JP7449646B2 - 細胞および組織への遺伝子編集タンパク質および組成物の、ベクターなしでの送達 - Google Patents
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Description
関連出願
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2015年12月30日に出願された米国仮特許出願第62/273,284号の優先権の恩典を主張する。
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2015年12月30日に出願された米国仮特許出願第62/273,284号の優先権の恩典を主張する。
技術分野
本明細書記載の主題は、細胞および組織への遺伝子編集化合物および複合体の、ベクターなしでの送達に関する。
本明細書記載の主題は、細胞および組織への遺伝子編集化合物および複合体の、ベクターなしでの送達に関する。
参照による配列表の組入れ
2016年12月22日に作成された、サイズが64.2KBの「48831_506001WO_ST25.txt」という名称のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2016年12月22日に作成された、サイズが64.2KBの「48831_506001WO_ST25.txt」という名称のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
背景
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-Casゲノム操作システム（以下「CRISPR-Casシステム」）は、研究者が細胞内部のゲノムDNAを改変することを可能にする。このシステムには3種の成分が必要であり、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来し得るCas9は、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）と複合体化してRGEN（RNA-guided endonuclease）を形成するエンドヌクレアーゼである。これらのRGENは、細胞内の染色体DNAを切断し、部位特異的二本鎖切断（DSB）を生じる。これらのDSBの修復は、内因性高忠実度相同組換え（HR）またはエラープローン非相同末端結合（NHEJ）を介して起こり得、標的変異誘発および染色体再配列を招く。RGENの特異性は、crRNAと標的DNAとの間のワトソン-クリック塩基対形成およびNGG-トリヌクレオチド性プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）のCas9認識によって決定される。crRNAおよびtracrRNAは、融合してシングルガイドRNA（gRNAまたはsgRNA）を形成し得る。他のゲノム編集ヌクレアーゼと比べたCRISPR-Cas9の主な利点は、DNAを標的とする特異性をタンパク質工学戦略によって変更しなければならないジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）とは対照的に、crRNAを置換することによってCas9の特異性を容易に再プログラミングできることである。
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-Casゲノム操作システム（以下「CRISPR-Casシステム」）は、研究者が細胞内部のゲノムDNAを改変することを可能にする。このシステムには3種の成分が必要であり、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来し得るCas9は、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）と複合体化してRGEN（RNA-guided endonuclease）を形成するエンドヌクレアーゼである。これらのRGENは、細胞内の染色体DNAを切断し、部位特異的二本鎖切断（DSB）を生じる。これらのDSBの修復は、内因性高忠実度相同組換え（HR）またはエラープローン非相同末端結合（NHEJ）を介して起こり得、標的変異誘発および染色体再配列を招く。RGENの特異性は、crRNAと標的DNAとの間のワトソン-クリック塩基対形成およびNGG-トリヌクレオチド性プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）のCas9認識によって決定される。crRNAおよびtracrRNAは、融合してシングルガイドRNA（gRNAまたはsgRNA）を形成し得る。他のゲノム編集ヌクレアーゼと比べたCRISPR-Cas9の主な利点は、DNAを標的とする特異性をタンパク質工学戦略によって変更しなければならないジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）とは対照的に、crRNAを置換することによってCas9の特異性を容易に再プログラミングできることである。
CRISPR-Casシステムは、3つの成分を別々のプラスミドまたは複合プラスミドのいずれかとしてコードするプラスミドDNAの形態で最も一般的に細胞内に送達されてきた。しかし、プラスミドは、オフターゲット編集に関連する。プラスミドは、ゲノム内またはCas9によって生成された部位にランダムに組み込み得る。後者の事象は少なくとも予測および監視することができるが、前者は、検出が困難なことがあり、より問題となり得る。これらの外来配列は、組込み部位にかかわらず、宿主免疫応答を引き起こす可能性があり、これは、遺伝子編集された幹細胞または初代細胞の臨床適用における使用に関する難題を生む。さらに、臨床適用のためのプラスミドがトランスフェクトされた細胞は、規制当局によって遺伝子改変されたと見なされるので、長期にわたり費用のかかる規制手続きに従うものとされる。
下記の装置、方法、およびシステムは、遺伝子編集システムの基本単位、例えばタンパク質または遺伝子編集複合体を送達するための信頼できる効率的なシステムを提供し、それにより、そのようなタンパク質をコードするプラスミドDNAまたは他のベクターの送達を回避することによって、以前の遺伝子編集アプローチに関連する問題および欠点の多くを解決する。本システムは、エレクトロポレーション、マグネトフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、レンチウイルス媒介トランスフェクション、または細胞内注入法のような他のアプローチに勝る利点も提供する。
いくつかの遺伝子編集システムがDNAプラスミド型のCas9およびガイドRNAを使用しているが、本明細書記載の発明は、RNP［例えば遺伝子編集タンパク質およびガイドRNA］を送達して、より一過性の遺伝子編集効果を達成することで、より少ないオフターゲット効果を導く。タンパク質、例えば遺伝子編集タンパク質を細胞に送達するためにエレクトロポレーションを使用することができるが、本明細書記載の方法、システム、および組成物は、エレクトロポレーションと比べていくつかの利点を与える。例えば、本発明のエタノールを介したスプレー式送達システムは、エレクトロポレーションと比べて、例えば10％、20％、50％、75％、2倍またはそれ以上のより大きい効率で、かつエレクトロポレーションと比べて送達後に同等またはより良好な細胞生存率で、かつ同等またはより良好な遺伝子編集効率で、遺伝子編集タンパク質および複合体を送達する。そのうえ、細胞機能、例えば、幹細胞の分化または免疫細胞の活性化は、エレクトロポレーションと比べて、記載されたエタノールスプレー法を使用してより良好に保たれる（例えば、10％、20％、50％、75％、2倍またはそれ以上）。加えて、本明細書記載のシステムとは違い、リポソーム媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションのような他の方法は、後者のアプローチが、例えばエレクトロポレーターを使用して接着細胞にトランスフェクトするために、接着細胞をその基層から剥離することを必要とし、そのような余分な操作段階は、細胞の無菌性および生物学的性質／機能の両方を損なう。そのうえ、他の方法、例えばエレクトロポレーションを用いて、送達カーゴ（遺伝子送達タンパク質および／または遺伝子送達複合体）を複数回投与することは、そのような処置に伴う高レベルの細胞損傷のせいで、不可能である。本明細書記載の組成物および方法は、細胞へのカーゴの送達効率および標的細胞への遺伝子編集組成物の量を増加させるプロセスである、2、3、4、5回、またはそれ以上の投与（送達スプレー、その後の停止液）を可能にする。標的細胞には、初代細胞（例えば、起源臓器組織から直接培養された、または血液から得られた細胞）および不死化細胞、例えば細胞株、ならびに接着細胞および懸濁細胞、例えば自由浮遊細胞が含まれる。初代ヒト細胞は、それらの起源臓器組織または血液細胞から直接培養される。
エレクトロポレーションは、広く使用される、ベクターなし／担体なしの方法であるが、それは、一部の細胞型への核酸および／またはタンパク質の送達に効率的であり得るとはいえ、特に初代細胞に毒性が高い可能性がある。したがって、代替的な膜破壊方法が必要とされる。上述のように、本明細書記載の装置、方法、およびシステムは、そのような他の技法よりも有利であり、特にエレクトロポレーションよりも有利である。
本主題の局面は、細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物を送達するための方法を提供する。好ましい態様では、方法は、ベクター、例えばレンチウイルスベクター、リポソーム、またはエレクトロポレーションを含まない。一部の態様では、方法は、遺伝子編集タンパク質をコードするプラスミドDNAと細胞を接触させる段階、またはそれを細胞に送達する段階を含み；他の態様では、方法は、遺伝子編集タンパク質をコードするプラスミドDNAと細胞を接触させる段階、またはそれを細胞に送達する段階を含まない。一部の態様では、方法は、遺伝子編集タンパク質をコードするRNAと細胞を接触させる段階、またはそれを細胞に送達する段階を含み；他の態様では、方法は、遺伝子編集タンパク質をコードするRNAと細胞を接触させる段階、またはそれを細胞に送達する段階を含まない。本明細書記載の方法は、細胞集団を提供する段階、ならびに細胞集団を、例えば遺伝子編集タンパク質および／または複合体を含む、ある体積の水溶液と接触させる段階を含む。水溶液は、遺伝子編集組成物および少なくとも濃度約2％のアルコールを含み得る。様々な態様では、体積は、(i)細胞集団の露出表面積または(ii)細胞集団における細胞数の関数である。
好ましくは、溶液は、スプレーまたはミストの形態で、例えば、細胞1個あたり複数の、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の水性粒子として細胞に送達される。例えば、細胞は、スプレーでコーティングされるが、送達化合物を含有する溶液に浸漬または浸水されない。スプレーまたはミストは、小滴の形態で空気により吹き飛ばすまたは吹き付けられる液体を含む。
コーティングされた細胞集団のコーティングを達成する条件の例には、微粒子スプレーの送達が含まれ、例えば、この条件は、細胞に大量の溶液を滴下またはピペッティングして実質的な細胞集団が液体の体積に浸漬または浸水されることを除外する。したがって、ミストまたはスプレーは、液体の体積と細胞の体積との一定の比を含む。または、この条件は、ミストまたはスプレーの体積と露出細胞面積との一定の比、例えば細胞が、組織培養容器、例えば組織培養プレート、例えばマイクロタイター組織培養プレートのウェルの底のような実質的な平面上に集密な層または実質的に集密な層として存在する場合に露出している細胞膜の面積との一定の比を含む。
したがって、形質膜を通過して細胞内に、生物学的に関連するペイロード、例えば化合物または組成物を送達するためのベクターなしのアプローチ、例えばウイルスベクターなしのアプローチを提供する必要性がある。「カーゴ」または「ペイロード」は、水溶液によって細胞形質膜を通過して細胞内部に送達される化合物または組成物を説明するために使用される用語である。
一部の例では、水溶液は、約2％～約50％；少なくとも約2％で、かつ約20、19、18、17、16、もしくは15％未満；または少なくとも約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.7.5、8.8.5、9.9.5、10、11、12、13、14、もしくは15％の濃度のアルコールを含む。一部の局面では、アルコールは、約50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、または2％未満の濃度である。一部の局面では、アルコール、例えばエタノールの濃度は、50％を超えない。一部の局面では、アルコール、例えばエタノールの濃度は、70％を超えない。一部の例では、アルコール濃度は、約25％である。アルコール濃度は、細胞型に応じて変動し得、例えばアルコール濃度は、25％、27％または33％であり得る。例えば、ある特定の標的細胞、例えば、初代T細胞のようなT細胞は、エタノールに対するより高い耐容能によって特徴付けられ、25％よりも高い、例えば27％、30％、33％、35％またはそれ以上のエタノールを含有する送達緩衝液を使用する処置の後に生存率および機能性を維持する。NK細胞、例えば、初代NK細胞も、カーゴ送達緩衝液中のエタノールの存在／濃度に関してそのような耐容能レベルを有し得る。
以下の特徴の1つまたは複数は、任意の実行可能な組合せで含まれ得る。細胞に送達される溶液の体積は、複数のユニット、例えば水性粒子のスプレー、例えば複数の小滴（droplet）である。体積は、個別の細胞に対して、または集密もしくは実質的に集密な（例えば少なくとも75％、少なくとも80％、例えば、85％、90％、95％、97％、98％、100％集密な）細胞集団の露出表面積に対して記載される。例えば、体積は、6.0×10-7マイクロリットル/細胞～7.4×10-4マイクロリットル/細胞であることができる。体積は、4.9×10-6マイクロリットル/細胞～2.2×10-3マイクロリットル/細胞である。体積は、9.3×10-6マイクロリットル/細胞～2.8×10-5マイクロリットル/細胞であることができる。体積は、約1.9×10-5マイクロリットル/細胞であることができ、約10パーセント以内である。体積は、6.0×10-7マイクロリットル/細胞～2.2×10-3マイクロリットル/細胞である。体積は、2.6×109マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.1×10-6マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積であることができる。体積は、5.3×10-8マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.6×10-7マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積であることができる。体積は、約1.1×10-7マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積であることができる。用語「約」は、述べられたユニットまたは量の、例えば10パーセント以内であり得る。
細胞の集密度は、表面で相互に接触している細胞を表す。例えば、集密度は、推定（または計数）パーセンテージとして表現することができ、例えば、集密度10％は、表面、例えば組織培養容器の表面の10％が細胞で覆われていることを意味し、100％は、表面が完全に覆われていることを意味する。例えば、接着細胞は、組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面で二次元的に増殖する。非接着細胞は、遠心沈殿する、真空もしくは組織培養培地の吸引により細胞集団の上部から引き抜く（pull down）、または容器の底から吸引もしくは真空除去により除去することができる。
細胞集団を、ある体積の水溶液と接触させる段階は、水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行うことができる。気体は、窒素、大気、または不活性な気体を含み得る。噴霧物は、直径10nm～100μm、例えば30～100μmのサイズ範囲の、別個の体積ユニットを含み得る。噴霧物は、直径約30～50μmを有する、別個の体積ユニットを含む。水溶液の総体積20μlを噴霧物として細胞占有面積約1.82cm2に、例えば24ウェル培養プレートのウェル1個に送達することができる。水溶液の総体積10μlは、細胞占有面積約0.2～2cm2、例えば約0.95cm2、例えば、96ウェル培養プレートのウェル1個（面積は、マルチウェルプレートの製造業者に応じて変動し得る）に送達される。例えば、噴霧物10μlは、24ウェルプレートについて細胞占有面積約1.82cm2に、48ウェルプレートについて0.64cm2に、および96ウェルプレートについて0.29cm2にスプレー送達され、より多くのウェルおよび／またはマルチウェルプレートのウェル1個あたりより小さなおよその細胞増殖／細胞占有面積を有する、マイクロタイタープレートについてスプレー送達体積が調整される（追加的な例を下に示す）。上述のように、ウェルのサイズは、プラスチック製品の供給業者により変動する可能性がある。供給業者の平均は、
24ウェル=約2.0cm2；送達20μl
48ウェル=約0.8cm2；送達5μl
96ウェル=約0.3cm2；送達2.5μl
である。
24ウェル=約2.0cm2；送達20μl
48ウェル=約0.8cm2；送達5μl
96ウェル=約0.3cm2；送達2.5μl
である。
この例では、各サイズのウェルに入っている溶液の体積を測定した。「体積と表面積と」または「体積と細胞数と」の比が、一般的に使用される。
別の局面では、培養プレートは、ウェル1、6、9、12、24、48、96、384、および1536個より選択される試料ウェルを含み得、特定の例では、培養プレートは、96個の試料ウェルを有する。試料ウェルの直径は、0.1mmから100mmの範囲であり得、例えば、24ウェル培養プレートは、直径約15.6mmを有し得、48ウェル培養プレートは、直径約11mmを有し得、96ウェル培養プレートは、直径約6.4mmを有し得る。およそのウェル寸法およびスプレー送達体積を下に示す。
典型的には、水溶液は、細胞膜を通過して細胞内に送達されるペイロードを含み、第2の体積は、ペイロードを含有しない緩衝液または培養培地である。または、第2の体積（緩衝液または培地）もペイロードを含有することができる。一部の態様では、水溶液は、ペイロードおよびアルコールを含み、第2の体積は、アルコールを含有しない（および任意でペイロードを含有しない）。第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、細胞集団を、水溶液と0.01～10分間、例えば0.1～10分間接触させることができる。緩衝液または培養培地は、リン酸緩衝食塩水（PBS）であることができる。細胞集団は、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、水溶液と2秒～5分間接触させ得る。細胞集団は、例えばペイロードを有さない第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、例えばペイロードを含有する水溶液と30秒～2分間接触させることができる。細胞集団は、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、スプレーされた溶液と約1～2分間接触させることができる。一部の例では、水溶液の調製は、送達の約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1分未満前である。
一部の態様では、水溶液へのアルコールの添加は、5、10、15、20、25、30、45分（例えば20～30分）インキュベーションした後であり得る。
細胞のスプレーと緩衝液または培養培地の添加との間の期間中、細胞は、スプレー体積からの水分層によって水和されたままである。
遺伝子編集組成物は、ゲノムDNAを編集する化合物を含み得る。例えば、遺伝子編集組成物は、ゲノムDNAを、切断する、切れ目を入れる、スプライスする、再編成する、転位する、組み換える、または他の方法で変更する化合物または複合体を含み得る。代替的にまたは追加的に、遺伝子編集組成物は、(i)ゲノムDNAを、切断する、切れ目を入れる、スプライスする、再編成する、転位する、組み換える、もしくは他の方法で変更する遺伝子編集複合体に含まれ得る；または(ii)ゲノムDNAを、切断する、切れ目を入れる、スプライスする、再編成する、転位する、組み換える、もしくは他の方法で変更する遺伝子編集複合体に含まれる化合物になるようにプロセシングもしくは変更され得る、化合物を含み得る。様々な態様では、遺伝子編集組成物は、(a)遺伝子編集タンパク質；(b)RNA分子；および／または(c)リボ核タンパク質（RNP）のうちの、1つまたは複数を含む。
一部の態様では、遺伝子編集組成物は、遺伝子編集タンパク質を含み、遺伝子編集タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、Casタンパク質、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼである。追加的な態様では、遺伝子編集タンパク質は、ホーミングエンドヌクレアーゼをTALENのモジュラーDNA結合ドメインと組み合わせた融合タンパク質（megaTAL）であり得る。例えば、megaTALはタンパク質として送達されてもよく、あるいはその代わりに、megaTALタンパク質をコードするmRNAが細胞に送達される。
様々な態様では、遺伝子編集組成物は、RNA分子を含み、RNA分子は、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを含む。
ある特定の態様では、遺伝子編集組成物は、RNPを含み、RNPは、Casタンパク質と、sgRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAとを含む。本主題の局面は、特定の遺伝子編集化合物がいつ、どれほど長く細胞内に存在するかを制御するために特に有用である。
本主題の様々な実施形態では、遺伝子編集組成物は、(a)細胞集団を水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間、または(b)細胞集団を水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間未満、細胞集団またはその後代細胞において検出可能である、
一部の態様では、細胞集団における細胞またはその後代細胞のゲノムは、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼのための少なくとも1つの部位特異的組換え部位を含む。
本発明の局面は、1種の遺伝子編集化合物を含む細胞と、これらの細胞に別の遺伝子編集化合物を挿入することとに関する。例えば、RNPの1つの成分を、RNPの別の成分を発現するまたは別の方法ですでに含有する細胞に導入することができる。例えば、細胞集団における細胞またはその後代細胞は、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを含み得る。一部の態様では、細胞集団またはその後代細胞は、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを発現する。代替的にまたは追加的に、細胞集団における細胞またはその後代細胞は、Casタンパク質を発現する。
本明細書における主題の様々な実施形態は、Casタンパク質を含む。一部の態様では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその変異体である。例示的なCasタンパク質（Cas9およびCas9変異体の非限定的な例を含む）は、本明細書に記載されている。
様々な局面では、Cas9タンパク質の濃度は、約0.1～約25μgの範囲であり得る。例えば、Cas9の濃度は、約1μg、約5μg、約10μg、約15μg、または約20μgであり得る。または、Cas9の濃度は、約10ng/μL～約300ng/μL；例えば約10ng/μL～約200ng/μl；または約10ng/μL～約100ng/μl、または約10ng/μL～約50ng/μlの範囲であり得る。
ある特定の態様では、遺伝子編集組成物は、(a)第1のsgRNA分子および第2のsgRNA分子を含み、第1のsgRNA分子の核酸配列は第2のsgRNA分子の核酸配列と異なるか；(b)第1のsgRNAを含む第1のRNPおよび第2のsgRNAを含む第2のRNPを含み、第1のsgRNA分子の核酸配列は第2のsgRNA分子の核酸配列と異なるか；(c)第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子を含み、第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列と異なるか；(d)第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子であって、第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列と異なり、tracrRNA分子をさらに含む、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子を含むか；または(e)第1のcrRNAおよびtracrRNAを含む第1のRNPおよび第2のcrRNAおよびtracrRNAを含む第2のRNPを含み、第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる。
局面では、Cas9タンパク質とガイドRNAとの比は、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、または1:10であり得る。
態様では、細胞が送達工程を経験する回数を増加させること（または、投与回数を増加させること）は、編集パーセンテージを増加させ得、一部の態様では投与回数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回の投与を含み得る。
様々な態様では、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子は、一緒になって、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列に隣接する標的配列に相補的な核酸配列を含み、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列は、約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロ塩基長であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロ塩基長である。一部の態様では、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子を含むRNP対の使用は、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列を含むポリヌクレオチド分子を作るために使用され得る。
ある特定の態様では、sgRNAまたはcrRNAの標的配列は、約12～約25、または約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17～23、または18～22ヌクレオチド長である。一部の態様では、標的配列は、20ヌクレオチド長または約20ヌクレオチド長である。
様々な態様では、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子は、発現ベクター内の染色体外配列に隣接する配列と相補的である。
本主題の局面は、遺伝子編集複合体の複数の成分であって、一緒に複合体化していない複数の成分の送達に関する。一部の態様では、遺伝子編集組成物は、少なくとも1種の遺伝子編集タンパク質と少なくとも1種の核酸とを含み、遺伝子編集タンパク質と核酸とは、互いと結合または複合体化していない。
本主題は、高い細胞生存率を維持しながら高い遺伝子編集効率を可能にする。一部の態様では、細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、またはそれ以上が、水溶液と接触後に遺伝的改変型になる。様々な態様では、細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、またはそれ以上が、水溶液と接触後に生存可能である。
ある特定の態様では、遺伝子編集組成物は、細胞内でDNAに一本鎖または二本鎖切断を誘導する。一部の態様では、遺伝子編集組成物は、修復テンプレートポリヌクレオチドをさらに含む。様々な態様では、修復テンプレートは、(a)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の約40～約90塩基対と相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の約40～約90塩基対と相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域；または(b)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対と相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対と相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域を含む。CRISPR-Casシステムを使用する遺伝子編集（修復テンプレートを含む）に関する非限定的な説明は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるRan et al. (2013) Nat Protoc. 2013 Nov; 8(11): 2281-2308に述べられている。修復テンプレートを含む態様は、CRISPR-Casシステムを含む態様に限定されない。
本主題の様々な実施形態では、水溶液の体積は、スプレーの形態で細胞集団に送達される。一部の態様では、体積は、6.0×10-7マイクロリットル/細胞～7.4×10-4マイクロリットル/細胞である。ある特定の態様では、スプレーは、直径10nm～100μmを含むコロイド粒子または亜粒子を含む。様々な態様では、体積は、2.6×10-9マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.1×10-6マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積である。
一部の態様では、RNPは、約100Å×100Å×50Åまたは10nm×10nm×5nmのサイズを有する。様々な態様では、スプレー粒子のサイズは、スプレー粒子1個あたり少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のRNPを収容するように調整されている。
例えば、細胞集団を、ある体積の水溶液と接触させる段階は、水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行われ得る。ある特定の態様では、細胞集団は、緩衝液または培養培地の第2の体積を添加して、細胞集団を沈水または懸濁させる前に、水溶液と0.01～10分間（例えば、0.1～10分間）接触する。
一部の態様では、緩衝液または培養培地は、リン酸緩衝食塩水（PBS）を含む。様々な態様では、水溶液は、約5～約50％のエタノール濃度を含む。非限定的な例では、水溶液は、(a)約75～約98％H2O；(b)約2～50％エタノール；(c)約6～約91mMスクロース；(d)約2～約35mM塩化カリウム；(e)約2～約35mM酢酸アンモニウム；(f)約1～約14mM(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)（HEPES）；(g)約0.1～約10mMマグネシウム塩もしくは約0.5～約10mM塩化マグネシウム；および／または(h)約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、もしくは3mMマグネシウム塩もしくは塩化マグネシウムのうちの1つまたは複数を含む。図8に示すように、2.5mM塩化マグネシウムを含む送達溶液は、塩化マグネシウムを含まない送達溶液と比較して送達効率に驚くべき増加を示した。
