JP7340591B2 - 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用 - Google Patents
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Description
各々、出願人Actym Therapeutics,Inc.、発明者Christopher D.Thanos、Laura Hix Glickman、およびJustin Skobleの、各々、発明の名称が「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」である、2018年7月11日に出願され、2019年1月17日にWO2019/014398として公開された、国際特許出願番号PCT/US2018/041713、および2018年7月11日に出願され、2019年1月17日に米国特許出願公開第2019/0017050A1号として公開された、同時係属米国特許出願第16/033,187号の優先権の利益を主張する。
配列リストの電子バージョンは、本願と共に出願され、その内容は、その全体が参照により組み込まれるものとする。電子出願は、2019年7月10日に作製されており、サイズは457キロバイトであり、表題は1704SEQPC.txtである。
rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptAおよびlpxTのうちの1つまたは複数の中から選択される、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
自殺遺伝子を導入し、sacB、nuk、hok、gef、kilまたはphlAのうちの1つまたは複数から選択される、突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
溶菌遺伝子を導入し、hlyおよびclyの一方または両方から選択される、突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
IsyA、pag、prg、iscA、virG、plcおよびactの中から選択される1つまたは複数のビルレンス因子(複数可)の突然変異;および/または
recA、htrA、htpR、hspおよびgroELの中から選択される、ストレス応答を改変する遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
細胞周期を撹乱するminの突然変異;および/または
cya、crp、phoP/phoQおよびompRの中から選択される、調節性機能を撹乱するかまたは不活性化する遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数。
rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptAおよびlpxTのうちの1つまたは複数の中から選択される、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
自殺遺伝子を導入し、sacB、nuk、hok、gef、kilおよびphlAのうちの1つまたは複数の中から選択される、突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
溶菌遺伝子を導入し、hlyおよびclyの一方または両方の中から選択される、突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
IsyA、pag、prg、iscA、virG、plcおよびactの中から選択される1つまたは複数のビルレンス因子(複数可)の突然変異;および/または
recA、htrA、htpR、hspおよびgroELの中から選択される、ストレス応答を改変する遺伝子(複数可)の1つまたは複数の突然変異;および/または
細胞周期を撹乱するminの突然変異;および/または
cya、crp、phoP/phoQおよびompRの中から選択される調節性機能を撹乱するかまたは不活性化する1つまたは複数の突然変異。
A.定義
B.免疫刺激性細菌の概説
C.がん免疫療法
1.免疫療法
2.養子免疫療法
3.がんワクチンおよび腫瘍崩壊性ウイルス
D.細菌によるがん免疫療法
1.細菌による治療法
2.細菌およびウイルスに対する免疫応答の比較
3.サルモネラ属による治療法
a.腫瘍指向性細菌。
b.サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム
c.細菌の弱毒化
i.msbB-突然変異体
ii.purI-突然変異体
iii.弱毒突然変異の組合せ
iv.VNP20009ならびに他の弱毒化および野生型S.ティフィムリウム菌株
v.高分子をデリバリーするように遺伝子操作されたS.ティフィムリウム
4.治療指数を増加させるための免疫刺激性細菌の強化
a.asd遺伝子欠失
b.アデノシン栄養要求性
c.フラジェリン欠損菌株
d.サルモネラ属含有液胞(SCV)を逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属
e.バイオフィルム形成に必要なサルモネラ属遺伝子における欠失
f.LPS生合成経路中の遺伝子における欠失
g.SPI-1およびSPI-2遺伝子の欠失
h.プラスミドデリバリーを増加させるためのエンドヌクレアーゼ(endA)突然変異
i.RIG-I阻害
j.DNASE II阻害
k.RNase H2阻害
l.スタビリン-1/CLEVER-1阻害
5.免疫刺激性タンパク質
6.免疫細胞によるサルモネラ属等のグラム陰性細菌の取込みを増加させ、免疫細胞死を減少させる、改変
7.細菌培養条件
E.細菌弱毒化および定着
1.フラジェリンの欠失(fliC-/fljB-)
2.LPS生合成経路における遺伝子の検出
3.定着
F.治療用タンパク質をコードする例示的プラスミドの構築
1.免疫刺激性タンパク質
2.抗体および抗体断片
3.干渉RNA(RNAi)
a.shRNA
b.マイクロRNA
4.複製起点およびプラスミドコピー数
5.CpGモチーフおよびCpGアイランド
6.プラスミドの維持/構成成分の選択
7.RNAポリメラーゼプロモーター
8.DNA核標的化配列
9.CRISPR
G.腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、抗腫瘍免疫を刺激するための例示的免疫標的遺伝子に対するRNAiを含む
1.TREX1
2.PD-L1
3.VISTA
4.SIRPα
5.β-カテニン
6.TGF-β
7.VEGF
8.追加の例示的なチェックポイント標的
H.医薬産生、組成物、および製剤
1.製造
a.細胞バンクの製造
b.原薬の製造
c.薬物産物の製造
2.組成物
3.製剤
a.液体剤、注射剤、乳剤
b.熱安定性乾燥製剤
4.他の投与経路のための組成物
5.投薬量および投与
6.包装および製造物品
I.処置および使用の方法
1.腫瘍
2.投与
3.モニタリング
J.実施例
別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明(複数可)が属する技術分野における当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における開示全体にわたって言及される全ての特許、特許出願、出願公開および文献、GenBank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の刊行物は、特に注釈がない限り、その全体が参照により組み込まれるものとする。本明細書における用語に関して複数の定義が存在する場合には、この項におけるものが優先される。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されている場合があり、インターネット上の特定の情報が押し寄せてくる場合があるが、インターネット検索によって等価の情報を見出すことができることを理解されたい。その参照は、そのような情報の利用可能性および一般的な普及の証拠となる。
本明細書において免疫刺激性細菌と称される改変された細菌であって、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞および/もしくは腫瘍微小環境(TME)に蓄積するおよび/もしくはそこで複製する(すなわち、それに定着する);ならびに/または腫瘍常在性免疫細胞の細胞死をより少なく誘導する;ならびに/またはその阻害、抑制またはサイレンシングによって腫瘍療法が果たされる遺伝子を標的とする治療用産物、例えば、抗腫瘍剤、免疫刺激性タンパク質ならびに阻害性RNA(RNAi)、例えばshRNAおよびマイクロRNA(miRNA)、をコードする、改変された細菌が提供される。改変のための細菌の菌株は、治療的使用にいずれも好適である。本明細書において提供される改変された免疫刺激性細菌は、がんを処置するための使用のためのものおよび方法のためのものである。細菌は、そのような使用および方法のために改変される。
腫瘍微小環境(TME)内で認められる免疫抑制性環境は、腫瘍を発症し、進行させるドライバーである。がんは、免疫系が腫瘍の制御および封じ込めを失敗した後に出現する。複数の腫瘍特異的な機序が腫瘍環境を作り出し、免疫系は、それらを除去する代わりに腫瘍およびそれらの細胞の許容を示さざるを得ない。がん免疫療法の目標は、腫瘍を消失する免疫系の自然の能力を助けることである。微生物感染と関連する急性の炎症は、何世紀にもわたる観察に基づいた腫瘍の自然消失に関連している。
いくつかの臨床的ながん免疫療法は、抗腫瘍免疫に対する免疫抑制のバランスを混乱させることが求められている。IL-2およびIFN-α等のサイトカインを直接投与することを介して免疫を刺激するための戦略では、少数の患者において中程度の臨床応答が認められ、同時に重篤な全身性炎症関連毒性が誘導されてきた(Sharma et al. (2011) Nat Rev Cancer 11:805-812)。免疫系は、T細胞上のプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)の上方調節、および抗原提示細胞(APC)上と腫瘍細胞上の両方で発現されるその同族リガンドであるプログラム死リガンド1(PD-L1)に対するその結合等の自己免疫を制限するためにいくつかのチェックおよびバランスを進化させてきた。PD-L1がPD-1へ結合すると、CD8+T細胞シグナル伝達経路に干渉し、CD8+T細胞の増殖およびエフェクター機能を損なわせ、T細胞寛容を誘導する。PD-1およびPD-L1は、多数の阻害性「免疫チェックポイント」のうちの2つの例であり、これらは免疫応答を下方調節することによって機能する。他の阻害性免疫チェックポイントとしては、細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、シグナル調節タンパク質α(SIRPα)、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサー(VISTA)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)1および2、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、ガレクチン-9、IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有3(TIM-3、A型肝炎ウイルス細胞受容体2(HAVCR2)としても公知である)、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)、CD39、CD73、B7-H3(CD276としても公知である)、B7-H4、CD47、CD48、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD155、CD160、CD244(2B4)、B-およびT-リンパ球アテニュエーター(BTLA、またはCD272)およびがん胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM1、またはCD66a)がある。
冷たい腫瘍を再活性化し、より免疫原性になるようにするための試みにおいては、養子細胞療法(ACT)として公知であるある種の免疫療法は、免疫細胞を利用し、抗腫瘍活性を有するようにそれらを再プログラムする様々な戦略を包含する(Hinrichs et al. (2011) Immunol. Rev. 240:40-51)。樹状細胞ベースの治療法は、更なる免疫刺激特性を有する遺伝子操作された樹状細胞(DC)を導入する。これらの治療法は、がんに対する免疫寛容を破壊することができないために成功していない(例えば、Rosenberg et al. (2004) Nat. Med. 12:1279を参照のこと)。DCリクルートメントを刺激するために、内因性腫瘍抗原および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む全体が照射された腫瘍細胞を使用する、GVAXとして公知の方法は、腫瘍寛容を破壊するための能力が無いために同様に臨床においてできない(Copier et al. (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12:647-653)。個別の自家細胞ベース療法であるシプロイセル-T(Provenge)は、去勢抵抗性前立腺がんに対して2010年にFDA承認された。それは、患者から採取されたAPCを利用し、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)抗原を発現するように再武装し、T細胞応答を刺激し、次いでリンパ切除後に再導入される。残念ながら、その広範な採用は、観察される客観的奏効率が低く、かつコストが高いことによって制限されており、その使用は、前立腺がんの初期段階のみに限定される(Anassi et al. (2011) P T. 36(4):197-202)。同様に、自家T細胞療法(ATC)は、患者自身のT細胞を採取し、それらをエクスビボで再活性化し、腫瘍寛容を克服し、次いでそれらをリンパ切除後に患者へ再導入する。ATCの臨床的成功は限定され、黒色腫においてのみであり、同時に重大な安全性および実行可能性の問題が生じ、これらがその有用性を限定する(Yee et al. (2013) Clin. Cancer Res. 19:1-3)。
冷たい腫瘍は、T細胞および樹状細胞(DC)の浸潤が無く、T細胞非炎症性である(Sharma et al. (2017) Cell 9; 168(4):707-723)。冷たい腫瘍を再活性化し、より免疫原性にするための試みにおいては、別の種類の免疫療法で、腫瘍において自然にまたは工学に基づき蓄積することができる微生物が利用される。これらは、免疫系を刺激し、腫瘍抗原を発現し、その結果、免疫系を活性化および再プログラミングし、腫瘍を拒絶するように設計されたウイルスを含む。ウイルスベースのがんワクチンは、ウイルス性ベクター自体に対する既存のまたは後天的な免疫、ならびに腫瘍抗原を提示するのに十分な免疫原性の欠如を含むいくつかの因子のために臨床的に大きく失敗している(Larocca et al. (2011) Cancer J. 17(5):359-371)。APCの適正なアジュバント活性化が無いことも、DNAワクチン等の他の非ウイルス性ベクターがんワクチンの妨げになる。対照的に、腫瘍崩壊性ウイルスは、健常組織よりも分裂腫瘍細胞において優先的に複製しようとし、するとその後の腫瘍細胞溶解が、免疫原性の腫瘍細胞死および更なるウイルス性播種をもたらす。腫瘍崩壊性ウイルスのタリモジェンラヘルパレプベク(T-VEC)は、改変単純ヘルペスウイルスをDCリクルーティングサイトカインGM-CSFと組み合わせて使用しており、転移性の黒色腫に関してFDA承認されている(Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21)。一部の黒色腫患者における臨床的利点と、他の免疫療法よりも免疫毒性が少ないことが実証されたが、腫瘍内投与経路および製造条件が制限され、ならびに遠位腫瘍有効性および他の腫瘍タイプに対する幅広い適用が欠如している。とりわけ、パラミクソウイルス、レオウイルスおよびピコナウイルスを利用したもの等の他の腫瘍崩壊性ウイルス(OV)ベースのワクチンでは、全身性抗腫瘍免疫の誘導において類似の制限が認められる(Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300)。腫瘍崩壊性ウイルスの全身投与は、ユニークな課題を示す。I.V.投与の場合、ウイルスは急速に希釈され、したがって高力価が必要とされ、それが肝毒性をもたらすことがある。更に、既存の免疫が存在する場合、ウイルスは血液中で急速に中和され、そして後天的な免疫が反復投薬を制限する(Maroun et al. (2017) Future Virol. 12(4):193-213)。
1.細菌療法
細菌が抗がん活性を有するという認識は、何名かの医師が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)に感染した患者において腫瘍の退行を観察したときの1800年代にさかのぼる。William Coleyは、末期のがんの処置に対して細菌を利用して研究を最初に開始し、S.ピオゲネス(S.pyogenes)およびセラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)から構成されるワクチンを開発し、肉腫、がん腫、リンパ腫および黒色腫を含む様々ながんの処置に使用するのに成功した。その後、クロストリジウム属(Clostridium)、マイコバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、L.モノサイトゲネス等のリステリア属、およびエシェリキア属(Escherichia)の菌種を含むいくつかの細菌が、抗がんワクチンの原料として研究されている(例えば、国際公開第1999/013053号;国際公開第2001/025399号;Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199;Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21;Pawelek et al. (2003) Lancet Oncol.4:548-556を参照のこと)。
細菌は、ウイルスと同様、自然免疫刺激性であるという利点を有する。細菌およびウイルスは、宿主細胞パターン認識受容体(PRR)によって感知される病原体関連分子パターン(PAMP)として公知の保存構造を含むことは公知である。PRRによるPAMPの認識は、サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす下流シグナル伝達カスケード、および病原体クリアランスをもたらす免疫応答の開始を誘発する(Iwasaki and Medzhitov (2010) Science 327(5963):291-295)。自然免疫系にPAMPが関与する様式、および何のタイプの感染因子からかが、侵入病原体を阻止するための適切な適応免疫応答を決定する。
サルモネラ属は、がん治療剤として使用することができる細菌属の例示的なものである。本明細書において例示されるサルモネラ属は、弱毒化菌種、またはがん治療剤として使用するための改変が毒性を減少させることに基づいたものである。
いくつかの細菌菌種が、遠位部位から注射したときに、固形腫瘍内で優先的に複製することは実証されている。これらの細菌としては、これらに限定されるものではないが、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、およびエシェリキア属の菌種がある。細菌性感染に対する宿主の自然免疫応答と組み合わせた細菌の天然の腫瘍ホーミング特性は、抗腫瘍応答を媒介すると考えられている。この腫瘍組織指向性は、腫瘍のサイズを様々な程度に減少させることが示されている。これらの細菌菌種の腫瘍指向性に対する1つの要因は、無酸素または低酸素環境中で複製するための能力である。いくつかのこれらの天然の腫瘍指向性細菌が、抗腫瘍応答の効力を高めるように更に遺伝子操作されている(reviewed in Zu et al. (2014) Crit Rev Microbiol. 40(3):225-235;およびFelgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078)。
サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム(S.ティフィムリウム)は、抗がん治療剤として使用するための細菌菌種の例示的なものである。がんに対する宿主免疫を刺激するために細菌を使用するための1つのアプローチは、グラム陰性通性嫌気性菌S.ティフィムリウムを介しており、この菌は、腫瘍微小環境を含む低酸素部分および身体の壊死部分において優先的に蓄積する。S.ティフィムリウムは、組織壊死から栄養素を利用することができ、腫瘍血管系が漏出性であり、かつそれらが免疫系回避腫瘍微小環境において生き残る可能性が高いために、これらの環境において蓄積する(Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-294)。S.ティフィムリウムは、好気性と嫌気性の両方の条件下で成長することができ;したがって低酸素の程度が低い小さい腫瘍および低酸素の程度が高い大きい腫瘍に定着することができる。
がんの処置として投与するための治療用細菌は、弱毒化されるべきである。細菌性病原体を弱毒化するための様々な方法が、当技術分野において公知である。例えば、栄養要求性突然変異によって、細菌は必須栄養素を合成することができなくなり、aro、pur、gua、thy、nadおよびasd等の遺伝子における欠失/突然変異(米国特許出願公開第2012/0009153号)が広範囲に使用される。これらの遺伝子に関与する生合成経路によって産生される栄養素は、宿主細胞において利用できないことが多く、したがって、細菌の生存が課題である。例えば、サルモネラ属および他の菌種の弱毒化は、シキミ酸経路の一部であり、芳香族化合物アミノ酸生合成のための解糖に関連するaroA遺伝子の欠失によって達成することができる(Felgner et al. (2016) MBio 7(5):e01220-16)。したがって、aroAの欠失は、細菌の芳香族化合物アミノ酸栄養要求性、およびその後の弱毒化をもたらす(米国特許出願公開第2003/0170276号、同第2003/0175297号、同第2012/0009153号、同第2016/0369282号、国際出願公開第2015/032165号、および国際出願公開第2016/025582号)。同様に、aroCおよびaroDを含む、芳香族化合物アミノ酸のための生合成経路に関与する他の酵素は、欠失され、弱毒化が達成されている(米国特許出願公開第2016/0369282;国際特許出願公開第2016/025582号)。例えば、S.ティフィムリウム菌株SL7207は、芳香族化合物アミノ酸栄養要求株(aroA-突然変異体)であり;菌株A1およびA1-Rはロイシン-アルギニン栄養要求株である。VNP20009はプリン栄養要求株(purI-突然変異体)である。本明細書において示すように、免疫抑制性ヌクレオシドアデノシン栄養要求性でもある。
