SK288274B6 - Monoklonálna protilátka proti CTLA-4, spôsob jej výroby, farmaceutická kompozícia, bunková línia, izolovaná nukleová kyselina, hostiteľská bunka, transgénny cicavec a použitie monoklonálnej protilátky - Google Patents

Abstract

Je opísaná monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na antigén 4 ľudských cytotoxických T–lymfocytov alebo jej fragment, farmaceutická kompozícia obsahujúca túto protilátku alebo jej fragment, bunková línia produkujúca protilátku alebo fragment viažuci antigén, izolovaná nukleová kyselina kódujúca ľahký a/alebo ťažký reťazec protilátky alebo fragmentu viažuceho antigén, hostiteľská bunka obsahujúca izolovanú nukleovú kyselinu alebo fragment, spôsob prípravy monoklonálnej protilátky proti CTLA-4 a jej použitie.

Description

Predmetom predkladaného vynálezu sú úplné ľudské monoklonálne protilátky proti ľudskému antigénu 4 cytotoxických T-lymfocytov (CTLA-4). Ďalej nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinové sekvencie obsahujúce ťažké a ľahké reťazce imunoglobulinových molekúl. Obzvlášť súvislé sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca zahrnujúce oblasti určujúce komplementaritu (CDR), špecificky od FR1 a/alebo CDR1 až po CDR3 a/alebo v FR4. Predmetom vynálezu sú tiež protilátky majúce podobné väzbové vlastnosti a protilátky (alebo iné antagonisty) s podobnou funkciou ako protilátky opísané v tomto vynáleze.

Doterajší stav techniky

Regulácia imunitnej reakcie pacientov by poskytla potrebnú liečbu mnohých ľudských ochorení, ktoré by mohli viesť k špecifickému účinku, ktorý je možné len zriedka dosiahnuť použitím bežných liekov. Bolo by možné dosiahnuť aktiváciu aj utlmenie reakcií imunitného systému. Úlohy T- a B-lymfocytov boli rozsiahle študované a charakterizované v spojitosti s reguláciou imunitnej reakcie. Z týchto štúdií vyplýva, že úloha T-lymfocytov je v mnohých prípadoch obzvlášť dôležitá na prevenciu ochorení a liečbu.

T-lymfocyty majú veľmi zložitý systém kontroly svojich interakcií. Na interakciu medzi T-lymfocytmi sú používané početné receptory a rozpustné faktory. Teda účinok každého konkrétneho signálu na imunitnú reakciu sa väčšinou mení a závisí na konkrétnych faktoroch, receptoroch a protireceptoroch, ktoré sú zapojené do metabolickej dráhy. Metabolické dráhy na utlmenie reakcie sú rovnako dôležité ako dráhy vyžadované na aktiváciu. Jeden mechanizmus prevencie imunitnej reakcie na konkrétny antigén je zrenie v týmuse vedúce k tolerancii T-lymfocytov. Sú tiež známe ďalšie mechanizmy, ako je napríklad sekrécia supresívnych cytokínov.

Aktivácia T-lymfocytov nevyžaduje iba stimuláciu prostredníctvom antigénového receptora (T-bunkový receptor (TCR)), ale ďalšie signály prostredníctvom kostimulačných (spoločne stimulujúcich) povrchových molekúl, ako je napríklad CD28. Ligandy na CD28 sú proteíny B71 (CD80) a B7-2 (CD86), ktoré sú exprimované na bunkách prezentujúcich antigén, ako sú napríklad dendritické bunky, aktivované B-lymfocyty alebo monocyty, ktoré interagujú s CD28 alebo CTLA-4 T-lymfocytov na zaistenie kostimulačného signálu. Úloha kostimulačného signálu bola študovaná na experimentálnej alergickej encefalomyelitíde (EAE), autori Perrinem et al. (Immunol. Res., 14, 189 - 99, 1995). EAE je autoimunitná porucha indukovaná bunkami Thl namierenými na myelínové antigény, ktorá poskytuje in vivo model na štúdium úlohy B7 sprostredkovanej kostimulácie v indukcii patologickej imunitnej reakcie. Použitím rozpustného fúzneho proteínového ligandu na receptory B7, ako aj monoklonálnych protilátok špecifických buď na CD80, alebo CD86, Perrin et al. dokázali, že B7 kostimulácia má významnú úlohu na určenie klinického výsledku ochorenia pri EAE.

Interakcia medzi B7 a CD28 je jedna z niekoľkých kostimulačných signálnych dráh, ktorá sa javí postačujúca na spustenie maturácie a proliferácie antigén-špecifických T-lymfocytov. Nedostatočná kostimulácia a sprievodná nedostatočnosť produkcie IL-2 zabraňujú následnej proliferácii T-lymfocytov a indukujú stav nereaktivity nazývaný anergia. Aktiváciu a proliferáciu T-lymfocytov môže blokovať celý rad vírusov a nádorov, čo vedie k nepostačujúcej aktivite alebo nereaktivite hostiteľského imunitného systému na infikované alebo transformované bunky. Z celého radu možných porúch T-lymfocytov môže byť anergia aspoň čiastočne zodpovedná za zlyhanie hostiteľa zbaviť sa patogénov alebo nádorových buniek.

Použitie proteínu B7 na sprostredkovanie protinádorovej imunity bolo opísané v práci Chen et al. (Celí, 71, 1093 - 1102, 1992) a Townsend a Allison (Science, 259, 368, 1993). Schwartz (Celí, 71, 1065, 1992) podáva prehľad úlohy CD28, CTLA-4 a B7 v produkcii IL-2 a imunoterapii. Harding et al. (Náture, 356, 607 až 609, 1994) dokazuje, že signály sprostredkované CD28 kostimulujú myšie T-lymfocyty a zabraňujú indukcii anergie v klonoch T-lymfocytov (pozri tiež patenty Spojených štátov č. 5 434 131, 5 770 197 5 773 253 a medzinárodné patentové prihlášky č. WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 a WO 95/33770).

Z uvedeného je jasné, že T-lymfocyty vyžadujú dva typy signálov od buniek prezentujúcich antigén (APC) na aktiváciu a následnú diferenciáciu efektorovej funkcie. Po prvé je tu antigén-špecifický signál vznikajúci pri interakciách medzi TCR na T-lymfocytoch a molekulách MHC prezentujúcich peptidy na APC. Po druhé je tu signál na antigéne nezávislý, ktorý je sprostredkovaný interakciou CD28 s členmi rodiny B7 (B7-1 (CD80) alebo B7-2 (CDB6)). Na začiatku bolo nejasné, kam presne do prostredia imunitnej reaktivity CTLA-4 patria. Myší CTLA-4 bol prvý raz identifikovaný a klonovaný autormi Brunet et al. (Náture, 328, 267 - 270, 1987) ako súčasť hľadania molekúl, ktoré sú prednostne exprimované na cytotoxických T-lymfocytoch. Ľudský CTLA-4 bol identifikovaný a klonovaný, krátko na to autormi Dariavach et al. (Eur. J. Immunol., 18, 1901 - 1905, 1988). Molekuly CTLA-4 myšieho a ľudského pôvodu majú približne 76 % celkovú sekvenčnú homológiu a blížia sa k úplnej identite sekvencií svojich cytoplazmatických domén (Dariavach et al., Eur. J. Immunol., 18, 1901 - 1905, 1988). CTLA-4 je člen imunoglobulínovej (Ig) veľkej rodi2 ny (superfamily) proteínov. Rodina Ig je skupina proteínov, ktorá má kľúčové štruktúrne charakteristické vlastnosti buď variabilných (V), alebo konštantných (C) domén Ig molekúl. Členy Ig rodiny bez obmedzenia zahrnujú samotné imunoglobulíny, molekuly hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) (t. j. MHC triedy I a II) a molekuly TCR.

V roku 1991, Linsley et al. (J. Exp. Med., 174, 561 - 569, 1991) navrhovali, že CTLA-4 je druhý receptor na B7. Podobne Harper et al. (J. Immunol., 147, 1037 - 44, 1991) dokázali, že molekuly CTLA-4 a CD28 sú blízko príbuzné myšiam a človeku, čo sa týka sekvencie, expresie RNA, génovej štruktúry a lokalizácie chromozómu (pozri tiež Balzano et al., Int. J. Cancer Suppl., 7, 28 - 32, 1992). Ďalší dôkaz tejto úlohy bol získaný funkčnými štúdiami. Napríklad Lenschow et al. (Science, 257, 789 - 792, 1992) dokázal, že CTLA-4-Ig indukoval dlhodobé prežívanie štepov pankreatických ostrovčekov. Freeman et al. (Science, 262, 907 až 909, 1993) skúmal úlohu CTLA-4 na myšiach s deficitom B7. Skúmanie ligandu CTLA-4 je opísané v práci Lenschow et al. (P. N. A. S, 90, 11054 - 11058, 1993). Linsley et al. (Science, 257, 792 - 795, 1992) opisuje imunosupresiu in vivo prostredníctvom rozpustnej formy CTLA-4. Linsley et al. (J. Exp. Med. 176, 1595 - 604, 1992) pripravili protilátky, ktoré viažu CTLA-4 a ktoré nereagujú skrížené s CD28, a uzavreli, že CTLA-4 je exprimovaný spoločne (koexprimovaný) s CD28 na aktivovaných T-lymfocytoch a kooperatívne reguluje adhéziu T-lymfocytov a aktiváciu prostredníctvom B7. Kuchroo et al. (Celí, 80, 707 - 18, 1995) dokázali, že kostimulačné molekuly B7-1 a B7-2 odlišne aktivovali vývojové metabolické dráhy Thl/Th2. Yiqun et al. (Int. Immunol. 8, 37 - 44, 1996) dokázali, že existujú odlišné požiadavky na kostimulačné signály od členov rodiny B7 pomocou pokojných versus novoaktivovaných pamäťových T-lymfocytov na rozpustné pripomínajúce antigény (pozri tiež de Boer et al., Eur. J. Immunol., 23, 3120 - 5, 1993).

Niekoľko skupín vedcov navrhovalo alternatívne alebo rozdielne interakcie receptor/ligand na CTLA-4 v porovnaní s CD28 a dokonca premýšľali o treťom B-7 komplexe, ktorý bol rozpoznávaný prostredníctvom protilátky BB1 (pozri napríklad Hathcock et al., Science, 262, 905 - 7, 1993, Freeman et al., Science, 262, 907 - 9, 1993, Freeman et al. , J. Exp. Med., 178, 2185 - 92, 1993, Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90, 11054 - 8, 1993, Razi-Wolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90, 11182 - 6, 1993 a Boussiotis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90, 11059 - 63). Ale Freeman et al. (J. Immunol., 161, 2708 - 15, 1998) diskutovali zistenie, že protilátka BB1 viaže molekulu, ktorá je totožná s bunkovou povrchovou formou CD74, a teda BB1 mAB viaže proteín odlišný, ako je B7-1, a tento epitop sa tiež vyskytuje na proteíne B7-1. Toto zistenie teda vyžadovalo priestor na opätovné uváženie štúdií s použitím BB1 mAB v analýze expresie a funkcie CD80.

Začiatkom roku 1993 s kulmináciou v roku 1995 začali vedci ďalej spresňovať úlohu CTLA-4 v stimulácii T-lymfocytov. Najskôr s použitím monoklonálnych protilátok proti CTLA-4 Walunas et al. (Immunity, 1, 405 - 13, 1994) poskytli dôkaz, že CTLA-4 môže pôsobiť ako negatívny regulátor aktivácie T-lymfocytov. Potom Waterhouse et al. (Science, 270, 985 - 988, 1995) dokázali, že myši s deficitom CTLA-4 akumulovali T-lymfoblasty s aktivovanými aktivačnými markermi vo svojich lymfatických uzlinách a slezine. Blasty tiež infiltrovali pečeň, srdce, pľúca a pankreatické tkanivo a množstvo sérových imunoglobulínov bolo zvýšené a T-lymfocyty proliferovalí silno a spontánne, keď boli stimulované prostredníctvom T-bunkového receptora, ale boli senzitívne na bunkovú smrť indukované obsadením (zosieťovaním, cross-linking) receptorov Fas a žiarením gama. Waterhouse et al. uzavreli, že CTLA-4 pôsobí ako negatívny regulátor aktivácie T-lymfocytov a je životne dôležitý na kontrolu homeostázy lymfocytov. V komentári v rovnakom vydaní Allison a Krummmel (Science, 270, 932 - 933, 1995) diskutovali prácu Waterhouse et al. ako prácu, ktorá dokázala, že CTLA-4 pôsobí tak, že tlmí reaktivitu T-lymfocytov alebo má inhibičnú signálnu úlohu v aktivácii a vývoji T-lymfocytov. Tivol et al. (Immunity, 3, 541 - 7, 1995) tiež vytvorili myši s deficitom CTLA-4 a dokázali, že sa na týchto myšiach rýchlo vyvíjajú lymfoproliferatívne choroby s multiorgánovou lymfocytárnou infiltráciou a tkanivovou deštrukciou, s obzvlášť závažnou myokarditídou a pankreatitídou. Uzavreli, že CTLA-4 má kľúčovú úlohu v tlmení aktivácie T-lymfocytov a udržiavaní imunologickej homeostázy. Krummmel a Allison (J. Exp. Med., 182, 459 - 65, 1995) ďalej objasnili, že CD28 a CTLA-4 majú opačné účinky na reakciu T-lymfocytov na stimuláciu. Vytvorili protilátku proti CTLA-4 a skúmali účinky jej väzby na CTLA-4 v systéme používajúcom vysoko purifikované T-lymfocyty. Vo svojom článku ukázali, že prítomnosť nízkych hladín B7-2 na čerstvo explantované T-lymfocyty môže čiastočne inhibovať proliferáciu T-lymfocytov a táto inhibícia bola sprostredkovaná interakciami s CTLA-4. Skrížená väzba CTLA-4 spolu s TCR a CD28 silno inhibuje proliferáciu a sekréciu IL-2 T-lymfocytu. Konečné výsledky ukázali, že CD28 a CTLA-4 odovzdávajú opačné signály, ktoré, ako sa zdá, sú zjednotené T-lymfocyty pri určovaní reakcie na antigén. Autori teda uzavreli, že výsledok stimulácie receptora T-lymfocytu antigénom je regulovaný CD28 kostimulačnými signálmi, ako aj inhibičnými signálmi pochádzajúcimi od CTLA-4 (pozri tiež Krummel et al., Int. Immunol., 8, 519 - 23, 1996 a patent Spojených štátov č. 5 811 097 a medzinárodná patentová prihláška WO 97/20574).

Uskutočnil sa celý rad ďalších pokusov na ďalšie objasnenie uvedenej funkcie CTLA-4. Napríklad Walunas et al. (J. Exp. Med., 183, 2541 - 50, 1996) prostredníctvom použitia protilátok anti-CTLA-4 navrhovali, že signálna dráha CTLA-4 nereguluje prežívanie buniek alebo reaktivitu na IL-2, ale inhibuje produkciu IL-2 závislú na CD28. Tiež Perrin et al. (J. Immunol., 157, 1333 - 6, 1996) dokázali, že protilátky anti-CTLA-4 použité pri experimentálnej alergickej encefalomyelitíde (EAE) exacerbovali ochorenie a zvýšili úmrtnosť. Excerbácia ochorenia bola spojená so zvýšenou produkciou encefalitogénnych cytokínov TNF alfa, IFN-gama a IL-2. Títo autori teda uzavreli, že CTLA-4 reguluje intenzitu autoimunitnej reakcie pri EAE, oslabuje produkciu zápalových cytokínov a klinickú manifestáciu ochorenia (pozri tiež Hurwitz et al., J. Neuroimmunol., 73, 57 - 62, 1997 a Cepero et al., J. Exp. Med., 188, 199 - 204 , 1998) (anti-CTLA-4 vlásenkový ribozóm, ktorý špecificky ruší expresiu CTLA-4 po prenose génu do myšieho modelu T-lymfocytov).

Okrem toho Blair et al. (J. Immunol., 160, 12 - 5, 1998) vyhodnotili pôsobenie panelu CTLA-4 monoklonálnych protilátok (mAb) na pokojné ľudské CD4+ T-lymfocyty. Ich výsledky dokázali, že niektoré CTLA-4 mAb inhibovali proliferáciu pokojných buniek CD4+ a prechodné štádium bunkového cyklu od G0 do Gl. Inhibičný vplyv CTLA-4 bol zjavný behom 4 hodín v čase, keď expresia bunkového povrchového CTLA-4 nebola detekovateľná. Ale ďalšie CTLA-4 mAb nemali zistený inhibičný účinok, čo indikovalo, že väzba mAb na samotný CTLA-4 nebola postačujúca na sprostredkovanie útlmu reakcie T-lymfocytov. Je zaujímavé, že zatiaľ čo produkcia IL-2 bola zastavená, inhibičné anti-CTLA-4 mAb umožnili indukciu a expresiu génu prežívania buniek bcl-X(L). V zhode s týmto pozorovaním zostávali bunky životaschopné a po ligácii CTLA-4 nebola zistená apoptóza.

V spojitosti s anergiou Perez et al. (Immunity, 6, 411 - 7, 1997) dokázali, že indukcii anergie T-lymfocytov bolo zabránené blokovaním CTLA-4 a uzavreli, že výsledok rozpoznávania antigénu T-lymfocytmi je určovaný interakciou CD28 alebo CTLA-4 na T-lymfocytoch s molekulami B7. Tiež Van Parijs et al. (J. Exp. Med., 186, 1119 - 28, 1997) skúmali úlohu interleukínu 12 a ko stimulátorov pri anergii T-lymfocytov in vivo a objavili, že prostredníctvom inhibície zapojenia CTLA-4 v priebehu indukcie anergie bola blokovaná proliferácia T-lymfocytov a nebola podnecovaná plná diferenciácia Thl. Ale T-lymfocyty vystavené antigénu vyvolávajúcemu toleranciu v prítomnosti ako IL-12, tak protilátky anti-CTLA-4 neboli anergizované a správali sa identicky ako T-lymfocyty, ktoré stretli imunogénny antigén. Tieto výsledky svedčia v prospech toho, že k indukcii anergie in vivo prispievajú dva procesy: zapojenie CTLA-4, ktoré vedie k blokovaniu schopnosti T-lymfocytov proliferovať, a absencii prototypového zápalového cytokínu, IL-12, ktorý zabraňuje diferenciácii T-lymfocytov na Thl efektorové bunky. Kombinácia IL-12 a anti-CTLA-4 protilátky bola postačujúca na konverziu normálne tolerovaného stimulu na imunogénny podnet.

V spojitosti s infekciami dokázali McCoy et al., (J. Exp. Med., 186, 183 - 7, 1997), že anti-CTLA-4 protilátky značne zosilnili a urýchlili imunitné reakcie T-lymfocytov na Nippostrongylus brasiliensis, čo malo za následok výdatnú redukciu počtu dospelých červov a včasné ukončenie produkcie vajíčok parazitom (pozri tiež Murphy et al. , J. Immunol., 161, 4153 -4160, 1998) (Leishmania donovani).

V spojitosti s rakovinou zaviedli Kwon et al. (PNAS USA, 94, 8099 - 103, 1997) syngénny myší model karcinómu prostaty a skúmali dve odlišné manipulácie, o ktorých sa predpokladalo, že vyvolajú reakciu proti karcinómu prostaty prostredníctvom zvýšenej kostimulácie T-lymfocytov: i) zabezpečenie priamej kostimulácie prostatickými rakovinovými bunkami transdukovanými tak, že exprimovali ligand B7-1 a ii) in vivo blokovanie CTLA-4 T-lymfocytu sprostredkované protilátkou, čo zabraňovalo útlmu T-lymfocytov. Bolo dokázané, že in vivo blokáda CTLA-4 sprostredkovaná protilátkou zvýšila imunitnú reakciu proti karcinómu prostaty. Tiež Yang et al. (Cancer Res., 57, 4036 - 41, 1997) študovali, či blokovanie funkcie CTLA-4 vedie k zosilneniu nádorového rastu. Na základe in vitro a in vivo výsledkov zistili, že blokovanie CTLA-4 u jedincov s nádorom zvýšilo kapacitu vytvárať protinádorovú odpoveď T-lymfocytov, ale expresia tohto zosilňujúceho účinku modelu bola obmedzená na včasné štádia rastu nádoru. Ďalej Hurwitz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, 10067 - 71, 1998) zistili, že vyvolanie protinádorovej reakcie sprostredkované T-lymfocytmi závisí na zapojení receptora T-lymfocytov hlavným histokompatibilným komplexom/antigénom, ako aj ligáciou CD28 prostredníctvom B7. Určité nádory, ako napríklad karcinóm prsníka SMI, boli refraktérne na imunoterapiu anti-CTLA-4. A tak vďaka použitiu kombinácie blokovania CTLA-4 a vakcíny obsahujúcej faktor stimulujúci granulocytové a makrofágové kolónie exprimované bunkami SMI bola pozorovaná regresia parentálnych SMI nádorov, napriek neúčinnosti jednotlivej liečby použitej samotne. Táto kombinačná liečba mala za následok dlhotrvajúcu imunitu na SMI a závisela ako na CD4(+), tak na CD8(+) T-lymfocytoch. Zistenie nasvedčuje tomu, že blokovanie CTLA-4 pôsobí na úrovni bunky prezentujúcej antigén pochádzajúci od hostiteľa.

V spojitosti s diabetom Luhder at al. (J. Exp. Med., 187, 427 - 32, 1998) injikovali anti-CTLA-4 mAb do TCR transgénneho myšieho modelu diabetu v rôznych štádiách ochorenia. Zistili, že zapojenie CTLA-4 v čase, keď sú prvýkrát aktivované potenciálne diabetogénne T-lymfocyty, je kľúčový jav, ak je zapojenie tolerované, nastáva invázia ostrovčekov, ale ostáva po celé mesiace celkom neškodná. Ak zapojenie nie je tolerované, inzulitída je oveľa agresívnejšia a rýchlo vzniká diabetes.

V spojitosti s imunizáciou prostredníctvom vakcíny zistili Horspool et al. (J. Immunol., 160, 2706 - 14, 1998), že intaktná anti-CTLA-4 mAb, ale nie fragmenty Fab, tlmili primárnu humorálnu odpoveď na pCIA/beta gal bez ovplyvnenia pripomínajúcej reakcie, čo naznačuje, že aktivácia CTLA-4 inhibovala produkciu Ab, ale nie inštruovanie (priming) T-lymfocytov. Blokovanie ligandov na CD28 a CTLA-4, CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2), odhalilo rozdielnu a neprekrývajúcu sa funkciu. Blokovanie CD80 na iniciálnu imunizáciu kompletne zrušilo primárnu a sekundárnu Ab reakciu, zatiaľ čo blokovanie CD86 tlmila odpoveď primárna, ale nie sekundárna. Súčasné blokovanie CD80 + CD86 bolo menej účinné v tlmení Ab reakcií ako blokovanie každého z nich samotného. Zosilnenie kostimulácie prostredníctvom spoločnej injekcie plazmidov exprimujúcich B7 zvýšilo CTL reakcie, ale nie Ab odpoveď a bez dôkazu asymetrie Thl na Th2. Tieto zistenia svedčia o zložitých a rozdielnych úlohách CD28, CTLA-4, CD80 a CD86 na kostimuláciu T-lymfocytov po vakcinácii nukleovou kyselinou.

V spojitosti s rejekciou štepu zistili Markees et al. (J. Clin. Invest., 101, 2446 - 55, 1998) v myšom modeli rejekcie kožného aloštepu prijatie spočiatku záviselo na prítomnosti IFN-gama, CTLA-4 a CD4(+) T-lymfocytov. Pridanie anti-CTLA-4 alebo anti-IFN-gama mAb do laboratórneho protokolu bolo spojené s okamžitou rejekciou štepu, zatiaľ čo anti-IL-4 mAb nemala žiadny účinok.

V spojitosti s úlohou CTLA-4 vo vzťahu na CD28 Fallarino et al. (J. Exp. Med., 188, 205 - 10, 1998) vytvorili transgénne myši TCR/s deficitom génu 2 aktivujúceho rekombinázu/s CD28 divým typom alebo s deficitom CD28, ktoré boli imunizované nádorom exprimujúcim antigén. Inštruované T-lymfocyty od oboch typov myší produkovali cytokíny a proliferovali pri reakcii na stimulujúce bunky bez expresie B7. Ale zatiaľ čo odpoveď CD28+/+ T-lymfocytov zosilnená kostimuláciou s B7-1, odpoveď CD28-/- T-lymfocytov bola silno inhibovaná. Táto inhibícia bola zrušená monoklonálnou protilátkou proti B7-1 alebo CTLA-4. Teda CTLA-4 môžu účinne inhibovať aktiváciu T-lymfocytov v neprítomnosti CD28, čo indikuje, že antagonizmus signálu sprostredkovaného TCR je postačujúci na vysvetlenie inhibičného účinku CTLA-4. Tiež Lin et al. (J. Exp. Med., 188, 199 - 204, 1988) študovali rejekciu srdcových aloštepov u myší s deficitom CD28. H-2(q) srdca bola transplantovaná do myší s alogénnym divým typom alebo s deficitom CD28 (H-2(b)). Rejekcia štepu bola oddialená pri myšiach s deficitom CD28 v porovnaní s myším divým typom. Ošetrenie príjemcov s divým typom s CTLA-4 imunoglobulínom (Ig) alebo s anti-B7-l plus anti-B7-2 mAb významne predĺžilo prežívanie aloštepu. Na rozdiel od toho, ošetrenie myší s deficitom CD28 s CTLA-4-Ig, anti-B7-l plus anti-B7-2 mAb alebo blokujúcim anti-CTLA-4 mAb indukovalo akcelaráciu rejekcie aloštepu. Táto zvýšená rýchlosť rejekcie štepu bola spojená so závažnejšou infiltráciou mononukleárnymi bunkami a zvýšenými hladinami transkriptu IFN-gama a IL-6 v srdciach darcov neošetreného divého typu a myším deficitom CD28 ošetrených s CTLA-4-Ig- alebo anti-CTLA-4 mAb. Teda negatívna regulačná úloha CTLA-4 sa šíri za jeho potenciálnej schopnosti zabrániť aktivácii CD28 prostredníctvom kompetície o ligand. Dokonca aj v neprítomnosti CD28 má inhibičný účinok v regulácii rejekcie aloštepu.

Bola tiež študovaná ďalšia charakterizácia expresie CTLA-4. Napríklad Alegre et al. (J. Immunol., 157, 4762 - 70, 1996) navrhli, že povrchový CTLA-4 je rýchlo internalizovaný, čo môže vysvetliť nízke hladiny expresie všeobecne zisťované na povrchu buniek. Uzavreli, že ako CD28, tak IL-2 majú dôležité úlohy v aktivácii expresie CTLA-4. Okrem toho sa zdá, že akumulácia CTLA-4 na bunkovom povrchu je primárne regulovaná jeho rýchlou endocytózou. Tiež Castan et al. (Immunology, 90, 265 - 71, 1997) na základe in situ imunohistologických analýz expresie CTLA-4 naznačili, že germinálne centrá T-lymfocytov, ktoré boli CTLA-4 pozitívne, môžu byť dôležité na imunitnú reguláciu.

Podľa toho vo svetle širokej a ústrednej úlohy, ktorú, ako sa zdá, CTLA-4 má v imunitnej reaktivite, by bolo žiaduce vytvoriť protilátky na CTLA-4, ktoré môžu byť účinne používané v imunoterapii. Navyše by bolo žiaduce vytvoriť protilátky proti CTLA-4, ktoré môžu byť používané pri chronických ochoreniach, pri ktorých sa vyžaduje opakované podávanie protilátok.

Zoznam citovanej literatúry

Všetky publikácie citované v prihláške vynálezu vrátane patentov, patentových prihlášok, vedeckých článkov, príručiek a pod., a tiež publikácie v nich citované, sú zahrnuté v plnom rozsahu formou odkazu. Okrem toho sú plne zahrnuté aj nasledujúce publikácie vrátane publikácií v nich citovaných.

Alegre et al. J. Immunol 157: 4762 - 70 (1996)

Allison and Krummel Science 270: 932 - 933 (1995)

Baizano et al. Int J Cancer Suppl 7: 28 - 32 (1992)

Blair et al. J Immunol 160: 12-5 (1998)

Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3: 510 - 513 (1992)

Boussiotis et al. Proc Natl Acad Sci USA 90: 11059 - 63 (1993)

Bowie et al. Science 253: 164 (1991)

Bruggeman et al. PNAS USA 86: 6709 - 6713 (1989)

Bruggeman, M. and Neuberger, M. S. in Methods'. A companion to Methods in Enzymology 2: 159 - 165 (Lemer et al. eds. Academic Press (1991))

Braggemann et al., Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus. Eur. J. Immunol. 21: 1323 - 1326 (1991)

Braggemann, M. and Neuberger, M. S, Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice. Immunology Today 17: 391 - 397 (1996)

Brunet et al. Náture 328: 267 - 270 (1987)

Bumpers et al J. Surgical Res. 61: 282 - 288 (1996)

Capscy et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))

Castan et al. Immunology 90: 265 - 71 (1997)

Cepero ct al. J Exp Med 188: 199 - 204 (1998)

Chen et al. Immunoglobulín gene rearrangement in B-celí deficient mice generated by targeted deletion of the J_H locus, International Immunology 5: 647 - 656 (1993)

Chen et al. Celí 71: 1093 - 1102 (1992)

Chen et al. Human Gene Therapy 5: 595 - 601 (1994)

Chiswell and McCafferty TIBTECH 10: 80 - 84 (1992)

Choi et al. Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome, Náture Genetics 4: 117 - 123 (1993)

Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987)

Chothia et al. Náture 342: 878 - 883 (1989)

Chuang et al. J. Immunol. 159: 144 - 151(1997)

Coligan et al., Unit 2.1, Enzyme-linked immunosorbent assays, in Current protocols in immunology (1994) Cwirla et al. PNAS USA 87: 6378 - 6382 (1990)

Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18: 1901 - 1905 (1988)

Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101 - 110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10 de Boer et al. Eur J Immunol 23: 3120-5 (1993)

Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)).

Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)

Fallarino et al .JExp Med 188: 205 - 10 (1998)

Fanger et al. Immunol Methods 4: 72 - 81 (1994)

Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)

Fishwild et al., High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice, Náture Biotech. 14: 845 - 851 (1996)

Freeman et al. J Exp Med 178: 2185 - 92 (1993)

Freeman et al. J Immunol 161: 2708 - 15 (1998)

Freeman et al. Science 262: 907 - 9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., e.„ 2nd cd. Raven Press, N. Y. (1989))

Galfre, G. and Milstein, C., Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)

Gorman et al. P. N. A. S. 79: 6777 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483 - 495 (1998)

Green et al. Náture Genetics 7: 13-21 (1994)

Grosschedl et al. Celí 41: 885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS USA 94: 4937 - 4942 (1997)

Harding et al. Náture 356: 607 - 609 (1994)

Harper et al. J Immunol 147: 1037 -44 (1991)

Hathcock et al. Science 262: 905 - 7 (1993)

Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130: 43 - 68 (1992)

Horspool et al. J Immunol 160: 2706 - 14 (1998)

Houghten et al. Biotechniques 13: 412 - 421 (1992)

Houghten PNAS USA 82: 5131 -5135 (1985)

Hurwitz et al. JNeuroimmunol 73: 57 - 62 (1997)

Huwitz et al. Proc Natl Acad Set U S A 95: 10067 - 71 (1998)

Immunology - A Synthesis (2^nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))

Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))

Jakobovits et al., Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome, Náture 362: 255-258 (1993)

Jakobovits, A. et al., Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavychain joining región blocks B-cell development and antibody production, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 -2555 (1993)

Jakobovits, A., Humanizing the mouse genome, Current Biology 4: 761 - 763 (1994)

Jakobovits, A., Production of fully human antibodies by transgenic mice, Current Opinion in Biotechnology 6: 561 -566 (1995)

Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655 - 686 (2d edition, Chafher and Longo, eds., Lippineott Raven (1996))

Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H. publication no. 91 - 3242 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))

Kostelny et al. J. Immunol. 148: 1547 - 1553 (1992)

Krummel and Allison J Exp Med 182: 459 - 65 (1995)

Krummel et al. Int Immunol 8: 519 - 23 (1996)

Kuchroo ct al. Celí 80: 707 - 18 (1995)

Kwon et al. PNAS USA 94: 8099 - 103 (1997)

LaPlanche et al. Nucl Acids Res. 14: 9081 (1986)

Lenschow et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:11054 - 8 (1993)

Lenschow et al. Science 257: 789 - 792 (1992)

Lin et al. J Exp Med 188: 199 - 204 (1998)

Linsley et al. J Exp Med 176: 1595 - 604 (1992)

Linsley et al. J. Exp. Med. 174: 561 - 569 (1991)

Linsley et al. Science 257: 792 - 795 (1992)

Liu et al. J. Immunol. 39: 3521 (1987)

Liu et al, P. N. A. S. 84: 3439 (1987)

Lonberg et al, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Náture 368: 856 - 859 (1994).

Luhder et al. J Exp Med 187: 427 - 32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4: 11 - 15 (1997)

Markees et al. J Clin Invest 101: 2446 - 55 (1998)

Marks et al., Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and of family-specific oligonucleotide probes Eur. J. Immunol. 21: 985 - 991 (1991)

McCoy et al. JExp Med 186: 183 - 7 (1997)

Mendez et al. Náture Genetics 15: 146 - 156 (1997)

Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)

Okayama et al. Mol. Celí. Bio, 3: 280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73: 305 - 318 (1988)

Pearson and Lipman Prov. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85: 2444 (1988)

Perez et al. Immunity 6: 411 - 7 (1997)

Perrin et al. Immunol Res 14: 189-99 (1995)

Perrin et al. J Immunol 157: 1333 -6 (1996)

Pinalla et al. Biotechniques 13: 901 -905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))

Razi-Wolf et al. Proc Natl Acad Sci U 5 A 90: 11182-6 (1993)

Remington’s Pharmaceutical Sciences (15^th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularly

Chapter 87 by Blaug, Seymour

Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem, 61: 387 (1992)

Russel et al. Nucl. Acids Research 21: 1081 - 1085 (1993)

Schwartz Celí 71: 1065 (1992)

Scott TIBS 17: 241 -245 (1992)

Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)

Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315 - 321 (1990)

Steč et al. J. Am. Chem, Soc. 106: 6077 (1984)

Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988)

Taylor et al., A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Research 20: 6287 - 6295 (1992)

Taylor et al, Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM, International Immunology 6: 579 - 591 (1994)

The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)) Thornton et at. Náture 354: 105 (1991)

Tivol et al. Immunity 3: 541 - 7 (1995)

Townsend and Allison Science 259: 368 (1993)

Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51 - 52 (1992)

Tuaillon et al. Analysis of direct and inverted DJ_H rearrangements in a human lg heavy chain transgenic minilocus, J. Immunol. 154: 6453 -6465 (1995)

Tuaillon et al., Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: genesegment use in μ and γ transcripts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720 - 3724 (1993)

Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990)

Van Parijs et al. J Exp Med 186: 1119-28 (1997)

Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993)

Walunas et al. Immunity 1: 405 - 13 (1994)

Walunas et al. J Exp Med 183: 2541 - 50 (1996)

Waterhouse et al. Science 270: 985 - 988 (1995)

Winter and Harris Immunol Today 14: 43 - 46 (1993)

Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125 - 168 (1992)

Yang et al. Cancer Res 57: 4036 - 41 (1997)

Yi-qun et al. Int Immunol 8: 37-44 (1996)

Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991)

Zon et al. Oligonucleotides and Analogues; A Practical Approach, pp. 87 - 108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Fry et al. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor, Proc Natl Acad Sci USA 95: 12022 - 7 (1998)

Hoffman et al. A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homo logy domain, J Mol Biol 282: 195 - 208 (1998)

Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p38-a čase study, Acta Biochim Pol 44: 557 - 64 (1997)

Jouko et al. Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure, Biochem J 322: 927 - 35 (1997)

Singh et al. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases, J Med Chem 40: 1130-5 (1997)

Mandel et al. ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling, Nat Biotechnol 14: 323 -8 (1996)

Monfardini et al. Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists, Proc Assoc Am Physicians 108: 420-31 (1996)

Furet et al. Modelling study of protein kinase inhibitors: binding móde of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411, J Comput Aided Mol Des 9: 465 - 72 (1995)

111 et al. Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions, Protein Eng 10: 949 - 57 (1997)

Martin et al. The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6, EMBO J 13: 5303-9(1994)

Prihlášky vynálezu USA:

U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No, U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No, U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No. U. S. Patent Application Seriál No.