様々な態様では、細胞集団は、初代細胞または不死化細胞のうちの少なくとも1つを含む。例えば、細胞集団は、間葉系幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞、およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞、初代または不死化造血幹細胞（HSC）、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞を含む場合がある。T細胞の非限定的な例は、CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞を含む場合がある。一部の局面では、CD3+ T細胞のCD8+亜集団が使用される。CD8+ T細胞は、抗CD8ビーズを使用してポジティブ単離によりPBMC集団から精製され得る。一部の局面では、初代NK細胞は、PBMCから単離され、GFP mRNAは、プラットフォーム送達技法（すなわち、24時間で発現3％および生存率96％）によって送達され得る。追加的な局面では、NK細胞株、例えばNK92が使用され得る。
細胞型は、治療効力を高めるために以前に改変された細胞、例えばT細胞、NK細胞およびMSCも含む。例えば、キメラ抗原受容体を発現するT細胞またはNK細胞（それぞれCAR T細胞、CAR NK細胞）；改変T細胞受容体（TCR）を発現するT細胞；MSCの固有特性を補完する治療用タンパク質を過剰発現するようにウイルス的または非ウイルス的に改変されたMSC（例えば、レンチウイルスベクターを使用するEpoまたはAAV-6を使用するBMP-2の送達）（Park et al, Methods, 2015 Aug;84-16に総説）；それぞれ増強した効力および外部制御されたターゲティングのために非ペプチド薬または磁性ナノ粒子を用いてプライミングされたMSC（Park et al., 2015）；酵素的改変（例えばフコシルトランスフェラーゼ）、化学コンジュゲーション（例えば、N-ヒドロキシ-スクシンイミド（NHS）化学反応を使用することによるMSCへのSLeX修飾）または非共有結合相互作用（例えば、その後の抗体のコンジュゲーションのための疎水性アンカーとして作用するパルミチン酸化タンパク質を用いて細胞表面を操作すること）（Park et al., 2015）を、使用して治療部位へのMSCのホーミングを増強するためのターゲティング部分で機能付与されたMSCである。例えば、キメラ抗原受容体を発現するように改変されたT細胞、例えば、初代T細胞またはT細胞株（CAR T細胞）が、CARをコードする遺伝子を編集するために遺伝子編集タンパク質および／またはCARをコードする配列に特異的なガイド核酸を含有する複合体を用いて本発明によりさらに処置され、それにより、改変T細胞におけるCARの発現を減少または停止させ得る。
本主題の局面は、細胞形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、ペイロードおよび少なくとも濃度2％のアルコールを含む水溶液を含む組成物も提供する。一部の態様では、組成物は、マグネシウム塩をさらに含む。ある特定の態様では、組成物は、約0.1～約10mMマグネシウム塩または約0.1～約10mM塩化マグネシウムを含む。マグネシウム塩は、マグネシウムイオンを含む。
本主題の局面は、細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、ペイロード、少なくとも濃度2％のアルコール、マグネシウムイオンを欠く約46mM未満の塩、約121mM未満の糖、19mM未満の緩衝剤、および約0.1～約10mMマグネシウム塩を含む水溶液を含む組成物をさらに提供する。
ある特定の態様では、緩衝剤は、水溶液のpHをpH約6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、または8.5に調整または維持するために有効な弱酸または弱塩基である。様々な態様では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、またはベンジルアルコールである。一部の態様では、マグネシウムイオンを欠く塩は、NaイオンまたはKイオンを含む。一部の態様では、塩は、NaCl、KCl、Na2HPO4、C2H3O2NH4、またはKH2PO4である。ある特定の態様では、糖は、スクロースを含む。緩衝剤は、例えば、4-2-(ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、3-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸、2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、またはピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)を含む。
本発明の局面は、細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物を送達するための器具を提供する。様々な態様では、器具は、加圧気体を生成する空気圧発生装置；空気圧発生装置と動作可能に連結された噴霧器；遺伝子編集組成物および濃度2パーセント超のアルコールを含む、ある体積の水溶液を収容するように構成されたリザーバー；空気圧発生装置と噴霧器との間のバルブを含む。一部の態様では、バルブは、加圧気体が噴霧器を作動させるのを防止する閉鎖位置と、加圧気体に噴霧器を作動させて、水溶液からコロイド状小滴を生成するための開放位置との間で切替可能である。様々な態様では、バルブは、約250ミリ秒未満の切替速度を有する。ある特定の態様では、噴霧器は、細胞集団を水溶液と接触させるように向けられ、体積は、(i)細胞集団の露出表面積または(ii)細胞集団における細胞数の関数である。
本明細書において記載または例証される追加的な器具、システム、方法、組成物、および物品も提供される。
局面では、細胞の形質膜を通過してペイロードを送達する段階は、細胞集団を提供する段階、および細胞集団を、ある体積の水溶液と接触させる段階を含む。水溶液は、ペイロードおよび濃度5パーセント超のアルコール含量を含む。水溶液の体積は、細胞集団の露出表面積の関数の場合または細胞集団における細胞数の関数の場合があり得る。
別の局面では、細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物は、ペイロード、濃度5パーセント超のアルコール、46mM未満の塩、121mM未満の糖、および19mM未満の緩衝剤を含む水溶液を含む。例えばアルコール、例えばエタノールの濃度は、50％を超えない。
以下の特徴の1つまたは複数は、任意の実施可能な組合せに含まれることができる。細胞に送達される溶液の体積は、複数のユニット、例えばスプレー、例えば水性粒子の複数の小滴である。体積は、個別の細胞に対して、または集密もしくは実質的に集密な（例えば、少なくとも75％、少なくとも80％、例えば85％、90％、95％、97％、98％、100％集密な）細胞集団の露出表面積に対して記載される。例えば、体積は、6.0×10-7マイクロリットル/細胞～7.4×10-4マイクロリットル/細胞であることができる。体積は、4.9×10-6マイクロリットル/細胞～2.2×10-3マイクロリットル/細胞である。体積は、9.3×10-6マイクロリットル/細胞～2.8×10-5マイクロリットル/細胞であることができる。体積は、約1.9×10-5マイクロリットル/細胞であることができ、約は、約10パーセント以内である。体積は、6.0×10-7マイクロリットル/細胞～2.2×10-3マイクロリットル/細胞である。体積は、2.6×10-9マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.1×10-6マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積であることができる。体積は、5.3×10-8マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.6×10-7マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積であることができる。体積は、約1.1×10-7マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積であることができる。約は、10パーセント以内であることができる。
細胞の集密度は、表面で相互に接触している細胞を表す。例えば、集密度は、推定（または計数）パーセンテージとして表現することができ、例えば、集密度10％は、例えば組織培養容器の、表面の10％が細胞で覆われていることを意味し、100％は、表面が完全に覆われていることを意味する。例えば、接着細胞は、組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面で二次元増殖する。非接着細胞は、遠心沈殿する、真空もしくは組織培養培地の吸引により細胞集団の上部から引き抜く、または容器の底から吸引もしくは真空除去により除去することができる。
細胞集団を、ある体積の水溶液と接触させることは、水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行うことができる。気体は、窒素、大気、または不活性な気体を含み得る。噴霧物は、10nm～100μm、例えば直径30～100μmのサイズ範囲の、別個の体積ユニットを含むことができる。噴霧物は、直径約30～50μmを有する、別個の体積ユニットを含む。例えば、水溶液の総体積20μlを噴霧物として細胞占有面積約1.9cm2に、例えば24ウェル培養プレートのウェル1個に送達することができる（体積およびウェルのサイズ／面積に関する上記説明も参照されたい）。水溶液の総体積10μlは、細胞占有面積約0.95cm2、例えば、48ウェル培養プレートのウェル1個に送達される。典型的には、水溶液は、細胞膜を通過して細胞内に送達されるペイロードを含み、第2の体積は、ペイロードを含有しない緩衝液または培養培地である。または、第2の体積（緩衝液または培地）もペイロードを含有することができる。一部の態様では、水溶液は、ペイロードおよびアルコールを含み、第2の体積は、アルコールを含有しない（かつ任意でペイロードを含有しない）。第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、細胞集団は、水溶液と0.1～10分間接触することができる。緩衝液または培養培地は、リン酸緩衝食塩水（PBS）であることができる。細胞集団は、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、水溶液と2秒～5分間接触することができる。細胞集団は、例えばペイロードを有さない第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、例えばペイロードを含有する水溶液と30秒～2分間接触することができる。細胞集団は、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して細胞集団を沈水または懸濁させる前に、スプレーと約1～2分間接触することができる。細胞のスプレーから緩衝液または培養培地の添加の間の期間中、細胞は、スプレー体積からの水分層によって水和されたままである。
水溶液は、エタノール濃度5～30％を含むことができる。水溶液は、75～98％H2O、2～45％エタノール、6～91mMスクロース、2～35mM KCl、2～35mM酢酸アンモニウム、および1から14mM(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)（HEPES）のうちの1つまたは複数を含むことができる。
細胞集団は、接着細胞または非接着細胞を含むことができる。接着細胞は、初代間葉系幹細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞または細胞株のような不死化細胞のうちの少なくとも1つを含むことができる。細胞集団は、非接着細胞を含むことができる。非接着細胞は、初代造血幹細胞（HSC）、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞、またはJurkat T細胞株のような細胞株のうちの少なくとも1つを含むことができる。
細胞集団は、75パーセント超の集密のように実質的に集密であることができる。細胞の集密度は、表面で相互に接触している細胞を表す。例えば、集密度は、推定（または計数）パーセンテージとして表現することができ、例えば、集密度10％は、例えば組織培養容器の、表面の10％が細胞で覆われていることを意味し、100％は、表面が完全に覆われていることを意味する。例えば、接着細胞は、組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面で二次元増殖する。非接着細胞は、遠心沈殿する、真空もしくは組織培養培地の吸引により細胞集団の上部から引き抜く、または容器の底から吸引もしくは真空除去により除去することができる。細胞集団は、細胞の単層を形成することができる。
一部の態様では、本主題の組成物または溶液は、アルコール；塩；糖；緩衝剤；および／または酢酸アンモニウムを含む。アルコールは、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールおよびベンジルアルコールより選択することができる。塩は、例えば、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、およびC2H3O2NHより選択することができる。糖は、例えばスクロースを含むことができる。緩衝剤は、例えば、4-2-（ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、3-[[1,3-ジヒドロキシ-2-（ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸、2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-（ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸、3-（N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、またはピペラジン-N,N'-ビス（2-エタンスルホン酸)を含むことができる。一部の例では、溶液または緩衝液は、マグネシウムイオンを含み、例えばマグネシウムイオンは、任意でMgCl2のような塩の形態で提供される。
本主題は、形質膜を通過して遺伝子編集化合物および複合体を送達するための方法に関する。本主題の方法は、化合物または複合体を水性組成物に導入してマトリックスを形成させる段階；マトリックスを噴霧してスプレーにする段階；およびマトリックスを形質膜と接触させる段階を含む。
本明細書記載の例示的な方法はペイロードを含み、このペイロードはアルコールを含む。用語「アルコール」は、少なくとも1つの炭素原子に結合したヒドロキシル（-OH）官能基を含む多原子有機化合物を意味する。アルコールは、一価アルコールであり得、少なくとも1つの炭素原子、例えばメタノールを含み得る。アルコールは、少なくとも2つの炭素原子（例えばエタノール）を含み得る。他の局面では、アルコールは、少なくとも3つの炭素（例えばイソプロピルアルコール）を含む。アルコールは、少なくとも4つの炭素原子（例えばブタノール）、または少なくとも7つの炭素原子（例えばベンジルアルコール）を含む場合がある。例示的なペイロードは50％(v/v)以下のアルコールを含み得、より好ましくは、ペイロードはアルコールを2～45％(v/v)、アルコールを5～40％、およびアルコールを10～40％含む。ペイロードはアルコールを20～30％(v/v)含み得る。
最も好ましくは、ペイロードは、アルコールを25％(v/v)含む。または、ペイロードは、アルコールを2～8％(v/v)、またはアルコールを2％含むことができる。アルコールは、エタノールを含む場合があり、ペイロードは、エタノールを5、10、20、25、30、40、または50％(v/v)含む。例示的な方法は、アルコールとしてメタノールを含む場合があり、ペイロードは、メタノールを5、10、20、25、30、40、または50％(v/v)含む場合がある。ペイロードは、メタノールを2～45％(v/v)、メタノールを20～30％(v/v)、または25％(v/v)含む場合がある。好ましくは、ペイロードは、メタノールを20～30％(v/v)含む。さらに代替的に、アルコールは、ブタノールであり、ペイロードは、ブタノールを2、4、または8％(v/v)含む。
本主題の一部の局面では、ペイロードは、低張溶液または緩衝液中にある。ペイロード溶液は、浸透圧濃度171mOsm/Lを有する場合がある。例示的な方法によると、ペイロード溶液は、室温で浸透圧濃度171mOsm/Lを有する。
本主題によると、ペイロードは、少なくとも1種の塩を含む場合がある。塩は、NaCl、KCl、Na2HPO4、C2H302NH4およびKH2PO4より選択される場合がある。例示的な方法によると、ペイロードは、NaCl、KCl、Na2HPO4、およびKH2PO4のそれぞれを含む。ペイロードは、46mM未満の塩を含む場合がある。さらに、ペイロードは、2～35mM塩、または10～15mM塩（例えば、12mM塩）を含む。例示的な方法によると、塩はKClであり、ペイロードは、2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8、または33.6mM KClを、より好ましくは12mM KClを含む。
本主題の例示的な方法によると、ペイロードは、糖（例えば、スクロース、または二糖）を含む場合がある。例示的な方法によると、ペイロードは、121mM未満の糖、6～91mM、または26～39mM糖を含む。なおさらに、ペイロードは、32mM糖（例えばスクロース）を含む。任意で、糖はスクロースであり、ペイロードは、6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8、または89.6mMスクロースを含む。
本主題の例示的な方法によると、ペイロードは、緩衝剤（例えば弱酸または弱塩基）を含む場合がある。緩衝剤は、双性イオンを含む場合がある。例示的な方法によると、緩衝剤は、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸である。ペイロードは、19mM未満の緩衝剤（例えば、1～15mm、または4～6mMまたは5mM緩衝剤）を含む場合がある。例示的な方法によると、緩衝剤は、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、ペイロードは、1、2、3、4、5、10、12、14mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。さらに好ましくは、ペイロードは、5mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。
本主題の例示的な方法によると、ペイロードは、酢酸アンモニウムを含む。ペイロードは、46mM未満の酢酸アンモニウム（例えば、2～35mM、10～15mM、または12mM酢酸アンモニウム）を含む場合がある。ペイロードは、2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8、または33.6mM酢酸アンモニウムを含む場合がある。
本明細書記載の方法は、68mM NaCl、1.4mM KCl、5mM Na2HPO4、および0.9mM KH2PO4を含む第2のペイロード（例えば水溶液）が提供される、本主題の第2の局面を含む。第2のペイロードのpHは、pH7.4であり得る。
様々な態様では、水溶液を噴射する気体によって行われる水溶液の体積は、例えば圧縮された空気（例えば大気）を含む場合がある。これらおよび他の実施形態は、不活性な気体、例えば、ヘリウム、ネオン、およびアルゴンを含む場合がある。
本主題のある特定の局面では、細胞集団は、接着細胞（例えば、肺細胞、腎臓細胞、マクロファージのような免疫細胞）または非接着細胞（例えば、懸濁細胞）を含む場合がある。
本主題のある特定の局面では、細胞集団は、実質的に集密な場合があり、集密度75パーセント超を実質的に含む場合がある。好ましい実施形態では、細胞集団は、単一の単層を形成する場合がある。
細胞形質膜を通過して化合物を送達するための方法、システム、器具および装置の追加的な非限定的な説明は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2015年10月23日に出願されたPCT国際特許出願PCT/US2015/057247に記載されている。
本主題は、形質膜を通過してペイロードを送達するための器具、システム、技法および物品にさらに関する。本主題は、形質膜を通過してタンパク質またはタンパク質複合体のようなペイロードを送達するための器具にも関する。本主題は、細胞内送達の分野に有用性を見出す場合があり、例えば、細胞、組織、または臓器のような標的部位への遺伝子編集組成物の送達に適用される。
一部の実施形態では、形質膜を通過してペイロードを送達するための器具は、少なくとも1つの噴霧放出器を有する噴霧器および噴霧器に向けられた支持体を含むことができる。方法は、形質膜をペイロードと接触させる前にペイロードを微粒化する段階をさらに含み得る。様々な態様では、噴霧器は、例えば、機械式噴霧器、超音波噴霧器、エレクトロスプレー、ネブライザー、およびベンチュリ管より選択することができる。噴霧器は、市販の噴霧器であることができる。噴霧器は、鼻腔内粘膜噴霧装置であることができる。噴霧器は、LMA Teleflex（NC, USA）から市販されている鼻腔内粘膜噴霧装置であることができる。噴霧器は、LMA Teleflex（NC, USA）からカタログ番号MAD300で市販されている鼻腔内粘膜噴霧装置であることができる。
ある特定の態様では、噴霧器は、形質膜をペイロードと接触させる前に、直径30～100μmを有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適応されることができる。様々な態様では、噴霧器は、直径30～80μmを有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適応されることができる。例えば、噴霧器は、直径50～80μmを有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適応されることができる。
一部の態様では、噴霧器は、気体リザーバーを含む。例えば、噴霧器は、気体が加圧下で維持される気体リザーバーを含むことができる。ある特定の態様では、気体は、空気、二酸化炭素、およびヘリウムより選択される。様々な態様では、気体リザーバーは、固定圧力水頭発生装置（fixed pressure head generator）を含む。一部の態様では、気体リザーバーは、噴霧放出器と流体連通することができる。本主題の様々な実施形態では、気体リザーバーは、噴霧放出器と流体連通することができる気体ガイドを含む。一部の態様では、気体ガイドは、中に気体を通過させるように適応されている。気体ガイドは、例えば中空体を含むことができる。例えば、気体ガイドは、開放端を有する中空体であることができる。一部の態様では、気体ガイドは、第1および第2の開放端を有する中空体を含む。様々な態様では、気体ガイドは、第1および第2の対向する開放端を有する中空体である。ある特定の態様では、第1の開放端の直径は、第2の開放端の直径と異なる。様々な態様では、第1の開放端の直径は、第2の開放端の直径よりも小さいまたは大きいことができる。様々な実施形態では、第1の開放端は、気体リザーバーと流体連通するか、または第2の開放端は、噴霧放出器と流体連通する。
ある特定の態様では、器具は、試料リザーバーを含む。非限定的な例では、試料リザーバーは、噴霧器と流体連通する。様々な態様では、試料リザーバーは、噴霧放出器と流体連通する。例えば、気体リザーバーおよび試料リザーバーは、両方とも噴霧放出器と流体連通することができる。
一部の態様では、器具は、試料リザーバーと気体リザーバーとの間に位置する試料バルブを含む。これらおよび他の態様では、器具は、試料リザーバーと気体ガイドとの間に位置する試料バルブを含むことができる。ある特定の態様では、試料バルブは、試料リザーバーからの試料の流れを調整するように適応されることができる。一部の例では、試料バルブは、試料の連続流動または半連続流動を可能にするように適応されることができる。様々な実施形態では、試料バルブは、試料の所定の量の半連続流動を可能にするように適応されることができる。例えば、試料バルブは、0.5～100μLまたは10μLの試料の半連続流動を可能にするように適応され得る。非限定的一例では、試料バルブは、面積0.065～0.085cm2への試料の半連続流動1μLを可能にするように適応される。
様々な態様では、噴霧器および支持体は、間隔を空けられる。支持体は、固体支持体を含むことができる。一部の態様では、支持体は、試料ウェルを含むプレートを含むことができる。例えば、支持体は、ウェル1、6、9、12、24、48、384、および1536個より選択される試料ウェルを含むプレートを含むことができる。ある特定の態様では、固体支持体は、不活性な材料から形成される。例えば、固体支持体は、プラスチック材料、または金属もしくは金属合金、またはその組合せから形成されることができる。一部の態様では、支持体は、発熱素子および／または抵抗素子を含む。ある特定の態様では、支持体は、器具に往復取り付け可能である。様々な実施形態では、支持体は、器具に対して往復移動可能である。例えば、支持体は、噴霧器に対して往復移動可能であることができる。様々な態様では、支持体は、噴霧放出器に対して往復移動可能であることができる。一部の態様では、支持体は、噴霧器に対して支持体を往復移動させるために支持体アクチュエーターを含む。様々な態様では、支持体は、噴霧放出器に対して支持体を往復移動させるために支持体アクチュエーターを含む。非限定的な例では、支持体は、噴霧放出器の縦軸に対して支持体を往復移動させるために支持体アクチュエーターを含むことができる。一部の態様では、支持体は、噴霧放出器の縦軸に対して支持体を横方向に往復移動させるための支持体アクチュエーターを含むことができる。
一部の態様では、スプレー域の縦軸は、ペイロードが送達される支持体および／または支持体の円形ウェルの縦軸または中心点と同軸である。ある特定の態様では、噴霧放出器の縦軸は、支持体および／または支持体の円形ウェルの縦軸または中心点と同軸である。様々な態様では、噴霧放出器の縦軸、支持体の縦軸、およびスプレー域の縦軸は、それぞれ同軸である。ある特定の態様では、スプレー域の縦方向の長さは、スプレー域の円形基部（例えば、ペイロードが送達される細胞面積）の直径よりも大きい（2倍よりも大きい場合がある）。
様々な態様では、器具は、気体リザーバーと噴霧器との間に位置するバルブを含む。一部の態様では、バルブは、電磁作動式バルブである。ある特定の態様では、バルブは、ソレノイドバルブまたは空気圧バルブである。一部の態様では、バルブは、気体ガイドに位置する。例えば、バルブは、気体ガイド内の気体流動を調整するように適応されることができる。様々な態様では、バルブは、連続または半連続気体流動を可能にするように適応されている。非限定的な例では、バルブは、時間間隔1秒のように所定の時間間隔で半連続気体流動を可能にするように適応されている。ある特定の態様では、器具は、少なくとも1つのフィルターを含む。一部の態様では、フィルターは、細孔径10μm未満または細孔径10μmを含む。様々な態様では、フィルターは、気体ガイドに位置する。一部の態様では、フィルターは、気体ガイドと液体連通する。
ある特定の態様では、器具は、少なくとも1つの調節器を含む。調節器は、例えば電気的調節器または機械的調節器であることができる。一部の態様では、調節器は、気体ガイドに位置する。一部の態様では、調節器は、気体ガイドと液体連通する。様々な態様では、調節器は、調節バルブである。一部の態様では、気体ガイド内の圧力は、約1.0～2.0barまたは約1.5barである。非限定的な例では、気体ガイド内の圧力は、1.0～2.0barであり、噴霧器と支持体との間の距離は、31mm以下である。例えば、気体ガイド内の圧力は、1.5barであることができ、噴霧器と支持体との間の距離は、31mmであることができる。様々な実施形態では、気体ガイド内の圧力は、噴霧器と支持体との距離1ミリメートルあたり約0.05barである。一部の態様では、調節バルブは、気体ガイド内の圧力を約1.0～2.0barまたは約1.5barに調整するように適応されることができる。ある特定の態様では、各調節バルブは、気体ガイド内の圧力を約1.0～2.0barまたは約1.5barに維持するように適応されることができる。
一部の態様では、器具は、2つの調節器を含む。例えば、器具は、第1および第2の調節器を含むことができる。様々な実施形態では、第1および第2の調節器は、気体ガイドに位置することができる。一部の実施形態では、第1および第2の調節器は、気体ガイドと流体連通することができる。ある特定の態様では、第1の調節器は、気体リザーバーとフィルターとの間に位置する。様々な態様では、第1の調節器は、気体ガイド内の気体リザーバーからの圧力を約2.0barに調整するまたは気体ガイド内の圧力を約2.0barに維持するように適応されることができる。一部の態様では、第2の調節器は、フィルターとバルブとの間に位置することができる。
様々な態様では、噴霧放出器は、錐状スプレー域（例えば、一般的に円錐状スプレー域）を提供するように適応されることができる。例えば、噴霧放出器は、30°の錐状スプレー域を提供するように適応されることができる。一部の態様では、器具は、器具のいずれかまたは全ての部分を制御するためにマイクロプロセッサーをさらに含むことができる。様々な態様では、マイクロプロセッサーは、試料バルブ、支持体アクチュエーター、バルブ、および調節器のいずれかまたは全てを制御するように配置することができる。一部の実施形態では、器具は、少なくとも1つの噴霧放出器を有する噴霧器および噴霧器に向けられた支持体を含むことができ；噴霧器は、機械式噴霧器、超音波噴霧器、エレクトロスプレー、ネブライザー、およびベンチュリ管より選択することができる。ある特定の態様では、噴霧器は、直径30～100μmを有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適応されることができる。非限定的な例では、器具は、試料リザーバーおよび気体ガイド、ならびに試料リザーバーと気体ガイドとの間に位置する試料バルブを含むことができる。一部の態様では、試料バルブは、半連続試料流動10～100μLを可能にするように適応されることができる。様々な実施形態では、噴霧器および支持体は、間隔を空け、その間に一般的に錐状のスプレー域を規定することができ；噴霧器と支持体との間の距離は、分子が送達される細胞域の円形基部の直径の約2倍であることができ；噴霧器と支持体との間の距離は、31mmであることができ、分子が送達される細胞域の円形基部の直径は、15.5mmであることができる。ある特定の態様では、器具は、気体ガイドを含むことができ、気体ガイド内の圧力は、1.0～2.0barである。一部の態様では、器具は、10μm未満の細孔径を有する少なくとも1つのフィルターを含むことができる。
変形の非限定的な例には、移動プレートポジショナ上方の静止フレームに保持された1つまたは複数の噴霧器；調整可能なx-y-z-r軸（ここで、rは、0～360度の回転可動域である）に保持された1つまたは複数の噴霧器；移動プレートポジショナの上方の静止支持体に保持された1つまたは複数の噴霧器；調整可能なx-y軸に保持された1つまたは複数の噴霧器；移動プレートポジショナ上方の静止フレームに保持された1つまたは複数の噴霧器；および調整可能なx軸に保持された1つまたは複数の噴霧器が含まれる。
一部の実施形態では、1つまたは複数の噴霧器は、組織または組織の部分にエクスビボまたはインビボで取り組むという目的でカテーテルまたは棒（wand）の遠位端に位置づけられる。例えば、本主題の局面は、露出した組織、例えば、動物の真皮もしくは眼組織、または内部組織、例えば、哺乳動物、例えばヒトもしくはヒト以外の哺乳動物の肺組織（気道）、消化管組織（食道、腸管）、もしくは心血管組織（動脈もしくは静脈）のような内腔を含む組織への遺伝子編集ペイロードの送達に関する。
様々な態様では、1つまたは複数の噴霧器は、ウェルプレート表面の部分またはサブセット（例えば、プレートの部分またはマルチウェルプレートの特定のウェル）に取り組むという目的でカテーテルまたは棒の遠位端に位置づけられる。ある特定の態様では、1つまたは複数の噴霧器は、連続的に移動している基材の上方に位置づけられる静止支持体上に位置づけられる。基材は、細胞培養物と適合し得る、または中で細胞が培養されるプレートまたはウェルを含む。
一部の態様では、本主題の装置または器具は、スプレーが送達されているまたは送達されるであろう場所を示すための、1つまたは複数の噴霧器と一致する、可視低出力レーザーおよびレンズ配置を含む。様々な態様では、レーザーおよびレンズは、噴霧器と同じ分散パターンを採用するように適応されることができる。一部の態様では、分散パターンは、錐状の分散パターンである。
