JP7488709B2 - 猫の排泄行動阻害抑制剤 - Google Patents
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Description
しかしながら、これまでにアセチルセドレン及びフロルヒドラルの猫の排泄行動に及ぼす影響を検討した報告例はない。
1)アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、猫の排泄行動阻害抑制剤。
2)アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも1種を、猫が排泄する環境にある対象物に適用することを含む、猫の排泄行動阻害の抑制方法。
フロルヒドラルは、β-Methyl-3-(1-methylethyl)benzenepropanal、CAS登録番号:125109-85-5である。
アセチルセドレン及びフロルヒドラルは、いずれも市販のものを購入することができる。例えば、これらの化合物は、International Flavors&Fragrances,Inc.やGivaudan SA等から入手することが可能である。或いは、化学合成によって、該市販品と同一物質又はそれを含む組成物を製造することが可能である。
本発明者の研究によって、FcOR2M3及びFcOR2M3-likeが、猫尿臭に特徴的な成分であるチオール類、3-メルカプト-3-メチルブチルフォルメート(MMF)と3-メルカプト-3-メチル-1-ブタノール(MMB)に応答する猫嗅覚受容体であること、さらに、アセチルセドレン及びフロルヒドラルが、当該FcOR2M3及びFcOR2M3-likeの活性化を阻害する物質として機能することが見出された(後記参考例を参照)。アセチルセドレン及びフロルヒドラルは、これまで香料素材として知られていたが、FcOR2M3及びFcOR2M3-likeに対するアンタゴニスト作用を有することや、チオール類に起因する猫尿臭に対する猫の嗅覚を抑制する機能があることは知られていなかった。
このように、アセチルセドレンやフロルヒドラルにより、チオール類臭を嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂いの抑制によって抑えることで、猫個体における猫尿臭の認識を抑制できる。
従って、アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも1種(以下、本明細書においては「アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも1種」を「アセチルセドレン等」と記載することがある)は、猫の排泄行動の阻害を抑制する排泄行動阻害抑制剤となり得、また、猫の排泄行動阻害抑制剤を製造するために使用することができる。また、アセチルセドレン等は、猫の排泄行動の阻害を抑制するために使用することができる。排泄行動の阻害が抑制されることにより、猫は安心して排泄可能となり、猫にとって快適なトイレ環境となる。
本明細書において、猫の排泄行動は、好ましくは猫の排尿である。
他の成分としては、例えば、抗菌剤、界面活性剤、消臭剤、キレート剤、水溶性溶剤、油分、pH調整剤、保湿剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、天然抽出物、色素、アセチルセドレン及びフロルヒドラル以外の香料、有機溶剤等が挙げられ、なかでも、抗菌の観点、均一配合の観点から、抗菌剤、界面活性剤、消臭剤を含むことが好ましい。
抗菌剤としては、ピロクトンオラミン、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸エステル、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、イソプロピルメチルフェノール等が挙げられる。尚、フロルヒドラルは当該抗菌剤でもあるが、本明細書においては抗菌剤に含めないものとする。
抗菌剤は、1種を単独で又は2種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、低い濃度で効果が期待される観点から、ピロクトンオラミン、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウムが好ましい。
アニオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸又はその塩、エーテルカルボン酸又はその塩、N-アシルアミノ酸塩等のカルボン酸基を有するアニオン性界面活性剤が好ましい。