07/466,008, filed January 12,1990 07/574,748, filed August 29, 1990 07/575,962, filed August 31, 1990 07/610,515, filed November 8, 1990 07/810,279, filed December 17, 1991 07/853,408, filed March 18, 1992 07/904,068, filed June 23, 1992 07/919,297, filed July 24,1992 07/922,649, filed July 30, 1992 07/990,860, filed December 16, 1992 08/031,801, filed March 15,1993 08/053,131, filed April 26, 1993 08/096,762, filed July 22, 1993 08/112,848, filed August 27, 1993 08/155,301, filed November 18, 1993 08/161,739, filed December 3, 1993 08/165,699, filed December 10, 1993 08/209,741, filed March 9, 1994 08/234,145, filed April 28, 1994 08/724,752, filed October 2, 1996 08/730,639, filed October 11, 1996 08/759,620, filed December 3, 1996

U. S. Patent Application Seriál No. 08/759,620, filed December 3, 1996

Patenty USA:

U. S. Patent No. 4,399,216

U. S. Patent No. 4,681,581

U. S. Patent No. 4,683,195

U. S. Patent No. 4,683,202

U. S. Patent No. 4,735,210

U. S. Patent No. 4,740,461

U. S. Patent No. 4,816,397

U. S. Patent No. 4,912,040

U. S. Patent No. 4,959,455

U. S. Patent No. 5,101,827

U. S. Patent No. 5,102,990 (RE 35,500)

U. S. Patent No. 5,151,510

U. S. Patent No, 5,194,594

U. S. Patent No. 5,434,131

U. S. Patent No, 5,530,101

U. S. Patent No. 5,545,806

U. S. Patent No. 5,545,807

U. S. Patent No. 5,585,089

U. S. Patent No. 5,591,669

U. S. Patent No. 5,612,205

U. S. Patent No. 5,625,126

U. S. Patent No. 5,625,825

U. S. Patent No. 5,633,425

U. S. Patent No. 5,643,763

U. S. Patent No. 5,648,471

U. S. Patent No. 5,661,016

U. S. Patent No. 5,693,761

U. S. Patent No. 5,693,792

U. S. Patent No. 5,697,902

U. S. Patent No. 5,703,057

U. S. Patent No. 5,714,350

U. S. Patent No. 5,721,367

U. S. Patent No. 5,733,743

U. S. Patent No. 5,770,197

U. S. Patent No. 5,770,429

U. S. Patent No. 5,773,253

U. S. Patent No. 5,777,085

U. S. Patent No. 5,789,215

U. S. Patent No. 5,789,650

U. S. Patent No. 5,811,097

Európske patenty:

European Patent No. EP 0 546 073 BI

European Patent No. EP 0 463 151 BI, grant published June 12, 1996

Medzinárodné prihlášky PCT: International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No International Patent Application No

WO 92/02190

WO 92/03918

WO 92/22645

WO 92/22647

WO 92/22670

WO 93/00431

WO 93/12227

WO 94/00569

WO 94/02602, published February 3, 1994 WO 94/25585 WO 94/29444

International Patent Application No. WO 95/01994

International Patent Application No. WO 95/03408

International Patent Application No. WO 95/24217

International Patent Application No. WO 95/33770

International Patent Application No. WO 96/14436

International Patent Application No. WO 96/34096, published October 31, 1996

International Patent Application No. WO 97/13852

International Patent Application No. WO 97/20574

International Patent Application No. WO 97/38137

International Patent Application No. WO 98/24884

International Patent Application No. WO 98/24893, published June 11, 1998

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález v prvom aspekte poskytuje protilátku schopnú viazať CTLA-4, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu variabilného úseku ťažkého reťazca obsahujúcu súvislú sekvenciu aminokyselín od sekvencie FR1 po sekvenciu FK3, ktorá je kódovaná génom ľudskej rodiny V_H3-3 3 a obsahuje aspoň jednu z aminokyselinových substitúcií v sekvencií CDR1, CDR2 alebo v sekvencií kostry, ako je ukázané na obrázku 2. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu aminokyselinová sekvencia obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvenciu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 a SEQ ID NO: 70. V inom výhodnom uskutočnení protilátka ďalej obsahuje sekvenciu variabilného úseku ľahkého reťazca, ktorá obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvenciu SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 71.

Predkladaný vynález v druhom aspekte poskytuje protilátku, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca obsahujúcu sekvenciu SEQ ID NO: 1 a aminokyselinovú sekvenciu variabilného úseku ľahkého reťazca obsahujúcu sekvenciu SEQ ID NO: 14.

Tretí aspekt predkladaného vynálezu poskytuje protilátku, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 15.

Štvrtý aspekt predkladaného vynálezu poskytuje protilátku, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca obsahujúcu sekvenciu SEQ ID NO: 4 a variabilnú aminokyselinovú sekvenciu ľahkého reťazca obsahujúcu sekvenciu SEQ ID NO: 17.

Piaty aspekt predkladaného vynálezu poskytuje izolovanú ľudskú monoklonálnu protilátku, ktorá je schopná viazať sa na CTLA-4. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka schopná kompetovať o väzbu s CTLA-4 s protilátkou vybranou zo skupiny obsahujúcej protilátky 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. V inom výhodnom vyhotovení majú protilátky v podstate podobnú väzobnú špecificitu na CTLA-4 ako protilátky vybrané zo skupiny obsahujúcej protilátky

3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.

V ešte ďalšom výhodnom vyhotovení vynálezu sú protilátky vybrané zo skupiny obsahujúcej protilátky 3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2, 4.13.1,4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. V ešte ďalšom vyhotovení predkladaného vynálezu nie je protilátka krížovo reaktívna s CTLA-4 nižších cicavcov, kde výhodne k nižším cicavcom patria druhy, ako je myš, potkan/krysa a králik, najvýhodnejšie myš a potkan/krysa.

V inom výhodnom vyhotovení je protilátka krížovo reaktívna s CTLA-4 primátov, hlavne sú výhodné primáty rodu makak (Macaca) ako M. fascicularis (cynomológna m.) a M. mullata (m. Rhesus). V ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka vykazuje selektivitu na CTLA-4 v porovnaní s CD28, B7-2, CD44 a hlgGl vyššiu ako 100 : 1 a výhodne 500 : 1 alebo vyššiu. V ďalšom výhodnom vyhotovení je väzobná afinita protilátky 10⁹ M alebo vyššia a výhodne 10¹⁰ M alebo vyššia. V inom výhodnom vyhotovení protilátka inhibuje väzbu medzi CTLA-4 B7-2 s IC₅₀ menším ako 100 nM a výhodne menším ako 0,38 nM. V ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka inhibuje väzbu medzi CTLA-4 B7-1 s IC₅₀ menším ako 100 nM a výhodne menším ako 0,50 nM.

V inom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IL-2 v teste T-buniek blast/Raji o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 3846 pg/ml alebo viac. V inom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IFN-γ v teste T-buniek blast/Raji o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 1233 pg/ml alebo viac. V ešte ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IL-2 v superantigénovom teste hPBMT alebo celej krvi o 500 pg/ml alebo viac. V inom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IFN-γ v teste T-buniek blast/Raji o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 1233 pg/ml alebo viac. V ešte ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IL-2 v superantigénovom teste hPBMT alebo celej krvi o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 1500 pg/ml a viac alebo o 30 % viac, výhodne o 50 % viac v porovnaní s kontrolou.

Predkladaný vynález v šiestom aspekte poskytuje humanizovanú protilátku, ktorá má v podstate podobnú väzobnú špecificitu na CTLA-4 ako protilátky vybrané zo skupiny obsahujúcej protilátky 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,

4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. Vo výhodnom vyhotovení nie je protilátka krížovo reaktívna s CTLA-4 nižších cicavcov, kde výhodne k nižším cicavcom patria druhy, ako je myš, potkan/krysa a králik, najvýhodnejšie myš a potkan/krysa. V inom výhodnom vyhotovení je protilátka krížovo reaktívna s CTLA-4 primátov, ako je hlavne výhodný cynomologický makak (Macaca fascicularis) a makak rhesus (Macaca mullata). V ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka vykazuje selektivitu na CTLA-4 v porovnaní s CD28, B7-2, CD44 a hlgGl vyššiu ako 100 : 1 a výhodne 500 : 1 alebo vyššiu. V ďalšom výhodnom vyhotovení je väzobná afinita protilátky 10⁹ M alebo vyššia a výhodne 10¹⁰ M alebo vyššia. V inom výhodnom vyhotovení protilátka inhibuje väzbu medzi CTLA-4 B7-2 s IC50 menším ako 100 nM a výhodne menším ako 0,38 nM. V ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka inhibuje väzbu medzi CTLA-4 B7-1 s IC₅₀ menším ako 100 nM a výhodne menším ako 0,50 nM. V inom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IL-2 v teste s T-blastami/bunkami Raji o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 3846 pg/ml alebo viac. V inom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IFN-γ v teste T-blast/Raji o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 1233 pg/ml alebo viac. V ešte ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IL-2 v superantigénovom teste hPBMT alebo celej krvi o 500 pg/ml alebo viac. V inom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu IFN-γ v teste T-buniek blast/Raji o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 1233 pg/ml alebo viac. V ešte ďalšom výhodnom vyhotovení protilátka zvyšuje produkciu 11-2 v superantigénovom teste hPBMT alebo celej krvi o 500 pg/ml alebo viac a výhodne o 1500 pg/ml a viac, alebo o 30 % viac výhodne o 50 % viac v porovnaní s kontrolou.

Predkladaný vynález v siedmom aspekte poskytuje protilátku, ktorá sa viaže na CTLA-4 a ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca obsahujúceho ľudské sekvencie FR1, FR2 a FR3 kódované génom ľudskej rodiny V_H3-33, ktorý je operatívne spojený vo štvrtom rámci so sekvenciou CDR1, CDR2 a CDR3, pričom sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3 sú nezávisle vybrané zo sekvencií CDR1, CDR2 a CDR3 uvedených na obrázku 2. Vo výhodnom vyhotovení protilátka podľa vynálezu ďalej obsahuje akékoľvek somatické mutácie v sekvenciách FR1, FR2 a FR3, ako je ilustrované na obrázku 2.

Predkladaný vynález vo ôsmom aspekte poskytuje protilátku viažucu sa na CTLA-4, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca obsahujúcu ľudské sekvencie FR1, FR2 a FR3 kódované génom ľudskej rodiny V_H3-33, ktorý je operatívne spojený vo štvrtom rámci so sekvenciou CDR1, CDR2 a CDR3, pričom sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3 protilátka má nasledujúce výhodné vlastnosti: väzobnú afinitu na CTLA-4 10⁹ M alebo vyššiu, inhibuje väzbu medzi CTLA-4 a B7-1 s IC50 100 nM alebo nižší, inhibuje väzbu medzi CTLA-4 a B7-2 s IC50 100 nM alebo nižší a zvyšuje produkciu cytokínu v teste ľudských T-lymfocytov o 500 pg/ml alebo viac.

Predkladaný vynález v deviatom aspekte poskytuje protilátku viažucu sa na CTLA-4, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca obsahujúcu ľudské sekvencie FR1, FR2 a FR3 operatívne spojené v čítacom rámci so sekvenciou CDR1, CDR2 a CDR3, nezávisle vybranou zo sekvencií CDR1, CDR2 a CDR3 uvedených na obrázku 2 a 3, pričom protilátka má nasledujúce výhodné vlastnosti: väzobnú afinitu na CTLA-4 10⁹ M alebo vyššiu, inhibuje väzbu medzi CTLA-4 a B7-1 s IC₅₀ 1 00 nM alebo nižší, inhibuje väzbu medzi CTLA-4 a B7-2 s IC₅₀ 100 nM alebo nižší a zvyšuje produkciu cytokínu v teste ľudských T-lymfocytov o 500 pg/ml alebo viac.

Predkladaný vynález v desiatom aspekte poskytuje systém bunkovej kultúry na testovanie stimulácie T-lymfocytov, obsahujúcich kultúru ľudských T-lymfoblastov ko kultivovaných (spoločne kultivovaných) s bunkami línie Raji. Vo výhodnom vyhotovení T-lymfoblasty sú pred kokultiváciou opláchnuté s bunkovou líniou Raji.

Predkladaný vynález v jedenástom aspekte poskytuje spôsob testovania na meranie stimulácie T-lymfocytov, ktorý spočíva v tom, že sa poskytne kultúra ľudských T-lymfoblastov a buniek Raji, táto kultúra sa privedie do kontaktu s testovaným činidlom a meria sa produkcia cytokínov v tejto kultúre.

Predkladaný vynález v dvanástom aspekte poskytuje funkčný test na skríning stimulačných funkčných skupín T-lymfocytov, ktorý spočíva v tom, že sa poskytne kultúra ľudských T-lymfoblastov a buniek Raji, táto kultúra sa privedie do kontaktu s testovanou funkčnou skupinou a vyhodnotí sa produkcia cytokínov v tejto kultúre.

Predkladaný vynález v trinástom aspekte poskytuje test stimulácie T-lymfocytov na CTLA-4 inhibičné funkcie, ktorý spočíva v tom, že sa kultúra ľudských T-lymfoblastov a buniek Raji privedie do kontaktu s testovaným činidlom a vyhodnotí sa produkcia cytokínov v tejto kultúre.

Predkladaný vynález v štrnástom aspekte poskytuje spôsob testovania (skríning) na stimulačnú aktivitu T-lymfocytov, ktorý spočíva v tom, že sa činidlo privedie do kontaktu s kultúrou ľudských T-lymfoblastov a buniek Raji a vyhodnotí sa produkcia cytokínov v tejto kultúre.

V desiatom až štrnástom aspekte vynálezu sa výhodne T-lymfoblasty pred kultiváciou s bunkami Raji opláchnu. V inom výhodnom vyhotovení vynálezu cytokíny sú IL-2 alebo IFN-γ. Vo výhodnom vyhotovení vynálezu sa produkcia cytokínov meria v supernatante izolovanom z kultúry. Vo výhodnom vyhotovení je činidlo protilátka a výhodne sa viaže na CTLA-4.

Predkladaný vynález v pätnástom aspekte poskytuje test na meranie stimulácie T-lymfocytov, ktorý spočíva v tom, že sa poskytne populácia ľudských mononukleárnych buniek periférnej krvi alebo celej krvi stimulovaných stafylokokovým enterotoxínom A, kultúra sa privedie do kontaktu s činidlom a meria sa produkcia cytokínu bunkovou populáciou.

Predkladaný vynález v šestnástom aspekte poskytuje funkčný test na skríning skupín so stimulačnou funkciou na T-lymfocyty, ktorý spočíva v tom, že sa poskytne populácii ľudských monoklonálnych buniek periférnej krvi alebo celej krvi stimulovaných stafylokokovým enterotoxínom A, kultúra sa privedie do kontaktu s funkčnou skupinou a meria sa produkcia cytokínu bunkovou populáciou.

Predkladaný vynález v sedemnástom aspekte poskytuje stimulačný test T-lymfocytov na inhibičnú funkciu CTLA-4, ktorý spočíva v tom, že sa populácia ľudských mononukleárnych buniek periférnej krvi alebo celej krvi stimulovaných stafylokokovým enterotoxínom A privedie do kontaktu s činidlom a vyhodnotí sa produkcia cytokínov bunkovou populáciou.

Predkladaný vynález v osemnástom aspekte poskytuje spôsob skríningu činidiel na stimulačnú aktivitu na T-lymfocyty, ktorý spočíva v tom, že sa populácia ľudských mononukleárnych buniek periférnej krvi alebo celej krvi stimulovaných stafylokokovým enterotoxínom A privedie do kontaktu s činidlom a vyhodnotí sa produkcia cytokínov bunkovou populáciou.

Vo výhodnom vyhotovení šestnásteho až osemnásteho aspektu predkladaného vynálezu je cytokín IL-2. V inom výhodnom vyhotovení je produkcia cytokínu meraná v supernatante izolovanom z kultúry. Vo výhodnom vyhotovení je činidlo protilátka a výhodne viažuca sa protilátka na CTLA-4.

Podrobný opis vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje úplne ľudskú monoklonálnu protilátku proti ľudskému CTLA-4. Vynález hlavne poskytuje tiež nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinové sekvencie obsahujúce ťažký a ľahký reťazec imunoglobulínových molekúl, hlavne sekvencie zodpovedajúce súvislým sekvenciám ťažkého a ľahkého reťazca z FRI a CDRl a CDR3 a FR4. Ďalej vynález poskytuje protilátky majúce podobné väzobné vlastnosti ako protilátky a protilátky (alebo iné antagonisty) majúce podobné funkcie ako protilátky opísané vo vynáleze. Tiež poskytuje hybridómy exprimujúce tieto imunoglobulínové molekuly a tiež monoklonálne protilátky.

Definície

Pokiaľ nie je definované inak, vedecké a technické termíny sú v predkladanej prihláške používané v tom zmysle, ako sú odborníkovi všeobecne zrozumiteľné. Pokiaľ zo súvislostí nevyplýva opak, termíny použité v jednotnom čísle zahrnujú aj množné číslo a termíny použité v množnom čísle zahrnujú aj jednotné číslo. Všeobecne je názvoslovie a metódy použité v tejto prihláške v súvislosti s bunkovými a tkanivovými kultúrami, molekulárnou biológiou, biochémiou proteínov, oligonukleotidov a polynukleotidov a hybridizačnými technikami všeobecne známe a odborníkovi zrozumiteľné. Na rekombinantnú DNA, syntézu oligonukleotidov, tkanivové kultúry a transformáciu boli použité štandardné postupy odborníkovi známe (ako je napr. elektroforéza, lipofekcia atď.). Enzýmové reakcie a purifikačné metódy sa robili podľa návodu výrobcu alebo všeobecne známymi postupmi, alebo ako je opísané. Všetky zmienené metódy sa uskutočnili odborníkovi známym spôsobom, ako boli opísané vo všeobecných príručkách, ako je napr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, alebo v špecifických publikáciách, ktoré sú ďalej v texte citované, a tieto citácie sú formou odkazu zahrnuté do prihlášky. Názvoslovie použité v prihláške v súvislosti s laboratórnymi postupmi z odboru analytickej chémie, organickej syntetickej chémie a lekárskej farmaceutickej chémie sú všeobecne používané a odborníkovi známe. Na chemické syntézy, chemické analýzy, prípravu a formuláciu farmaceutických prípravkov a podávanie prípravkov pacientom a liečenie boli použité štandardné postupy odborníkom známe.

Nasledujúce termíny používané v prihláške majú, pokiaľ nie je špecificky uvedené inak, nasledujúci význam:

Termín izolovaný polynukleotid znamená podľa vynálezu polynukleotid genómovej DNA, cDNA alebo syntetického pôvodu alebo ich akúkoľvek kombináciu, ktorý je izolovaný tým, že 1) nie je spojený ani s celým ani s časťou polynukleotidu, v ktorom sa izolovaný polynukleotid nachádza v prírode, 2) je operatívne spojený s polynukleotidom alebo 3) v prírode sa nevyskytuje ako súčasť dlhšej sekvencie.

Termín izolovaný protein znamená podľa vynálezu protein vzniknutý na základe cDNA, rekombinantnej RNA alebo syntetickým spôsobom, alebo akoukoľvek ich kombináciou, ktorý je izolovaný vzhľadom na pôvod alebo vznikol tým, že 1) nie je spojený s proteínmi tak, ako sa nachádza v prírode, 2) neobsahuje ďalšie proteíny z rovnakého zdroja, napr. neobsahuje žiadne ďalšie proteíny z myší, a 3) je exprimovaný bunkami iného biologického druhu alebo 4) nevyskytuje sa v prírode.

Termín „polypeptid sa používa v opise vynálezu ako generický termín a označuje natívny protein, frag12 menty alebo analógy polypeptidovej sekvencie. Teda natívny proteín, fragmenty alebo analógy sú druhy polypeptidového rodu. Výhodné polypeptidy podľa predkladaného vynálezu sú napr. molekuly ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu a molekuly ľahkého reťazca kapa ľudského imunoglobulínu uvedené na obr. 1 a tiež molekuly protilátok vytvorené ich kombináciou, obsahujúce molekuly ťažkého reťazca s molekulami ľahkého reťazca, napr. ľahkého reťazca kapa ľudského imunoglobulínu, a naopak a tiež ich fragmenty a analógy.

Termín prirodzene sa vyskytujúci alebo vyskytujúci sa v prírode sa v opise vynálezu týka skutočnosti, že príslušný predmet možno nájsť v prírode. Tak napr. polypeptid alebo polynukleotidová sekvencia, ktoré sú prítomné v organizme (vrátene vírusov) a ktoré z takéhoto prírodného zdroja môžu byť izolované a neboli pritom zámerne človekom modifikované, či už v laboratóriu alebo inak, sú prirodzene sa vyskytujúce.

Termín operatívne spojený v opise vynálezu označuje to, že zložky sú v takej pozícii, ktorá im umožňuje zamýšľanú funkciu. Kontrolná sekvencia operatívne spojená s kódujúcou sekvenciou je ligovaná s kódujúcou sekvenciou takým spôsobom, aby bola dosiahnutá expresia kódujúcej sekvencie za podmienok vhodných na funkciu kontrolnej sekvencie.

Termín kontrolná sekvencia označuje v opise vynález polynukleotidovú sekvenciu, ktorá je nutná na expresiu a všeobecnú činnosť kódujúcej sekvencie, na ktorú je ligovaná (pripojená). Kontrolné sekvencie sú rôznej povahy v závislosti na hostiteľskom organizme: u prokaryotických organizmov obsahuje kontrolná sekvencia všeobecne promótor, ribozomálne väzobné miesto a terminačnú sekvenciu transkripcie, u eukaryotických organizmov obsahuje kontrolnú sekvenciu všeobecne promótor a terminačnú sekvenciu transkripcie. Termín kontrolná sekvencia zahrnuje ako minimum všetky zložky, ktorých prítomnosť je nevyhnutná na expresiu a spracovanie DNA, pritom môže obsahovať ešte ďalšie zložky, ktorých prítomnosť je výhodná, napr. vedúcu sekvenciu (leader) alebo partnerskú fúznu sekvenciu.

Termín polynukleotid podľa predkladaného vynálezu znamená polymérnu formu nukleotidu dĺžky najmenej 10 báz a to buď ribonukleotidov, alebo deoxyribonukleotidov alebo modifikované formy oboch týchto typov nukleotidov. Termín pritom zahrnuje ako jednoreťazcové tak dvojreťazcové, formy DNA.

Termín oligonukleotid podľa vynálezu označuje prirodzene sa vyskytujúce a modifikované nukleotidy naviazané oligonukleotidovými väzbami prirodzene sa vyskytujúcimi alebo inými než prirodzene sa vyskytujúcimi. Oligonukleotidy sú všeobecne podmnožinou polynukleotidu a obsahujú približne 200 báz alebo menej. Výhodné oligonukleotidy obsahujú 10 až 60 báz a najvýhodnejšie 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 alebo 20 až 40 báz. Oligonukletidy sú obvykle jednoreťazcové, napr. oligonukleotidové sondy, hoci môžu byť aj dvojreťazcové, napr. na konštrukciu mutovaných génov. Oligonukleotidy podľa vynálezu sú buď sense, alebo antisense oligonukleotidy. Termín prirodzene sa vyskytujúce oligonukleotidy označuje ako ribonukleotidy, tak aj deoxyribonukleotidy. Termín modifikované oligonukleotidy označuje v opise vynálezu nukleotidy s modifikovanými alebo substituovanými cukrovými skupinami a podobne. Termín oligonukleotidové väzby označuje oligonukleotidové väzby, ako je väzba fosforotioátová, fosforoditioátová, fosforoselenoátová, fosfordiselenoátová, fosforoanilotoátová, fosforoaniladátová, fosforoamidátová a ďalšie. Pozri napr. publikácie LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Steč et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87 - 108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Steč et al. U. S. Patent č. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), ktoré sú zahrnuté formou odkazu. Všetky oligonukleotidy môžu byť na detekciu označené, pokiaľ je to potrebné.

Termín selektívne hybridizovať znamená v opise vynálezu detekovateľne a špecificky sa viazať. Polynukleotidy, oligonukleotidy a ich fragmenty podľa vynálezu selektívne hybridizujú s reťazcami nukleových kyselín za podmienok hybridizácie a premývania, keď je minimalizované množstvo detekovateľnej väzby nešpecifických nukleových kyselín. Podmienky s vysokou stringenciou sa používajú na dosiahnutie selektívnej hybridizácie, čo je odborníkom známe a bude tu ešte diskutované. Všeobecne homológia sekvencii nukleových kyselín medzi polynukleotidmi, oligonukleotidmi a fragmentmi sekvencii nukleových kyselín podľa vynálezu a požadovanými nukleovými kyselinami je najmenej 80 % a viac, výhodne s rastúcou homológiou aspoň 85 %, 90 %, 95 % a 100 %. Dve aminokyselinové sekvencie sú homologické, pokiaľ je tu čiastočná alebo úplná identita medzi ich sekvenciami. Tak napr. 85 % homológie znamená, že 85 % aminokyselín je identických, keď sú dve sekvencie priradené (alignment) s dosiahnutím maximálnej zhody (matching). Medzery (v jednej z dvoch priradených sekvencii) sú povolené, aby bola dosiahnutá maximálna zhoda, výhodné sú medzery veľkosti 5 alebo kratšie, najvýhodnejšie sú medzery veľkosti dve alebo kratšie. Alternatívne a výhodne dve proteínové sekvencie (alebo dve polypeptidové sekvencie z nich odvodené dlhé aspoň 30 aminokyselín) sú homologické v zmysle používaného termínu, pokiaľ majú skóre zhody priradenia vyššie ako 5 (v jednotkách štandardnej odchýlky) pri použití programu ALIGN s mutačnou maticou údajov a sankciou za medzeru 6 alebo viac. Pozri Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein: Sequence and Structure, str. 101 - 110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)), a Supplement 2 na tento diel, str. 1 - 10. Dve sekvencie alebo ich časti sú výhodne homologické, keď ich aminokyseliny sú z 50 % a viac identické pri do13 siahnutí optimálnej zhody priradenia v programe ALIGN. Termín zodpovedá, sa v opise vynálezu používa vo význame, že polynukleotidová sekvencia je homo logická (t. j. identická, v žiadnom prípade nie evolučné príbuzná) s celou alebo časťou referenčnej polynukleotidovej sekvencie, alebo že polypeptidová sekvencia je identická s referenčnou polypeptidovou sekvenciou. Naproti tomu termín komplementárny znamená, že komplementárna sekvencia je homologická na časť alebo celú polynukleotidovú sekvenciu, s ktorou sa porovnáva. Tak na ilustráciu nukleotidová sekvencia TATAC zodpovedá referenčnej sekvencií TATAC a je komplementárna na referenčnú sekvenciu GTATA.

Nasledujúce termíny sa používajú na opis vzťahov medzi dvoma alebo viacerými polynukleotidovými alebo aminokyselinovými sekvenciami: referenčná sekvencia, porovnávacie okno, sekvenčná identita, percento sekvenčnej identity a podstatná identita. Referenčná sekvencia je definovaná ako sekvencia použitá ako základ na porovnávanie sekvencií, referenčná sekvencia môže byť podmnožina väčšej sekvencie, napr. segment cDNA úplnej dĺžky alebo génové sekvencie uvedené v zozname sekvencií, alebo môže obsahovať celú cDNA alebo génovú sekvenciu. Všeobecne je referenčná sekvencia dlhá aspoň 18 nukleotidov alebo 6 aminokyselín, často 24 nukleotidov alebo 8 aminokyselín a častejšie aspoň 48 nukleotidov alebo 16 aminokyselín. Keďže v prípade dvoch polynukleotidov alebo aminokyselinových sekvencií každý/á z nich 1) môže obsahovať sekvenciu (t. j. časť úplnej polynukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencie), ktorá je pre obe molekuly podobná a 2) ďalej môže obsahovať sekvenciu, ktorá je pre obe molekuly odlišná, porovnanie dvoch alebo viac sekvencií sa robí obvykle pomocou tzv. porovnávacieho okna na identifikáciu a porovnávanie lokálnych úsekov sekvenčnej identity/podobnosti. Termín porovnávacie okno označuje myslený segment aspoň 18 súvisle po sebe nasledujúcich nukleotidových pozícií alebo 6 aminokyselín, kde polynukleotidová sekvencia alebo aminokyselinová sekvencia môže byť porovnaná s referenčnou sekvenciou aspoň 18 súvisle po sebe idúcich nukleotidov alebo sekvencií 6 aminokyselín, pričom úsek polynukleotidovej sekvencie v porovnávacom okne môže obsahovať adície, delécie, substitúcie a pod. (t. j. medzery) o 20 % alebo menej v porovnaní s referenčnou sekvenciou (ktorá neobsahuje adície alebo delécie) na dosiahnutie optimálnej zhody priradením dvoch sekvencií. Optimálne priradenie sekvencií pri porovnávaní porovnávacích okien môže byť sprevádzané algoritmom lokálnej homológie podľa Smith a Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), algoritmom homologického priradenia podľa Needleman a Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), metódou vyhľadávania podobnosti podľa Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci (U. S. A.) 85: 2444 (1988), počítačovou implementáciou týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA v programovom balíku Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 od Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) alebo v programovom balíku Geneworks alebo MacVector), alebo prehliadaním a najlepšie priradenie (ktoré vedie k najvyššiemu percentu homológie v porovnávacom okne) získané rôznymi metódami sa vyberie.

Termín sekvenčná identita znamená identitu dvoch polynukleotidových alebo aminokyselinových sekvencií (t. j. sú identické na báze nukleotid za nukleotidom alebo zvyšok za zvyškom) v porovnávacom okne. Termín percento sekvenčnej identity označuje hodnotu, ktorá sa vypočíta porovnaním dvoch optimálne priradených sekvencií v porovnávacom okne a určením počtu pozícií, kde sú identické bázy (napr. A, T, d, G, U alebo I) alebo aminokyselinové zvyšky v oboch sekvenciách, čím sa získa počet zhodných pozícií a tento počet zhodných pozícií sa delí celkovým počtom pozícií v porovnávacom okne (t. j. veľkosti okna) a výsledok sa vynásobí 100, čím sa dostane hodnota percenta sekvenčnej identity. Termín podstatná identita v prihláške označuje vlastnosti polynukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencie, keď polynukleotidová alebo aminokyselinová sekvencia obsahuje sekvenciu, ktorá má aspoň 85 % sekvenčnú identitu, výhodne aspoň 90 až 95 % sekvenčnú identitu a najvýhodnejšie a najobvyklejšie aspoň 99 % sekvenčnú identitu pri porovnaní s referenčnou sekvenciou v porovnávacom okne veľkosti aspoň 18 nukleotidov (6 aminokyselín), často veľkosti aspoň 24 až 48 nukleotidov (8 až 16 aminokyselín), keď percento sekvenčnej identity sa vypočítava z porovnania referenčnej sekvencie so sekvenciou, ktorá môže obsahovať delécie alebo adície predstavujúce najviac 20 % celkovej referenčnej sekvencie v porovnávacom okne.

V opise vynálezu sa na označenie 20 esenciálnych aminokyselín používajú konvenčné skratky, pozri publikáciu Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 20 (1991)), ktorá je vložená formou odkazu. Stereoizoméry dvadsiatich konvenčných aminokyselín (napr. D-aminokyseliny), prírodné sa nevyskytujúce aminokyseliny ako napr. α-, α-disubstiované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mliečna a ďalšie neobvyklé aminokyseliny môžu byť tiež vhodné zložky polypetidov podľa predkladaného vynálezu. K príkladom neobvyklých aminokyselín patrí: 4-hydroxyprolín, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Ν-trimetyllyzín, ε-Ν-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetylserín, N-formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, σ-Ν-metylarginín a ďalšie podobné aminokyseliny (napr. 4-hydroxyprolín). Pri označovaní polypeptidu v opise vynálezu je vľavo aminokoncová časť a vpravo karboxykoncová časť polypeptidu v súlade s konvenciou odborníkovi známou.

Obdobne pokiaľ nie je špecifikované inak, ľavý koniec jednoreťazcovej polynukleotidovej sekvencie je 5'-koniec, a teda smer vľavo u dvojreťazcovej polynukleotidovej sekvencie je označovaný ako 5'-smer. Smer od 5'-konca do 3'-konca, ktorým vzniká RNA transkript, je označovaný ako smer transkripcie, úseky DNA reťazca majúce rovnakú sekvenciu ako RNA, ležiace 5'-smerom od 5'-konca RNA transkriptu, sú označované ako upstream (t. j. proti smeru transkripcie) sekvencie, úseky DNA reťazca majúce rovnakú sekvenciu ako RNA ležiace 3'-smerom od 3'-konca RNA transkriptu sú označované ako downstream (t. j. v smere transkripcie) sekvencie.

Pri aplikácii na polypeptidy termín podstatná identita znamená, že dve peptidové sekvencie, pokiaľ sú optimálne priradené ako napr. v programe GAP alebo BESTFIt pri použití vopred nastavených hodnôt váhy medzery, majú aspoň 80 % sekvenčnú identitu, výhodne aspoň 90 % sekvenčnú identitu, výhodnejšie 95 % sekvenčnú identitu a najvýhodnejšie aspoň 99 % sekvenčnú identitu. Výhodne aminokyselinové zvyšky v pozíciách, ktoré nie sú identické, sa líšia konzervatívnou substitúciou aminokyseliny. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú vzájomnou zámenou takých aminokyselín, ktoré majú podobné postranné reťazce. Tak napr. skupiny aminokyselín s alifatickým postranným reťazcom obsahuje glycín, alanín, valín, leucín a izoleucín, skupina aminokyselín majúcich alifatický-hydroxylový postranný reťazec obsahuje serín a treonín, skupina aminokyselín s postranným reťazcom obsahujúcim amidovú skupinu obsahuje asparagín a glutamín, skupina aminokyselín majúca aromatické postranné reťazce obsahuje fenylalanín, tyrozín a tryptofán, skupina aminokyselín majúcich bázický postranný reťazec obsahuje lyzín, arginín a histidín a skupina aminokyselín majúcich postranný reťazec obsahujúci síru obsahuje cystein a metionín. Výhodné skupiny aminokyselín na konzervatívnu substitúciu sú: valín-leucín-izoleucín, fenylalanín-tyrozín, lyzín-arginín, alanínvalín, glutamát-aspartát a asparagín-glutamín.

