラムを０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）溶出緩衝液で洗浄し、Ａ２８０ ＵＶ吸収ピークに従って溶出ピークを回収し、回収した溶出サンプルを１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中性化した。

中性化した溶出サンプルを限外濾過により濃縮し、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。緩衝液は１×ＰＢＳであり、カラムはＸＫ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ （ＧＥ）であった。流速を４ｍｌ／分に制御し、ロード量を５ｍｌ未満とし、標的タンパク質のピークをＡ２８０のＵＶ吸収に従ってプールした。収集したタンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって同定した場合９５％超であり、ＬＣ－ＭＳで確認された。確認したサンプルを、使用のために分注した。ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップが得られた。

本開示におけるＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップ融合タンパク質の性能および有益な効果は、以下に示すような生化学的試験方法によって検証される。

試験例（ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的評価）

試験例１：ＴＧＦ－β１に結合するＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＡ検出

検出プロセスは次のとおりである：
ａ．９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌの濃度のヒトＴＧＦ－β１（８９１５ＬＣ、ＣＳＴ）１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。
ｂ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、２５０μｌの５％ミルクＰＢＳを添加して、３７℃で２時間ブロッキングした。
ｃ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップの勾配希釈液を添加し、ＴＧＦ－βトラップをポジティブコントロールとして使用し、３７℃で１時間インキュベートした。
ｄ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。
ｅ．１００μｌの抗ヒトＦｃ抗体－ＨＲＰ（１：４０００）を各ウェルに添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。
ｆ．１００μｌのＴＭＢを各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、１００μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止させた。
ｇ．４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、データをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によって分析した。

融合タンパク質のヒトＴＧＦ－β１へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合の結果を図２および３に示す。ＥＬＩＳＡは、表２中の融合タンパク質１がヒトＴＧＦ－β１への結合活性を保持しないことを示した。質量分析は、融合タンパク質１（すなわち、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（１－１３６）の非トランケート型）が不安定であり、重鎖ＴＧＦ－βＲＩＩにおいて容易に破壊され、ポジティブコントロールが同じ欠陥を有することを示した。ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端トランケート型を含む融合タンパク質、例えば、融合タンパク質７、９、１０、１２～１５は、ヒトＴＧＦ－β１に特異的に結合する。

試験例２：ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＡ検出

検出に用いた抗原：ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ

検出プロセスは次のとおりである：
ａ．９６ウェルプレートを、５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（配列番号１８）１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。
ｂ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、２５０μｌの５％ミルクＰＢＳを添加して、３７℃で２時間ブロッキングした。
ｃ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップの勾配希釈液とポジティブコントロールとしてのＰＤ－Ｌ１抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ｄ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。
ｅ．１００μｌの抗ヒトＦｃ抗体－ＨＲＰ（１：４０００）を各ウェルに添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。
ｆ．１００μｌのＴＭＢを各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、１００μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止させた。
ｇ．４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、データをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によって分析した。

本開示の融合タンパク質のヒトＰＤ－Ｌ１へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合の結果を図４に示す。ＥＬＩＳＡは、すべての融合タンパク質がヒトＰＤ－Ｌ１への結合活性を保持していることを示した。

試験例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路のブロッキング検出

１．試験目的：

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップのブロッキング効果を調べるために、細胞ベースの抗体ブロッキング実験が、Ｐｒｏｍｅｇａによって構築されたヒトＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１受容体分子をそれぞれ保持する細胞で行われた。

２．試験サンプル

（１）配列番号１２として示される重鎖および配列番号１３として示される軽鎖を有するＰＤ－Ｌ１抗体；

（２）コントロール１（２０Ｔ－Ｆｃ）：ＥＣＤ（２０－１３６）－Ｆｃ（トランケートされたＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインフラグメントＥＣＤ（２０－１３６）およびＦｃを含む融合タンパク質）。その配列は以下のとおりである：

（３）コントロール２（２２Ｔ－Ｆｃ）：ＥＣＤ（２２－１３６）－Ｆｃ（トランケートされたＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインフラグメントＥＣＤ（２２－１３６）とＦｃの融合タンパク質）。その配列は以下のとおりである：

（４）本開示の実施例１で調製したＴＧＦ－β受容体融合タンパク質：融合タンパク質９、融合タンパク質１５：

融合タンパク質９において、ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖－（Ｇ_４Ｓ）_４Ｇ－ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤ（２０－１３６）の融合ペプチド配列は、以下のとおりである：