S.ティフィムリウムにおけるmsbB遺伝子によってコードされる酵素リピドA生合成ミリストイル転写酵素は、末端ミリスチル基がリポポリサッカライド(LPS)のリピドAドメインへ追加されることを触媒する(Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。したがってmsbBの欠失は、グラム陰性細菌の外膜の主要な構成成分であるLPSのリピドAドメインのアシル組成を変更する。この改変は、敗血症ショックを誘導するLPSの能力を顕著に減少させ、細菌菌株を弱毒化し、TNFαの潜在的に有害な産生を減少させ、したがって、全身毒性を低下させる。S.ティフィムリウム msbB突然変異体は、マウスにおける他の組織にわたる腫瘍に優先的に定着するそれらの能力を維持し、抗腫瘍活性を保持し、したがってサルモネラ属ベースの免疫療法の治療インデックスを増加させる(米国特許出願公開第2003/0170276号、同第2003/0109026号、同第2004/0229338号、同第2005/0225088号、同第2007/0298012号)。
プリン(例えばアデニン)、ヌクレオシド(例えばアデノシン)またはアミノ酸(例えば、アルギニンおよびロイシン)等の1つまたは複数の必須栄養素に対する栄養要求性にすることによって弱毒化することができる免疫刺激性細菌が用いられる。特に、S.ティフィムリウム等の本明細書において提供される免疫刺激性細菌の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境において優先的に蓄積するアデノシンに対する栄養要求性が付与される。したがって、本明細書において記載する免疫刺激性細菌の菌株は、成長するためにアデノシンを必要とし、以下で検討されるようなアデノシンを豊富に有するTMEで優先的に定着するため、弱毒化される。
染色体の異なる領域における遺伝子欠失を用いて複数の遺伝子的弱毒化を有する細菌は、弱毒化を増加し、同時に野生型遺伝的材料との相同的組換えによる遺伝子の獲得によってビルレント表現型への復帰の可能性を減少させることができるため、細菌免疫療法に望ましい。相同的組換えによってビルレンスが回復すると、同じ有機体内で起こるように2つの個別の組換え事象を必要とすることになる。理想的には、免疫療法薬剤において使用するために選択される弱毒突然変異の組合せは、有効性を低下させることなく忍容性を増加させ、その結果、治療インデックスが増加する。例えば、S.ティフィムリウム菌株VNP20009におけるmsbBおよびpurI遺伝子の撹乱は、腫瘍を標的とし、成長を抑制するために使用されており、動物モデルにおいて低毒性を誘導する(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002;Bermudes et al. (2000) Cancer Gene Therapy: Past Achievements and Future Challenges, edited by Habib Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp. 57-63;Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59;Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25;Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225;Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178;Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883;Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508)。VNP20009(msbB-/purI-)を同系またはヒト異種移植腫瘍を有するマウスに投与した場合、細菌は、300~1000対1を超える比で腫瘍の細胞外構成成分内に優先的に蓄積し、TNFα誘導を減少させ、腫瘍が退行し、制御マウスと比較して生存率が延長することが実証された(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002)。しかし、ヒトにおける第1相臨床試験からの結果、VNP20009は比較的安全であり、優れた耐容性を示すことが示されたが、不十分な蓄積がヒト黒色腫腫瘍において観察され、抗腫瘍活性は非常にわずかであることが実証された(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152)。任意の抗腫瘍活性を示すために必須の高用量は、毒性のために不可能であった。
出発菌株は、ATCC14028の識別特徴の全てを有する菌株等の、野生型非弱毒化菌株であり得る。次いで、菌株は、腫瘍微小環境へのまたは腫瘍細胞へのおよび/または腫瘍常在性免疫細胞へのその特異性または標的化を高めるように改変される。それを、アデノシン栄養要求性になるように改変することもできる。菌株をフラジェリン-(fliC-/fljB-)にすることができ、msbB-、purI-/M-、およびpagP-のうちの1つまたは複数にしてもよい。菌株は、asd-であり得る。改変された菌株は、RNAポリメラーゼIIまたはIII等の、哺乳動物宿主によって認識されるプロモーターの制御下の治療用産物を、一般には低から中コピー数で存在するプラスミド上にコードする。腫瘍微小環境における発現および細胞内での輸送を制御するための追加の調節配列を含めることもできる。
S.ティフィムリウムは、腫瘍関連抗原(TAA)サバイビン(SVN)をAPCへデリバリーし、適応免疫をプライムするようにも改変されている(米国特許出願公開第2014/0186401号;Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270)。SVNは、細胞生存を延長し、細胞周期制御を提供し、全ての固形腫瘍において過剰発現され、健常組織では発現が少ないアポトーシスタンパク質阻害剤(IAP)である。この技術は、サルモネラ病原性アイランド2(SPI-2)およびそのIII型分泌装置(T3SS)を利用しており、TAAをAPCのサイトゾルへデリバリーし、次いでAPCが活性され、TAA特異的CD8+T細胞および抗腫瘍免疫を誘導する(Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270)。リステリア属ベースのTAAワクチンと同様に、このアプローチは、マウスモデルにおいて有望であることを示しているが、ヒトにおける効果的な腫瘍抗原特異的T細胞初回抗原刺激はまだ実証されていない。
毒性を低下させ、抗腫瘍活性を改善する免疫刺激性細菌に対する強化が本明細書において提供される。そのような強化の例示的なものは、以下のものである。これらはサルモネラ属、特にS.ティフィムリウムに関して記載しており;当業者であれば、他の細菌菌種および他のサルモネラ属菌株において同様の強化を与えることができる点を理解されたい。
細菌におけるasd遺伝子は、アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。S.ティフィムリウムのasd-突然変異体は、細胞壁合成に必須のジアミノピメリン酸(DAP)に対して偏性の必須要件を有し、DAPに恵まれない環境において溶解されることになる。asd遺伝子がプラスミド上で、トランス型で相補される場合に、このDAP栄養要求性は、プラスミドを選択し、抗生物質を使用せずにプラスミドの安定性を維持するために、インビボで使用することができる。抗生物質不含ベースのプラスミド選択系は有利であり、1)有害事象の症状における急速なクリアランス機序として投与された抗生物質の使用、および2)そのような使用は通常回避される場合、抗生物質を使用しない生産のスケールアップを可能にする。asd遺伝子相補系はそのような選択を提供する(Galan et al. (1990) Gene 28:29-35)。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにasd遺伝子相補系を使用すると、遺伝子または干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたS.ティフィムリウムの効力を高めることが期待される。
トリプトファンおよびATP/アデノシン経路由来の代謝産物は、腫瘍内の免疫抑制性環境形成において主要なドライバーである。細胞の内部および外部に遊離形態で存在するアデノシンは、免疫機能のエフェクターである。アデノシンは、NF-κBのT細胞受容体誘導性活性化を低下させ、IL-2、IL-4、およびIFN-γを阻害する。アデノシンは、T細胞細胞毒性を減少させ、T細胞アネルギーを増加させ、Foxp3+またはLag-3+調節性(T-reg)T細胞へのT細胞分化を増加させる。NK細胞に関しては、アデノシンはIFN-γ産生を減少させ、NK細胞の細胞毒性を抑制する。アデノシンは、好中球接着血管外漏出を遮断し、食作用を減少させ、スーパーオキシドおよび一酸化窒素のレベルを弱毒化する。アデノシンは、マクロファージ上でTNF-α、IL-12、およびMIP-1αの発現も減少させ、MHCクラスII発現を弱毒化し、IL-10およびIL-6のレベルを増加させる。アデノシン免疫調節活性は、腫瘍の細胞外空間へのその放出および標的免疫細胞、がん細胞または内皮細胞表面上のアデノシン受容体(ADR)の活性化後に起こる。腫瘍微小環境においてアデノシンレベルが高いと、局在的な免疫抑制をもたらし、それが、がん細胞を消失するための免疫系の能力を制限する。
鞭毛は、細菌の表面上にある小器官であり、フックを介して回転モーターへ結合された長いフィラメントから構成され、そのモーターは、時計回りまたは反時計回りの様式で回転し、移動するための手段を提供することができる。S.ティフィムリウムにおける鞭毛は、胃腸管内の粘膜層全体での運動性を媒介するための能力に起因して、走化性のため、かつ経口経路を介した感染を確立するために重要である。鞭毛は、インビトロでの円柱腫瘍への走化性およびそこへの定着に必須であることが実証され(Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209)、運動性は、腫瘍貫通のために重要であることが示されているが(Toley and Forbes (2012) Integr Biol (Camb). 4(2):165-176)、鞭毛は、細菌が静脈内で投与された場合に、動物における腫瘍定着に必須ではない(Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456)。各鞭毛フィラメントは、何万ものフラジェリンサブユニットからなる。S.ティフィムリウム染色体は、2つの遺伝子、fliCおよびfljBを含み、これらは抗原的に異なるフラジェリンモノマーをコードする。fliCとfljBの両方が欠陥している突然変異体は、感染の経口経路を介して投与したときに非運動性およびビルレントであるが、非経口で投与したときにビルレンスを維持する。
S.ティフィムリウム等のサルモネラ属は、サルモネラ属含有液胞(SCV)と称される膜結合性コンパートメントにおいて主に複製する細胞内病原体である。一部の上皮細胞株においてかつ低頻度で、S.ティフィムリウムはサイトゾルへ逃避し、複製できることが示されてきた。SCVの脂質二重層が潜在的な障壁であるため、高い効率でSCVを逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属は、プラスミド等の高分子のデリバリーにおいてより効率的であろう。SCVからの逃避の頻度が強化されたサルモネラ属および方法が本明細書において提供される。これは、フィラメント(SIF)形成を誘導されるサルモネラ属に必須の遺伝子を欠失することによって達成される。これらの突然変異体は、SCVからの逃避の頻度が増加され、サイトゾルにおいて複製することができる。
細菌および真菌は、バイオフィルムと称される多細胞構造体を形成することができる。細菌性バイオフィルムは、分泌された細胞壁関連のポリサッカライド、糖タンパク質、および糖脂質、ならびに、細胞外高分子物質と総称される細胞外DNAの混合物に内包される。これらの細胞外高分子物質は、細菌を、洗浄剤、抗生物質、および抗菌ペプチド等の複数の傷害から保護する。細菌性バイオフィルムは、表面に定着し、インジェクションポートおよびカテーテル等の人工器官の顕著な感染の原因である。バイオフィルムは、感染の進行中の組織において形成し、細菌存続およびシェディングの持続を増加させ、抗生物質療法の有効性を制限する場合もある。バイオフィルムにおける細菌の慢性的な存続は、例えば胆嚢のS.ティフィ(S.typhi)感染における腫瘍形成の増加と関連する(Di Domenico et al. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887)。
グラム陰性細菌のLPSは、細菌膜の外葉の主要な構成成分である。それは、3つの主要な部分であるリピドA、非反復コアオリゴサッカライド、およびO抗原(またはOポリサッカライド)からなる。O抗原は、LPS上の最も外側の部分であり、細菌透過性に対する防御層としての役割を果たすが、O抗原の糖組成は、菌株間で広範囲に異なる。リピドAおよびコアオリゴサッカライドは非常に少なく、より典型的には、同じ菌種の菌株内に保存される。リピドAは、エンドトキシン活性を含むLPSの一部である。それは、典型的には、複数の脂肪酸で修飾されるジサッカライドである。これらの疎水性脂肪酸鎖は、LPSを細菌膜へ固定し、残りのLPSは細胞表面から突出する。リピドAドメインは、グラム陰性細菌の毒性の多くの原因となる。典型的には、血液中のLPSは、深刻な病原体関連分子パターン(PAMP)として認識され、重度の炎症促進性応答を誘導する。LPSは、CD14、MD2およびTLR4を含む膜結合受容体複合体のためのリガンドである。TLR4は、輸送膜タンパク質NFκB経路を刺激するためのMyD88およびTRIF経路を介してシグナルを送ることができ、TNF-αおよびIL-1β等の炎症促進性サイトカインの産生をもたらし、内毒素性ショックとなることがある結果、命に関わる場合がある。哺乳動物細胞のサイトゾル中のLPSは、カスパーゼ4、5、および11のCARDドメインに直接結合し、自己活性化およびパイロトーシス細胞死を引き起こすことがある(Hagar et al. (2015) Cell Research 25:149-150)。リピドAの組成およびリピドA変異体の毒素産生性は十分に立証されている。例えば、モノリン酸化されたリピドAは、複数のホスフェート基を有するリピドAよりも炎症性が低い。リピドA上のアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に深刻な影響を与える場合がある。E.コリからの標準的なリピドAは、6個のアシル鎖を有し、このヘキサアシル化は、強力な毒性である。S.ティフィムリウムリピドAは、E.コリのものと同様であり;それは4つの第一級および2つの第二級ヒドロキシアシル鎖を保有するグルコサミンジサッカライドである(Raetz and Whitfield (2002) Annu Rev Biochem. 71:635-700)。
上述のように、S.ティフィムリウム等のサルモネラ属菌種を含む、ある特定の細菌菌種における病態形成には、サルモネラ(Salmonella)病原性アイランド(SPI;図22を参照のこと)と称される遺伝子のクラスターが関与する。SPI-1と称されるSPIは、上皮細胞侵入を媒介する。オペロンおよび遺伝子およびそれらの機能は、図22に示されている。SPI-1遺伝子は、これらに限定されないが、avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB、およびsptPを含む。これらの遺伝子のうちの1つまたは複数の欠失は、上皮細胞に感染する細菌の能力を低下させるかまたは消失させるが、免疫食細胞を含む、食細胞に感染または侵入するそれらの能力に影響を与えない。
endA遺伝子(例えば、配列番号250)は、グラム陰性細菌のペリプラズムにおける二本鎖DNAの分解を介在するエンドヌクレアーゼ(例えば、配列番号251)をコードする。endA遺伝子の突然変異は、高収率のプラスミドDNAを可能にするため、実験用E.コリの最も一般的な菌株はendA-である。この遺伝子は菌種と一緒に保存される。無傷プラスミドDNAデリバリーを促進するために、遺伝子操作された免疫刺激性細菌のendA遺伝子を欠失または突然変異させ、そのエンドヌクレアーゼ活性を阻止する。そのような突然変異の例示的なものは、E208Kアミノ酸置換(Durfee、et al. (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606)または目的の菌種に対応する突然変異である。E208を含むendAは、サルモネラ属を含む細菌菌種と一緒に保存される。したがって、E208K突然変異を使用し、サルモネラ属菌種を含む他の菌種においてエンドヌクレアーゼ活性を消失することができる。当業者であれば、endA活性を消失するために、他の突然変異または欠失を導入することができる。サルモネラ属等、本明細書における免疫刺激性細菌においてendAの活性を消失するために、遺伝子にこの突然変異または欠失または撹乱を行うと、無傷プラスミドDNAデリバリーの効率を増加させ、その結果、shRNAおよび/またはmiRNA等のRNAの発現を増加させ、プラスミドにおいてコードされる免疫チェックポイントのうちのいずれかまたは2つ以上を標的とし、その結果、チェックポイント遺伝子のRNAi-介在性ノックダウンを増加させ、抗腫瘍有効性を強化する。
TLR非依存性I型IFN経路のうちの1つは、サイトゾルにおける一本鎖ストランド(ss)および二本鎖ストランド(ds)RNAの宿主認識によって介在される。これらは、RNAヘリカーゼによって感知され、これらとしては、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)、黒色腫分化関連遺伝子5(MDA-5)があり、IRF-3転写因子のIFN-βプロモーター刺激因子1(IPS-1)アダプタータンパク質介在性リン酸化を介して、I型IFNの誘導を引き起こす(Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919)。RIG-Iは、5’-トリホスフェートを有するdsRNAおよびssRNAを認識する。この部分は、RIG-Iに直接結合するか、またはポリDNA依存性RNAポリメラーゼIII(Pol III)によってポリ(dA-dT)鋳型から合成することができる(Chiu, Y. H. et al. (2009) Cell 138(3):576-91)。2つのAAジヌクレオチド配列を含むポリ(dA-dT)鋳型は、一般的なレンチウイルスshRNAクローニングベクター中のU6プロモーター転写開始部位において生じる。その後のプラスミドにおけるその欠失は、I型IFN活性化を阻止する(Pebernard et al. (2004) Differentiation. 72:103-111)。RIG-I結合配列は、本明細書において提供されるプラスミドに含むことができ;含有していると、本明細書における免疫刺激性細菌の抗腫瘍活性を増加させる免疫刺激を増加することができる。
外来および自己DNA分解の原因となる別のヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであるDNase IIであり、これはエンドソームのコンパートメント中に常在し、アポトーシス後のDNAを分解する。DNase II(マウスにおけるDnase2a)が無いと、サイトゾルへ逃避し、cGAS/STINGシグナル伝達を活性化するエンドソームDNAの蓄積をもたらす(Lan YY et al. (2014) Cell Rep. 9(1):180-192)。TREX1と同様に、ヒトにおけるDNase II-欠乏は、自己免疫I型インターフェロン症を示す。がんでは、腫瘍常在性マクロファージによって取り込まれた死滅腫瘍細胞は、cGAS/STING活性化およびエンドソームコンパートメント内のDNAのDNase II消化を介した潜在的な自己免疫を阻止する(Ahn et al. (2018) Cancer Cell 33:862-873)。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、DNase IIの発現を阻害するか、抑制するか、または撹乱し、腫瘍微小環境においてDNase IIを阻害することができるshRNAまたはmiRNA等のRNAiをコードし、その結果、サイトゾルにおいてエンドサイトーシスされたアポトーシス腫瘍DNAの蓄積をもたらし、強力なcGAS/STINGアゴニストとして作用することができる。
TREX1およびDNase IIは、異常なDNA蓄積を除去するために機能するが、RNase H2は、サイトゾルにおいてRNA:DNAハイブリッドの病原性の蓄積を消失するために同様に機能する。TREX1と同様に、RNase H2の不足は、エカルディグティエール症候群の自己免疫表現型の一因にもなる(Rabe、B. (2013) J Mol Med. 91:1235-1240)。特に、RNase H2の損失およびRNA:DNAハイブリッドまたはゲノム埋込リボヌクレオチド基質のその後の蓄積は、cGAS/STINGシグナル伝達を活性化することを示している(MacKenzie et al. (2016) EMBO J. Apr15;35(8):831-44)。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、RNAse H2の発現を阻害するか、抑制するか、または撹乱するshRNAまたはmiRNA等のRNAiをコードし、その結果RNase H2を阻害し、腫瘍由来RNA:DNAハイブリッドおよびこれらの誘導体をもたらし、cGAS/STINGシグナル伝達および抗腫瘍免疫を活性化する。
最初に単球上で発現され、免疫調節することに関与する別の分子は、スタビリン-1(遺伝子名STAB1、CLEVER-1、FEEL-1としても公知である)である。スタビリン-1は、炎症後に内皮細胞およびマクロファージ上で、特に腫瘍関連マクロファージ上で上方調節されるI型輸送膜タンパク質である(Kzhyshkowska et al. (2006) J. cell. Mol. Med. 10(3):635-649)。炎症が活性化した場合に、スタビリン-1はスカベンジャーとして作用し、創傷治癒およびアポトーシス小体クリアランスを助け、肝線維症等の組織損傷を阻止することができる(Rantakari et al. (2016) PNAS 113(33):9298-9303)。スタビリン-1の上方調節は、抗原特異的T細胞応答を直接阻害し、単球におけるsiRNAによるノックダウンは、それらの炎症促進性機能を強化することが示された(Palani、S. et al. (2016) J Immunol.196:115-123)。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、腫瘍微小環境においてスタビリン-1/CLEVER-1の発現を阻害するか、抑制するか、または撹乱するshRNAまたはmiRNA等のRNAiをコードし、その結果腫瘍常在性マクロファージの炎症促進性機能を強化する。