多孔性粒子は、少なくとも粒子表面に多数の細孔を有する粒子であって、揮発する臭い成分をその孔に捕集、吸着及び/又は包摂できるものである。例えば、活性炭、シリカ、二酸化ケイ素(シリカゲル)、ケイ酸カルシウム、ハイシリカゼオライト(疎水性ゼオライト)、セピオライト、カンクリナイト、ゼオライト、水和酸化ジルコニウム等の無機多孔質物質等が挙げられる。
水溶性のpH緩衝剤は、猫の排尿等により発生した酸性やアルカリ性の臭い成分を中和し、pHの変化を小さくする剤である。例えば、クエン酸等の弱酸やその共役塩基、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンといったポリヒドロキシアミン化合物等の弱塩基やその共役酸、或いはそれらの混合物、それらの塩等が挙げられる。
猫が排泄する環境にある対象物としては、特に限定するものではなく、猫が排泄する環境に備わる床、壁、家具、カーテン、カーペット等のインテリア、トイレ、該トイレ用品(トイレ用砂やシート)、ケージ、ハウス、ベッド等が挙げられる。
好適には、本発明の猫の排泄行動阻害抑制剤は、猫のトイレ用品に使用される製品や製剤に配合して使用される。
当該製品や製剤の形態としては、用途に応じて適宜選択することができ、例えば、液状、ゲル状、ペースト状、固形状とすることができる。
また、紙、天然繊維、再生繊維(レーヨン等)及び/又は合成繊維(ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等)の織布又は不織布に、アセチルセドレン及びフロルヒドラルを塗布、或いは含浸した形態とすることができる。
具体的な製品や製剤の形態としては、例えば、洗浄剤、消臭剤、防臭剤、芳香剤、ウェット拭き取り用品が挙げられる。
チオール類は猫尿に元々含まれるため、チオール類臭は排尿直後から発生し、また、そのまま時間が経過しても発生し続ける。そのため、アセチルセドレン等は、猫が排泄する前、或いは排泄後に適用することが好ましい。
猫の排泄行動の阻害を抑制するためには、猫が排泄する環境にある対象物にアセチルセドレン等を接触させればよい。接触は、特に限定するものではなく、塗布又は噴霧する、浸漬する、添加する、揮散する等が挙げられる。
本発明のアセチルセドレン等の使用量は、猫個体における猫尿臭の認識を抑制でき、猫の排泄行動の阻害を抑制し得る量であればよく、その使用形態により適宜決定することができる。
(アンタゴニスト香料)
アセチルセドレン(メチルセドリルケトン;[1-[(1S,2R,5R,7S)-2,6,6,8-tetramethyltricyclo[5.3.1.01,5]undec-8-en-9-yl]ethanone);(CAS登録番号:32388-55-9;商品名:Vertofix;International Flavors&Fragrances,Inc.)
フロルヒドラル(β-Methyl-3-(1-methylethyl)benzenepropanal);(登録商標(国際登録0534879))(CAS登録番号:125109-85-5)(Givaudan SA)
アセチルセドレンとフロルヒドラルを、質量比98:2の割合で混合し、アンタゴニスト香料として用いた。
(猫尿臭原因物質)
3-Mercapto-3-methybutyl Formate(MMF)(Sigma aldrich Co.)
3-Mercapto-3-methy-1-butanol(MMB)(東京化成工業(株))
表1の処方に従って液剤を配合した。この液剤を図1に示すシート1に10g/シートの量でスプレーし50℃で2時間乾燥を行った。
・表面シート2 :ポリオレフィン系不織布、20gsm
・裏面シート3 :ポリエチレン系シート、20gsm
・表面側のコアラップシート44a:薄葉紙、16gsm
・裏面側のコアラップシート44b:薄葉紙、16gsm
・吸液性材料46上層部 :パルプ、100gsm
・高吸収性ポリマー47 :ポリアクリル酸ナトリウムの架橋体の吸水性樹脂、117gsm
・吸液性材料46下層部 :パルプ、100gsm
シート1の表面材側から全体にスプレーされた液剤は吸収体4の表面側すなわち、44aの薄葉紙に多くが吸収される。
木製のチップ32は植物由来の素材の粉砕物と結合剤とを固めたもので、植物由来の素材の粉砕物として、針葉樹の粉砕物等を用いた。結合剤としては、合成樹脂を用いることで、チップの撥水性を高め、そうすることで、尿はチップでは吸収されず、下部に配置したシートに吸収される。