注：通常のフォントはＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖の配列であり、イタリック体はリンカー配列であり、下線はＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域のトランケートされたフラグメントＥＣＤ（２０－１３６）の配列である。

融合タンパク質９におけるＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖配列は、以下のとおりである：

融合タンパク質１５におけるＰＤ－Ｌ１抗体重鎖－（Ｇ_４Ｓ）_５Ｇ－ＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤ（２２－１３６）の融合ペプチド配列は、以下のとおりである：

注：通常のフォントはＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖の配列であり、イタリック体はリンカー配列であり、下線はＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域のトランケートされたフラグメントＥＣＤ（２２－１３６）の配列である。

融合タンパク質１５におけるＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖配列は、以下のとおりである：

（５）ヒトＩｇＧ：ブランクコントロール、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａなどの従来のアフィニティークロマトグラフィー法を用いた精製によって混合正常ヒト血清から得られたヒト免疫グロブリン；

（６）ポジティブコントロール（ＦＰ１７０２２）：ＰＤ－Ｌ１抗体２／ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインの融合タンパク質；

ＦＰ１７０２２融合タンパク質におけるＰＤ－Ｌ１抗体２軽鎖のアミノ酸配列：

ＦＰ１７０２２融合タンパク質におけるＰＤ－Ｌ１抗体２重鎖／ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（１－１３６）の融合ペプチドのアミノ酸配列：

３．試験プロセス

ＣＨＯ／ＰＤ－Ｌ１細胞（ＣＳ１８７１０８、Ｐｒｏｍｅｇａ）を消化し、Ｆ－１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）完全培地に再懸濁した。細胞計数の結果に従って、完全培地を用いて細胞密度を４×１０^５／ｍＬに調整した。細胞懸濁液をローディングタンクに移し、マルチチャネルピペットを用いて１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２０～２４時間インキュベートした；翌日、Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１（ＣＳ１８７１０２、Ｐｒｏｍｅｇａ）細胞懸濁液を調製し、アッセイ培地を使用して細胞計数の結果に従って細胞を再懸濁し、細胞密度を１．２５×１０^６／ｍＬに調整した；インキュベーターからＣＨＯ／ＰＤ－Ｌ１細胞を含む細胞培養プレートを取り出し、マルチチャネルピペットを用いてウェル当たり９５μＬの培養液を取り出し、勾配希釈した融合タンパク質、ＰＤ－Ｌ１抗体およびポジティブコントロール（ＦＰ１７０２２）をそれぞれ４０μＬ／ウェルで添加した。次いで、Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１細胞懸濁液をローディングタンクに移し、４０μＬ／ウェルで細胞培養プレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で５～６時間インキュベートした。タンパク質とのインキュベーション中に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を取り出し、室温に戻した。細胞培養プレートを取り出し、室温で５～１０分間置いた。次に、４０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を各ウェルに添加し、安全キャビネット内で５～１０分間インキュベートし、多機能マイクロプレートリーダーを使用して化学発光シグナル値を読み取った。

４．結果

図５に示すように、ポジティブコントロール分子と同様に、本開示の融合タンパク質９は、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＨＯ／ＰＤ－Ｌ１細胞への結合を効果的にブロックすることができ、薬物濃度および用量依存的効果があった。融合タンパク質１５は、融合タンパク質９と同じブロッキング能力を有する。

試験例４：Ｂｉａｃｏｒｅによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合親和性および動態検出

ヒトもしくはマウスＴＧＦ－β１またはヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する試験分子の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）によって決定した。実験手順は以下のとおりである：

一定量のＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップをＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップで捕捉した後、ヒトもしくはマウスＴＧＦ－β１（８９１５ＬＣ、ＣＳＴ）またはヒトＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をチップの表面に流した。反応シグナルを、Ｂｉａｃｏｒｅを用いてリアルタイムで検出し、会合および解離曲線を得た。次に、バイオチップを洗浄し、グリシン－塩酸（ｐＨ１．５、ＧＥ）で再生した。実験に使用した緩衝溶液は、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ）であった。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１ソフトウェア（ＧＥ）を使用して、実験データを（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルにフィッティングし、親和性値を取得し、表３に示した。

表３：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける本開示の融合タンパク質のＴＧＦ－β１またはヒトＰＤ－Ｌ１に対する親和性

融合タンパク質の結合活性を表３に示す。結果は、本開示の融合タンパク質９および融合タンパク質１５がヒト、マウスＴＧＦ－β１およびヒトＰＤ－Ｌ１に対して極めて高い親和性を有することを示している。