本明細書における免疫刺激性細菌を、抗腫瘍応答を促進するか誘導するかまたは強化する免疫刺激性タンパク質をコードするように改変することができる。免疫刺激性タンパク質は、真核生物対象、特に、免疫刺激性細菌が投与されることになるヒト等の対象における発現のために、RNAポリメラーゼIIによって認識されるプロモーター等の、真核生物プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上にコードすることができる。免疫刺激性タンパク質をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞における発現または輸送のための、例えば、細胞の表面での分泌または発現のための、他の調節シグナルを含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書における免疫刺激性細菌は、これらに限定されないが、IL-2、IL-7、IL-12(IL-12p70(IL12p40+IL-12p35))、IL-15(およびIL-15:IL-15Rアルファ鎖複合体)、およびIL-18を含む、免疫系を刺激するためのサイトカインを発現するように、遺伝子操作される。サイトカインは、腫瘍部位の免疫エフェクター細胞および間質細胞を刺激し、細胞毒性細胞による腫瘍細胞認識を強化する。一部の実施形態では、免疫刺激性細菌を、例えばCCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10およびCXCL11等の、ケモカインを発現するように、遺伝子操作することができる。
がんの処置のために認可された最初のサイトカインであるインターロイキン-2(IL-2)は、CTL成長の活性化および促進、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞の発生、Treg細胞成長および増殖の促進、TILの刺激、ならびにT細胞、B細胞およびNK細胞増殖および分化の促進を含む、いくつかの機序によって、免疫系の活性化に関与する。組換えIL-2(rIL-2)は、転移性腎細胞癌(RCC)および転移性黒色腫の処置のためにFDAにより認可されている(Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166)。
IL-2スーパーファミリーのメンバーであるIL-7は、T細胞の生存、増殖および恒常性に関与する。IL-7受容体の突然変異は、T細胞の喪失、および重症複合免疫不全(SCID)の発症をもたらすことが示されており、これにより、IL-7がT細胞発生において果たす重要な役割が強調される。IL-7は、休止ナイーブおよびメモリーT細胞に連続シグナルを提供する恒常性サイトカインであり、リンパ球減少状態の間に蓄積して、T細胞増殖とT細胞レパートリー多様性の両方の増加をもたらす。IL-2と比較して、IL-7は、CD4+FOXP3+調節性T細胞よりもCD8+T細胞の拡大に選択的である。組換えIL-7は、マウスにおいてワクチン接種および養子細胞療法後に抗原特異的T細胞応答を増強することが示されている。IL-7は、造血幹細胞移植の化学療法後のT細胞回復の促進に関与することもできる。進行した悪性腫瘍を有する患者に関する早期臨床試験によって、組換えIL-7が、良好な耐容性を示し、生物活性用量で制限毒性がある(すなわち、循環CD4+およびCD8+T細胞の数が3~4倍増加した)ことが示されている(Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。IL-7は、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、前立腺がんおよび神経膠芽腫等の腫瘍において抗腫瘍効果を有することが示されており、マウスモデルにおけるIL-7のインビボ投与は、がん細胞成長の減少をもたらした。IL-7は、ラット神経膠腫腫瘍においてIFN-γの抗腫瘍効果を強化すること、ならびに単球によるIL-1α、IL-1βおよびTNF-αの産生を誘導し、その結果、黒色腫成長が阻害されることになることも示されている。加えて、小児肉腫の処置後の組換えIL-7の投与は、免疫回復の促進をもたらした(Lin et al. (2017) Anticancer Research 37:963-968)。
介在性免疫を促進する生物活性IL-12(IL-12p70)は、p35およびp40サブユニットで構成されているヘテロダイマーであり、これに対してIL-12p40モノマーおよびホモダイマーは、IL-12アンタゴニストとして作用する。抗原提示細胞によって分泌されるIL-12は、NKおよびT細胞からのIFN-γの分泌を促進し、腫瘍血管新生を阻害し、NK細胞、CD8+T細胞およびCD4+T細胞の活性化および増殖をもたらし、CD4+Th0細胞のTh1細胞への分化を増進し、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)を促進する。IL-12は、黒色腫、結腸癌、乳癌および肉腫のマウスモデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが示されている(Kalinski et al. (2001) Blood 97:3466-3469; Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol.13(3):148-166; Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。
IL-15は、IL-2と構造的に類似しており、IL-2およびIL-15は両方とも、T細胞の増殖および活性化のための初期刺激を提供するが、IL-15は、刺激されたT細胞の消失およびT細胞寛容の誘導につながるプロセスであって、メモリーT細胞応答を制限し、単独でのIL-2の治療有効性を制限する可能性があるプロセスである、IL-2誘導アポトーシスを遮断する。IL-15は、長期抗腫瘍免疫を維持するためのメモリーCD8+T細胞の存続も支援し、前臨床マウスモデルにおいて抗原非依存的な方法でのCD8+エフェクターT細胞の直接活性化によって有意な抗腫瘍活性を実証した。CD8+T細胞に加えて、IL-15は、エフェクターナチュラルキラー(NK)細胞の発生、増殖および活性化に関与する(Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893; Han et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810)。
IL-18は、NKおよびCD8+T細胞によるIFN-γの分泌を誘導して、それらの毒性を強化する。IL-18はまた、マクロファージを活性化し、Th1ヘルパーCD4+T細胞の発生を刺激する。IL-18は、いくつかの前臨床マウスモデルにおいて有望な抗腫瘍活性を示している。例えば、組換えIL-18(rIL-18)の投与は、同種マウスにおいてCD4+T細胞および/またはNK細胞介在性応答の活性化によって黒色腫または肉腫の退縮をもたらした。他の研究は、IL-18抗腫瘍効果が、IFN-γによって媒介され、血管新生機序を伴うことを示した。IL-12等の他のサイトカインとまたはCD80等の共刺激分子とIL-18の組合せは、IL-18介在性抗腫瘍効果を強化する。進行した固形腫瘍およびリンパ腫を有する患者における第I相臨床試験は、IL-18投与が安全であること、ならびにそれが、免疫調節活性をもたらし、患者の血清IFN-γおよびGM-CSFレベルの上昇と若干の臨床応答とをもたらすことを示した。臨床試験は、IL-18を、他の抗がん治療剤、例えば、モノクローナル抗体、細胞毒性薬またはワクチンと、組み合わせることができることを示した(Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol.97:665-675; Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。
ケモカインは、損傷部位または炎症部位への白血球遊走を媒介し、免疫応答および炎症応答の介在に関与する、小分子サイトカインのファミリーである。ケモカインは、それらの配列中のシステイン残基の位置に基づいて4つのサブファミリー、すなわち、XCケモカインリガンド、CCケモカインリガンド、CXCケモカインリガンドおよびCX3Cケモカインリガンド、またはXCL、CCL、CXCLおよびCX3CLに分類される。ケモカインリガンドは、それらの同族受容体に結合し、免疫細胞の循環、ホーミングおよび保持を調節し、ケモカインリガンド-受容体ペア各々が、ある特定の種類の免疫細胞を選択的に調節する。異なるケモカインは、異なる白血球集団を誘引し、インビボで濃度勾配を形成し、誘引された免疫細胞は、この勾配によって、より高いケモカイン濃度の方に移動する(Argyle D. and Kitamura, T. (2018) Front. Immunol. 9:2629; Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335)。ケモカインは、腫瘍への免疫細胞の浸潤を増加させること、およびナイーブT細胞およびB細胞を刺激する、腫瘍流入領域リンパ節への抗原提示細胞(APC)の移動を助長することによって、抗腫瘍免疫応答を改善することができる(Lechner et al.(2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340)。本明細書における免疫刺激性細菌を、これらに限定されないが、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10およびCXCL11を含む、ケモカインをコードするように、遺伝子操作することができる。
CCL3、CCL4およびCCL5は、高い相同度を共有し、ヒトとマウス両方における、成熟DCおよびT細胞を含む、いくつかの細胞タイプ上のCCR5(CCL3、CCL4およびCCL5)およびCCR1(CCL3およびCCL5)に結合する。治療用T細胞は、CCL3、CCL4およびCCL5の腫瘍特異的分泌によって、腫瘍部位への自然免疫細胞の走化性を誘導することが示されている(Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335)。
CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(ITAC)は、IFN-γの産生によって誘導される。これらのケモカインは、活性化T細胞上に優先的に発現されるCXCR3に結合し、血管新生抑制的にも、白血球のリクルートメントおよび活性化においても、機能する。結腸直腸がんの予後は、腫瘍浸潤T細胞、特に、Th1およびCD8+エフェクターT細胞と強く相関し、CXCL9、CXCL10、CXCL11の高度の腫瘍内発現は、良好な予後を示す。例えば、結腸がんを有する163名の患者の試料において、高いCXCL9またはCXCL11レベルを有した者は、術後生存率の増加を示し、高度なCXC発現を有した患者は、有意に多いCD3+T細胞、CD4+ヘルパーT細胞およびCD8+細胞毒性T細胞数を有した。結腸直腸がん患者の肝臓転移では、CXCL9およびCXCL10レベルは、浸潤先進部において増加され、エフェクターT細胞密度と相関した。CXCR3に対するCXCL9およびCXCL10の作用によるリンパ球遊走の刺激は、浸潤先進部においてCCL5の産生をもたらした(Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601; Kistner et al. (2017) Oncotarget 8(52):89998-90012)。
共刺激分子は、腫瘍細胞に対する免疫応答を強化し、共刺激経路は、腫瘍形成を促進するために腫瘍細胞によって阻害される。本明細書における免疫刺激性細菌を、例えば、CD40、CD40L、4-1BB、4-1BBL、OX40(CD134)、OX40L(CD252)、TNFRスーパーファミリーの他のメンバー(例えば、CD27、GITR、CD30、Fas受容体、TRAIL-R、TNF-R、HVEM、RANK)、B7およびCD28等の、共刺激分子を発現するように遺伝子操作することができる。本明細書における免疫刺激性細菌を、抗腫瘍免疫応答を強化するために共刺激分子に対するアゴニスト抗体を発現するように遺伝子操作することもできる。
TNFスーパーファミリーのリガンド(TNFSF)およびそれらの受容体(TNFRSF)は、腫瘍および免疫エフェクター細胞の増殖、分化、活性化および生存に関与する。このファミリーのメンバーは、アポトーシスを誘導するCD30、Fas-L、TRAIL-RおよびTNF-R、ならびにBおよびT細胞免疫応答を調節するCD27、OX40L、CD40L、GITR-Lおよび4-1BBLを含む。他のメンバーとしては、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)およびCD27が挙げられる。本明細書における免疫刺激性細菌によるTNFSFおよびTNFRSFの発現は、抗腫瘍免疫応答を強化することができる。例えば、マウス腫瘍における4-1BBLの発現は免疫原性を強化し、OX40Lの発現増加を有する樹状細胞(DC)の腫瘍内注射はマウスモデルにおいて腫瘍拒絶をもたらすことができることが、示されている。研究によって、B16黒色腫細胞への、組換えGITRを発現するアデノウイルスの注射は、T細胞浸潤を促進し、腫瘍容量を減少させることも示されている。4-1BB、OX40およびGITR等の分子に対する刺激性抗体を、免疫系を刺激するために免疫刺激性細菌にコードすることもできる。例えば、アゴニスト抗4-1BBモノクローナル抗体は、抗腫瘍CTL応答を強化することが示されており、アゴニスト抗OX40抗体は、移植可能な腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を増加させることが示されている。加えて、アゴニスト抗GITR抗体は、抗腫瘍応答および免疫を強化することが示されている(Lechner et al.(2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Peggs et al.(2009) Clinical and Experimental Immunology 157:9-19)。
TNF受容体スーパーファミリーのメンバーであるCD40は、APCおよびB細胞によって発現されるが、そのリガンドであるCD40L(CD154)は、活性化T細胞によって発現される。CD40とCD40L間の相互作用は、サイトカインを産生するようにB細胞を刺激し、その結果、T細胞活性化および腫瘍細胞死が生じる。研究によって、抗腫瘍免疫応答は、T細胞上でのCD40Lの発現の減少または樹状細胞上でのCD40の発現の低減によって損なわれることが示されている。CD40は、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性白血病および慢性リンパ球性白血病等の、いくつかのB細胞腫瘍の表面に発現され、CD40Lとのその相互作用は、CD40+腫瘍細胞におけるB7.1/CD80、B7.2/CD86およびHLAクラスII分子の発現を増加させ、それらの抗原提示能力を向上させることが示されている。多発性骨髄腫のマウスモデルにおけるCD40Lのトランスジェニック発現は、CD4+およびCD8+T細胞、局在性および全身性抗腫瘍免疫応答ならびに低減された腫瘍増殖の誘導をもたらした。抗CD40アゴニスト抗体は、抗腫瘍T細胞応答も誘導した(Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39; Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207; Murugaiyan et al. (2007) J Immunol.178:2047-2055)。
4-1BB(CD137)は、そのリガンドである4-1BBLに結合して免疫細胞増殖および活性化を誘発する、T細胞、NK細胞およびAPC(DC、B細胞および単球を含む)によって発現される、誘導性共刺激受容体である。4-1BBは、活性化T細胞のより長い、より広範な応答をもたらす。抗4-1BBアゴニストおよび4-1BBL融合タンパク質は、CD4+およびCD+T細胞が介在する、例えば肉腫およびマスト細胞腫に対する、免疫介在性抗腫瘍活性、ならびに腫瘍特異的CTL活性を増加させることが示されている(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39)。
OX40(CD134)は、活性化エフェクターT細胞上に発現されるTNF受容体スーパーファミリーのメンバーであるが、そのリガンドであるOX40Lは、TLRアゴニストによる活性化およびCD40-CD40Lシグナル伝達後に、DC、B細胞およびマクロファージを含むAPC上に発現される。OX40-OX40Lシグナル伝達は、T細胞の活性化、増強、増殖および生存、ならびにNK細胞機能のモジュレーション、およびTregの抑制活性の阻害をもたらす。OX40によるシグナル伝達は、サイトカイン(IL-2、IL-4、IL-5およびIFN-γ)の分泌ももたらし、その結果、Th1およびTh2細胞応答を高める。TILによる腫瘍抗原の認識は、TILによるOX40の発現増加をもたらし、この発現増加は、予後の改善との相関関係が証明されている。研究によって、抗OX40アゴニスト抗体またはFc-OX40L融合タンパク質での処置は、黒色腫、肉腫、結腸癌および乳がんのマウスモデルにおいて腫瘍特異的CD4+T細胞応答の強化および生存率の増加をもたらす一方で、腫瘍細胞ワクチンに組み込まれたFc-OX40Lは、乳癌細胞でのその後のチャレンジからマウスを防御することが実証されている(Lechner et al.(2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Marin-Acevedo et al.(2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39)。
CD28は、抗原提示細胞上に発現される共刺激分子であるB7-1(CD80)およびB7-2(CD86)の受容体として作用する、T細胞の表面に発現される共刺激分子である。CD28-B7シグナル伝達は、T細胞活性化および生存、ならびにT細胞アネルギーの阻止に必要とされ、IL-6等のインターロイキンの産生をもたらす。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌のゲノムを、免疫細胞、特に、腫瘍微小環境における免疫細胞、例えば食細胞、への感染を増加させるまたは促進するように改変することができる。これは、上皮細胞等の非免疫細胞への感染を減少させること、または免疫細胞への感染を増加させることを含む。細菌を、免疫細胞におけるパイロトーシスを減少させるように改変することもできる。細菌ゲノムの非常に多くの改変は、免疫細胞への感染を増加させることおよびパイロトーシスを減少させることの一方または両方を行うことができる。本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、このような改変、例えば、SPI-1 T3SS経路に関与する遺伝子の欠失および/または撹乱、例えば、hilAの撹乱もしくは欠失、ならびに/またはフラジェリン、ロッドタンパク質およびニードルタンパク質をコードする遺伝子の撹乱/欠失を含む。
自然免疫および抗菌応答に関与するマクロファージNLRC4インフラマソームは、サイトゾル病原体を認識し、カスパーゼ1の自己触媒的活性化をもたらす、大きい多タンパク質複合体である。カルパーゼ-1の活性化は、炎症促進性サイトカインIL-1βおよびIL-18の成熟および放出を誘導し、急速炎症型のマクロファージ細胞死であるパイロトーシスを誘発する。3または4型分泌装置をコードする、ある特定のグラム陰性細菌、例えば、サルモネラ・ティフィムリウムおよびPseudomonas aeruginosaによる感染は、Stm病原性アイランド-1のIII型分泌装置(SPI-1 T3SS)による宿主細胞サイトゾルへのトランスロケーション後、ニードルタンパク質、ロッドタンパク質およびフラジェリン等の細菌リガンドの認識によってNLRC4インフラマソームの活性化を誘発する。パイロトーシスは、マクロファージに限定されず、カスパーゼ-1依存性の死が、サルモネラ属による感染後に樹状細胞において観察されている(Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447; Chen et al. (2014) Cell Reports 8:570-582; (Fink and Cookson (2007) Cellular Microbiology 9(11):2562- 2570))。本明細書において示されるように、パイロトーシスの誘導に関与するサルモネラ属ゲノム内の遺伝子のノックアウトは、抗腫瘍免疫応答を強化する。これは、細菌感染後の、マクロファージを含む免疫細胞の喪失を、阻止する。例えば、hilA、ロッドタンパク質(PrgJ)、ニードルタンパク質(PrgI)、フラジェリンおよび/またはQseCをコードする遺伝子を、本明細書において提供される免疫刺激性細菌においてノックアウトすること/撹乱することができる。
3型分泌装置(T3SS)を含む、侵入関連サルモネラ病原性アイランド-1(SPI-1)は、サルモネラ属の取込みにつながるアクチン再構成を引き起こす、宿主細胞のサイトゾルへのエフェクタータンパク質のトランスロケーションの原因となる。hilAは、SPI-1遺伝子の転写活性化因子であり、その発現は、例えば、酸素、モル浸透圧濃度、pHおよび増殖期等の、環境シグナルによって調節される。準最適条件は、hilAの発現を抑止することによって、細菌の侵襲性表現型を抑制する(Kong et al.(2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419)。T3SSエフェクターは、真核細胞等の宿主非食細胞へのS.ティフィムリウムの取込みを媒介する。SPI-1 T3SSは、消化管上皮層を横断するのに必須であるが、細菌が非経口注射される場合等には、感染にとって重要でない。SPI-1突然変異体は、上皮細胞侵入に欠陥があり、したがって経口ビルレンスを低下させるが、マクロファージ等の食細胞によって正常に取り込まれる。本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、hilA遺伝子および/またはT3SS経路における他の遺伝子の欠失または撹乱を有するものを含む。これらの細菌が、投与、例えば、静脈内投与または腫瘍内投与された場合、感染は、取込みのためにSPI-1 T3SSを必要としない、マクロファージおよび樹状細胞等の食細胞に集中される。これは、本明細書において提供される免疫刺激性細菌の安全性プロファイルを強化する。それは、オフターゲットの細胞への侵入を阻止し、糞口感染を阻止する。
SPI-1 T3SSに加えて、サルモネラ属等の細菌のフラジェリンは、マクロファージにおけるパイロトーシスの誘発に必要であり、マクロファージNLRC4インフラマソームによって検出され得る。鞭毛の主要構成成分であるフラジェリンは、TLR5によって認識される。サルモネラ属は、fliCおよびfljBという2つのフラジェリン遺伝子をコードし、フラジェリンサブユニットの消失は、マクロファージにおけるパイロトーシスを減少させる。例えば、fliCおよびfljBの欠失を有するS.ティフィムリウムは、野生型株と比較して有意に減少したIL-1β分泌をもたらすが、細菌の細胞取込みおよび細胞内複製は、依然として影響を受けない。これは、フラジェリンが、インフラマソーム活性化において有意な役割を果たすことを実証する。加えて、FliCを構成的に発現するように遺伝子操作されたS.ティフィムリウム菌株は、マクロファージパイロトーシスを誘導することが見出された(Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447; Fink and Cookson (2007) Cellular Microbiology 9(11):2562-2570; Winter et al. (2015) Infect. Immun.83(4):1546-1555)。本明細書における免疫刺激性細菌のゲノムを、S.ティフィムリウムにおけるフラジェリン遺伝子fliCおよびfljBを欠失させるかまたは突然変異させるように改変し、その結果、マクロファージ等の腫瘍常在性免疫細胞の細胞死の減少をもたらすこと、および免疫刺激性細菌の抗腫瘍免疫応答を強化することができる。