Ako sa už diskutovalo, menšie variácie v aminokyselinovej sekvencii protilátok alebo imunoglobulínových molekúl sú zahrnuté v predkladanom vynáleze za predpokladu, že variácie udržujú aspoň 75 %, výhodnejšie 80 %, 90 % alebo 95 % a najvýhodnejšie 99 % sekvenčnú identitu. Hlavne sem patrí konzervatívna substitúcia aminokyselín. Konzervatívne substitúcie sú také substitúcie, ktoré sa odohrávajú v rámci rodiny aminokyselín, ktoré sú príbuzné svojimi postrannými skupinami. Geneticky kódované aminokyseliny sa všeobecne delia do rodín: (1) kyslé = aspartát, glutamát, (2) bázické = lyzín, arginín, histidín, (3) nepoláme = = alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán a (4) nenabité polárne = glycín, asparagín, glutamín, cystein, serín, treonín, tyrozín. Výhodnejšie rodiny sú: serín a treonín tvoria rodinu alifaticko-hydroxylovú, asparagín a glutamín tvoria rodinu obsahujúcu amidovú skupinu, alanín, valín, leucín a izoleucín tvoria alifatickú rodinu a fenylalanín, tryptofán a tyrozín tvoria aromatickú rodinu. Tak napr. je rozumné očakávať, že izolované nahradenie leucínu izoleucínom alebo valínom, aspartátu glutamátom, treonínu serínom alebo podobné náhrady aminokyselín štruktúrne príbuznými aminokyselinami, nebudú mať závažný vplyv na väzobné a iné vlastnosti výslednej molekuly, hlavne ak sa náhrady nebudú týkať oblasti kostry. Či zámena aminokyseliny viedla k funkčnému peptidu možno okamžite overiť testovaním špecifickej aktivity polypeptidového derivátu. Príslušné testy sú v tejto prihláške podrobne opísané. Fragmenty alebo analógy protilátok alebo imunoglobulínových molekúl môžu byť odborníkom ľahko pripravené. Výhodné aminokonce alebo karboxykonce fragmentov alebo analógov sa vyskytujú v blízkosti hraníc funkčných domén. Štruktúrne a funkčné domény môžu byť identifikované porovnávaním nukleotidovej a/alebo aminokyselinovej sekvencie s údajmi vo verejných alebo súkromných databázach sekvencií. Výhodne sa používajú počítačové metódy na identifikáciu sekvenčných motívov alebo predikciu proteínových konformačných domén, ktoré sa vyskytujú u iných proteínov, ktorých štruktúra a/alebo funkcia je známa. Metódy na identifikáciu proteínových sekvencií, ktoré sa skladajú do známych trojrozmerných štruktúr, sú odborníkom známe (pozri napr. Bowie et al. Science 253: 164 (1991)). Teda predchádzajúce príklady ukazujú, že odborník je schopný rozpoznať motívy a štruktúrne konformácie, ktoré je možno použiť na definovanie štruktúrnych a funkčných domén podľa predkladaného vynálezu.

Výhodné aminokyselinové substitúcie sú také, ktoré: (1) redukujú citlivosť na proteolýzu, (2) redukujú citlivosť na oxidáciu, (3) menia väzobnú afinitu na vytvárajúce sa proteínové komplexy, (4) menia väzobné afinity a (5) poskytujú alebo modifikujú iné fyzikálno-chemické alebo funkčné vlastnosti takýchto analógov. Analógy môžu obsahovať rôzne muteínové sekvencie odlišné od prirodzene sa vyskytujúcej peptidovej sekvencie. Tak napr. jednoduchá alebo viacnásobná aminokyselinová substitúcia (výhodne konzervatívna substitúcia aminokyselín) sa môže uskutočniť v prirodzene sa vyskytujúcej sekvencii (výhodne v časti polypeptidu mimo domény/domén tvoriacich intramolekulové spojenie). Konzervatívna aminokyselinová substitúcia by mala podstatne zmeniť štruktúrne charakteristiky pôvodnej (parentálnej) sekvencie (napr. náhrada aminokyseliny by nemala narušiť šroubovnicovú štruktúru parentálnej molekuly alebo narušiť iné typy sekundárnych štruktúr charakteristických pre parentálnu sekvenciu). Príklady v odbore známych sekundárnych a terciálnych štruktúr polypeptidov boli opísané napr. v publikáciách Proteins, Structures and Molecular Principels (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)), Introduction to Proteín Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)), a Thorton et al. Náture 354: 105 (1991), ktoré sú vložené formou odkazu.

Termín polypeptidový fragment označuje v predkladanej prihláške polypeptíd s deléciou aminokonca a/alebo karboxykonca, pričom zostávajúca aminokyselinová sekvencia je identická so zodpovedajúcimi pozíciami prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie, dedukovanej napr. na základe cDNA úplnej dĺžky. Fragmenty sú typicky dlhé aspoň 5, 6, 8 alebo 10 aminokyselín, výhodne aspoň 14 aminokyselín a najvýhodnejšie aspoň 20 aminokyselín, obvykle však aspoň 50 aminokyselín a ešte výhodnejšie aspoň 70 aminokyselín.

Termín analóg v opise vynálezu znamená polypeptid, ktorý obsahuje segment aspoň 25 aminokyselín, ktorý má podstatnú identitu s úsekom dedukovanej aminokyselinovej sekvencie, ktorá má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností: (1) špecificky sa viaže na CTLA-4 za vhodných väzobných podmienok, (2) má schopnosť blokovať väzbu CTLA-4 s jeho receptorom alebo (3) má schopnosť inhibovať rast buniek exprimujúcich CTLA-4 in vitro alebo in vivo. Typicky polypeptidové analógy obsahujú konzervatívne aminokyselinové substitúcie (alebo adície alebo delécie) vzhľadom na prirodzene sa vyskytujúcu sekvenciu. Analógy sú typicky dlhé aspoň 20 aminokyselín, výhodne aspoň 50 aminokyselín alebo dlhšie a úplnej dĺžky.

Peptidové analógy sú všeobecne vo farmaceutickom priemysle používané ako nepeptidové liečivá s vlastnosťami analogickými s pôvodným (templátovým) peptidom. Tieto typy nepeptidových zlúčenín sa nazývajú peptidová mimetiká alebo tiež peptidomimetiká (pozri Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)). Takéto zlúčeniny sú obvykle vyvíjané pomocou počítačového modelovania molekúl. Peptidomimetiká štruktúrne podobná terapeuticky užitočným peptidom sa môže použiť na dosiahnutie ekvivalentného terapeutického alebo profylaktického účinku. Všeobecne sú peptidomimetiká štruktúrne podobné paradigmatickému peptidu (t. j. polypeptidu, ktorý má požadované biochemické vlastnosti alebo farmakologickú aktivitu), často sú dlhé rovnako ako prirodzene sa vyskytujúci polypeptid, ako sú napr. protilátky, ale má jednu alebo viac peptidových väzieb nahradených väzbou vybranou zo skupiny obsahujúcej: —CH₂NH—, —CH₂S—, —CH₂-CH₂—, —CH=CH— (cis a trans), —COCH₂—, —CH(OH)CH₂— a —CH₂SO—, a síce metódami, ktoré sú odborníkom známe. Systematická substitúcia jednej aminokyseliny alebo viac aminokyselín kanonickou sekvenciou D-aminokyselín rovnakého typu (t. j. napr. D-lyzín namiesto L-lyzínu) sa môže využiť na prípravu stabilnejších peptidov. Okrem toho neprirodzené peptidy obsahujú kanonickú sekvenciu alebo v podstate identickú variáciu, môžu byť pripravené metódami, ktoré sú odborníkom známe (pozri napr. Rizo a Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)), napr. pridaním vnútorných cysteínových zvyškov schopných tvoriť intramolekuláme disulfidické mostíky, ktoré cyklizujú peptid.

Termíny protilátka alebo protilátkový peptid sa týkajú intaktnej protilátky alebo jej väzobného fragmentu, ktorý kompetuje s intaktnou protilátkou o špecifickú väzbu. Väzobné fragmenty sa pripravujú technikami rekombinantnej DNA alebo enzýmovým alebo chemickým štiepením intaktných protilátok. Medzi väzobné fragmenty patria fragmenty Fab, Fab', F(ab')₂, Fv a jednoreťazcové protilátky. Protilátky iné než bišpecifické alebo bifunkčné sú také, ktoré majú všetky svoje väzobné miesta identické. Protilátka podstatne inhibuje adhéziu receptora na protireceptor, keď prístup protilátky znižuje množstvo receptora viazaného na protireceptor aspoň o 20 %, 40 %, 60 % alebo 80 %, obvykle aspoň o viac ako 85 % (merané kompetitívnym väzobným testom in vitro).

Termín epitop označuje akýkoľvek proteínový determinant schopný špecificky sa viazať na imunoglobulín alebo receptor T-bunky. Epitopové determinaty sú obvykle tvorené chemicky aktívnym povrchovým zoskupením molekúl, ako sú aminokyseliny alebo cukrové postranné reťazce, a obvykle majú špecifické trojrozmerné štruktúrne vlastnosti a tiež také špecifické vlastnosti, pokiaľ ide o náboj. Protilátka sa špecificky viaže na antigén, keď disociačná konštanta je menšia alebo rovná 1 μΜ, výhodne menšia alebo rovná 100 nM a najvýhodnejšia alebo rovná 10 nM.

Termín činidlo alebo agens označuje v prihláške chemickú zlúčeninu, zmes chemických zlúčenín, biologickú makromolekulu alebo extrakt pripravený z biologických materiálov.

Termín značka a/alebo značený v opise vynálezu znamená inkorporáciu detekovateľného markera, t. j. napr. vložením rádioaktívne značenej aminokyseliny alebo naviazanie biotinylových skupín k polypeptidu, ktoré potom môžu byť detegované značeným avidínom (t. j. straptavidínom obsahujúcim fluorescenčný marker alebo enzymatickú aktivitu, ktoré môžu byť detegované optickými alebo kolorimetrickými metódami). Môžu byť použité rôzne metódy značenia polypeptidov a glykoproteínov, ktoré sú odborníkom známe. K príkladom značiek pre polypeptidy patria, bez toho aby bol výpočet obmedzujúci, nasledujúce: rádioizotopy alebo rádionukleotidy (napr. ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ^nlIn, ¹²⁵I, ¹³¹I), fluorescenčné značky (napr. FITC, rhodamín, lantanidofosfory), enzymatické značky (napr. chrenová peroxidáza, β-galaktozidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemiluminiscenčné značky, biotinylové skupiny, predeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundárnou reportérovou molekulou (napr. párové sekvencie leucínového zipsu, väzobné miesta na sekundárnu protilátku, domény viažuce kov, epitopové značky). V niektorých vyhotoveniach vynálezu sú značky naviazané prostredníctvom oddeľovacieho ramienka (spaceru) rôznej dĺžky, aby sa redukovali potenciálne stérické zábrany.

Termíny farmaceutické činidlo alebo farmaceutický prípravok alebo liečivo sa v opise vynálezu používajú na označenie chemických zlúčenín, ktoré sú schopné vyvolať požadovaný terapeutický účinok, pokiaľ sú správne podávané pacientovi. Ďalšie chemické termíny sú v predkladanej prihláške používané v zmysle, ktorý je obvyklý a odborníkom známy, napr. ako je uvedené v slovníku The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Termín antineoplázické činidlo označuje činidlo, ktoré má také funkčné vlastnosti, že inhibuje vývoj ale16 bo progresiu neoplázií u človeka, hlavne malígnych (rakovinových) lézií, ako je napr. karcinóm, sarkóm, lymfóm alebo leukémia. Častou vlastnosťou antineoplázického činidla je inhibícia metastáz.

V podstate čistý znamená v predkladanej prihláške, že predmetný druh je prevládajúci prítomný druh (t. j. na molárnej úrovni je lepší ako ktorýkoľvek iný druh prítomný v zlúčenine), výhodne v podstate čistá frakcia je prípravok, kde predmetný druh je zastúpený aspoň z 50 % (na molárnom základe) medzi všetkými prítomnými makromolekulami. Všeobecne v podstate čistý prípravok obsahuje viac ako 80 % všetkých druhov makromolekúl prítomných v prípravku, výhodnejšie viac ako 85 %, 90 %, 95 % a 99 %. Najvýhodnejšie je predmetný druh purifikovaný do nevyhnutnej homogenity (konvenčnými metódami nie je možné detegovať kontaminujúce druhy molekúl), pričom prípravok je v podstate tvorený jediným druhom makromolekuly. Štruktúra protilátky

Základná štruktúrna jednotka protilátky je, ako je známe, tvorená tetramérom. Každý tetramér je zložený z dvoch identických dvojíc polypeptidových reťazcov, pričom každý pár obsahuje jeden ľahký (približne 25 kDa) a jeden ťažký (približne 50 až 70 kDa) reťazec. Aminokoncová časť každého reťazca obsahuje variabilný úsek zložený približne zo 100 až 110 alebo aj viac aminokyselín, primárne zodpovedný za rozpoznanie antigénu. Karboxykoncová časť každého reťazca definuje konštantný úsek primárne zodpovedný za efektorové funkcie. Ľudské ľahké reťazce sú klasifikované ako kapa a lambda ľahké reťazce. Ľudské ťažké reťazce sú klasifikované ako mí (μ), delta, gama, alfa a epsilon a definujú izotyp protilátky označovaný ako IgM, IgD, IgG, IgA a IgE, v uvedenom poradí. Vnútri ťažkého a ľahkého reťazca sú variabilný a konštantný úsek spojený úsekom J veľkosti 12 alebo viac aminokyselín, pričom ťažký reťazec obsahuje navyše úsek D veľkosti 10 a viac aminokyselín (na všeobecný prehľad pozri publikácia Fundamental Imunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)), ktorá je celá zahrnutá formou odkazu. Variabilné úseky každej dvojice ťažký/ľahký reťazec vytvárajú väzobné miesto protilátky.

Takže intaktná IgG má dve väzobné miesta. Až na bifunkčné alebo bišpecifické protilátky, tieto väzobné miesta sú zhodné.

Všetky reťazce majú rovnakú všeobecnú štruktúru relatívne konzervatívneho úseku kostry (FR) spojeného tromi hypervariabilnými úsekmi determinujúcimi komplementaritu, skrátene CDR. Úseky CDR z dvoch reťazcov z každého páru sú spojené úsekom kostry, čo umožňuje väzbu na špecifický epitop. V smere od N-konca k C-koncu, ťažký a ľahký reťazec obsahujú domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Priradenie aminokyselín ku každej doméne je v súlade s definíciami podľa Kabata: Sequences od Proteins of Immunological Interest (National Institutes of health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), alebo publikáciami Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 -917 (1987), Chothia et al. Náture 342: 878 - 883 (1989).

Bišpecifická alebo bifunkčná protilátka je umelá hybridná protilátka obsahujúca dva rôzne páry ťažký/ľahký reťazec a dve odlišné väzobné miesta. Bišpecifické protilátky môžu byť pripravené radom metód, napr. fúziou hybridómov alebo spojením fragmentov Fab' (pozri Songsivilai & Lachmenn Clin. Exp. Immunol. 79: 315 - 321 (1990), Kostelny et al. J Immunol. 148: 1547 - 1553 (1992)). Okrem toho bišpecifické protilátky môžu byť tvorené ako tzv. Diabodies (Holliger et al., Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90: 6444 - 6448 (1993)) alebo Janusiny (Traunecker et al. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10: 3655 - 3659 (1991), Trauncker et al. Janusin: new molecular design for biospecific reagents Int J Cancer Suppl 7: 51 - 52 (1992)). Produkcia bišpecifických protilátok je proces relatívne náročný na prácu v porovnaní s produkciou konvenčných protilátok a výťažkami aj stupňom čistoty, ktoré sa dosahujú, sú obvykle nižšie pre biošpecifické protilátky. Bišpecifické protilátky neexistujú vo forme fragmentov majúcich jedno väzobné miesto (ako sú napr. fragmenty Fab, Fab a Fv).

Ľudské protilátky a humanizácia protilátok

Pri použití ľudských protilátok nedochádza k niektorým problémom, ktoré sú spojené s protilátkami, ktoré obsahujú variabilné a/alebo konštantné úseky z protilátok myší alebo potkana. Prítomnosť proteínov pochádzajúcich z myši alebo potkana vedie k tomu, že sa zvyšuje clearancia a protilátka môže vyvolať imunitnú reakciu u pacienta. Aby sa zabránilo používaniu protilátok pochádzajúcich z myši alebo potkana, bolo navrhnuté vyvinúť humanizované protilátky alebo pripraviť úplné ľudské protilátky tým, že sa vnesú funkcie ľudských protilátok do hlodavca, ktorý potom bude produkovať protilátky majúce úplné ľudské sekvencie.

Ľudské protilátky

Schopnosť klonovania a rekonštrukcie ľudských lokusov veľkosti megabáz v YAC (umelých kvasinkových chromozómov a ich vnesenie do myších zárodočných buniek poskytujú veľmi účinné metódy na zistenie funkčných komponentov veľmi veľkých alebo len hrubo zmapovaných lokusov a na vytvorenie užitočných modelov ľudských ochorení. Okrem toho použitie takejto technológie na nahradenie myších lokusov ich ľudskými ekvivalentmi poskytuje jedinečné informácie o expresii a regulácii produktov ľudských génov v priebehu vývoja, ich komunikácii s inými systémami a ich účasť v indukcii a rozvoji ochorenia.

Dôležitou praktickou aplikáciou takejto stratégie je humanizácia myšieho humorálneho imunitného systému. Vnesenie ľudských imunoglobulínových (Ig) lokusov do myši, ktorej endogénne Ig gény boli inaktivované, poskytuje možnosť skúmať mechanizmus programovanej expresie a zostavovania protilátok a tiež ich úlohu vo vývoji B-lymfocytov. Okrem toho táto stratégia poskytuje ideálny zdroj na produkciu monoklonálnych úplne ľudských protilátok ako významný míľnik na ceste k splneniu prísľubu protilátkových terapií ľudských ochorení. Očakáva sa, že úplné ľudské protilátky minimalizujú imunitné a alergické reakcie, ktoré sú vlastné myším protilátkam alebo protilátkam z nich derivatizovaných, a teda zvýšia bezpečnosť a účinnosť podávania protilátok. Podávanie úplne ľudských protilátok bude zásadne výhodné na liečenie chronických a reumatických ochorení, ako sú zápalové a autoimunitné ochorenia a rakovina, kde je treba opakované podávanie protilátok.

Jeden z prístupov na dosiahnutie tohto cieľa je metódami génového inžinierstva upraviť myšie kmene deficitné v tvorbe protilátok pomocou veľkých fragmentov ľudských Ig lokusov s očakávaním, že takto modifikované myši budú tvoriť veľký repertoár ľudských protilátok bez toho, aby tvorili myšie protilátky. Veľké fragmenty ľudské Ig zachovajú veľkú génovú diverzitu a tiež správnu reguláciu tvorby a expresie protilátok. Vzhľadom na využitie mechanizmu myšieho organizmu na diverzifikáciu a selekciu protilátok a neprítomnosti imunologickej tolerancie na ľudské proteíny, reprodukovaný repertoár ľudských protilátok v týchto myších kmeňoch by mal viesť k vysokoafinitným protilátkam proti akémukoľvek požadovanému antigénu, vrátane ľudských antigénov. Použitím technológie hybridómov môžu byť ľahko pripravované a selektované antigénovo špecifické monoklonálne protilátky.

Táto všeobecná stratégia bola prvýkrát demonštrovaná v spojení s vytvorením prvých kmeňov myší XenoMouse™, ako bolo publikované v r. 1994 (pozri Green at al. Náture Genetics 7: 13 - 21 (1994)). Kmene XenoMouse™ boli geneticky manipulované pomocou umelých kvasinkových chromozómov (YAC) obsahujúcich fragmenty veľkosti 245 a 190 kb so zárodočnou konfiguráciou lokusu na ľudský ťažký reťazec a ľudský ľahký reťazec kapa, obsahujúci jadro sekvencie konštantného a variabilného úseku. YAC obsahujúce ľudské Ig sa ukázali ako kompatibilné s myším systémom ako na nové usporiadanie, tak expresiu protilátok, a boli vhodné na substitúciu inaktivovaných myších Ig génov. To bolo dokázané ich schopnosťou indukovať vývoj B-lymfocytov, vytvárať dospelý repertoár úplne ľudských protilátok a vytvárať antigénne špecifické ľudské Mabs protilátky. Tieto výsledky tiež viedli k predpokladu, že vnesenie veľkých častí ľudských Ig lokusov obsahujúcich veľký počet V génov, ďalšie regulačné elementy a ľudské konštantné úseky, by mohlo v podstate opakovať úplný repertoár, ktorý je charakteristický na ľudskú imunitnú humorálnu reakciu na infekciu a imunizáciu. Práca Greena et al. bola nedávno rozšírená o vnesenie viac ako 80 % repertoáru ľudských protilátok prostredníctvom fragmentov YAC veľkosti megabáz obsahujúcich zárodočnú konfiguráciu lokusu na ľudský ťažký reťazec a ľudský ľahký reťazec kapa do myši XenoMouse™ (pozri napr. Mendez et al. Náture Genetics 15: 146 - 156 (1997), Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483 - 495 (1998), patentová prihláška U. S. Seriál No. 08/759, 620, podaná 3. 12. 1996, vložená formou odkazu).

Tento experimentálny prístup bol ďalej diskutovaný a opísaný v patentovej prihláške U. S. 07/466,008, podanej 12. 1. 1990, 07/610,515, podanej 8. 11. 1990, 07/919,297, podanej 24. 7. 1992, 07/922, 649, podanej 30. 7. 1992, 08/031,801, podanej 15. 3. 1993, 08/112,848, podanej 27. 8. 1993, 08/234,145, podanej 28. 4. 1994, 08/376,279, podanej 20. 1. 1995, 08/430,938, podanej 27. 4. 1995, 08/464,584, podanej 5. 6. 1995, 08/464,582, podanej 5. 6. 1995, 08/463,191, podanej 5. 6. 1995, 08/462,837, podanej 5. 6. 1995, 08/486,853, podanej 5. 6. 1995, 08/486,857, podanej 5. 6. 1995, 08/486,859, podanej 5. 6. 1995, 08/462,513, podanej

5. 6. 1995, 08/1724,752, podanej 2. 10. 1996 a 08/759,620, podanej 3. 12. 1996. Pozri tiež publikácie Mendez et al. Náture Genetics 15: 146 - 156 (1997) a Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483 - 495 (1998). Pozri ďalej tiež Európsky patent EP 0 463 151 B 1, udelenie zverejnené 12. 6. 1996, medzinárodnú patentovú prihlášku č. W094/02602, publikovanú 3. 2. 1994, medzinárodnú patentovú prihlášku č. WO 96/34096, publikovanú 31. 10. 1996 a medzinárodnú patentovú prihlášku č. WO 98/24893, publikovanú 11.6. 1998. Vynálezy opísané v citovaných patentoch, prihláškach a publikáciách sú v úplnosti formou odkazu zahrnuté v predkladanej prihláške.

Alternatívny prístup použitý ďalšími, napr. firmou GenPharm International, Inc., využil tzv. minilokusy. Pri tejto metóde je exogénny Ig lokus napodobnený vložením kúska (jednotlivých génov) z Ig lokusu. Takže sa vytvorí konštrukt, obsahujúci jeden V_H gén alebo viac V_H génov, jeden D_H gén alebo viac D_H génov, jeden J_H gén alebo viac J_H génov, konštantný úsek μ a druhý konštantný úsek (výhodne konštantný úsek gama), vhodný na inzerciu do zvieraťa. Takéto metódy boli opísané v patente U. S. č. 5,545,807, Surani et al., a U.

S. č. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650 a 5,814,318, všetky Lonberg a Kay a U. S. č. 5,591,669, Krimpenfort a Berns, U. S: č. 5,612,205 5,721,367 a 5,789,215, Berns et al. a U. S. č. 5,643,763 Choi a Dunn a U. S. patentovej prihlášky GenPharm International č. 07/574,748, podanej 29. 8. 1990, č. 07/575,962, podanej 31. 8. 1990,'č. 07/810,279, podanej 17. 12. 1991, 07/853,408, 18. 3.

1992, č. 07/904,068, podanej 23. 6. 1992, č. 07/990,860, podanej 16. 12. 1992, č. 08/053,131, podanej 26. 4.

1993, č. 08/096,762, podanej 22. 6. 1993, č. 08/155,301, podanej 18. 11. 1993, č. 08/161,739, podanej 3. 12. 1993, č. 08/165,699, podanej 10. 12. 1993, č. 08/209,741, podanej 9. 3. 1994, ktorých úplné opisy sú zahrnu18 té formou odkazu. Pozri tiež Európsky patent č. 0 546 073 B 1, medzinárodnej patentovej prihlášky WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 a WO 98/24884, ktorých úplné opisy sú tiež zahrnuté formou odkazu. Pozri tiež publikácie Taylor et al., 1992, Chen at al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), and Tuaillon et al., (1995) a Fishwild et. al., (1996), ktoré sú tiež plne zahrnuté formou odkazu.

Pôvodcovia Surani et. al., v citovanom vynáleze prihlasovateľa Medical Research Counsel (MRC) pripravili transgénnu myš majúcu Ig lokus metódou minilokusov. Pôvodcovia vynálezu firmy GenPharm International Lonberg a Kay navrhli inaktiváciu endogénneho myšieho Ig lokusu spojenou s podstatnou duplikáciou práce Surani et al.

Výhodou metódy minilokusu je predovšetkým rýchlosť, s akou môžu byť konštrukty obsahujúce úseky Ig lokusov vytvárané a vkladané do zvierat. Ale súčasne nevýhodou metódy minilokusov je to, že vnesením malého počtu V, D a J génov sa vnesie nedostatočná diverzita. A skutočne publikované práce potvrdzujú tieto obavy. Vývoj B-lymfocytov a tvorba protilátok u zvierat pripravených metódou minilokusov sú nedostatočné. Teda výskum, ktorý bol základom predkladaného vynálezu, bol zameraný na vnesenie veľkých úsekov Ig lokusov, aby bola dosiahnutá veľká diverzia a aby bol rekonštituovaný celý imunitný repertoár.

Ľudská anti-myšia protilátková reakcia (HAMA) viedla priemysel na prípravu chimérických alebo iným spôsobom humanizovaných protilátok. Keďže chimérické protilátky majú ľudský konštantný úsek a myší variabilný úsek, očakáva sa, že bude pozorovaná určitá ľudská antichimérická protilátková reakcia (HACA), hlavne pri chronickom alebo mnoho dávkovom použití protilátky.

Je teda potrebné poskytnúť úplne ľudské protilátky proti CTLA-4, aby bolo možné odstrániť obavy a tiež ovplyvniť HAMA alebo HACA reakcie.

Humanizácia protilátok a metódy displeja

Ako sa už diskutovalo v spojitosti s tvorbou ľudských protilátok, je výhodné pripravovať protilátky so zníženou imunogenecitou. Toto je možné do istej miery dosiahnuť metódami humanizácie a displeja použitím vhodných knižníc. Je známe, že myšie protilátky alebo protilátky z iných druhov môžu byť humanizované alebo primatizované metódami, ktoré sú v odbore dobre známe, pozri napr. Winter a Harris Immunol Today 14: 43 - 46 (1993) a Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125 - 168 (1992). Požadované protilátky možno pripraviť metódami rekombinantnej DNA substitúciou domén CH1, CH2, CH3, kĺbovej domény a/alebo domény kostry zodpovedajúcimi ľudským doménam (pozri WO 92/02190 a U. S. patenty č. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 a 5,777,085). Tiež použitie Ig cDNA na konštrukciu chimérických Ig génov je odborníkom známe (pozri napr. Liu et al. P. N. A. S. 84: 3439 (1987) a J. Immunol. 139: 3521 (1987)). mRNA sa izoluje z hybridómov alebo iných buniek produkujúcich protilátku a použije sa na prípravu cDNA. Požadovaná cDNA sa potom amplifikuje napr. polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím špecifických primárov (pozri U. S. patenty č. 4,683,195 a 4,683,202). Alternatívne sa pripraví knižnica a urobí sa jej skríning, čím sa izoluje požadovaná sekvencia. DNA sekvencia kódujúca variabilný úsek protilátky sa potom fúzuje so sekvenciou ľudskej konštantnej sekvencie. Sekvencie ľudských konštantných úsekov je možné nájsť v publikácii Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, N. H. I. publication no. 91 - 3242. Ľudské gény C-úsekov sú okamžite k dispozícii zo známych klonov. Výber izopytov sa riadi požadovanými efektorovými funkciami, ako je napr. fixácia komplementu alebo aktivita v bunkovej cytotoxicite závislej na protilátkach. Výhodné izotypy sú IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Zvlášť výhodné izotypy protilátok podľa predkladaného vynálezu sú IgG2 a IgG4. Môžu byť použité oba typy konštantných úsekov ľudského reťazca kapa aj lambda. Chimérické humanizované protilátky sa potom exprimujú obvyklým spôsobom.

Protilátkové fragmenty, ako napr. Fv, F(ab')₂ a Fab, sa pripravia štiepením intaktných proteínov, napr. proteázami alebo chemicky. Alternatívne sa pripravia skrátené gény. Tak napr. chimérický gén kódujúci časť fragmentu F(ab')₂ by zahŕňal sekvencie DNA kódujúce domému CH1 a kĺbový úsek H reťazca, potom by nasledoval translačný stop-kodón, aby vznikla skrátená molekula.

V jednej metóde sa použijú kanonické sekvencie kódujúce J-úseky ťažkého a ľahkého reťazca na návrh sekvencií oligonukleotidových primérov, ktoré sa použijú na vnesenie vhodných reštrikčných miest do J-úseku na následné spojenie segmentov V-úseku so segmentmi ľudského C-úseku. cDNA C úseku môže byť modifikovaná miestne cielenou mutagenézou, aby sa umiestnili reštrikčné miesta do analogických pozícií v ľudskej sekvencií.

K expresným vektorom patria plazmidy, retrovírusy, kozmidy, YAC, epizómy odvodené z EBV atď. Vhodným vektorom je taký, ktorý kóduje funkčne kompletnú CH alebo CL sekvenciu ľudského imunoglobulínu, s vhodne vloženými reštrikčnými miestami, takže akákoľvek sekvencia VH alebo VL môže byť ľahko vložená a exprimovaná. V takýchto vektoroch dochádza k zostrihu spravidla medzi donorovým zostrihovým miestom vo vloženom J úseku a akceptorovým zostrihovým miestom, ktorému predchádza ľudský C-úsek a tiež v zostrihových úsekoch, ktoré sa vyskytujú v ľudských Ch exónoch. Polyadenylácia a terminácia trans19 kripcie sa uskutočňujú v prirodzených chromozómových miestach smerom downstream do kódujúceho úseku. Výsledná chimérická protilátka sa môže spojiť s akýmkoľvek silným promótorom, vrátane promótorov ako je retrovírusový LTR, napr. skorý promótor SV-40 (Okayama et al. Mol. Celí. Bio. 3: 280 (1983)), LTR vírusu Rousovho sarkómu (Gorman et al. P. N. A. S. 79: 6777 (1982)) a LTR Moloneyho myšieho leukemického vírusu (Grosschedl et al. Celí 41: 885 (1985)), natívne promótory lg a pod.

Okrem toho ľudské protilátky alebo protilátky z iných biologických druhov môžu byť pripravené metódami typu displej, napr. displeja na ľágu, retrovíruse, ribozóme a pod., čo sú metódy odborníkovi známe a výsledné molekuly sa podrobia dodatočnej maturácii (zrení), ako je napr. afmitná maturácia, ktorá je v odbore známa (pozri napr. Wright a Harris, pozri, Hanes a Plucthau PNAS USA 94: 4937 - 4942 (1997) (ribozomálny displej), Parmley a Smith Gene 73: 305 - 318 (1988) ťágový displej, Scott TIBS 17: 241 - 245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87: 6378 -6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21: 1081 - 1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130: 43 - 68 (1992), Chiswell a McCaľľerty TIBTECH 10: 80 - 84 (1992) a U. S. Patent č. 5,733,743.

Pokiaľ sa uvedené metódy displeja použijú na produkciu protilátok, ktoré nie sú ľudské, takéto protilátky sa potom môžu humanizovať, ako bolo už opísané.

Použitím týchto postupov možno pripraviť protilátky na bunky produkujúce CTLA-4, samotnému CTLA-4, formám CTLA-4 epitopov alebo peptidov a ich expresným knižniciam (pozri napr. U.S. Patent č. 5,703,057), ktoré sa potom môžu podrobiť skríningu na aktivity, ktoré už boli opísané.

Ďalšie kritériá na protilátkové liečivá

Všeobecne povedané, nie je žiaduce usmrtiť bunky exprimujúce CTLA-4. Skôr je potrebné jednoducho inhibovať väzbu CTLA-4 s ligandami, aby sa zmiernila inaktivácia T-lymfocytov. Jeden z hlavých mechanizmov, ktorým protilátky usmrcujú bunky, je fixácia komplementu a účasť na CDC. Konštantný úsek protilátky hrá dôležitú úlohu v schopnosti protilátky fixovať komplement a podieľať sa na CDC. Takže všeobecne sa vyberie izotyp protilátky, ktorý buď umožňuje fixáciu komplementu, alebo nie. V predkladanom vynáleze nie je výhodné, ako už bolo zmienené, použiť takéto protilátky, ktoré vedú k usmrteniu buniek. Existujú početné izotypy protilátok, ktoré sú schopné fixovať komplement a CDC, patria k nim napr. nasledujúce protilátky: myší IgM, myší IgG2a, myší IgG2b, myší IgG3, ľudský IgM, ľudský IgGl a ľudský IgG3. Nepatria sem však napr. izotypy ľudský IgG2 a IgG4.

Protilátky, ktoré sa pripravia, nemusia mať na začiatku zvláštny požadovaný izotyp, ale môžu to byť protilátky v podstate akéhokoľvek izotypu, a potom je izotyp prepnutý použitím metód, ktoré sú odborníkovi známe. K takýmto metódam patria napr. metódy priamej rekombinácie (pozri napr. U. S, Patent č. 4 816 397), metódy bunkovej ťúzie (pozri napr. U. S. patentová prihláška 08/730,639 podanie 11. 10. 1996).

Pri metóde bunkových ľúzií sa pripraví myelómová bunková línia alebo iná línia, ktorá obsahuje ťažký reťazec požadovaného izotypu a ďalšia myelómová bunková línia alebo iná línia, ktorá obsahuje ľahký reťazec. Tieto bunky sú potom ťúzované a výsledná bunková línia exprimujúca intaktnú protilátku je izolovaná.

Ako príklad uvádzame, väčšina CTLA-4 protilátok diskutovaných v predloženej prihláške sú ľudské antiCTLA-4 IgG2 protilátky. Keďže tieto protilátky majú požadovanú väzbu na molekulu CTLA-4, akákoľvek z nich môže byť ľahko izotypovo prepnutá a vytvoriť napr. ľudský izotyp IgG4, pričom si uchová rovnaký variabilný úsek (ktorý definuje protilátkovú špecificitu a tiež z časti afinitu).

Teda sa pripravia kandidátne protilátky, ktoré spĺňajú štruktúrne požiadavky, ako bolo diskutované, a ktoré sú vybavené aspoň niektorými ďalšími ťunkčnými vlastnosťami nutnými na prepnutie izotypu.

Návrhy a tvorba ďalších liečiv

Na základe aktivity protilátok na CTLA-4 opísaných a charakterizovaných možno v súlade s vynálezom ľahko navrhnúť ďalšie liečivá, vrátane ďalších protilátok, antagonistov alebo chemických zlúčenín iných, než sú protilátky. K takýmto formám liečiv patria napr. protilátky majúce podobnú väzbovú aktivitu alebo ťunkciu, pokročilé protilátkové liečivá, ako sú napr. bišpecifické protilátky, imunotoxíny a rádioaktívne značené liečivá, tvorba peptidových liečiv, génová terapia „intrabodies“, antisense liečivá a malé molekuly. Okrem toho, ako už bolo diskutované, eťektorové ťunkcie protilátok podľa vynálezu môžu byť zmenené prepnutím izotypu na IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE alebo IgM na rôzne terapeutické využitia.

V spojení s prípravou pokročilých protilátkových liečiv, kde je požadovanou vlastnosťou fixácia komplementu, je možné závislosť usmrtených buniek na komplemente obísť tým, že sa použijú bišpecifické protilátky, imunotoxíny alebo rádioaktívne značky.

Môžu byť pripravené také bišpecifické protilátky, ktoré obsahujú (I) dve protilátky, kde jedna má špecifickú na CTLA-4 a druhá protilátka má špecificitu na druhú molekulu, ktoré sú spoločne konjugované, (II) jednu protilátku, ktorá má jeden reťazec špecifický na CTLA-4 a druhý reťazec špecifický na druhú molekulu alebo (III) jednoreťazcovú protilátku, ktorá má špecificitu na CTLA-4 a na druhú molekulu. Takéto bišpecifické protilátky môžu byť prípravné metódami, ktoré sú odborníkom známe, na (I) a (II) pozri napr. Fanger et al. Immunol Methods 4: 72 - 81 (1994) a Wright a Harris, cit., na (III) pozri napr. Traunecker et al. Int. J.

Cancer (Suppl.) 7: 51 - 52 (1992).