本主題の様々な実施形態は、マイクロリットル、ナノリットルまたはピコリットルの液滴を生成し、小滴／粒子サイズの顕微鏡的制御、視覚化、操作、および／またはチューニング下で液滴を個別に細胞に位置づけることが可能な液体ディスペンサーおよびピペットを含む。例えば、ナノリットルまたはピコリットル範囲の体積を有する小滴／水性粒子（例えば、1つまたは複数のRNPを含む）が、顕微鏡ガイド下で単一細胞に（単独でまたは単層のメンバーもしくは連続した細胞のマットとして）投与される。このアプローチを使用して、マイクロインジェクションのように形質膜が針で穿刺されることはない。どちらかといえば、小滴／粒子が細胞上に滴下または適用され、マイクロインジェクションのような形質膜の物理的操作なしに細胞質に入り込む。このようにして、小滴／粒子は、細胞のサイズ（直径）または露出表面積の関数として細胞による最適な取込みのためにサイズ（例えば、直径500ナノメートル～100ミクロン）または体積（例えば、1.0×10-7～10マイクロリットル；1.0×10-6～10マイクロリットル；1.0×10-5～1マイクロリットル；1.0×10-4～1.0マイクロリットル；1.0×10-6～1.0×10-3マイクロリットル；6.0×10-7～7.4×10-4マイクロリットル、4.9×10-6～2.2×10-3マイクロリットル、9.3×10-6～2.8×10-5マイクロリットル、約1.9×10-5マイクロリットル、または6.0×10-7マイクロリットル～2.2×10-3マイクロリットル）が適合される。一部の例では、小滴／粒子は、直径約10から約100,000ナノメートルである。例えば、小滴／粒子は、直径約10、50、100、200、300、400、500、1000、10,000、または100,000ナノメートルであり得る。一部の態様では、代わりに、マイクロインジェクションのために使用され得る装置または器具は、形質膜のマイクロインジェクション穿刺なしに小滴／粒子を細胞表面に送達するために使用される。そのような態様では、針は、細胞を穿刺しないが、その代わりに小滴／粒子を細胞近くに至らせ、かつ／または小滴／粒子を細胞上に位置づけるために使用される。針を伴うある特定の態様では（マイクロインジェクション装置または器具を併用するか併用しないかどちらにせよ）、針のサイズおよび／または針を通して溶液が押し出される圧力は、小滴／粒子サイズを改変するように調整され得る。様々な態様では、1つまたは複数の小滴／粒子は、培養細胞または生きた生物の細胞のような複数の細胞に送達され得る。例えば、小滴／粒子は、粘膜細胞もしくは眼細胞、または受精卵もしくは接合子に送達され得る。非限定的な一例では、小滴は、マウス、カエル、または魚（例えば、ゼブラフィッシュ）の接合子の1つまたは複数の細胞に送達される。そのような例では、接合子は、水溶液から短時間で取り出され、小滴／粒子を受け入れ、次に水溶液に戻され得る。
本発明の局面は、初代ヒトT細胞および造血幹細胞（HSC）におけるゲノム編集のためのCas-gRNAリボ核タンパク質の送達のような、細胞および組織への遺伝子編集化合物および複合体の、発現ベクターなしでの送達に関する。
CRISPR-Casシステムの様々な局面は、当技術分野において公知である。このシステムの非限定的な局面は、例えば2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,649号；2015年7月7日に発行された米国特許第9,074,199号；2014年4月15日に発行された米国特許第8,697,359号；2015年1月13日に発行された米国特許第8,932,814号；2015年8月27日に公開されたPCT国際公開公報第2015/071474号；Cho et al., (2013) Nature Biotechnology Vol 31 No 3 pp 230-232（補足情報を含む）；およびJinek et al., (2012) Science Vol 337 No 6096 pp 816-821に記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
Casタンパク質の非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても公知）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、その相同体、またはその改変バージョンが含まれる。これらの酵素は公知であり、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースのアクセッション番号Q99ZW2（SEQ ID NO:1）およびNCBIデータベースのアクセッション番号Q99ZW2.1として見出され得る。UniProtデータベースのアクセッション番号A0A0G4DEU5およびCDJ55032は、Cas9タンパク質のアミノ酸配列の別の例（SEQ ID NO:18）を提供する。別の非限定的な例は、ストレプトコッカス-サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、UniProtデータベースのアクセッション番号Q03JI6.1（SEQ ID NO:19）に見出され得る。一部の態様では、未改変CRISPR酵素は、Cas9のようにDNA切断活性を有する。ある特定の態様では、CRISPR酵素はCas9であり、化膿連鎖球菌または肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）からのCas9であり得る。様々な態様では、CRISPR酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内のような標的配列の位置で一方または両方の鎖の切断を指令する。一部の態様では、CRISPR酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500個、またはそれ以上の塩基対内で一方または両方の鎖の切断を指令する。一部の態様では、ベクターは、変異型CRISPR酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠如するように、対応する野生型酵素に関して変異されたCRISPR酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌からのCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（D10A、ここで、アミノ酸の付番は、SEQ ID NO:1に示される）は、Cas9を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Cas9をニッカーゼにする変異の他の例には、非限定的に、H840A、N854A、およびN863Aが含まれる（アミノ酸の付番をSEQ ID NO:1に示す）。本発明の局面では、ニッカーゼは、相同組換えを介してゲノム編集のために使用され得る。
ある特定の態様では、Cas9ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、DNA標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する2つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組合せは、両方の鎖に切れ目を入れて使用して、NHEJを誘導することを可能にする。
さらなる例として、全てのDNA切断活性を実質的に欠如する変異型Cas9を産生するように、Cas9の2つ以上の触媒ドメイン（RuvC I、RuvC II、およびRuvC III）が変異され得る。D10A変異をH840A、N854A、またはN863A変異のうちの1つまたは複数と組み合わせて、全てのDNA切断活性を実質的に欠如するCas9酵素を産生させ得る。ある特定の態様では、変異型酵素のDNA切断活性が、その非変異型に対して約25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％未満、またはそれ未満の場合、CRISPR酵素は、全てのDNA切断活性を実質的に欠如すると考えられる。他の変異が有用な場合があり、Cas9または他のCRISPR酵素が化膿連鎖球菌以外の種由来の場合、類似の効果を実現するために対応するアミノ酸に変異が加えられる場合がある。
ある特定の態様では、送達されるタンパク質（例えば、Casタンパク質またはその異種）は、細胞内局在シグナルを含む場合がある。例えば、RNP内のCasタンパク質は、細胞内局在シグナルを含む場合がある。状況に応じて、例えばCas9および核局在シグナルを含む融合タンパク質は、核局在シグナルの包含を特定せずに本明細書において「Cas9」と呼ばれる場合がある。一部の態様では、ペイロード（例えば、RNP）は、局在シグナルを含む融合タンパク質を含む。例えば、融合タンパク質は、核局在シグナル、核小体局在シグナル、またはミトコンドリア標的化シグナルを含む場合がある。そのようなシグナルは、当技術分野において公知であり、非限定的な例は、Kalderon et al., (1984) Cell 39 (3 Pt 2): 499-509; Makkerh et al., (1996) Curr Biol. 6 (8):1025-7; Dingwall et al., (1991) Trends in Biochemical Sciences 16 (12): 478-81; Scott et al., (2011) BMC Bioinformatics 12:317 (7 pages); Omura T (1998) J Biochem. 123(6):1010-6; Rapaport D (2003) EMBO Rep. 4(10):948-52;およびBrocard & Hartig (2006) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research 1763(12):1565-1573に記載されており、そのそれぞれの内容は、これによって参照により本明細書に組み入れられる。様々な態様では、Casタンパク質は、2、3、4、5つ、またはそれ以上の核局在シグナルなどの1つを超える局在シグナルを含む場合がある。一部の態様では、局在シグナルは、Casタンパク質のN末端にあり、他の態様では、局在シグナルは、Casタンパク質のC末端にある。
核局在シグナルの非限定的な例には、
が含まれる。ミトコンドリア局在シグナルの非限定的な例には、
が含まれる。
一部の態様では、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞のような特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を非限定的に含む哺乳動物のような特定の生物の細胞またはそれ由来の細胞であり得る。一般的に、コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも1つのコドン（例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個もしくはそれ以上のコドン、または約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個もしくはそれ以上より多いコドン）を、より頻繁または最も頻繁に関心対象の宿主細胞の遺伝子に使用されているコドンにより置換することによって、その宿主細胞における発現増強のために核酸配列を改変する工程を表す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドン使用頻度における差）は、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率としばしば相関し、次に翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移RNA（tRNA）分子の入手性に依存すると考えられる。細胞中の選択されたtRNAの優位性は、一般的にペプチド合成に最も頻繁に使用されるコドンの反映である。
したがって、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を適合することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Codon Usage Database」から容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応されることができる。Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するための、Gene Forge（Aptagen; Jacobus, Pa.）のようなコンピューターアルゴリズムも入手可能である。一部の態様では、CRISPR酵素をコードする配列における1つまたは複数のコドン（例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個もしくはそれ以上のコドン、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
一般的に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、かつ標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指令するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の態様では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適に整列化した場合に、約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％もしくはそれ以上であるか、または約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％もしくはそれ以上より多い。一部の態様では、相補性の程度は100％である。最適なアライメントは、配列を整列化するために適切な任意のアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例には、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム（例えば、Burrows Wheeler Aligner）、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies、ELAND（Illumina, San Diego, Calif.）、SOAP（soap.genomics.org.cnから入手可能）、およびMaq（maq.sourceforge.netから入手可能）が含まれる。一部の態様では、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75もしくはそれ以上のヌクレオチド長、または約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75もしくはそれ以上より多いヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12未満、またはそれより少ないヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指令する能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、CRISPR配列の成分をコードするベクターを用いたトランスフェクションなどによって、被験ガイド配列を含むCRISPR複合体を形成するために十分なCRISPRシステムの成分が、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され、続いて、本明細書記載のSurveyorアッセイのような標的配列内の優先的切断が評価され得る。同様に、標的配列、被験ガイド配列を含むCRISPR複合体の成分、および試験ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供し、試験ガイド配列の反応と対照ガイド配列の反応との間で標的配列での結合または切断速度を比較することによって、標的ポリヌクレオチド配列の切断を試験管内で調べ得る。
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択され得る。一部の態様では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列には、標的ゲノムにおける独特な配列が含まれる。例えば、化膿連鎖球菌Cas9について、ゲノムにおける独特な標的配列は、形態：
のCas9標的部位を含む場合があり、
式中、
（Nは、A、G、T、またはCであり；Xは、任意のものであることができる）は、ゲノム中に1回出現する。ゲノム中の独特な標的配列は、形態：
の化膿連鎖球菌Cas9標的部位を含む場合があり、
式中、
（Nは、A、G、T、またはCであり；Xは、任意のものであることができる）は、ゲノム中に1回出現する。ストレプトコッカス-サーモフィルスCRISPR1 Cas9について、ゲノムにおける独特な標的配列は、形態：
のCas9標的部位を含む場合があり、
式中、
（Nは、A、G、T、またはCであり；Xは、任意のものであることができ；Wは、AまたはTである）は、ゲノム中に1回出現する。ゲノムにおける独特な標的配列は、形態：
のS.サーモフィルスCRISPR1 Cas9標的部位を含む場合があり、
式中、
（Nは、A、G、T、またはCであり；Xは、任意のものであることができ；Wは、AまたはTである）は、ゲノム中に1回出現する。化膿連鎖球菌Cas9について、ゲノムにおける独特な標的配列は、形態：
のCas9標的部位を含む場合があり、
式中、
（Nは、A、G、T、またはCであり；Xは、任意のものであることができる）は、ゲノム中に1回出現する。ゲノムにおける独特な標的配列は、形態：
の化膿連鎖球菌Cas9標的部位を含む場合があり、
式中、
（Nは、A、G、T、またはCであり；Xは、任意のものであることができる）は、ゲノム中に1回出現する。これらの配列のそれぞれにおいて、「M」は、A、G、T、またはCの場合があり、配列を独特と特定するときに考慮する必要がない。一部の態様では、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の度合いを減少させるように選択される。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。一部のプログラムは、最小のギブズ自由エネルギーを計算することに基づく。1つのそのようなアルゴリズムの例は、ZukerおよびStiegler（Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148）によって記載されたようなmFoldである。別の例示的なフォールディングアルゴリズムは、重心構造予測アルゴリズムを使用してウイーン大学（University of Vienna）の理論化学研究所（Institute for Theoretical Chemistry）で開発されたオンラインウェブサーバーRNAfoldである（例えば、A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24；およびPA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62を参照されたい）。
式中、
式中、
式中、
式中、
式中、
式中、
広範囲の細胞型においてゲノム操作を促進するCRISPR-Cas技法は、急速に発展している。リボ核タンパク質（RNP）の形態でのCas9-gRNA編集ツールの送達が、Cas9およびgRNAをコードするプラスミドの送達と比較していくつかの利点をもたらすことが、最近示された。利点には、より速くより効率的な編集、より少ないオフターゲット効果、およびより低い毒性が含まれる。RNPは、リポフェクションおよびエレクトロポレーションによって送達されてきたが、特に、ある特定の臨床的に関連する細胞型について、これらの送達方法で解決されない限界には、毒性および低い効率が含まれる。したがって、生物学的に関連するペイロード、例えばRNPを、形質膜を通過して細胞内に送達するための、ベクターなしのアプローチ、例えばウイルスベクターなしのアプローチを提供する必要性がある。「カーゴ」または「ペイロード」は、水溶液によって細胞形質膜を通過させて細胞内部に送達される化合物または組成物を記載するために使用される用語である。
本主題は、広範囲のペイロードを低い毒性で細胞に送達することを促す送達技法に関する。ゲノム編集は、本主題の一部の局面を使用してRNPを細胞に送達することによって達成され得る。Cas9および2種のAlexa488標識gRNAが、A549ヒト肺細胞株の細胞のような細胞に個別に送達され得る。Cas9は、送達の1時間後に細胞におけるウエスタンブロッティングによって検出され得る。その後、Cas9がもはや検出不能になるまでレベルは低下する。送達技法自体は、Jurkat細胞および初代T細胞の生存率または機能性に悪影響を及ぼさない。本主題は、臨床的に関連する細胞型においてCas9 RNPによる遺伝子編集を最低の毒性で可能にする。
Casおよび／またはgRNAのようなCRISPR/Cas成分の一過性で直接の送達は、発現ベクター媒介送達と比較して利点を有する。例えば、Cas、gRNA、またはRNPの量を、発現ベクターの使用と比較してより正確なタイミングで限られた時間で添加することができる。ベクターから発現される成分は様々な量および多様な時間で産生され得、オフターゲット編集なしに一貫した遺伝子編集を達成することを困難にする。追加的に、CasおよびgRNAの事前形成複合体（RNP）を、発現ベクターを用いて送達することができない。
例示的な態様では、水溶液は、添加剤をさらに含み得る。グリセロールのような最適以下であった添加剤を含む、追加的な非限定的な添加剤は、グリセロール（例えば、水溶液中に濃度0.01～25％v/v）、NDSB（例えば、水溶液中に濃度約0.01M～約1M）、D-ソルビトールのようなソルビトール（例えば、水溶液中に濃度0.01～10％w/v）、D-マンニトールのようなマンニトール（例えば、水溶液中に濃度0.01～10％w/v）、ウシの眼レンズから精製されたα-クリスタリンのようなα-クリスタリン（例えば、水溶液中に濃度1～500μM；または約1～400μM、または約1～300μM、または約1～200μM、または約1～100μM、または約1～50μM、または約1～20μM、または約1～10μM）、ゼラチンAまたはゼラチンBのようなゼラチン（例えば、水溶液中に濃度0.01～10％w/v）、グリシン（例えば、水溶液中に濃度約0.01M～約1M）、プロリン（例えば、水溶液中に濃度約1mM～約200mM）、Tween-20（例えば、水溶液中に濃度約0.01％～約5％v/v）、L-ヒスチジン（例えば、水溶液中に濃度約1mM～約200mM）、ミオイノシトール（例えば、水溶液中に濃度0.01～10％w/v）、およびトレハロース（例えば、水溶液中に濃度約1mM～約200mM）を含み得る。
好ましい態様では、添加剤は、α-クリスタリンであり得る。α-クリスタリンのアミノ酸配列と関連するアクセッション番号およびヒトα-クリスタリンの例には、CAA32891.1、ACP18852.1、AAB22011.1、AAB22010.1、AMM63587.1、EAX09498.1、EAW67163.1、AAI13599.1、AAP35416.1、AMM63591.1、およびAAB22009.1が含まれる。
一部の例では、α-クリスタリンのアミノ酸配列は、アクセッション番号CAA32891.1（EMBLL X14789 mRNA.翻訳:CAA32891.1）を含み、アミノ酸配列（SEQ ID NO:23）が示されている。
例示的な領域またはフラグメントは、アミノ酸1～50および60～104を非限定的に含む。
一部の例では、α-クリスタリンのアミノ酸配列は、アクセッション番号ACP18852.1（EMBL FJ876064 mRNA.翻訳:ACP18852.1.）を含み、アミノ酸配列（SEQ ID NO:24）が示されている。
例示的な領域またはフラグメントは、アミノ酸1～51、14～161、または67～50を非限定的に含む。
一部の態様では、市販のα-クリスタリンは、2つのアイソフォーム、cry-aAまたはcry-aBのものであり得る。一部の態様では、cry-aAとcry-aBとの比は、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、または2:1、3:1、4:1、または5:1であり得る。レンズにおいて、アルファ-クリスタリンは、3:1の比のアルファAサブユニットとアルファBサブユニットとからなる多分散分子である。一部の例では、α-クリスタリンは、ウシのレンズ、例えば、ウシ-アルファクリスタリン（Sigma C4163）から精製され得る。
アルファ-クリスタリンA鎖CRYAA（ウシ）のアミノ酸配列（SEQ ID NO:25）が示されている。
アルファ-クリスタリンB鎖CRYAB（ウシ）のアミノ酸配列（SEQ ID NO:26）が示されている。
一部の態様では、ヒトアルファAまたはBクリスタリンは、Cell Sciencesを含む任意の適切な供給業者から購入され得る。一部の例では、アルファクリスタリンA（品番CRC167）は、アミノ酸配列（SEQ ID NO:27）を有し得る。
他の例では、アルファクリスタリンB（品番CRC168）は、アミノ酸配列（SEQ ID NO:28）を有し得る。
一部の態様では、ヒトアルファAまたはBクリスタリンは、Abcamも含む任意の適切な供給業者から購入され得、アルファA（ab48778）は、アミノ酸配列（SEQ ID NO:29）を有する。
他の局面では、AbcamからのアルファクリスタリンB（ab48779）は、アミノ酸配列（SEQ ID NO:30）を有する。
一部の態様ではMgCl2は、約2.5、2、0.5、0.1、もしくは0.01 MgCl2未満および／または約5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.01％w/v未満のグリセロールの濃度であり得る。
本明細書記載の組成物および方法のさらなる利点は、遺伝子編集タンパク質カーゴ、例えばCas9の沈殿の最小化または減少を含む。細菌タンパク質Cas9は、ある特定の条件で溶液から沈殿することが観察され、その沈殿は、Cas9の機能または活性を減少させ得る。Cas9の沈殿を減少、最小化、または除去するために、送達緩衝液組成物は、任意で、タンパク質を沈殿から防ぐ賦形剤または添加剤を含む。そのような保護剤は、熱ショックタンパク質、例えばα-クリスタリンを含む。他の熱ショックタンパク質保護剤には、Hsp60、Hsp72およびHsp73が含まれる（Whitley et al., 1999, J. of Vascular Surgery 29(4):748-751）。
他の賦形剤または添加剤には、糖アルコール、例えばソルビトールが含まれる。α-クリスタリンおよび／またはソルビトールの添加は、アルコールへの曝露、例えばエタノールベースの送達溶液の後に、Cas-9:gRNAのヌクレアーゼ活性を改善し、それにより、ある特定の緩衝液におけるCas9の沈殿／活性減少の問題および欠点を克服した。
したがって、本発明は、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集複合体を細胞に送達するための組成物、例えば緩衝溶液を含み、この組成物は、アルコール、例えばエタノールを、少なくとも2％（であるが、70％未満）含有し、任意でα-クリスタリンのような熱ショックタンパク質および／またはソルビトールのような糖アルコールを含有する。細胞における標的遺伝子を編集するための方法は、細胞（その中での遺伝子編集が望まれる）を、遺伝子編集タンパク質または複合体を含む小滴のミストのスプレーと接触させる段階、細胞を、例えば約0～10分間、0.1～10分間、1～5分間、例えば、約2分間の期間、インキュベートして、細胞の形質膜を不安定化し、それにより形質膜を通過した細胞内へのカーゴの進入を可能にする段階、その細胞を停止液と、例えば0～5分間、0.1～5分間、0.2～4分間、0.3～3分間、0.4～2分間、0.5～1分間、例えば30秒間の期間、接触させて、細胞膜透過化／不安定化工程を逆行させる段階、ならびに細胞を細胞培養培地、例えば標準細胞培養培地中で、インキュベートする段階であって、その間に遺伝子編集が起こり、例えば、この培養期間中、細胞がこの溶液中に残り得る段階を含む。上述のように、記載された方法の顕著な利点は、この一連の段階が、任意で数回（2、3、4、5、6、8、10回、またはそれ以上）繰り返されて、細胞に送達されるカーゴの量および／または遺伝子編集の効率を増加させ得ることである。任意で、投与（例えば、次の送達スプレー）間の回復期間は、カーゴ送達事象とスプレー送達事象との間で1～8時間、例えば2～6時間、例えば約4時間の範囲である。
細胞の処理から臨床使用に適した生存可能な遺伝子編集細胞への期間がより短いので、本明細書記載の方法および組成物は、他の送達方法よりも有利である。本明細書記載のエタノールスプレー送達システムを使用するカーゴの送達速度は、エレクトロポレーションと匹敵するが、細胞の回復は、エレクトロポレーションよりも速やかである。T細胞について、増殖は、本発明の方法によって遅延しないが、エレクトロポレーションでは2日間遅延する。MSCについて、本発明の技法を用いた細胞分化は、未処理対照と等価であるが、エレクトロポレーションでは遅延する。生存率および機能性に関して、本明細書記載のスプレー技法を使用して処理した4時間後に、細胞は使用できる状態である。
したがって、その後の使用、例えば臨床処置のためのヒトまたは動物対象への送達のために、細胞を加工する速さは、処理された細胞が正常な健康／機能を回復するために非常に長い期間を要する手順よりも有利である。例えば、エレクトロポレーションによる送達は、MSCおよびT細胞のような一部の細胞の機能を損なう。エレクトロポレーションのこの欠点は、DNA損傷および内因性修復メカニズムを引き起こす大きな電気勾配（特に小型細胞において）および局所加熱に起因する可能性が高い（Meaking et al., 1995, Biochimica et Biophysics Acta 1264:357-362およびBranzei et al., 2008, Nature Reviews Molecular Cell Biology 9:297-308）。例えば、一部の細胞の機能完全性が損なわれるようになる、例えばエレクトロポレーションの後に分化が減少し、活性が減少するようになる、例えばエレクトロポレーションの後に、機能完全性が最大数週間低下するようになる。対照的に、方法および組成物を使用して処理された細胞の生存率および機能性は、最小限に損なわれるまたは損なわれず、細胞は、数時間（処理の1、2、6、12、18、24時間後）または数日（処理の1、2、3、4、5、6、7日後）以内に使える状態になる。したがって、本明細書記載の遺伝子編集技法の全体的な主な利点は、電気勾配による膜破壊の回避である。そのうえ、エレクトロポレーションのパラメーターは、細胞型および実験条件に応じて広く変動し得る。対照的に、本発明のデータの方法およびシステムは、広範囲の細胞型にうまく機能し、方法は、数分で完了することができ、かつ細胞にやさしい条件で実施される。本明細書記載のスプレー送達方法および組成物を使用して処理された細胞の生存率および機能性は、最小限に損なわれるまたは損なわれず、細胞は、数時間（処理の1、2、6、12、18、24時間後）または数日（処理の1、2、3、4、5、6、7日後）以内に使える状態になる。
本明細書開示の各態様は、その他の開示された態様のそれぞれに適用可能であると考えられる。一部の局面では、水溶液は、MgCl2および／またはグリセロールを含まない。したがって、本明細書記載の様々な要素の全ての組合せは、本発明の範囲内である。
[本発明1001]
細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物を送達するための方法であって、
細胞集団を提供する段階；および
該細胞集団を、該遺伝子編集組成物と少なくとも約2％の濃度のアルコールとを含む、ある体積の水溶液と接触させる段階を含み、
該体積は、(i)該細胞集団の露出表面積または(ii)該細胞集団における細胞数の関数である、
前記方法。
[本発明1002]
前記水溶液が、
(a)約5％～約50％；
(b)少なくとも約5％で、かつ約50、40、30、20、19、18、17、16、もしくは15％未満；または
(c)少なくとも約2.5、3、3.5、4、4.5、もしくは5％
の濃度のアルコールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
遺伝子編集組成物が、
(a)遺伝子編集タンパク質；
(b)RNA分子；および／または
(c)リボ核タンパク質（RNP）
のうちの1つまたは複数を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