試験例５：ＳＭＡＤ３レポーター遺伝子抑制アッセイ

１．試験目的：

この実験では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＳｍａｄ３結合エレメント（ＳＢＥ）をＨｅｐＧ２細胞で発現させ、ＴＧＦ－β１誘導Ｓｍａｄ３活性化に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップの抑制効果を検討し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップの活性をＩＣ５０値に従って評価した。

２．試験サンプル：融合タンパク質９、ポジティブコントロール（ＦＰ１７０２２）。

３．試験プロセス

ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ完全培地（ＧＥ、ＳＨ３０２４３．０１）中で培養し、３日毎に継代培養した。実験の初日に、１ウェルあたり２５，０００個の細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０３）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。翌日、細胞培養プレートの培地を廃棄し、１ウェルあたり１００ｎｇの３ＴＰ－Ｌｕｘプラスミドをトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間さらに培養した。試験サンプルの添加の６時間前に、９６ウェルプレートの完全培地を廃棄し、８０μＬの不完全培地（ＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ）を各ウェルに添加した。６時間後、不完全培地で調製した１０μＬのヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ、２４０－Ｂ－０１０）溶液（最終濃度２ｎｇ／ｍＬ）と、１０μＬの試験サンプル（最終濃度は５００、５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５および０ｎＭ）を添加し、ヒトＴＧＦ－β１溶媒をコントロールとして使用し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でさらに１８時間培養した。次に、調製したルシフェラーゼ基質ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１１０）１００μＬを各ウェルに添加し、室温にて１０分間暗所でインキュベートした後、Ｖｉｃｔｏｒ ３マルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光シグナル値を読み取った。試験サンプルのＩＣ５０値は、データソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を用いて計算することによって取得された。

図６は、融合タンパク質９がＴＧＦβ誘導ｐＳＭＡＤ３レポーター活性を用量依存的に抑制し、ポジティブコントロールＦＰ１７０２２と同等の有効性およびＩＣ_５０（最大活性の５０％を抑制するのに必要な濃度）を有することを示した。ＰＤ－Ｌ１抗体の試験結果は、それが抑制効果を有さないことを示した（ＩＣ_５０＞５００ｎＭ）。

試験例６：ツベルクリン（ＴＢ）刺激によるＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出

１．試験目的

ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップによるＴリンパ球の活性化を調べるために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集および精製し、ツベルクリン（ＴＢ）でｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間刺激して、ＩＦＮγサイトカインの分泌レベルを検出した。

２．サンプル
（１）ヒトＩｇＧ；
（２）ＰＤ－Ｌ１抗体；
（３）融合タンパク質９；
（４）コントロール１（２０Ｔ－Ｆｃ）：ＥＣＤ（２０－１３６）－Ｆｃ；
（５）ＰＤ－Ｌ１抗体＋コントロール１（２０Ｔ－Ｆｃ）。

３．試験プロセス

２０μＬのツベルクリンを、新たに単離および精製したＰＢＭＣ（１５ｍＬ、約３×１０^７）に添加し、インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２で５日間培養した。６日目に、培養細胞を回収および遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮な培地に再懸濁して密度を１×１０^６細胞／ｍｌに調整し、９０μｌの再懸濁細胞を９６ウェルプレートに加えた。１０μＬ／ウェルの異なる濃度の抗体を、上記の９６ウェル細胞培養プレートの対応するウェルに別々に添加し、１０μＬのＰＢＳをコントロール群およびブランク群にそれぞれ添加した。次いで、細胞培養プレートをインキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。細胞培養プレートを取り出し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）後、各ウェルから上清を採取した。１０倍希釈後、特定の操作に関する試薬の指示に従って、ＩＦＮ－γの分泌をＥＬＩＳＡ（ヒトＩＦＮ－γ検出キット、ＮＥＯＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、ＥＨＣ １０２ｇ．９６）によって検出した。表４に示すように、すべてのＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップ融合タンパク質サンプルは、活性化Ｔリンパ球によるサイトカインＩＦＮ－γの分泌を増強することができ、薬物濃度用量効果が認められた。

表４．サイトカインＩＦＮ－γの分泌結果

４．結果

図７および表４に示すように、融合タンパク質９は活性化Ｔリンパ球を増強してサイトカインＩＦＮ－γを用量依存的に分泌させることができ、ＰＤ－Ｌ１抗体および２０Ｔ－ＦＣよりも強い活性化効果を有していた。