Okrem toho môžu byť pripravené aj tzv. kappabodies (111 et al. Design arid construction of a hybrid immunoglobulin domain with properities of both heavy and light chain variable regions, Protein Eng 10: 949 až 57 (1997)), minibodies (Martin et al. The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibítor of human interleukin-6, EMBO J 13: 5303 - 9 (1994)), diabodies (Holliger et al. 'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90: 6444 - 6448 (1993)), alebo Janusiny (Traunecker et al. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells, EMBO J 10: 3655 až 3659 (1991) a Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents, Int J Cancer Suppl 7: 51 -52(1992)).

Pokiaľ ide o imunotoxíny, protilátky môžu byť modifikované tak, aby pôsobili ako imunotoxíny a síce metódami, ktoré sú odborníkom známe. Pozri napr. Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993) a tiež U. S. Patent Č. 5,194,594.

Pokiaľ ide o prípravu rádioaktívne značených protilátok, takto modifikované protilátky možno ľahko pripraviť metódami, ktoré sú odborníkom známe. Pozri napr. Junghans et al., Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655 - 686 (2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)), U. S. Patenty č. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 a 5,697,902. Každý z imunotoxínov alebo rádioaktívne značených molekúl pravdepodobne povedie k usmrteniu buniek exprimujúcich CTLA-4, hlavne tých buniek, kde sú protilátky podľa vynálezu účinné.

Pokiaľ ide o prípravu peptidových liečiv, použitím štruktúrnych informácií týkajúcich sa CTLA-4 a protilátok na CTLA-4, napr. protilátok podľa vynálezu (ako bude ešte opísané ďalej v spojení s malými molekulami), alebo skríningom peptidových knižníc, je možné pripraviť terapeutické peptidy namierené proti CTLA-4. Návrh a skríning peptidových liečiv boli napr. opísané v publikáciách Houghten et al. Biotechniques 13: 412 - 421 (1992), Houghten PNAS USA 82: 5131 - 5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13: 901 - 905 (1992), Blake a Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3: 510 - 513 (1992). Imunotoxíny a rádioaktívne značené protilátky môžu byť pripravené podobným spôsobom ako peptidové časti, ako už bolo diskutované pre protilátky.

Dôležité informácie týkajúce sa väzby protilátky a antigénu sa môžu získať experimentmi s fágovou expozíciou (fágový displej). Takéto experimenty sa všeobecne uskutočňujú „ryžovaním“ fágovej knižnice, exprimujúcej náhodné peptidy na väzbu s protilátkou podľa vynálezu a potom určením, či peptid, ktorý sa viaže, môže byť izolovaný. Pokiaľ je pokus úspešný, z peptidu, ktorý sa viaže, je možné získať určité informácie o epitope.

Všeobecne fágové knižnice exprimujúce náhodné peptidy môžu byť zakúpené od firmy New England Biolabs (knižnice 7-mérov a 12-mérov, súprava Ph.D.-7 Peptide 7-mér Library Kit a Ph.D.-12). Peptidy predstavujú prevažnú väčšinu, ak nie všetky, z 20⁷ = 1,28 x 10⁹ sekvencií 7-mérov. Knižnica 12-mérov predstavuje diverziu približne 1,9 x 10⁹ nezávislých klonov, ktoré predstavujú len veľmi malú časť možných 20¹² = 4,1 x 10¹⁵ sekvencií 12-mérov. Každá z knižníc 7-mérov a 12-mérov bola ryžovaná alebo skrínovaná podľa návodu výrobcu, kde doštičky boli potiahnuté protilátkou na zachytenie vhodnej protilátky (napr. kozí anti-ľudský IgG Fc na IgG protilátku) a potom opláchnuté. Naviazaný fág bol eluovaný 0,2 M glycín-HCl, pH 2,2. Po troch opakovaniach cyklov selekcia/amplifikácia pri konštantnej stringencii (0,5 % Tween) bolo možné pomocou sekvenovania DNA charakterizovať klony z knižnice, ktoré reagovali s jednou protilátkou alebo viacerými protilátkami. Reaktivita peptidov sa môže určiť pomocou ELISA. Na ďalšiu diskusiu o epitopovej analýze peptidov pozri napr. tiež Scott, J. K. a Smith, G. P. Science 249: 368 - 390 (1990); Cwirla et al. PNAS USA 87: 6378 - 6382 (1990); Felici et al. J. Mol. Biol. 222: 301 - 310 (1991), and Kuwabara et al. Náture Biotechnology 15: 74 - 78 (1997).

Návrh a príprava génových liečiv a antisense liečiv konvenčnými metódami sú tiež uľahčené prostredníctvom predkladaného vynálezu. Tieto formy liečiv sa môžu použiť na moduláciu funkcie CTLA-4. V tejto súvislosti protilátky podľa vynálezu uľahčujú návrh a použitie funkčných testov. Návrh a príprava antisense liečiv boli podrobne diskutované napr. v medzinárodnej patentovej prihláške WO 94/29444. Návrhy a stratégie na génovú terapiu sú odborníkom známe. Ale v špecifickom prípade použitie metód používajúcich intrabodies môže byť obzvlášť výhodné. Pozri napr. Chen et al. Human Gene Therapy 5: 595 - 601 (1994) a Marasco Gene Therapy 4: 11 - 15 (1997). Všeobecné návrhy a úvahy týkajúce sa liečiv vhodných na génovú terapiu možno nájsť napr. tiež v medzinárodnej patentovej prihláške WO 97/38137. Genetické materiály kódujúce protilátky podľa vynálezu (ako napr. 4.1.1, 4.8.1 alebo 6.1.1 a ďalšie) sa vložia do vhodného expresného systému (vo forme vírusu, atenuovaného vírusu, nevírusovej formy, „nahej“ formy alebo inej) a podajú sa príjemcovi, a potom sa protilátky tvoria in vivo v príjemcovi/hostiteľovi.

Liečivá nazývané malé molekuly možno tiež pripravovať použitím predkladaného vynálezu. Možno navrhnúť také liečivá, ktoré budú modulovať aktivitu CTLA-4. Poznatky získané zo štruktúry CTLA-4 a interakcie s inými molekulami podľa vynálezu, napr. CD28, B7, B7-1, B7-2 a ďalšími sa môžu využiť na racionálny návrh ďalších foriem liečiv. V tomto ohľade môžu byť využité metódy racionálnych návrhov liečiv ako je rôntgenová kryštalografia, počítačové molekulové modelovanie (CAMM), kvantitatívna alebo kvalitatívna analýza vzťahu štruktúra-aktivita (QSAR) a podobné metódy, na ďalšie spresnenie cieľa na nájdenie nových liečiv. Metódy racionálneho navrhovania dovoľujú predikovať proteínové alebo syntetické štruktúry, ktoré reagujú s molekulou alebo ich špecifickou formou a ktoré môžu byť použité na modifikáciu alebo moduláciu aktivity CTLA-4. Takéto štruktúry sa môžu syntetizovať chemicky alebo exprimovať v biologických systémoch. Tieto metódy boli v prehľade uvedené napr. v Capsey et al. Genetically Engineered Humen Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). A skutočne racionálny návrh molekúl (peptidov, peptidomimetík, malých molekúl a pod.) založený na známom alebo aspoň načrtnutom vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou s inými molekulami (ako sú napr. protilátky podľa vynálezu), sa teraz všeobecne stáva rutinným postupom. Pozri napr. Fry et al. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibítor Proc Natl Acad Sci USA 95: 12022 - 7 (1998); Hoffman et al. A model of Cdc25 phosphate catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain, J Mol Biol 282: 195 - 208 (1998); Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p38—a čase study Acta Biochim Pol 44: 557 - 64 (1997); Jouko et al. Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure, Biochem J 322: 927 - 35 (1997); Singh et al. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibítor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases, J Med Chem 40: 1130-5 (1997); Mandel et al. ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling, Nat Biotechnol 14: 323 - 8 (1996); Monfardini et al. Rational desig analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists, Proc Assoc Am Physicians 108: 420 - 31 (1996); Furet et al. Modelling study of protein kinase inhibitors: binding móde of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411, J comput Aided Mol Des 9: 465 - 72 (1995).

Ďalšou možnosťou je pripraviť a syntetizovať kombinačné knižnice a použiť v skríningových programoch, ako sú napr. vysokovýkonné skríningové programy.

Formulácia liečiv a ich podávanie

Liečivá obsahujúce zlúčeniny podľa vynálezu sa podávajú formulované s vhodnými nosičmi, excipientami a ďalšími činidlami, ktoré sú súčasťou farmaceutického prípravku, aby sa zlepšil prenos, príjem, tolerancia a pod. Existujú mnohé vhodné liekové formy, ako je známe odborníkom v odbore farmaceutickej chémie a ako bolo opísané napr. v publikácii Remington s Pharmaceutical Sciences (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), hlavne kapitola 87: Blaug a Seymour. Takéto prípravy obsahujú napr. prášky, pasty, masti, želé, vosky, oleje, tuky, vezikuly (katiónové alebo aniónové) obsahujúce tuky (ako je napr. Lipofectin™), DNA konjugáty, bezvodé absorpčné pasty, emulzie typu olej vo vode alebo typu vody v oleji, emulzné karbovosky (polyetylénglykoly rôznych molekulových hmotností), polotuhé gély a polotuhé zmesi obsahujúce karbovosky. Ktorákoľvek uvedená zmes môže byť vhodná na použitie vynálezu za predpokladu, že účinná zložka prípravku nie je inaktivovaná týmito pomocnými látkami na formuláciu prípravku a že prípravok je fyziologicky kompatibilný a tolerovaný pri danom spôsobe podávania. Ďalšie informácie týkajúce sa excipientov a nosičov, ktoré sú odborníkom vo farmaceutickej chémii známe, pozri tiež Powell et al. Compendium of excipients for parental formulations, PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238 - 311 (1998).

Príprava protilátok

Protilátky podľa predkladaného vynálezu sa výhodne pripravujú prostredníctvom transgénnych myší, ktoré obsahujú vloženú podstatnú časť ľudského genómu produkujúceho protilátky a naopak sú deficientné v produkcii endogénnych myších protilátok. Takéto myši sú potom schopné produkovať molekuly ľudského imunoglobulínu a protilátok a sú deficitné v produkcii myších imunoglobulínových molekúl a protilátok. Postupy vhodné na dosiahnutie tohto cieľa boli opísané v patentových prihláškach a ďalších publikáciách, ktoré sú uvedené v stave techniky. Výhodné uskutočnenie transgénnych myší a produkcie protilátok je opísané v U. S. patentovej prihláške č. 08/759,620, podanej 3. 12. 1996 a ďalej tiež pozri Mendez et al. Náture Genetics 15: 146 - 156 (1997), čo je úplne zahrnuté formou odkazu.

Použitím týchto metód boli pripravené úplné ľudské monoklonálne protilátky na celý rad rôznych antigénov. Podstata postupu spočívala v tom, že myšie línie XenoMouse™ boli imunizované požadovaným antigénom z myší, ktorá exprimovala požadované protilátky, boli odobrané lymfatické bunky (ako napr. Blymfocyty), fúzované s bunkami myeloidnej línie, čím sa získali imortalizované hybridómové línie a tieto hybridómové línie sa potom podrobili skríningu a selekcii, kde boli identifikované hybridómové bunkové línie produkujúce protilátku špecifickú k požadovanému antigénu. V predkladanom vynáleze boli tieto metódy použité na prípravu protilátok špecifických na CTLA-4. Opisuje sa tu preto príprava mnohých hybridómových línií, ktoré produkujú protilátky špecifické proti CTLA-4. Ďalej vynález poskytuje charakteristiky týchto protilátok vrátane analýz nukleotidových a aminokyselinových sekvencii ťažkého a ľahkého reťazca týchto protilátok.

Protilátky pochádzajúce z uvedených hybridómových línií boli označené 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,

4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 1E2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1.

Každá z týchto protilátok predstavuje úplne ľudský buď IgG2, alebo IgG4 reťazec s ľudským ľahkým reťazcom kapa. Všeobecne povedané, protilátky podľa vynálezu majú veľmi vysokú afinitu, typicky majú hodnoty Kd od 10⁹ do 10¹¹ M, keď sú merané v pevnej alebo kvapalnej fáze.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť exprimované aj v iných bunkách či bunkových líniách než len hybridómových.

Sekvencie kódujúce cDNA alebo genomické klony určitých protilátok môžu byť použité na transformáciu buniek vhodného hostiteľa, ktorým je cicavec alebo organizmus iný ako cicavec. Na transformáciu možno použiť akúkoľvek známu metódu na vnesenie polynukleotidov do hostiteľskej bunky vrátane metód, ako je napr. zbalenie (pakážovanie) polynukleotidov do vírusu (alebo do vírusového vektora) a transdukcia hostiteľskej bunky vírusom (vektorom) alebo transfekciou, ako boli napr. opísané v U. S. patentoch č. 4,399,216, 4, 912,040, 4,740,461 a 4,959,455 (ktoré sú zahrnuté formou odkazu). Použité metódy transformácie závisia na hostiteľovi, ktorý má byť transformovaný. Metódy na vnášanie heterológnych polynukleotidov do cicavčích buniek sú odborníkom známe a patria k nim bez toho, aby však tieto údaje boli vyčerpávajúce, dextrantom sprostredkovaná transfekcia, precipitácia s kalciumfosfátom, transfekcia sprostredkovaná polybrenom, fúzia protoplastov, elektorporácia, bombardovanie mikročasticami, enkapsulácia polynukleotidu do lipozómov, peptidové konjugáty, dendriméry a priame mikroinjekcie DNA do jadra.

Línie cicavčích buniek vhodných ako hostiteľské bunky na expresiu sú odborníkom dobre známe a patrí k nim mnoho imortalizovaných bunkových línií dostupných v Americkej zbierke kultúr a mikroorganizmov (ATCC), ako sú napr. bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), bunky NSOo, bunky HeLa, bunky BHK (fetálne obličky škrečka), COS bunky (opičích obličiek), bunky ľudského hepatocelulárneho karcinómu (napr. Hep G2) a celý rad ďalších bunkových línií. K vhodným bunkám, ktoré nie sú z cicavcov a ktoré môžu byť použité na expresiu rekombinantných protilátok patria, ale limit tým nie je obmedzený, napr. bakteriálne bunky, kvasinky, huby, hmyz a rastliny. Miestne cielená mutagenéza protilátkovej domény CH2, ktorá eliminuje glykozyláciu je výhodná, aby sa zabránilo zmenám v imunogenecite, farmakokinetike a/alebo efektorových funkciách, ktoré sú výsledkom glykozylácie líšiacej sa od ľudského glykozylačného profilu. Metódy expresie sa vyberajú na základe toho, že sa stanoví, ktorý systém produkuje najvyššie expresné hladiny a tvorí protilátky s konštitutívnymi väzobnými vlastnosťami na CTLA-4.

Ďalej expresia protilátok podľa vynálezu (alebo iných zlúčenín) v produkčných líniách môže byť zosilnená radom známych metód. Tak napr. expresný systém glutamínsyntetázy a DHFR sú známe systémy na zvýšenie expresie za istých podmienok. Bunkové klony s vysokou expresiou môžu byť identifikované konvenčnými metódami, ako je napr. klonovanie limitného riedenia alebo technika mikrokvapky. Systém GS bol podobne opísaný a diskutovaný v spojení s európskymi patentmi č. 0 216 846, 0 256 055 a 0 323 997 a európskou patentovou prihláškou č. 89303964.4.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť pripravené tiež transgénnym spôsobom a síce vytvorením transgénneho zvieraťa alebo transgénnej rastliny, ktoré je transgénne na požadované sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca imunoglobulínov a produkciu protilátok v izolovanej forme. Pokiaľ ide o transgénne cicavce, protilátky môžu byť produkované do mlieka, z ktorého sú potom izolované, a síce u kozy, kravy a iných cicavcov (pozri patenty U. S. č. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 a 5,741,957.

Protilátky podľa predkladaného vynálezu boli analyzované štruktúrne aj funkčne. V spojení so štruktúrami protilátok boli aminokyselinové sekvencie ťažkého a kapa ľahkého reťazca predikované na základe cDNA sekvencií získaných pomocou RT-PCR hybridómov. Pozri príklady 3 a 4 a obrázky 1 až 8. Sekvenovanie A-koncov protilátok bolo tiež uskutočnené na potvrdenie výsledkov diskutovaných v príkladoch 3 a 4. Pozri tiež príklady 5 a obrázok 9. Kinetické analýzy protilátok boli uskutočnené na stanovenie ich afinít, pozri príklad 2. Protilátky podľa vynálezu (hlavne 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1) majú vysoké afinity (4.1.1: 1,63 x 10¹⁰ 1/M, 4.8.1: 3,54 x 10¹⁰ 1/M a 6.1.1: 7,2 x 10⁹ 1/M). Ďalej boli protilátky analyzované izoelektrickým zaostrovaním (IEF), redukujúcou gélovou elektroforézou (SDS- PAGE), veľkostnou vylučovacou chromatografiou, kvapalinovou chromatografiou a hmotnostnou spektroskopiou a vyhodnotením tvorby protilátok hybridómami. Pozri príklad 6 a obrázok 10.

Pokiaľ ide o funkčnú analýzu protilátok podľa vynálezu, tieto protilátky sa ukázali byť silnými inhibítormi CTLA-4 a jeho väzby na ligandy z rodiny molekúl B7. Tak napr. bolo ukázané, že protilátky podľa vynálezu blokovali väzbu CTLA-4 ako na B7-1, tak aj B7-2. Pozri príklad 7. Skutočne, mnoho protilátok podľa vynálezu má hodnotu IC₅₀ na inhibíciu väzby CTLA-4 na B7-1 alebo B7-2 rádov nanomólov a nižšiu. Okrem toho protilátky podľa vynálezu majú vynikajúcu selektivitu na CTLA-4 v porovnaní napr. s CD28, CD44, B7-2 alebo hlgGl. Pozri príklad 8. Selektivita je pomer, ktorý odráža stupeň preferencie väzby molekuly s prvým činidlom v porovnaní s druhým a prípadne ďalším činidlom. V predkladanom opise sa termín selektivita týka stupňa preferencie väzby protilátky podľa vynálezu na CTLA-4 v porovnaní s väzbou protilátky s inými molekulami, ako napr. CD 28, CD44, B7-2 alebo hlgGl. Hodnoty selektivity protilátok podľa vynálezu vyššie ako 500 : 1 sú bežné. Bolo tiež ukázané, že protilátky podľa vynálezu indukujú alebo zvyšujú expresiu niektorých cytokínov (ako napr. IL-2 a IFN-γ) v kultúre T-lymfocytov a v modeli T-lymfoblastov. Pozri príklady 9 a 10 a tiež obrázky 12 až 17. Možno tiež očakávať, že protilátky podľa vynálezu budú inhibo23 vaťrast nádorov vo vhodných in vivo modeloch nádorov. Návrh takýchto modelov je opísaný a diskutovaný v príkladoch 11 a 12.

Výsledky opísané v predkladanej prihláške ukázali, že protilátky podľa vynálezu majú určité výhodné vlastnosti, na ktoré sú vhodnejšie a účinnejšie ako v súčasnosti používané protilátky proti CTLA-4.

Hlavné protilátky 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1 podľa vynálezu majú výhodné vlastnosti. Ich štruktúrne charakteristiky, funkcie alebo aktivity poskytujú mierky, ktoré uľahčujú návrh a selekciu ďalších protilátok alebo iných typov molekúl, ako už bolo diskutované. K týmto kritériám patrí jedno alebo viaceré z nasledujúcich:

schopnosť kompetovať o väzbu na CTLA-4 a jednu protilátku alebo viacerými protilátkami podľa vynálezu,

- podobná väzobná špecificita na CTLA-4, ako má jedna protilátka alebo viac protilátok podľa vynálezu, väzobná afinita k CTLA-4 10⁹ alebo vyššia, výhodne 10¹⁰ alebo vyššia,

- nereaguje krížovo s CTLA-4 nižších cicavcov, ako je napr. myš, potkan, králik, výhodne nereaguje s CTLA-4 myši a potkana,

- reaguje krížovo s CTLA-4 primátov, výhodne cynomológneho makaka (Macaca fascicularis) a makaka rhesus (Macaca mullata),

- selektivita na CTLA-4 proti CD2B, B7-2, CD44 alebo hlgGl je aspoň 100 : 1 alebo vyššia, výhodne 300,

400 alebo 500 : 1 alebo vyššia,

IC₅₀ blokovania CTLA-4 väzby na B7-2 je lOOnM alebo nižšia, výhodne 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 alebo 0,38 nM alebo nižšia, zvyšuje produkciu cytokínu v jednom alebo viac in vitro testoch, napr.

zvyšuje produkciu IL-2 v teste T-lymfoblasty/Raji bunky o 500 pg/ml alebo viac, výhodne 750, 100,

1500, 2000, 3000 alebo 3846 pg/ml, zvyšuje produkciu IFN-γ v teste T-lymfoblastov/Raji bunky o 500 pg/ml alebo viac, výhodne 750, 100 alebo 1233 pg/ml alebo viac, zvyšuje produkciu IL-2 v teste hPBMC alebo teste superantigénu celej krvi o 500 pg/ml alebo viac a výhodne 750, 1000, 1200 alebo 1511 pg/ml alebo viac, vyjadrené inak produkcia IL-2 je zvýšená o 30, 35, 40, 45, 50 percent a viac pri porovnaní s kontrolným testom.

Očakáva sa, že protilátky podľa vynálezu (alebo molekuly na ich základe navrhnuté alebo syntetizované), majúce jednu vlastnosť alebo viac z uvedených vlastností budú mať tiež podobnú účinnosť ako protilátky podľa predkladaného vynálezu.

Požadované funkčné vlastnosti už opísané vedú k väzbe na CTLA-4 a inhibícii väzby CTLA-4 molekulou (napr. protilátkou, protilátkovým fragmentom, peptidom, malou molekulou) podobným spôsobom, ako sa správa protilátka podľa vynálezu (t. j. väzbou na rovnaký alebo podobný epitop molekuly CTLA-4).

Molekula podľa vynálezu sa podáva buď priamo (t. j. priame podávanie molekúl pacientovi), alebo sa môže podávať nepriamo (t. j. napr. podávaním peptidu alebo podobnej molekuly, ktorá vyvolá imunitnú reakciu u pacienta podobne ako vakcína a táto reakcia zahrnuje tvorbu protilátok, ktoré sa viažu na rovnaký alebo podobný epitop alebo protilátku alebo jej fragment, ktoré sú produkované po podaní genetického materiálu, ktorý kóduje také protilátky alebo ich fragmenty viažuce rovnaký alebo podobný epitop). Takže je jasné, že epitop na CTLA-4, na ktorý sa viažu protilátky podľa vynálezu, je užitočný v spojení s prípravou liečiv podľa vynálezu. Pri návrhu liečiv býva rovnako dôležitá aj negatívna informácia (t. j. skutočnosť, že protilátka, ktorá sa viaže na CTLA-4, sa neviaže na epitop, ktorý pôsobí ako inhibítor CTLA-4, je užitočná). Takže epitop, na ktorý sa viažu protilátky podľa vynálezu, ktoré nevedú k požadovaným funkciám, môže byť tiež veľmi dôležitý. Teda do rozsahu predkladaného vynálezu patria také molekuly (a hlavne protilátky), ktoré sa viažu na rovnaký alebo podobný epitop ako protilátky podľa predkladaného vynálezu.

Okrem toho, že predmetom predkladaného vynálezu sú protilátky a možno teda uvažovať aj epitopy, na ktoré sa viažu, boli uskutočnené aj predbežné štúdie mapovania epitopov na určité protilátky podľa vynálezu, hlavne protilátky 4.1.1 a 11.2.1.

Ako prvý krok boli uskutočnené kompetenčné štúdie BIAcore na vytvorenie hrubej mapy väzieb medzi protilátkami podľa vynálezu tiež v spojení s ich schopnosťou kompetovať o väzbu s CTLA-4. Na tento účel bol CTLA-4 naviazaný na čip BIAcore a prvá protilátka, za saturujúcich podmienok, bola naviazaná na čip a potom bola meraná kompetičná väzba následnej sekundárnej protilátky na CTLA-4. Táto metóda umožňuje vytvorenie hrubej mapy, podľa ktorej možno klasifikovať rodiny protilátok.

Týmto spôsobom bolo stanovené, že protilátky podľa vynálezu možno rozdeliť do nasledujúcich epitopových kategórií.

Kategória	Protilátka	Kompetícia o väzbu CTLA-4
A	B01M* B02M*	x Úplne krížovo kompetujú navzájom, krížovo kompetujú s kategóriou B, do istej miery kompetujú s kategóriou D
B	4.1.1 4.13.1	Úplne krížovo kompetujú navzájom, krížovo kompetujú s kategóriou A, C a D

C	6.1.1	Úplne krížovo kompetujú navzájom, krížovo kompetujú s kategóriou B a D
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D	4.14.1	Krížovo kompetujú s kategóriou C a B, do istej miery s kategóriou A
E	4.9.1	BNI3 blokuje väzbu 4.9.1 na CTLA-4, ale nie naopak
BNI3 * * *

(*) a (**) sú dostupné od Biostride (***) sú dostupné od Pharmingen

V ďalšom kroku sa pôvodcovia pokúsili stanoviť, či protilátky podľa vynálezu rozpoznávajú lineárny epitop na CTLA-4 za redukujúcich a neredukujúcich podmienok metódou westernového prenosu (western blot). Bolo pozorované, že žiadna z protilátok 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 11.6.1 alebo 11.2.1 nerozpoznávala redukovanú formu CTLA-4 na westernovom prenose. Teda sa zdá, že všetky epitopy rozpoznávané príslušnými protilátkami nie sú lineárne epitopy, ale skôr konformačný epitop, ktorého štruktúra je zrušená v redukujúcich podmienkach.

Ďalej bolo skúmané, či je možné niečo zistiť o aminokyselinových zvyškoch, ktoré sú dôležité pre väzbu protilátok podľa vynálezu. Jednou metódou bolo použitie kinetickej metódy stanovenia rýchlostných konštánt na ľudský CTLA-4 a dva vysoko konzervatívne CTLA-4 primátov (makak, Macaca fascicularis a marmoset, Callithirix jachcuss). Štúdie pomocou techniky BIAcore ukázali, že protilátka podľa vynálezu

4.1.1 sa viaže na CTLA-4 človeka aj oboch primátov rovnakou rýchlosťou. Ale vzhľadom na kinetiku sa ukázalo, že protilátka 4.1.1 má najvyššiu afinitu (najmenšiu rýchlosť rozpadu) na ľudský CTLA-4, rýchlejší rozpad na CTLA-4 makaka a ešte oveľa rýchlejší marmoseta. Naproti tomu protilátka 11.2.1 sa viaže na CTLA-4 človeka aj oboch primátov s rovnakou rýchlosťou, pritom má aj rovnaké afinity (rýchlosti rozpadu) na všetky tri CTLA-4. Táto informácia ďalej ukazuje, že protilátky 4.1.1 a 11.2.1 sa viažu na rôzne epitopy CTLA-4.

Na ďalšie skúmanie epitopov, na ktoré sa viažu protilátky kategórie B a C podľa vynálezu, boli uskutočnené štúdie s miestne cielenou mutagenézou. CTLA-4 marmoseta má oproti ľudskému dva významné rozdiely, a síce vo zvyškoch 105 a 106. Tieto rozdiely sú zmena leucínu na metionín v pozícii 105 a glycínu na serín v pozícii 106. Teda bola mutovaná cDNA kódujúca ľudský CTLA-4 tak, aby kódovala mutovaný CTLA-4 majúci zmeny L105M a G106S. Homologická náhrada mutovaného CTLA-4 neovplyvnila väzbu B7.2-IgGl fúzneho proteínu. Ale táto molekula bola významne inhibovaná v schopnosti viazať sa na protilátku

4.1.1 podľa vynálezu (podobne marmoset). Ďalej bola mutovaná cDNA marmoseta kódujúca CTLA-4, čím bol vytvorený mutant CTLA-4 marmoseta obsahujúci zámenu S106G. Táto zámena viedla k obnoveniu pôvodnej stabilnej väzby. Okrem toho bol pripravený mutant CTLA-4 marmoseta majúci zámenu M105L. Táto zámena čiastočne obnovila väzbu medzi protilátkou 4.1.1 a mutovaným CTLA-4. Každá z kategórie protilátok A až D podľa vynálezu, ako sa zdá, má podobné funkčné vlastnosti a má zrejme potenciál pôsobiť ako silné terapeutické činidlo anti-CTLA-4. Ďalej každá z molekúl vykazuje istú krížovú kompetíciu vo väzbe na CTLA-4. Ale ako už bolo diskutované, každá z molekúl rôznych kategórií sa zjavne viaže na samostatný konformačný epitop CTLA-4.

Z predchádzajúcich údajov a diskusií vyplýva, že informácie o epitopoch, o ktorých sa už diskutovalo, ukazujú, že protilátky (alebo iné molekuly) podľa vynálezu, ktoré krížovo kompetujú s protilátkami, budú mať zrejme značný terapeutický potenciál. Ďalej možno očakávať, že protilátky (alebo iné molekuly) podľa vynálezu, ktoré krížovo kompetujú s protilátkami podľa vynálezu (t. j. krížovo kompetujú s protilátkami skupín B, C, a/alebo D, budú mať podľa predkladaného vynálezu ďalší terapeutický potenciál. A ďalej možno očakávať, že protilátky (alebo iné molekuly) podľa vynálezu, ktoré krížovo kompetujú s protilátkami podľa vynálezu (t. j. krížovo kompetujú s protilátkami skupín B, C a/alebo D a I), nemajú zníženú väzbu s CTLA-4 marmoseta, budú mať podľa predkladaného vynálezu ďalší terapeutický potenciál. Také protilátky (alebo iné molekuly) podľa vynálezu, ktorá krížovo kompetuje s protilátkami skupín A a E podľa vynálezu majú určitý terapeutický potenciál.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 opisuje rad nukleotidových a aminokyselinových sekvencii ťažkého reťazca a ľahkého reťazca kapa (K) imunoglobulínových molekúl podľa vynálezu: 4.1.1 (obrázok IA), 4.8.1 (obrázok 1B), 4.14.3 (obrázok 1C), 6.1.1 (obrázok ID), 3.1.1 (obrázok IE), 4.10.2 (obrázok 1F), 2.1.3 (obrázok 1G), 4.13.1 (obrázok 1H),

11.2.1 (obrázok II), 11.6.1 (obrázok IJ), 11.7.1 (obrázok 1K), 12.3.1.1 (obrázok ÍL) a 12.9.1.1 (obrázok IM).

Obrázok 2 poskytuje porovnanie sekvencii medzi predikovanými aminokyselinovými sekvenciami ťažkého reťazca z klonov 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie DP-50 (3-33). Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie DP-50 a sekvencie v klone sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3, ktoré sú vytieňované.

Obrázok 3 ukazuje priradenie sekvencie predikovanej aminokyselinovej sekvencii ťažkého reťazca klonu 2.1.3 a zárodočné línie DP-65 (4-31). Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie DP-65 a sekvencie v klone sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3, ktoré sú podčiarknuté.

Obrázok 4 ukazuje priradenie predikovanej aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca kapa klonov

4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a zárodočnej línie A27 aminokyselinovej sekvencie. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie A27 a sekvencie v klone sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, ktoré sú podčiarknuté. Zjavné delécie v úseku CDR1 klonov 4.8.1,4.14.3 a 6.1.1 sú označené symbolmi 0.

Obrázok 5 ukazuje priradenie predikovanej aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca kapa klonov

3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 a 11.7.1 a zárodočnej línie 012. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie 012 a sekvencie v klone sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, ktoré sú podčiarknuté.

Obrázok 6 ukazuje priradenie predikovanej aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca kapa klonu 2.1.3 a sekvencie zárodočnej línie A10/A26. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie A10/A26 a sekvencie klonu sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, ktoré sú podčiarknuté.

Obrázok 7 ukazuje priradenie predikovanej aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca kapa klonu

12.3.1 a sekvencie zárodočnej línie A17. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie A17 a sekvencie klonu sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, ktoré sú podčiarknuté.

Obrázok 8 ukazuje priradenie predikovanej aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca kapa klonu

12.9.1 a zárodočnej línie A3/A19. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii zárodočnej línie A3/A19 a sekvencie klonu sú znázornené hrubo. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, ktoré sú podčiarknuté.

Obrázok 9 ukazuje súhrn N-koncovej aminokyselinovej sekvencie získaný priamym proteínovým sekvenovaním ťažkého a ľahkého reťazca protilátok.

Obrázok 10 uvádza niektoré ďalšie charakteristiky niektorých protilátok podľa vynálezu. Na obrázku 10A sú zhrnuté údaje týkajúce sa klonov 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 a 6.1.1. Údaje týkajúce sa koncentrácie, izoelektrickej fokusácie (IEF), SDS-PAGE, vylučovacej chromatografie, kvapalinovej chromatografie/hmotnostnej spektroskopie (LCMS), hmotnostnej spektroskopie (MALDI), N-koncové sekvencie ľahkého reťazca sú uvedené. Dalšie detailné údaje týkajúce sa IEF sú na obrázku 10B, dáta týkajúce sa SDS-PAGE na obrázku 10C a SEC protilátky klonu 4.1.1 na obrázku 10D.

Obrázok 11 ukazuje expresiu B7-1 a B7-2 na bunkách Raji použitím monoklonálnych protilátok (mAb) anti-CD80-PE a anti-CD86-PE.

Obrázok 12 ukazuje koncentráciu závislej zvýšenej produkcie IL-2 v teste T-lymfoblastov/Raji indukovanej blokujúcimi protilátkami anti-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1). Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IL-2 ľudskými T-lymfocytmi po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 z XenoMouse v 72 hodinovom teste T-lymfoblastov/Raji buniek.

Obrázok 13 ukazuje koncentráciu závislej zvýšenej produkcie IFN-γ v teste T-lymfoblastov/Raji indukovanej blokujúcimi protilátkami anti-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1) (zhodné donorové T-bunky). Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IFN-γ ľudskými T-lymfocytmi po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 z Xeno-Mouse v 72 hodinovom teste T-lymfoblastov/Raji buniek.

Obrázok 14 ukazuje priemerné zvýšenie produkcie IL-2 T-bunkami od 6 donorov indukovaných blokujúcimi monoklonálnymi protilátkami anti-CTLA-4 testu T-bunky blast/Raji. Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IL-2 ľudskými T-lymfocytmi po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 z Xeno-Mouse v 72 hodinovom teste T-lymfoblastov/Raji buniek (6 darcov).

Obrázok 15 ukazuje priemerné zvýšenie produkcie IFN-γ T-bunkami zo 6 donorov indukovaných blokujúcimi monoklonálnymi protilátkami anti-CTLA-4 testu T-bunky blast/Raji. Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IFN-γ ľudskými T-lymfocytmi po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 4 z Xeno-Mouse v 72 hodinovom teste T-lymfoblastov/Raji buniek. (6 darcov).

Obrázok 16 ukazuje priemerné zvýšenie produkcie IL-2 v h P BMC 5 donorov indukovaných blokujúcimi monoklonálnymi protilátkami anti-CTLA-4 testu T-bunky blast/Raji, merané 72 hodín po stimulácií SEA. Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IL-2 po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 CT4.1.1 (30 pg/ml) v celej ľudskej krvi stimulovanej SEA (100 ng/ml) a Mab anti-CD3 (60 ng/ml).

Obrázok 17 ukazuje priemerné zvýšenie produkcie IL-2 v celej krvi z 3 indukovaných blokujúcimi monoklonálnymí protilátkami anti-CTLA-4 testu T-bunky blast/Raji, merané 72 a 96 hodín po stimulácii SEA. Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IL-2 po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 CT4.1.1 (30 pg/ml) v celej ľudskej krvi stimulovanej SEA (100 ng/ml) a Mab anti-CD3 (60 ng/ml).

Obrázok 18 ukazuje inhibíciu rastu nádoru s protilátkou anti-myšou CTLA-4 na modeli myšieho fíbrosarkómu.

Obrázok 19 ukazuje zvýšenie produkcie IL-2 indukovanej protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podľa vynálezu v teste T-blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách (mononukleárne bunky z celej krvi a periférnej krvi od 6 darcov). Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IL-2 po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 (30 pg/ml) v 72 hodinovom teste T-lymfoblastov/Raji buniek a v superantigénovom teste(6 darcov).