遺伝子編集組成物が遺伝子編集タンパク質を含み、該遺伝子編集タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、MegaTAL、Casタンパク質、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
遺伝子編集組成物がRNA分子を含み、該RNA分子が、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
遺伝子編集組成物がRNPを含み、該RNPが、Casタンパク質と、gRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAとを含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
遺伝子編集組成物が、細胞集団またはその後代細胞において、
(a)該細胞集団を前記水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間、または
(b)該細胞集団を前記水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間未満、
検出可能である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
細胞集団またはその後代細胞における細胞ゲノムが、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFLPリコンビナーゼのための少なくとも1つの部位特異的組換え部位を含む、本発明1004の方法。
[本発明1009]
細胞集団における細胞またはその後代細胞が、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを含む、本発明1004の方法。
[本発明1010]
細胞集団またはその後代細胞が、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを発現する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
細胞集団における細胞またはその後代細胞が、Casタンパク質を発現する、本発明1005の方法。
[本発明1012]
Casタンパク質が、Cas9タンパク質またはその変異体である、本発明1004の方法。
[本発明1013]
遺伝子編集組成物が、
(a)第1のsgRNA分子の核酸配列が第2のsgRNA分子の核酸配列と異なる、第1のsgRNA分子および第2のsgRNA分子；
(b)第1のsgRNA分子の核酸配列が第2のsgRNA分子の核酸配列と異なる、第1のsgRNAを含む第1のRNPおよび第2のsgRNAを含む第2のRNP；
(c)第1のcrRNA分子の核酸配列が第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子；
(d)第1のcrRNA分子の核酸配列が第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子であって、さらにtracrRNA分子を含む、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子；または
(e)第1のcrRNA分子の核酸配列が第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる、第1のcrRNAおよびtracrRNAを含む第1のRNPならびに第2のcrRNAおよびtracrRNAを含む第2のRNP
を含む、本発明1003の方法。
[本発明1014]
第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子が、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列に隣接する標的配列に相補的な核酸配列を共に含み、該遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列は、約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロ塩基長であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロ塩基長である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
第1および第2のsgRNAまたは第1もしくは第2のcrRNA分子が、発現ベクター内にある染色体外配列に隣接する配列に相補的である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
遺伝子編集組成物が、少なくとも1種の遺伝子編集タンパク質および少なくとも1種の核酸を含み、該遺伝子編集タンパク質および該核酸は、互いと結合または複合体化していない、本発明1001の方法。
[本発明1017]
細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、またはそれ以上が、前記水溶液との接触後に遺伝子改変型になる、本発明1001の方法。
[本発明1018]
細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、またはそれ以上が、前記水溶液との接触後に生存可能である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
遺伝子編集組成物が、細胞内のDNAに一本鎖または二本鎖切断を誘導する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
遺伝子編集組成物が、修復テンプレートポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
修復テンプレートが、
(a)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域、および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域；または
(b)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域、および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域
を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記体積の水溶液が、水性粒子のスプレーの形態で細胞集団に送達される、本発明1001の方法。
[本発明1023]
(a)水性粒子のスプレーの体積が、6.0×10 -7 マイクロリットル/細胞～7.4×10 -4 マイクロリットル/細胞であり；かつ／または
(b)水性粒子が、直径10nm～100μm、30～100μm、50～80μmまたは30～50μmのサイズ範囲の、別個の体積ユニットを有する、
本発明1022の方法。
[本発明1024]
スプレーが、10nm～100μmの直径を含むコロイド粒子または亜粒子を含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記体積が、2.6×10 -9 マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.1×10 -6 マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積である、本発明1001の方法。
[本発明1026]
細胞集団を、ある体積の水溶液と接触させる段階が、該水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1027]
細胞集団を前記水溶液と0.1～10分間接触させてから、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して該細胞集団を沈水または懸濁させる、本発明1001の方法。
[本発明1028]
緩衝液または培養培地がリン酸緩衝食塩水（PBS）を含む、本発明1022の方法。
[本発明1029]
前記水溶液が約2～約20％のエタノール濃度を含む、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記水溶液が、
(a)約75～約98％H 2 O；
(b)約2～20％エタノール；
(c)約6～約91mMスクロース；
(d)約2～約35mM塩化カリウム；
(e)約2～約35mM酢酸アンモニウム；
(f)約1～約14mM(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)（HEPES）；および／または
(g)約0.1～約10mMマグネシウム塩；および／または
(h)約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、もしくは3mMマグネシウム塩
のうちの1つまたは複数を含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記水溶液が、約0.1～約10mMの塩化マグネシウムを含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記水溶液が、少なくとも約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、または3mMの塩化マグネシウムを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
細胞集団が、初代細胞または不死化細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1034]
細胞集団が、初代もしくは不死化間葉系幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞、およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞、初代もしくは不死化造血幹細胞（HSC）、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞、A549細胞、Beas-2B細胞、Jurkat細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）のうちの少なくとも1つを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、該組成物が、ペイロードと少なくとも2％の濃度のアルコールとを含む水溶液を含み、該ペイロードが遺伝子編集組成物を含む、前記組成物。
[本発明1036]
マグネシウム塩をさらに含む、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
約0.1～約10mMのマグネシウム塩を含む、本発明1035の組成物。
[本発明1038]
少なくとも約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、または3mMの塩化マグネシウムを含む、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、またはベンジルアルコールを含む、本発明1035の組成物。
[本発明1040]
約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50％のエタノールを含む、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
pH約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0を有する、本発明1035の組成物。
[本発明1042]
細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、該組成物が、該ペイロード、少なくとも2％の濃度のアルコール、マグネシウムイオンを欠く約46mM未満の塩、約121mM未満の糖、19mM未満の緩衝剤、および約0.1～約10mMのマグネシウム塩を含む水溶液を含み、該ペイロードが遺伝子編集組成物を含む、前記組成物。
[本発明1043]
緩衝剤が、前記水溶液のpHをpH約6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、または8.5に調整または維持するために有効な弱酸または弱塩基である、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、またはベンジルアルコールを含む、本発明1042の組成物。
[本発明1045]
マグネシウムイオンを欠く塩が、NaイオンまたはKイオンを含む、本発明1042の組成物。
[本発明1046]
マグネシウムイオンを欠く塩が、NaCl、KCl、Na 2 HPO 4 、C 2 H 3 O 2 NH 4 、またはKH 2 PO 4 を含む、本発明1042の組成物。
[本発明1047]
糖がスクロースを含む、本発明1042の組成物。
[本発明1048]
緩衝剤が、4-2-(ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、3-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸、2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、またはピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)を含む、本発明1042の組成物。
[本発明1049]
約32mMスクロース、約12mM塩化カリウム、約12mM酢酸アンモニウム、約5mM HEPES、約15％エタノール、および約2.5mM MgCl 2 を含む、本発明1042の組成物。
[本発明1050]
32mMスクロース、12mM塩化カリウム、12mM酢酸アンモニウム、5mM HEPES、2.5mM MgCl 2 、15％エタノール、および85％H 2 Oを含む、本発明1049の組成物。
[本発明1051]
前記溶液のpHを約pH7.4に調整してからエタノールを添加した、本発明1049の組成物。
[本発明1052]
細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物を送達するための器具であって、
加圧気体を生成する空気圧発生装置；
該空気圧発生装置と動作可能に連結された噴霧器；
該遺伝子編集組成物および2パーセントを超える濃度のアルコールを含む、ある体積の水溶液を収容するように構成されたリザーバー；
加圧気体による該噴霧器の作動を防止する閉鎖位置と加圧気体による該噴霧器の作動によって該水溶液からコロイド状の小滴を生成させる開放位置との間で切替可能な、250ミリ秒未満の切替速度を有する、該空気圧発生装置と該噴霧器との間のバルブ
を含み、
該噴霧器が、細胞集団を該水溶液と接触させるように方向づけられており、該体積が、(i)該細胞集団の露出表面積または(ii)該細胞集団の細胞数の関数である、
前記器具。
[本発明1053]
前記水溶液が、熱ショックタンパク質または糖アルコールを含む添加剤をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1054]
熱ショックタンパク質がα-クリスタリンを含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
α-クリスタリンが約1～約500μMの濃度で存在する、本発明1054の方法。
[本発明1056]
糖アルコールが、約1～約10重量/体積％の濃度のソルビトールを含む、本発明1053の方法。
[本発明1057]
前記水溶液が、約50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5％未満の濃度のアルコールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1058]
細胞が幹細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1059]
幹細胞が間葉系幹細胞（MSC）を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
MSCが骨髄由来MSCを含む、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記水溶液が、グリセロールまたはMgCl 2 を含まない、本発明1001の方法。
本明細書記載の主題の1つまたは複数の変形の詳細は、添付の図面および下記の説明に示される。本明細書記載の主題の他の特徴および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。タンパク質または核酸配列についてのアクセッション番号の引用の内容を含む、本明細書において引用される全ての参照は、参照により組み入れられる。
細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物を送達するための方法であって、
細胞集団を提供する段階；および
該細胞集団を、該遺伝子編集組成物と少なくとも約2％の濃度のアルコールとを含む、ある体積の水溶液と接触させる段階を含み、
該体積は、(i)該細胞集団の露出表面積または(ii)該細胞集団における細胞数の関数である、
前記方法。
[本発明1002]
前記水溶液が、
(a)約5％～約50％；
(b)少なくとも約5％で、かつ約50、40、30、20、19、18、17、16、もしくは15％未満；または
(c)少なくとも約2.5、3、3.5、4、4.5、もしくは5％
の濃度のアルコールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
遺伝子編集組成物が、
(a)遺伝子編集タンパク質；
(b)RNA分子；および／または
(c)リボ核タンパク質（RNP）
のうちの1つまたは複数を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
遺伝子編集組成物が遺伝子編集タンパク質を含み、該遺伝子編集タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、MegaTAL、Casタンパク質、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
遺伝子編集組成物がRNA分子を含み、該RNA分子が、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
遺伝子編集組成物がRNPを含み、該RNPが、Casタンパク質と、gRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAとを含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
遺伝子編集組成物が、細胞集団またはその後代細胞において、
(a)該細胞集団を前記水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間、または
(b)該細胞集団を前記水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間未満、
検出可能である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
細胞集団またはその後代細胞における細胞ゲノムが、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFLPリコンビナーゼのための少なくとも1つの部位特異的組換え部位を含む、本発明1004の方法。
[本発明1009]
細胞集団における細胞またはその後代細胞が、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを含む、本発明1004の方法。
[本発明1010]
細胞集団またはその後代細胞が、sgRNA、crRNA、および／またはtracrRNAを発現する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
細胞集団における細胞またはその後代細胞が、Casタンパク質を発現する、本発明1005の方法。
[本発明1012]
Casタンパク質が、Cas9タンパク質またはその変異体である、本発明1004の方法。
[本発明1013]
遺伝子編集組成物が、
(a)第1のsgRNA分子の核酸配列が第2のsgRNA分子の核酸配列と異なる、第1のsgRNA分子および第2のsgRNA分子；
(b)第1のsgRNA分子の核酸配列が第2のsgRNA分子の核酸配列と異なる、第1のsgRNAを含む第1のRNPおよび第2のsgRNAを含む第2のRNP；
(c)第1のcrRNA分子の核酸配列が第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子；
(d)第1のcrRNA分子の核酸配列が第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子であって、さらにtracrRNA分子を含む、第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子；または
(e)第1のcrRNA分子の核酸配列が第2のcrRNA分子の核酸配列と異なる、第1のcrRNAおよびtracrRNAを含む第1のRNPならびに第2のcrRNAおよびtracrRNAを含む第2のRNP
を含む、本発明1003の方法。
[本発明1014]
第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子が、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列に隣接する標的配列に相補的な核酸配列を共に含み、該遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列は、約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロ塩基長であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロ塩基長である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
第1および第2のsgRNAまたは第1もしくは第2のcrRNA分子が、発現ベクター内にある染色体外配列に隣接する配列に相補的である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
遺伝子編集組成物が、少なくとも1種の遺伝子編集タンパク質および少なくとも1種の核酸を含み、該遺伝子編集タンパク質および該核酸は、互いと結合または複合体化していない、本発明1001の方法。
[本発明1017]
細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、またはそれ以上が、前記水溶液との接触後に遺伝子改変型になる、本発明1001の方法。
[本発明1018]
細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、またはそれ以上が、前記水溶液との接触後に生存可能である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
遺伝子編集組成物が、細胞内のDNAに一本鎖または二本鎖切断を誘導する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
遺伝子編集組成物が、修復テンプレートポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
修復テンプレートが、
(a)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域、および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域；または
(b)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域、および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域
を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記体積の水溶液が、水性粒子のスプレーの形態で細胞集団に送達される、本発明1001の方法。
[本発明1023]
(a)水性粒子のスプレーの体積が、6.0×10 -7 マイクロリットル/細胞～7.4×10 -4 マイクロリットル/細胞であり；かつ／または
(b)水性粒子が、直径10nm～100μm、30～100μm、50～80μmまたは30～50μmのサイズ範囲の、別個の体積ユニットを有する、
本発明1022の方法。
[本発明1024]
スプレーが、10nm～100μmの直径を含むコロイド粒子または亜粒子を含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記体積が、2.6×10 -9 マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.1×10 -6 マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積である、本発明1001の方法。
[本発明1026]
細胞集団を、ある体積の水溶液と接触させる段階が、該水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1027]
細胞集団を前記水溶液と0.1～10分間接触させてから、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して該細胞集団を沈水または懸濁させる、本発明1001の方法。
[本発明1028]
緩衝液または培養培地がリン酸緩衝食塩水（PBS）を含む、本発明1022の方法。
[本発明1029]
前記水溶液が約2～約20％のエタノール濃度を含む、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記水溶液が、
(a)約75～約98％H 2 O；
(b)約2～20％エタノール；
(c)約6～約91mMスクロース；
(d)約2～約35mM塩化カリウム；
(e)約2～約35mM酢酸アンモニウム；
(f)約1～約14mM(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)（HEPES）；および／または
(g)約0.1～約10mMマグネシウム塩；および／または
(h)約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、もしくは3mMマグネシウム塩
のうちの1つまたは複数を含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記水溶液が、約0.1～約10mMの塩化マグネシウムを含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記水溶液が、少なくとも約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、または3mMの塩化マグネシウムを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
細胞集団が、初代細胞または不死化細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1034]
細胞集団が、初代もしくは不死化間葉系幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞、およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞、初代もしくは不死化造血幹細胞（HSC）、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞、A549細胞、Beas-2B細胞、Jurkat細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）のうちの少なくとも1つを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、該組成物が、ペイロードと少なくとも2％の濃度のアルコールとを含む水溶液を含み、該ペイロードが遺伝子編集組成物を含む、前記組成物。
[本発明1036]
マグネシウム塩をさらに含む、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
約0.1～約10mMのマグネシウム塩を含む、本発明1035の組成物。
[本発明1038]
少なくとも約2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、または3mMの塩化マグネシウムを含む、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、またはベンジルアルコールを含む、本発明1035の組成物。
[本発明1040]
約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50％のエタノールを含む、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
pH約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0を有する、本発明1035の組成物。
[本発明1042]
細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、該組成物が、該ペイロード、少なくとも2％の濃度のアルコール、マグネシウムイオンを欠く約46mM未満の塩、約121mM未満の糖、19mM未満の緩衝剤、および約0.1～約10mMのマグネシウム塩を含む水溶液を含み、該ペイロードが遺伝子編集組成物を含む、前記組成物。
[本発明1043]
緩衝剤が、前記水溶液のpHをpH約6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、または8.5に調整または維持するために有効な弱酸または弱塩基である、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、またはベンジルアルコールを含む、本発明1042の組成物。
[本発明1045]
マグネシウムイオンを欠く塩が、NaイオンまたはKイオンを含む、本発明1042の組成物。
[本発明1046]
マグネシウムイオンを欠く塩が、NaCl、KCl、Na 2 HPO 4 、C 2 H 3 O 2 NH 4 、またはKH 2 PO 4 を含む、本発明1042の組成物。
[本発明1047]
糖がスクロースを含む、本発明1042の組成物。
[本発明1048]
緩衝剤が、4-2-(ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、3-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸、2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、またはピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)を含む、本発明1042の組成物。
[本発明1049]
約32mMスクロース、約12mM塩化カリウム、約12mM酢酸アンモニウム、約5mM HEPES、約15％エタノール、および約2.5mM MgCl 2 を含む、本発明1042の組成物。
[本発明1050]
32mMスクロース、12mM塩化カリウム、12mM酢酸アンモニウム、5mM HEPES、2.5mM MgCl 2 、15％エタノール、および85％H 2 Oを含む、本発明1049の組成物。
[本発明1051]
前記溶液のpHを約pH7.4に調整してからエタノールを添加した、本発明1049の組成物。
[本発明1052]
細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物を送達するための器具であって、
加圧気体を生成する空気圧発生装置；
該空気圧発生装置と動作可能に連結された噴霧器；
該遺伝子編集組成物および2パーセントを超える濃度のアルコールを含む、ある体積の水溶液を収容するように構成されたリザーバー；
加圧気体による該噴霧器の作動を防止する閉鎖位置と加圧気体による該噴霧器の作動によって該水溶液からコロイド状の小滴を生成させる開放位置との間で切替可能な、250ミリ秒未満の切替速度を有する、該空気圧発生装置と該噴霧器との間のバルブ
を含み、
該噴霧器が、細胞集団を該水溶液と接触させるように方向づけられており、該体積が、(i)該細胞集団の露出表面積または(ii)該細胞集団の細胞数の関数である、
前記器具。
[本発明1053]