試験例７：薬物動態評価

雌のＳＤラット３匹をＪｉｅ Ｓｉ Ｊｉｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入し、１２／１２時間の明暗サイクル（温度は２４±３℃、相対湿度は５０～６０％）で維持し、ラットは水および食餌を自由に摂取できた。実験当日、ＳＤラットに６ｍｇ／ｋｇの用量および５ｍｌ／ｋｇの注射量で尾静脈に融合タンパク質を注射した。

投与後１５分、７時間（１日目）、２４時間（２日目）、３日目、４日目、６日目、８日目、１０日目および１５日目の時点で採血し、２００μｌの血液（１００μｌの血清に相当）をラットの眼底静脈から採取した。血液サンプルを室温で３０分間置いて凝集させた後、１００００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を採取し、直ちに－８０℃で保存した。血清中の融合タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。

測定プロセスは次のとおりである：
ａ．９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌの濃度のヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（１００μｌ／ウェル）で、４℃で一晩コーティングした。
ｂ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで４回洗浄し、２５０μｌの５％ミルクＰＢＳを添加して、３７℃で３時間ブロッキングした。
ｃ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μｌの勾配希釈血清サンプルを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、融合タンパク質９をポジティブコントロールとして使用した。
ｄ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。
ｅ．１００μｌ／ウェルのビオチン化抗ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ｆ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。
ｇ．１００μｌ／ウェルのＴＭＢを添加し、室温で１０分間インキュベートし、１００μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止させた。
ｈ．４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、データをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によって分析した。

表５：ＳＤラットにおける融合タンパク質のＴ１／２

ＰＫ分析の結果は、ラットにおける本開示の融合タンパク質９の半減期が約２３６時間（９．８日）であることを示した（表５参照）。

試験例８：ヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のマウス皮下異種移植片に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップの効果

この実験で使用したマウス系統は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウス（Ｃａｖｅｎｓ）であった。実験に用いたヒト末梢血単核細胞は、採取したばかりの血液から抽出したもので、抽出方法は以下のとおりであった：ヘパリン抗凝固静脈血を２％ＦＢＳを含有する同量のＰＢＳと混合し、混合後、２５ｍｌの希釈血液を１５ｍｌのリンパ球分離溶液を含有する遠心分離管にゆっくりと添加し、１２００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。リンパ球層を別の遠心分離管にピペットで移した；細胞をＰＢＳで洗浄し、３００ｇで８分間室温で遠心分離した。１回繰り返した後、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、４０ｎｇ／ｍｌ）でプレコーティングした６ウェルプレートに細胞を２×１０^６細胞／ウェル（２ｍｌ）で添加した後、３７℃のインキュベーターに４日間置いた。

試験サンプル：
（１）ブランクコントロール：ＰＢＳ；
（２）融合タンパク質９：４．８ｍｐｋ；
（３）融合タンパク質９：２４ｍｐｋ；
（４）ＰＤ－Ｌ１抗体：４ｍｐｋ；
（５）ＰＤ－Ｌ１抗体：２０ｍｐｋ；
（６）ＰＤ－Ｌ１抗体４ｍｐｋ＋コントロール１（２０Ｔ－Ｆｃ）２．１４ｍｐｋ；
（７）コントロール１（２０Ｔ－Ｆｃ）：２．１４ｍｐｋ。

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、等量のマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）と混合し、１００μｌ（２．３×１０^６）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下接種した。１１日後、過大または過小サイズの腫瘍を有する動物を除外し、マウスをランダムに群化し、各群９匹とした。５×１０^５の刺激されたＰＢＭＣ（６０μＬ）を腫瘍組織に注入し、残りのＰＢＭＣを刺激なしでさらに培養した。１週間後、１ラウンド目の注入として、５×１０^６のＰＢＭＣ（１００μＬ）を腫瘍保持マウスに腹腔内注入した。実験期間中、２ラウンド半（２ ａｎｄ ａ ｈａｌｆ－ｒｏｕｎｄ）、合計５回のＰＢＭＣ注入が行われた。１回目の腫瘍内注入の日に腹腔内投与を行い、週に３回、計１４回の投与を行った。投与レジメンを表６に示した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した。実験結果を表７に示す。実験の終わりに、腫瘍保持マウスを安楽死させ、腫瘍を取り出して秤量した。

表６：試験の群化および投与

表７：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のマウス皮下異種移植片に対する融合タンパク質９の効果