Obrázok 20 ukazuje na dávke závislé zvýšenie produkcie IL-2 indukovanej protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podľa vynálezu v teste T-blast/Raji a Superantigén po 72 hodinách. Na obrázku je znázornené zvýšenie tvorby IL-2 ľudskými T-lymfocytmi po indukcii monoklonálnou protilátkou (MAb) anti-CTLA-4 v 72 hodinovom teste T-lymfoblastov/Raji buniek.

Obrázok 21 ukazuje na dávke závislé zvýšenie produkcie IL-2 indukovanej protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podľa vynálezu v teste T-blast/Raji a Superantigén po 72 hodinách, kde celá krv bola stimulovaná 100 ng/ml superantigénu.

Obrázok 22 ukazuje sériu ďalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencií nasledujúcich reťazcov protilátok anti-CTLA-4: ťažký reťazec 4.1.1 plnej dĺžky (cDNA 22(a), genómová sekvencia 22(b), a aminokyselinová sekvencia 22(c)), aglykozylovaný ťažký reťazec 4.1,1 (cDNA 22(d) a aminokyselinová sekvencia 22(e)), ľahký reťazec 4.1.1 (cDMA22(f) a aminokyselinová sekvencia 22(g)), ťažký reťazec 4.8.1 plnej dĺžky (cDNA 22(h) a aminokyselinová sekvencia 22(i)), ľahký reťazec 4.8.1 (cDNA 22(j) a aminokyselinová sekvencia 22(k)), ťažký reťazec 6.1.1 plnej dĺžky (cDNA 22(1) a aminokyselinová sekvencia 22(m)), ľahký reťazec 6.1.1 (cDNA 22(n) a aminokyselinová sekvencia 22 (o)), ťažký reťazec 11.2.1 plnej dĺžky (cDMA 22 (p) a aminokyselinová sekvencia 22(q)) a ľahký reťazec 11.2.1 (cDNA 22(r) a aminokyselinová sekvencia 22(s)).

Na obrázkoch 22 (A-S) sú:

• signálne peptidy znázornené hrubými a väčšími písmenami • otvorený čítací rámec v genómovom klone je podčiarknutý • mutácia vnesená na vytvorenie deglykozylovanej protilátky (M294Q) je znázornená väčším písmom a je dvakrát podčiarknutá.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady vrátane uskutočnených pokusov a dosiahnutých výsledkov sú uvedené iba na ilustratívne účely a predkladaný vynález nijako neobmedzujú.

Príklad 1

Príprava hybridómov produkujúcich protilátku anti-CTLA-4

Protilátky podľa vynálezu boli pripravené, selektované a testované podľa opísaného príkladu.

Príprava antigénu:

Na imunizáciu myši XenoMouse™ boli pripravené tri rozdielne imunogény: i) fúzny proteín CTLA-4-IgG, ii) peptid CTLA-4 a iii) bunky myšieho lymfómu 300,19 transfekované mutantom CTLA-4 (Y201V), ktorá je konštitutívne exprimovaná na bunkovom povrchu.

i) fúzny proteín CTLA-4-IgG

Konštrukcia expresného vektora:

cDNA kódujúca zrelú extracelulámu doménu CTLA-4 bola amplifikovaná pomocou PCR z cDNA knižnice ľudského týmusu (Clontech) s použitím primérov navrhnutých podľa publikovanej sekvencie (Eur. J. Immunol., 18, 1901 - 1905, 1988). Fragment bol cielene subklonovaný do pSR5, expresného plazmidu vírusu Sindbis (InVitrogen), medzi doménami CH1/CH2/CH3 signálneho peptidu ľudského onkostatínu M a ľudského IgG gama 1 (IgGl). Fúzny proteín neobsahuje kĺbovú doménu, ale obsahuje cysteín 120 v extracelulárnej doméne CTLA-4 za vzniku kovalentného diméru. Výsledný vektor bol nazvaný CTLA-4-IgG/pSR5. Sekvencia kompletnej cDNA CTLA-4-IgGl vo vektore bola potvrdená v obidvoch vláknach. Aminokyselinová sekvencia proteínu CTLA-4-Ig je ukázaná ďalej. Zrelá extracelulárna doména na CD44 bola amplifikovaná pomocou PCR z ľudskej lymfocytovej knižnice (Clontech) a subklonovaná do pSinRep5 za vzniku kontrolného proteínu s identickým koncom IgGl.

Fúzny proteín OM-CTLA-4-IgGl:

MGVLLTORTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAWLASSRGIASFVC

EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT

GTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY

VIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE

YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Podčiarknuté: signálny peptid

Hrubé: extraceluláma doména CTLA-4 cDNA pre zrelú extracelulámu doménu CD28 boh amplifikované pomocou PCR z ľudskej lymfocytovej knižnice (Clontech), a potom subklonované do pCDM8 (J. Immunol., 151, 5261 - 71, 1993) za vzniku fúzneho proteínu ľudského IgGl obsahujúceho oblasť štiepenia trombínom a kĺbovú oblasť. CTLA-4 z opíc Callithrix jacchuss, Macaca fascicularis a Macaca mullata bol klonovaný z mRNA izolovanej z PBMC stimulovaných PHA s použitím štandardných techník degenerovanej PCR. Sekvenovanie ukázalo, že aminokyselinové sekvencie opíc rhesus a cynomologous boh totožné s tromi odlišnosťami oproti zrelej ľudskej extracelulárnej doméne CTLA-4 (S13N, I17T a L105M). U opíc C. Jacchuss bolo dokázaných desať aminokyselinových odchýliek od zrelej ľudskej extracelulámej domény CTLA-4 (V21A, V33I, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M a G106S). Miestne cielená mutagenéza bola použitá na vytváranie jednobodových mutácií všetkých aminokyselín odlišných u marmoseta CTLA-4 na mapovanie aminokyselín dôležitých na interakciu protilátok s ľudským CTLA-4-IgG. Mutácie ľudského a marmoset CTLA-4-IgG na epitopové mapovanie boh vytvárané pomocou značkovacej súpravy na miestne cielenú mutagenézu (Promega). Fúzne proteíny IgG boh produkované pomocou prechodnej transfekcie buniek COS7 a purifikované s použitím štandardných techník Proteín A. U mutovaných proteínov CTLA-4-IgG bola hodnotená väzba na protilátky prostredníctvom imunoprenosu (imunoblotting) a s použitím analýz BIAcore.

Expresia/purifikácia rekombinantného proteínu

Rekombinantný vírus Sindbis vznikal elektroporáciou (Gibco) buniek z embryonálnych obličiek škrečka s SP6 in vitro transkribovanou mRNA CTLA-4-IgGl/pSR5 a pomocou mRNA DH-26S, ako je opísané firmou InVitrogen. Rekombinantný vírus bol odobratý po štyridsiatich ôsmich hodinách a titrovaný na optimálnu expresiu proteínu v bunkách ovárií čínskeho škrečka (CHO-K1). Bunky CHO-K1 boh pestované v suspenzii DMEM/F12 (Gibco) obsahujúcej 10 % teplom inaktivovaná fetálne bovinné sérum (Gibco), neesenciálne aminokyseliny (Gibco), 4mM glutamín (Gibco), penicilín/streptomycín (Gibco), lOmM Hepes pH 7,5 (Gibco). Aby produkovali CTLA-4-IgG, boh bunky CHO-K1 rozsuspendované v množstve lxlO⁷ buniek/ml v DMEM/F12 a inkubované s vírusom Sindbis jednu hodinu pri teplote miestnosti. Potom boli bunky nariedené na lxl0⁶/ml v DMEM/F12 obsahujúcom 1 % fetálne bovinné sérum zbavené bovinného IgG s použitím Protein A Sepharose (Pharmacia), neesenciálnej aminokyseliny, 4mM glutamín, 12,5 mM Hepes pH 7,5 a penicilín/streptomycín. Štyridsať osem hodín po infekcii boh bunky peletované a kondiciované média boh odobraté a doplnené tabletkami úplného inhibítora proteáz (Boehringer Mannheim), pH bolo upravené na 7,5 a média boh filtrované cez 0,2 filter (Nalgene). FPLC (Pharmacia) bola použitá na afinitnú purifikáciu fúzneho proteínu s použitím 5 ml kolóny A HiTrap (Pharmacia) pri rýchlosti prietoku 10 ml/minútu. Kolóna bola premytá PBS 30 objemami kolóny a eluovaná 0,1 M glycínom/HCl, pH 2,8, rýchlosťou 1 ml/minútu. Frakcie (1 ml) boh okamžite neutralizované na pH 7,5 pomocou Tris pH 9. Frakcie obsahujúce CTLA-4-IgGl boh identifikované prostredníctvom SDS-PAGE a potom koncentrované s použitím Centriplus 50 (Amicon) pred aplikáciou na kolónu Sepharose 200 (Pharmacia) rýchlosťou 1 ml/minútu s použitím PBS ako rozpúšťadla. Frakcie obsahujúce CTLA-4-IgGl boh zlúčené, sterilizované filtráciou 0,2 (Milipore), rozdelené na pomerné časti a zamrazené na -80 °C. CD44-IgGl bol exprimovaný a purifikovaný použitím rovnakých metód. CD28-IgG bol purifikovaný z kondiciovaných médií od prechodne transfekovaných buniek COS7.

Charakterizácia CTLA-4-IgGl

Purifikovaný CTLA-4-IgGl migroval ako jeden pás na SDS-PAGE pri použití farbenia koloidnou modrou Coomassie (Novex). Za neredukujúcich podmienok bol CTLA-4-IgGl dimér (100 kD), ktorý sa redukoval na monomér s veľkosťou 50 kDa, keď bol ošetrený 50mM DTT. Sekvenovanie aminokyselín purifikovaného CTLA-4-IgGl v roztoku potvrdilo N-koncovú časť CTLA-4 (MHVAQPAVVLAS) a to, že signálny peptid onkostatínu M bol odštiepený zo zrelého fúzneho proteínu.

CTLA-4-IgGl sa viazal na mobilizovaný B7.1-IgG spôsobom závislým na koncentrácii a väzba bola blokovaná škrečou protiľudskou anti-CTLA-4 protilátkou (BNI3, PharMingen). Sterilný CTLA-4-IgG bol bez endotoxínu a bol kvantifikovaný pri OD280 s použitím 1,4 ako extinkčného koeficientu. Výťažok purifikovaného CTLA-4-IgG sa pohyboval v rozmedzí 0,5 až 3 mg/1 buniek CHO-K1.

(ii) CTLA-4 peptid

Nasledujúci peptid CTLA-4 bol pripravený tak, ako je opísané ďalej: NH₂:MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVT EVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH₂

Skratky/materiál:

NMP, N-metylpyrolidinón; TFE, 2,2,2-trifluóretanol; DCM, dichlórmetán; FMOC, fluorenylmetoxykarbonyl. Všetky reagencie boli dodávané firmou Perkin Elmer s nasledujúcimi výnimkami: TFE od firmy Aldrich Chemical, FMOC-PAL-PEG živica od firmy Perseptive Biosystems. Pre tie aminokyseliny, ktoré vyžadujú ochranné skupiny bočných reťazcov, sa použili: Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH a FMOC-Tyr(tBu)-OH.

Syntéza peptidu

Syntéza peptidu sa uskutočnila na prístroji Perkin-Elmer 431A dodatočne vybavenom monitorovaním väzby prostredníctvom UV absorbancie pri 301 nm (Perkin-Elmer Model 759A detector). Sekvencia peptidu bola syntetizovaná na živici FMOC-PAL-PEG s použitím kondiciovaných dvojitých kondenzačných cyklov. Zosilnené dvojice kondenzačnej reakcie boli uskutočňované v cykloch 10, 11, 18, 19, 20 a 28 až 33. Živica bola premytá 50 % zmesou DCM a TFE pri ukončení každého acylačného cyklu a potom nasledovalo zakrytie nezreagovaných aminoskupín acetanhydridom v NMP. Živica bola odstránená z reaktora po ukončení cyklu 49 a zvyšok pokračoval až do ukončenia. Odštiepenie peptidu zo živice bolo uskutočňované s použitím Reagentu K (King et al., International Journal of Protein and Peptide Research, 36, 255 - 266, 1990) počas 6 hodín na 415 mg živice, ktorá poskytla 186 mg hrubého peptidu CTLA-4.

Charakterizácia peptidu mg alikvóty hrubého peptidu CTLA-4 boli rozpúšťané v 5 ml 6M guanidín HCl/lOOmM K₂PO₃ pri pH 6,4 a eluované cez kolónu Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 mm x 600 mm, 120 ml objem kolóny) s 2M guanidín HCl/lOOmM K₂PO₃ pri pH 6,4 rýchlosťou 2 ml/min počas 180 minút a pri zbere 5 ml frakcií. Frakcie boli analyzované nanesením 1,7 μΐ frakcie na gél NuPAGE Laemli s MES pufrom a vizualizáciou prostredníctvom Daichiilovho protokolu farbenie striebrom. Frakcie o molekulovej hmotnosti 12 kDa, ako bolo určené na základe porovnania so štandardmi molekulovej hmotnosti, boli zlúčené a uložené pri 4 °C. Spojené frakcie boli analyzované pomocou UV a gélovej elektorforézy. Sekvenovanie aminokyselín bolo uskutočňované absorpciou vzorky o objeme 100 μΐ v zásobníku ProSorb (absorpcia na membránu PVDF) a premytím na odstránenie soli pufŕu. Sekvenovanie bolo uskutočňované na prístroji Applied Biosystems 420. Bola pozorovaná očakávaná N-koncová sekvencia (M HVAQPAVVL A). Imunoprenos dokázal, že peptid bol rozpoznávaný CTLA-4 protiľudskou BNI3 (PharMingen). Na odsolenie bol alikvót obsahujúci 648 pg materiálu prenesený do dialyzačných trubičiek 3500 D MWCO a bol dialyzovaný oproti 0,1 % TFA/H₂O pri 4 °C počas 9 dní s miešaním. Celý obsah dialyzačného vrecka bol lyofilizovaný na prášok.

(iii) Bunky 300.19 transfekované CTLA-4 (Y201V)

Kompletná cDNA CTLA-4 bola amplifikovaná pomocou PCR z cDNA knižnice ľudského týmusu (Stratagene) a subklonovaná do pIRESneo (Clontech). Bola zavedená mutácia CTLA-4, ktorá má za následok konštitutívnu expresiu na bunkovom povrchu s použitím systému MatchMaker Mutagenesis (Promega). Mutácia tyrozínu Y201 na valín inhibuje väzbu proteínu adaptínu AP50, ktorý je zodpovedný za rýchlu internalizáciu CTLA-4 (Chuang et al., J. Immunol., 159, 144 - 151, 1997). Bunky 300.19 myšieho lymfómu bez mykoplazmát boli pestované v RPMI-1640 obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum, neesenciálne aminokyseliny, penicilín/streptomycín, 2 mM glutamín, 12,5 mM Hepes pH 7,5 a 25 M beta-merkaptoetanol. Bunky boli transfekované elektroporáciou (3xl0⁶/0,4 ml RPMI bez séra) v 1 ml komôrke s 20 g CTLA-4-Y201V/pIRESneo s použitím 200V/1180uF (Gibco CellPorator). Bunky boli ponechané v pokoji 10 minút a potom bolo pridané 8 ml vopred ohriateho kompletného média RPMI obsahujúcom 1 mg/ml G418 (Gibco). Rezistentné bunky sa rozšírili a vykazovali expresiu CTLA-4 na bunkovom povrchu pri použití protilátky BNI3 konjugovanej s fykoerytrínom (PharMingen). Bunky s vysokou hladinou expresie boli izolované sterilným triedením.

Imunizácia a príprava hybridómov

Myši XenoMouse (staré 8 až 10 týždňov) boli imunizované i) subkuntánne do koreňa chvosta s lxlO⁷ buniek 300.19, ktoré boli transfekované tak, aby exprimovali CTLA-4, ako už bolo opísané, a rozsuspendované vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi (PBS) s kompletným Freundovým adjuvans alebo ii) subkuntánne do koreňa chvosta sa) 10 g CTLA-4 fúzneho proteinu alebo b) 10 g peptidu CTLA-4 emulgovaného v kompletnom Freundovom adjuvans. V každom prípade bola dávka opakovaná trikrát alebo štyrikrát v nekompletnom Freundovom adjuvans. Štyri dni pred fúziou dostali myši poslednú injekciu imunogénu alebo buniek v PBS. Lymfocyty zo sleziny a/alebo lymfatických uzlín z imunizovaných myší boli fúzované s bunkovou líniou myšieho nesekrečného myelómu P3 a boli podrobené selekcii HAT tak, ako bolo opísané (Galfre, G. A Milstein, C., Preparation of monoclonal antibodies, strategies and procedures, Methods Enzymol., 73, 3 - 46, 1981). Bol získaný veľký panel hybridómov, ktoré všetky sekrétovali CTLA-4 špecifické ľudské IgG₂K alebo IgG₄K protilátky (ako je odhalené).

Test ELISA

ELISA na zisťovanie antigén-špecifických protilátok v myšom sére a v supematantoch hybridómov bola uskutočňovaná tak, ako bolo opísané (Coligan et al., Oddiel 2.1, Enzýme linked immunosorbent assays, Current protocols in immunology, 1994) s použitím CTLA-4-Ig fúzneho proteinu na zachytávanie protilátok. Zvieratá, ktoré boli imunizované fúznym proteínom CTLA-4-Ig, pôvodcovia navyše testovali na nešpecifickú reaktivitu proti ľudskej Ig časti fúzneho proteinu. To bolo uskutočňované s použitím ELISA doštičiek potiahnutých ľudským Ig ako negatívnou kontrolou špecificity.

Vo výhodnom teste ELISA boli použité nasledujúce techniky:

ELISA doštičky boli potiahnuté 100 μΙ/jamku poťahujúcim pufrom na doštičky s antigénom (0,1 M uhličitanový pufer, pH 9,6 a NaHCO₃ (MW 84) 8,4 g/1). Potom boli doštičky inkubované cez noc pri 4 °C. Po inkubácii bol poťahujúci pufer odstránený a doštička bola blokovaná 200 μΙ/jamku blokovacieho pufru (0,5 % BSA, 0,1 % Tween 20, 0,01 % Thimerosal v 1 x PBS) a inkubovaná pri teplote miestnosti 1 hodinu. Alebo boli doštičky s blokujúcim pufrom uložené v chladničke a utesnené. Blokujúci pufer bol odstránený a z hybridómu bolo pridané 50 μΙ/j am k u supernatantu, séra alebo supernatantu z iného hybridómu (pozitívna kontrola) a média HAT alebo blokujúceho pufra (negatívna kontrola). Doštičky boli inkubované 2 hodiny pri teplote miestnosti. Po inkubácii boli doštičky premyté premývacím pufrom (1 x PBS). Detegujúca protilátka (t. j. myšia protiľudská IgG4-HRP (SB #9070-05) na protilátky IgG2 alebo myšia protiľudská IgG4-HRO (SB #9200-05) na protilátky IgG4) bola pridaná v množstve 100 μΙ/jamku (myšia protiľudská IgG2-HRP v riedení 1 : 2000 alebo myšia protiľudská IgG4-HRP v riedení 1 : 1000 (každá nariedená blokujúcim pufrom). Doštičky boli inkubované pri teplote miestnosti 1 hodinu a potom premyté premývacím pufrom. Potom bolo do jamiek pridané 100 μΙ/jamku čerstvo pripraveného vyvíjaceho roztoku (10 ml substrátového pufra, 5 mg OPD (o-fenylendiamín, Sigma kat. č. P-7288) a 10 μϊ 30 % H₂O₂ (Sigma). Doštičky sa ponechali vyvíjať 10 až 20 minút, pokiaľ sa neobjavilo slabé zafarbenie v jamkách s negatívnymi kontrolami. Potom bolo pridané 100 μΙ/jamku stopovacieho roztoku (2M H₂SO₄) a doštičky boli odčítané na odčítavacom zariadení na doštičky ELISA pri vlnovej dĺžke 490 nm.

Zisťovanie afinitných konštánt úplne ľudských Mab pomocou zariadenia BIAcore

Meranie afinity purifikovaných ľudských monoklonálnych protilátok, Fab fragmentov alebo supernatantu z hybridómov prostredníctvom plazmónovej rezonancie bolo uskutočňované s použitím prístroja BIAcore 2000, použitím všeobecných postupov uvedených výrobcom.

Kinetická analýza protilátok bola uskutočňovaná s použitím antigénov imobilizovaných s nízkou denzitou na povrchu senzora. Na troch povrchoch senzorického čipu BIAcore bol imobilizovaný fúzny protein CTLA-4-Ig o hustote pohybujúcej sa od približne 390 do 900 pri použití fúzneho proteinu CTLA-4-Ig v koncentrácii 20 alebo 50 g/ml v 10 mM acetáte sodnom, pH 5,0, s použitím súpravy na kondenzáciu amínov dodávanej výrobcom (BIAcore, Inc.). Na štvrtom povrchu senzorického čipu BIAcore bol imobilizovaný IgGl (900 RU) a bol použitý ako negatívny kontrolný povrch na nešpecifickú väzbu. Kinetická analýza bola uskutočňovaná pri rýchlosti prietoku 25 alebo 50 μΙ/minútu a boli určované disociačné (kd alebo k_off) a asociačné (ka alebo k_on) rýchlosti s použitím softvéru poskytnutého výrobcom (BIA evaluation 3.0), ktorý umožnil celkové výpočty.

Príklad 2

Meranie afinity anti-CTLA-4 protilátok

V nasledujúcej tabuľke sú poskytnuté výsledky merania afinity niektorých z protilátok takto vybraných.

Tabuľka I

	Pevná fáza (pomocou BIAcore)
Hybridom	Rýchlosť asociácie Ka (M-1 S1 x 106)	Rýchlosť disociácie Kd (S-1 x IO'4)	Asociačná konštanta KA	Disociačná konštanta KD	Povrchová denzita (RU)
	(1/M) =K,Kdx 1010	(M) = Kd/Ka x IO'10
MoabOl	0,68	1,01	0,67	1,48	878,7
	0,7	4,66	0,15	6,68	504,5
	0,77	6,49	0,19	8,41	457,2
	0,6	3,08	0,2	5,11	397,8
4.1.1	1,85	0,72	2,58	0,39	878,7
	1,88	1,21	1,55	0,64	504,5
	1,73	1,54	1,13	0,88	457,2
	1,86	1,47	1,26	0,79	397,8
4.8.1	0,32	0,07	4,46	0,22	878,7
	0,31	0,23	1,33	0,75	504,5
	0,28	0,06	4,82	0,21	397,8
4.14.3	2,81	3,04	0,92	1,08	878,7
	2,88	3,97	0,73	1,38	504,5
	2,84	6,66	0,43	2,35	457,2
	3,17	5,03	0,63	1,58	397,8
6.1.1	0,43	0,35	1,21	0,83	878,7
	0,46	0,90	0,51	1,98	504,5
	0,31	0,51	0,61	1,63	457,2
	0,45	0,79	0,57	1,76	397,8
3.1.1	1,04	0,96	1,07	0,93	878,7
	0,95	1,72	0,55	1,82	504,5
	0,73	1,65	0,44	2,27	457,2
	0,91	2,07	0,44	2,28	397,8
4.9.1	1,55	13,80	0,11	8,94	878,7
	1,43	19,00	0,08	13,20	504,5
	1,35	20,50	0,07	15,20	397,8
4.10.2	1,00	2,53	0,39	2,54	878,7
	0,94	4,30	0,22	4,55	504,5
	0,70	5,05	0,14	7,21	457,2
	1,00	5,24	0,19	5,25	397,8
2.1.3	1,24	9,59	0,13	7,72	878,7
	1,17	13,10	0,09	11,20	504,5
	1,11	13,00	0,09	11,70	397,8
4.13.1	1,22	5,83	0,21	4,78	878,7
	1,29	6,65	0,19	5,17	504,5
	1,23	7,25	0,17	5,88	397,8

Ako je z údajov vidieť, protilátky pripravené podľa vynálezu majú vysoké afinity a väzobné konštanty.

Príklad 3

Štruktúry anti-CTLA-4 protilátok pripravených podľa vynálezu

V nasledujúcej diskusii sú poskytnuté štrukturálne informácie týkajúce sa protilátok pripravených podľa vynálezov.

Aby sa analyzovali štruktúry protilátok vytvorených podľa vynálezu, naklonovali pôvodcovia gény kódu10 júce fragmenty ťažkého a ľahkého reťazca z konkrétneho hybridómu. Klonovanie génov a sekvenovanie bolo uskutočňované nasledovne:

Poly(A)⁺ mRNA bola izolovaná z približne 2xl0⁵ hybridómových buniek pochádzajúcich z imunizovaných myší XenoMouse s použitím súpravy Fast-Track (Invitrogen). Po vytvorení cDNA s náhodnými primármi nasledovala PCR. Boli použité priméry špecifické na variabilné oblasti rodín ľudských V_H alebo ľud15 ských V_K (Marks et al., Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes, Eur. J. Immunol., 21, 985 až 991, 1991) v spojení s primérmi špecifickými na konštantnú oblasť ľudského C2 (MG-40d, 5-GCTGAG GGAGTAGAGTCCTGAGGA-3) alebo konštantná oblasť C_K (h_KP2, ako je opísané v Green et al., 1994). Sekvencia transkriptu ľudských mAb pochádzajúcich z ťažkého reťazca a reťazca kappa z hybridómov boli získané priamym sekvenovaním produktov PCR vzniknutých z poly(A)⁺ RNA s použitím opísaných primérov. Produkty PCR boli tiež klonované do pCRII s použitím TA klonovacieho kitu (Invitrogén) a obe vlákna boli sekvenované s použitím súprav na sekvenovanie s terminačnou farebnou značkou Prism a prístrojom na sekvenovanie ABI 377. Všetky sekvencie boli analyzované pomocou porovnania s „V BASE sequence directory“ (Tomlinson et al., MRC Centre for Proteín Engineering, Cambrige, UK) s použitím programového Software Mac Vector a Geneworks.

Ďalej bola každá z protilátok 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1 a 6.1.1 podrobená sekvenovaniu kompletnej DNA. Na toto sekvenovanie bola izolovaná poly(A)⁺ mRNA z približne 4xl0⁶ hybridómových buniek s použitím súpravy mRNA Direct kit (Dynal). mRNA bola reverzne prepísaná s použitím oligo-dT(18) a súpravy Advantage RT/PCR kit (Clontech). Bola použitá databáza variabilných oblastí (V Base) na návrh amplifikačných primérov začínajúcich v počiatočnom mieste ATG ťažkého reťazca génu DP50:

5-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3 a k stop kodónu konštantnej oblasti IgG2:

5-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3

Na počiatočné miesto ATG bola pridaná 5'optimálna Kozákova sekvencia (ACCGCCACC). Rovnaká metóda bola použitá na návrh priméru na počiatočné miesto ATG reťazca kappa génu A27: 5-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3 k stop kodónu kapa konštantnej oblasti:

5-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3. 012 cDNA bola klonovaná s použitím priméru na počiatočné miesto ATG:

5-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGCATGAGGGTCCCCGCT-3 a priméru na stop kodón kappa konštantnej oblasti, ktorý bol už uvedený. cDNA ťažkého reťazca boli tiež klonované ako genómové konštrukty miestne cielenou mutagenézou pridaním miesta NheI na koniec variabilnej J-domény a subklonovaním fragmentu NheI obsahujúcim genómové oblasti IgG2 CHl/kĺbová oblasť/CH2/CH3. Bodová mutácia na vznik miesta NheI nemení aminokyselinovú sekvenciu proti sekvencií zárodočnej línie. Páry primérov boli použité na amplifikáciu cDNA s použitím súpravy Advantage High fidelity PCR Kit (Clontech). Sekvencia z PCR bola získaná priamym sekvenovaním použitím sekvenčných súprav s terminačnou farebnou značkou a prístrojom na sekvenovanie ABI. Produkt PCR bol klonovaný do cicavčích expresných vektorov pEE-glutamín-sysntetáza (Lonza) a tri klony boli sekvenované na potvrdenie somatických mutácií. U každého klonu bola sekvencia verifikovaná na oboch vláknach v prinajmenšom troch reakciách. Neglykolyzovaná protilátka 4.1.1 bola vytvorená miestne cielenou mutagenézou N294Q v doméne CH2. Rekombinantné protilátky boli produkované prechodnou transfekciou buniek COS7 v FCS bez IgG a purifikované s použitím štandardných techník Proteín A Sepharose. Stabilné transfekty boli vytvárané elektroporáciou myších buniek NSO a selekcia v médiu bez glutamínu. Rekombinant 4.1.1 s glykozyláciou alebo bez nej prejavoval identickú špecificitu a afinitu na CTLA-4 v in vitro testoch ELISA a BIAcore.

Analýza utilizácie génu

Nasledujúca tabuľka uvádza utilizáciu génu dokázanú vybranými hybridómovými klonmi protilátok podľa vynálezu:

Tabuľka II

Utilizácia génu ťažkého a ľahkého reťazca

Kloň	Ťažký reťazec	Ľahký reťazec
VH	D	JH	VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 alebo DIR3	JH4	A27	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4	A27	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 alebo DIR5rc	JH4	A27	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6	012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6	A10/A26	JK4
4.13.1	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
11.2.1	DP-50	D1-26	JH6	012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 alebo D4	JH6	012	JK3
11.7.1	DP-50	D3-22 alebo D21-9	JH4	012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 alebo DXP4	JH6	A17	JK1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	JH4	A3/A19	JK4
4.9.1	DP-47	5-24 a/alebo 6-19	JH4	L5	JK1

Ako bolo pozorované, protilátky podľa predkladaného vynálezu boli vytvárané so silnou tendenciou na uti32 lizáciu variabilnej oblasti ťažkého reťazca DP-50. Gén DP-50 je tiež odkazovaný do rodiny génov V_H 3-33. Iba jedna protilátka, ktorá bola selektovaná na základe väzby CTLA-4 a predbežných in vitro funkčných testov, dokázala utilizáciu génu ťažkého reťazca iného, než je DP-50. Tento kloň, 2.1.3, používal variabilnú oblasť ťažkého reťazca DP-65 a je izotypu IgG4. Gén DP-65 je tiež odkazovaný do rodiny génu V_H 4-31. Na druhej strane kloň 4.9.1, ktorý má variabilnú oblasť ťažkého reťazca DP-47, viaže CTLA-4, ale neinhibuje väzbu na B7-1 alebo B7-2. U myší XenoMouse je viac než 30 odlišných funkčných variabilných génov ťažkého reťazca DP-47, viaže CTLA-4, ale neinhibuje väzbu k B7-1 alebo B7-2. U myši XenoMouse je viac než 30 odlišných funkčných variabilných génov ťažkého reťazca, na ktoré sa tvoria protilátky. Táto tendencia je teda ukazovateľ preferovaného väzobného motívu v interakcii protilátka-antigén s ohľadom na kombinované vlastnosti väzby k antigénu a funkčnú aktivitu.

Mutačná analýza

Ako bolo vyhodnotené, analýza utilizácie génov poskytuje iba obmedzený prehľad protilátkovej štruktúry. Pretože B-lymfocyty myší XenoMouse náhodne vytvárajú transkripty V-D-J- ťažkého reťazca alebo V-J kappa ľahkého reťazca, je tu celý rad sekundárnych procesov, ktoré sa objavujú, vrátane, ale bez obmedzenia, somatické hypermutácie, n-adícia a CDR3 extenzie (pozri napríklad Mendez et al., Náture Genetics, 15, 146 - 156, 1997, patentová prihláška Spojených Štátov č. 08/759 620, podaná 3. decembra, 1996). V súlade s tým boli na ďalšie skúmanie protilátkové štruktúry vytvárané z cDNA získanej z klonov predikovanej aminokyselinovej sekvencie protilátok. Navyše boli získané prostredníctvom sekvenovania proteínov N-koncové aminokyselinové sekvencie.

Obrázok 1 poskytuje nukleotidové a predikované aminokyselinové sekvencie ťažkých a kappa ľahkých reťazcov z klonov 4.1.1 (obrázok 1A), 4.8.1 (obrázok 1B), 4.14.3 (obrázok IC), 6.1.1 (obrázok ID), 3.1.1 (obrázok IE), 4.10.2 (obrázok 1F), 2.1.3 (obrázok IG), 4.13.1 (obrázok IH), 11.2.1 (obrázok II), 11.6.1 (obrázok 1J), 11.7.1 (obrázok 1K), 12.3.1.1 (obrázok ÍL) a 12.9.1.1 (obrázok IM). Na obrázkoch ΙΑ, 1B a 1D sú uvedené rozšírené sekvencie protilátok 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1 získané klonovaním kompletných cDNA, ako je opísané. Na základe týchto obrázkov sú sekvencie signálneho peptidu (alebo bázy kódujúce to isté) označené hrubo a sekvencie používané na 5'PCR reakcie sú podčiarknuté.

Obrázok 2 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanými aminokyselinovými sekvenciami ťažkého reťazca z klonov 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie DP-50 (3-33). Rozdiely medzi sekvenciami zárodočnej línie DP-50 a sekvenciami z klonov sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozície sekvencií CDR1, CDR2 a CDR3 protilátok ako tieňované.

Obrázok 3 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanou aminokyselinovou sekvenciou ťažkého reťazca klonu 2.1.3 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie DP-65 (4-31). Rozdiely medzi sekvenciami zárodočnej línie DP-65 a sekvenciou z klonu sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozíciu sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky ako podčiarknutú.

Obrázok 4 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanou aminokyselinovou sekvenciou kappa ľahkého reťazca z klonu 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie A27 a sekvenciami z klonu sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozície sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3 protilátok ako podčiarknuté. Zrejmé delécie v CDR klone 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1 sú označené 0.

Obrázok 5 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanou aminokyselinovou sekvenciou kappa ľahkého reťazca z klonu 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 a 11.7.1 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie 012 a sekvencie z klonov sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozície sekvencií CDR1, CDR2 a CDR3 protilátok ako podčiarknuté.

Obrázok 6 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanou aminokyselinovou sekvenciou kappa ľahkého reťazca klonu 2.1.3 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie A10/A26. Rozdiely medzi sekvenciou zárodočnej línie A10/A26 a sekvenciou klonu sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozície sekvencií CDR1, CDR2 aCDR3 protilátok ako podčiarknuté.

Obrázok 7 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanou aminokyselinovou sekvenciou kappa ľahkého reťazca klonu 12.3.1 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie A17. Rozdiely medzi sekvenciou zárodočnej línie A 17 a sekvenciou z klonu sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozície sekvencií CDR1, CDR2 a CDR3 protilátok ako podčiarknuté.

Obrázok 8 poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanou aminokyselinovou sekvenciou kappa ľahkého reťazca klonu 12.9.1 aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie A3/A19. Rozdiely medzi sekvenciou zárodočnej línie A3/A19 a sekvenciou z klonu sú označené hrubým písmom. Obrázok tiež ukazuje pozície sekvencií ODRI, CDR2 a CDR3 protilátok ako podčiarknuté.

Obrázok 22 poskytuje série ďalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencií nasledujúcich antiCTLA-4 protilátkových reťazcov:

4.1.1:

kompletný 4.1.1 ťažký reťazec (cDNA 22(a), genómová 22(b) a aminokyselinová 22(c)) kompletný neglykozylovaný 4.1.1 ťažký reťazec (cDNA 22(d) a aminokyselinová 22(e))

4.1.1 ľahký reťazec (cDNA 22(f) a aminokyselinová 22(g))

4.8.1:

kompletný 4.8.1 ťažký reťazec (cDNA 22(h) a aminokyselinová 22(i))

4.8.1 ľahký reťazec (cDNA 22(j) a aminokyselinová 22(k))

6.1.1:

kompletný 6.1.1 ťažký reťazec (cDNA 22(1) a aminokyselinová 22(m))

6.1.1 ľahký reťazec (cDNA 22(n) a aminokyselinová 22(o))

11.2.1:

kompletný 11.2.1 ťažký reťazec (cDNA 22(p) a aminokyselinová 22(q))

11.2.1 ľahký reťazec (cDNA 22(r) a aminokyselinová 22(s))

Sekvencie signálneho peptidu sú označené hrubým písmom a veľkým textom. Otvorené čítacie rámce kompletnej sekvencie 4.1.1 genómovej DNA (obe 22(b)) sú podčiarknuté. A mutácie zavedené na vytvorenie neglykozylovaného 4.1.1 ťažkého reťazca a výsledná zmena (N294Q) sú označené podčiarknutím a hrubým textom (sekvencia cDNA (obr. 22(b)) a aminokyselinová sekvencia (obr. 22(c)).