前記水溶液が、熱ショックタンパク質または糖アルコールを含む添加剤をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1054]
熱ショックタンパク質がα-クリスタリンを含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
α-クリスタリンが約1～約500μMの濃度で存在する、本発明1054の方法。
[本発明1056]
糖アルコールが、約1～約10重量/体積％の濃度のソルビトールを含む、本発明1053の方法。
[本発明1057]
前記水溶液が、約50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5％未満の濃度のアルコールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1058]
細胞が幹細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1059]
幹細胞が間葉系幹細胞（MSC）を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
MSCが骨髄由来MSCを含む、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記水溶液が、グリセロールまたはMgCl 2 を含まない、本発明1001の方法。
本明細書記載の主題の1つまたは複数の変形の詳細は、添付の図面および下記の説明に示される。本明細書記載の主題の他の特徴および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。タンパク質または核酸配列についてのアクセッション番号の引用の内容を含む、本明細書において引用される全ての参照は、参照により組み入れられる。
詳細な説明
現在のところ、CRISPR-Cas9システムは、最も一般的には、3つの成分を別々のプラスミドまたは複合プラスミドのいずれかとしてコードするプラスミドDNAの形態で細胞に送達されている。Cas9をコードするmRNAも使用されている（Liang et al., (2015) J Biotechnol 20;208:44-53）。Cas9タンパク質は、Cas9をコードするプラスミドのまたはmRNAの代替物として使用されている。興味深いことに、細胞に送達する前に精製Cas9タンパク質がgRNAと複合体化しているCas9リボ核タンパク質（Cas9を含むRNP）は、例えば以下に記載されるように、最近、プラスミドおよびmRNAアプローチと比べていくつかの利点を提供すると報告されている：Cho SW, Lee J, Carroll D, Kim JS, Lee J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 2013. 195(3):1177-80; Sung YH, Kim JM, Kim HT, Lee J, Jeon J, Jin Y, Choi JH, Ban YH, Ha SJ, Kim CH, Lee HW, Kim JS. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Res. 2014. 24(1):125-131; Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014. 24(6):1012-9 （以後「Kim et al.」）; Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 2014. 15;3:e04766; Zuris JA, Thompson DB, Shu Y, Guilinger JP, Bessen JL, Hu JH, Maeder ML, Joung JK, Chen ZY, Liu DR. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2015. 33(1):73-80; Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015. 20;208:44-53（以後Lin et al.」）;およびSchumann K, Lin S, Boyer E, Simeonov DR, Subramaniam M, Gate RE, Haliburton GE, Ye CJ, Bluestone JA, Doudna JA, Marson A. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015. 18; 112(33):10437-42（これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる）。
現在のところ、CRISPR-Cas9システムは、最も一般的には、3つの成分を別々のプラスミドまたは複合プラスミドのいずれかとしてコードするプラスミドDNAの形態で細胞に送達されている。Cas9をコードするmRNAも使用されている（Liang et al., (2015) J Biotechnol 20;208:44-53）。Cas9タンパク質は、Cas9をコードするプラスミドのまたはmRNAの代替物として使用されている。興味深いことに、細胞に送達する前に精製Cas9タンパク質がgRNAと複合体化しているCas9リボ核タンパク質（Cas9を含むRNP）は、例えば以下に記載されるように、最近、プラスミドおよびmRNAアプローチと比べていくつかの利点を提供すると報告されている：Cho SW, Lee J, Carroll D, Kim JS, Lee J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 2013. 195(3):1177-80; Sung YH, Kim JM, Kim HT, Lee J, Jeon J, Jin Y, Choi JH, Ban YH, Ha SJ, Kim CH, Lee HW, Kim JS. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Res. 2014. 24(1):125-131; Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014. 24(6):1012-9 （以後「Kim et al.」）; Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 2014. 15;3:e04766; Zuris JA, Thompson DB, Shu Y, Guilinger JP, Bessen JL, Hu JH, Maeder ML, Joung JK, Chen ZY, Liu DR. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2015. 33(1):73-80; Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015. 20;208:44-53（以後Lin et al.」）;およびSchumann K, Lin S, Boyer E, Simeonov DR, Subramaniam M, Gate RE, Haliburton GE, Ye CJ, Bluestone JA, Doudna JA, Marson A. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015. 18; 112(33):10437-42（これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる）。
ZFNを含む遺伝子編集ヌクレアーゼは、Bhakta, M. et al., Genome Research 23:530-538; 2013、およびBeerli, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci v.95 pp 14628-14633; 1998に記載されており、TALは、Cermak, T. et al., Nucleic Acids Research 2011, v.39, no. 12、Miller, J. et al., Nature Biotechnology vol. 29 no. 2; 2011、Christian, M. et al., Genetics 186:757-761; 2010、Deng, D. et al, Science 2012: v.335 p.720、およびBoch, J. et al., Science 2009: v.326 p.1509に記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。追加的に、Creは、Chevalier, B. et al., Nucleic Acids Research 2001, v.29 no. 18に記載されており、この全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。MegaTalは、Sather, B. et al Sci Transl Med 7(307) 2015、Ibarra, G. et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2016) 5,e352、Osborn, M. et al., Molecular Therapyv. 24 no. 3, 570-581 (2016); Wang, Y. et al., Nucleic Acid Research 2014; v.42, 6463-6475;およびGaj, T. et al., Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2015に記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。Cas9は、Wiedenheft, Bl. et al., Nature 2012; v.482; 331、Fineran, P. et al., Virology 2012; 433; 202-209、およびHsu, P. et al., Cell 2014; v.157; 1262-1278に記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
一部の細胞型ではプラスミドおよびmRNAを発現停止することができるが、一方で他の細胞型はDNAトランスフェクションに対して不応性である可能性がある。いくつかの研究で、RNPは、プラスミドトランスフェクションよりも迅速性および効率性の両者を兼ね備えた編集を生じることが示されている。これは、細胞内で即時に機能することができ、かつプラスミドの場合のような転写、翻訳、および集合を必要としない、完全に形成した複合体の直接導入に起因し得る。RNPは、プラスミドDNAよりも低毒性であるとも報告されている。この理由は、外因性DNA自体が一部の細胞に有毒な可能性があること、またはRNPの半減期がプラスミドの半減期よりも有意に短く、プラスミドがこれらの外来mRNAおよびタンパク質のより長期間の発現をもたらすことであり得る。重要なことに、RNPのより短い発現時間は、プラスミドと比較して少ないオフターゲット編集とも関連しており、この理由は、おそらくCas9タンパク質の活性持続が減少するからである。プラスミドは、ゲノム内にまたはCas9生成部位にランダムに組み入れられる可能性もある。後者の事象は、少なくとも予測および監視することができるが、前者は、検出するのが困難な可能性があり、より問題となる可能性がある。組入れ部位にかかわらず、これらの外来配列は、宿主免疫応答を引き起こす可能性があり、このことは、臨床適用における遺伝子編集された幹細胞または初代細胞の使用に関する難問となる。さらに、臨床適用のためにプラスミドをトランスフェクトされた細胞は、規制当局によって遺伝子改変されたと見なされ、それゆえに、時間および費用のかかる規制関連手順が必要となる。
本主題は、形質膜を通過したペイロードの、ベクター（例えば、無ウイルスベクター）なしでの送達を提供する。一部の態様では、送達は、発現ベクターを含まない。特に、物質の細胞内送達は、細胞（および／または細胞集団）をアルコールおよび送達物質（例えばペイロード）を含む水溶液と接触させることによって達成できることが発見された。アルコールは、膜を透過化するように作用して、ペイロードが膜を通過して移行できるようにする。しかし、細胞と接触する水溶液の体積が大きすぎる、および／または曝露が長すぎる時間で起こる場合、細胞への永続的なまたは激しい（例えば、不可逆的な）損傷が起こり得る（細胞生存率に不利に影響する）。逆に、細胞と接触する水溶液の体積が小さすぎる、および／または曝露が短すぎる時間で起こる場合、物質の細胞内送達は達成されない。したがって、細胞生存率を維持しながら形質膜を通過したペイロードの送達を達成するために、適切な体積の水溶液を適用することができ、および／または曝露の長さを制御することができる。
細胞集団と接触される水溶液の適切な体積は、意図される適用に基づき、例えば、集団中の細胞数、露出細胞表面積、細胞のサイズ、水溶液の構成、ペイロード、水溶液を細胞集団と接触させる技法などに基づき（例えばこれらの関数であり）、変動することができる。
送達プラットフォームは、ゲノム編集が達成されるようにCas9 RNPを細胞に送達するために使用される。
ベクターなしでのゲノム編集
送達プラットフォーム技法を使用してCas9 RNPを送達することによってゲノム編集を達成できるかどうかを判定するために、A549ヒト肺細胞株における標的遺伝子から領域を欠失させる戦略が考案されている（図1）。Cas9媒介切断に続いて非相同末端結合（NHEJ）が行われる。標的領域に隣接するPCRプライマーならびに参照およびドロップオフプローブとして作用する内部プローブを設計する。編集が好結果ならば、ddPCRアッセイは、編集された遺伝子のどこでドロップオフプローブが結合できず、参照プローブだけが結合するかを示す、小滴の分離をもたらす。
送達プラットフォーム技法を使用してCas9 RNPを送達することによってゲノム編集を達成できるかどうかを判定するために、A549ヒト肺細胞株における標的遺伝子から領域を欠失させる戦略が考案されている（図1）。Cas9媒介切断に続いて非相同末端結合（NHEJ）が行われる。標的領域に隣接するPCRプライマーならびに参照およびドロップオフプローブとして作用する内部プローブを設計する。編集が好結果ならば、ddPCRアッセイは、編集された遺伝子のどこでドロップオフプローブが結合できず、参照プローブだけが結合するかを示す、小滴の分離をもたらす。
2部分ガイドRNAおよびシングルガイドRNAを使用して2つのガイドRNAアプローチを採用する。2部分ガイドRNAアプローチについて、標的遺伝子内の選択された領域を標的化するために42bpのCRISPR RNA（crRNA）分子を設計する。69bpのトランス活性化crRNA（tracrRNAまたはtrRNA）も設計する。crRNAおよびtracrRNA分子を化学合成し、tracrRNA分子をFAMで標識する。実験のために、tracrRNAをcrRNAと共にインキュベートして、2部分ガイドRNA分子を形成させる。シングルガイドRNAアプローチについて、標的配列に対応するsgRNAをDNAテンプレートからインビトロ転写させる。
Cas9タンパク質を2部分ガイドRNAまたはシングルガイドRNAのいずれかと共にインキュベートすることにより、Cas9 RNPが形成される。
一般的な定義および一般的な技法
特に具体的に規定しないかぎり、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、および生化学における）によって一般に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
特に具体的に規定しないかぎり、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、および生化学における）によって一般に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
上記説明および特許請求の範囲において、「のうちの少なくとも1つ」または「のうちの1つまたは複数」のような語句は、要素または特徴の接続的な一覧の前に存在し得る。用語「および／または」も、2つ以上の要素または特徴の一覧の中に存在し得る。それが使用される文脈によって特に暗示的または明示的に否定されないかぎり、そのような語句は、一覧された要素もしくは特徴のいずれかを個別に、または記載された要素もしくは特徴のいずれかを他の記載された要素もしくは特徴のうちのいずれかと組み合わせて、意味することが意図される。例えば、語句「AおよびBのうちの少なくとも一方」、「AおよびBのうちの1つまたは複数」、ならびに「Aおよび／またはB」は、それぞれ「A単独、B単独、またはAおよびBを一緒に」を意味することが意図される。3つ以上の項目を含む一覧について類似の解釈も意図される。例えば、語句「A、B、およびCのうちの少なくとも1つ」、「A、B、およびCのうちの1つまたは複数」ならびに「A、B、および／またはC」は、それぞれ「A単独、B単独、C単独、AおよびBを一緒に、AおよびCを一緒に、BおよびCを一緒に、またはAおよびBおよびCを一緒に」を意味することが意図される。加えて、上記および特許請求の範囲における用語「基づく」の使用は、記載されていない特徴または要素も許容されるように「少なくとも一部基づく」を意味することが意図される。
数値または数値範囲に関連して本明細書に使用される用語「約」は、文脈がより限定された範囲を必要としないかぎり、記載または請求された数値または数値範囲の±10％を意味する。
パラメーターの範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数およびその10分1も本発明によって提供されることが理解される。例えば、「0.2～5mg」は、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mgなど～5.0mg以下までの開示である。ガイドRNA（gRNA）は、2つの形式で使用することができる：crRNAおよびtracrRNAをデュプレックスRNA（または「デュアルRNA」）の形態で使用することができるか、またはシングルガイドRNA（sgRNA）分子を作ることができる。本明細書に使用される「gRNA」は、CRISPR-CasシステムのガイドRNAを表す。用語「gRNA」は、crRNAとtracrRNAとの組合せ（デュアルRNA）またはcrRNAおよびtracrRNA配列の両方を含む単一RNA分子（sgRNA）を表し得る。
本明細書に使用される複合体は、非共有結合相互作用による分子の会合を意味する。例えば、複合体は、例えば水素結合により、相互に流体静力学的に会合した2つ以上の分子を含み得る。複合体の非限定的な例は、Casタンパク質およびgRNAを含むRNPである。
本明細書に使用される「遺伝子編集タンパク質」は、DNA分子の糖リン酸エステル骨格を切断するタンパク質または遺伝子発現を減少させるために十分な親和性で標的DNAと結合するタンパク質である。遺伝子発現を減少させるために十分な親和性で標的DNAと結合するタンパク質の非限定的な例は、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）、すなわちDNAを切断できないCas9である。dCas9の例は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質のD10AおよびH840A二重変異体である。
本明細書に使用される「発現ベクター」は、1つまたは複数のポリヌクレオチドの発現を引き起こすことが可能なDNAベクターまたはRNAベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核細胞性または真核細胞性のいずれかであることができ、典型的にはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、本明細書記載の原核細胞または真核細胞のうちの1つを含む、本発明の宿主細胞、例えばグラム陽性、グラム陰性、病原性、非病原性、共生、球状、桿状、もしくはらせん状の細菌細胞；古細菌細胞；または原生動物、藻、真菌、酵母、植物、動物、脊椎動物、無脊椎動物、節足動物、哺乳類、齧歯類、霊長類、またはヒト細胞において機能する（すなわち遺伝子発現を指令する）任意のベクターを含む。本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および宿主細胞と適合性であり、ポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列のような調節配列を含む。特に本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終止を制御する配列である。特に、重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列のような転写開始を制御する配列である。適切な転写制御配列は、本発明の細胞のうちの少なくとも1つにおいて機能することができる任意の転写制御配列を含む。様々なそのような転写制御配列は、当業者に公知である。好ましい態様では、方法は、核酸分子または構築物を送達するためのアデノウイルスのようなウイルスベクターの使用を含まない。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、複合体、または他の薬剤のようなペイロード組成物は、精製および／または単離し得る。具体的には、本明細書に使用される「単離された」または「精製された」化合物、核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または例えばタンパク質およびポリヌクレオチドを含む複合体は、それが一緒に自然に存在する他の細胞性物質、または組換え技法によって産生された場合の培養培地、または化学的に合成された場合の化学前駆物質もしくは他の化学物質を、実質的に有さない。精製された化合物は、関心対象の化合物が少なくとも60重量％（乾量）である。好ましくは、調製物は、関心対象の化合物が少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％である。例えば、精製された化合物は、所望の化合物が少なくとも90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％、または100％(w/w)の化合物である。純度は、任意の適切な標準方法、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA））は、その天然状態でそれに隣接する遺伝子または配列を有さない。単離または精製された核酸分子の例には、(a)天然のゲノムDNA分子の一部であるが、それが自然に存在する生物のゲノムにおける該分子のその一部に隣接する両側の核酸配列が隣接していないDNA；(b)結果として生じる分子が任意の天然のベクターまたはゲノムDNAと同一ではないような形で原核生物または真核生物のベクターまたはゲノムDNAに組み込まれる核酸；(c)cDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって産生されたフラグメント、または制限フラグメントのような別の分子；および(d)雑種遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列が含まれる。本発明による単離された核酸分子は、合成的に産生された分子ならびに化学的に変更されたおよび／または改変骨格を有する任意の核酸をさらに含む。
実施例1：本明細書記載のデータを生成させるために以下の材料および方法を使用した。
細胞および細胞培養
A549細胞（A549 European Collection of Cell Cultures （ECACC）をSigma-Aldrich Corp.（St. Louis, MO, USA）から購入（Cat No 86012804）し、Beas-2B（Sigma-Aldrich Corp Cat. No. 95102433）細胞を、5％ウシ胎児血清および2mM L-グルタミン（Gibco）を補充したDMEM（Gibco）中で日常的に培養した。Jurkat細胞（European Collection of Authenticated Cell Cultures； ECACC）を、10％(v/v) FBS（Sigma）、および1％(v/v) ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640（Gibco）に入れて37℃および5％CO2で増殖および維持した。初代ヒトPBMCを新たに単離し、10％(v/v)熱不活性化FBS、0.01％(v/v) 2-βメルカプトエタノール（lifesciences）および1％(v/v) L-グルタミンを補充したRPMI 1640（Gibco）中で、37℃および5％CO2で維持した。CD34+骨髄由来細胞（HSC）をLonzaから購入し、増殖因子SCF（25ng/ml）、TPO（50ng/ml）およびFLT-3（50ng/ml）を補充したHPMG造血性増殖培地（Lonza）中で増殖および維持した。培養物を37℃および5％CO2で1週間維持し、培地を3日毎に交換した。
細胞および細胞培養
A549細胞（A549 European Collection of Cell Cultures （ECACC）をSigma-Aldrich Corp.（St. Louis, MO, USA）から購入（Cat No 86012804）し、Beas-2B（Sigma-Aldrich Corp Cat. No. 95102433）細胞を、5％ウシ胎児血清および2mM L-グルタミン（Gibco）を補充したDMEM（Gibco）中で日常的に培養した。Jurkat細胞（European Collection of Authenticated Cell Cultures； ECACC）を、10％(v/v) FBS（Sigma）、および1％(v/v) ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640（Gibco）に入れて37℃および5％CO2で増殖および維持した。初代ヒトPBMCを新たに単離し、10％(v/v)熱不活性化FBS、0.01％(v/v) 2-βメルカプトエタノール（lifesciences）および1％(v/v) L-グルタミンを補充したRPMI 1640（Gibco）中で、37℃および5％CO2で維持した。CD34+骨髄由来細胞（HSC）をLonzaから購入し、増殖因子SCF（25ng/ml）、TPO（50ng/ml）およびFLT-3（50ng/ml）を補充したHPMG造血性増殖培地（Lonza）中で増殖および維持した。培養物を37℃および5％CO2で1週間維持し、培地を3日毎に交換した。
送達プラットフォームを使用した送達
送達システムは、送達器具、装置、または機器および透過化送達溶液を含む（図6に送達機構のグラフィック表示を示す）。送達装置は、プレートポジショナープラットフォーム上方の調整可能なx-y-z軸に保持された噴霧器を含む。噴霧器は、チュービングを介して5barコンプレッサーに接続されている。位置決めカラーは、ウェルにわたるスプレーのセンタリングを可能にし、プレートポジショナープラットフォームは、噴霧器下方にウェルを再現的にうまく位置決めできるようにする。ペイロードは、噴霧器の上面に位置する送達口にピペット注入され、スプレーアクチュエーターボタンを使用してスプレーが生成される。好ましい送達溶液は、分子研究用水（Sigma-Aldrich）中に32mMスクロース、12mM塩化カリウム、12mM酢酸アンモニウム、5mM HEPESおよび25％エタノール）、ならびに任意で2.5mM MgCl2を含む。エタノールの添加前に、溶液をpH7.4に調整し、フィルターを滅菌した。様々なペイロード体積の場合、それに応じて水の体積を調整した。
送達システムは、送達器具、装置、または機器および透過化送達溶液を含む（図6に送達機構のグラフィック表示を示す）。送達装置は、プレートポジショナープラットフォーム上方の調整可能なx-y-z軸に保持された噴霧器を含む。噴霧器は、チュービングを介して5barコンプレッサーに接続されている。位置決めカラーは、ウェルにわたるスプレーのセンタリングを可能にし、プレートポジショナープラットフォームは、噴霧器下方にウェルを再現的にうまく位置決めできるようにする。ペイロードは、噴霧器の上面に位置する送達口にピペット注入され、スプレーアクチュエーターボタンを使用してスプレーが生成される。好ましい送達溶液は、分子研究用水（Sigma-Aldrich）中に32mMスクロース、12mM塩化カリウム、12mM酢酸アンモニウム、5mM HEPESおよび25％エタノール）、ならびに任意で2.5mM MgCl2を含む。エタノールの添加前に、溶液をpH7.4に調整し、フィルターを滅菌した。様々なペイロード体積の場合、それに応じて水の体積を調整した。
接着細胞への送達のために、送達時に細胞が集密度70～95％に達する密度で、48ウェルまたは96ウェル培養プレート（Nunc）に播種した（別の例では、1、6、9、12、24、48、96、384、および1536個より選択される試料ウェルを有する培養プレートが使用される場合がある）。上清を標的ウェルから除去し、プレートをプレートポジショナープラットフォーム上に置き、x-y-z軸を使用して、噴霧器を細胞単層に向いたスプレーヘッドから31mmの距離に位置づけた。送達溶液10μlを細胞にスプレーした。室温で2分後に、マイクロピペットを使用して0.5×PBS 100μlを細胞上に添加し、細胞を室温で30秒間インキュベートし（48ウェル培養プレートについて）；96ウェルプレートを使用している場合は、0.5×PBS 50μlを細胞に添加した。0.5×PBS溶液を除去し、新たな培養培地100μlを添加した。3時間後、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを各ウェルに添加した。ダブルスプレーの場合、第1のスプレー処理から1～5時間（例えば、2時間または好ましくは4時間）インキュベートした後に手順を繰り返した。次に、細胞を3時間インキュベートし、その後抗生物質を添加した。
懸濁細胞への送達のために、細胞1.0×106個を0.4μmポリエステルメンブランインサート（Corning）に入れた。インサートを施設内の真空機器内に置き、-0.5bar～-0.68barの真空を適用して、培養培地を除去した。次に、インサートを12ウェルプレートに入れ、鼻腔用スプレーヘッドの下方に位置づけた。接着細胞について記載したようにスプレー手順を実施し、新たな培養培地が添加されたときに、細胞を新たな培養プレートに移した。
sgRNAのインビトロ転写
Agilent（Santa Clara, CA） Sure Guideインビトロ転写キットを製造業者のガイドラインに沿って使用して、sgRNAのインビトロ転写を実施した。
Agilent（Santa Clara, CA） Sure Guideインビトロ転写キットを製造業者のガイドラインに沿って使用して、sgRNAのインビトロ転写を実施した。
Cas9 RNPの集合および送達
組換えCas9タンパク質をToolGen, IncおよびIDT-DNAから購入した。SureGuide IVTキット（Agilent）を製造業者のガイドラインに沿って使用してガイドRNAを生成させた。pCas9-GFP-382a2-384プラスミドをアッセイにおいて陽性対照として使用した。このプラスミドは、CAS9-GFPおよび2つのgRNAを含んでいた。Cas9タンパク質（1ug～20ug）をインビトロ転写されたgRNA（1ug～20ug）と予め混合し、複合体を室温で10分間インキュベートした。RNP複合体を送達溶液（1×S緩衝液 25％EtOH）に添加し、送達プラットフォームを使用して細胞内に送達した。RGENのプラスミド媒介発現のために、Lipofectamine 2000を使用して細胞1×105個にpCas9-GFP-382a2-384をトランスフェクトした。
組換えCas9タンパク質をToolGen, IncおよびIDT-DNAから購入した。SureGuide IVTキット（Agilent）を製造業者のガイドラインに沿って使用してガイドRNAを生成させた。pCas9-GFP-382a2-384プラスミドをアッセイにおいて陽性対照として使用した。このプラスミドは、CAS9-GFPおよび2つのgRNAを含んでいた。Cas9タンパク質（1ug～20ug）をインビトロ転写されたgRNA（1ug～20ug）と予め混合し、複合体を室温で10分間インキュベートした。RNP複合体を送達溶液（1×S緩衝液 25％EtOH）に添加し、送達プラットフォームを使用して細胞内に送達した。RGENのプラスミド媒介発現のために、Lipofectamine 2000を使用して細胞1×105個にpCas9-GFP-382a2-384をトランスフェクトした。
ウエスタンブロッティング