NLRC4も有鞭毛S.ティフィムリウムを検出する。フラジェリン非依存性応答は、S.ティフィムリウムにおけるSPI-1 T3SSロッドタンパク質であるPrgJの欠失に起因することが発見された。マクロファージサイトゾルへの精製PrgJタンパク質のデリバリーは、迅速なNLRC4依存性カスパーゼ-1活性化をもたらし、フラジェリンによって誘導される効果と同様の、IL-1βの分泌ももたらした(Miao et al.(2010) PNAS 107(7):3076-3080)。したがって、S.ティフィムリウムにおけるPrgJをコードする遺伝子の突然変異またはノックアウトは、マクロファージパイロトーシスを減少させることができ、これは、免疫刺激性細菌の抗腫瘍免疫効果を、これらの細菌によって死滅させられやすい免疫細胞を保護することによって、強化する。
S.ティフィムリウムにおけるSPI-1 T3SSニードルタンパク質であるPrgIもまた、NLRC4によって認識され、NLRC4を活性化する。ヒト初代単球由来のマクロファージのサイトゾルへのS.ティフィムリウムPrgIのデリバリーは、IL-1β分泌およびその後の細胞死をもたらしたが、PrgIを発現するがフラジェリンを発現しないサルモネラ属突然変異体は、初代単球由来のマクロファージにおいてフラジェリンを発現する菌株より後の時点でインフラマソームを活性化することが示された(Kortmann et al. (2015) J. Immunol. 195:815-819)。本明細書において提供される免疫刺激性細菌を、S.ティフィムリウムにおけるニードルタンパク質をコードする遺伝子を突然変異または欠失させるように改変し、その結果、免疫細胞パイロトーシスを阻止することおよび抗腫瘍免疫効果を強化することができる。
QseCは、多くのグラム陰性細菌において見出され、環境に応答し、いくつかのビルレンス因子の発現を調節する、高度に保存される膜ヒスチジンセンサーキナーゼであり、前記ビルレンス因子には、S.ティフィムリウムにおける鞭毛生合成の主要調節因子をコードするflhDC遺伝子;非食細胞への侵入、サルモネラ属含有液胞(SCV)の早期成熟および輸送の調節、ならびにSCV-リソソーム融合の阻害に関与するタンパク質をコードする、sopB遺伝子;ならびにSCV維持および膜完全性に必要とされるsifA遺伝子が含まれる。LED209によるQseCの選択的阻害は、S.ティフィムリウム成長を抑制することなく、ビルレンス関連遺伝子発現(例えば、flhDC、sifAおよびsopB)のQseC介在性活性化を阻害することによって細菌のビルレンスを阻害すること、およびS.ティフィムリウムまたはFrancisella tularensisによる感染後に死なないようにマウスをある程度防御することが示されている。QseC遮断は、感染したマクロファージにおける過剰なインフラマソーム活性化を阻害することによって、カスパーゼ-1活性化、IL-1β放出およびマクロファージのS.ティフィムリウム誘導パイロトーシスを阻害することが見出された。QseCの阻害はまた、鞭毛遺伝子発現および運動性を抑制し、S.ティフィムリウムの上皮細胞への侵入能力および上皮細胞における複製能力を抑制した(Li et al.(2016) Scientific Reports 6:37447)。したがって、QseCをコードする遺伝子を突然変異させるようにまたはノックアウトするように本明細書における免疫刺激性細菌を改変することは、S.ティフィムリウム感染を非上皮細胞に集中させることによって、および免疫細胞の細胞死を、例えばマクロファージにおけるパイロトーシスを阻止することにより、減少させることによって、抗腫瘍免疫応答を強化することができる。
細菌のための培養条件は、それらの遺伝子発現に影響を与える場合がある。S.ティフィムリウムは、SPI-1およびその関連するT3SS-1を含む機序により、感染して30~60分以内にマクロファージの急速な炎症促進性カスパーゼ依存性細胞死を誘導することができるが、上皮細胞は誘導しないことが報告されている(Lundberg et. al (1999) Journal of Bacteriology 181(11):3433-3437)。この細胞死は、その後、IL-1βおよびIL-18の成熟および放出を促進し、パイロトーシスと称される細胞死の新規な形態を開始する、カスパーゼ-1を活性化するインフラマソームの活性化によって介在されることは、現在公知である(Broz and Monack (2011) Immunol Rev. 243(1):174-190)。このパイロトーシス活性は、対数期細菌を使用することによって誘導することができ、一方、静止期細菌は、マクロファージにおいてこの急速な細胞死を誘導しない。SPI-1遺伝子は、対数期成長中に誘導される。したがって、静止期において治療上使用することになるS.ティフィムリウムを採取することによって、マクロファージの急速なパイロトーシスを阻止することができる。マクロファージは、自然免疫系の重要なメディエーターであり、これらは適切な抗腫瘍応答を確立するのに重要であるサイトカインを分泌するように作用することができる。更に、IL-1βおよびIL-18等の炎症促進性サイトカイン分泌を制限すると、投与されたS.ティフィムリウム療法の忍容性が改善するであろう。本明細書において提供する、静止期において採取される免疫刺激性S.ティフィムリウムは、抗腫瘍応答を誘導するために使用されるであろう。
1.フラジェリンの欠失(fliC-/fljB-)
炎症促進性シグナル伝達を減少させるためにフラジェリンサブユニットfliCおよびfljBの両方を欠くように遺伝子操作された、サルモネラ属細菌種S.ティフィムリウム等の免疫刺激性細菌が、提供される。例えば、本明細書において示されるように、TNF-アルファ誘導の減少をもたらす、msbBが無いサルモネラ属菌株が、fliCおよびfljBノックアウトと組み合わせられる。結果として得られるサルモネラ属菌株は、TNF-アルファ誘導の減少とTLR5認識の減少を兼備する。これらの改変、msbB-、fliC-およびfljB-、を細菌プラスミドと組み合わせることができ、前記細菌プラスミドは、CpGを含んでいてもよく、真核生物プロモーターの制御下で、例えば、免疫刺激性タンパク質、例えば、サイトカインもしくはケモカイン、例えばIL-2、および/または同じく阻害性分子、例えば、ナノボディ等の抗体断片を含む、抗体、ならびに/あるいはTREX1、PD-L1、VISTA、SIRP-アルファ、TGF-ベータ、ベータ-カテニン、CD47、VEGF等の、免疫チェックポイントを標的とするRNAi分子(複数可)、ならびにこれらの組合せ等の、治療用タンパク質の発現をもたらすためのcDNA発現カセットも含んでいてもよい。結果として得られる細菌は、炎症促進性シグナル伝達が減少しており、頑強な抗腫瘍活性を有する。
グラム陰性細菌のLPSは、細菌膜の外葉の主要な構成成分である。それは、3つの主要な部分であるリピドA、非反復コアオリゴサッカライド、およびO抗原(またはOポリサッカライド)で構成されている。O抗原は、LPS上の最も外側の部分であり、細菌透過性に対する防御層としての役割を果たすが、O抗原の糖組成は、菌株間で広範囲に異なる。リピドAおよびコアオリゴサッカライドは然程異ならず、より典型的には、同じ菌種の菌株内に保存される。リピドAは、エンドトキシン活性を含む、LPSの一部である。それは、典型的には、複数の脂肪酸で修飾されたジサッカライドである。これらの疎水性脂肪酸鎖は、5つのLPSを細菌膜へ固定し、残りのLPSは、細胞表面から突出する。リピドAドメインは、グラム陰性細菌の毒性の多くについての原因となる。典型的には、血液中のLPSは、深刻な病原体関連分子パターン(PAMP)として認識され、重度の炎症促進性応答を誘導する。LPSは、CD14、MD2およびTLR4を含む膜結合受容体複合体のリガンドである。TLR4は、MyD88およびTRIF経路を介してシグナルを送ってNFκB経路を刺激し、TNF-αおよびIL-1β等の炎症促進性サイトカインの産生をもたらすことができ、この結果、命に関わることもある内毒素性ショックとなることがある、膜貫通型タンパク質である。哺乳動物細胞のサイトゾル中のLPSは、カスパーゼ4、5および11のCARDドメインに直接結合することができ、これは、自己活性化およびパイロトーシス細胞死につながることがある(Hagar et al.(2015) Cell Research 25:149-150)。リピドAの組成およびリピドA変異体の毒素産生性は、十分に立証されている。例えば、モノリン酸化されたリピドAは、複数のホスフェート基を有するリピドAよりも炎症性がはるかに低い。リピドA上のアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に深刻な影響を与えることがある。E.コリからの標準的なリピドAは、6個のアシル鎖を有し、このヘキサアシル化は、強力な毒性である。S.ティフィムリウムリピドAは、E.コリのものと類似しており;それは、4つの第一級および2つの第二級ヒドロキシアシル鎖を保有するグルコサミンジサッカライドである(Raetz and Whitfield (2002) Annu Rev Biochem.71:635-700)。上述のようなS.ティフィムリウムのmsbB-突然変異体は、そのLPSの末端ミリストイル化を受けることができず、ヘキサアシル化リピドAよりも有意に毒性が低いペンタアシル化リピドAを主に産生する。パルミテートを用いたリピドAの改変は、パルミトイル転写酵素(PagP)によって触媒される。pagP遺伝子の転写は、例えばSCV内部で、低濃度のマグネシウムによって活性されるPhoP/PhoQ系の制御下にある。したがって、S.ティフィムリウムのアシル含有量は、可変的であり、野生型細菌の場合、それは、ヘキサまたはペンタアシル化されていることもある。そのリピドAをパルミテートするS.ティフィムリウムの能力は、ファゴリソソームへ分泌される抗菌ペプチドに対する耐性を増加させる。
VNP20009は、がんの処置のために開発された弱毒化S.ティフィムリウムベースの微生物がん療法である。VNP20009は、遺伝子msbBおよびpurI(purM)の欠失によって弱毒化される。purI欠失は、微生物をプリンまたはアデノシン栄養要求性にする。msbB遺伝子の欠失は、リピドAへの末端ミリストイル基の付加を阻止することによってリポポリサッカライド(LPS)に関連する毒性を減少させる(Kahn et al., (1998) Mol.Microbiol.29:571-579)。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、改変されたものである。それらは、下記に論じるような、細菌ゲノムに対する改変ならびに細菌発現および宿主細胞侵入に対する改変を、例えば、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞および腫瘍微小環境への標的化または蓄積を改善するかまたは増加させるための改変、ならびにまた、細菌プロモーターを含めることによって細菌に発現される産物をコードするプラスミド、または適切な真核生物プロモーターおよび他の調節領域を適宜含めることによって宿主に発現される産物をコードするプラスミドを含めるための改変を含む。フラジェリン-(fliC-/fljB-)および/またはpagP-であり、hilA-であってもよい、免疫刺激性細菌は、腫瘍定着の増加を示すこと、したがって、ヒトにおいて腫瘍に適切に定着することができなかったVNP20009に関して遭遇する以前の問題を克服することができることが、本明細書において示される。VNP20009の臨床的活性は、一つには、ヒト腫瘍に定着するその能力が乏しいことから、期待外れであった(Nemunaitis et al.(2003) Cancer Gene Ther. 10(10):737-744; Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152; Heimann et al. (2003) J. Immunother. 26(2):179-180)。
下記におよび本明細書中の他の箇所に論じるように、腫瘍微小環境における免疫応答を付与するか高めるかまたは強化するための免疫刺激性タンパク質等の遺伝子産物をコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌が、提供される。これらの免疫刺激性細菌は、腫瘍常在性免疫細胞を含む腫瘍に優先的に感染するように改変され、および/または免疫刺激性細菌のゲノムは、腫瘍常在性免疫細胞の細胞死をより少なく誘導するように改変され、そのために、免疫刺激性細菌は腫瘍細胞に蓄積することによって、免疫刺激性タンパク質を標的細胞にデリバリーして腫瘍に対する免疫応答を刺激する。免疫刺激性細菌は、特定の腫瘍に対する応答を強化するための腫瘍抗原を更にコードすることができる。本明細書において提供される上記および下記の免疫刺激性細菌のいずれも、免疫刺激性タンパク質をコードするように改変することができる。一般に、免疫刺激性タンパク質は、RNAポリメラーゼII(RNAPII)プロモーターの制御下にあり、そしてまた発現時の腫瘍微小環境への分泌のためにプラスミドにコードされる。改変について本明細書において記載する細菌のいずれも、例えば、サルモネラ属、シゲラ属、E.コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属およびエリジペロスリックス属の菌株またはこれらの弱毒化菌株またはこれらの改変菌株のいずれも、免疫刺激性タンパク質をコードし、したがって、感染した対象の細胞においてその免疫刺激性タンパク質が発現される。免疫刺激性細菌は、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞および/またはTMEに定着するように、または蓄積するように、または優先的に感染するように、本明細書において記載するように改変されているものを含む。
抗腫瘍免疫応答を付与するか高めるかまたは強化するために、抗体および抗体断片等の遺伝子産物をコードするヌクレオチドの配列を含む、免疫刺激性細菌が、提供される。これらは、CTLA-4、PD-1、PD-L1、CD47等の、免疫チェックポイントを標的とするか、または腫瘍抗原および腫瘍ネオ抗原を標的とする、抗体および抗体断片であって、数ある中でも特に、処置される対象の腫瘍から同定されたもの、および例えば、免疫抑制をモジュレートする、特に阻害する、抗IL-6抗体を含む、抗体および抗体断片を含む。抗体またはそれらの断片、例えば、scFvおよび他の一本鎖抗体、例えばラクダ科動物のものおよびナノボディを、真核生物対象、特に、免疫刺激性細菌が投与されることになるヒト等の対象における発現のために、RNAポリメラーゼIIによって認識されるプロモーター等の、真核生物プロモーターを含む、真核生物調節配列およびシグナルの制御下で細菌中のプラスミド上にコードすることができる。抗体および抗体断片をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞における発現および/または輸送のための、例えば、細胞の表面での分泌または発現のための、他の調節シグナルを含むことができる。
本明細書における免疫刺激性細菌中のプラスミドは、上述の免疫チェックポイントおよび目的の他の標的を標的とするRNAi核酸をコードする。RNAiは、shRNA、siRNA、およびマイクロRNAを含む。RNA干渉(RNAi)は、標的遺伝子と相同の配列を有する短鎖合成dsRNA分子である低分子干渉RNA(siRNA)を使用して、真核細胞における遺伝子発現の配列選択的抑制を可能にする。RNAi技術は、疾患関連転写物の枯渇のための強力なツールを提供する。
典型的には、約19~29塩基対長であるsiRNAは、特異的な宿主mRNA配列を分解し、それらの各タンパク質産物への翻訳を不可能にし、標的とする遺伝子の発現を効果的にサイレンシングすることによって機能する。タイトなヘアピンループを含むショートヘアピン型RNA(shRNA)は、RNAiにおいて広範囲に使用される。shRNAは、4~15ヌクレオチドのループスペーサーによって連結された各19~29bps長の2つの相補的RNA配列を含む。標的遺伝子配列相補的である(したがってmRNA配列と同一である)RNA配列は、「センス」ストランドとして公知であり、同時にmRNAに相補的である(および標的遺伝子配列と同一である)ストランドは、「アンチセンス」または「ガイド」ストランドとして公知である。shRNA転写は、siRNA二本鎖へのダイサーとして公知のRNase III酵素によってプロセシングされる。次いで産物は、アルゴノート(Ago)タンパク質および他のRNA-結合タンパク質を有するRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)へ積み込まれる。次いでRISCは、アンチセンスまたは「ガイド」ストランドをその相補的mRNA配列へ局在化させ、その後、それがAgoによって開裂される(米国特許第9,624,494号)。shRNAの使用は、より費用効果が高く、細胞内高濃度のsiRNAはオフターゲット効果と関連するため、かつsiRNAの濃度は細胞分裂時に希釈されるようになるためにsiRNAよりも好ましい。一方、shRNAの使用は、安定で長期の遺伝子ノックダウンをもたらし、複数の一連のトランスフェクションの必要がない(Moore et al. (2010) Methods Mol. Bio. 629:141-158)。
マイクロRNA(miRNA)は、約20~24または20~24ヌクレオチド長の短い非コード一本鎖ストランドのRNA分子である。天然発生miRNAは、遺伝子発現の転写後調節に関与し;miRNAは、遺伝子をコードしない。miRNAは、細胞増殖および生存、ならびに細胞分化を調節することが示されている。miRNAは、配列相補性を共有する標的となるmRNAへ結合することによって翻訳を阻害するかまたはRNA分解を促進する。これらはmRNAの安定性および翻訳に作用し;miRNAは、配列相補性を共有する標的となるmRNAへ結合することによって、翻訳を阻害しおよび/またはRNA分解を促進する。真核生物中に存在するmiRNAは、RNA Pol IIによって一次miRNA、またはpri-miRNAとして公知の、キャップされ、ポリアデニル化されたヘアピン含有一次転写産物へ転写される。これらのpri-miRNAは、酵素ドローシャリボヌクレアーゼIIIおよびその補助因子Pasha/DGCR8によって、前駆体miRNAまたはプレ-miRNAとして公知の約70ヌクレオチド長の前駆体miRNAヘアピンへ開裂され、次いでこれらは核から細胞質へ輸送され、ダイサーリボヌクレアーゼIIIによって、およそ22ヌクレオチド長のセンスおよびアンチセンスストランド産物を有するmiRNA:miRNA*二本鎖へ開裂される。成熟miRNAは、RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれ、それが標的mRNAを認識し、通常、miRNAと対を成す不完全な塩基を介して3’非翻訳領域(UTR)においてそこに結合し、翻訳の阻害または標的mRNAの不安定化/分解をもたらす(例えば、Auyeung et al. (2013) Cell 152(4):844-85を参照のこと)。
5’-CCGGATC AACGCCCTAG GTTTATGTTT GGATGAACTG ACATACGCGTATCCGTC GTAG TGAAATATAT ATTAAAC TACGGTAACGCG GAATTCGCAA CTATTTTATC AATTTTTTGC GTCGAC-3’(配列番号249)
であり、Nは、相補的な、一般的に18~26、例えば19~24、19~22、19~20塩基対長のアンチセンスおよびセンスヌクレオチド配列であって、サイレンシングされることになる遺伝子を標的とし、マイクロRNAループの前後に挿入される配列を表す。ARI-205(配列番号214)およびARI-206(配列番号215)等のRNAは、配列番号249のマイクロRNA骨格をベースとする例示的なコンストラクトであり、21および22個の塩基対相同配列をそれぞれコードする。ARI-207(配列番号216)およびARI-208(配列番号217)は、配列番号249のマイクロRNA骨格ベースの例示的コンストラクトであり、19個の塩基対相同配列をコードする。別の例は、ARI-201と称されるコンストラクトであり、これはマイクロRNAコンストラクトARI-205であり、Nは、マウスPD-L1を標的とするヌクレオチドの配列で置き換えられる。ARI-202と称されるコンストラクトは、マイクロRNAコンストラクトARI-206を表し、Nは、マウスPD-L1を標的とする配列で置き換えられる。当業者であれば、miR-16-2骨格、または当業者であれば公知の他の好適な骨格を使用して、本明細書において記載され、例示されるようなプラスミド中に含ませるためのマイクロRNAを容易に構成することができる。
プラスミドは、複製起点を用いて細菌内に維持される自律複製染色体外環状二本鎖DNA分子である。コピー数は、プラスミドの安定性に影響を与える。コピー数が高いと、細胞分裂時にランダムな分割が生じた場合に、プラスミドに優れた安定性を一般的にもたらす。プラスミド数が高いと、成長速度が一般的に低下し、したがって場合により、プラスミドが少ない細胞が、成長が早いために培養を支配することを可能にする。複製起点も、プラスミドの相互性、すなわち同じ細菌性細胞内の別のプラスミドと共に複製するためのその能力を決定する。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌性細胞中で共存できない。これらは同じ相互性グループに属すると言われている。同じ相互性グループから第2のプラスミドの形態で新規の起点を導入すると、常在性プラスミドを複製するという結果を模倣する。したがって、任意の更なる複製は、2つのプラスミドが異なる細胞に分離され、正しい複製前コピー数の生成を済ませるまで阻止される。
非メチル化シチジン-ホスフェート-グアノシン(CpG)モチーフは、細菌においてよく認められるが、脊椎動物のゲノムDNAでは認められない。CpGモチーフを含む病原性DNAおよび合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、宿主防御機序を活性化し、先天的および後天的な免疫応答を引き起こす。非メチル化CpGモチーフは、中心非メチル化CGジヌクレオチドとフランキング領域を含む。ヒトにおける、CpG ODNの4つの個別のクラスは、誘導する免疫応答の構造および性質における相違に基づいて同定されている。K-タイプODN(B-タイプとも称される)は、典型的には、1から5個のCpGモチーフをホスホロチオエート骨格上に含む。D-タイプODN(A-タイプとも称される)は、混合ホスホジエステル/ホスホロチオエート骨格を有し、ステム-ループ構造の形成を可能にするパリンドローム配列に隣接する単一のCpGモチーフ、ならびにポリGモチーフを3’および5’終端において有する。C-タイプODNは、ホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造またはダイマーを形成することができる複数のパリンドロームCpGモチーフを含む。P-クラスCpG ODNは、ホスホロチオエート骨格を有し、複数のCpGモチーフを含み、二重パリンドロームを伴い、それらのGCが豊富な3’終端においてヘアピンを形成することができる(Scheiermann and Klinman (2014) Vaccine 32(48):6377-6389)。本明細書における目的に関しては、CpGは、プラスミドDNAにおいてコードされ;モチーフとしてまたは遺伝子中に導入することができる。