結果を図８に示す。抗体融合タンパク質９（４．８ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ）はヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のマウス皮下異種移植片の成長を有意に抑制することができる。高用量と低用量の間には用量依存的な関係があり、それぞれ等モル用量で、参照薬物ＰＤ－Ｌ１抗体（４ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ）、ＴＧＦ－βＲＩＩコントロール分子２０Ｔ－ＦＣ（２．１４ｍｇ／ｋｇ）および併用群（ＰＤ－Ｌ１抗体（４ｍｇ／ｋｇ）＋２０Ｔ－ＦＣ（２．１４ｍｇ／ｋｇ））より優れていた。融合タンパク質９の各用量は、投与後１４日目以降、所望の抗腫瘍効果を維持した；ＰＤ－Ｌ１抗体（２０ｍｐｋ）と比較した場合、高用量の融合タンパク質９は明らかな利点を有していた（ｐ＜０．０５）。投与後２５日目に、各抗体の抗腫瘍効果は最適レベルに達した。融合タンパク質９およびＰＤＬ－１抗体の低用量および高用量ならびに併用群の抗腫瘍率は、それぞれ３７．２４％、５２．３８％、３０．２４％、２８．０１％および３１．３８％であった。投与後３２日目でも、融合タンパク質９の抗腫瘍効果は依然として非常に有意であった。低用量群および高用量群の％ＴＧＩはそれぞれ３６．６８％および５０．７６％であり、腫瘍体積はコントロール群と比較すると統計学的に異なっていた（ｐ＜０．０５）。

試験例９：ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βトラップの物理的安定性

この試験例は、融合タンパク質９および融合タンパク質１５の安定性を検出するために使用された。

ＤＳＣ（示差走査熱量測定）を用いて、さまざまな抗体の熱安定性を検出し、さまざまな緩衝液系における安定性を比較した。緩衝液系は、１０ｍＭ酢酸塩／１３５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）、および１０ｍＭ酢酸塩／９％トレハロース（ｐＨ５．５）などを含む。

サンプルを対応する緩衝液に溶解し、濃度を約５０ｍｇ／ｍｌに制御した。検出は、ＭｉｃｒｏＣａｌ＊ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって行われた。試験前に、真空脱気装置を用いて、各サンプルおよびブランク緩衝液を１～２分間脱気した。プレートの各ウェルに４００μｌのサンプルまたはブランク緩衝液を添加した（ローディング量は３００μｌであった）。最後に、２対のウェルプレートにそれぞれ１４％Ｄｅｃｏｎ９０とｄｄＨ_２Ｏを添加し、洗浄の準備をした。サンプルをプレートにロードし、次いでプレートをプラスチックカバーで密封した。走査は２５℃の温度で開始し、１００℃で終了し、走査速度は６０℃／時間である。結果は表８に示され、融合タンパク質９および融合タンパク質１５の両方が、これらの２つの試験系において良好な熱安定性を示すことを示している。

表８．熱安定性試験

ＳＥＣ－ＨＰＬＣを介して純度をモニターすることによって、特定の濃度での周期的安定性を調べた。例示的な条件では、例えば、サンプルの濃度は１０ｍＭ酢酸塩／１３５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）中で約５０ｍｇ／ｍｌに制御され、安定性は、－８０℃での５サイクルの凍結および解凍などの条件下と、４０℃での１ヶ月間の保管後とで比較された。検出のために、Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００Ａ（Ｗａｔｅｒｓ）ＨＰＬＣカラムを使用した。結果を以下の表９に示す。これら２つの融合タンパク質は良好な安定性を示した。

表９．安定性

試験例１０：融合タンパク質の化学的安定性

脱アミド化は、後の段階での抗体の安定性に影響を与える一般的な化学修飾であり、特に、ＣＤＲ領域中のいくつかのアミノ酸の高度に脱アミド化された修飾を変異によって可能な限り回避または低減することが一般的に選択される。試験対象の抗体１６００μｇを２００μｌの１０ｍＭ酢酸塩／１３５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）に溶解し、４０℃のインキュベーターに入れた。酵素加水分解アッセイのために、０、１４および２８日目にサンプルを採取した。異なる時点で採取した各サンプル１００μｇを１００μｌの０．２Ｍ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍ Ｇｕａ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ６．０）に溶解し、３μｌの０．１ｇ／ｍＬ ＤＴＴを添加し、次いでサンプルを５０℃の水浴中で１時間インキュベートした。次いで、サンプルを０．０２Ｍ Ｈｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）で２回限外濾過し、３μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬトリプシンを添加することによって３７℃の水浴中で一晩消化した。Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ－ＭＳを用いて脱アミド化修飾を調べた。その結果を以下の表１０に示す。