Príklad 4

Analýza aminokyselinových substitúcií ťažkého a ľahkého reťazca

Na obrázku 2, ktorý poskytuje porovnanie sekvencií medzi predikovanými aminokyselinovými sekvenciami ťažkého reťazca z klonov 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1,

12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvenciou zárodočnej línie DP-50 (3-33), vyšiel najavo zaujímavý vzor. Navyše k faktu dispozície pre ťažký reťazec DP-50 vo väčšine klonov, existuje relatívne obmedzená hypermutácia v protilátkach príbuzných s génom zárodočnej línie DP-50. Napríklad klony 3.1.1 a 11.2.1 nemali žiadne mutácie. Navyše mutácie v ďalších klonoch sú všeobecne konzervatívne zmeny týkajúce sa substitúcií aminokyselín s podobnými vlastnosťami s aminokyselinami v zárodočnej línii. Mutácie v mnohých sekvenciách CDR1 a CDR2 sú obzvlášť konzervatívnej povahy. Tri ťažké reťazce zobrazené na obrázku 2, 4.10.2, 4.13.1 a 4.14.3, jasne pochádzajú od jedného rekombinantného javu (t. j. pochádzajú z totožného germinálneho centra) a majú takmer totožnú sekvenciu. Ak sú tieto tri považované za jednu sekvenciu, potom z 10 rozdielnych protilátok obsahujúcich DP50 ťažký reťazec sú v CDR1 a CDR2 3 pozície, v ktorých je nepolárny zvyšok nahradený iným nepolárnym zvyškom 12, keď je polárny nabitý zvyšok nahradený iným polárnym nenabitým zvyškom a 1, v ktorej polárny nabitý zvyšok nahradený iným polárnym nabitým zvyškom. Navyše sú dve pozície, v ktorých sú dva zvyšky, ktoré sú veľmi podobné štrukturálne, glycín a alanín, substituovali navzájom. Jedine mutácie, ktoré nie sú striktne konzervatívne, sa týkajú 3 substitúcií polárneho nabitého zvyšku polárnym nenabitým zvyškom a jednej substitúcie nepolárneho zvyšku polárnym zvyškom.

Ľahké reťazce týchto protilátok pochádzajú z 5 rozdielnych génov Vk. Gén A27 je zastúpený najviac a je zdrojom 6 odlišných ľahkých reťazcov. Porovnanie týchto 6 sekvencií odhalilo dve pozoruhodné charakteristické stránky. Po prvé, tri z nich, 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1, obsahujú delécie jedného alebo dvoch zvyškov v CDR1, čo je vzácny jav. Po druhé, existuje silný dôvod proti serínu v pozícii šesť v CDR3 zárodočnej línie a serín je v každej sekvencií nahradený. To svedčí o tom, že serín v tejto pozícii je nekompatibilný s väzbou CTLA-4.

Uznáva sa, že mnoho z identifikovaných aminokyselinových substitúcií existuje v tesnej blízkosti s CDR alebo v CDR. Zdá sa, že tieto substitúcie majú určitý vplyv na väzbu protilátky na molekulu CTLA-4. Ďalej tieto substitúcie by mohli mať významný účinok na afinitu protilátok.

Príklad 5

Analýza N-koncovej aminokyselinovej sekvencie protilátok podľa vynálezu

Aby sa ďalej verifikovalo zloženie a štruktúra identifikovaných protilátok podľa vynálezu, sekvenovali pôvodcovia niekoľko týchto protilátok s použitím sekvenčného prístroja Perkin-Elmer. Boli izolované oba, ťažký a kappa ľahký reťazec protilátok a purifikované prostredníctvom preparatívnej gélovej elektroforézy a elektroprenosu a potom priamo sekvenované, ako je opísané v príklade 6. Väčšina sekvencií ťažkého reťazca bola blokovaná na svojom aminokonci. Tieto protilátky boli teda najskôr ošetrené pyroglutamátaminopeptidázou, a potom sekvenované.

Výsledky tohto pokusu sú ukázané na obrázku 9. Obrázok 9 tiež poskytuje molekulovú hmotnosť ťažkého a ľahkého reťazca, ako boli určené hmotnostnou spektroskopiou (MALDI).

Príklad 6

Ďalšia charakterizácia protilátok podľa vynálezu

Obrázok 10 poskytuje niektoré ďalšie charakteristické informácie o určitých protilátkach podľa vynálezu. Na obrázku sú sumarizované údaje týkajúce sa klonov 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1. Sú poskytnuté nasledujúce údaje: koncentrácia, izoelektronické zaostrovanie (focusing) (IEF), SDS-PAGE, vylučovacia chromatografia, FACS, hmotnostná spektroskopia (MALDI) a N-koncové sekvencie ľahkého reťazca.

Údaje všeobecne boli získavané nasledovne:

Materiál a metódy:

Proteínová koncentrácia bola zisťovaná pri 280 nm z UV skenu (200 až 350 nm), keď 1,58 jednotky absorbancie pri 280 nm zodpovedalo 1 mg/ml.

SDS-PAGE bola uskutočňovaná s použitím elektorforetického systému s 10 % gélom NuPAGE a pracovným pufrom MES. Vzorky boli pripravené riedením 3 : 1 so 4x pufrom NuPAGE pre vzorky (+/-), betamerkaptoetanolom, zahriatím a na gél bolo nanesené ~5 g proteínu. Gél bol potom farbený farbiacom roztokom Brilliant Blue R (Sigma kat. č. B-6529) a molekulové hmotnosti boli vyhodnotené porovnaním ofarbených pásov so štandardmi Perfect Protein Markers (Novagen kat. č. 69149-3).

Na N-koncové sekvenovanie boli vzorky delené tak, ako je uvedené, na géloch NuPAGE, prenesené na imobilizačnú membránu Pro Blot (Applied Biosystems), a potom zafarbené modrou Coomasie Blue R-250. Zafarbené proteínové pásy boli vyrezané a podrobené sekvenčnej analýze pomocou automatizovanej Edmanovej degradácie na sekvenčnom prístroji Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer.

Izoelekrické zaostrovanie (IEF) bolo uskutočňované použitím gélu Pharmácia IEF 3-9 pHast (kat. č. 17-0543-01). Vzorky boli nariedené 10 % glycerolom na koncentráciu ~0,8 mg/ml a 1 μΐ bol nanesený na gél a potom zafarbený. Hodnoty pl potom boli vyhodnotené porovnaním zafarbených pásov so štandardmi IEF na široké rozmedzie (pH 3 až 10) (Pharmacia, kat. C. 17-0471-01).

Vylučovacia chromatografia (SEC) bola uskutočňovaná vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi (PBS) na systéme SMART Pharmacia s použitím kolóny Superdex 75 PC 3.2/30. Molekulové hmotnosti boli vyhodnotené porovnaním retenčného času gélu.

Na štúdie FACS boli pripravené ľudské periférne T-lymfocycty a 48 hodín stimulované. T-lymfocyty boli jedenkrát premyté, rozsuspendované v FACS pufri v množstve lxlO⁶ buniek/100 μΐ a farbené na povrchovú expresiu CD3 s 10 μΐ anti-CD3-FITC (Imunotech, Marseille, Francúzsko) počas 30 minút pri teplote miestnosti. Bunky boli premyté dvakrát, potom fixované, permeabilizované (Fix and Perm, Caltag) a zafarbené na intracelulárnu expresiu CTLA-4 s 10 μΐ anti-CD152-PE (Pharmingen). Prietoková cytometria bola uskutočňovaná s použitím prístroja FACsort Becton Dickinson. Kvadranty boli stanovené analýzou relevantných izotypových kontrolných protilátok (Caltag).

Ako už bolo diskutované, bolo dokázané, že anti-CTLA protilátky majú spoľahlivú silnú imunomodulačnú aktivitu. Nasledujúce pokusy boli uskutočňované preto, aby sa určilo, či protilátky podľa predkladaného vynálezu majú túto aktivitu. Pokusy boli všeobecne navrhnuté na stanovenie schopnosti protilátok inhibovať interakciu medzi molekulami CTLA-4 a B7. Byť selektívne na molekuly CTLA-4, B7 a CD28 a podporovať produkciu cytokínov T-lymfocytmi vrátane, ale bez obmedzenia, expresie IL-2 a/alebo IFN-γ. Ďalej sa vyšetrovala skrížená reaktivita protilátok podľa vynálezu s niektorými ľudskými tkanivami a molekulami CTLA-4 iných živočíšnych druhov (napr. myší a primátov).

Príklad 7

Kompetitívna ELISA: inhibícia interakcie CTLA-4/B7-1 alebo B7-2 protilátkami podľa vynálezu

Bol uskutočnený in vitro test, aby sa určilo, či boli protilátky podľa predkladaného vynálezu schopné inhibície väzby CTLA-4 s B7-1 alebo B7-2. Ako bolo uznané, očakáva sa, že protilátky podľa vynálezu, ktoré sú schopné inhibovať väzbu CTLA-4 s molekulami B7, sú kandidátmi na reguláciu imunity prostredníctvom metabolickej dráhy CTLA-4. V teste boli použité nasledujúce materiály a metódy:

Materiály a metódy

96-jamkové doštičky MaxiSorp boli potiahnuté 3 nM B7.1-Ig(Gl) alebo B7.2-Ig(Gl) (Repligen, Inc. Needham, MA) v Dulbeccovej PBS a inkubované pri 4 °C cez noc. Na druhý deň bol B7-Ig odstránený a doštičky boli blokované 1 % BSA s 0,05 % Tween-20 v D-PBS počas dvoch hodín. Doštičky boli premyté 3x premývacím pufrom (0,05 % Tween-20 v D-PBS). Protilátky v príslušných testovaných koncentráciách a CTLA-4-Ig(G4) (0,3 nM konečná koncentrácia) (Repligen, Inc. Needham, MA) boli vopred miešané počas 15 minút, a potom pridané na doštičku potiahnutú B7-Ig (60 μΐ celkový objem) a inkubované pri teplote miestnosti 1,5 hodiny. Doštičky boli premyté 3x a bolo pridané 50 μΐ riedenie 1 až 1000 myšej protiľudskej protilátky IG4 konjugovanej s HRP (Zymed, San Francisco, CA, č. 05-3820) a doštičky boli inkubované 20 minút pri teplote miestnosti, a potom bolo na doštičku pridané 50 μΐ IN H2SO4. Doštičky boli odčítané pri 450 nm s použitím odčítacieho zariadenia na doštičky od Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Všetky vzor35 ky boli testované v duplikátoch. Maximálny signál bol definovaný, ako väzba bola definovaná ako absorbancia v neprítomnosti CTLA-4-Ig a testovanej protilátky.

Výsledky testu sú uvedené v tabuľkách IIIA a IIIB. V tabuľke IIIA sú výsledky uvedené na celý rad protilátok podľa vynálezu. V tabuľke IIB sú uvedené výsledky porovnávajúce protilátku 4.1.1 podľa vynálezu s protilátkou 11.2.1 podľa vynálezu zo samostatného pokusu.

Tabuľka IIIA

Kloň CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA-4/B7.2 Kom. ELISA IC50 (nM)	CTLA-4/B7.1 Kômp. Elisa IC50 (nM)
CT3.1.1	IgG2	0,45 0,07 (n = 3)	0,63 0,10 (n = 2)
CT4.1.1	IgG2	0,38 0,06 (n = 5)	0,50 0,05 (n = 2)
CT.8.1	IgG2	0,57 0,03 (n = 3)	0,17 0,28 (n = 2)
CT4.9.1	IgG2	Nekompetitívna (n = 3)	Nekompetitívna (n = 2)
CT4.10.2	IgG2	1,50 0,37 (n = 3)	3,39 0,31 (n = 2)
CT4.13.1	IgG2	0,49 0,05 (n = 3)	0,98 0,11 (n = 2)
CT4.14.3	IgG2	0,69 0,11 (n = 3)	1,04 0,15 (n = 2)
CT6.1.1	IgG2	0,39 0,06 (n = 3)	0,67 0,07 (n = 2)

Tabuľka IIIB

Kloň CTLA-4-Ig	Izoptyp	CTLA-4/B7.2 Kômp. ELISA IC50 (nM)	CTLA-4/B7.1 Kômp. ELISA IC50 (nM)
CT4.1.1	IgG2	0,55 0,08 (n = 4)	0,87 0,14 (n = 2)
CTI.2.1	IgG2	0,56 0,05 (n = 4)	0,81 0,24 (n =2)

Príklad 8

Pomer selektivity protilátok podľa vynálezu k CTLA-4 v porovnaní s CD28 alebo B7-2

Uskutočnil sa ďalší in vitro test, aby sa určila selektivita protilátok podľa vynálezu vzhľadom na CTLA-4 buď proti CD28, alebo B7-2. V pokusoch boli použité nasledujúce materiály a metódy.

ELISA na selektivitu CTLA-4:

Materiály a metódy

96-jamková doštička FluroNUNC (Nunc kat. č. 475515) bola potiahnutá štyrmi antigénmi: CTLA-4/Ig, CD44/Ig, CD28/Ig a B7.2/Ig (antigény vytvorené vo vlastnom laboratóriu). Doštička bola poťahovaná cez noc pri 4 °C antigénmi v koncentrácii 1 g/ml v množstve 100 μΙ/jamku v 0,lM pufri hydrogénuhličitanu sodného, pH 96. Doštička bola potom premytá s PBST (PBS + 0,1 % Tween-20) trikrát s použitím umývačky doštičiek NUNC. Doštička bola blokovaná s PPBST + 0,5 % BSA v množstve 150 μΙ/jamku. Doštička bola inkubovaná pri teplote miestnosti počas 1 hodiny a potom premytá trikrát s PBST. Potom boli nariedené antiCTLA-4 protilátky podľa vynálezu en bloc v lg/ml a boli pridané na doštičku. Doštička bola inkubovaná pri teplote miestnosti počas 1 hodiny a potom premytá trikrát s PBST. Jamky, ktoré obsahovali protilátky podľa vynálezu, potom boli ošetrené 100 μΙ/jamku protiľudským IgG2-HRP (Souther Biotech kat. č. 9070-05) v riedení 1 : 4000 en bloc. Jeden rad bol tiež ošetrený protiľudským IgG (Jackson kat. č. 209-035-088) na normalizáciu potiahnutia doštičky. Táto protilátka bola nariedená 1 : 5000 en bloc a pridaná v množstve 100 μΙ/jamku. Jeden rad bol tiež ošetrený protiľudským CTLA-4-HRP (Pharmingen, kat. č. 345815/konjugované s HRP na prianie zákazníka) ako pozitívna kontrola. Táto protilátka bola použitá v množstve 0,05 g/ml riedená en bloc. Doštička bola inkubovaná pri teplote miestnosti počas 1 hodiny a potom premytá trikrát s PBST. LBA chemiluminiscenčný substrát (Pierce) bol pridaný v množstve 100 μΙ/jamku a doštička bola inkubovaná na trepačke doštičiek 5 minút. Doštička bola potom odčítaná s použitím zobrazovacieho zariadenia luminiscencie po 2 minútovej expozícii.

Test selektivity väzby IGEN na CTLA-4:

Materiál a metódy

Perličky M-450 Dynabeads (Dynal A. S., Oslo, Nórsko, č. 140.02) boli premyté 3x pufrom fosfátu sodného, pH 7,4 a rozsuspendované v pufri fosfátu sodného. K 100 μΐ perličiek bol pridaný 1,0 g CTLA-4-Ig (Gl), 1,0 g CD28-Ig(Gl) alebo 1,0 až 3,0 g B7.2-Ig (Gl) (Repligen, Inc. Needham, MA) a boli inkubované cez noc na rotačnej trepačke pri 4 °C. Na druhý deň boli perličky premyté 3x v 1 % BSA plus 0,05 % Tween20 v Dulbeccovom PBS a blokované 30 minút. Perličky boli nariedené 1 až 10 blokovacím pufrom a 25 μΐ potiahnutých perličiek bolo dané do polypropylénových skúmaviek 12x75 nm. Všetky vzorky boli testované duplikované. Do skúmaviek bolo pridané 50 μΐ testovanej protilátky (výsledná koncentrácia 1 g/ml) alebo blokujúceho pufra a inkubovaného 30 minút na karuzelovom páse analyzátora Origen 1,5 (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) pri teplote miestnosti, vortexované 100 rpm. Do skúmaviek bolo pridané 25 μΐ myšej protiľudskej IgGl, IgG2 alebo IgG4 s ruténiom (Zymed, Inc., San Francisco, CA, č. 05-3300, 05-3500 a 05-3800) (výsledná koncentrácia 3 g/ml v 100 μΐ celkového objemu). Skúmavky boli inkubované 30 minút pri teplote miestnosti na karuzelovom páse, vortexované 100 rpm. Bolo pridané 200 μΐ pufra testu Origen (IGEN International, Inc., Gaitheesburg, MD, č. 402-050-03) do každej skúmavky, krátko vortexované a potom boli skúmavky odčítané na analyzátore Origen a na každú skúmavku boli určené jednotky ECL (elekrochemiluminiscencie). Boli zaistené normalizačné faktory na opravu odchýlok väzby fúznych proteínov na perličky Dynabeads a jednotky ECL boli korigované na nešpecifickú väzbu pred výpočtom stupňa selektivity.

Výsledky testov sú uvedené v tabuľkách IVA a IVB.

Tabuľka IVA

Kloň	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/CD44 IGEN	CTLA4/CD28 IGEN	CTLA4/B7.2 IGEN
3.1.1	IgG2	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 2)	>500 : 1 (n = 1) 195 : 1 (n= 1)
4.1.1	IgG2	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 2) 485 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 1) 261 : 1 (n= 1)	>500 : 1 (n = 1) 107 : 1 (n = 1)
4.8.1	IgG2	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 2) 190: 1 (n= 1)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 2)	>500 : 1 (n = 2)
4.9.1	IgG2	>500 : 1 (n = 2) 244 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 2) 33 : 1 (n= 1)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 11
4.10.2	IgG2	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 1)
4.13.1	IgG2	>500 : 1 (n = 2) 46 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 1) 329 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n=2)
4.14.3	IgG2	>500 : 1 (n = 2) 80 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 2) 10 : 1 (n= 1)	>500 : 1 (n = 2) 126 : 1 (n= 1)	>413 : 1 (n= 1)	>243 : 1 (n = 1)
6.1.1	IgG2	>500 : 1 (n = 2) 52 : 1 (n = 1)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 2)	>500 : 1 (n = 2)

Tabuľka IVB

Kloň	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hIgG ELISA
4.1.1	IgG2	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 2)	>500 : 1 (n = 3)
11.2.1	IgG2	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)	>500 : 1 (n = 3)

Príklad 9

Model bunkového signálu ľudských T-lymfocytov

Na ďalšie vymedzenie aktivity protilátok podľa vynálezu pri pôsobení ako regulátora imunity, vyvinuli pôvodcovia niektoré testy T-lymfocytov, aby sa kvantifikovalo zvýšenie produkcie IL-2 T-lymfocytov pri blokovaní CTLA-4 signálu protilátkami. Pri týchto pokusoch boli použité nasledujúce materiály a metódy:

Materiály a metódy

Čerstvo izolované ľudské T-lymfocyty boli pripravené a použitím Histopaque (Sigma, St Louis, MO č. A-70543) a T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, č. LK-50-T) a stimulované s PHA (1 g/ml) (purifikovaný fytohemaglutinín, Murex Diagnostics Ltd., Dartford, England, č. HA 16) v médiu (PPMI 1640 obsahujúcom L-glutamín, MEM neesenciálnej aminokyseliny, epnicilín, streptomycín, 25 mM HEPES a 10 % FBS) v koncentrácii lxlO⁶ buniek/ml a inkubované pri 37 °C 2 dni. Bunky boli premyté a nariedené médiom na 2xl0⁶ buniek/ml. Bunky Raji (Burkitov Lynfóm, ľudský ATCC č.: CCL 86 Class II American Type Culture Collection, Rockville, MD) boli ošetrené mitomycínom C (Sigma, St. Louis, MO, č. M-4287) (25 g/ml) jednu hodinu pri 37 °C. Bunky Raji boli premyté 4x v PBS a rozsuspendované v množstve 2xl0⁶ buniek/ml. Ľudské T-lymfoblasty (5xl0⁵/ml), bunky Raji (5xl0⁵/ml) a anti-CTLA-4 protilátky alebo kontrolná protilátka súhlasného izotypu v rôznych koncentráciách boli pridané na 96-jamkové mikrotitračné doštičky a boli inkubované pri 37 °C 72 hodín. Celkový objem jamky bol 200 μΐ. 72 hodín po stimulácii boli doštičky stočené a supernatant bol odstránený a zamrazený na neskoršie zisťovanie IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, MN, č. D 2050) a IFN-γ (Quantikine IFN-γ ELISA kit, R&D Systems). Zvýšenie cytokínov bolo definované ako rozdiel medzi hladinami cytokínov v tkanivových kultúrach obsahujúcich anti-CTLA-4 blokujúci mAb proti kontrolnej protilátke súhlasného izotypu. Na experimenty s prietokovou cytometriou boli bunky Raji premyté lx pufrom FCS (PBS obsahujúci 2 % teplom inaktivované FCS, 0,025 % azid sodný). Bunkové pelety boli rozsusependované v pufri FACS v množstve lxlO⁶ buniek/100 μΐ a inkubované s 10 μΐ anti-CD80-PE (Becton Dickinson, San Josse, CA) alebo anti-CD86-PE (Pharmigen, San Diego) počas 30 minút pri teplote miestnosti. Bunky boli premyté dvakrát a rozsuspendované v 1 ml pufru FACS. Prietoková cytometria bola uskutočňovaná s použitím prístroja Becton Dickinson FACSort. Histogramové markery boli nastavené analýzou relevantných izotypových kontrolných protilátok (Caltag, Burlingame, CA).

Pôvodcovia všeobecne vyvinuli test, ktorý môže byť použitý na rýchle určenie aktivácie IL-2 T-lymfocytmi. Ako bolo uznané, stimulácia T-lymfocytov je závislá na B7 a CD28. Navyše premyté T-blasty netvorili zistiteľný IL-2 a bunky Raji netvorili zistiteľný IL-2, dokonca ani keď boli stimulované LPS alebo PWM. Ale v kombinácii T-blasty spoločne pestované s bunkami Raji môžu modelovať signálne javy B7, CTLA-4 a CD28, a teda môže na nich byť hodnotený účinok protilátok.

Obrázok 11 ukazuje expresiu B7-1 a B7-2 na bunkách Raji pri použití anti-CD80-PE a anti-CD86-PE mAb a s použitím prietokovej cytometrie (FACS), ako je opísané v príklade 6.

Obrázok 12 ukazuje na koncentrácii závislé zvýšenie produkcie IL-2 v teste s T-lymfoblastami/Raji indukované protilátkami blokujúcimi CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) a 4.1.1, 4.8.6 a 6.1.1 protilátkami podľa vynálezu).

Obrázok 13 ukazuje na koncentráciu závislej zvýšenej produkcie IFN-γ v teste s T-lymfoblastami/Raji indukovanej protilátkami blokujúcimi CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) a 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1 protilátkami podľa vynálezu) (rovnaké darcovské T-lymfocyty).

Obrázok 14 ukazuje priemerné zvýšenie produkcie IL-2 v T-lymfocytoch od 6 darcov indukovanej protilátkami blokujúcimi CTLA-4 v teste s T-lymfoblastami/Raji. Je zaujímavé zvážiť, že mAb CT4.9.1 sa viaže na CTLA-4, ale neblokuje väzbu B7. Teda iba samotná väzba na CTLA-4 nepostačuje sama zaistiť funkčnú protilátku podľa vynálezu.

Obrázok 15 ukazuje priemerné zvýšenie produkcie IFN-γ v T-lymfocytoch od 6 darcov indukovanej protilátkami blokujúcimi CTLA-4 v teste s T-lymfoblastami/Raji.

Obrázok 19 ukazuje porovnanie medzi 4.1.1 a 11.2.1 protilátkami podľa vynálezu v koncentrácii 30 g/ml v 72 hodinovom teste s T-lymfoblastami/Raji, ako bolo opísané v príklade 10.

Obrázok 20 ukazuje na koncentrácii závislé zvýšenie produkcie IL-2 v teste s T-lymfoblastami/Raji indukovanej 4.1.1 a 11.2.1 CTLA-4 protilátkami podľa vynálezu.

Nasledujúca tabuľka IVC poskytuje informáciu týkajúcu sa priemerného zvýšenia a rozsahu zvýšenia cytokínovej odpovede v testoch Raji a SEA podľa vynálezu. Každý z týchto pokusov zahrnutý vo výsledkoch je založený na protilátke v dávke 30 g/ml a meraný v 72 hodinách. Uvedené sú počty darcov zúčastnených v pokusoch ako aj odpovede.

Tabuľka IVC

Test	mAb	Cytokín	Priemerné zvýšenie pg/ml	SEM	Rozsah zvýšenia pg/ml	n	Reakcia darcov
T-lymfoblasty/Raj i	4.1.1	IL-2	3329	408	0 až 8861	42	19 z 21
T-lymfoblasty/Raj i	4.1.1	IFN-γ	3630	980	600 až 13939	17	13 z 13
T-lymfoblasty/Raj i	11.2.1	IL-2	3509	488	369 až 6424	18	14 z 14
SEA (PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 až 6699	42	17 z 17
SEA (PBMC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147 až 8360	25	15 z 15
SEA (úplná krv)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168 až 18417	46	15 z 17
SEA (úplná krv)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111 až 11803	25	12 z 14

Príklad 10

Model signálov T-lymfocytov u človeka

Pôvodcovia vyvinuli druhý bunkový test, aby sa kvantifikovalo zvýšenie aktivácie IL-2 T-lymfocytov pri blokovaní signálu CTLA-4 protilátkami. Pri týchto pokusoch boli použité nasledujúce materiály a metódy:

Materiály a metódy

Ľudské PBMC boli pripravené s použitím Accuspin. Mikrotitračné doštičky boli vopred potiahnuté s antiCD3 protilátkou (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) a inkubované 2 hodiny pri 37 °C. Do jamiek boli pridané hPBMC v množstve 200 000 buniek na jamku. Do jamiek bol pridaný stafylokokový enterotoxín A (SEA) (Sigma) v koncentrácii 100 ng/ml. Do jamiek boli pridané protilátky, obyčajne v koncentrácii 30 g/ml. Potom boli bunky stimulované 48, 72 alebo 96 hodín. Doštičky boli stočené v požadovanom časovom bode a z jamiek bol odstránený supematant. Potom bola v supematante vyšetrovaná produkcia IL-2 s použitím ELISA (R&D Systems).

Výsledky z týchto pokusov sú ukázané na obrázkoch 16, 17 a 21. Na obrázku 16 bola meraná indukcia produkcie IL-2 v hPBMC od 5 darcov 72 hodín po stimulácii. Na obrázku 17 sú ukázané výsledky z merania úplnej krvi rozoberajúci rozdiel v indukcii produkcie IL-2 v krvi 3 darcov, ako bola meraná 72 a 96 hodín po stimulácii.

Na obrázku 21 je zvýšenie produkcie IL-2 v úplnej krvi 2 darcov, merané 72hodín po stimulácii.

Príklad 11

Model nádorov u zvierat

Pôvodcovia nastolili model nádoru u zvierat na in vivo analýzu protimyších CTLA-4 protilátok pri inhibícii nádorového rastu. V tomto modeli nádoru je pestovaný myší fibrosarkóm a zvieratá sú ošetrované proti10 myšími CTLA-4 protilátkami. Materiál a metódy zavedenia modelu sú poskytnuté ďalej:

Materiál a metódy

Samiciam myší A/J (vo veku 6 až 8 týždňov) boli podané subkutánne injekcie do dorzálnej strany krku s 0,2 ml nádorových buniek SalN (lxlO⁶) (Baskar 1995). Intraperitonálna injekcia bola podaná protimyšej

CTLA-4 lebo kontrolná protilátka súhlasného izotypu (Phramingen, San Diego, CA, 200 g/zviera) v dňoch 0, 4, 7 a 14 po injekcii nádorových buniek. Nádor bol meraný v priebehu 3 až 4 týždňov pokusu s použitím elektronického kapileru Starrett SPC Plus (Athol, MA) a veľkosť nádoru bola vyjadrená ako povrchová oblasť postihnutá rastom nádoru (mm²).

Obrázok 18 ukazuje inhibíciu nádorového rastu pri protimyšej CTLA-4 protilátke v modeli nádoru my20 šieho fibrosarkómu. Ak je ukázané na obrázku 18, u zvierat ošetrených s anti-CTLA-4 nastala redukcia nádorového rastu v porovnaní so zvieratami ošetrenými izotypovou kontrolnou protilátkou. Podľa toho sú protimyšie CTLA-4 mAb schopné inhibovať rast fibrosarkómu v modeli myšieho nádoru.

Možno očakávať, že protilátky, ktoré reagujú skrížené s myším CTLA-4, sa budú v tomto modeli správať podobne. Ale žiadna z protilátok podľa vynálezu, u ktorých bola skúmaná skrížená reaktivita, nereaguje skrí25 žene s myším CTLA-4.

Príklad 12

Model nádoru u zvierat

Aby sa dala skúmať aktivita protilátok podľa vynálezu, bol navrhnutý model xenoimplantátu myší SCID na testovanie eradikácie zistených nádorov a ich metastáz. V tomto modeli sú myším SCID podané ako štep ľudské T-lymfocyty a myšiam sú implantované bunky pochádzajúce z veľkobunkového pľúcneho karcinómu (NSCL) alebo kolorektáleneho (CC) karcinómu pacientov. Implantácia sa uskutočňuje do tukových vankúšikov v gonádach myší SCID. Tumory sa ponechajú rásť, a potom sa odstránia. U myší sa rozvinuli nádorové metastázy pečene podobné ľudskému nádoru. Tento model je opísaný v práci Bumpers et al., J. Surgical

Res., 61, 282-288, 1996).

Očakáva sa, že protilátky podľa vynálezu budú inhibovať rast nádorov tvorený u týchto myší.

Zoznam sekvencii

Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie sú uvádzané vo forme zoznamu podľa WIPO štandardu 25.

Všetky uvedené sekvencie sú ľudského pôvodu v opisnom poli <213> anglický termín human označuje zdroj sekvencie Homo sapiens.

<210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 1

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Val

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

His

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

íle 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg 75

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala 80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

90 95

Thr

Leu

Phe

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

115 Thr

Leu

Val

Thr

Val

120 Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

125 Lys

Gly

Pro

Ser

Val

130 Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

135 Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

140 Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145 Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

150 Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

155 Pro

Glu

Pro

Val

Thr

160 Val

Ser

Trp

Asn

Ser

165 Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

170 Gly

Val

His

Thr

Phe

175 Pro

Ala

Val

Leu

Gin

180 Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

185 Ser

Leu

Ser

Ser

Val

190 Val

Thr

Val

Pro

Ser

195 Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

200 Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

205 Asn

Val

Asp

His

Lys

210 Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

215 Val

Asp

Lys

Thr

Val

220 Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225 Val

Glu

Cys

Pro

Pro

230 Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

235 Val

Ala

Gly

Pro

Ser

240 Val

Phe

Leu

Phe

Pro

245 Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

250 Thr

Leu

Met

íle

Ser

255 Arg

Thr

Pro

Glu

Val

260 Thr

Cys

Val

Val

Val

265 Asp

Val

Ser

His

Glu

270 Asp

Pro

Glu

Val

Gin

275 Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

280 Asp

Gly

Val

Glu

Val

285 His

Asn

Ala

Lys

Thr

290 Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

295 Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

300 Phe

Arg

Val

Val

Ser

305 Val

Leu

Thr

Val

Val

310 His

Gin

Asp

Trp

Leu

315 Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

320 Lys

Cys

Lys

Val

Ser

325 Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

330 Ala

Pro

íle

Glu

Lys

335 Thr

íle

Ser

Lys

Thr

340 Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

345 Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

350 Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

355 Arg

Glu

Glu

Met

Thr

360 Lys

Asn

Gin

Val

Ser

365 Leu

Thr

Cys

Leu

Val

370 Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

375 Ser

Asp

íle

Ala

Val

380 Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385 Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

390 Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

395 Pro

Pro

Met

Leu

Asp

400 Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

405 Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

410 Leu

Thr

Val

Asp

Lys

415 Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

420 Gly

Asn

Val

Phe

Ser

425 Cys

Ser

Val

Met

His

430 Glu

Ala

Leu

His

Asn

435 His

Tyr

Thr

Gin

Lys

440 Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

445 Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 2 <211>464 <212> PRT <213> Human

<400> 2

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn 50

Tyr

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65 Asp

Ser

Val

Lys

Gly

70 Arg

Phe

Thr

íle

Ser

75 Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

80 Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

85 Gin

Met

Asn

Ser

Leu

90 Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

95 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

100 Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

105 Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

110 Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

115 Gly

Thr

Leu

Val

Thr

120 Val

Ser

Ser

Ala

Ser

125 Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130 Val

Phe

Pro

Leu

Ala

135 Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

140 Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145 Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

150 Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

155 Phe

Pro

Glu

Pro

Val

160 Thr

Val

Ser

Trp

Asn

165 Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

170 Ser

Gly

Val

His

Thr

175 Phe

Pro

Ala

Val

Leu

180 Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

185 Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

190 Val

Val

Thr

Val

Pro

195 Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

200 Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

205 Cys

Asn

Val

Asp

His

210 Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

215 Lys

Val

Asp

Lys

Thr

220 Val

Glu

Arg

Lys

Cys

225 Cys

Val

Glu

Cys

Pro

230 Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

235 Pro

Val

Ala

Gly

Pro

240 Ser

Val

Phe

Leu

Phe

245 Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

250 Asp

Thr

Leu

Met

íle

255 Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

260 Val

Thr

Cys

Val

Val

265 Val

Asp

Val

Ser

His

270 Glu

Asp

Pro

Glu

Val

275 Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

280 Val

Asp

Gly

Val

Glu

285 Val

His

Asn

Ala

Lys

290 Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

295 Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

300 Thr

Phe

Arg

Val

Val

305 Ser

Val

Leu

Thr

Val

310 Val

His

Gin

Asp

Trp

315 Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

320 Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

325 Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

330 Pro

Ala

Pro

íle

Glu

335 Lys

Thr

íle

Ser

Lys

340 Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

345 Arg

Glu

Pro

Gin

Val

350 Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

355 Ser

Arg

Glu

Glu

Met

360 Thr

Lys

Asn

Gin

Val

365 Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370 Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

375 Pro

Ser

Asp

íle

Ala

380 Val

Glu

Trp

Glu

Ser

385 Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

390 Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

395 Thr

Pro

Pro

Met

Leu

400 Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

405 Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

410 Lys

Leu

Thr

Val

Asp

415 Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

420 Gin

Gly

Asn

Val

Phe

425 Ser

Cys

Ser

Val

Met

430 His

Glu

Ala

Leu

His

435 Asn

His

Tyr

Thr

Gin

440 Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

445 Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 3 <211> 163 <212> PRT <213> Human

<400> 3

Pro Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1

5

10

15

Ser Ser

His

Gly

íle

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

25 30

Glu

Trp

Val 35

Ala

Val

íle

Trp

Tyr 40

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys 45

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Lys

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

145

150

155

160

Val

Leu

Gin

<210>4 <211> 463 <212> PRT <213> Human

<400> 4

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Glu

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

Tyr

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

íle 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser 75

Asn

Lys

His

Tyr

Ala 80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

íle

Ser 90

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu 120

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp 125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly 130

Thr

Leu

Val

Thr

Val 135

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr 140

Lys

Gly

Pro

Ser

Val 145

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 150

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr 155

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala 160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu 165

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Glu

Pro

Val

Thr 175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser 180

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin 195

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr 200

Ser

Leu

Ser

Ser

Val 205

Val

Thr

Val

Pro

Ser 210

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr 215

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys 220

Asn

Val

Asp

His

Lys 225

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys 230

Val

Asp

Lys

Thr

Val 235

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys 240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 260