実験室背景におけるプラスミドの維持は、抗生物質抵抗性遺伝子をプラスミド上に含ませ、成長培地中に抗生物質を使用することによって常に確実にする。上述のように、プラスミド上の機能性asd遺伝子で相補されるasd欠失突然変異体の使用は、抗生物質を使用することなくインビトロでのプラスミド選択を可能にし、かつインビボでのプラスミド維持を可能にする。asd遺伝子相補系によって、このような選択/維持が得られる(Galan et al.(1990) Gene 28:29-35)。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためのasd遺伝子相補系の使用は、免疫刺激性タンパク質、抗体、抗体断片または干渉RNA等の治療用産物をコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたS.ティフィムリウムおよび他の免疫刺激性細菌の効力を高める。
本明細書において提供されるプラスミドは、上述のような免疫チェックポイントおよび他の標的を標的とする干渉RNAをコードするように設計される。RNA発現カセットは、H1プロモーター、またはU6プロモーター、またはCMVプロモーター等のヒト細胞において転写するためのプロモーターを含む。U6およびH1はRNAポリメラーゼIII(RNAP III)プロモーターであり、これらは、小分子RNAを産生およびプロセシングするためのものである。CMVプロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識され、RNAP IIIよりも長いRNA伸展を発現することを可能にする。プロモーターは、上述のようなshRNA、siRNAまたはmiRNA等の干渉RNAに先行する。
SV40DTS等のDNA核標的化配列(DTS)は、核膜孔複合体を介してDNA配列のトランスロケーションを媒介する。この輸送の機序は、核局在配列を含むDNA結合タンパク質の結合に依存することが報告されている。プラスミド上にDTSが含まれると、核輸送および発現が増加することが実証されており(Dean、D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res.253(2):713-722)、その含まれる点を使用し、S.ティフィムリウムによってデリバリーされるプラスミドから遺伝子発現を増加させる(Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(47):19414-19419)。
CRISPRカセットをコードする免疫刺激性細菌は、ヒト免疫、骨髄または造血細胞に感染して目的の標的遺伝子を部位特異的にノックアウトするために使用することができる。使用される菌株は、asd-であり得、相補的asdカセットが無いがkanカセットを含むプラスミドを含むこともある。液体培地中で菌株をインビトロで成長させるために、DAPが、asd-遺伝子欠損を相補するために添加される。ヒト細胞への感染後、菌株は、もはや複製することができないためCRISPRカセットにコードされたプラスミドが送達される。菌株はまた、hilA-であること、またはSPI-1の1つもしくは複数の部分が無いこと、またはフラジェリンが無いこと、またはこれらの任意の組合せであり得、このことによって食細胞のパイロトーシス(炎症介在性細胞死)が低減されるかまたは阻止される。
任意の免疫標的に対するRNAiは、プラスミドにおいてコードすることができる。これらとしては、これらに限定されるものではないが、本明細書における開示において検討される任意のもの、および当業者であれば公知の任意のものがある。以下の議論では、例示的な標的を記載する。プラスミドは、そのような標的に対する任意のRNAiを含むことができ、それらとしては、これらに限定されないが、shRNA、siRNAおよびマイクロRNAがある。
本明細書において提供されるある特定の実施形態では、免疫刺激性細菌は、TREX1発現を阻害するかまたは撹乱するかまたは抑制するshRNA等の阻害性RNAをコードする。TREX1によってコードされ、cGASから上流に位置する酵素産物は、I型インターフェロン経路のメディエーターである。TREX1は、哺乳動物細胞において主要な3’DNAエキソヌクレアーゼ(DRNase IIIとも称される)をコードする。ヒトTREX1タンパク質は、細菌性エキソヌクレアーゼと同じように触媒的に効率的である(Mazur and Perrino (2001) J. Biol. Chem. 276:17022-17029)。RNAサイレンシング以外のプロセスによってTREX1発現を阻害する免疫刺激性細菌も本明細書において検討される。
プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)は、免疫応答の負の調節に関与する免疫阻害受容体である。その同族リガンドであるプログラム死リガンド1(PD-L1)は、APC上に発現され、T細胞上のPD-1に結合したときにCD8+T細胞エフェクター機能の損失をもたらし、T細胞耐性を誘導する。PD-L1の発現は、ある特定のヒトがんにおける腫瘍攻撃性および生存率の低下と関連することが多い(Gao et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(3):971-979)。
免疫活性化における他の非冗長なチェックポイントは、T細胞活性化のV-ドメイン免疫グロブリン(Ig)サプレッサー(VISTA)等のPD-1/PD-L1およびCTLA-4と共に相乗効果を与えることができる。VISTAは、APC上に、特に腫瘍浸潤骨髄細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)上に、かつ少ない程度ではあるが調節性T細胞(CD4+Foxp3+Tregs)上に最初に発現される(Wang et al. (2011) J. Exp. Med. 208(3):577-592)。PD-L1と同様に、VISTAの上方調節は、T細胞増殖および細胞毒性機能を直接抑制する(Liu et al. (2015) PNAS 112(21):6682-6687)。VISTAを標的とするモノクローナル抗体は、マウスにおける腫瘍微小環境を再モデル化し、APC活性化を高め、抗腫瘍免疫を強化することが示された(LeMercier et al. (2014) Cancer Res. 74(7):1933-1944)。臨床的には、VISTAの発現は、前立腺がんにおける抗CTLA-4療法処置後に、腫瘍常在性マクロファージ上で上方調節されることが示されており、免疫チェックポイントの代償性調節が実証された(Gao et al. (2017) Nat. Med. 23(5):551-555)。VISTAの発現の大部分は、骨髄細胞の表面上ではなく細胞内コンパートメントに位置するとされており、これはモノクローナル抗体アプローチの有効性を制限する場合がある(Deng et al. (2016) J.Immunother. Cancer 4:86)。本明細書において提供するVISTAに対するshRNAを含む腫瘍標化細菌を使用して、APC内からVISTAを阻害するための能力は、より効率的であり、VISTAのT細胞抑制機能を完全に阻害し、T細胞介在性抗腫瘍免疫の活性化および腫瘍退行をもたらすであろう。
腫瘍細胞が除去を回避することによる1つの機序は、自然免疫細胞によってそれらの食作用を阻止することである。食作用は、造血および非造血細胞上に広範囲に発現するCD47の表面発現によって阻害される(Liu et al. (2015) PLoS ONE 10(9):e0137345)。CD47が、その受容体のシグナル調節タンパク質アルファ(SIRPα)に結合すると、食作用に関する阻害性シグナルが開始される。SIRPαは、マクロファージ、顆粒球およびDCを含む食細胞上に豊富に発現する。したがって、CD47とSIRPαとの間のタンパク質-タンパク質相互作用は、APCに特有の別のクラスの免疫チェックポイント、特に腫瘍常在性マクロファージを提示する。食作用の阻止におけるCD47の有効性は、様々な腫瘍において上方調節されることが多く、これは腫瘍微小環境においてAPCによる貪食を回避することを可能にするという事実によって証明されている(Liu et al. (2015) Nat. Med. 21(10):1209-1215)。抗CD47もしくは抗SIRPα抗体または抗体断片の開発、いずれかのタンパク質に結合する小ペプチドの使用、またはCD47発現のノックダウンを含む、CD47/SIRPα相互作用を遮断するためのいくつかの方法が検討されている(米国特許出願公開第2013/0142786号、同第2014/0242095号;国際公開第2015/191861号;McCracken et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(16):3597-3601)。このため、抗体依存性細胞食作用(ADCP)として公知のプロセスにおいて、SIRPαを直接標的とするいくつかのモノクローナル抗体が、単独で、または抗体オプソニン化腫瘍細胞の食作用を強化することができる腫瘍標的化抗体(例えばリツキシマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ)と組み合わせて臨床的に開発されている(McCracken et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(16):3597-3601;Yanagita et al. (2017) JCI Insight 2(1):e89140)。
免疫チェックポイント経路は、免疫の過剰活性化および自己免疫を阻止するために存在する複数の層の調節、抗腫瘍免疫を促進するためのこれらの経路の破壊における困難を例示する。腫瘍がチェックポイント治療法に対して難治性に進化した1つの機序は、T細胞非炎症性または「冷たい腫瘍」として記載されるT細胞および樹状細胞(DC)浸潤の欠如を介している(Sharma et al. (2017) Cell 9;168(4):707-723)。いくつかの腫瘍の内因性機序は同定されており、抗腫瘍T細胞の排除および免疫療法に対する抵抗性につながっている。黒色腫では、特に、チェックポイント治療法-難治性腫瘍の分子プロファイリングによって、腫瘍浸潤リンパ球の欠如と相関するβ-カテニンおよびその下流標的遺伝子のシグネチャーの上昇が明らかにされた(Gajewski et al. (2011) Curr. Opin. Immunol. 23(2):286-292)。
形質転換成長因子ベータ(TGF-β)は、胚形成、創傷治癒、血管新生および免疫調節において多くの役割を有する多面的なサイトカインである。哺乳動物細胞では、3つのアイソフォーム、TGF-β1、TGF-β2およびTGF-β3が存在し;TGF-β1は、免疫細胞中で最も優勢である(Esebanmen et al. (2017) Immunol Res. 65:987-994)。免疫抑制剤としてのTGF-βの役割は、おそらく、その最も優勢な機能である。腫瘍微小環境における潜在的形態からのその活性化は、特に、DCに対して広範囲の免疫抑制性効果、および抗原特異的T細胞に対して耐性化するためのそれらの能力を有する。TGF-βは、Th1 CD4+T細胞を免疫抑制性Tregに直接変換し、腫瘍寛容の促進を更に拡大することもできる(Travis et al. (2014) Annu Rev Immunol. 32: 51-82)。その腫瘍特異的な免疫抑制性機能に基づいて、かつその公知のがん細胞成長および転移促進特性に関係なく、TGF-βの阻害が、がん療法の標的である。高TGF-βシグナル伝達は、CRC、HCC、PDACおよびNSCLCを含むいくつかのヒト腫瘍タイプにおいて実証されている(Colak et al. (2017) Trends in Cancer 3:1)。TGF-βの全身性の阻害は、許容できない自己免疫毒性をもたらすことがあり、その阻害は、腫瘍微小環境に対して局在的とするべきである。したがって、本明細書において提供されるTGF-βに対するshRNAまたはTGF-βRIIに対するshRNA等のRNAiを有する腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、腫瘍免疫寛容を破壊し、抗腫瘍免疫を刺激する。
血管新生または新規の血管の発達は、任意の腫瘍微小環境が確立されるようになるために必須の工程である。血管内皮成長因子(VEGF)は、内皮増殖および血管新生に重要なマイトジェンであり、腫瘍微小環境におけるVEGFが阻害されると、腫瘍血管分布が顕著に減少し、その結果、腫瘍への血液供給が枯渇する(Kim et al. (1993) Nature 362(6423):841-4)。この初期研究は、VEGFのモノクローナル抗体阻害剤、ベバシズマブ(アバスチン;Genentech)の開発へつながっており、化学療法と組み合わせて、転移性のCRCに関する標準治療となっている。ベバシズマブの全身投与も、NSCLCの第II相トライアルにおいて複数の死亡を含む顕著な毒性が実証され、大部分は出血によるものであった。したがって、抗VEGF受容体2抗体ラムシルマブ(Cyramza、Imclone)等のいくつかの次世代の抗血管新生剤および抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤のアキシチニブ(Inlyta、Pfizer)が評価されてきたが、全身毒性を克服することも、無増悪生存を顕著に改善することもできなかった(Alshangiti et al. (2018) Curr Oncol. 25(Suppl 1):S45-S58)。抗VEGF治療法の抗腫瘍活性は、一部の有望性を示すが、全身毒性は、明らかに制限されている。したがって、本明細書において提供されるVEGFに対するshRNAを有する免疫刺激性腫瘍標的化細菌等の腫瘍微小環境のみを標的とする治療法は、局在性の抗血管新生療法をデリバリーし、同時に全身毒性を阻止する。この治療モダリティは、腫瘍微小環境においてVEGFを主に産生する骨髄細胞へ取り込まれるという追加の利点を有し、これは、腫瘍の進行に最大限の影響を与えるであろう(Osterberg et al. (2016) Neuro-Oncology. 18(7):939-949)。
マイクロRNAおよびshRNA等のRNAiを調製することができる、または本明細書において例示される、例示的なチェックポイント標的は、これらに限定されないが、以下のものを含む:
本明細書において提供される免疫刺激性細菌のうちのいずれか、および薬学的に許容される賦形剤または添加物を含む、医薬組成物および製剤を製造する方法が本明細書において提供される。医薬組成物は、腫瘍またはがん等の過剰増殖性疾患または状態等の疾患の処置において使用することができる。免疫刺激性細菌は、単一の薬剤療法として投与することができるか、または更なる薬剤または処置を用いた併用療法として投与することができる。組成物は、単回投薬量投与用にまたは多回投薬量投与用に製剤化することができる。薬剤は、直接投与するために製剤化することができる。組成物は、液体または乾燥製剤として提供されることもある。
a.細胞バンクの製造
本明細書において記載する免疫療法の活性成分は、遺伝子操作された自己複製細菌からなるため、選択される組成物は、長期貯蔵のためにかつ原薬を製造するための出発材料として維持されるであろう一連の細胞バンクへ拡大することになる。細胞バンクは、連邦規則集(Code of Federal Regulations)(CFR)21 part211または他の関連規制当局に従って、適切な製造施設において、現行の製造管理および品質管理に関する基準(current Good Manufacturing Practice)(cGMP)の下で作製される。免疫療法剤の活性薬剤は生存細菌であるため、本明細書において記載する製品は、定義によれば非滅菌であり、最終的に滅菌することはできない。無菌手順が、汚染を阻止するために、製造プロセスにわたって使用されることが確実になるように注意するべきである。したがって、全ての原材料および溶液は、製造プロセスにおいて使用する前に滅菌されていなくてはならない。
原薬は、上述のようなcGMPの下で滅菌プロセスを使用して製造される。ワーキング細胞バンク材料は、典型的には、cGMPの下で原薬を製造するための出発材料として使用されるが、他の細胞バンク(例えば、MCBまたはMWCB)を使用することができる。滅菌プロセシングは、細菌性細胞ベース療法剤を含む全ての細胞療法剤を製造するために使用される。細胞バンクからの細菌は発酵によって膨張され、これは、プレ培養物を製造することによって(例えば、振とうフラスコ中で)または発酵槽へ直接接種することによって達成することができる。発酵は、滅菌バイオリアクター、または使い捨てであっても、再使用可能であってもよいフラスコ中で達成される。細菌は、濃縮することによって(例えば、遠心分離、連続遠心分離、または接線流ろ過によって)採取される。濃縮された細菌は、培地を緩衝液と交換することによって(例えば、ダイアフィルトレーション)培地構成成分および細菌性代謝産物から精製される。バルク薬物製品は、中間体として製剤化され、保存されるか(例えば、凍結または乾燥によって)、または薬物製品へと直接プロセシングされる。原薬は、同一性、強度、純度、効力、および品質に関して試験される。
薬物製品は、その最終容器中に含まれる活性物質の最終製剤として定義される。薬物製品は、cGMPの下で滅菌プロセスを使用して製造される。薬物製品は、原薬から製造される。原薬は、必要に応じて解凍されるかまたは復元され、次いで適切な標的の強度に製剤化される。薬物製品の活性構成成分は生存している遺伝子操作された細菌であるため、強度は、懸濁液内に含まれるCFUの数によって判定される。バルク製品は、以下に記載するような貯蔵および使用に適した最終製剤で希釈される。容器へ充填し、容器閉鎖系を用いて密閉し、薬物製品にラベル付けする。薬物製品は、適切な温度で貯蔵され、安定性を維持し、同一性、強度、純度、効力、および品質に関して試験を行い、特定の承認基準を満たす場合はヒトに使用するために発売される。
薬学的に許容される組成物は、規制当局または他の当局の承認を考慮して調製され、動物およびヒトにおいて使用するための一般的に認識されている薬局方に従って調製される。組成物は、溶液剤、懸濁剤、粉末剤、または持続放出製剤として調製することができる。典型的には、化合物は、当技術分野において周知の技術および手順を使用して医薬組成物へ製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと)。製剤は、投与様式に適合する必要がある。
a.液体剤、注射剤、乳剤
製剤は、投与経路に適合するように概して作製される。概して、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内のいずれかでの注射または点滴によって特徴付けられる非経口投与が本明細書において検討される。非経口投与のための細菌の調製物としては、調製済み懸濁注射剤(直接投与)または凍結乾燥粉末剤等の使用前に解凍される凍結懸濁液、可溶性乾燥産物、使用直前に再懸濁溶液を組み合わせる調製済み製剤(ready to be combined with a resuspension solution just prior to use)、およびエマルションがある。凍結乾燥された製剤等の乾燥された熱安定製剤は、後で使用するための単位用量を貯蔵するために使用することができる。
細菌は乾燥することができる。凍結乾燥または噴霧乾燥粉末およびガラス化ガラス(vitrified glass)等の乾燥された熱安定製剤は、溶液、エマルションおよび他の混合物として投与するために復元することができる。乾燥された熱安定製剤を、上述の懸濁剤等の液体製剤のうちのいずれかから調製することができる。医薬製剤は、使用前に水または他の好適な媒体を用いて復元するための凍結乾燥またはガラス化形態として提供することができる。
処置される状態によって、局所適用、経皮パッチ等の非経口、経口および直腸投与に加えて他の投与経路も本明細書において検討される。上述の懸濁剤および散剤は、経口で投与することができるか、または経口投与のために復元することができる。直腸投与のための医薬投薬形態は、全身的な効果のための直腸坐剤、カプセル剤および錠剤およびゲルカプセル剤である。直腸坐剤は、体温で融解または軟化する直腸へ挿入するための固形物を含み、1つまたは複数の薬理学的または治療上活性成分を放出する。直腸坐剤中の薬学的に許容される物質は、融点を上げるための基剤または媒体および薬剤である。基剤の例としては、ココアバター(テオブロマ油)、グリセリンゼラチン、カーボワックス(ポリオキシエチレングリコール)および脂肪酸モノ-、ジ-およびトリグリセリドの適切な混合物がある。様々な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤としては、鯨ろうおよびワックスがある。直腸坐剤は、圧縮法によってまたは成形によって調製することができる。直腸坐剤の典型的な重量は、約2~3gmである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、同じ薬学的に許容される物質を使用して、かつ経口投与のための製剤と同じ方法によって製造される。直腸投与に好適な製剤は、単位用量坐剤として提供されることもある。これらは、原薬を、1つまたは複数の従来の固形担体、例えば、ココアバターと混合し、次いで得られた混合物を成形することによって調製することができる。
組成物は、単回投薬量または多回投薬量投与のために医薬組成物として製剤化することができる。免疫刺激性細菌は、処置された患者に対する不所望の副作用が無い場合は、治療有用効果に影響を与えるのに十分な量で含むことができる。例えば、薬学的活性化合物の濃度は、注射が、所望の薬理学的効果を生成するために有効量を提供できるように調整される。治療上有効な濃度は、本明細書において記載するまたは当技術分野において公知のアッセイを使用することによって等の、公知のインビトロおよびインビボ系において免疫刺激性細菌を試験することによって経験的に判定することができる。例えば、標準的な臨床的技術を用いることができる。インビトロアッセイおよび動物モデルは、最適な投薬量範囲の同定の助けとなるように用いることができる。経験的に判定することができる正確な用量は、患者または動物の年齢、重量、体表面積、および状態、投与される特定の免疫刺激性細菌、投与経路、処置されることになる疾患のタイプおよび疾患の重症度によって決まり得る。
包装材料、本明細書において提供される任意の医薬組成物、および組成物が、本明細書において記載する疾患または状態を処置するために使用されることを示すラベルを含む製造物品も提供される。例えばラベルは、処置が、腫瘍またはがんのためのものであることを示す場合もある。