実施例1又は比較例1の液剤をスプレーしたシートをそれぞれ、シート格納部16に配置した2台のシステムトイレセットを用いて下記実験を行った。
実施場所:猫とのふれあい施設(室内)
広さ:50m2
猫の数:15頭
トイレ配置:30cm間隔で左右にトイレを並べて配置、左右の配置を30分間隔で入れ替え
実施時間:AM9時~PM16時(7時間)
図5に示すとおり、アセチルセドレン及びフロルヒドラルを含む液剤をスプレーした実施例のトイレでは、比較例のトイレに比べて排尿回数が多くなり、また、排尿後の滞在時間が短くなった。この結果は、実施例がより猫にとって好ましいトイレ環境になっていることを示している(非特許文献1)。
(1)猫の尿添加シートに対する行動試験
実施例1で製造した実施例1液剤添加シート及び比較例1液剤添加シートの中央直径5cmの領域に、滅菌ろ過した雄猫(年齢1~10)の尿混合物を5mL滴下した。24頭の猫(年齢3~13、雌雄12頭ずつ)を自由行動下で飼育している環境下に、該猫尿を滴下した実施例1液剤添加シート及び比較例1液剤添加シートを載置した。猫は猫尿臭を認識すると好奇心をもって嗅ぎ行動を示す。猫による猫尿臭の認識が実施例1液剤により抑制されたならば、その猫の猫尿臭に対する嗅ぎ行動は減少するはずである。本試験では、60分間の試験時間内にいずれかのシート中央部の尿添加部分に到達及び匂い嗅ぎ行動を示した猫を解析対象とした。
上記(1)における実施例1液剤添加シートでの猫の尿臭嗅ぎ行動の減少が、アンタゴニスト香料による猫尿臭抑制効果によるものであることを確認する試験を行った。すなわち、シートから発せられたアンタゴニスト香料の匂いが猫にとって不快なものであったために、猫が尿臭を認識してもシートの嗅ぎ行動を控えた可能性が考えられた。本試験では、そのような可能性を検証した。試験例2と同じ24頭の猫を自由行動下で飼育している環境下に、実施例1液剤添加シート及び比較例1液剤添加シートを載置した。30分間の試験時間内にいずれかのシートに到達及び滞在した猫を解析対象とした。
表2の処方に従って液剤を配合した。
本試験では、カーペットの切れはし(30cm×30cm)の中央部に試験例2と同じ尿混合物5mLを添加した。その後、同じ場所に10mLの液剤をスプレーした。その後の処理を下記液剤のタイプ別にA,B,Cとして表2に記載した。
後処理直後とそのまま1週間放置した後の評価を表2に示した。評価方法並びに評価の基準としては次のとおりである。
(後処理方法)
A:なし
B:ふき取る
C:水で洗い流す
(評価方法)
それぞれの後処理をしたカーペットを試験例2と同様の方法で猫飼育施設に並べて設置して、猫の行動を観察した。評価の基準は、猫が匂いを嗅ぎに行った回数がそれぞれのタイプの比較例に対して三分の一以下であれば◎、二分の一以下であれば〇、二分の一より大きければ×とした。
1)嗅覚受容体ポリペプチド遺伝子の合成
GenBankに登録されている配列情報を基に、猫嗅覚受容体ポリペプチドFcOR2M3及びFcOR2M3-likeをコードする遺伝子(それぞれ配列番号1及び2)を合成した。遺伝子の合成には、Thermo Fisher ScientificによるDNA合成サービスを利用した。またGenBankに登録されている配列情報を基に、猫尿臭原因物質に応答するヒト嗅覚受容体HsOR2M3(GenBank Accession number:KP290147、特願2019-005550参照)をコードする遺伝子をhuman genomic DNA female(G1521:Promega)よりクローニングした。各遺伝子をpME18Sベクター上のFlag-Rhoタグ配列の下流に組込んだ。
ヒトRTP1Sをコードする遺伝子(配列番号3)をpME18SベクターのEcoRI、XhoIサイトへ組み込んだ。
各嗅覚受容体ポリペプチドをそれぞれ発現させたHEK293細胞を作製した。表3に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で15分間静置した。マルチウェルプレート(96ウェルプレート、BioCoat)の各ウェルに反応液10μLを添加し、次いでHEK293細胞(2×105細胞/cm2)90μLを添加して細胞を播種した。細胞を37℃、5%CO2を保持したインキュベータ内で24時間培養した。対照として、嗅覚受容体を発現させない細胞(mock)を用意した。