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 265

Thr

Leu

Met

íle

Ser 270

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275 280 285

Val

Gin 290

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 295

Asp

Gly

Val

Glu

Val 300

His

Asn

Ala

Lys

Thr 305

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 310

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr 315

Phe

Arg

Val

Val

Ser 320

Val

Leu

Thr

Val

Val 325

His

Gin

Asp

Trp

Leu 330

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 340

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro 345

Ala

Pro

íle

Glu

Lys 350

Thr

íle

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser 370

Arg

Glu

Glu

Met

Thr 375

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 380

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 385

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 390

Ser

Asp

íle

Ala

Val 395

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 410

Pro

Pro

Met

Leu

Asp 415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 420

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 425

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 430

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 435

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 440

Cys

Ser

Val

Met

His 445

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Human

<400> 5 Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

Val

Ala

25 Val

íle

Trp

Tyr

Asp

30 Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 íle

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

75 Ala

Arg

íle

íle

Thr

80 Pro

Cys

Met

Asp

Val

85 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

90 Thr

Val

Thr

Val

Ser

95 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

100 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

105 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

110 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

120 Leu

Gly

Cys

Leu

Val

125 Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130 Glu

Pro

Val

Thr

Val

135 Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

140 Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145 Val

His

Thr

Phe

Pro

150 Ala

Val

Leu

Gin

155

160

165 <210> 6 <211> 157 <212> PRT <213> Human

<400> 6

Gly Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly Phe

íle

Phe

Ser

Ser

His

Gly

íle

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

25 30

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

íle

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210>7 <211> 172 <212> PRT <213> Human

<400> 7 Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gin

íle

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

1 Thr

Val

Ser

Gly

5 Gly

Ser

íle

Ser

Ser

10 Gly

Gly

His

Tyr

Trp

15 Ser

Trp

He

Arg

Gin

20 His

Pro

Gly

Lys

Gly

25 Leu

Glu

Trp

íle

Gly

30 Tyr

íle

Tyr

Tyr

íle

35 Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

40 Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

45 Ser

Arg

Val

Thr

íle

50 Ser

Val

Asp

Thr

Ser

55 Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

60 Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

65 Val

Thr

Ala

Ala

Asp

70 Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

75 Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

80 Gly

Asp

Tyr

Tyr

Gly

85 íle

Asp

Val

Trp

Gly

90 Gin

Gly

Thr

Thr

Val

95 Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100 Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

105 Ser

Val

Phe

Pro

Leu

110 Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

115 Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

120 Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

125 Cys

Leu

Val

Lys

Asp

130 Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

135 Val

Thr

Val

Ser

Trp

140 Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145 Thr

Ser

Gly

Val

His

150 Thr

Phe

Pro

Ala

Val

155 Leu

Gin

160

165 170 <210> 8 <211> 153 <212> PRT <213> Human

<400> 8

Pro 1

Gly

Arg

Ser

Leu 5

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala 10

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

Gly 20

íle

His

Trp

Val

Arg 25

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys 30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val 35

Ala

Val

íle

Trp

Tyr 40

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys 45

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser 50

Val

Lys

Gly

Arg

Phe 55

Thr

íle

Ser

Arg

Asp 60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65 Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

70 Val

Ala

Pro

Leu

Gly

75 Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

80 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

85 Val

Thr

Val

Ser

Ser

90 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

95 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

100 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

105 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

110 Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

115 Gly

Cys

Leu

Val

Lys

120 Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

125 Pro

Val

Thr

Val

Ser

130 Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

135 Leu

Thr

Ser

140

145 150 <210> 9 <211> 167 <212> PRT <213> Human

<220>

<400> 9 Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

Val

Ala

25 Val

íle

Trp

Tyr

Asp

30 Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 íle

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

75 Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

80 Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

85 Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

90 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

95 Thr

Val

Thr

Val

Ser

100 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

105 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

110 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

120 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

125 Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130 Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

135 Glu

Pro

Val

Thr

Val

140 Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145 Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

150 Val

His

155

160

165 <210> 10 <211> 151 <212> PRT <213> Human <400> 10

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

íle

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Ser

His

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

He

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Val

Val

Pro

Ala

90 95

Ala	Met	Asp	Val 100
Ser	Thr	Lys 115	Gly
Thr	Ser 130	Glu	Ser
Pro	Glu	Pro	Val

145 <210> 11 <211> 146 <212> PRT <213> Human

Trp	Gly	Gin	Gly
Pro	Ser	Val	Phe 120
Thr	Ala	Ala 135	Leu
Thr	Val 150	Ser

Thr	Thr	Val	Thr
105
Pro	Leu	Ala	Pro
Gly	Cys	Leu	Val 140

Val	Ser 110	Ser	Ala
Cys	Ser	Arg	Ser
125
Lys	Asp	Tyr	Phe

<220>
<400> 11 Val Val	Gin	Pro
1
Phe	Thr	Phe	Ser
Lys	Gly	Leu	20 Glu
Tyr	Tyr	35 Ala	Asp
Ser	50 Lys	Asn	Thr
65
Thr	Ala	Val	Tyr
Leu	Asp	Tyr	Trp
Thr	Lys	Gly	100 Pro
Ser	Glu	115 Ser	Thr

130

Glu Pro 145 <210> 12 <211> 174 <212> PRT <213> Human

Gly	Arg	Ser	Leu
5
Ser	Xaa	Gly	Met
Trp	Val	Ala	Val 40
Ser	Val	Lys 55	Gly
Leu	Tyr 70	Leu	Gin
Tyr	Cys	Ala	Arg
85
Gly	Gin	Gly	Thr
Ser	Val	Phe	Pro 120
Ala	Ala	Leu 135	Gly

Arg	Leu 10	Ser	Cys
His	Trp	Val	Arg
25
He	Trp	Ser	Asp
Arg	Phe	Thr	íle 60
Met	Asn	Ser 75	Leu
Gly	Thr 90	Met	íle
Leu	Val	Thr	Val
105
Leu	Ala	Pro	Cys
Cys	Leu	Val	Lys 140

Ala	Ala	Ser 15	Gly
Gin	Ala 30	Pro	Gly
Gly	Ser	His	Lys
45
Ser	Arg	Asp	Asn
Arg	Ala	Glu	Asp 80
Val	Val	Gly 95	Thr
Ser	Ser 110	Ala	Ser
Ser	Arg	Ser	Thr
125
Asp	Tyr	Phe	Pro

<400> 12

Ser 1	Gly	Gly	Gly
Ala	Ala	Ser	Gly 20
Gin	Ala	Pro 35	Gly
Gly	Ser 50	Asn	Lys
Ser 65	Arg	Asp	Asn
Arg	Ala	Glu	Asp
Asp	Phe	Trp	Ser 100
Thr	Val	Thr 115	Val
Leu	Ala 130	Pro	Cys

Val	Val	Gin	Pro
5
Phe	Thr	Phe	Ser
Lys	Gly	Leu	Glu 40
Tyr	Tyr	Ala 55	Asp
Ser	Lys 70	Ser	Thr
Thr	Ala	Val	Tyr
85
Gly	Arg	Gly	Gly
Ser	Ser	Ala	Ser 120
Ser	Arg	Ser 135	Thr

Gly	Arg 10	Ser	Leu
Ser	Tyr	Gly	Val
25
Trp	Val	Ala	Val
Ser	Val	Lys	Gly 60
Leu	Tyr	Leu 75	Gin
Tyr	Cys 90	Ala	Arg
Met	Asp	Val	Trp
105
Thr	Lys	Gly	Pro
Ser	Glu	Ser	Thr 140

Arg	Leu	Ser 15	Cys
His	Trp 30	Val	Arg
íle	Trp	Tyr	Asp
45
Arg	Phe	Thr	íle
Met	Asn	Ser	Leu 80
Asp	Ser	Tyr 95	Tyr
Gly	Gin 110	Gly	Thr
Ser	Val	Phe	Pro
125
Ala	Ala	Leu	Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

<210> 13 <211> 163 <212> PRT <213> Human

<400> 13

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

1

5

10

15

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

20

25

30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Val

Val

íle

Trp

His

Asp

Gly

Asn

Asn

Lys

Tyr

35

40

45

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

He

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

50

55

60

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65

70

75

80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

Gly

85

90

95

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His

Thr

Phe

<210> 14 <211> 235 <212> PRT <213> Human <400> 14

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly 20

Glu

íle

Val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 30

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 35

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 40

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 45

Ser

Gin

Ser

íle

Ser 50

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala 55

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg 60

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 65

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr 70

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg 75

Ala

Thr

Gly

íle

Pro 80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 85

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 90

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 95

íle

Ser

Arg

Leu

Glu 100

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 105

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin 110

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser 115

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly 120

Gin

Gly

Thr

Lys

Val 125

Glu

íle

Lys

Arg

Thr 130

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 135

Val

Phe

íle

Phe

Pro 140

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin 145

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 150

Ser

Val

Val

Cys 155

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe 160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165 170 175

Ser	Gly	Asn	Ser 180
Thr	Tyr	Ser 195	Leu
Lys	His 210	Lys	Val
Pro	Val	Thr	Lys

225 <210> 15 <211> 233 <212> PRT <213> Human

Gin	Glu	Ser	Val
Ser	Ser	Thr	Leu 200
Tyr	Ala	Cys 215	Glu
Ser	Phe 230	Asn	Arg

Thr	Glu	Gin	Asp
185 Thr	Leu	Ser	Lys
Val	Thr	His	Gin
Gly	Glu	Cys 235	220

Ser	Lys 190	Asp	Ser
Ala	Asp	Tyr	Glu
205
Gly	Leu	Ser	Ser

<400> 15

Met 1	Glu	Thr	Pro
Asp	Thr	Thr	Gly
Leu	Ser	Pro	20 Gly
Ser	Ser	35 Tyr	Leu
Leu	50 Leu	íle	Tyr
65
Phe	Ser	Gly	Ser
Leu	Glu	Pro	Glu
Ser	Pro	Phe	100 Thr
Val	Ala	115 Ala	Pro
Lys	130 Ser	Gly	Thr
145
Arg	Glu	Ala	Lys
Asn	Ser	Gin	Glu
Ser	Leu	Ser	180 Ser
Lys	Val	195 Tyr	Ala
Thr	210 Lys	Ser	Phe

225 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Human

Ala	Gin	Leu	Leu
5
Glu	íle	Val	Leu
Glu	Arg	Ala	Thr 40
Ala	Trp	Tyr 55	Gin
Gly	Ala 70	Ser	Ser
Gly	Ser	Gly	Thr
85
Asp	Phe	Ala	Val
Phe	Gly	Gly	Gly 120
Ser	Val	Phe 135	íle
Ala	Ser 150	Val	Val
Val	Gin	Trp	Lys
165
Ser	Val	Thr	Glu
Thr	Leu	Thr	Leu 200
Cys	Glu	Val 215	Thr
Asn	Arg 230	Gly	Glu

Phe	Leu 10	Leu	Leu
Thr 25	Gin	Ser	Pro
Leu	Ser	Cys	Arg
Gin	Lys	Pro	Gly 60
Arg	Ala	Thr 75	Gly
Asp	Phe 90	Thr	Leu
Tyr 105	Tyr	Cys	Gin
Thr	Lys	Val	Glu
Phe	Pro	Pro	Ser 140
Cys	Leu	Leu 155	Asn
Val	Asp 170	Asn	Ala
Gin 185	Asp	Ser	Lys
Ser	Lys	Ala	Asp
His Cys	Gin	Gly	Leu 220

Leu Gly Thr	Trp Thr 30 Ser	Leu 15 Leu Val	Pro Ser Ser
45 Gin	Ala	Pro	Arg
íle	Pro	Asp	Arg
Thr	íle	Ser	80 Arg
Gin	Tyr	95 Gly	íle
íle	110 Lys	Arg	Thr
125 Asp	Glu	Gin	Leu
Asn	Phe	Tyr	Pro
Leu	Gin	Ser	160 Gly
Asp	Ser	175 Thr	Tyr
Tyr	190 Glu	Lys	His
205 Ser	Ser	Pro	Val

<400> 16

Gly 1	Thr	Leu	Ser
Ala	Ser	Gin	Ser 20
Gly	Gin	Ala 35	Pro
Gly	íle 50	Pro	Asp
Leu 65	Thr	íle	Ser

Leu 5	Ser	Pro	Gly
Val	Ser	Ser	Tyr
Arg	Leu	Leu	íle 40
Arg	Phe	Ser 55	Gly
Arg	Leu 70	Glu	Pro

Glu	Arg 10	Ala	Thr
Leu 25	Ala	Trp	Tyr
Tyr	Gly	Ala	Ser
Ser	Gly	Ser	Gly 60
Glu	Asp	Phe 75	Ala

Leu	Ser	Cys 15	Arg
Gin	Gin 30	Lys	Pro
Ser 45	Arg	Ala	Thr
Thr	Asp	Phe	Thr
Val	Tyr	Tyr	Cys 80

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg 85

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe 90

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys 95

Val

Asp

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

Phe

Pro

Pro

100

105

110

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 <210> 17 <211>234 <212> PRT <213> Human <400> 17

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly 20

Glu

íle

Val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 30

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 35

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 40

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 45

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 50

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 55

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 60

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 65

Pro

Leu

íle

Tyr

Gly 70

Val

Ser

Ser

Arg

Ala 75

Thr

Gly

íle

Pro

Asp 80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 90

Phe

Thr

Leu

Thr

íle 95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro 100

Glu

Asp

Phe

Ala

Val 105

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 110

Tyr

Gly

íle

Ser

Pro 115

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 120

Gly

Thr

Lys

Val

Asp 125

íle

Lys

Arg

Thr

Val 130

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 135

Phe

íle

Phe

Pro

Pro 140

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 145

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 150

Ser

Val

Val

Cys

Leu 155

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 165

Val

Gin

Trp

Lys

Val 170

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin 175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin 180

Glu

Ser

Val

Thr

Glu 185

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp 190

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu 195

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr 200

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp 205

Tyr

Glu

Lys

His Val

Lys 210 Thr

Val Lys

Tyr Ser

Ala Phe

Cys Asn

Glu 215 Arg

Val Gly

Thr Glu

His Cys

Gin

Gly 220

Leu

Ser

Ser

Pro

225 230 <210> 18 <211> 152 <212> PRT <213> Human <400> 18

Gin 1

Ser

Pro

Ser

Ser 5

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 10

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 15

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Asn

Thr

Tyr

Leu

íle

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn

Phe

Leu

íle

Ser

Ala

Thr

Ser

íle

35

40

45

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Asn

Ser

Leu

His

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 85

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro 90

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

140

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

145 150 <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 19

Ser 1

Pro

Gly

Thr

Leu 5

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 10

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu 15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 20 <211> 155 <212> PRT <213> Human <400> 20

Ser 1

Pro

Asp

Phe

Gin 5

Ser

Val

Thr

Pro

Lys 10

Glu

Lys

Val

Thr

íle 15

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val

Glu

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

<210> 21 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 21

Gin 1	Ser	Pro	Gly
Ser	Cys	Arg	Ala 20
Gin	Lys	Pro 35	Gly
Arg	Ala 50	Thr	Gly
Asp 65	Phe	Thr	Leu
Tyr	Tyr	Cys	Gin
Thr	Lys	Val	Asp 100
Phe	Pro	Pro 115	Ser
Cys	Leu	Leu	Asn

130

Gly Gly 145 <210> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Human

Thr	Leu	Ser	Leu
5
Ser	Gin	Ser	Val
Gin	Ala	Pro	Arg 40
íle	Pro	Asp 55	Arg
Thr	íle 70	Ser	Arg
Gin	Tyr	Gly	Arg
85
íle	Lys	Arg	Thr
Asp	Glu	Gin	Leu 120
Asn	Phe	Tyr 135	Pro

Ser	Pro 10	Gly	Glu
Ser	Ser	Tyr	Leu
25
Leu	Leu	íle	Tyr
Phe	Ser	Gly	Ser 60
Leu	Glu	Pro 75	Glu
Ser	Pro 90	Phe	Thr
Val	Ala	Ala	Pro
105
Lys	Ser	Gly	Thr
Arg	Glu	Ala	Lys 140

Arg	Ala	Thr 15	Leu
Ala	Trp 30	Tyr	Gin
Gly	Ala	Ser	Ser
45
Gly	Ser	Gly	Thr
Asp	Phe	Ala	Val 80
Phe	Gly	Pro 95	Gly
Ser	Val 110	Phe	íle
Ala	Ser	Val	Val
125
Val	Gin	Trp	Lys

<400> 22

Pro 1	Ser	Ser	Leu
Arg	Ala	Ser	Gin 20
Pro	Gly	Lys 35	Ala
Ser	Gly 50	Val	Pro
Thr 65	Leu	Thr	íle
Cys	Gin	Gin	Tyr
Val	Glu	íle	Lys 100
Pro	Ser	Asp 115	Glu
Leu	Asn 130	Asn	Phe

Ser	Ala	Ser	Val
5
Ser	íle	Asn	Ser
Pro	Lys	Leu	Leu 40
Ser	Arg	Phe 55	Ser
Ser	Ser 70	Leu	Gin
Tyr	Ser	Thr	Pro
85
Arg	Thr	Val	Ala
Gin	Leu	Lys	Ser 120
Tyr	Pro	Arg 135	Glu

Gly	Asp 10	Arg	Val
Tyr	Leu	Asp	Trp
25
íle	Tyr	Ala	Ala
Gly	Ser	Gly	Ser 60
Pro	Glu	Asp 75	Phe
Phe	Thr 90	Phe	Gly
Ala	Pro	Ser	Val
105
Gly	Thr	Ala	Ser
Ala	Lys	Val

Thr	íle	Thr 15	Cys
Tyr	Gin 30	Gin	Lys
Ser 45	Ser	Leu	Gin
Gly	Thr	Asp	Phe
Ala	Thr	Tyr	Tyr 80
Pro	Gly	Thr 95	Lys
Phe	íle 110	Phe	Pro
Val 125	Val	Cys	Leu

<210> 23 <211> 134 <212> PRT <213> Human <400> 23

Thr 1	Gin	Ser	Pro
íle	Thr	Cys	Arg 20

Ser	Ser	Leu	Ser
5
Ala	Ser	Gin	Asn

Ala	Ser 10	Val	Gly
íle 25	Ser	Arg	Tyr

Asp	Arg	Val 15	Thr
Leu	Asn 30	Trp	Tyr

Gin

Gin

Lys 35

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro 40

Lys

Phe

Leu

íle

Tyr 45

Val

Ala

Ser

íle

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

íle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

130 <210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Human <400> 24

Thr 1

Gin

Ser

Pro

Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser 10

Val

Gly

Asp

Arg

Val 15

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Val

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Leu

Gin

Gly

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

íle

Asp

Cys

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

íle

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Arg

Val

Asp

íle

Glu

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

íle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

130

135

140

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Tyr

145 150 <210> 25 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 25

Pro 1

Leu

Ser

Leu

Pro 5

Val

Thr

Leu

Gly

Gin 10

Pro

Ala

Ser

íle

Ser 15

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin 20

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser 25

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr 30

Leu

Asn

Trp

Phe

Gin 35

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin 40

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu 45

íle

Tyr

Lys

Val

Ser 50

Asn

Trp

Asp

Ser

Gly 55

Val

Pro

Asp

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 70

Leu

Lys

íle

Ser

Arg 75

Val

Glu

Ala

Glu

Asp 80

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr 85

Cys

Met

Gin

Gly

Ser 90

His

Trp

Pro

Pro

Thr 95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

100 105 110

Val

Phe

íle 115

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp 120

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser 125

Gly

Thr

Ala

Ser Val 130 <210> 26 <211> 133 <212> PRT <213> Human <400> 26

Val

Cys

Leu

Leu

Asn 135

Asn

Phe

Tyr

Pro

Pro 1

Gly

Glu

Pro

Ala 5

Ser

íle

Ser

Cys

Arg 10

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu 15

Leu

His

Ser

Asn

Gly 20

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp 25

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys 30

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro 35

Gin

Leu

Leu

íle

Tyr 40

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg 45

Ala

Ser

Gly

Val

Pro 50

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 55

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 60

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys 65

Leu

Ser

Arg

Val

Glu 70

Ala

Glu

Asp

Val

Gly 75

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met 80

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr 85

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly 90

Gly

Gly

Thr

Lys

Val 95

Glu

íle

Lys

Arg

Thr 100

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 105

Val

Phe

íle

Phe

Pro 110

Pro

Ser

Asp Asn

Glu Phe

Gin 115 Tyr

Leu Pro

Lys Arg

Ser

Gly

Thr 120

Ala

Ser

Val

Val

Cys 125

Leu

Leu

Asn

130 <210> 27 <211> 364 <212> PRT <213> Human <400> 27

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

20 Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

25 Gly

íle

Ala

Ser

Phe

30 Val

Cys

Glu

Tyr

Ala

35 Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

40 Thr

Glu

Val

Arg

Val

45 Thr

Val

Leu

Arg

Gin

50 Ala

Asp

Ser

Gin

Val

55 Thr

Glu

Val

Cys

Ala

60 Ala

Thr

Tyr

Met

Met

65 Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

70 Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

75 íle

Cys

Thr

Gly

Thr

80 Ser

Ser

Gly

Asn

Gin

85 Val

Asn

Leu

Thr

íle

90 Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

95 Met

Asp

Thr

Gly

Leu

100 Tyr

íle

Cys

Lys

Val

105 Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

110 Pro

Pro

Tyr

Tyr

Leu

115 Gly

íle

Gly

Asn

Gly

120 Thr

Gin

íle

Tyr

Val

125 íle

Asp

Pro

Glu

Pro

130 Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

135 Leu

Glu

Gly

Ala

Pro

140 Ser

Val

Phe

Leu

Phe

145 Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

150 Asp

Thr

Leu

Met

íle

155 Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

160 Val

Thr

Cys

Val

Val

165 Val

Asp

Val

Ser

His

170 Glu

Asp

Pro

Glu

Val

175 Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

180 Val

Asp

Gly

Val

Glu

185 Val

His

Asn

Ala

Lys

190 Thr

Lys

Pro

195 200 205

Arg

Glu 210

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser 215

Thr

Tyr

Arg

Val

Val 220

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

225

230

235

240

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Thr

Pro

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Ser

Lys

Ala

245

250

255

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

260

265

270

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

275

280

285

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

290

295

300

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

305

310

315

320

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

325

330

335

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

340

345

350

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

355 360 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 28

Met 1

His

Val

Ala

Gin 5

Pro

Ala

Val

Val

Leu 10

Ala

Ser

<210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Human <400> 29 Met His

Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

Gly

íle

1 Ala

Ser

Phe

Val

5 Cys

Glu

Tyr

Ala

Ser

10 Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

15 Glu

Val

Arg

Val

Thr

20 Val

Leu

Arg

Gin

Ala

25 Asp

Ser

Gin

Val

Thr

30 Glu

Val

Cys

Ala

Ala

35 Thr

Tyr

Met

Met

Gly

40 Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

45 Leu

Asp

Asp

Ser

íle

50 Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

55 Ser

Gly

Asn

Gin

Val

60 Asn

Leu

Thr

íle

Gin

65 Gly

Leu

Arg

Ala

Met

70 Asp

Thr

Gly

Leu

Tyr

75 íle

Cys

Lys

Val

Glu

80 Leu

Met

Tyr

Pro

Pro

85 Pro

Tyr

Tyr

Leu

Gly

90 íle

Gly

Asn

Gly

Thr

95 Gin

íle

Tyr

Val

íle

100 Asp

Pro

Glu

Pro

Cys

105

110

115 120 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 30

Met His	Val Ala Gin Pro	Ala Val Val Leu Ala
1	5	10

<210> 31 <211> 89 <212> PRT <213> Human <400> 31

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

<210> 32 <211> 169 <212> PRT <213> Human <400> 32

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

íle

íle

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 33 <211> 167 <212> PRT <213> Human <400> 33

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

His

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

íle

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

75 Gly

His

Phe

Gly

Pro

80 Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

85 Gin

Gly

Thr

Leu

Val

90 Thr

Val

Ser

Ser

Ala

95 Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

100 Ser

Val

Phe

Pro

Leu

105 Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

110 Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

115 Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

120 Cys

Leu

Val

Lys

Asp

125 Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

130 Val

Thr

Val

Ser

Trp

135 Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

140 Thr

Ser

Gly

Val

His

145 Thr

Phe

Pro

Ala

Val

150 Leu

Gin

155

160

165 <210> 34 <211> 166 <212> PRT <213> Human <400> 34

Gly

Val 1

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

His

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Ser

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

85

90

95

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 <210> 35 <211> 167 <212> PRT <213> Human <400> 35

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly

Phe

íle

Phe 20

Ser

Ser

His

Gly

íle 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

íle

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

íle

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

90 95

Asp

Tyr

Trp

Gly 100

Gin

Gly

Thr

Leu

Val 105

Thr

Val

Ser

Ser

Ala 110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 36 <211> 153 <212> PRT <213> Human <400> 36

Pro 1

Gly

Arg

Ser

Leu 5

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala 10

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

Gly

íle

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Le

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145 150 <210> 37 <211> 163 <212> PRT <213> Human <400> 37

Pro 1

Gly

Arg

Ser

Leu 5

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala 10

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

Gly 20

íle

His

Trp

Val

Arg 25

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys 30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val 35

Ala

Val

íle

Trp

Tyr 40

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys 45

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser 50

Val

Lys

Gly

Arg

Phe 55

Thr

íle

Ser

Arg

Asp 60

Asn

Ser

Lys

Lys

Thr 65

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met 70

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala 75

Glu

Asp

Thr

Ala

Val 80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg 85

Val

Ala

Pro

Leu

Gly 90

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp 95

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 100

Val

Thr

Val

Ser

Ser 105

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 110

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 115

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 120

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 125

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 130

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 135

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu 140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

145

150

155

160

Val

Leu

Gin

<210> 38 <211> 138 <212> PRT <213> Human

<400> 38

Gly

Gly

Val

Val

Glu

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

1

5

10

15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

35

40

45

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

50

55

60

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

65

70

75

80

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

85

90

95

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130 135 <210> 39 <211> 167 <212> PRT <213> Human

<220>

<400> 39 Gly Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

Val

Ala

25 Val

íle

Trp

Tyr

Asp

30 Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 íle

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

75 Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

80 Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

85 Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

90 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

95 Thr

Val

Thr

Val

Ser

100 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

105 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

110 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

120 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

125 Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130 Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

135 Glu

Pro

Val

Thr

Val

140 Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145 Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

150 Val

His

155

160

165 <210> 40 <211> 150 <212> PRT <213> Human <400> 40

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

His

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Val

Val

Val

Pro

Ala

85

Ala 90

95

Ala

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

145 150 <210> 41 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 41

Val 1

Val

Gin

Pro

Gly 5

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu 10

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 20

Ser

Cys

Gly

Met

His 25

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 35

Glu

Trp

Val

Ala

Val 40

íle

Trp

Ser

Asp

Gly 45

Ser

His

Lys

Tyr

Tyr 50

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 55

Gly

Arg

Phe

Thr

íle 60

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 65

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 70

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 75

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 80

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 85

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr 90

Met

íle

Val

Val

Gly 95

Thr

Leu

Asp

Tyr

Trp 100

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 105

Val

Thr

Val

Ser

Ser 110

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 115

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 120

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 125

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130 135 140

Glu Pro 145 <210> 42 <211> 171 <212> PRT <213> Human <400> 42

Gly Val Val Gin	Pro Gly Arg	Ser Leu Arg Leu	Ser Cys Ala Ala Ser
1	5	10	15

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Val 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

Asp

Phe

Trp

85

90

95

Ser

Gly

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

115

120

125

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 170 <210> 43 <211> 163 <212> PRT <213> Human <400> 43

Val 1

Gin

Pro

Gly

Arg 5

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 10

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly 15

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn 20

Tyr

Ala

Met

His

Trp 25

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 35

Trp

Val

Val

Val

íle 40

Trp

His

Asp

Gly

Asn 45

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala 50

Glu

Ser

Val

Lys

Gly 55

Arg

Phe

Thr

íle

Ser 60

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 65

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 70

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 75

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 85

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly 90

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly 95

Gly

Phe

Asp

Phe

Trp 100

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 105

Val

Thr

Val

Ser

Ser 110

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 115

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 120

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 125

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 130

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 135

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu 145 His

Pro Thr

Val Phe

Thr

Val

Ser 150

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 155

Leu

Thr

Ser

Gly

Val 160

<210> 44 <211> 76 <212> PRT <213> Human <400> 44

Val 1

Ser

Gly

Gly

Ser 5

íle

Ser

Ser

Gly

Gly 10

Tyr

Tyr

Trp

Ser

Trp 15

íle

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

íle

Gly

Tyr

íle

Tyr

Tyr

20

25

30

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

íle

40 45

Ser

Val 50

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn 55

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys 60

Leu

Ser

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

65

70

75

<210> 45 <211> 172 <212> PRT <213> Human

<400> 45

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gin

íle

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

1

5

10

15

Thr

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

íle

Ser

Ser

Gly

Gly

His

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

25

30

íle

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

íle

Gly

Tyr 45

íle

Tyr

35

40

Tyr

íle

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

50

55

60

íle

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

65

70

75

80

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Gly

85

90

95

Asp

Tyr

Tyr

Gly

íle

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

100

105

110

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115

120

125

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

130

135

140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 170 <210> 46 <211> 96 <212> PRT <213> Human <400> 46

Glu 1

íle

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 30

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala 35

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys 40

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 45

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr 50

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg 55

Ala

Thr

Gly

íle

Pro 60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 75

íle

Ser

Arg

Leu

Glu 80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ser

Ser

Pro

90 95 <210> 47 <211> 141 <212> PRT <213> Human <400> 47

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

25 30

Gin

Gin

Arg 35

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 40

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr 45

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

85

90

95

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

íle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130 135 140 <210> 48 <211> 141 <212> PRT <213> Human <400> 48

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

35

40

45

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

íle

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val

Glu

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 49 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 49

Gly 1

Thr

Leu

Ser

Leu 5

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg 10

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys 15

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

20 Pro

Arg

Leu

Leu

íle

25 Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

30 Arg

Ala

Thr

Gly

íle

35 Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

40 Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

45 Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

50 Thr

íle

Ser

Arg

Leu

55 Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

60 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

65 Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

70 Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

75 Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

80 Val

Asp

íle

Lys

Arg

85 Thr

Val

Ala

Ala

Pro

90 Ser

Val

Phe

íle

Phe

95 Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

100 Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

105 Thr

Ala

Ser

Val

Val

110 Cys

Leu

Leu

115 120 125

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 <210> 50 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 50

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Pro

Leu

íle

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

íle

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 51 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400>51

Ser 1

Pro

Gly

Thr

Leu 5

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 10

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu 15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 52 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 52

Gin 1	Ser	Pro	Gly	Thr 5
Ser	Cys	Arg	Ala 20	Ser

Leu	Ser	Leu	Ser	Pro 10
Gin	Ser	Val	Ser 25	Ser

Glu	Arg	Ala	Thr 15	Leu
Leu	Ala	Trp 30	Tyr	Gin

Gin	Lys	Pro 35	Gly
Arg	Ala 50	Thr	Gly
Asp 65	Phe	Thr	Leu
Tyr	Tyr	Cys	Gin
Thr	Lys	Val	Asp 100
Phe	Pro	Pro 115	Ser
Cys Gly 145	Leu 130 Gly	Leu	Asn

<210> 53 <211> 95 <212> PRT <213> Human <400> 53

Asp 1	íle	Gin	Met
Asp	Arg	Val	Thr 20
Leu	Asn	Trp 35	Tyr
Tyr	Ala 50	Ala	Ser
Ser 65	Gly	Ser	Gly
Glu	Asp	Phe	Ala

<210> 54 <211> 152 <212> PRT <213> Human <400> 54

Gin 1	Ser	Pro	Ser
Thr	Cys	Arg	Ala 20
Gin	Lys	Pro 35	Gly
Leu	Gin 50	Ser	Gly
Asn 65	Phe	Thr	Leu
Tyr	Tyr	Cys	Gin
Thr	Lys	Val	Asp 100
Phe	Pro	Pro 115	Ser
Cys	Leu 130	Leu	Asn
Val 145	Asp	Asn	Ala

Gin	Ala	Pro	Arg 40
íle	Pro	Asp 55	Arg
Thr	íle 70	Ser	Arg
Gin 85	Tyr	Gly	Arg
íle	Lys	Arg	Thr
Asp	Glu	Gin	Leu 120
Asn	Phe	Tyr 135	Pro

Thr	Gin	Ser	Pro
5
íle	Thr	Cys	Arg
Gin	Gin	Lys	Pro 40
Ser	Leu	Gin 55	Ser
Thr	Asp 70	Phe	Thr
Thr 85	Tyr	Tyr	Cys

Ser	Leu	Ser	Ala
5
Ser	Gin	Ser	íle
Lys	Ala	Pro	Asn 40
Val	Pro	Ser 55	Arg
Thr	íle 70	Asn	Ser
Gin	Ser	Tyr	Ser
85
íle	Lys	Arg	Thr
Asp	Glu	Gin	Leu 120
Asn	Phe	Tyr 135	Pro
Leu	Gin 150	Ser	Gly

Leu	Leu	íle	Tyr
Phe	Ser	Gly	Ser 60
Leu	Glu	Pro 75	Glu
Ser	Pro 90	Phe	Thr
Val 105	Ala	Ala	Pro
Lys	Ser	Gly	Thr
Arg	Glu	Ala	Lys 140

Ser	Ser 10	Leu	Ser
Ala 25	Ser	Gin	Ser
Gly	Lys	Ala	Pro
Gly	Val	Pro	Ser 60
Leu	Thr	íle 75	Ser
Gin	Gin 90	Ser	Tyr

Ser	Val 10	Gly	Asp
Asn	Thr	Tyr	Leu
25
Phe	Leu	íle	Ser
Phe	Arg	Gly	Ser 60
Leu	His	Pro 75	Glu
Thr	Pro 90	Phe	Thr
Val	Ala	Ala	Pro
105
Lys	Ser	Gly	Thr
Arg	Glu	Ala	Lys 140

Gly	Ala	Ser	Ser
45
Gly	Ser	Gly	Thr
Asp	Phe	Ala	Val
Phe	Gly	Pro	80 Gly
Ser	Val	95 Phe	íle
Ala	110 Ser	Val	Val
125
Val	Gin	Trp	Lys

Ala	Ser	Val 15	Gly
íle	Ser 30	Ser	Tyr
Lys	Leu	Leu	íle
45
Arg	Phe	Ser	Gly
Ser Ser	Leu Thr	Gin Pro 95	Pro 80
Arg	Val	Thr 15	íle
íle	Trp 30	Tyr	Gin
Ala	Thr	Ser	íle
45
Gly	Ser	Gly	Thr
Asp	Phe	Ala	Thr 80
Phe	Gly	Pro 95	Gly
Ser	Val 110	Phe	íle
Ala	Ser	Val	Val
125
Val	Gin	Trp	Lys

<210> 55 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 55

Pro 1	Ser	Ser	Leu
Arg	Ala	Ser	Gin 20
Pro	Gly	Lys 35	Ala
Ser	Gly 50	Val	Pro
Thr 65	Leu	Thr	He
Cys	Gin	Gin	Tyr
Val	Glu	íle	Lys 100
Pro	Ser	Asp 115	Glu
Leu	Asn 130	Asn	Phe

<210> 56 <211> 134 <212> PRT <213> Human <400> 56

Thr 1	Gin	Ser	Pro
íle	Thr	Cys	Arg 20
Gin	Gin	Lys 35	Pro
íle	Leu 50	Gin	Ser
Pro 65	Asp	Phe	Thr
Thr	Tyr	Tyr	Cys
Gly	Thr	Lys	Val 100
íle	Phe	Pro 115	Pro
Val	Cys 130	Leu	Leu

<210> 57 <211> 150 <212> PRT <213> Human

Ser	Ala	Ser	Val
5
Ser	íle	Asn	Ser
Pro	Lys	Leu	Leu 40
Ser	Arg	Phe 55	Ser
Ser	Ser 70	Leu	Gin
Tyr	Ser	Thr	Pro
85
Arg	Thr	Val	Ala
Gin	Leu	Lys	Ser 120
Tyr	Pro	Arg 135	Glu