本明細書で提供される方法は、がん等の疾患または状態を有する対象を処置するための免疫刺激性細菌を投与または使用する方法を含み、対象の症状はそのような細菌の投与によって改善または緩和され得る。特定の例では、疾患または状態は腫瘍またはがんである。加えて、処置のための1つまたは複数の追加の薬剤、例えば、抗がん剤、例えば腫瘍崩壊性ウイルス、免疫療法剤、および/または抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼ、との併用療法の方法も、提供される。細菌は、非経口、全身、腫瘍内等の局所および局部、静脈内、直腸、経口、筋肉内、粘膜ならびに他の経路を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。本明細書において記載する細菌の改変のため、全身投与に関連する問題が解決される。各々の投与経路に適した製剤が提供される。各々に適した製剤が提供される。当業者は、適切なレジメンおよび用量を確立し、経路を選択することができる。
本明細書で提供される免疫刺激性細菌、組合せ、使用および方法は、がん、特に、肺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、胃がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんを含む固形腫瘍を含む、全てのタイプの腫瘍の処置に適用可能である。方法はまた、血液がんに使用することもできる。
本明細書の使用および方法の実施において、本明細書で提供される免疫刺激性細菌は、腫瘍を有するか、もしくは新生物細胞を有する対象、または免疫化される対象を含む対象に投与され得る。対象への免疫刺激性細菌の投与の前、同時または後に、免疫刺激性細菌の投与に適した状態を有する対象の診断、対象の免疫力の決定、対象の免疫化、化学療法剤による対象の処置、放射線による対象の処置、または対象の外科的処置を含むがこれらに限定されない1つまたは複数のステップが行われ得る。
本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および/または対象に投与される免疫刺激性細菌をモニタリングする1つまたは複数のステップを更に含んでもよい。腫瘍サイズのモニタリング、転移の存在および/またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリング、対象の体重または血液もしくは尿マーカーを含む他の健康指標のモニタリング、抗細菌抗体力価のモニタリング、検出可能な遺伝子産物の細菌発現のモニタリング、ならびに対象の腫瘍、組織または臓器における細菌力価の直接モニタリングを含むがこれらに限定されない任意の様々なモニタリングステップが、本明細書で提供される方法に含まれ得る。
以下の例は例示目的のみで含まれ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
株AST-101を調製した。株AST-101は、asd-(asd遺伝子ノックアウト)になるように遺伝子操作されているYS1646(ATCCから購入することができる、カタログ# 202165)に由来する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムである。この例では、サルモネラ・ティフィムリウム株YS1646 asd-遺伝子欠失は、図1に概説され、以下に記載されるように、DatsenkoおよびWanner[Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645(2000)]の方法の変更形態を使用して遺伝子操作した。この実施例および下記の全ての実施例における方法および結果として得られる産物は、他の出発細菌、例えば、野生型サルモネラ・ティフィムリウム、例えば、ATCC登録番号14028で寄託された株と共に使用することができる。
YS1646株は、以前に記載されているように[Sambrook J., (1998), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory]、培養物をLBで成長させ、100倍濃縮し、氷冷10%グリセロールで3回洗浄してエレクトロコンピテントになるように調製した。エレクトロコンピテントな株に、0.2cmギャップキュベットを使用して以下の設定:2.5kV、186ohm、50μFでラムダレッドヘルパープラスミドpKD46(配列番号218)を電気穿孔した。pKD46を担持する形質転換体を、アンピシリンおよび1mM L-アラビノースを含む5mL SOC培地、30℃で成長させ、アンピシリンを含有するLB寒天プレートで選択した。ラムダレッドヘルパープラスミドpKD46を含有するYS1646クローンを、次いで、上記に記載したようにYS1646用にエレクトロコンピテントにした。
YS1646のゲノム由来のasd遺伝子[Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178]を、asd遺伝子ノックアウトカセットの設計に使用した。asd遺伝子の左側および右側領域に相同な204および203bpをそれぞれ含有するプラスミドを、DH5-アルファコンピテント細胞に形質転換した。lox P部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、このプラスミドにクローニングした。asd遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーasd-1およびasd-2(表1)を使用してPCR増幅し、ゲル精製した。
プラスミドpKD46を担持するYS1646株に、ゲル精製した直鎖状asd遺伝子ノックアウトカセットを電気穿孔した。電気穿孔細胞をSOC培地に回収し、カナマイシン(20μg/mL)およびジアミノピメリン酸(DAP、50μg/ml)を補充したLB寒天プレートにプレーティングした。このステップ中、ラムダレッドリコンビナーゼは、染色体asd遺伝子とkanカセットとの相同組換えを誘導し(染色体asd遺伝子の上流および下流の相同な隣接配列の存在のため)、asd遺伝子の染色体コピーのノックアウトが起こる。選択したカナマイシン耐性クローンにおける撹乱されたasd遺伝子の存在を、撹乱部位に隣接するYS1646ゲノム由来のプライマー(プライマーasd-3)およびマルチクローニング部位由来のプライマー(プライマーscFv-3)を用いたPCR増幅によって確認した(表1)。また、DAP栄養要求性を証明するために、補充DAPを含むおよび含まないLBプレートにコロニーをレプリカプレーティングした。asd遺伝子欠失を有する全てのクローンは補充DAPの非存在下では成長できず、DAP栄養要求性を証明した。
kan選択マーカーは、Cre/loxP部位特異的組換え系を使用して除去した。YS1646 asd-遺伝子KanR突然変異体を、pJW168(creリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド、配列番号224)で形質転換した。AmpRコロニーを30℃で選択し、pJW168はその後、42℃での成長によって排除した。選択されたクローン(AST-101)を、次いで、カナマイシンを含むおよび含まないLB寒天プレートにレプリカプレーティングしてkanの喪失についてテストし、撹乱部位に隣接するYS1646ゲノム由来のプライマー(プライマーasd-3およびasd-4、プライマー配列については、表1を参照のこと)を使用したPCR検証によって確認した。
asd突然変異体AST-101はLB寒天プレート、37℃で成長することができなかったが、50μg/mLジアミノピメリン酸(DAP)を含有するLBプレートでは成長することができた。asd突然変異体成長率をLB液体培地で評価した。asd突然変異体は液体LBで成長することができなかったが、600nMで吸光度を測定して決定した場合、50μg/mL DAPを補充したLBでは成長することができた。
AST-101 asd遺伝子欠失株を、プライマーasd-3およびasd-4を使用したDNA配列決定によって検証した。asd座に隣接する領域の配列決定を行い、該配列により、asd遺伝子がYS1646染色体から欠失されたことを確認した。
DatsenkoおよびWanner[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)]に記載されているラムダ由来レッド組換え系を使用して、野生型サルモネラ・ティフィムリウム菌株ATCC14028のゲノムからpurI、msbBおよびasd遺伝子を個々に欠失させて、14028と称する基本菌株:ΔpurI/ΔmsbB/Δasdを生成した。その後、フラジェリン遺伝子fljBおよびfliCを欠失させて、菌株14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/ΔfliCを生成し、次いでpagP遺伝子を欠失させて、菌株14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/ΔfliC/ΔpagPを生成した。asdの染色体欠失を相補し、インビボでのプラスミド維持を確実にするための機能性asd遺伝子を含有するプラスミドと、EF1-αプロモーターの制御下の赤色蛍光タンパク質mCherryをコードする真核生物発現カセットとを、菌株14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/ΔfliC、および14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/ΔfliC/ΔpagPに電気穿孔した。
PD-L1
免疫系は、自己免疫を制限するためにいくつかのチェック・アンド・バランスを発達させた。プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)およびプログラム死リガンド1(PD-L1)は、免疫応答を下方調節することにより機能する数多くの阻害性「免疫チェックポイント」の2つの例である。PD-L1のPD-1への結合は、CD8+T細胞シグナル伝達経路を妨げ、CD8+T細胞の増殖およびエフェクター機能を損ない、T細胞寛容を誘導する[Topalian et al. (2012) N Engl J Med 366:3443-3447]。
腫瘍に対する適応免疫を誘導する特徴は、遠位の未処置腫瘍の退縮を誘導する能力である。pEQU6 shRNAプラスミドを含有するYS1646株の、両側腹部マウス結腸癌モデルにおいて原発および遠位腫瘍成長阻害を誘導する能力を評価するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26マウス結腸癌(100μL PBS中2×105細胞)を右側腹部および左側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-104(YS1646でのpEQU6 shTREX1)、AST-105(YS1646でのpEQU6 shPD-L1)またはAST-102(YS1646でのプラスミド対照)を4日空けて2回、右側腹部腫瘍へ腫瘍内(IT)注射し、PBS対照と比較した。
Toll様受容体(TLR)は、病原体関連分子パターン(PAMP)を感知し、病原体に対する自然免疫を活性化するための重要な受容体である[Akira et al. (2001) Nat Immunol. 2(8):675-680]。これらのうち、TLR9は、哺乳動物DNAには天然に存在しない病原体DNAの低メチル化CpGモチーフを認識することに関与している[McKelvey et al. (2011) J Autoimmunity 36:76]。免疫細胞サブセットにおけるエンドソームへの病原体の食作用時のCpGモチーフの認識により、IFR7依存性I型インターフェロンシグナル伝達が誘導され、自然および適応免疫が活性化される。CpGモチーフを含有する改変サルモネラ・ティフィムリウムプラスミドを担持するS.ティフィムリウム株YS1646(YS1646 pEQU6スクランブル)は、プラスミドを含まないYS1646株と比べて、TLR9を同様に活性化し、I型IFN介在性自然および適応免疫を誘導することが本明細書に示されている。
プラスミドからのasd発現によるasd欠失の相補
プラスミド(pATIU6)を化学的に合成し、アセンブルした(配列番号225)。プラスミドは、以下の特徴を含有した:高コピー(pUC19)複製起点、ショートヘアピンの発現を駆動するためのU6プロモーター、その後の除去のためのHindIII制限部位と隣接するアンピシリン耐性遺伝子、および開始コドンの上流に85塩基対の配列を含有するasd遺伝子(配列番号246)。このベクターに、マウスTREX1を標的にするshRNAまたはスクランブル非同族shRNA配列をSpeIおよびXhoIによる制限消化およびライゲーションによって導入し、E.コリDH5-アルファにクローニングした。それぞれ、pATI-shTREX1およびpATI-shSCRと名付けられた得られたプラスミドをE.コリで増幅し、電気穿孔によるasdノックアウト株AST-101への形質転換、ならびにそれぞれ株AST-108およびAST-107を産生する、LB ampプレートでのクローン選択のために精製した。pATIU6由来プラスミドで相補したasd突然変異体は、DAPの非存在下のLB寒天および液体培地で成長することができた。
以下の特徴を含有するプラスミドを設計し、合成した:pBR322複製起点、SV40 DNA核標的化配列(DTS)、rrnBターミネーター、shRNAの発現を駆動するためのU6プロモーターと、これに続く、プロモーターおよびshRNAまたはマイクロRNAをクローニングするための隣接制限部位、asd遺伝子、rrnGターミネーター、ならびに除去のためのHindIII部位およびマルチクローニング部位と隣接するカナマイシン耐性遺伝子(配列番号247)。更に、2つの別個のshRNAまたはマイクロRNAの発現用のプラスミドを設計し、合成した。このプラスミドは、以下の特徴を含有した:pBR322複製起点、SV40 DNA核標的化配列(DTS)、rrnBターミネーター、shRNAの発現を駆動するためのU6プロモーターと、これに続く、プロモーターおよびshRNAまたはマイクロRNAをクローニングするための隣接制限部位、第2のshRNAまたはマイクロRNAの発現を駆動するためのH1プロモーター、H1とU6プロモーターの間に置かれる450bpのランダムに生成されたスタッファー配列、asd遺伝子、rrnGターミネーター、ならびに除去のためのHindIII部位およびマルチクローニング部位と隣接するカナマイシン耐性遺伝子(配列番号245)。
本明細書の例では、S.ティフィムリウム株を、炎症促進性シグナル伝達を低減するためにフラジェリンサブユニットfliCおよびfljBの両方を欠くように遺伝子操作した。fliCおよびfljBの欠失は、YS1646のasd遺伝子欠失株(AST-101)の染色体へ連続的に遺伝子操作させた。
この例では、実施例1に詳細に記載され、図4に図式的に示されるDatsenkoおよびWannerの方法[Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645 (2000)]の修正を使用して、AST-101株の染色体からfliCを欠失させた。fliC遺伝子に隣接する224および245塩基の相同な配列を含有する合成fliC遺伝子相同性アーム配列を注文し、pSL0147と呼ばれるプラスミドにクローニングした(配列番号230)。cre/lox p部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、次いでpSL0147にクローニングし、fliC遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーflic-1(配列番号232)およびflic-2(配列番号233)を用いてPCR増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドpKD46を担持するAST-101株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔細胞をSOC+DAP培地に回収し、カナマイシン(20μg/mL)およびジアミノピメリン酸(DAP、50μg/ml)を補充したLB寒天プレートにプレーティングした。コロニーを選択し、ノックアウト断片の挿入について、プライマーflic-3(配列番号234)およびflic-4(配列番号235)を使用するPCRによってスクリーニングした。pKD46を、次いで、選択したカナマイシン耐性株を42℃で培養して除去し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングした。カナマイシン耐性マーカーを、次いで、Creリコンビナーゼ(pJW1680)を発現する温度感受性プラスミドの電気穿孔によって除去し、AmpRコロニーを30℃で選択した;pJW168はその後、培養物を42℃で成長させて排除した。選択したfliCノックアウトクローンを、次いで、撹乱部位に隣接するプライマー(flic-3およびflic-4)を使用するPCR、およびアガロースゲルでの電気泳動移動度の評価によって、カナマイシンマーカーの喪失についてテストした。
fljBを、次いで、上記に記載した方法の修正を使用してasd/fliC欠失YS1646株で欠失させた。fliC遺伝子に隣接する、それぞれ249および213塩基の左側および右側配列を含有する合成fljB遺伝子相同性アーム配列を合成し、pSL0148と呼ばれるプラスミドにクローニングした(配列番号231)。cre/loxP部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、次いでpSL0148にクローニングし、fljB遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーfljb-1(配列番号236)およびfljb-2(配列番号237)を用いてPCR増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドpKD46を担持するAST-101に電気穿孔によって導入した。カナマイシン耐性遺伝子を、次いで、上記に記載したようにcre介在性組換えによって除去し、温度感受性プラスミドは非許容温度での成長によって除去した。fliCおよびfljB遺伝子ノックアウト配列を、プライマーflic-3およびflic-4またはfljb-3(配列番号238)およびfljb-4(配列番号239)を使用するPCRによって増幅し、DNA配列決定によって検証した。YS1646のこのasd-/fliC-/fljB-突然変異体誘導体をAST-111と名付けた。
本明細書でAST-111またはASD/FLGと呼ばれる、fliCおよびfljBの両方の欠失を有するYS1646由来asd突然変異体株を、10マイクロリットルの一晩培養物をスイミングプレート(0.3%寒天および50mg/mL DAPを含有するLB)にスポットして、遊泳運動性について評価した。運動性はYS1646およびasd欠失株AST-101で観察されたが、asd/fliC/fljB欠失株AST-111では運動性が明白ではなかった。AST-111株に、次いで、pATIshTREX1(asd遺伝子およびTREX1を標的にするshRNAを含有するプラスミド)を電気穿孔してAST-112を作製し、DAPの非存在下でのその成長率を評価した。図5に示すようにASD/FLG(pATI-shTREX1)株AST-112は、補充DAPの非存在下、LBで複製することができ、pATIshTREX1を含有するasd株(AST-108)と同等の速度で成長した。これらのデータは、フラジェリンの排除は、S.ティフィムリウムのインビトロでの適応度を低下させないことを示している。
結腸癌のマウスモデルで投与されたフラジェリンノックアウト株の影響を評価するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、pATIKan-shTREX1プラスミドを含有するASD/FLG株(AST-113)または同じpATIKan-shTREX1プラスミドを有するASD株(AST-110)5×106CFUの週3回投与をIV注射し、PBS対照と比較した。初回IV投与の6時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Mouse Inflammation Cytometric Bead Arrayキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、FACS(BD Biosciences)によって分析した。
この例では、実施例1に記載されたYS1646のasd欠失株(AST-101)を更に改変して、サルモネラ属菌株の細胞質に蓄積するシグナル配列を欠くリステリオリシンO(LLO)タンパク質(本明細書ではcytoLLOと呼ばれる)を発現させた。LLOは、リステリア・モノサイトゲネスから分泌され、細菌のファゴソームエスケープ(phagosomal escape)を介在するコレステロール依存性の膜孔形成細胞溶解素である。コドン2~24個を欠失したLLOをコードする遺伝子を、サルモネラ菌での発現に最適化されたコドンにより合成した。cytoLLOのオープンリーディングフレームの配列は、配列番号240にある。cytoLLO遺伝子を、S.ティフィムリウムにおける転写を誘導するプロモーター(以下に再現された配列番号241)の制御下に置いた。実施例1に記載されているDatsenkoおよびWanner[Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:6640-6645]の方法の修正を使用して、cytoLLO発現カセットをasd欠失株AST-101のノックアウトasd座に単一コピーで挿入した。
cytoLLO遺伝子ノックインが抗腫瘍効果をもたらしたかどうかを決定するために、ASD/LLO(pATI-shTREX1)株AST-115を結腸癌のマウスモデルで評価した。この試験のために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり8匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-115の単回投与をIV注射し、PBS対照と比較した。
本明細書で提供される株は、アデノシンに対して栄養要求性であるように遺伝子操作される。その結果、株はインビボで弱毒化される。その理由は、正常組織の低アデノシン濃度では株は複製することができず、したがって定着は主に、アデノシンレベルが高い固形腫瘍微小環境で生じるためである。サルモネラ属菌株YS1646(AST-100)は野生型株ATCC14028の誘導体であり、purI遺伝子の撹乱のためにプリンに対して栄養要求性であるように遺伝子操作された[Low et al., (2004) Methods Mol. Med 90:47-60]。YS1646の全ゲノムのその後の分析は、purI遺伝子(purMと同義)は実際に欠失されないが、代わりに染色体逆位によって撹乱されること[Broadway et al. (2014) J.Biotechnol. 20:177-178]、および遺伝子全体は、挿入配列と隣接するYS1646染色体の2つの部分内に依然として含有されること(そのうち1つは、活性トランスポザーゼを有する)を示した。染色体再結合(chromosomal reengagement)によって撹乱されたpurI遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子の復帰可能性を残す。YS1646のプリン栄養要求性がインビトロでの連続継代後に安定であることは以前に示されているが、復帰率がどれほどであるかは明らかでなかった[Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002]。