HEK293細胞に発現させた嗅覚受容体ポリペプチドは、細胞内在性のGαsと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内cAMP量を増加させる。本実施例での猫尿臭原因物質に対する細胞の応答測定には、細胞内cAMP量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子(fluc2P-CRE-hygro)由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、CMVプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの(hRluc-CMV)を同時に細胞に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。ルシフェラーゼの活性測定には、Dual-GloTMluciferase assay system(Promega)を用いた。3)の操作後、嗅覚受容体発現細胞の培養物から培地を取り除き、各ウェルに猫尿臭原因物質を含む培地又は含まない培地を75μLずつ添加した。培地には、300μM CuCl2を含むDMEM溶液を用いた。猫尿臭原因物質としては、MMF(最終濃度0~0.03mM)又はMMB(最終濃度0~0.1mM)を用いた。猫尿臭原因物質添加の4時間後に、製品の操作マニュアルに従って発光を測定し、ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値[fLuc/hRluc]を算出した。猫尿臭原因物質刺激に対する嗅覚受容体の応答性の指標として、下記式に従ってFold increaseを算出した。
Fold increase=X/Y
X:猫尿臭原因物質刺激により誘導されたfLuc/hRluc
Y:猫尿臭原因物質刺激なしの場合のfLuc/hRluc
以上の結果から、FcOR2M3及びFcOR2M3-likeは、猫尿臭の成分であるMMF及びMMBを認識する猫由来嗅覚受容体ポリペプチドであることが示された。
アセチルセドレン又はフロルヒドラル存在下でのMMF又はMMBに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定し、応答強度の変化を調べた。参考例1と同様の手順に従って、嗅覚受容体ポリペプチド発現HEK293細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。MMFの最終濃度は0.01mM、MMBの最終濃度は0.03mMに調整した。アセチルセドレン及びフロルヒドラルの最終濃度は0~0.3mMの範囲で調整した。MMF又はMMB単独刺激により誘導されたfLuc/hRluc値(X)、MMF又はMMBで刺激しなかった細胞でのfLuc/hRluc値(Y)、及び、MMF又はMMBとアセチルセドレン又はフロルヒドラルとの共刺激により誘導されたfLuc/hRluc値(Z)を求めた。下記式により、アセチルセドレン又はフロルヒドラル存在下での嗅覚受容体ポリペプチドのMMF又はMMBに対する応答強度(Response(%))を求めた。
Response(%)=(Z-Y)/(X-Y)×100
独立した実験を3回行い、各回の実験で得られた応答強度の平均値を求めた。
以上の結果から、嗅覚受容体FcOR2M3又はFcOR2M3-likeのアンタゴニストであるアセチルセドレン及びフロルヒドラルにより、MMFやMMB等による猫尿臭に対する猫の嗅覚が抑制されることが示された。
Claims (5)
- アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、猫の排泄行動阻害抑制剤。
- アセチルセドレン及びフロルヒドラルの両方を有効成分とする、請求項1記載の猫の排泄行動阻害抑制剤。
- ピロクトンオラミン、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド及び塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される少なくとも1種の抗菌剤と組み合わせて用いる、請求項1又は2記載の猫の排泄行動阻害抑制剤。
- 洗浄剤又は消臭剤の形態である請求項1~3のいずれか1項記載の猫の排泄行動阻害抑制剤。
- アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも1種を、猫が排泄する環境にある対象物に適用することを含む、猫の排泄行動阻害の抑制方法。
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