細胞を剥離して氷冷1×PBS溶液中に入れ、2200rpmで5分間遠心分離した。ペレットを放射性免疫沈降（RIPA）緩衝液（Sigma, Dublin）中に溶解し、タンパク質25mgを4～20％ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。ゲル電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースメンブラン上に移し、5％ミルク／1×TBS 0.1％Tween-20（Sigma, Dublin）中でブロッキングした。一次抗体を用いてメンブランを4℃で一晩プローブした後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに連結された二次抗体を室温で1時間適用した。ECL検出システム（Gbox, Syngene, Cambridge UK）を使用してゲルの視覚化を実施した。使用した一次抗体は、抗cas9（Abcam, Cambridge UK）、GAPDH（Sigma, Dublin）を含む。
細胞を剥離して氷冷1×PBS溶液中に入れ、2200rpmで5分間遠心分離した。ペレットを放射性免疫沈降（RIPA）緩衝液（Sigma, Dublin）中に溶解し、タンパク質25mgを4～20％ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。ゲル電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースメンブラン上に移し、5％ミルク／1×TBS 0.1％Tween-20（Sigma, Dublin）中でブロッキングした。一次抗体を用いてメンブランを4℃で一晩プローブした後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに連結された二次抗体を室温で1時間適用した。ECL検出システム（Gbox, Syngene, Cambridge UK）を使用してゲルの視覚化を実施した。使用した一次抗体は、抗cas9（Abcam, Cambridge UK）、GAPDH（Sigma, Dublin）を含む。
免疫蛍光法
Millipore製抗Cas9抗体を1/200希釈で使用して免疫蛍光法を実施した。
Millipore製抗Cas9抗体を1/200希釈で使用して免疫蛍光法を実施した。
編集のためのPCRアッセイ
PCRのために使用した反応混合物は、H2O 30.5μl、5×緩衝液10μl、25mM MgCl2 5μl、10mM dNTP 1μl、10μMプライマーF 1μl、10μMプライマーR 1μl、Taqポリメラーゼ 0.5μl、DNA 1μl、総体積50μlであった。
35サイクルを使用した。
95℃：120秒（s）
------------
95℃：30s
55℃：30s ×35
72℃：45s
-----------
72℃：5分
PCRのために使用した反応混合物は、H2O 30.5μl、5×緩衝液10μl、25mM MgCl2 5μl、10mM dNTP 1μl、10μMプライマーF 1μl、10μMプライマーR 1μl、Taqポリメラーゼ 0.5μl、DNA 1μl、総体積50μlであった。
35サイクルを使用した。
95℃：120秒（s）
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95℃：30s
55℃：30s ×35
72℃：45s
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72℃：5分
生存能アッセイ
アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム（PI）アポトーシス検出キット（eBioscience）を製造業者のプロトコールに沿って用いて、Jurkat細胞における生存率およびアポトーシスマーカーの存在を分析した。細胞を1×結合緩衝液中で1回洗浄し、1×結合緩衝液に細胞濃度1～5×106個/mlで再懸濁した。APCコンジュゲート型アネキシンVを細胞懸濁液100μlに添加した。細胞を蛍光色素と共に暗条件において室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1×結合緩衝液で洗浄し、1×結合緩衝液100μlに再懸濁した。PI 5μlを細胞に添加した。染色から4時間以内に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。生存可能細胞およびアポトーシス細胞のパーセンテージを計算し、グラフ化した。
アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム（PI）アポトーシス検出キット（eBioscience）を製造業者のプロトコールに沿って用いて、Jurkat細胞における生存率およびアポトーシスマーカーの存在を分析した。細胞を1×結合緩衝液中で1回洗浄し、1×結合緩衝液に細胞濃度1～5×106個/mlで再懸濁した。APCコンジュゲート型アネキシンVを細胞懸濁液100μlに添加した。細胞を蛍光色素と共に暗条件において室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1×結合緩衝液で洗浄し、1×結合緩衝液100μlに再懸濁した。PI 5μlを細胞に添加した。染色から4時間以内に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。生存可能細胞およびアポトーシス細胞のパーセンテージを計算し、グラフ化した。
活性化マーカーの分析
24ウェルプレート中のJurkat細胞を5μg/ml PHAで4hrおよび24hr刺激した。活性化マーカーCD25およびCD69の表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、FAC緩衝液に細胞1×106個/mlの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液100μlをCD25 APC（eBioscience）およびCD69 PE（eBioscience）またはアイソタイプ対照で4℃の暗条件下で15分間染色した。500μlを添加して細胞を洗浄し、細胞をFACs緩衝液100μlに再懸濁し、BD Accuri C6フローサイトメーターで分析した。
24ウェルプレート中のJurkat細胞を5μg/ml PHAで4hrおよび24hr刺激した。活性化マーカーCD25およびCD69の表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、FAC緩衝液に細胞1×106個/mlの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液100μlをCD25 APC（eBioscience）およびCD69 PE（eBioscience）またはアイソタイプ対照で4℃の暗条件下で15分間染色した。500μlを添加して細胞を洗浄し、細胞をFACs緩衝液100μlに再懸濁し、BD Accuri C6フローサイトメーターで分析した。
インビトロ編集アッセイにおいて送達溶液組成物がCas9 RNPの活性に及ぼす影響
送達溶液組成物がCas9タンパク質の活性に及ぼす影響を最初にインビトロアッセイで分析した。Cas9タンパク質（Toolgen; Seoul, South Korea製）を、キット緩衝液（溶液A、表1）と一緒にAgilentキットに供給されている対照gRNAおよび対照プラスミドと共にインキュベートした。切断産物を観察した（図2）。
送達溶液組成物がCas9タンパク質の活性に及ぼす影響を最初にインビトロアッセイで分析した。Cas9タンパク質（Toolgen; Seoul, South Korea製）を、キット緩衝液（溶液A、表1）と一緒にAgilentキットに供給されている対照gRNAおよび対照プラスミドと共にインキュベートした。切断産物を観察した（図2）。
次に、キット緩衝液を送達溶液（エタノールなし）により置換する影響を判定した（溶液B、表1）。送達産物は観察されなかった（図3）。
（表１）インビトロ編集用の緩衝液の組成
送達溶液の効果を判定するために実験を実施した。様々な異なる送達溶液：キット緩衝液を使用した。最大でS緩衝液1.5μl：キット緩衝液0.5μlまでのある特定の送達溶液の比で切断が起こったことが見出された（表2および図4）。したがって、送達溶液／反応緩衝液にMgCl2を添加する効果を検討した（溶液C、表1）。溶液Bへの1.25mM MgCl2の添加は、切断反応を起こさせた（図5）。一部の切断は、MgCl2の非存在下で起こることができるが、これは最適以下であり、一貫していないように見える。したがって、この点から送達溶液に2.5mM MgCl2を含ませた。望ましい送達溶液は、32mMスクロース、12mM KCl、12mM酢酸アンモニウム、5mM HEPES、2.5mM MgCl2、15％エタノール、および85％H2Oを含む。
（表２）Agilentキット緩衝液を送達溶液（10×S緩衝液）と様々な比で混合した場合のインビトロ編集のための緩衝液の組成
15％エタノールを含有し、2.5mM MgCl2を補充された送達プラットフォーム溶液がレポーターペイロード、Ovalbumin-FITC（OVA-FITC）を送達する効率を検討した。驚くことに、OVA-FITCの送達は、MgCl2を有さない送達溶液と比較して2.5mM MgCl2を含有する送達溶液の方が増強したようであった（図8）。
したがって、その後の研究について、2.5mM MgCl2を補充した15％エタノールを含有する送達溶液中でCas9 RNPを送達した。
Cas9タンパク質の送達および発現の時間経過
Cas9は、通常、Cas9タンパク質をコードするDNAの形態で送達される。しかし、DNAは、細胞中に数日間から数ヶ月間残存する可能性があり、これは、酵素が細胞における非特異的部位を切断するオフターゲット効果をもたらす可能性がある。タンパク質形態のCas9を送達することは、酵素の発現持続時間の減少を招き、したがって減少したオフターゲット効果を招くことが示唆されている。gRNAを有さない精製組換えCas9タンパク質を、送達プラットフォームを使用してA549細胞に送達することができたかどうかを。プラスミド媒介発現と比較した発現の持続時間も検討した。Cas9タンパク質（5μg）をA549細胞に送達し、発現を細胞溶解物のウエスタンブロット分析により検討した。送達の1時間時間後に細胞からCas9タンパク質が検出され、その後、レベルは減少した（図9）。対照的に、Cas9をコードするプラスミドを細胞にリポフェクションしたとき、6時間よりも前に発現は観察されず、24時間目に強い発現が観察された（図9）。
Cas9は、通常、Cas9タンパク質をコードするDNAの形態で送達される。しかし、DNAは、細胞中に数日間から数ヶ月間残存する可能性があり、これは、酵素が細胞における非特異的部位を切断するオフターゲット効果をもたらす可能性がある。タンパク質形態のCas9を送達することは、酵素の発現持続時間の減少を招き、したがって減少したオフターゲット効果を招くことが示唆されている。gRNAを有さない精製組換えCas9タンパク質を、送達プラットフォームを使用してA549細胞に送達することができたかどうかを。プラスミド媒介発現と比較した発現の持続時間も検討した。Cas9タンパク質（5μg）をA549細胞に送達し、発現を細胞溶解物のウエスタンブロット分析により検討した。送達の1時間時間後に細胞からCas9タンパク質が検出され、その後、レベルは減少した（図9）。対照的に、Cas9をコードするプラスミドを細胞にリポフェクションしたとき、6時間よりも前に発現は観察されず、24時間目に強い発現が観察された（図9）。
Cas9タンパク質は、BEAS-2B細胞、Jurkat細胞、ヒトPBMCおよびHSCにも好結果に送達された（表3）。
（表３）Cas9タンパク質が好結果に送達された細胞型
Cas9タンパク質の送達
CRISPR/Cas9のウイルス送達では、送達される編集ツールの用量を制御することが困難な可能性がある。したがって、送達プラットフォーム技法がCas9タンパク質の漸増する用量を送達することができたかどうかを検討した。
CRISPR/Cas9のウイルス送達では、送達される編集ツールの用量を制御することが困難な可能性がある。したがって、送達プラットフォーム技法がCas9タンパク質の漸増する用量を送達することができたかどうかを検討した。
漸増する濃度のCas9タンパク質がA549およびJurkat細胞に送達された場合に用量反応が見られた（図10AおよびB）。
Cas9タンパク質およびRNPの送達 - 細胞内局在
Cas9 RNPは核内で機能するので、送達プラットフォームを用いた送達後のCas9タンパク質およびCas9 RNPの細胞内局在を決定した。Cy3標識Cas9およびFAM標識デュアルRNAを使用して、蛍光顕微鏡観察によりCas9およびRNPの局在を検討した。加えて、抗Cas9抗体を使用する免疫蛍光法によってCas9を検出した。
Cas9 RNPは核内で機能するので、送達プラットフォームを用いた送達後のCas9タンパク質およびCas9 RNPの細胞内局在を決定した。Cy3標識Cas9およびFAM標識デュアルRNAを使用して、蛍光顕微鏡観察によりCas9およびRNPの局在を検討した。加えて、抗Cas9抗体を使用する免疫蛍光法によってCas9を検出した。
送達プラットフォームを使用してA549細胞にCas9-Cy3タンパク質1ugを送達した。送達の1時間後に、Cas9は細胞の細胞質全体および核内に観察された（図11A）。
送達プラットフォームを使用して未標識Cas9タンパク質10ugをA549細胞に送達し、抗Cas9抗体を使用する免疫蛍光法によってCas9を検出した。送達の1時間後に、Cas9は細胞の細胞質全体および核内に観察された（図11B）。染色パターンは、Cas9-Cy3について観察されたパターンと類似していた。送達プラットフォームを使用してA549細胞に100uM sgRNA1-FAMを送達した。送達の1時間後に、sgRNA1-FAMは細胞の細胞質全体および核内に観察された（図11C）。
次に、A549細胞に送達後のRNPの局在を調査した。未標識Cas9をsgRNA1-FAMと複合体化し、送達プラットフォームを使用して送達した。送達の1時間後に、sgRNA1-FAMは細胞の細胞質全体および核内に観察された（図11D）。染色パターンは、図11Cに示すsgRNA1-FAMのパターンよりも多く「スペックル」を形成しているように見え、これは、sgRNAが実際にCas9と複合体化したことを示している。
次に、抗Cas9抗体を使用する免疫蛍光法によってRNPの局在を調査した。未標識Cas9をsgRNA1-FAMと複合体化し、送達プラットフォームを使用して送達した。送達の1時間後に、Cas9は細胞の細胞質全体および核内に観察された（図11E）。染色パターンは、予想通り図11Dに示すパターンと類似していた。
Jurkat細胞、PMBCおよびHSCへの、送達プラットフォームを介した送達の効果
臨床適用のためには、送達プロトコールおよびトランスフェクションプロトコールの後に細胞によって高い率の生存率および機能性が維持されていることが重要である。送達プラットフォーム技法がJurkat細胞、PBMCおよびHSCの生存率に及ぼす効果を検討した。プラットフォームを介した送達の効果の分析のために、ペイロードを有さない送達溶液をJurkat細胞、ヒトPBMCおよびHSCに送達した。送達後の細胞生存率をアネキシンV／ヨウ化プロピジウム（PI）染色によって調査した。細胞生存率は、未処理対照と比較して減少が最小限であった（図12）。追加的に、GFP mRNAは初代NK細胞に送達され（図7）、細胞は生存率96.6％を有した。
臨床適用のためには、送達プロトコールおよびトランスフェクションプロトコールの後に細胞によって高い率の生存率および機能性が維持されていることが重要である。送達プラットフォーム技法がJurkat細胞、PBMCおよびHSCの生存率に及ぼす効果を検討した。プラットフォームを介した送達の効果の分析のために、ペイロードを有さない送達溶液をJurkat細胞、ヒトPBMCおよびHSCに送達した。送達後の細胞生存率をアネキシンV／ヨウ化プロピジウム（PI）染色によって調査した。細胞生存率は、未処理対照と比較して減少が最小限であった（図12）。追加的に、GFP mRNAは初代NK細胞に送達され（図7）、細胞は生存率96.6％を有した。
生存率と効率との比較：エタノールスプレー送達をNeonエレクトロポレーターと比べる
Cas9 RNPを細胞にインビトロ送達するためにエレクトロポレーションが使用されている（Kim et al., (2014) Genome Res 24(6):1012-9; Lin et al., (2014) eLife 15;3:e04766; Liang et al., (2015) J Biotechnol 20;208:44-53; Schumann et al., (2015) Proc Natl Acad Sci USA 18;112(33):10437-42）。しかし、エレクトロポレーションは、T細胞および幹細胞を含む臨床的に関連する細胞の生存率および機能に影響することが公知である。したがって、プラットフォームを介した送達の効果をエレクトロポレーションの効果と比較した。他のグループによって使用されているNeonエレクトロポレーションを使用した（Liang et al., (2015) J Biotechnol 20;208:44-53; Schumann et al., (2015) Proc Natl Acad Sci USA 18;112(33):10437-42）。
Cas9 RNPを細胞にインビトロ送達するためにエレクトロポレーションが使用されている（Kim et al., (2014) Genome Res 24(6):1012-9; Lin et al., (2014) eLife 15;3:e04766; Liang et al., (2015) J Biotechnol 20;208:44-53; Schumann et al., (2015) Proc Natl Acad Sci USA 18;112(33):10437-42）。しかし、エレクトロポレーションは、T細胞および幹細胞を含む臨床的に関連する細胞の生存率および機能に影響することが公知である。したがって、プラットフォームを介した送達の効果をエレクトロポレーションの効果と比較した。他のグループによって使用されているNeonエレクトロポレーションを使用した（Liang et al., (2015) J Biotechnol 20;208:44-53; Schumann et al., (2015) Proc Natl Acad Sci USA 18;112(33):10437-42）。
ウシ血清アルブミン-FITC（BSA-FITC）をJurkat細胞に送達し、送達の24時間後に生存率を決定した。送達プラットフォームを用いたとき、生存率は、未処理対照での81％からBSA-FITCを受け入れた細胞における65％に減少した（図13A）。対照的に、BSA-FITCがエレクトロポレーションによって細胞に送達された場合、生存レベルは8％に下がった。緩衝液のみ（BSA-FITCなし）を送達した場合、生存率に類似の減少が見られた。
スプレーの24時間後にBSA-FITCの送達効率をフローサイトメトリーによって調査した。送達プラットフォームを用いたとき、生存可能細胞65％のうち34％がBSA-FITC陽性であった（図13B）。エレクトロポレーションを用いたとき、生存可能細胞8％のうち62％がBSA-FITC陽性であった。したがって、本来の出発集団のうち、プラットフォームを介した送達後の細胞の22％およびエレクトロポレーション後の細胞の5％にBSA-FITCが存在した。
送達プラットフォーム技法を介した送達が初代Jurkat細胞の機能性に及ぼす効果
次に、プラットフォームを介した送達がJurkat細胞の機能性に及ぼす効果を検討した。送達プラットフォームを使用して細胞にだけスプレー緩衝液を送達した。CD69およびCD25は、それぞれT細胞活性化の初期および後期細胞表面マーカーである。送達プラットフォームを使用して、ペイロードを有さない送達溶液（スプレー緩衝液のみ、SBO）を細胞に送達した。細胞をPHAで刺激し、それぞれ刺激の4時間後および24時間後にフローサイトメトリーによってCD69およびCD25の発現を測定した。処理された細胞においてCD69およびCD25のアップレギュレーションが観察された（図14）。
次に、プラットフォームを介した送達がJurkat細胞の機能性に及ぼす効果を検討した。送達プラットフォームを使用して細胞にだけスプレー緩衝液を送達した。CD69およびCD25は、それぞれT細胞活性化の初期および後期細胞表面マーカーである。送達プラットフォームを使用して、ペイロードを有さない送達溶液（スプレー緩衝液のみ、SBO）を細胞に送達した。細胞をPHAで刺激し、それぞれ刺激の4時間後および24時間後にフローサイトメトリーによってCD69およびCD25の発現を測定した。処理された細胞においてCD69およびCD25のアップレギュレーションが観察された（図14）。
実施例2：遺伝子編集ツールの機能を試験するためのインビトロ編集アッセイの確立および送達溶液が遺伝子編集ツールの機能に及ぼす効果
遺伝子編集のCrispr Cas9システムは、広く採用されている。しかし、大部分の使用者は、DNAプラスミド形態のCas9をガイドRNAと組み合わせて利用している。RNPバージョンのシステムを送達することは、より一過性であり、したがって、より少ないオフターゲット効果をもたらすはずであったので、これは関心対象であった。必須のツール（組換えCas9ヌクレアーゼ、一本鎖ガイド、2部分ガイド）が、最近市販されるようになった。文献に報告された対応するプラスミド配列に基づいて、オーダーメイドのガイドRNA配列を設計した。試薬の品質をチェックするために検証アッセイを行った。遺伝子編集ツールを評価するために、Agilent Sure Guide Cas9 Programmable Nuclease Kitのインビトロ編集試験に基づくアッセイを開発した。このアッセイでは、Cas9タンパク質をガイド（一本鎖または2部分）と一緒にインキュベートして、RNPを形成させた。次に、このRNPを、標的部位を含んでいた精製長のDNA（約250～750bp）と共にインキュベートした。編集が好結果ならば、編集の結果としてDNAの2つの鎖が生成し、そのことは、アガロースDNAゲルで分離した後に明らかになる。このアッセイは、2つの目的に役立つ：第1に、このアッセイは、遺伝子編集ツールの機能性をチェックするための品質管理アッセイとして役立ち、第2に、このアッセイは、送達溶液が遺伝子編集ツールに及ぼす効果、特にCas9/RNP活性に及ぼす効果を判定するために役立つ。後者の目的のために、Cas9またはRNPの溶液を送達溶液中に調製し、スプレーし、次にスプレーされた溶液のアリコットを集め、編集アッセイに使用した。
遺伝子編集のCrispr Cas9システムは、広く採用されている。しかし、大部分の使用者は、DNAプラスミド形態のCas9をガイドRNAと組み合わせて利用している。RNPバージョンのシステムを送達することは、より一過性であり、したがって、より少ないオフターゲット効果をもたらすはずであったので、これは関心対象であった。必須のツール（組換えCas9ヌクレアーゼ、一本鎖ガイド、2部分ガイド）が、最近市販されるようになった。文献に報告された対応するプラスミド配列に基づいて、オーダーメイドのガイドRNA配列を設計した。試薬の品質をチェックするために検証アッセイを行った。遺伝子編集ツールを評価するために、Agilent Sure Guide Cas9 Programmable Nuclease Kitのインビトロ編集試験に基づくアッセイを開発した。このアッセイでは、Cas9タンパク質をガイド（一本鎖または2部分）と一緒にインキュベートして、RNPを形成させた。次に、このRNPを、標的部位を含んでいた精製長のDNA（約250～750bp）と共にインキュベートした。編集が好結果ならば、編集の結果としてDNAの2つの鎖が生成し、そのことは、アガロースDNAゲルで分離した後に明らかになる。このアッセイは、2つの目的に役立つ：第1に、このアッセイは、遺伝子編集ツールの機能性をチェックするための品質管理アッセイとして役立ち、第2に、このアッセイは、送達溶液が遺伝子編集ツールに及ぼす効果、特にCas9/RNP活性に及ぼす効果を判定するために役立つ。後者の目的のために、Cas9またはRNPの溶液を送達溶液中に調製し、スプレーし、次にスプレーされた溶液のアリコットを集め、編集アッセイに使用した。
材料
Agilent Sure Guide Cas9ヌクレアーゼキット：キットは、Cas9ヌクレアーゼ、対照DNA標的、対照gRNA、10×Cas9消化緩衝液（Agilent）およびRNアーゼ不含水を提供した。対照反応のための最適化された体積を表4に挙げる。様々なgRNAおよびDNA標的を合成するか、またはIDT-DNA Cas9（IDT-DNA）が提供した。送達溶液は、本明細書に記載されている。
Agilent Sure Guide Cas9ヌクレアーゼキット：キットは、Cas9ヌクレアーゼ、対照DNA標的、対照gRNA、10×Cas9消化緩衝液（Agilent）およびRNアーゼ不含水を提供した。対照反応のための最適化された体積を表4に挙げる。様々なgRNAおよびDNA標的を合成するか、またはIDT-DNA Cas9（IDT-DNA）が提供した。送達溶液は、本明細書に記載されている。
インビトロ編集（IVE）アッセイ：遺伝子編集ツールの機能を試験する
このアッセイは、Agilent Sure Guide Cas9ヌクレアーゼキットに基づいた。各成分について最適化された体積を表4に挙げる。手順を検証するために、DNA標的、gRNAおよびCas9がキットに提供された。氷上に保った全ての成分を表4記載の比率で、サーモサイクラーに適した試験管に添加した。次に、30℃に予熱したサーモサイクラーにチューブを移動させた。以下のプログラムを実行した。
・30℃で30分
・65℃で15分
・4℃で維持
このアッセイは、Agilent Sure Guide Cas9ヌクレアーゼキットに基づいた。各成分について最適化された体積を表4に挙げる。手順を検証するために、DNA標的、gRNAおよびCas9がキットに提供された。氷上に保った全ての成分を表4記載の比率で、サーモサイクラーに適した試験管に添加した。次に、30℃に予熱したサーモサイクラーにチューブを移動させた。以下のプログラムを実行した。
・30℃で30分
・65℃で15分
・4℃で維持
次に、消化された試料をゲル電気泳動によって分析し、サイズが予想されるDNAフラグメントに対応する追加的なDNAバンドが存在することによって好結果の編集を確認した。このアッセイにより、これらの研究に使用した組換えCas9タンパク質および様々なガイドRNAが機能的であることが確認された。
（表４）IVE反応のための成分の体積*
試験した全てのgRNAおよび対応する標的DNAをここに挙げる：標的DNAがpCMV EGFRのsun sgGFP RNA、標的DNAがEGFPのsgRNA EGFP4、標的としてHRT1 DNAを有するsgHPRT1、標的DNAとしてAAVS1を有するsgAAVS1 T1、sgAAVS1 T2およびAAVS1 T3。
送達溶液が機能的遺伝子編集ツールに及ぼす効果を試験する
このアッセイでは、送達溶液およびスプレー手順のCas9およびRNPの機能性に及ぼす効果を研究するために、IVEプロトコールを採用した。そのために、単独の、またはRNP（gRNAと複合体化したCas9）としてのCas9を最初に送達溶液中に調製し、次に、それをIVEのために使用するか、またはそれをスプレーしてからIVEのために集めた。編集が起こったことにより、RNPの成分が標的DNA配列を切断できたことが確認され、それゆえに、送達溶液中にエタノールおよび他の化学物質が存在するにもかかわらず、RNPの成分は機能的であった。
このアッセイでは、送達溶液およびスプレー手順のCas9およびRNPの機能性に及ぼす効果を研究するために、IVEプロトコールを採用した。そのために、単独の、またはRNP（gRNAと複合体化したCas9）としてのCas9を最初に送達溶液中に調製し、次に、それをIVEのために使用するか、またはそれをスプレーしてからIVEのために集めた。編集が起こったことにより、RNPの成分が標的DNA配列を切断できたことが確認され、それゆえに、送達溶液中にエタノールおよび他の化学物質が存在するにもかかわらず、RNPの成分は機能的であった。
送達溶液中のCas9またはRNPの溶液を表5に報告したように作製した。S緩衝液および水を添加する前に、Cas9をgRNAと共に15分間インキュベートすることによってRNPを形成させた。さらに、比較目的で、対応する試料を水に溶かして作製した。複合体を作製するために、モル比1:1のCas9/gRNAを使用した。Cas9のみの溶液の場合、IVE反応を実施したときにgRNAが提供された（表6参照）。
（表５）Cas9溶液またはRNP溶液の組成
エタノール以外の全ての成分を試験管に添加し、10分間インキュベートした。次に、エタノールを添加した。各溶液について、表6および表7によるIVE試験のために、アリコット1μl（Cas9溶液）または2μl（RNP）を試験管に移した。スプレー工程がRNP活性に及ぼす効果を試験するために、他のアリコット10μlを48ウェルプレートの空のウェルにスプレーし、スプレーの後に溶液1μlまたは2μlを集め、PCR試験管に移した。IVEについては、表6および表7を参照されたい。試料を上述のように消化させ、次にアガロースゲル電気泳動法により分析した。ゲルの典型的な画像を図17に提供する。
（表６）反応1回あたりの成分の体積、Agilent Cas9緩衝液
（表７）反応1回あたりの成分の体積、Agilent Csa9緩衝液
実施例3：細胞内送達の視覚化のためのCas9と蛍光標識とのコンジュゲーション
送達プラットフォーム技法を用いた送達の後にCas9が細胞に進入していたかどうかを分析するために、タンパク質を蛍光標識とコンジュゲーションすることを探究した。アミン基を標的化するCas9標識方法は、その物理化学的性質が原因でCas9の沈殿をもたらすので、避けなければならない。したがって、システインのチオール基を経由してCas9を蛍光タグAlexa-488マレイミドで標識した（タンパク質1分子あたり2個のシステイン残基）。この反応は、生理pHでタンパク質の全体的な電荷を変更しなかった。その後の実験プロトコールは、以前の研究に基づいた（Zuris, JA et al., Nat Biotechnol 2015; 33(1) 73-80）。
送達プラットフォーム技法を用いた送達の後にCas9が細胞に進入していたかどうかを分析するために、タンパク質を蛍光標識とコンジュゲーションすることを探究した。アミン基を標的化するCas9標識方法は、その物理化学的性質が原因でCas9の沈殿をもたらすので、避けなければならない。したがって、システインのチオール基を経由してCas9を蛍光タグAlexa-488マレイミドで標識した（タンパク質1分子あたり2個のシステイン残基）。この反応は、生理pHでタンパク質の全体的な電荷を変更しなかった。その後の実験プロトコールは、以前の研究に基づいた（Zuris, JA et al., Nat Biotechnol 2015; 33(1) 73-80）。
材料
Cas9をToolgen Genome Engineering（South Korea）またはIDT Integrated DNA Technologies（USA）のいずれかから購入した。TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、Hepes、グリセロールおよびKClは、分析等級であり、Sigma Aldrichから購入した。Alexa 488マレイミド（Mw720.66g/mol）をThermo Fisher Scientificから購入し、粉末1mgとして受領した。粉末にDMSO 139μlを添加することによって10mM原液を調製した。原液を-20℃で保存した。タンパク質の沈殿を避けるために、DMSOの終濃度が10％以下になるようにAlexa 488マレイミド溶液をCas9溶液に添加しなければならない。12.5μM Cas9について、20倍モル過剰は、250μM Alexa色素に対応し、それは、250μl中に10mM原液の体積6.25μlに対応した。作製したタンパク質溶液250μlの全てを使用するために、色素原液6.25μlをCas9溶液250μlに添加して、最終体積256.25μlとした（DMSOは2.5％であったので、タンパク質の沈殿を誘導する10％の限界を十分下回る）。サイズ排除ゲルクロマトグラフィーのためにSephadex G-25（Sigma-Aldrich）を利用した。溶離緩衝液は、250mM KCl、20mM Hepes（pH7.8）を含有した。