表１０．脱アミド化修飾

注：Ｎは検出可能な修飾されたアスパラギンを表し、数字はＮ末端からの軽鎖または重鎖中の位置を表す。パーセント含有量は、その部位におけるすべてのペプチドのシグナルに対するＬＣ－ＭＳによって検出された脱アミド化修飾の比率を表す。

質量分析の結果は、２つの融合タンパク質が明らかな脱アミド化修飾部位を有さないことを示しており、融合タンパク質が良好な化学的安定性を有することを示唆していた。

調製例

融合タンパク質医薬組成物（調製物）の例示的な調製プロセス

第１ステップ：一定量の精製ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質のストック溶液を採取し、限外濾過膜を少なくとも６倍量通過させることによって、無タンパク質緩衝液（例えば、１０ｍＭ、ｐＨ６．２のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液）を用いて溶媒置換（好ましくは限外濾過による）を行い、次いで、タンパク質を約７０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。一定量のスクロースストック溶液を添加および混合して、スクロースの最終濃度を８０ｍｇ／ｍＬにした。一定量のＴｗｅｅｎ－８０ストック溶液を添加および混合して、Ｔｗｅｅｎ－８０の最終濃度を０．４ｍｇ／ｍＬにした。５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度が得られるように、ｐＨ６．２の１０ｍＭクエン酸緩衝液を指定された容量に達するまで添加した（試験される他の調製物または安定な調製物は、同様のステップに従って調製された）。

濾過された後、製品は培地コントロールの目的で無菌試験のためにサンプリングされた。ストック溶液は０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターに通され、濾液が回収された。

第２ステップ：充填容量を６．３ｍｌに調整し、濾液を６ｍｌバイアルに充填し、次いでバイアルにストッパーで蓋をし、培地コントロールの目的で、充填容量の差を検出するために充填の開始時、中間時、および終了時にサンプルを採取した。

第３ステップ：キャッピングマシンが起動され、アルミニウムキャップがキャップされた。

第４ステップ：目視検査を行って、製品に不正確な充填などの欠陥がないことを確認した。ラベルを印刷し、バイアルにラベルを貼った；カートンラベルを印刷し、カートンを折りたたみ、カートンにバイアルをロードしてし、ラベルを貼った。

調製例１．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の調製緩衝液系のｐＨ値のスクリーニング

ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）調製物は、以下の緩衝液を使用して、５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製された：
１）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０；
２）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０；
３）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．５；
４）１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．０；
５）１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．５。

各調製物を濾過し、中性ホウケイ酸ガラス製の２ｍＬ注射バイアルに１．２ｍＬ／バイアルで添加した。注射バイアルにストッパーを設け、蓋をして、密封した。サンプルを採取し、４０℃の高温および振盪実験に供した。実験結果を表１１に示す。結果は、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質がｐＨ６．０～６．５でより良好な安定性を有することを示している。

表１１．強制劣化実験のスクリーニング結果

調製例２．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物のための緩衝液系のスクリーニング

ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）調製物は、以下の緩衝液を使用して、５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製された：
１）１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０；
２）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；
３）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５；
４）１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．５；
５）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、ｐＨ６．５。

各調製物を濾過し、中性ホウケイ酸ガラス製の２ｍＬ注射バイアルに１．２ｍＬ／バイアルで添加した。注射バイアルにストッパーを設け、蓋をして、密封した。振盪（２５℃、３００ｒｐｍ）実験のためにサンプルを採取した。実験結果を表１２に示す。結果は、振盪下で６日目にリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウムの群で大量の小さな粒子が観察され、凝集体がＳＥＣによって検出された１．８％に達したことを示している。しかしながら、他の群では、時々小さな粒子のみが観察された。クエン酸、ヒスチジンおよびコハク酸緩衝液系におけるＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の安定性は、リン酸緩衝液系における安定性よりも優れていることが分かる。

表１２．緩衝液系およびｐＨ値のスクリーニング実験結果

調製例３．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物のための緩衝液系のさらなるスクリーニング

１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩または１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．２の緩衝液を使用して、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）を含む調製物を調製した。

各調製物を濾過し、中性ホウケイ酸ガラス製の２ｍＬ注射バイアルに１．２ｍＬ／バイアルで添加した。注射バイアルにストッパーを設け、蓋をして、密封した。安定性分析、６ヶ月ＳＥＣまたは非還元ＣＥ－ＳＤＳ検出のために、サンプルを２５℃で保存した。