プラスミドを含有する細菌株の適応度を評価するために、37℃でSpectramaxプレートリーダーを使用し、15分ごとにOD600を読み取ってLB液体培地で成長曲線を行った。図13に示すように、低コピープラスミドpEQU6-shTREX1を含有する株YS1646(AST-104)は、プラスミドを含有しない株YS1646(AST-100)と同等に成長した。asd欠失を相補し得るasd遺伝子を含む高コピーshTREX1プラスミドを有するasd突然変異体株(AST-110)は、DAPの非存在下のLBで複製することができたが、株YS1646より遅く成長した。低コピー数の複製起点およびasd欠失を相補し得るasd遺伝子を含むshTREX-1発現プラスミド(pATIlow-shTREX1)を含有するasd欠失株、株AST-117は、AST-110より速い速度で成長した。これらのデータは、asd遺伝子欠失を相補する低コピー数プラスミドは、S.ティフィムリウムのインビトロでのより迅速な複製速度を可能にすることから、高コピー数プラスミドより優れていることを示している。
高および低コピープラスミド上のasdを相補したasd突然変異体の適応度を測定するために、マウス腫瘍細胞株において細胞内で複製する細菌株の能力を、ゲンタマイシン保護アッセイを使用して評価した。このアッセイでは、マウスメラノーマB16.F10細胞またはマウス結腸がんCT26細胞を、相補的asd遺伝子を含有し、および高コピー複製起点、AST-110(ASD pATI-shTREX1)または低コピー複製起点、AST-117(ASD pATI低コピー-shTREX1)のどちらかを有するプラスミドを含有するasd突然変異体サルモネラ属菌株に感染させた。細胞を、1細胞当たり約5個の細菌の多重度で30分間感染させ、次いで細胞をPBSで洗浄し、ゲンタマイシンを含有する培地を添加して細胞外細菌を死滅させた。細胞内細菌は細胞膜を通過することができないことから、ゲンタマイシンによって死滅されない。感染後の様々な時点で、細胞単層を水による浸透圧ショックによって溶解し、細胞溶解物を希釈し、LB寒天にプレーティングして生存コロニー形成単位(CFU)を数えた。
この例では、CT26腫瘍担持マウスを、TREX1を標的にするshRNAを発現するプラスミド(pEQU6-TREX1)を含有する株YS1646、株AST-104、または機能性asd遺伝子およびTREX1を標的にするshRNAを有するプラスミド(pATI-shTREX1)を含有するYS1646のasd欠失株、株AST-110で処置した。最後のサルモネラ注射後12日目に、腫瘍をホモジナイズし、ホモジネートを連続希釈し、LB寒天プレートにプレーティングして存在するCFUの総数を数えるか、またはカナマイシンを含有するLBプレートにプレーティングしてカナマイシン耐性コロニーの数を数えた。
asd相補系を、プラスミド喪失を防ぎ、S.ティフィムリウム株によるインビボでの阻害性RNAデリバリーの抗腫瘍効果を増強するように設計する。これをテストするために、shTREX1プラスミドを含有するasd欠失株(AST-110)、または機能性asd遺伝子カセットを含有するスクランブル対照(AST-109)を、pEQU6-shTREX1を含有するYS1646(AST-104、asd遺伝子カセットを欠き、したがってプラスミド維持のための機構を有さないプラスミド)とマウス結腸癌モデルにおける抗腫瘍効果について比較した。この実験のために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり8匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-109(pATI-shスクランブルで形質転換されたASD)、AST-110(pATI-shTREX1で形質転換されたASD)、またはAST-104(pEQU6-shTREX1で形質転換されたYS1646)を8日目および18日目に2回IV注射し、PBS対照と比較した。
高コピーshTREX1プラスミドに対して、asd相補系を有する低コピーshTREX1プラスミドの抗腫瘍効果を結腸癌のマウスモデルで比較するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-117[ASD(pATI Low-shTREX1)]またはAST-110[ASD(pATI-shTREX1)]の週2回投与をIV注射し、陰性対照としてのPBS注射と比較した。図17に示すように、低コピープラスミドを有する株、AST-117は、高コピープラスミドを有する株AST-110と比べて優れた抗腫瘍効果を示した(高TGI 59%、低TGI 79%、p=0.042、25日目)。
上記に記載したように、S.ティフィムリウムのasd遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする。この遺伝子の欠失により、細菌は、インビトロまたはインビボで成長するときジアミノピメリン酸(DAP)に対して栄養要求性となる。この例は、asd欠失株(実施例1に記載)を使用する。該株は、DAPに対して栄養要求性であり、該株がインビボでの複製を欠損するようにasd相補遺伝子を含有しないRNAiのデリバリーに適したプラスミドを含有する。この株は、DAPの存在下、インビトロで増殖され、正常に成長し、次いで、DAPが存在しない哺乳動物宿主に免疫療法剤として投与され、細菌の自己溶解をもたらす。自己溶解株は、宿主細胞に侵入することができるが、哺乳動物組織におけるDAPの欠如のため複製することができない。特質のこの組合せにより、RNAi介在性遺伝子ノックダウンおよび複製する株と比べた安全性の増加が可能になる。
cytoLLOおよびTREX1を標的にするマイクロRNAをデリバリーするように遺伝子操作された自己溶解株AST-120が、ビルレンスを弱毒化されたかどうかを決定するために、半致死量(LD50)試験を行った。1×106~5×107CFUにわたるAST-120の漸増用量を、C57BL/6マウス(LPSに高度に感受性であるマウス株)にIV投与した。IV投与後、AST-120は、全ての用量で十分に忍容性であり、単回投与後に一過性の体重減少が観察された。2回目の投与は、初回投与7日後に投与し、最も高い用量レベル(5×107CFU)の4匹中1匹のマウスが瀕死で見出され、安楽死を必要とした。AST-120を投与された全ての他のマウスが一過性の体重減少を経験したが、回復した。これらのデータは、TREX1を標的にするマイクロRNAをデリバリーするS.ティフィムリウム(typhimurim)の自己溶解株(AST-120)のLD50が、5×107CFUより大きいことを示唆している。VNP20009株のLD50は、C57BL/6マウスで約5×106であることが知られている[Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25]。これは、AST-120がVNP20009と比べて少なくとも10倍弱毒化されることを示している。
cytoLLOおよびTREX1を標的にするマイクロRNAをデリバリーするように遺伝子操作された自己溶解株AST-120が、抗腫瘍応答をもたらすことができるかどうかを決定するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹)に、CT26(100μL PBS中、2×106細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUの自己溶解株AST-120[ASD/LLO(pEQU6-miTREX1)]の単回投与をIV注射し、対照としてPBSで処置したマウスと比較した。図20に示すように、PBS単独で処置した動物と比べて、抗腫瘍応答がわずか1回の投与後に検出された(TGI 52.4%、p=0.02、17日目)。まとめると、これらのデータは、DAP栄養要求性によって自己溶解性であるように遺伝子操作され、およびTREX1を標的にするRNAiのデリバリー用のプラスミドを含有するように遺伝子操作されたS.ティフィムリウムが見事に弱毒化され、抗腫瘍応答を誘発できることを示している。
adrAまたはcsgD欠失
この例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、サルモネラ・ティフィムリウムのバイオフィルム形成に必要な遺伝子、adrAを欠失させるために更に改変される。バイオフィルムを形成することができないサルモネラは、宿主食細胞によってより迅速に吸収され、より迅速に排除される。細胞内局在化におけるこの増加により、プラスミドデリバリーおよびRNA干渉による遺伝子ノックダウンの有効性は強化される。腫瘍/組織からのクリアランス速度の増加は、療法の忍容性を向上させ、バイオフィルム形成の欠如は、患者における人工器官および胆嚢への定着を妨げる。別の例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、csgDを欠失させるために更に改変される。この遺伝子はadrAの活性化に関与し、またTLR2アゴニストであるcurli線毛の発現も誘導する。csgDの喪失もまたバイオフィルム形成を防ぎ、TLR2活性化の阻害という追加の利点があり、それによって細菌のビルレンスを更に低減し、RNAiのデリバリーを強化する。
この例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたS.ティフィムリウムの生弱毒化株が、pagPを欠失させるために更に改変される。pagP遺伝子は、S.ティフィムリウムの感染ライフサイクル中に誘導され、リピドAをパルミトイル化(palmitylate)する酵素をコードする。野生型S.ティフィムリウムでは、pagPの発現は、ヘプタアシル化されたリピドAをもたらす。リピドAの末端アシル鎖を付加することができないmsbB突然変異体では、pagPの発現はヘキサアシル化LPSをもたらす。ヘキサアシル化LPSは、最も炎症促進性であることが示されている。この例では、pagPおよびmsbBを欠失した株は、ペンタアシル化LPSしか産生できず、細菌が干渉RNAをデリバリーするように遺伝子操作される場合、炎症促進性サイトカインの低下、忍容性の強化、および適応免疫の増加を可能にする。
この例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、hilAを欠失させるために更に改変される。hilAは、サルモネラ病原性アイランド-1(SPI-1)関連3型分泌装置(T3SS)の発現に必要とされる調節遺伝子である。この分泌装置は、改変S.ティフィムリウムの取込みを引き起こす上皮細胞等の非食宿主細胞のサイトゾルへのエフェクタータンパク質の注入に関与している。SPI-1 T3SSは、腸上皮層の通過に不可欠であることが示されているが、細菌が非経口的に注射される場合、感染には必ずしも必要でない。いくつかのタンパク質およびニードル複合体の注入自体も、インフラマソーム活性化および食細胞のパイロトーシスを誘導し得る。この炎症促進性細胞死は、抗原提示細胞(APC)死を直接誘導すること、およびサイトカイン環境を改変してメモリーT細胞の生成を妨げることによって、頑強な適応免疫応答の開始を制限する可能性がある。この例では、静脈内または腫瘍内のどちらかに投与される治療的サルモネラ・ティフィムリウム株からのhilA遺伝子の追加の欠失が、取込みにSPI-1 T3SSを必要としない食細胞に対してサルモネラ・ティフィムリウム感染を集中させ、次いでこれらの食細胞の寿命を延長させる。hilA突然変異は炎症促進性サイトカインの量を低減し、療法の忍容性、および適応免疫応答の質を向上させる。
DatsenkoおよびWanner[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)]に記載されているラムダ由来レッド組換え系を使用して、asd遺伝子が欠失しているS.ティフィムリウムのYS1646菌株およびasdとフラジェリン遺伝子fljBおよびfliCとが欠失しているYS1646菌株からhilA遺伝子を欠失させて、菌株HilA/ASDおよびHilA/FLG/ASDをそれぞれ作製した。次いで、これらの菌株に、機能性asd遺伝子を(欠失したasd遺伝子を相補するために、およびインビボでのプラスミド維持を確実にするために)含有するプラスミドと、マイクロRNA標的化マウスTREX-1の発現を駆動するU6プロモーターを含有する真核生物発現カセット(pATI-miTREX1)とを電気穿孔した。次いで、Spectramax 96ウェルプレートリーダー(Molecular devices)を使用してOD600によって測定して、LBブロス中、37℃で、菌株HilA/ASD(pATI-miTREX1)およびHilA/FLG/ASD(pATI-miTREX1)のインビトロでの成長速度を判定し、菌株ASD(pATI-miTREX1)およびYS1646と比較した。各改変株は、インビトロで親YS1646菌株と同等の速度で成長した。これは、hilA欠失が、インビトロでの細菌の適応度を低下させないことを示す。
hilA欠失突然変異体が、パイロトーシスを、SPI-1を産生することができる菌株より少なく誘導するかどうかを評価するために、菌株YS1646、ASD(pATI-miTREX1)、FLG/ASD(pATI-miTREX1)、およびHilA/ASD (pATI-miTREX1)を多重感染度(MOI)1000細菌でヒトTHP-1単球細胞に感染させた。1時間感染後、細胞外細菌を除去し、培地を、細胞外細菌を死滅させるための100μg/mLのゲンタマイシンを含有する培地と交換した。感染の4時間後、細胞を採取し、CellTiter-Glo(Promega)試薬の取込みを使用し、Spectramax 96ウェルプレートリーダー(Molecular devices)を使用して発光を測定して、THP-1細胞生存率を評価した。YS1646による感染は、86%細胞死をもたらしたが、HilA/ASD(pATI-miTREX1)による感染は、46%細胞死しかもたらさなかった。ASD(pATI-miTREX1)およびFLG/ASD(pATI-miTREX1)菌株についての死細胞%は、細胞死がそれぞれ77%および68%である中間表現型を示した。これらのデータは、hilA欠失菌株が、ヒト単球細胞の細胞死を、SPI-1を発現することができるS.ティフィムリウム菌株より少なく誘導することを示している。
菌株YS1646、ASD(pATI-miTREX1)、FLG/ASD(pATI-miTREX1)およびHilA/ASD(pATI-miTREX1)を多重感染度500細菌でHeLa細胞に感染させた。1時間後、細胞外細菌を除去し、培地を、細胞外細菌を死滅させるための100μg/mLゲンタマイシンを含有する培地と交換した。感染の4時間後、細胞を採取し、浸透圧ショックによって溶解し、細菌の生存可能なコロニー形成単位の数を、連続希釈およびLB寒天へのプレーティングによって数えた。YS1646では1ウェル当たり4.6×103CFUが回収されたが、HilA/ASD(pATI-miTREX1)菌株では2.0×102CFUしか回収されなかった。菌株ASD(pATI-miTREX1)およびFLG/ASD(pATI-miTREX1)は、中間表現型を示し、それぞれ、8.0×102CFUおよび6.0×102CFUが回収された。これらのデータは、hilA欠失菌株が、ヒト上皮細胞への取込みを、SPI-1を発現することができるS.ティフィムリウム菌株より少なく誘導することを示している。
DatsenkoおよびWanner[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)]に記載されているラムダ由来レッド組換え系を使用して、S.ティフィムリウムYS1646のasd遺伝子欠失菌株(purI/MおよびmsbB欠失を含む)からpagP遺伝子を欠失させて、菌株PagP/ASDを生成した。次いで、これらの菌株に、機能性asd遺伝子を(欠失したasd遺伝子を相補するために、およびインビボでのプラスミド維持を確実にするために)含有するプラスミドと、マイクロRNA標的化マウスTREX-1の発現を駆動するU6プロモーターを含有する真核生物発現カセット(pATI-miTREX1)とを電気穿孔して、菌株PagP/ASD(pATI-miTREX1)を生成した。次いで、リピドAをこの菌株から抽出し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI MS)によって評価し、野生型S.ティフィムリウム菌株ATCC14028、菌株YS1646(msbBおよびpurMが欠失している)、およびasd遺伝子を欠失させ、pATI-miTREX1プラスミドで相補した菌株YS1646と比較した。野生型サルモネラ属は、機能性msbBおよびpurM遺伝子の存在に起因して、ペンタアシル化およびヘキサアシル化種にそれぞれ対応する2034の質量を有するリピドA副ピークおよび1796の質量を有する主ピークを有した。msbB欠失菌株YS1646およびASD(pATI-miTREX1)は、ヘキサアシル化LPSとペンタアシル化LPSの混合物に対応する主ピークを1828および1585に有した。msbBおよびpagP欠失株であるPagP/ASD(pATI-TREX1)は、1585の質量を有する単一ピークしか有さなかった。これらのデータは、pagPの欠失が、LPSのパルミトイル化を阻止することによって、LPSを単一ペンタアシル化種に限定することを示している。
上記の改変された菌株が、菌株YS1646より弱毒化されるかどうかを判定するために、半致死量(LD50)研究を行った。漸増濃度の菌株YS1646、FLG/ASD(pATI-TREX1)、HilA/ASD(pATI-TREX1)、またはPagP/ASD(pATI-TREX1)をC57BL/6マウスに静脈内注射した。菌株YS1646のLD50は、この菌株の公開報告書と一致する1.6×106CFUであることを見出した。HilA/ASD(pATI-TREX1)菌株のLD50は、5.3×106CFUであると判定した。これは、ビルレンスが3分の1になることを示している。PagP/ASD(pATI-TREX1)菌株のLD50は、6.9×106CFUであると判定した。これは、ビルレンスが4分の1になることを示している。FLG/ASD(pATI-TREX1)菌株のLD50は、>7×106CFUであると判定した。これは、菌株YS1646と比較してビルレンスが4.4分の1未満になることを示している。これらのデータは、上記の遺伝子改変が、S.ティフィムリウムのビルレンスを減少させ、ヒトにおける忍容性の増加をもたらすことになることを示す。VNP20009の第1相臨床試験(Toso et al.(2002) J. Clin.Oncol.20(1):142-152)において、患者の腫瘍における細菌の存在は、試験した2つの最高用量で部分的にしか観察されなかった:3×108CFU/m2(33%存在)および1×109CFU/m2(50%存在)。これは、VNP20009の耐用量が低すぎて定着を達成することができなかったことを示す。上記の改変により菌株の忍容性を向上させることによって、VNP20009より高い用量を投与することができる。これは、定着した腫瘍を有することになる患者のパーセンテージも、腫瘍1個当たりの治療的定着レベルも向上させる。
hilA-突然変異は、T3SSの上方調節を防止し、感染したマクロファージのパイロトーシス細胞死を防止する。これは、インビボでプラスミド含有標的細胞株の忍容性および抗腫瘍有効性を強化するはずである。これを試験するために、miTREX1プラスミドを含有するΔhilA/Δasd菌株(HilA/ASD(pATI-miTrex1))、または媒体対照を、マウス結腸癌モデルにおいて腫瘍有効性についてmiTREX1プラスミドを含有するΔfljB/ΔfliC/Δasd菌株(FLG/ASD(pATI-miTrex1))と比較した。6~8週齢のメスのC57BL/6マウス(1群当たり9匹のマウス)の右側腹部にMC38(100μL PBS中5×105細胞)をS.C.接種した。8日目に、確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、3×105CFUの菌株HilA/ASD(pATI-miTrex1)、FLG/ASD(pATI-miTrex1)、またはPBS媒体対照をI.V.注射した。体重および腫瘍を週2回測定した。腫瘍測定は、電子ノギス(Fowler、Newton、MA)を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式1/2(縦×横2)を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の>20%に達したとき、または壊死したとき、IACUC規則に従ってマウスを安楽死させた。
親VNP20009菌株と比較して、腫瘍定着および忍容性に対するΔhilA/ΔasdおよびΔfljB/ΔfliC/Δasd菌株の影響を試験するために、miTREX1プラスミドを含有するこれらの菌株をマウス結腸癌モデルにおいて評価した。6~8週齢のメスのC57BL/6マウス(1群当たり3匹のマウス)の右側腹部にMC38細胞(100μL PBS中5×105細胞)をS.C.接種した。8日目に、確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、3×105CFUおよび1×105CFUのHilA/ASD(pATI-miTrex1)、FLG/ASD(pATI-miTrex1)、VNP20009またはPBS媒体対照をI.V.注射した。投与の2時間後にマウスを採血し、フローサイトメーター(Novocyte)を用いてMouse Inflammation Cytometric Bead Array(BD Biosciences)によって全身性サイトカインについて血清を評価した。I.V.投与後3日目に、マウスを屠殺し、腫瘍、脾臓および肝臓を採取し、計量した。組織を10mL滅菌PBS中でホモジナイズし(Mチューブ、GentleMacs、Miltenyi Biotec)、次いで10倍連続希釈を行い、LB+カナマイシン(Sigma)を含有するLB(ルリアブロス)寒天プレートにプレーティングした。翌日、コロニー形成単位(CFU)をカウントし、組織1グラム当たりの総CFUを評価した。
上記のように、asd遺伝子が欠失しているS.ティフィムリウムのYS1646菌株からhilA遺伝子ならびにフラジェリン遺伝子fljBおよびfliCを欠失させて、菌株HilA/ASDおよびFLG/ASDをそれぞれ生成した。加えて、FLG/ASD菌株を、サルモネラ属菌株(FLG/ASD/cLLO)の細胞質に蓄積する、シグナル配列を欠くリステリオリジンO(LLO)タンパク質(cytoLLO)を発現するように、更に改変した。これらの菌株に、EF1αプロモーターおよびマウスサイトカインIL-2(muIL-2)のための発現カセットを含有するプラスミドを電気穿孔した。加えて、FLG/ASD菌株に、非同族サイトカインの対照としてのIL-15δのための発現プラスミドを電気穿孔した。CMVプロモーターを使用して、追加の構築物を作出した。
hilA欠失S.ティフィムリウム菌株は、上皮細胞に感染するそれらの能力が低下していることを実証するために、HeLa子宮頸癌細胞に、プラスミド維持のための機能性asd遺伝子をコードするプラスミドを含有する以下のS.ティフィムリウム菌株を感染させた:YS1646、YS1646ΔasdおよびYS1646Δasd/ΔhilA。1×106HeLa細胞を、DMEMおよび10%FBSが入っている24ウェル皿に配置した。細胞にS.ティフィムリウムの対数期培養物を1時間感染させ、次いで細胞をPBSで洗浄し、培地を、細胞外細菌を死滅させるための50μg/mLのゲンタマイシンを含有する培地と交換した。4時間後、HeLa細胞単層をPBSで洗浄し、1%トリトンX 100溶解緩衝剤で溶解して細胞内細菌を放出させた。溶解物を連続希釈し、LB寒天プレートにプレーティングして細胞内細菌の数を定量化した。hilA欠失を有する菌株は、機能性hilA遺伝子を有する菌株と比較して回収されるCFUが90%減少された。これは、hilAの欠失が上皮由来細胞のS.ティフィムリウム感染を有意に減少させることを示している。