Cas9をToolgen Genome Engineering（South Korea）またはIDT Integrated DNA Technologies（USA）のいずれかから購入した。TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、Hepes、グリセロールおよびKClは、分析等級であり、Sigma Aldrichから購入した。Alexa 488マレイミド（Mw720.66g/mol）をThermo Fisher Scientificから購入し、粉末1mgとして受領した。粉末にDMSO 139μlを添加することによって10mM原液を調製した。原液を-20℃で保存した。タンパク質の沈殿を避けるために、DMSOの終濃度が10％以下になるようにAlexa 488マレイミド溶液をCas9溶液に添加しなければならない。12.5μM Cas9について、20倍モル過剰は、250μM Alexa色素に対応し、それは、250μl中に10mM原液の体積6.25μlに対応した。作製したタンパク質溶液250μlの全てを使用するために、色素原液6.25μlをCas9溶液250μlに添加して、最終体積256.25μlとした（DMSOは2.5％であったので、タンパク質の沈殿を誘導する10％の限界を十分下回る）。サイズ排除ゲルクロマトグラフィーのためにSephadex G-25（Sigma-Aldrich）を利用した。溶離緩衝液は、250mM KCl、20mM Hepes（pH7.8）を含有した。
Cas9を標識する手順
標識緩衝液197μl（20mM Hepes（pH7.8）；250mM KCl；グリセロール50μl（63.1mg）；10mM TCEP 3μl（10倍モル過剰））中にCas9 0.5mgを溶解して、2mg/ml Cas9溶液（12.5μM）を作製した。溶液をアルゴンで脱酸素した。ピペッティングで上下に撹拌しながら、20モル過剰のマレイミドのDMSO溶液を滴下した。混合物をAr雰囲気中で4℃で一晩インキュベートした（Zuris et al.Nat Bitoechnol 2015 33(1): 73-80）。注：KCl濃度は、最終体積250μl中に200mMになり、塩KClおよびグリセロールは、Cas9を溶液状態に保つのを助ける。TCEPは、生化学および分子生物学の応用に頻繁に使用される還元剤である。TCEPは、システインがジスルフィド結合を形成することから守ることができ、ジチオスレイトールおよびβ-メルカプトエタノールと異なり、マレイミド残基と同じように容易に反応することはない。
標識緩衝液197μl（20mM Hepes（pH7.8）；250mM KCl；グリセロール50μl（63.1mg）；10mM TCEP 3μl（10倍モル過剰））中にCas9 0.5mgを溶解して、2mg/ml Cas9溶液（12.5μM）を作製した。溶液をアルゴンで脱酸素した。ピペッティングで上下に撹拌しながら、20モル過剰のマレイミドのDMSO溶液を滴下した。混合物をAr雰囲気中で4℃で一晩インキュベートした（Zuris et al.Nat Bitoechnol 2015 33(1): 73-80）。注：KCl濃度は、最終体積250μl中に200mMになり、塩KClおよびグリセロールは、Cas9を溶液状態に保つのを助ける。TCEPは、生化学および分子生物学の応用に頻繁に使用される還元剤である。TCEPは、システインがジスルフィド結合を形成することから守ることができ、ジチオスレイトールおよびβ-メルカプトエタノールと異なり、マレイミド残基と同じように容易に反応することはない。
翌日、バイアル中に視認可能な沈殿が存在しないことをチェックした後、タンパク質溶液をSephadex G25カラムに負荷し、遊離の標識から標識Cas9を溶離させて、精製および分離した。弱いバンドがほとんど直ちに分離し、好結果の標識を示していた（図18）。溶離したタンパク質は顕著に希釈されていた。しかし、蛍光は裸眼で視認可能であった。緑色蛍光についてのトランスイルミネータを用いて蛍光を確認した（図19参照）。ビシンコニン酸アッセイを用いて精製後のCas9濃度を調べた。RNP研究のためにより濃縮されたアリコットを使用した。濃度は、集めた体積約1mlについて500～700ng/μlの範囲であった。
実施例4：Cas9沈殿の問題を克服するためのアプローチ
標識工程の間に、Cas9タンパク質は凝集および沈殿を起こしやすかった。他の人々も様々な溶液中のCas9に関する溶解性の問題を報告している（Burger, A et al. 2016. Development 2016 143(11): 2025-37）。タンパク質が送達溶液に添加されたときにもCas9の沈殿が観察された。エタノールがタンパク質の沈殿を促進することができるので、Cas9の沈殿に寄与する主な要因の1つが送達溶液中のエタノールの存在であったと仮定した。漸増するエタノール濃度がCas9の沈殿に及ぼす影響を評価した。
標識工程の間に、Cas9タンパク質は凝集および沈殿を起こしやすかった。他の人々も様々な溶液中のCas9に関する溶解性の問題を報告している（Burger, A et al. 2016. Development 2016 143(11): 2025-37）。タンパク質が送達溶液に添加されたときにもCas9の沈殿が観察された。エタノールがタンパク質の沈殿を促進することができるので、Cas9の沈殿に寄与する主な要因の1つが送達溶液中のエタノールの存在であったと仮定した。漸増するエタノール濃度がCas9の沈殿に及ぼす影響を評価した。
下記の研究から、15％を超えるエタノールは、タンパク質の急速な沈殿を誘導した。この情報を得て、1)送達溶液中のエタノール濃度を減少させること、および2)タンパク質を賦形剤／シャペロンで保護することによって、Cas9の溶解度を増加させようと決めた。
エタノール濃度がCas9沈殿に及ぼす影響
A. 送達溶液中のエタノール濃度がCas9の沈殿に及ぼす影響
標識Cas9を蛍光顕微鏡下で観察したところ、溶液は、小さな緑色の「スペックル」を有する緑色の色合いを示した。送達溶液（25％エタノール）をCas9に添加したとき、それらのスペックルはサイズおよび数が大きく増えた。沈殿がタンパク質上の蛍光プローブの存在によって起こったのではないことを確認するために、25％エタノールを含有する送達溶液中の未標識Cas9溶液を顕微鏡で観察した。写真を図21に表示するが、タンパク質の凝集物が視認可能であった。顕微鏡でガラススライドを眺めている間に、タンパク質の凝集および溶液からの沈降が同時進行で起こった。
A. 送達溶液中のエタノール濃度がCas9の沈殿に及ぼす影響
標識Cas9を蛍光顕微鏡下で観察したところ、溶液は、小さな緑色の「スペックル」を有する緑色の色合いを示した。送達溶液（25％エタノール）をCas9に添加したとき、それらのスペックルはサイズおよび数が大きく増えた。沈殿がタンパク質上の蛍光プローブの存在によって起こったのではないことを確認するために、25％エタノールを含有する送達溶液中の未標識Cas9溶液を顕微鏡で観察した。写真を図21に表示するが、タンパク質の凝集物が視認可能であった。顕微鏡でガラススライドを眺めている間に、タンパク質の凝集および溶液からの沈降が同時進行で起こった。
上記予備段階の後に、漸増する濃度のエタノールを含有する、蛍光色素で標識したCas9溶液を調製し、エタノールの添加直後に蛍光顕微鏡で分析した。施設内で標識および精製した133ng/μl Alexa 488 Cas9を、表8に挙げるようにS緩衝液および水に添加した。その試料の顕微鏡分析の直前に、エタノールを試験管に添加した。
エタノールの添加直後に、溶液5μlをガラススライドに移し、蛍光顕微鏡で観察した。最初に、試料1～6を検査し、結果を図22に示す。最初の結果判定の後に、試料7、8および9を加えた（図23）。Alexa 488 Cas9が低濃度であるせいで、10μlで送達できた最大量は、編集実験に関して通常送達される量（5μg）に対して約5倍少ない931ngであった。
（表８）反応物10μlあたりのCas9およびエタノールの体積
*1×S緩衝液：130mMスクロース、50mM KCl、50mM酢酸アンモニウム、20mM Hepes（pH7.4）；10×S緩衝液：1.3Mスクロース、0.5M KCl、0.5M酢酸アンモニウム、200mM Hepes（pH7.4）
図22から15％エタノールを含有する試料において凝集が出現したことが明らかであり、この現象は、20および25％で顕著になる。1、5および10％エタノールについては観察可能な凝集は観察されなかった。比較のために、カラムから溶離するときのエタノールおよびタンパク質を有さないCas9を図24に報告する。
10％未満のエタノール含量が細胞内へのペイロードの取込み不良を招き、15％を超えるエタノール含量がタンパク質の顕著な沈殿を招くので、10％～15％エタノールの範囲で綿密な研究を実施した、図23。エタノールが12％に達したとき、ガラススライド上の小滴の縁に凝集が見られ、このことは、10％エタノールがペイロードの取込みを促進しかつタンパク質の沈殿を回避するための最善の妥協点であったことを示している。
最終的に、時間がたてば（1～2h）、全ての試料（2時間後にさらに調査した1％エタノールを除く）においてタンパク質の凝集が観察されたことを強調することが重要であった。これらの観察は、Cas9およびエタノールを含有する溶液を調製から数分以内に使用しなければならないことを示した。
注目すべきは、市販のCas9から作ったAlexa 488 Cas9を用いて溶解度の試験を実施したので、Cas9の濃度は、編集実験のために通常使用される濃度よりも低かった。標識タンパク質は、精製された後に顕著な希釈を受ける。これらのアッセイのための送達溶液は、1回の送達のために使用される体積10μl中に25％エタノールおよび25％S緩衝液の比率を維持するように意図され、これは、Cas9の添加のために利用できる体積が最大5μlであったことを意味した。標識タンパク質は親タンパク質よりも大きく希釈されたので、利用可能な体積5μl中で5μgを送達することが困難であった。
送達溶液に最も適したエタノール含量は、10％であった。そのような含量で、細胞膜の透過化はなお可能であり、溶液を数分以内に調製および使用した場合、Cas9の沈殿が回避された。しかし、mRNAのような大型のペイロードの送達効率の減少が25％未満のエタノール濃度で起こり、したがって、好ましいのは、25％エタノール濃度を維持すること、およびCas9の沈殿を回避するか、または減少させるかのいずれかを行うことであった。
B. 送達溶液中のエタノール濃度およびCas9濃度がインビトロ編集効率に及ぼす影響
Cas9の沈殿が遺伝子編集ツールの編集効率に及ぼす影響を調べるためにインビトロ編集試験を実施した。表9に要約するように、異なるエタノール含量について異なる量のCas9を含有するいくつかの溶液を作製した。全ての試薬（Cas9およびgRNA）およびエタノール以外の送達溶液（S緩衝液、MGW）の成分を添加することによってRNP複合体を作製した。10分間のインキュベーション後で、スプレーする前に、エタノールを添加した。比Cas9/gRNAは、1:1モル比であった。Cas9をgRNA（384b、5.3μM、223.7ng/μl原液）に1:1モル比で添加し、15分間インキュベートし、次にS緩衝液およびMGWを添加し、混合物を10分間インキュベートした。最後にスプレーの直前にエタノールを添加した。
Cas9の沈殿が遺伝子編集ツールの編集効率に及ぼす影響を調べるためにインビトロ編集試験を実施した。表9に要約するように、異なるエタノール含量について異なる量のCas9を含有するいくつかの溶液を作製した。全ての試薬（Cas9およびgRNA）およびエタノール以外の送達溶液（S緩衝液、MGW）の成分を添加することによってRNP複合体を作製した。10分間のインキュベーション後で、スプレーする前に、エタノールを添加した。比Cas9/gRNAは、1:1モル比であった。Cas9をgRNA（384b、5.3μM、223.7ng/μl原液）に1:1モル比で添加し、15分間インキュベートし、次にS緩衝液およびMGWを添加し、混合物を10分間インキュベートした。最後にスプレーの直前にエタノールを添加した。
（表９）異なる量のエタノールを含有する送達溶液中に作製したRNP複合体についてのCas9濃度
エタノールを添加した直後に、溶液10μlを48ウェルプレートの空のウェルにスプレーした。次に、スプレーされた溶液2μlを、サーモサイクラーに適した試験管に移し、表10に報告するようにIVE試験のために使用して、複合体の機能性を評価した。氷中に保った成分を、同様に氷の中に保った、サーモサイクラーに適した反応チューブに添加した。次に、30℃に予熱したサーモサイクラーにチューブを移した。以下のプログラムを実行した。
・30℃で30分
・65℃で15分
・4℃で保持
次に、消化された試料を、1.5％ゲルを使用するゲル電気泳動法によって分析した。
・30℃で30分
・65℃で15分
・4℃で保持
次に、消化された試料を、1.5％ゲルを使用するゲル電気泳動法によって分析した。
（表１０）Cas9/gRNA複合体のIVEについての反応1回あたりの成分体積
図25に示すように、全てのDNA標的が、ある程度編集された。試料1～5は差を示さなかったが、これは、使用されるCas9タンパク質の量が、編集に必要な量に対して大過剰であり、したがって沈殿にもかかわらず、溶液中に残留するCas9は、標的を編集するために十分であることを示唆している。エタノールの効果は、最低のCas9濃度でのみ明らかになった。試料7（50ng/μl Cas9、20％エタノール）では、編集されたバンドは弱く、切断されていないDNAのシグナルがより強かった。これは、エタノール（最高濃度のエタノール）が最低濃度のCas9の沈殿を誘導することが、システムから編集に利用できる機能的Cas9を奪ったことを示していた。より高い濃度で、溶液中に残るタンパク質は、標的DNAを切断するためにおそらく十分であった。
C. Cas9の沈殿を防止するための賦形剤の使用
i)高い塩濃度がCas9の沈殿に及ぼす影響
Cas9は、溶液中にとどまるために比較的高い塩濃度を必要とし、大部分の重要な刊行物では濃度約200～250mMのKClが使用されている。エタノールの添加後に発生する沈殿を防止しようとして、水を0.5M KClまたは1M KClにより置換した送達溶液中にCas9溶液またはRNP溶液を作製した。前述のように、エタノールを除く全ての成分を添加し、次に溶液を室温で15分間インキュベートし、最後にエタノールを添加した。全ての場合に、タンパク質または複合体の実質的な沈殿が観察された。
i)高い塩濃度がCas9の沈殿に及ぼす影響
Cas9は、溶液中にとどまるために比較的高い塩濃度を必要とし、大部分の重要な刊行物では濃度約200～250mMのKClが使用されている。エタノールの添加後に発生する沈殿を防止しようとして、水を0.5M KClまたは1M KClにより置換した送達溶液中にCas9溶液またはRNP溶液を作製した。前述のように、エタノールを除く全ての成分を添加し、次に溶液を室温で15分間インキュベートし、最後にエタノールを添加した。全ての場合に、タンパク質または複合体の実質的な沈殿が観察された。
ii)グリセロールがCas9の沈殿に及ぼす効果
グリセロールは、タンパク質の溶解度を高めることが公知である。この実験では、5、20または20％グリセロールを送達溶液の処方に添加した。室温で15分間インキュベートした後に、今回もエタノールを成分の残りに添加した。Cas9を含有する試料において、エタノールの添加だけが、なお沈殿をもたらしたが、大きな凝集物は形成しなかった。逆に、20％グリセロールを含有する送達溶液中のRNPについて、エタノールの添加後であっても沈殿は観察されなかった（図25）。5％および10％グリセロールを含有する送達溶液中のRNPについて、目に見える粒子がいくつかのガラススライドに存在する背景の汚れのように見えたので、沈殿が形成されたかどうかを確証することは困難であった。確かに、タンパク質の典型的な大型クラスターは出現しなかった（図26A～26C）。しかし、グリセロール含有溶液が細胞にスプレーされたとき、細胞の損傷が観察された。したがって、グリセロールは、この状況で使用するために適切な賦形剤ではなかった。
グリセロールは、タンパク質の溶解度を高めることが公知である。この実験では、5、20または20％グリセロールを送達溶液の処方に添加した。室温で15分間インキュベートした後に、今回もエタノールを成分の残りに添加した。Cas9を含有する試料において、エタノールの添加だけが、なお沈殿をもたらしたが、大きな凝集物は形成しなかった。逆に、20％グリセロールを含有する送達溶液中のRNPについて、エタノールの添加後であっても沈殿は観察されなかった（図25）。5％および10％グリセロールを含有する送達溶液中のRNPについて、目に見える粒子がいくつかのガラススライドに存在する背景の汚れのように見えたので、沈殿が形成されたかどうかを確証することは困難であった。確かに、タンパク質の典型的な大型クラスターは出現しなかった（図26A～26C）。しかし、グリセロール含有溶液が細胞にスプレーされたとき、細胞の損傷が観察された。したがって、グリセロールは、この状況で使用するために適切な賦形剤ではなかった。
iii)NDSB-201（非界面活性型スルホベタイン、双性イオン化合物）がCas9の沈殿に及ぼす影響
NDSB-201は、タンパク質の溶解度を改善することが公知である。Cas9を単独で、またはRNPと共に、0.05（D’Astolfo DS et al., Cell 161(3): 674-90）、0.2および0.5M NDSBを含有する送達溶液中に作製した。今回も、エタノール以外の全ての成分を一緒に添加し、溶液を15分間インキュベートし、次にエタノールを添加した。エタノールを添加したとき、Cas9のみを含有する全ての試料について沈殿が形成された。0.5M NDSBを用いたときにRNP（リボ核タンパク質、Cas9とガイドRNAとの複合体）について沈殿は見られなかった（図26A～26C）。0.05および0.2M NDSBを伴うRNPについて、沈殿は、どちらの場合もほとんどまたは全く（バックグラウンドノイズのせいで見分けるのが難しい）観察されなかった。
NDSB-201は、タンパク質の溶解度を改善することが公知である。Cas9を単独で、またはRNPと共に、0.05（D’Astolfo DS et al., Cell 161(3): 674-90）、0.2および0.5M NDSBを含有する送達溶液中に作製した。今回も、エタノール以外の全ての成分を一緒に添加し、溶液を15分間インキュベートし、次にエタノールを添加した。エタノールを添加したとき、Cas9のみを含有する全ての試料について沈殿が形成された。0.5M NDSBを用いたときにRNP（リボ核タンパク質、Cas9とガイドRNAとの複合体）について沈殿は見られなかった（図26A～26C）。0.05および0.2M NDSBを伴うRNPについて、沈殿は、どちらの場合もほとんどまたは全く（バックグラウンドノイズのせいで見分けるのが難しい）観察されなかった。
iv)他の賦形剤がCas9の沈殿に及ぼす影響
上記結果を考慮して、公知の保護剤／シャペロン／賦形剤がCas9タンパク質をエタノール誘導沈殿から「保護する」能力を評価する一連の実験を計画した。熱ショックタンパク質（HSP）は、多種多様なクライアントタンパク質の正しいフォールディングおよび成熟のため、ならびにタンパク質を、ストレスが誘導するアンフォールディングおよび凝集から保護するために、不可欠である（Morimoto, R. I., 2008: Genes & Development, v. 22, p. 1427-1438; Richter, K et al. 2010: MolCell, v. 40, p. 253-266）。小型HSP（sHSP）は、アンフォールディング途中のタンパク質を、その後の再フォールディングに適切な立体配座に保持することでタンパク質の不可逆的凝集を防止する、主要な「ホールディング(holding）」シャペロンである（Eyles, S. J., and L. M. Gierasch, 2010: PNAS, v. 107, p. 2727-2728; Stengel, F et al, 2010: PNAS, v. 107, p. 2007-2012）。α-クリスタリンは、小型熱ショックタンパク質ファミリーの重要なメンバーであり、レンズの重大な構造成分である（Reddy, et al 2006: Iubmb Life, v. 58, p. 632-641）。
上記結果を考慮して、公知の保護剤／シャペロン／賦形剤がCas9タンパク質をエタノール誘導沈殿から「保護する」能力を評価する一連の実験を計画した。熱ショックタンパク質（HSP）は、多種多様なクライアントタンパク質の正しいフォールディングおよび成熟のため、ならびにタンパク質を、ストレスが誘導するアンフォールディングおよび凝集から保護するために、不可欠である（Morimoto, R. I., 2008: Genes & Development, v. 22, p. 1427-1438; Richter, K et al. 2010: MolCell, v. 40, p. 253-266）。小型HSP（sHSP）は、アンフォールディング途中のタンパク質を、その後の再フォールディングに適切な立体配座に保持することでタンパク質の不可逆的凝集を防止する、主要な「ホールディング(holding）」シャペロンである（Eyles, S. J., and L. M. Gierasch, 2010: PNAS, v. 107, p. 2727-2728; Stengel, F et al, 2010: PNAS, v. 107, p. 2007-2012）。α-クリスタリンは、小型熱ショックタンパク質ファミリーの重要なメンバーであり、レンズの重大な構造成分である（Reddy, et al 2006: Iubmb Life, v. 58, p. 632-641）。
成分の以下のような原液濃度を使用した：Cas9（10μg/μl）（IDT, 1074182）、Cas9消化緩衝液（Sureguideキット、Agilent）、HPRT（IDT）用のgRNA（21.8μm）、D-ソルビトール（Sigma, S3889）、D-マンニトール （Sigma, M4125）、ウシ眼レンズ由来α-クリスタリン（Sigma, C4163）、NDSB（Sigma, 82804）、ゼラチンA（Sigma, G1890）、ゼラチンB（Sigma, G9391）、グリシン（Sigma, G7126）、プロリン（Sigma, P5607）、Tween-20（Sigma, P9416）、L-ヒスチジン（Sigma, H8000）、ミオイノシトール（Sigma, 15125）、およびトレハロース（Sigma, 90210）。
タンパク質の安定化および凝集防止に関する現在の文献に基づき、添加剤を選択した。選択した添加剤の最終リストを表11に示す。エタノールの存在下で添加剤がCas-9ヌクレアーゼの機能を保つことができるかどうか知るために、添加剤を試験した。Cas9原液をヌクレアーゼ不含H2Oで希釈して、1μg/μl溶液を得た。Cas9およびsgRNAをモル比1:3で添加した。次にそれらを室温で10分間インキュベートして、Cas9:sgRNAリボ核タンパク質（RNP）を形成させた。表12に示す濃度まで添加剤を添加した。最後にエタノールを添加し、溶液を室温で2分間インキュベートした。次に、表13に要約したように、溶液をインビトロ編集反応物に直接添加した。試料を混合し、サーモサイクラーを用いて、製造業者の仕様書により以下のプログラムでインキュベートした：30℃で30分、65℃で15分、4℃で維持。試料を氷上に置き、6×負荷色素4μl（NEB、還元）を添加した。製造業者の説明書に沿ってSybrsafeで染色した2％アガロースゲルに試料を負荷し、100Vで1時間泳動させた。
Genetoolsプログラム（Syngene）を使用して、添加剤を含むまたは含まない様々な送達溶液への曝露後にCas9:gRNAの編集効率を測定した。バンド1と比べたバンド2（編集されたHPRT）の強度を得て、パーセンテージとして表現した。全ての値をエタノール不含試料に対して正規化した。
これらの保護剤が細胞内で遺伝子編集に対して及ぼす影響を試験するために、送達プラットフォーム技法によりCas9 RNPを上記保護剤のいくつかと共に細胞に送達した。骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）を96ウェルプレートに9×103個/ウェルの密度で播種し、37℃で一晩培養した。翌朝、Cas9 5μgおよびガイドRNA（HPRT；1:6の比）を複合体化し、α-クリスタリン（220μM）、NDSB（0.5M）またはスクロースの代わりにソルビトール（最終4％）を含む送達S緩衝液に添加した。次に、エタノール（25％v/v）を添加し、スプレーにより細胞に送達した。4時間後に工程を繰り返し、次に細胞を72時間培養し、その後ドロップレットデジタルPCRによって編集を分析した。
（表１１）本研究に使用した添加剤
（表１２）インビトロ編集反応の成分。Cas9の終濃度は75ng/μlであった。
（表１３）インビトロ編集反応の成分。Cas9の終濃度は75ng/μlであった。
インビトロ編集実験は、エタノールの存在下で添加剤がCas9ヌクレアーゼの機能を保つことができることを示した（図28および図19A～29B）。特に、α-クリスタリンおよびソルビトールの添加は、送達溶液に曝露後のCas-9:gRNAのヌクレアーゼ活性を改善した。Cas-9:gRNAのインビトロ編集効率は、平均して、添加剤なしの対照の49％から、それぞれソルビトール試料の98％およびα-クリスタリン試料の103％の効率に改善した。MSCにおけるhprtのCRISPR-Cas9編集を改善するために、α-クリスタリンおよびNDSBを送達溶液に添加した（図30）。終濃度220μMのα-クリスタリンの添加は、hprtの編集を11.09％（添加剤なしの対照）から16.34％に増加させた。送達溶液へのNDSBの添加は、MSCのhprt編集に効果を有さなかった。α-クリスタリンは、U2OS細胞におけるhprtの編集を最大化する際にソルビトールよりも優れた添加剤でもある（図31）。
エタノールは、タンパク質の部位で水と置き換わり、タンパク質の構造を変更することが公知である（Dwyer, 1999 Biopolymers 49(7): 635-45）。これは、タンパク質の凝集を導く可能性がある疎水性コアの露出を招く可能性もある。最近、Fernsらによる研究（Ferns, 2012: Neurochemical Research, v. 37, p. 244-252）により、エタノールが誘導するGAPDHの凝集がα-クリスタリンによって防止されたことが見出された。したがって、α-クリスタリンは、Cas-9の凝集を防止する可能性がある。
実施例5：より高い編集効率を達成するための送達プロトコールの最適化
送達プラットフォーム技法が接着細胞における編集に影響する能力は、標的細胞の単層のサイズ、Cas9の濃度、タンパク質とガイドRNAとの比およびこの技法によって細胞が処理される回数によって影響を受けた。Cas9タンパク質とガイドRNAとの最適な比があり得、それは、細胞特異的および遺伝子標的特異的の両方であり得る。
送達プラットフォーム技法が接着細胞における編集に影響する能力は、標的細胞の単層のサイズ、Cas9の濃度、タンパク質とガイドRNAとの比およびこの技法によって細胞が処理される回数によって影響を受けた。Cas9タンパク質とガイドRNAとの最適な比があり得、それは、細胞特異的および遺伝子標的特異的の両方であり得る。
使用される材料は、U2OS細胞（骨肉腫細胞株 - ECACC）、骨髄由来間葉系幹細胞（MSC; Lonza）、Jurkat E6.1細胞（T細胞株 - ECACC）、DMEM低グルコース（Sigma-Aldrich）、FBS（Sigma）、RPMI-1640（Life Technologies）、トリプシン/EDTA（Gibco）、Cas9ヌクレアーゼ（IDT-DNA）、crRNA（IDT-DNA）、trRNA（IDT-DNA）、送達S緩衝液、α-クリスタリン（Sigma）、エタノール、Hex標識ドロップオフプローブ（IDT-DNA）、FAM標識参照プローブ（IDT-DNA）、およびddPCR Supermix（BioRad）を含んでいた。
細胞培養
24ウェルプレートについて5×104個、48ウェルプレートについて3×104個および96ウェルプレートについて1×104個のU2OS細胞を播種し、37℃で一晩培養した。翌朝、Cas9 5μg（HPRTガイド；1:3比）を送達S緩衝液に添加し、α-クリスタリン（220μM）およびエタノール（25％v/v）も添加した。次に、これをスプレーの形態で細胞に送達した。細胞を、同じペイロードを再度スプレーする前に4時間、回復させた。次に、細胞を収集および分析する前に、72時間培養した。別のセットの実験で、骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）を密度9×103個/ウェルで96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩培養した。翌朝、Cas9 5rigを送達S緩衝液に添加し、α-クリスタリン（220riM）およびエタノール（25％v/v）も添加した。
24ウェルプレートについて5×104個、48ウェルプレートについて3×104個および96ウェルプレートについて1×104個のU2OS細胞を播種し、37℃で一晩培養した。翌朝、Cas9 5μg（HPRTガイド；1:3比）を送達S緩衝液に添加し、α-クリスタリン（220μM）およびエタノール（25％v/v）も添加した。次に、これをスプレーの形態で細胞に送達した。細胞を、同じペイロードを再度スプレーする前に4時間、回復させた。次に、細胞を収集および分析する前に、72時間培養した。別のセットの実験で、骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）を密度9×103個/ウェルで96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩培養した。翌朝、Cas9 5rigを送達S緩衝液に添加し、α-クリスタリン（220riM）およびエタノール（25％v/v）も添加した。
最初の実験において、MgCl2添加の影響を調べた。Cas9 RNP（5rig；HPRT標的1:6）を2.5mM MgCl2ありまたはなしでMSC細胞に送達した。工程を繰り返す前に細胞を4時間回復させ、次に編集分析の前に細胞を72時間培養した。次の実験では、異なる量のガイドも添加し（crRNA:trRNAは、モル比1:1であった）、それにより、タンパク質とガイドRNAとのモル比1:1、1:3および1:6を最終体積10 rilで達成した。これらの実験に使用したガイドは、HPRT遺伝子内の部位および文献から採用した配列を標的としていた（Liang et al., 2015 J Biotechnol 208L44-53）。培地を細胞から除去し、送達溶液中のペイロードをスプレーノズルに加えた。細胞にスプレーし、細胞を2分間インキュベートした後、0.5×PBS（停止液）150μlを添加した。細胞をさらに30秒間インキュベートし、停止液を除去し、通常の培地150μlを添加した。細胞を編集分析のために収集する前に72時間培養した。
第2の実験では、Cas9の量をタンパク質:ガイド比1:1で0.1μgから24μgに変動させた。ペイロードを送達し、細胞を上述のように処理した。第3の実験では、細胞を繰り返し加工した。Cas9 5μgをガイド比1:6で上述のように細胞に送達した。次に、細胞をトリプシン処理し、同じウェルに再播種した後、一晩培養した。翌朝、細胞を同じ条件で再度加工した。細胞を同じ条件で3回目に加工する前に細胞を培地中で4時間放置した。細胞を再び一晩培養した。翌朝、細胞を同じ条件で4回目の加工をし、トリプシン処理する前に4時間放置し、48ウェルプレートのウェルに播種し、72時間培養した。次に、細胞を収集し、ドロップレットデジタルPCRおよびドロップオフアッセイによる遺伝子編集分析のために調製した。
編集の分析
編集物の存在を、水-油乳剤小滴技法に基づくデジタルPCRを行うための方法であるドロップレットデジタルPCR（ddPCR）を使用して分析した。試料を小滴20,000個に分画し、各個別の小滴においてテンプレート分子のPCR増幅を起こした。この方法では、ゲノムに対するCas9 RNP作用によるHPRT遺伝子における編集の存在を検出するためにこの技法を使用した。DNAにおける二本鎖切断の非相同末端結合修復を特異的に扱うようにこのアッセイを設定した。フォワードおよびリバースプライマーにより、約150bpのアンプリコンが生成した。2つの内部プローブ、すなわち参照プローブとして作用し、かつ全ての増幅したDNA鎖と結合するはずの1つのプローブ、およびCas9切断部位にわたって位置し、かつ編集が起こらなかった場合に結合されるが、編集が及んだ場合には結合することができない第2のプローブを使用した。
編集物の存在を、水-油乳剤小滴技法に基づくデジタルPCRを行うための方法であるドロップレットデジタルPCR（ddPCR）を使用して分析した。試料を小滴20,000個に分画し、各個別の小滴においてテンプレート分子のPCR増幅を起こした。この方法では、ゲノムに対するCas9 RNP作用によるHPRT遺伝子における編集の存在を検出するためにこの技法を使用した。DNAにおける二本鎖切断の非相同末端結合修復を特異的に扱うようにこのアッセイを設定した。フォワードおよびリバースプライマーにより、約150bpのアンプリコンが生成した。2つの内部プローブ、すなわち参照プローブとして作用し、かつ全ての増幅したDNA鎖と結合するはずの1つのプローブ、およびCas9切断部位にわたって位置し、かつ編集が起こらなかった場合に結合されるが、編集が及んだ場合には結合することができない第2のプローブを使用した。