実験結果を表１３に示す。結果は、クエン酸－クエン酸ナトリウム系がヒスチジン－塩酸塩系より優れていることを示している（Ｍ６ ＳＥＣ凝集体：１．８％対２．２％；非還元ＣＥ－ＳＤＳ：９４．５％対９２．２％）；したがって、クエン酸系がＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の緩衝液系として選択され得る。

表１３．２５℃での緩衝液系スクリーニングの加速安定性試験結果

調製例４．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物の安定化剤のスクリーニング

ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）調製物は、以下の異なる糖類の緩衝液を使用して、５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製された：
１）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、ｐＨ６．２；
２）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、８０ｍｇ／ｍｌ α，α－トレハロース二水和物、ｐＨ６．２。

各調製物を濾過し、中性ホウケイ酸ガラス製の２ｍＬ注射バイアルに１．２ｍＬ／バイアルで添加した。注射バイアルにストッパーを設け、蓋をして、密封した。サンプルは、２５℃の室温および２～８℃の低温での長期保管実験のために採取された。

実験の結果を表１４に示す。結果は、スクロースおよびトレハロースがＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）の安定性に対して同様の効果を有することを示している。スクロースが、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）の安定化剤として選択された。スクロース濃度が８０ｍｇ／ｍｌの場合、浸透圧は約３００ｍｏｓｍ／ｋｇであって等張に近いため、スクロース濃度は８０ｍｇ／ｍｌであり得る。

表１４．糖類の種類についてのスクリーニング実験の結果

調製例５．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物の界面活性剤のスクリーニング

ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）調製物は、以下の異なる濃度の異なる種類の界面活性剤の緩衝液を使用して、５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製された：
１）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、ｐＨ６．２；
２）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、ｐＨ６．２；
３）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、ｐＨ６．２；
４）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．６ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、ｐＨ６．２；
５）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．８ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、ｐＨ６．２；
６）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、ｐＨ６．２；
７）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、ｐＨ６．２；
８）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、ｐＨ６．２；
９）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．６ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、ｐＨ６．２；
１０）１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩、０．８ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、ｐＨ６．２。

各調製物を濾過し、０．５ｍＬの調製物を５０ｍＬの生理食塩水注射液または５％グルコース注射液に注入し、希釈後に０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に到達させた。希釈後のサンプルの安定性を観察した。実験結果を表１５に示す。結果は、調製物中のポリソルベート２０の濃度が０．２ｍｇ／ｍｌを超えると、不溶性粒子が希釈後に大幅に減少し、ポリソルベート８０については、塩化ナトリウム希釈により生成される不溶性粒子がポリソルベート８０濃度の増加とともに減少したことを示している。ポリソルベート８０が０．４ｍｇ／ｍｌ以上に達すると、１０μｍを超える粒子は１０粒子／ｍｌ未満に減少した。

表１５．ポリソルベートスクリーニング－希釈および振盪実験の結果

調製例６．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物のための界面活性剤のさらなるスクリーニング

ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）調製物は、以下の異なる種類の界面活性剤の緩衝液を使用して、５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製された：
１）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、ｐＨ６．２；
２）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、０．６ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、ｐＨ６．２。

各調製物を濾過し、中性ホウケイ酸ガラス製の２ｍＬ注射バイアルに１．２ｍＬ／バイアルで添加した。注射バイアルにストッパーを設け、蓋をして、密封した。サンプルは、２～８℃の低温での長期保管実験のために採取された。

実験結果を表１６に示す。結果は、ポリソルベート８０がＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）に対してより優れた安定性効果を有することを示している。したがって、ポリソルベート８０がＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）の界面活性剤として選択された。

表１６．ポリソルベートをスクリーニングするための２～８℃での長期安定性実験の結果

調製例７．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物のフィルター膜適合性試験

ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）は、１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０（ｐＨ６．２）中に、５０ｍｇ／ｍｌで調製された。調製物はそれぞれ０．２２μｍのＰＥＳフィルター膜およびＰＶＤＦフィルター膜を通過し、試験の開始時、途中、および終了時にサンプルが採取された。

実験結果を表１７に示す。タンパク質含有量、外観および純度分析は、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）がフィルター膜との接触中に安定であり、調製物がＰＥＳおよびＰＶＤＦフィルター膜の両方と適合性であったことを示している。

表１７．フィルター膜との適合性試験結果

調製例８．ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質調製物の凍結乾燥

５０ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含むＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）調製物は、１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．２の緩衝液を用いて調製された。抗体を６．３ｍＬ／バイアルで２０ｍＬバイアルに添加し、凍結乾燥のためにディープフリーザーに入れた。