ΔhilAまたはΔfljB/ΔfliC S.ティフィムリウム菌株は、マクロファージの細胞死を引き起こすそれらの能力が低下していることを証明するために、THP-1ヒトマクロファージ細胞に、プラスミド維持を確実にするための機能性asd遺伝子をコードするプラスミドを含有する以下のS.ティフィムリウム菌株を感染させた:YS1646、YS1646Δasd、YS1646Δasd/ΔfljB/ΔfliC、およびYS1646Δasd/ΔhilA。5×104細胞を、DMEMおよび10%FBSが入っている96ウェル皿に配置した。細胞に、S.ティフィムリウムの洗浄した対数期培養物を1細胞当たり100CFUのMOIで1時間感染させ、次いで細胞をPBSで洗浄し、培地を、細胞外細菌を死滅させるための50pg/mLのゲンタマイシンと、50ng/mLのインターフェロンガンマとを含有する培地と交換した。24時間後、THP-1細胞を、CellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で染色し、Spectramaxプレートリーダーを使用して発光を定量化する発光細胞生存率アッセイを使用して生存細胞のパーセンテージを判定した。hilA欠失菌株を感染させた細胞は、およそ72%生存細胞を有したが、YS1646感染細胞は、38%の生存率しか有さなかった。これは、hilAの欠失がヒトマクロファージの細胞死を阻止することを示している。プラスミド含有菌株YS1646ΔasdおよびYS1646Δasd/ΔfljB/ΔfliCを感染させた細胞は、それぞれ40%および51%生存率を有した。これは、フラジェリン遺伝子の欠失もヒトマクロファージの細胞死を阻止したことを示す。
ヒトTHP-1マクロファージに 、真核細胞プロモーターの制御下のマウスIL-2のための発現カセットと、プラスミド維持を確実にするための機能性asd遺伝子とをコードするプラスミドを含有する以下のS.ティフィムリウム菌株を感染させた:YS1646Δasd/ΔfljB/ΔfliC、YS1646Δasd-cytoLLO、およびYS1646Δasd/ΔhilA。5×104細胞を、DMEMおよび10%FBSが入っている96ウェル皿に配置した。細胞に、S.ティフィムリウムの洗浄した対数期培養物を1細胞当たり50CFUのMOIで1時間感染させ、次いで細胞をPBSで洗浄し、培地を、細胞外細菌を死滅させるための50μg/mLのゲンタマイシンを含有する培地と交換した。48時間後、細胞の上清を除去し、R&D Systems(商標)Mouse IL-2 Quantikine ELISA Kitを使用してマウスIL-2について試験した。残存細胞を、CellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で染色し、Spectramaxプレートリーダーを使用して発光を定量化する発光細胞生存率アッセイを使用して生存細胞のパーセンテージを判定した。マウスIL-2のための発現カセットをコードするプラスミドを含有する、YS1646Δasd/ΔfljB/ΔfliC、YS1646Δasd-cytoLLO、およびYS1646Δasd/ΔhilA菌株は、それぞれ、35pg/mL、60pg/mLおよび103pg/mLのIL-2を発現した。
S.ティフィムリウムのYS1646菌株のhilAまたはフラジェリン遺伝子fljBおよびfliCの欠失を含有する免疫刺激性S.ティフィムリウム菌株を、asd遺伝子欠失を組み合わせて、菌株YS1646Δasd/ΔhilA、およびYS1646Δasd/ΔfljB/ΔfliCをそれぞれ形成した。これらの菌株に、EF1αプロモーターおよびマウスサイトカインIL-2のための発現カセットを含有するプラスミドを電気穿孔した。
本明細書において記載するように、VNP20009(YS1646)は、ヒトにおいて全身投与後にわずかな腫瘍定着を示す。VNP20009は、ヒト血液中の補体因子によって不活性化されることを本明細書において示す。このことを実証するために、菌株YS1646およびE.コリD10Bを、細菌の表面を変更する追加の突然変異を含む、本明細書において提供する例示的な免疫刺激性細菌と比較した。これらの菌株は、YS1646(pagP-)、YS1646(fljB-/fliC-)、およびYS1646(pagP-/fljB-/fliC-)であった。YS1646およびE.コリD10B培養物に加えて、これら3つの菌株を、プールされたマウス血液またはプールされた健常ヒトドナー(n=3)のどちらかからの血清または熱不活性化(HI)血清と共に、3時間、37℃でインキュベートした。血清とのインキュベーション後、細菌を連続希釈し、LB寒天プレートにプレーティングし、コロニー形成単位(CFU)を測定した。
以前に記載されたラムダ由来レッド組換え系[Datsenko and Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645を参照されたい]を使用して、purI-/msbB-である菌株YS1646からasdおよびフラジェリン(fljB/fliC)遺伝子を欠失させて、菌株YS1646ΔFLG/ΔASDを生成した。次いで、1)インビボでのプラスミド維持のためにasdの染色体欠失を相補するための機能性asd発現カセットと、2)細菌rpsmプロモーターの制御下の構成的mCherry発現カセット(rpsm-mCherry)とを含有する、細菌プラスミドpRPSM-mCherryでの電気穿孔によって、菌株YS1646ΔFLG/ΔASDを形質転換した。このプラスミドで形質転換された細菌コロニーは、mCherry赤色蛍光タンパク質の発現に起因して明らかに赤い色であった。腫瘍定着を評価するために、形質転換細菌菌株(YS1646ΔFLG/ΔASD(pRPSM-mCherry))をマウス結腸癌モデルにおいてインビボで試験した。6~8週齢のメスのC57BL/6マウス(1群当たり3匹のマウス)の右側腹部にMC38細胞(100μL PBS中5×105細胞)を皮下接種した。大きな確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、1×106CFUのYS1646ΔFLG/ΔASD(pRPSM-mCherry)を静脈内注射した。腫瘍を3日後に採取し、単個細胞浮遊液に解離させた(Miltenyi Biotec)。死細胞に透過するが生細胞には透過しないZombie Aqua(商標)fixable viability dye(BioLegend)を用いて、細胞を染色した。細胞を以下の抗体と共にインキュベートした:Brilliant Violet 510(商標)抗マウスCD45(クローン30-F11、BioLegend);Brilliant Violet 421(商標)抗マウスCD8a(クローン53-6.7、BioLegend);PE抗マウスCD3ε(クローン145-2C11、BioLegend);FITC 抗マウスCD4(クローンRM4-5、BioLegend);PE/Cy7抗マウス/ヒトCD11b(クローンM1/70、BioLegend);Brilliant Violet 785(商標)抗マウスLy6C(クローンHK1.4、BioLegend);Brilliant Violet 605(商標)抗マウスLy6G(クローン1A8、BioLegend);APC抗マウスF4/80(クローンBM8、BioLegend);およびPercP/Cy5.5抗マウスCD24(クローンM1/69、Biolegend)。次いで、様々な表面マーカーおよびmCherry+(PE Texas Red)を使用してフローサイトメトリー(Novocyte)によって細胞を選別して、採取した細胞による細菌の取込みを判定/局在定位した。
pagP遺伝子をS.ティフィムリウム菌株YS1646ΔASDおよびYS1646ΔFLG/ΔASDから欠失させて、菌株YS1646ΔpagP/ΔASDおよびYS1646ΔpagP/ΔFLG/ΔASDそれぞれ生成した。菌株ΔFLG/ΔASD、YS1646ΔpagP/ΔASD、およびYS1646ΔpagP/ΔFLG/ΔASDを、asd遺伝子をコードするプラスミドおよびマウスIL-2(muIL-2)をコードする真核生物発現カセットでの電子穿孔によって、形質転換した。これらの菌株のインビボでの忍容性を試験するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウスにおいてLD50研究を行った。3×105、1×106、3×106、1×107または3×107CFUの菌株YS1646、YS1646ΔFLG/ΔASD(muIL-2)、YS1646ΔPagP/ΔASD(muIL-2)、またはYS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD(muIL-2)を、マウスに静脈内注射した。次いで、マウスを罹患率および死亡率についてモニターし、LD50値を計算した。結果を下記の表に示す。
Claims (54)
- 真核生物プロモーターの制御下の治療用産物をコードする核酸を含むプラスミドを含む免疫刺激性細菌であって、
前記免疫刺激性細菌がサルモネラ菌(Salmonella bacterium)であり;
治療用産物が抗がん治療用産物であり;
前記免疫刺激性細菌のゲノムが改変され、そのために細菌が鞭毛を欠き、そして
野生型細菌が鞭毛を含む、
免疫刺激性細菌。 - ゲノム改変を含み、そのために細菌がpagP-である、請求項1に記載の免疫刺激性細菌。
- ゲノム改変を含み、そのために細菌がmsbB-である、請求項1または2に記載の免疫刺激性細菌。
- ゲノム改変を含み、そのために細菌がmsbB-、asd-、pagP-であり、そして鞭毛を欠く、請求項1から3のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- ゲノム改変を含み、そのために細菌がΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/ΔfliC/ΔpagP/ΔpurIである、請求項1から3のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 抗がん治療用産物が、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を付与するかまたはその一因となる免疫刺激性タンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を付与するかまたはその一因となる免疫刺激性タンパク質が、サイトカインまたはケモカインである、請求項6に記載の免疫刺激性細菌。
- 腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を付与するかまたはその一因となる免疫刺激性タンパク質が、IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-36ガンマ、IL-2Raへの結合を減弱させるIL-2、IL-15/IL-15Rアルファ鎖複合体、IL-18、IL-21、IL-23、IL-2Raへの結合を減弱させるかまたは結合しないように改変されたIL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、CCL3、CCL4、CCL5、T細胞のリクルートメント/存続に関与するかまたはそれを生じさせるかもしくは促進するタンパク質、CD40、CD40リガンド、CD28、OX40、OX40リガンド、4-1BB、4-1BBリガンド、B7-CD28ファミリーのメンバー、CD47アンタゴニスト、TGF-ベータポリペプチドアンタゴニスト、および腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーのメンバーのうちの1つまたは複数の中から選択される、請求項6または7に記載の免疫刺激性細菌。
- 治療用産物がTGF-ベータアンタゴニストポリペプチドである、請求項1から6のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 治療用産物が、IL-15またはIL-15/IL-15Rアルファ鎖複合体であるまたはさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 治療用産物が、抗体またはその抗原結合性断片であるまたはさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 治療用産物が、デュアルアフィニティリターゲティング(DART)抗体であるかまたは二重特異性T細胞誘導抗体(BiTE)であるタンデムscFvである、抗体またはその断片である、請求項1から6および11のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 抗体またはその抗原結合性断片が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2またはIL-6のアンタゴニストである、請求項11または12に記載の免疫刺激性細菌。
- ゲノム改変を含み、そのために細菌がcsgD-である、請求項1から13のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 治療用産物をコードする核酸が、分泌シグナルをコードする核酸に、発現について操作可能に連結されており、そのために宿主において発現時に前記治療用産物が分泌される、請求項1から14のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アデノシン栄養要求性であるか、またはアデノシンおよびアデニン栄養要求性である、請求項1から15のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)である、請求項1から16のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)であり、アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)をコードする内因性遺伝子のうちの全てまたは一部が撹乱または欠失しており、そのために内因性asdが発現されないことから、asd-である、請求項1から16のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)をプラスミド上にコードする、請求項1から18のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- ゲノム改変を含み、そのために細菌がasd-、purI-、msbB-、フラジェリン-およびpagP-である、請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アデノシン栄養要求性である、請求項1から20のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、低コピー数または中コピー数で存在する、請求項1から21のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌中のプラスミド上に治療用産物をコードし、前記産物の発現が、真核生物調節シグナルの制御下にある、請求項1から22のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 調節シグナルが、RNAポリメラーゼIIプロモーターである真核生物プロモーターを含む、請求項23に記載の免疫刺激性細菌。
- 免疫刺激性細菌が、サルモネラ属(Salmonella)菌種であり;
前記免疫刺激性細菌が、アデノシン栄養要求性であり;
前記免疫刺激性細菌が、フラジェリン-(fliC-/fljB-)であり;そして
前記プラスミド上にコードされた前記治療用産物が、真核生物調節配列の制御下で発現される、
請求項1から24のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - 腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を付与するかまたはその一因となる免疫刺激性タンパク質が、発現されたときにそれが膜に固定されているようにプラスミド上にコードされる、請求項6から14および16から25のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- ゲノム改変を含み、そのために細菌がcsgD-である、請求項1から26のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 3型分泌装置または4型分泌装置の改変を有する、請求項1から27のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、抗腫瘍抗体もしくはその断片、または細胞毒素をコードする、請求項1から28のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 抗がん治療用産物が、リシン(ricin)、サポリンおよび志賀毒素の中から選択される細胞毒素である、請求項29に記載の免疫刺激性細菌。
- 腫瘍抗原をコードする、請求項1から30のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 阻害性RNA(RNAi)またはCRISPRカセットをコードする、請求項1から30のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌であって、
前記RNAiまたはCRISPRカセットが、真核生物プロモーターの制御下で前記細菌中のプラスミド上にコードされ;そして
前記RNAiまたはCRISPRカセットが、免疫チェックポイントを阻害するかまたは撹乱するかまたは抑制する、請求項1から31のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - 治療用タンパク質のうちの2つをコードする核酸を含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 治療用産物をコードするプラスミドが、エンハンサー、プロモーター、IRES、前記治療用産物をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリAテールのうちの1つまたは複数を含むコンストラクトを含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発熱性を低下させるためにポリミキシン(polymyxin)で処置されている、請求項1から34のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 請求項1から35のいずれかに記載の免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- 非経口投与、全身投与、腫瘍内投与または腹腔内投与のために製剤化される、請求項36に記載の医薬組成物。
- 対象においてがんを処置することにおける使用のための、請求項1から35のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または請求項36または37に記載の医薬組成物。
- がんが固形腫瘍または血液悪性腫瘍を含む、請求項38に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 処置が、第2の抗がん剤または処置を含む併用療法レジメンを含む、請求項38または39に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 第2の抗がん剤または処置が、免疫療法、放射線または化学療法である、請求項40に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- がんが、白血病、リンパ腫、胃がん、ならびに乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頸部および肝臓のがんの中から選択される、請求項38から41のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 請求項1から35のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を含む、単離された細胞または培養された細胞。
- 免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞または初代細胞株であるまたは含む、請求項43に記載の単離された細胞または培養された細胞。
- 造血細胞またはT細胞であるまたは含む、請求項43に記載の単離された細胞または培養された細胞。
- 細胞に前記免疫刺激性細菌を感染させることによってエクスビボで産生される、請求項43から45のいずれか一項に記載の単離された細胞または培養された細胞。
- 腫瘍に定着する治療用細菌の能力を増大させるインビトロ方法であって、ゲノムを改変することを含み、そのために前記細菌がフラジェリン-およびpagP-であり、前記細菌が、抗がん剤または処置である治療用産物をコードするプラスミドを含む、および前記細菌がサルモネラ菌である、方法。
- 未改変細菌が、弱毒化細菌である、請求項1から46のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または細胞。
- 未改変細菌が、野生型菌株である、請求項1から46のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または細胞。
- 前記免疫刺激性細菌が、サルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項1から46、48および49のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または細胞。
- 前記免疫刺激性細菌が、VNP20009、YS1646、RE88、SL7207と称される菌株またはATCC 14028として寄託された菌株の識別特徴の全てを有する野生型菌株、の中から選択されるサルモネラ・ティフィムリウム菌株に由来する、請求項1から46および48から50のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または細胞。
- 前記免疫刺激性細菌が、YS1646と称される菌株の誘導体である、請求項51に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または細胞。
- 前記免疫刺激性細菌がゲノム改変を含み、そのために細菌がフラジェリン-およびpagP-/msbB-である、請求項1から46および48から52のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または細胞。
- 未改変細菌が、弱毒化細菌または野生型菌株である、請求項47に記載の方法。
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