この実験では、MagNA Pureコンパクトシステムを使用してDNAを試料から抽出した。ddPCR成分を製造業者のガイドラインに沿って調製した。成分をDG8カートリッジに移し、小滴をQX200ドロップレット発生装置を用いて発生させた。次に、小滴を96ウェル PCRプレートに移し、密封した。PCRを行い、QX200ドロップレットリーダーを使用して小滴を分析した。
i)細胞単層のサイズが編集効率に及ぼす影響
細胞をより小さいウェルに播種することにより細胞単層の直径が減少し、それにより、単層の直径とスプレーの直径がよりよくマッチしたときに、編集効率は増加した（図32）。
細胞をより小さいウェルに播種することにより細胞単層の直径が減少し、それにより、単層の直径とスプレーの直径がよりよくマッチしたときに、編集効率は増加した（図32）。
24、48、または96ウェルプレートのいずれかにU2OS細胞を播種し、一晩培養した。翌日、2回の用量のCas9 RNP（5μg；1:6比のHPRT gRNA）を送達プラットフォーム技法により送達し、収集する前に細胞をさらに72時間培養した。ddPCRによって編集効率を分析し、最小のウェルに播種された細胞が最大の編集効率を生じたことが示された。
ii)漸増するCas9濃度が編集効率に及ぼす影響
Cas9をガイドRNAと1:1の比で送達することによって達成される編集パーセンテージは、Cas9の濃度が増加するのと共に増加し、Cas9約5μgでプラトーに達した（図33）。
Cas9をガイドRNAと1:1の比で送達することによって達成される編集パーセンテージは、Cas9の濃度が増加するのと共に増加し、Cas9約5μgでプラトーに達した（図33）。
MSCを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、様々な濃度のCas9 RNP（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、24.0μg）をHPRTガイドRNAと1:1のモル比で送達プラットフォーム技法によって送達し、細胞を収集する前にさらに72時間培養した。ddPCRによって編集効率を分析し、Cas9タンパク質の量が増加するのと共に編集効率が増加し、Cas9約5μgで増加がプラトーに達したことが示された。
iii)Cas9:gRNA比が編集効率に及ぼす影響
Cas9 5ugをガイドRNAと共に様々な比（1:1、1:3または1:6）で送達することは、MSC細胞における編集効率を変更しなかった（図34）。
Cas9 5ugをガイドRNAと共に様々な比（1:1、1:3または1:6）で送達することは、MSC細胞における編集効率を変更しなかった（図34）。
MSCを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、Cas9 RNP（5μg）をHPRTガイドRNAと共に1:1、1:3または1:6のいずれかのモル比で送達プラットフォーム技法により送達し、細胞を収集する前にさらに72時間培養した。ddPCRにより編集効率を分析し、これらの細胞および特定の標的およびガイドRNAを用いて、試験したタンパク質:ガイドRNAの比で編集効率に差がなかったことが示された。
iv)送達されるRNPの投与回数が編集効率に及ぼす影響
細胞が送達工程を経る回数を増加させると（Cas9 5μg、比1:6）、HPRT遺伝子において検出される編集パーセンテージが増加した（図35）。
細胞が送達工程を経る回数を増加させると（Cas9 5μg、比1:6）、HPRT遺伝子において検出される編集パーセンテージが増加した（図35）。
MSCを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。続く3日間にわたり、Cas9 RNP（5μg；1:6比のHPRT gRNA）の1、2、3または4回の用量を送達プラットフォーム技法により送達し、最終用量が送達された後、細胞を収集する前にさらに72時間培養した。編集効率をddPCRにより分析し、細胞が受けるCas9 RNPの投与回数と共に編集効率が増加したことが示された。*独立した平均についてのスチューデントのt検定でp<0.05。
本明細書において明らかなように、プラットフォーム送達技法は、細胞の生存率および機能性を維持しながら一連の分子を細胞に送達することができる。この特性は、異なる時点での同じ分子または異なり得る分子の複数回投与方式を可能にする（図35）。これは、ずっと低い生存率を招く細胞への有害作用が原因で複数回の投与を成し遂げることができないエレクトロポレーションと異なる。したがって、Cas9のプラスミド形態を送達するための潜在的な出口は、このタンパク質が細胞によって発現される期間を与えてから、組み合わせた場合に編集に影響を及ぼすガイドRNAを送達することである。
v)MgCl2が編集効率に及ぼす影響
以前のインビトロ編集研究に基づくと、MgCl2の添加が編集に影響を及ぼすために必要であったことが観察された。この研究では、Cas9 RNPと一緒に細胞に添加する影響を評価した。MgCl2の添加は編集効率を改善しなかったことが実証され、その後の研究は、MgCl2の添加を含まなかった（図25）。MSC細胞を96ウェルプレートに播種し、Cas9 RNP（5ug；HPRT 1:6比）をMgCl2（2.5mM）の存在下または非存在下で送達プラットフォーム技法により送達した。
以前のインビトロ編集研究に基づくと、MgCl2の添加が編集に影響を及ぼすために必要であったことが観察された。この研究では、Cas9 RNPと一緒に細胞に添加する影響を評価した。MgCl2の添加は編集効率を改善しなかったことが実証され、その後の研究は、MgCl2の添加を含まなかった（図25）。MSC細胞を96ウェルプレートに播種し、Cas9 RNP（5ug；HPRT 1:6比）をMgCl2（2.5mM）の存在下または非存在下で送達プラットフォーム技法により送達した。
実施例6：エレクトロポレーションとの比較
タンパク質送達の業界標準であるエレクトロポレーションとの比較を、送達効率、生存率および機能性について評価した。
タンパク質送達の業界標準であるエレクトロポレーションとの比較を、送達効率、生存率および機能性について評価した。
A. 編集効率の比較：送達プラットフォームをエレクトロポレーションと比べる
Cas9が本明細書提供の送達技法により送達されたMSCにおいて、編集効率はエレクトロポレーションと比較して大きかった（図37）。
Cas9が本明細書提供の送達技法により送達されたMSCにおいて、編集効率はエレクトロポレーションと比較して大きかった（図37）。
MSCを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌3日間にわたり、Cas9 RNP（5μg；1:6比のHPRT gRNA）の4回の用量を送達プラットフォーム技法により送達し、最終用量が送達された後、細胞を収集する前にさらに72時間培養した。エレクトロポレーションとの比較のために、MSCを緩衝液中に調製し、製造業者の説明書に沿って処理した。同じ量のCas9およびガイドを、送達プラットフォーム処理細胞ごとに送達した。細胞を収集し、編集効率をddPCRにより分析した。Cas9をいずれの方法で送達した場合でも好結果の編集が観察されたが、Cas9 RNPが送達プラットフォーム技法により送達された細胞の方が、効率が有意に大きかった。*独立した平均についてのスチューデントのt検定でp<0.05。
B. RNP送達後の細胞生存率の比較：送達プラットフォームをエレクトロポレーションと比較する
送達プラットフォーム技法またはエレクトロポレーションのいずれかにより送達されたCas9 RNPによって編集された細胞間で細胞生存率は類似であった（図38）。Cas9 RNPの最終回を送達した24時間後に、生存率について細胞をEBAOカウントにより分析した。これらの2群間で生存率に有意差は観察されなかった。
送達プラットフォーム技法またはエレクトロポレーションのいずれかにより送達されたCas9 RNPによって編集された細胞間で細胞生存率は類似であった（図38）。Cas9 RNPの最終回を送達した24時間後に、生存率について細胞をEBAOカウントにより分析した。これらの2群間で生存率に有意差は観察されなかった。
C. RNPの送達後の細胞機能性の比較：送達プラットフォームをエレクトロポレーションと比較する
送達プラットフォーム技法によりMSCの機能性は影響されない（図39）。未処理群（未処理）、送達プラットフォーム技法により送達されたCas9 RNPの群（送達プラットフォーム）、およびエレクトロポレーションにより送達されたCas9 RNPの群（エレクトロポレーション）からの分化したMSCの3つの代表的な画像を試験した。Cas9 RNP（5rig；1:6の比のHPRT gRNA）を送達した1日後に、細胞1×105個を6ウェルプレートの培養培地中に播種し、5日間または細胞が90～100％集密になるまで培養した。次に、培地を除去し、細胞に脂肪生成分化培地2mlを添加した。分化が観察されるまで（通常は2～3週間）、培地を3日毎に交換した。細胞内に分化を示す油滴（白）を観察することができる。未処理細胞と送達プラットフォーム処理細胞との間で差はなかった。しかし、エレクトロポレーションによって処理された細胞では分化が阻害されるようであった。接着細胞と懸濁細胞との両方、および初代細胞と細胞株との両方を、送達プラットフォーム技法によるCas9 RNPの送達後の編集について評価した。
送達プラットフォーム技法によりMSCの機能性は影響されない（図39）。未処理群（未処理）、送達プラットフォーム技法により送達されたCas9 RNPの群（送達プラットフォーム）、およびエレクトロポレーションにより送達されたCas9 RNPの群（エレクトロポレーション）からの分化したMSCの3つの代表的な画像を試験した。Cas9 RNP（5rig；1:6の比のHPRT gRNA）を送達した1日後に、細胞1×105個を6ウェルプレートの培養培地中に播種し、5日間または細胞が90～100％集密になるまで培養した。次に、培地を除去し、細胞に脂肪生成分化培地2mlを添加した。分化が観察されるまで（通常は2～3週間）、培地を3日毎に交換した。細胞内に分化を示す油滴（白）を観察することができる。未処理細胞と送達プラットフォーム処理細胞との間で差はなかった。しかし、エレクトロポレーションによって処理された細胞では分化が阻害されるようであった。接着細胞と懸濁細胞との両方、および初代細胞と細胞株との両方を、送達プラットフォーム技法によるCas9 RNPの送達後の編集について評価した。
実施例7：接着型および懸濁型の細胞株および初代細胞における編集効率
MSCおよびU2OS細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌3日間にわたり、4回の用量のCas9 RNP（5rig；1:6比のHPRT gRNA）を送達プラットフォーム技法により送達し、細胞をさらに72時間培養した。懸濁細胞について、1.5×106個の単離ヒトCD3+ T細胞またはJurkat細胞を96ウェルフィルタープレート（1.2rim）に播種した。Cas9 RNP（5rig；1:6比のCXCR4 gRNA）を送達プラットフォーム技法により送達し、細胞をさらに72時間培養した。細胞を収集し、編集効率をddPCRにより分析した。細胞株および初代ヒト細胞の両方で好結果の編集が観察された（図40）。
MSCおよびU2OS細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌3日間にわたり、4回の用量のCas9 RNP（5rig；1:6比のHPRT gRNA）を送達プラットフォーム技法により送達し、細胞をさらに72時間培養した。懸濁細胞について、1.5×106個の単離ヒトCD3+ T細胞またはJurkat細胞を96ウェルフィルタープレート（1.2rim）に播種した。Cas9 RNP（5rig；1:6比のCXCR4 gRNA）を送達プラットフォーム技法により送達し、細胞をさらに72時間培養した。細胞を収集し、編集効率をddPCRにより分析した。細胞株および初代ヒト細胞の両方で好結果の編集が観察された（図40）。
実施例8：Cas9 mRNAを使用した編集効率
Cas9 mRNAの送達後の細胞において編集に影響する能力を評価した。Cas9 mRNAおよびガイドRNAが同じペイロード中で送達された細胞において遺伝子編集が検出された（図41）。MSCを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、Cas9 mRNA（4μg）およびガイドRNA（1:6比と等価；HPRT gRNA）を送達技法により送達し、細胞を収集する前にさらに72時間培養した。編集効率をddPCRにより分析し、これらの細胞から編集が検出された。
Cas9 mRNAの送達後の細胞において編集に影響する能力を評価した。Cas9 mRNAおよびガイドRNAが同じペイロード中で送達された細胞において遺伝子編集が検出された（図41）。MSCを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、Cas9 mRNA（4μg）およびガイドRNA（1:6比と等価；HPRT gRNA）を送達技法により送達し、細胞を収集する前にさらに72時間培養した。編集効率をddPCRにより分析し、これらの細胞から編集が検出された。
細胞および組織への遺伝子編集タンパク質の、ベクターなしでの送達
Crispr Cas9システムは、ゲノム編集の分野において急速に著名になった。Crispr Cas9は、ガイドRNAの助けを借りてゲノム内の特定配列を認識し、DNAに二本鎖切断を誘導する。細胞は、エラープローン非相同末端結合工程を用いてこの切断を修復することで、遺伝子を編集することができる。本明細書提供の送達プラットフォーム技法が細胞に遺伝子編集ツールを送達して編集に影響する能力を、評価した。
Crispr Cas9システムは、ゲノム編集の分野において急速に著名になった。Crispr Cas9は、ガイドRNAの助けを借りてゲノム内の特定配列を認識し、DNAに二本鎖切断を誘導する。細胞は、エラープローン非相同末端結合工程を用いてこの切断を修復することで、遺伝子を編集することができる。本明細書提供の送達プラットフォーム技法が細胞に遺伝子編集ツールを送達して編集に影響する能力を、評価した。
ツール（組換えCas9タンパク質および市販のガイドRNA）がDNA標的内に切断を誘導したかどうか評価するために、Agilent SureGuideCas9 Programmable Nuclease Kitに基づき、インビトロ編集アッセイを確立した。送達プラットフォーム送達溶液がCas9およびガイドRNAの機能に及ぼす影響も、この非限定的なアッセイを使用して評価した。Cas9が編集に及ぼす能力は、例示的な送達溶液によって打ち消されなかったことが見出された。さらに、完全な送達工程を反復するため、Cas9タンパク質を送達溶液に添加し、ウェル内にスプレーし、回収して、インビトロ編集試験で機能的に評価したとき、Cas9の活性は保たれていた。送達後の標的細胞へのCas9の取込みを確認するために、Cas9タンパク質を、システインアミノ酸（タンパク質1分子あたり2つのシステイン残基）のチオール基を経由して蛍光タグAlexa-488マレイミドで標識した。タンパク質の好結果の標識は、タンパク質の細胞内視覚化を可能にした。
Cas9は、哺乳動物細胞に自然に存在しない細菌タンパク質である。Cas9は、ある特定の条件下で溶液から沈殿する傾向を有し、このことがその機能に影響する。大部分の細胞の種類について、送達プラットフォーム送達技法を用いた細胞へのカーゴの最適な送達は、最大25％(v/v)のエタノール濃度で達成され、Cas9が15％を超えるレベルのエタノールと接触したときには沈殿しやすいことが観察された。エタノールが誘導するCas9の沈殿を減少させるために、インビトロ編集アッセイを用いて、細胞への送達後に一連の賦形剤を評価した。グリセロールおよび非界面活性型スルホベタイン（NDSB）のようないくつかの賦形剤が、エタノール誘導沈殿を防止した一方で、これらの賦形剤は、スプレー送達実験に含めた場合に、ある程度の細胞損傷を引き起こした。しかし、送達溶液への熱ショックタンパク質α-クリスタリンの添加は、インビトロ編集アッセイにおけるCas9の編集能を促進するようであり、かつ細胞への送達にも適合した。Cas9 RNPがα-クリスタリンの存在下で細胞に送達されたとき、細胞の効果的なゲノム編集がドロップレットデジタルPCRによって検出された。送達溶液へこの賦形剤を添加することにより、接着細胞と懸濁細胞との両方における、ならびに初代細胞および細胞株における、送達プラットフォーム技法を介したCas9 RNPゲノム編集のためのプロトコールが最適化された。一例として、この最適化は、初代ヒトMSCの50％に遺伝子編集をもたらした。さらに、MSCにおける送達プラットフォーム技法を介した編集のレベルは、エレクトロポレーションによって達成されるレベルよりも大きいこと、および編集されたMSCの生存率および機能性が、エレクトロポレーションと比較して本明細書提供の送達技法で優れていることが実証された。
他の態様
本明細書において引用された全ての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み入れられる。本明細書において引用された全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された全ての他の公表された参考文献、文書、原稿、アクセッション番号、および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において引用された全ての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み入れられる。本明細書において引用された全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された全ての他の公表された参考文献、文書、原稿、アクセッション番号、および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書記載の主題は、所望の構成に応じてシステム、器具、方法、および／または物品に具体化することができる。上記説明に示される実施形態は、本明細書記載の主題に合致する全ての実施形態を表すわけではない。その代わりに、それらは単に、記載された主題に関する局面と一致するいくつかの例である。上に少数の変形を詳細に記載したが、他の改変または追加が可能である。特に、本明細書に示される特徴および／または変形に加えて、さらなる特徴および／または変形を提供することができる。例えば、上記実施形態は、開示された特徴の様々な組合せおよびさらに下位の組合せならびに／または上に開示されたいくつかのさらなる特徴の組合せおよびさらに下位の組合せに向けることができる。加えて、添付の図面に示され、かつ／または本明細書に記載された論理の流れは、望ましい結果を達成するために、示された特定の順番、または連続的な順番を必ずしも必要としない。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内であり得る。
Claims (23)
- 細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物をインビトロまたはエクスビボで送達するための方法であって、
間葉系幹細胞(MSCs)、U2OS、JurkatまたはT細胞の集団をインビトロまたはエクスビボで提供する段階；および
該細胞集団を、該遺伝子編集組成物と、約25％の濃度のエタノール、約32mMスクロース、約12mM塩化カリウム、約12mM酢酸アンモニウム、約5mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および約2.5mM MgCl2とを含む、ある体積の低張水溶液と、インビトロまたはエクスビボで接触させる段階を含み、
ここで、該遺伝子編集組成物はCas9タンパク質およびgRNAを含み、
ここで、前記細胞集団をある体積の低張水溶液と接触させる段階は、該低張水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行われる、前記方法。 - 遺伝子編集組成物が、細胞集団またはその後代細胞において、
(a)該細胞集団を前記水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間、または
(b)該細胞集団を前記水溶液と接触させた後、0より大きく約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12もしくは0.5～72時間未満、
検出可能である、請求項1に記載の方法。 - 遺伝子編集組成物が、少なくとも1種の遺伝子編集タンパク質および少なくとも1種の核酸を含み、該遺伝子編集タンパク質および該核酸は、互いと結合または複合体化していない、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、またはそれ以上が、前記水溶液との接触後に遺伝子改変型になる、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団またはその後代細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、またはそれ以上が、前記水溶液との接触後に生存可能である、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子編集組成物が、細胞内のDNAに一本鎖または二本鎖切断を誘導する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子編集組成物が、修復テンプレートポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 修復テンプレートが、
(a)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域、および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域；または
(b)一本鎖もしくは二本鎖切断部の一方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域、および一本鎖もしくは二本鎖切断部の他方の側の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、もしくは90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域
を含む、請求項7に記載の方法。 - 前記体積の水溶液が、水性粒子のスプレーの形態で細胞集団に送達される、請求項1に記載の方法。
- (a)水性粒子のスプレーの体積が、6.0×10-7マイクロリットル/細胞～7.4×10-4マイクロリットル/細胞であり；かつ／または
(b)水性粒子が、直径10nm～100μm、30～100μm、50～80μmまたは30～50μmのサイズ範囲の、別個の体積ユニットを有する、
請求項9に記載の方法。 - スプレーが、10nm～100μmの直径を含むコロイド粒子または亜粒子を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記体積が、2.6×10-9マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積～1.1×10-6マイクロリットル/平方マイクロメートル露出表面積である、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団を前記水溶液と0.1～10分間接触させてから、第2の体積の緩衝液または培養培地を添加して該細胞集団を沈水または懸濁させる、請求項1に記載の方法。
- 緩衝液または培養培地がリン酸緩衝食塩水（PBS）を含む、請求項13に記載の方法。
- 細胞の形質膜を通過してペイロードを送達するための組成物であって、該組成物が、ペイロードと約25％の濃度のエタノール、約32mMスクロース、約12mM塩化カリウム、約12mM酢酸アンモニウム、約5mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および約2.5mM MgCl2とを含む低張水溶液を含み、該ペイロードが遺伝子編集組成物を含み、ここで、該遺伝子編集組成物はCas9タンパク質およびgRNA複合体を含む、前記組成物。
- pH約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0を有する、請求項15に記載の組成物。
- 細胞の形質膜を通過してペイロードをインビトロまたはエクスビボで送達するための組成物であって、以下を含む低張水溶液を含む組成物：
該ペイロード、
約25％の濃度のエタノール、約32mMスクロース、約12mM塩化カリウム、約12mM酢酸アンモニウム、約5mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および約2.5mM MgCl2
ここで、該ペイロードが遺伝子編集組成物を含み、さらにここで、該遺伝子編集組成物はCas9タンパク質およびgRNAを含む。 - 細胞の形質膜を通過して遺伝子編集組成物をインビトロまたはエクスビボで送達するための器具であって、
加圧気体を生成する空気圧発生装置；
該空気圧発生装置と動作可能に連結された噴霧器；
該遺伝子編集組成物および約25パーセントの濃度のエタノール、約32mMスクロース、約12mM塩化カリウム、約12mM酢酸アンモニウム、約5mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および約2.5mM MgCl2を含む、ある体積の低張水溶液を収容するように構成されたリザーバー、ここで、該遺伝子編集組成物はCas9タンパク質およびgRNAを含む；
加圧気体による該噴霧器の作動を防止する閉鎖位置と加圧気体による該噴霧器の作動によって該水溶液からコロイド状の小滴を生成させる開放位置との間で切替可能な、0より大きく250ミリ秒未満の切替速度を有する、該空気圧発生装置と該噴霧器との間のバルブ
を含み、
該噴霧器が、細胞集団を該低張水溶液と接触させるように方向づけられており、ここで、該細胞集団をある体積の水溶液と接触させることが、低張水溶液を噴射して噴霧物を形成する気体によって行われる、
前記器具。 - 前記水溶液が、熱ショックタンパク質または糖アルコールを含む添加剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 熱ショックタンパク質がα-クリスタリンを含む、請求項19に記載の方法。
- α-クリスタリンが約1～約500μMの濃度で存在する、請求項20に記載の方法。
- 糖アルコールが、約1～約10重量/体積％の濃度のソルビトールを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記低張水溶液が、グリセロールを含まない、請求項1に記載の方法。
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| KR20240099259A (ko) | 2021-10-14 | 2024-06-28 | 아스널 바이오사이언시스, 인크. | 공동 발현된 shrna 및 논리 게이트 시스템을 갖는 면역 세포 |
| CN114874319B (zh) * | 2022-06-27 | 2023-09-08 | 河南大学 | 一种用于急性肾损伤检测的cryab抗体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004536089A (ja) | 2001-06-26 | 2004-12-02 | イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム | 物質を細胞内に導入するための配合物及び方法 |
| WO2013142578A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
| WO2015088643A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
Family Cites Families (39)
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|---|---|---|---|---|
| EP0434616B1 (de) | 1989-12-19 | 1995-11-15 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren und Vorrichtung zur genetischen Transformation von Zellen |
| JPH03251187A (ja) | 1990-02-28 | 1991-11-08 | Kansai Paint Co Ltd | 生物または細胞に異物を導入し取り込ませる方法および該方法に使用する装置 |
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| JPH0662871A (ja) * | 1992-03-31 | 1994-03-08 | Kansai Paint Co Ltd | 生物または細胞に異物を導入し取り込ませる方法および該方法に使用する装置 |
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| US6447800B2 (en) | 1996-01-18 | 2002-09-10 | The University Of British Columbia | Method of loading preformed liposomes using ethanol |
| US6792940B2 (en) * | 1996-05-13 | 2004-09-21 | Universidad De Sevilla | Device and method for creating aerosols for drug delivery |
| US6433154B1 (en) | 1997-06-12 | 2002-08-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Functional receptor/kinase chimera in yeast cells |
| US6962691B1 (en) | 1999-05-20 | 2005-11-08 | U & I Pharmaceuticals Ltd. | Topical spray compositions |
| US7314969B2 (en) | 1999-11-29 | 2008-01-01 | Midwest Oilseeds, Inc. | Methods and compositions for the introduction of molecules into cells |
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| WO2009130187A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | National University Of Ireland, Maynooth | Electrospraying devices and methods |
| DE102008045830A1 (de) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Cinogy Gmbh | Verfahren zur Behandlung eines lebende Zellen enthaltenden biologischen Materials |
| US9834787B2 (en) * | 2009-04-09 | 2017-12-05 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted integration into stem cells |
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| WO2013058812A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | President And Fellows Of Harvard College | Targeted delivery to pancreatic islet endothelial cells |
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| US10391126B2 (en) * | 2011-11-18 | 2019-08-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA |
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