凍結乾燥手順には、予備凍結、一次乾燥および二次乾燥が含まれる。凍結乾燥プロセスが終了したら、バイアルに真空下で栓をした。サンプルを再構成し、凍結乾燥の前後で比較を行った。結果は、再構成溶液が溶液調製物のそれと同様に良好な性能を維持できることを示す。

表１８．調製物の凍結乾燥のステップ

調製例９．他の任意の調製組成物

さらに、本開示は、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質（融合タンパク質９）医薬調製物の他の調製物も提供する：
（１）７０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、７５ｍｇ／ｍｌスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および２０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．４である；
（２）８０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、８５ｍｇ／ｍｌスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１５ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．２である；
（３）６０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、９０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および５ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．２である；
（４）３０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、６０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．３ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および３０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．３である；
（５）９０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、９５ｍｇ／ｍｌスクロース、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．０である；
（６）１００ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、７０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．１ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および２５ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．５である；
（７）５０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは７．０である；
（８）５０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは７．５である；
（９）５０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは５．０である；
（１０）６０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、７０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１５ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは５．５である；
（１１）４０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．２である；
（１２）５５ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、７５ｍｇ／ｍｌスクロース、０．３ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および５ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは６．０である；
（１３）６５ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、９０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および３０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは７．５である；
（１４）７０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、７５ｍｇ／ｍｌスクロース、０．８ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および３０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは７．０である；
（１５）５０ｍｇ／ｍｌ融合タンパク質９、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．８ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、最終ｐＨは７．０である。

Claims (17)

1. ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、および
   緩衝液
   を含む医薬組成物であって、
   前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質は、
   ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖およびＴＧＦ－βＲＩＩ ＥＣＤによって形成される融合ペプチドであって、その配列は配列番号２３として示されるか、または配列番号２３として示される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、融合ペプチドと、
   ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖であって、その配列は配列番号１３として示されるか、または配列番号１３として示される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、軽鎖
   とを含み、
   前記緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液であり、
   前記緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約２０ｍＭであり、前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌであり、前記医薬組成物のｐＨは約６．０～約６．５であり、
   前記医薬組成物はスクロースを更に含み、前記スクロースの濃度は約６０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌであり、
   前記医薬組成物はポリソルベート８０を更に含み、前記ポリソルベート８０の濃度は約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌである、医薬組成物。
2. 前記緩衝液の濃度は約１０ｍＭである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度は約３０ｍｇ／ｍｌ～約７０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質の濃度は約５０ｍｇ／ｍｌである、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記医薬組成物のｐＨは約６．２である、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記スクロースの濃度は約８０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記ポリソルベート８０の濃度は約０．４ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 約３０ｍｇ／ｍｌ～約７０ｍｇ／ｍｌの前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、
   約５ｍＭ～約２０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、
   約６０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および
   約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
   を含み、
   ｐＨは約６．０～約６．５である、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 約５０ｍｇ／ｍｌの前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質、
   約１０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、
   約８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および
   約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
   を含み、
   ｐＨは約６．２である、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物の調製方法であって、前記ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を前記緩衝液と接触させるステップを含む、調製方法；
    前記緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液であり、
    前記緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約２０ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨは約６．０～約６．５である。
11. 請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物の凍結乾燥形態である、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物。
12. 再構成されて請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物を形成することができる、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物。
13. 請求項１１または１２に記載の凍結乾燥調製物の再構成形態である、ＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む再構成溶液。
14. １つ以上の容器を含む製造品であって、前記容器は、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または
    請求項１１もしくは１２に記載のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物、または
    請求項１３に記載のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む再構成溶液
    を含む、製造品。
15. 医薬品の調製における、以下から選択されるいずれか１つの使用：
    請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１１もしくは１２に記載のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む凍結乾燥調製物、または請求項１３に記載のＴＧＦ－β受容体融合タンパク質を含む再構成溶液、または請求項１４に記載の製造品；
    前記医薬品は、腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞転移に関連する疾患または障害を処置または抑制するために使用される。
16. 前記疾患または障害は腫瘍である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記腫瘍は、頭頸部癌、膠芽腫、神経膠腫、上咽頭癌、甲状腺癌、肺癌、骨髄腫癌、骨髄異形成症候群、神経内分泌癌、リンパ腫、白血病、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、肉腫、中皮腫、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮内膜癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌および精巣癌からなる群から選択され、前記肺癌は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。