Ser	Ser	Leu	Ser
5
Ala	Ser	Gin	Asn
Gly	Lys	Ala	Pro 40
Gly	Val	Pro 55	Ser
Leu	Thr 70	íle	Ser
Gin	Gin	Ser	Tyr
85
Asp	íle	Lys	Arg
Ser Asn	Asp Asn	Glu	Gin 120

Gly	Asp 10	Arg	Val
Tyr	Leu	Asp	Trp
25
íle	Tyr	Ala	Ala
Gly	Ser	Gly	Ser 60
Pro	Glu	Asp 75	Phe
Phe	Thr 90	Phe	Gly
Ala	Pro	Ser	Val
105
Gly	Thr	Ala	Ser
Ala	Lys	Val

Ala	Ser 10	Val	Gly
íle	Ser	Arg	Tyr
25
Lys	Phe	Leu	íle
Gly	Phe	Ser	Ala 60
Ser	Leu	Gin 75	Pro
Ser	Thr 90	Pro	Phe
Thr	Val	Ala	Ala
105
Leu	Lys	Ser	Gly

Thr	íle	Thr 15	Cys
Tyr	Gin 30	Gin	Lys
Ser 45	Ser	Leu	Gin
Gly	Thr	Asp	Phe
Ala	Thr	Tyr	Tyr 80
Pro	Gly	Thr 95	Lys
Phe	íle 110	Phe	Pro
Val 125	Val	Cys	Leu

Asp	Arg	Val 15	Thr
Leu	Asn 30	Trp	Tyr
Tyr 45	Val	Ala	Ser
Ser	Gly	Ser	Gly
Glu	Asp	Phe	Ala 80
Thr	Phe	Gly 95	Pro
Pro	Ser 110	Val	Phe
Thr 125	Ala	Ser	Val

<400> 57

Thr 1	Gin	Ser	Pro
íle	Thr	Cys	Arg 20
Gin	Gin	Lys 35	Pro

Ser	Ser	Leu	Ser
5
Ala	Ser	Gin	Ser
Gly	Lys	Ala	Pro 40

Ala	Ser 10	Val	Gly
íle 25	Cys	Asn	Tyr
Arg	Val	Leu	íle

Asp	Arg	Val 15	Thr
Leu	Asn 30	Trp	Tyr
Tyr 45	Ala	Ala	Ser

Ser

Leu 50

Gin

Gly

Gly

Val

Pro 55

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly 60

Ser

Gly

Ser

Gly

íle

Asp

Cys

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

íle

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Arg

Val

Asp

íle

Glu

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

íle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

130

135

140

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Tyr

145 150 <210> 58 <211> 96 <212> PRT <213> Human <400> 58

Glu 1

íle

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Asp

Phe 10

Gin

Ser

Val

Thr

Pro 15

Lys

Glu

Lys

Val

Thr 20

íle

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

íle

Gly 30

Ser

Ser

Leu

His

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys 45

Leu

Leu

íle

Lys

Tyr 50

Ala

Ser

Gin

Ser

Phe 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

íle 75

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala 80

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Gin

90 95 <210> 59 <211> 155 <212> PRT <213> Human <400> 59

Ser 1

Pro

Asp

Phe

Gin 5

Ser

Val

Thr

Pro

Lys 10

Glu

Lys

Val

Thr

íle 15

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val

Glu

íle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

<210> 60 <211> 100 <212> PRT <213> Human

<400> 60
Asp	Val	Val	Met
1
Gin	Pro	Ala	Ser 20
Asp	Gly	Asn 35	Thr
Pro	Arg 50	Arg	Leu
Asp	Arg	Phe	Ser
65
Ser	Arg	Val	Glu
Thr	His	Trp	Pro

100 <210> 61 <211> 139 <212> PRT <213> Human

Thr 5	Gin	Ser	Pro
íle	Ser	Cys	Arg
Tyr	Leu	Asn	Trp 40
íle	Tyr	Lys 55	Val
Gly	Ser 70	Gly	Ser
Ala 85	Glu	Asp	Val

Leu	Ser 10	Leu	Pro
Ser 25	Ser	Gin	Ser
Phe	Gin	Gin	Arg
Ser	Asn	Arg	Asp 60
Gly	Thr	Asp 75	Phe
Gly	Val 90	Tyr	Tyr

Val	Thr	Leu 15	Gly
Leu	Val 30	Tyr	Ser
Pro 45	Gly	Gin	Ser
Ser	Gly	Val	Pro
Thr	Leu	Lys	íle 80
Cys	Met	Gin 95	Gly

<400> 61

Pro 1	Leu	Ser	Leu
Arg	Ser	Ser	Gin 20
Trp	Phe	Gin 35	Gin
Val	Ser 50	Asn	Trp
Ser 65	Gly	Thr	Asp
Val	Gly	Val	Tyr
Gly	Gin	Gly	Thr 100
Val	Phe	íle 115	Phe
Ser	Val	Val	Cys

130 <210> 62 <211> 100 <212> PRT <213> Human

Pro	Val	Thr	Leu
5
Ser	Leu	Val	Tyr
Arg	Pro	Gly	Gin 40
Asp	Ser	Gly 55	Val
Phe	Thr 70	Leu	Lys
Tyr	Cys	Met	Gin
85
Lys	Val	Glu	íle
Pro	Pro	Ser	Asp 120
Leu	Leu	Asn 135	Asn

Gly	Gin 10	Pro	Ala
Ser	Asp	Gly	Asn
25
Ser	Pro	Arg	Arg
Pro	Asp	Arg	Phe 60
íle	Ser	Arg 75	Val
Gly	Ser 90	His	Trp
Lys	Arg	Thr	Val
105
Glu	Gin	Leu	Lys
Phe	Tyr	Pro

Ser	íle	Ser 15	Cys
Thr	Tyr 30	Leu	Asn
Leu 45	íle	Tyr	Lys
Ser	Gly	Ser	Gly
Glu	Ala	Glu	Asp 80
Pro	Pro	Thr 95	Phe
Ala	Ala 110	Pro	Ser
Ser 125	Gly	Thr	Ala

<400> 62

Asp 1	íle	Val	Met
Glu	Pro	Ala	Ser 20
Asn	Gly	Tyr 35	Asn
Pro	Gin 50	Leu	Leu
Asp 65	Arg	Phe	Ser

Thr 5	Gin	Ser	Pro
íle	Ser	Cys	Arg
Tyr	Leu	Asp	Trp 40
íle	Tyr	Leu 55	Gly
Gly	Ser 70	Gly	Ser

Leu	Ser 10	Leu	Pro
Ser 25	Ser	Gin	Ser
Tyr	Leu	Gin	Lys
Ser	Asn	Arg	Ala 60
Gly	Thr	Asp 75	Phe

Val	Thr	Pro 15	Gly
Leu	Leu 30	His	Ser
Pro 45	Gly	Gin	Ser
Ser	Gly	Val	Pro
Thr	Leu	Lys	íle 80

Ser	Arg	Val	Glu	Ala 85	Glu Asp Val Gly Val 90	Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 95
Leu	Gin	Thr	Pro
			100

<210> 63 <211> 133 <212> PRT <213> Human <400> 63

Pro 1

Gly

Glu

Pro

Ala 5

Ser

íle

Ser

Cys

Arg 10

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu 15

Leu

His

Ser

Asn

Gly 20

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp 25

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys 30

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro 35

Gin

Leu

Leu

íle

Tyr 40

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg 45

Ala

Ser

Gly

Val

Pro 50

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 55

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 60

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys 65

Leu

Ser

Arg

Val

Glu 70

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val 5

Tyr

Tyr

Cys

Met 80

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr 85

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly 90

Gly

Gly

Thr

Lys

Val 95

Glu

íle

Lys

Arg

Thr 100

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 105

Val

Phe

íle

Phe

Pro 110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115 120 125

Asn Phe Tyr Pro Arg

130 <210> 64 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 64

Asp	íle	Gin	Met	Thr Gin Ser Pro	Ser Ser Leu	Ser Ala Ser Val Gly
1				5	10	15
Asp	Arg	Val	Thr
			20

<210> 65 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 65

Glu	íle	Val	Leu	Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 66 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 66

Glu	íle	Val	Leu	Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 67

Asp	íle	Gin	Met	Thr Gin Ser Pro	Ser Ser Val Ser Ala	Ser Val Gly
1				5	10	15
Asp	Arg	Val	Thr
			20

<210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 68

Thr	Gly	Glu	Phe	Val Leu Thr Gin	Ser Pro Gly Thr Leu	Ser Leu Ser
1				5	10	15
Pro	Gly	Glu	Arg
			20

<210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 69

Glu	Phe	Val	Leu	Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 70 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 70

Glu	íle	Val	Leu	Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 71 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 71

Glu	íle	Val	Leu	Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 72 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 72

Glu	íle	Val	Leu	Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 73 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 73

Val	Gin	Leu	Val	Glu	Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro	Gly Arg Ser
1				5	10	15
Leu	Arg	Leu	Ser
			20

<210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 74

Pro Glu Val Gin 1 <210> 75 <211>20 <212> PRT <213> Human

Phe <400> 75

Val 1	Gin	Leu	Val Glu	Ser 5	Gly Gly Gly Val Val Gin Pro 10	Gly Arg Ser 15
Leu	Arg	Leu	Ser
			20

<210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 76

Pro Glu Val Gin 1 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Human

Phe Asn Trp 5

Tyr Val Asp 10 <400> 77

Val Gin Leu Val 1

Leu <210> 78 <211>8 <212> PRT <213> Human

Glu

Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 10 15

Ser <400> 78 Pro Glu Val <210> 79 <211>20 <212> PRT <213> Human

Gin Phe Asn 5

Trp

Tyr <400> 79

Glu	Val	Gin	Leu	Leu Glu	Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro	Gly
1				5	10	15
Ser	Leu	Arg	Leu
			20

<210> 80 <211>20 <212> PRT <213> Human <400> 80

Val	Gin	Leu 1	Val	Glu 5	Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro 10	Gly Arg Ser 15
Leu	Arg	Leu	Ser
			20

<210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 81

Pro Glu Val Gin 1 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Human

Phe Asn Trp 5

Tyr Val Asp 10 <400> 82

Val	Gin	Leu	Val	Glu	Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro	Gly Arg Ser
1				5	10	15
Leu	Arg	Leu	Ser
			20

<210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 83

Pro Glu Val Gin 1 <210> 84 <211>20 <212> PRT <213> Human

Phe Asn Tyr 5 Trp

Val <400> 84

Val	Gin	Leu	Val	Glu	Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro	Gly Arg Ser
1				5	10	15
Leu	Arg	Leu	Ser
			20

<210> 85 <211>6 <212> PRT <213> Human <400> 85 Pro Glu

Val Gin

Phe

Asn <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 86

Val	Gin	Leu	Val	Glu	Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro	Gly Arg Ser
1				5	10	15
Leu	Arg	Leu	Ser
			20

<210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 87 Pro Glu <210> 88 <211>8 <212> PRT <213> Human

Val Gin

Phe

Asn Trp Tyr Val

Asp <400> 88 Asp íle <210> 89 <211>8 <212> PRT <213> Human

Gin Met

Thr

Gin Ser Pro <400> 89 Glu íle <210> 90 <211>8 <212> PRT <213> Human

Val Leu

Thr

Gin Ser Pro <400> 90 Glu íle <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Human

Val Leu

Thr

Gin Ser Pro <400> 91 Thr Gly <210> 92 <211>8 <212> PRT <213> Human

Glu Phe

Val

Leu Thr Gin Ser

Pro <400> 92 Glu Phe

Val Leu

Thr

Gin Ser Pro

<210> 93 <211>8 <212> PRT <213> Human
<400> 93 Glu íle 1 <210> 94 <211>8 <212> PRT <213> Human	Val	Leu	Thr 5	Gin	Ser	Pro
<400> 94 Glu íle	Val	Leu	Thr	Gin	Ser	Pro

5 <210> 95 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 95

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Val

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

His

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

íle 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg 75

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala 80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

íle

Ser 90

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Gly

Gly

His 120

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp 125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly 130

Thr

Leu

Val

Thr

Val 135

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr 40

Lys

Gly

Pro

Ser

Val 145

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 150

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr 155

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala 160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu 165

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Glu

Pro

Val

Thr 175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser 180

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin 195

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr 200

Ser

Leu

Ser

Ser

Val 205

Val

Thr

Val

Pro

Ser 210

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr 215

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys 220

Asn

Val

Asp

His

Lys 225

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys 230

Val

Asp

Lys

Thr

Val 235

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys 240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 260

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 265

Thr

Leu

Met

íle

Ser 270

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 275

Thr

Cys

Val

Val

Val 280

Asp

Val

Ser

His

Glu 285

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290 295 300

Thr 305

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 310

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr 315

Phe

Arg

Val

Val

Ser 320

Val

Leu

Thr

Val

Val 325

His

Gin

Asp

Trp

Leu 330

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 340

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro 345

Ala

Pro

íle

Glu

Lys 350

Thr

íle

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser 370

Arg

Glu

Glu

Met

Thr 375

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 380

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 385

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 390

Ser

Asp

íle

Ala

Val 395

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 410

Pro

Pro

Met

Leu

Asp 415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 420

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 425

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 430

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 435

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 440

Cys

Ser

Val

Met

His 445

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 96 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 96

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Val

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

His

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

íle 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg 75

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala 80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

íle

Ser 90

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Gly

Gly

His 120

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp 125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly 130

Thr

Leu

Val

Thr

Val 135

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr 140

Lys

Gly

Pro

Ser

Val 145

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 150

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr 155

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala 160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu 165

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Glu

Pro

Val

Thr 175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser 180

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin 195

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr 200

Ser

Leu

Ser

Ser

Val 205

Val

Thr

Val

Pro

Ser 210

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr 215

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys 220

Asn

Val

Asp

His

Lys 225

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys 230

Val

Asp

Lys

Thr

Val 235

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys 240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

íle

Ser

Arg

Thr

260 265 270

Pro

Glu

Val 275

Thr

Cys

Val

Val

Val 280

Asp

Val

Ser

His

Glu 285

Asp

Pro

Glu

Val

Gin 290

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 295

Asp

Gly

Val

Glu

Val 300

His

Asn

Ala

Lys

Thr 305

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 310

Gin

Phe

Gin

Ser

Thr 315

Phe

Arg

Val

Val

Ser 320

Val

Leu

Thr

Val

Val 325

His

Gin

Asp

Trp

Leu 330

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 340

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro 345

Ala

Pro

íle

Glu

Lys 350

Thr

íle

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser 370

Arg

Glu

Glu

Met

Thr 375

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 380

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 385

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 390

Ser

Asp

íle

Ala

Val 395

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 410

Pro

Pro

Met

Leu

Asp 415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 420

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 425

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 430

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 435

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 440

Cys

Ser

Val

Met

His 445

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 97 <211> 235 <212> PRT <213> Human <400> 97

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

íle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

íle

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

50

55

60

Pro

Arg

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

65

70

75

80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

85

90

95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

115

120

125

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165

170

175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

<210> 98 <211>464 <212> PRT <213> Human <400> 98

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

20 Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

25 Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

30 Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

35 Tyr

Gly

Met

His

Trp

40 Val

Arg

Gin

Ala

Pro

45 Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

50 Trp

Val

Ala

Val

íle

55 Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

60 Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65 Asp

Ser

Val

Lys

Gly

70 Arg

Phe

Thr

íle

Ser

75 Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

80 Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

85 Gin

Met

Asn

Ser

Leu

90 Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

95 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

100 Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

105 Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

110 Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

115 Gly

Thr

Leu

Val

Thr

120 Val

Ser

Ser

Ala

Ser

125 Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130 Val

Phe

Pro

Leu

Ala

135 Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

140 Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145 Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

150 Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

155 Phe

Pro

Glu

Pro

Val

160 Thr

Val

Ser

Trp

Asn

165 Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

170 Ser

Gly

Val

His

Thr

175 Phe

Pro

Ala

Val

Leu

180 Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

185 Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

190 Val

Val

Thr

Val

Pro

195 Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

200 Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

205 Cys

Asn

Val

Asp

His

210 Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

215 Lys

Val

Asp

Lys

Thr

220 Val

Glu

Arg

Lys

Cys

225 Cys

Val

Glu

Cys

Pro

230 Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

235 Pro

Val

Ala

Gly

Pro

240 Ser

Val

Phe

Leu

Phe

245 Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

250 Asp

Thr

Leu

Met

íle

255 Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

260 Val

Thr

Cys

Val

Val

265 Val

Asp

Val

Ser

His

270 Glu

Asp

Pro

Glu

Val

275 Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

280 Val

Asp

Gly

Val

Glu

285 Val

His

Asn

Ala

Lys

290 Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

295 Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

300 Thr

Phe

Arg

Val

Val

305 Ser

Val

Leu

Thr

Val

310 Val

His

Gin

Asp

Trp

315 Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

320 Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

325 Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

330 Pro

Ala

Pro

íle

Glu

335 Lys

Thr

íle

Ser

Lys

340 Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

345 Arg

Glu

Pro

Gin

Val

350 Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

355 Ser

Arg

Glu

Glu

Met

360 Thr

Lys

Asn

Gin

Val

365 Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370 Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

375 Pro

Ser

Asp

íle

Ala

380 Val

Glu

Trp

Glu

Ser

385 Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

390 Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

395 Thr

Pro

Pro

Met

Leu

400 Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

405 Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

410 Lys

Leu

Thr

Val

Asp

415 Lys

Ser

420 425 430

Arg	Trp	Gin 435	Gin
Leu	His	Asn	His
450 <210> 99 <211> 233 <212> PRT <213> Human <400> 99 Met Glu	Thr	Pro
1
Asp	Thr	Thr	Gly
Leu	Ser	Pro	20 Gly
Ser	Ser	35 Tyr	Leu
Leu	50 Leu	íle	Tyr
65
Phe	Ser	Gly	Ser
Leu	Glu	Pro	Glu
Ser	Pro	Phe	100 Thr
Val	Ala	115 Ala	Pro
Lys	130 Ser	Gly	Thr
145
Arg	Glu	Ala	Lys
Asn	Ser	Gin	Glu
Ser	Leu	Ser	180 Ser
Lys	Val	195 Tyr	Ala
Thr	210 Lys	Ser	Phe

225 <210> 100 <211> 463 <212> PRT <213> Human

Gly	Asn	Val	Phe 440
Tyr	Thr	Gin 455	Lys

Ala	Gin	Leu	Leu
5
Glu	íle	Val	Leu
Glu	Arg	Ala	Thr 40
Ala	Trp	Tyr 55	Gin
Gly	Ala 70	Ser	Ser
Gly	Ser	Gly	Thr
85
Asp	Phe	Ala	Val
Phe	Gly	Gly	Gly 120
Ser	Val	Phe 135	íle
Ala	Ser 150	Val	Val
Val	Gin	Trp	Lys
165
Ser	Val	Thr	Glu
Thr	Leu	Thr	Leu 200
Cys	Glu	Val 215	Thr
Asn	Arg 230	Gly	Glu

Ser	Cys	Ser	Val
Ser	Leu	Ser	Leu 460

Phe	Leu 10	Leu	Leu
Thr 25	Gin	Ser	Pro
Leu	Ser	Cys	Arg
Gin	Lys	Pro	Gly 60
Arg	Ala	Thr 75	Gly
Asp	Phe 90	Thr	Leu
Tyr 105	Tyr	Cys	Gin
Thr	Lys	Val	Glu
Phe	Pro	Pro	Ser 140
Cys	Leu	Leu 155	Asn
Val	Asp 170	Asn	Ala
Gin 185	Asp	Ser	Lys
Ser	Lys	Ala	Asp
His Cys	Gin	Gly	Leu 220

Met	His	Glu	Ala
445
Ser	Pro	Gly	Lys

Leu Gly Thr	Trp Thr 30 Ser	Leu 15 Leu Val	Pro Ser Ser
45 Gin	Ala	Pro	Arg
He	Pro	Asp	Arg
Thr	íle	Ser	80 Arg
Gin	Tyr	95 Gly	íle
íle	110 Lys	Arg	Thr
125 Asp	Glu	Gin	Leu
Asn	Phe	Tyr	Pro
Leu	Gin	Ser	160 Gly
Asp	Ser	175 Thr	Tyr
Tyr	190 Glu	Lys	His
205 Ser	Ser	Pro	Val

<400> 100

Met 1	Glu	Phe	Gly
Val	Gin	Cys	Gin 20
Pro	Gly	Arg 35	Ser
Ser	Ser 50	Tyr	Gly
Glu 65	Trp	Val	Ala
Asp	Ser	Ala	Lys
Thr	Leu	Tyr	Leu 100

Leu	Ser	Trp	Val
5
Val	Gin	Leu	Val
Leu	Arg	Leu	Ser 40
Met	His	Trp 55	Val
Val	íle 70	Trp	Tyr
Gly	Arg	Phe	Thr
85
Gin	Met	Asn	Ser

Phe	Leu 10	Val	Ala
Glu 25	Ser	Gly	Gly
Cys	Thr	Ala	Ser
Arg	Gin	Ala	Pro 60
Asp	Gly	Ser 75	Asn
íle	Ser 90	Arg	Asp
Leu 105	Arg	Ala	Glu

Leu	Leu	Arg 15	Gly
Gly	Val 30	Val	Glu
Gly 45	Phe	Thr	Phe
Gly	Lys	Gly	Leu
Lys	His	Tyr	Ala 80
Asn	Ser	Lys 95	Asn
Asp	Thr 110	Ala	Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu 120

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp 125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

íle

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

íle

Glu

Lys

Thr

íle

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

450

455

460

Lys

<210> 101 <211>234 <212> PRT <213> Human <400> 101

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly 20

Glu

íle

Val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 30

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 35

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 40

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 45

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 50

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 55

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 60

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 65

Pro

Leu

íle

Tyr

Gly 70

Val

Ser

Ser

Arg

Ala 75

Thr

Gly

íle

Pro

Asp 80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 90

Phe

Thr

Leu

Thr

íle 95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

100

105

110

íle

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

Arg

115

120

125

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

íle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130

135

140

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

145

150

155

160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

165

170

175

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

210

215

220

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 <210> 102 <211> 451 <212> PRT <213> Human <400> 102

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 10

Val

Gin

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

20 Trp

Val

Arg

Gin

Ala

25 Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30 Glu

Trp

Val

Ala

Val

35 íle

Trp

Tyr

Asp

Gly

40 Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

45 Ala

Asp

Ser

Val

Lys

50 Gly

Arg

Phe

Thr

íle

55 Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

60 Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65 Leu

Gin

Met

Asn

Ser

70 Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

75 Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

80 Cys

Ala

Arg

Asp

Pro

85 Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

90 Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

95 Gly

Met

Asp

Val

Trp

100 Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

105 Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

115 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

120 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

125 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

130 Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

135 Gly

Cys

Leu

Val

Lys

140 Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145 Pro

Val

Thr

Val

Ser

150 Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

155 Leu

Thr

Ser

Gly

Val

160 His

Thr

Phe

Pro

Ala

165 Val

Leu

Gin

Ser

Ser

170 Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

175 Ser

Ser

Val

Val

Thr

180 Val

Pro

Ser

Ser

Asn

185 Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

190 Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

195 Asp

His

Lys

Pro

Ser

200 Asn

Thr

Lys

Val

Asp

205 Lys

Thr

Val

Glu

Arg

210 Lys

Cys

Cys

Val

Glu

215 Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

220 Ala

Pro

Pro

Val

Ala

225 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

230 Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

235 Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

240 Met

íle

Ser

Arg

Thr

245 Pro

Glu

Val

Thr

Cys

250 Val

Val

Val

Asp

Val

255 Ser

His

260 265 270

Glu

Asp

Pro 275

Glu

Val

Gin

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 285

Val

Glu

Val

His

Asn 290

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 295

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe 300

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg 305

Val

Val

Ser

Val

Leu 310

Thr

Val

Val

His

Gin 315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 325

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 330

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro 335

íle

Glu

Lys

Thr

íle 340

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly 345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

Cys

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

íle

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Met

Leu

Asp

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His Pro

Glu Gly

Ala 435 Lys

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

450 <210> 103 <211> 214 <212> PRT <213> Human <400> 103

Asp 1

íle

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

íle

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

íle

Asn 30

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

íle

Tyr

Ala 50

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

íle 75

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro 95

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 100

Gly

Thr

Lys

Val

Glu 105

íle

Lys

Arg

Thr

Val 110

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 115

Phe

íle

Phe

Pro

Pro 120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 125

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 130

Ser

Val

Val

Cys

Leu 135

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 140

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 145

Val

Gin

Trp

Lys

Val 150

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin 155

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin 160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu 165

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp 170

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu 175

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr 180

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp 185

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 190

Val

Tyr

Ala Phe

Cys Asn

Glu 195 Arg

Val Gly

Thr Glu

His Cys

Gin

Gly 200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val 205

Thr

Lys

Ser

210 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Human <400> 104 caggtgcagc tggagcagtc gg <210> 105 <211>24 <212> DNA <213> Human <400> 105 gctgagggag tagagtcctg agga <210> 106 <211>49 <212> DNA <213> Human <400> 106 tatctaagct tctagactcg <210> 107 <211>46 <212> DNA <213> Human accgccacca tggagtttgg gctgagctg <400> 107 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc <210> 108 <211>9 <212> DNA <213> Human ggagacaggg agagct <400> 108 accgccacc <210> 109 <211> 45 <212> DNA <213> Human <400> 109 tcttcaagct tgcccgggcc <210> 110 <211> 43 <212> DNA <213> Human cgccaccatg gaaaccccag cgcag <400> 110 ttctttgatc agaattctca <210> 111 <211> 48 <212 > DNA <213> Human ctaacactct cccctgttga age <400> 111 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gacatgaggg tccccgct

<210> 112 <211> 1392 <212> DNA <213> Human
<400> 112
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtgtagcgt	ctggattcac	cttcagtagc	catggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagaaataa	atactatgca	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtttctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	aggaggtcac	360
ttcggtcctt	ttgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	agcctccacc	420
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gagcacagcg	480
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	540
ggcgctctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccagctgtcc	tacagtcctc	aggactctac	600
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcaacttcg	gcacccagac	ctacacctgc	660
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	cagttgagcg	caaatgttgt	720
gtcgagtgcc	caccgtgccc	agcaccacct	gtggcaggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	780
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacgtg	cgtggtggtg	840
gacgtgagcc	acgaagaccc	cgaggtccag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	900
cataatgcca	agacaaagcc	acgggaggag	cagttcaaca	gcacgttccg	tgtggtcagc	960
gtcctcaccg	ttgtgcacca	ggactggctg	aacggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	1020
aacaaaggcc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aaaccaaagg	gcagccccga	1080
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggaggaga	tgaccaagaa	ccaggtcagc	1140
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctacccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	1200
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccaca	cctcccatgc	tggactccga	cggctccttc	1260
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1320
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1380
ccgggtaaat	ga					1392
<210> 113
<211>708
<212> DNA
<213> Human
<400> 113
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgca	gggccagtca	gagtattagc	agcagcttct	tagcctggta	ccagcagaga	180
cctggccagg	ctcccaggct	cctcatctat	ggtgcatcca	gcagggccac	tggcatccca	240
gacaggttca	gtggcagtgg	gtctgggaca	gacttcactc	tcaccatcag	cagactggag	300
cctgaagatt	ttgcagtgta	ttactgtcag	cagtatggta	cctcaccctg	gacgttcggc	360
caagggacca	aggtggaaat	caaacgaact	gtggctgcac	catctgtctt	catcttcccg	420
ccatctgatg	agcagttgaa	atctggaact	gcctctgttg	tgtgcctgct	gaataacttc	480
tatcccagag	aggccaaagt	acagtggaag	gtggataacg	ccctccaatc	gggtaactcc	540
caggagagtg	tcacagagca	ggacagcaag	gacagcacct	acagcctcag	cagcaccctg	600
acgctgagca	aagcagacta	cgagaaacac	aaagtctacg	cctgcgaagt	cacccatcag	660
ggcctgagct	cgcccgtcac	aaagagcttc	aacaggggag	agtgttag		708
<210> 114
<211> 1395
<212> DNA
<213> Human
<400> 114
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtacagcgt	ctggattcac	cttcagtaac	tatggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagtaataa	acactatgga	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agtgacaatt	ccaagaacac	gctgtatctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	aggagagaga	360

ctggggtcct	actttgacta	ctggggccag	ggaaccctgg	tcaccgtctc	ctcagcctcc	420
accaagggcc	catcggtctt	ccccctggcg	ccctgctcca	ggagcacctc	cgagagcaca	480
gcggccctgg	gctgcctggt	caaggactac	ttccccgaac	cggtgacggt	gtcgtggaac	540
tcaggcgctc	tgaccagcgg	cgtgcacacc	ttcccagctg	tcctacagtc	ctcaggactc	600
tactccctca	gcagcgtggt	gaccgtgccc	tccagcaact	tcggcaccca	gacctacacc	660
tgcaacgtag	atcacaagcc	cagcaacacc	aaggtggaca	agacagttga	gcgcaaatgt	720
tgtgtcgagt	gcccaccgtg	cccagcacca	cctgtggcag	gaccgtcagt	cttcctcttc	780
cccccaaaac	ccaaggacac	cctcatgatc	tcccggaccc	ctgaggtcac	gtgcgtggtg	840
gtggacgtga	gccacgaaga	ccccgaggtc	cagttcaact	ggtacgtgga	cggcgtggag	900
gtgcataatg	ccaagacaaa	gccacgggag	gagcagttca	acagcacgtt	ccgtgtggtc	960
agcgtcctca	ccgttgtgca	ccaggactgg	ctgaacggca	aggagtacaa	gtgcaaggtc	1020
tccaacaaag	gcctcccagc	ccccatcgag	aaaaccatct	ccaaaaccaa	agggcagccc	1080
cgagaaccac	aggtgtacac	cctgccccca	tcccgggagg	agatgaccaa	gaaccaggtc	1140
agcctgacct	gcctggtcaa	aggcttctac	cccagcgaca	tcgccgtgga	gtgggagagc	1200
aatgggcagc	cggagaacaa	ctacaagacc	acacctccca	tgctggactc	cgacggctcc	1260
ttcttcctct	acagcaagct	caccgtggac	aagagcaggt	ggcagcaggg	gaacgtcttc	1320
tcatgctccg	tgatgcatga	ggctctgcac	aaccactaca	egeagaagag	cctctccctg	1380
tctccgggta	aatga					1395
<210> 115
<211>702
<212> DNA
<213> Human
<400> 115
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgca	ggaccagtgt	tagcagcagt	tacttagcct	ggtaccagca	gaaacctggc	180
caggctccca	ggctcctcat	ctatggtgca	tccagcaggg	ccactggcat	cccagacagg	240
ttcagtggca	gtgggtctgg	gacagacttc	actctcacca	tcagcagact	ggagcctgaa	300
gattttgcag	tctattactg	tcagcagtat	ggcatctcac	ccttcacttt	cggcggaggg	360
accaaggtgg	agatcaagcg	aactgtggct	gcaccatctg	tetteatett	cccgccatct	420
gatgagcagt	tgaaatctgg	aactgcctct	gttgtgtgcc	tgctgaataa	cttctatccc	480
agagaggcca	aagtacagtg	gaaggtggat	aacgccctcc	aatcgggtaa	ctcccaggag	540
agtgtcacag	agcaggacag	caaggacagc	acctacagcc	tcagcagcac	cctgacgctg	600
agcaaagcag	actacgagaa	acacaaagtc	tacgcctgcg	aagtcaccca	tcagggcctg	660
agctcgcccg	tcacaaagag	cttcaacagg	ggagagtgtt	ag		702
<210> 116
<211> 489
<212> DNA
<213> Human
<400> 116
cctgggaggt	ccctgagact	ctcctgtgca	gcgtctggat	tcaccttcag	tagtcatggc	60
atccactggg	tccgccaggc	tccaggcaag	gggctggagt	gggtggcagt	tatatggtat	120
gatggaagaa	ataaagacta	tgcagactcc	gtgaagggcc	gattcaccat	ctccagagac	180
aattccaaga	agacgctgta	tttgcaaatg	aacagcctga	gagccgagga	cacggctgtg	240
tattactgtg	cgagagtggc	cccactgggg	ccacttgact	actggggcca	gggaaccctg	300
gtcaccgtct	cctcagcctc	caccaagggc	ccatcggtct	tccccctggc	gccctgctcc	360
aggagcacct	ccgagagcac	agcggccctg	ggctgcctgg	tcaaggacta	cttccccgaa	420
ceggtgacgg	tgtcgtggaa	ctcaggcgct	ctgaccagcg	gcgtgcacac	cttcccagct	480
gtcctacag						489
<210> 117
<211> 417
<212> DNA
<213> Human
<400> 117
ggcaccctgt	ctttgtctcc	aggggaaaga	gccaccctct	cctgcagggc	cagtcagagt	60
gtcagcagct	acttagcctg	gtaccagcag	aaacctggcc	aggctcccag	actcctcatc	120
tatggtgcat	ccagcagggc	cactggcatc	ccagacaggt	tcagtggcag	tgggtctggg	180

acagacttca	ctctcaccat	cagcagactg	gagcctgagg	attttgcagt	gtattactgt	240
cagcagtatg	gtaggtcacc	attcactttc	ggccctggga	ccaaagtgga	tatcaagcga	300
actgtggctg	caccatctgt	cttcatcttc	ccgccatctg	atgagcagtt	gaaatctgga	360
actgcctctg	ttgtgtgcct	gctgaataac	ttctatccca	gagaggccaa	agtacag	417
<210> 118
<211> 1392
<212> DNA
<213> Human
<400> 118
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtcgagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtacagcgt	ctggattcac	cttcagtagt	tatggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagcaataa	acactatgca	240
gactccgcga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtatctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	agccggactg	360
ctgggttact	ttgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	agcctccacc	420
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gagcacagcg	480
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	540
ggcgctctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccagctgtcc	tacagtcctc	aggactctac	600
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcaacttcg	gcacccagac	ctacacctgc	660
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	cagttgagcg	caaatgttgt	720
gtcgagtgcc	caccgtgccc	agcaccacct	gtggcaggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	780
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacgtg	cgtggtggtg	840
gacgtgagcc	acgaagaccc	cgaggtccag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	900
cataatgcca	agacaaagcc	acgggaggag	cagttcaaca	gcacgttccg	tgtggtcagc	960
gtcctcaccg	ttgtgcacca	ggactggctg	aacggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	1020
aacaaaggcc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aaaccaaagg	gcagccccga	1080
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggaggaga	tgaccaagaa	ccaggtcagc	1140
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctacccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	1200
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccaca	cctcccatgc	tggactccga	cggctccttc	1260
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1320
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1380
ccgggtaaat	ga					1392
<210> 119
<211>705
<212> DNA
<213> Human
<400> 119
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgta	gggccagtca	aagtgttagc	agctacttag	cctggtacca	acagaaacct	180
ggccaggctc	ccaggcccct	catctatggt	gtatccagca	gggccactgg	catcccagac	240
aggttcagtg	gcagtgggtc	tgggacagac	ttcactctca	ccatcagcag	actggagcct	300
gaagattttg	cagtgtatta	ctgtcagcag	tatggtatct	caccattcac	tttcggccct	360
gggaccaaag	tggatatcaa	acgaactgtg	gctgcaccat	ctgtcttcat	cttcccgcca	420
tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	tctgttgtgt	gcctgctgaa	taacttctat	480
cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	tccaatcggg	taactcccag	540
gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	gcctcagcag	caccctgacg	600
ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	gcgaagtcac	ccatcagggc	660
ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	gttag		705
<210> 120
<211> 507
<212> DNA
<213> Human
<400> 120
ggcgtggtcc	agcctgggag	gtccctgaga	ctctcctgtg	cagcgtctgg	attcaccttc	60
agtagctatg	gcatgcactg	ggtccgccag	gctccaggca	aggggctgga	gtgggtggca	120

gttatatggt	atgatggaag	taataaatac	tatgcagact	ccgtgaaggg	ccgattcacc	180
atctccagag	acaattccaa	gaacacgctg	tatctgcaaa	tgaacagcct	gagagccgag	240
gacacggctg	tgtattactg	tgcgagaggg	gcccgtataa	taaccccttg	tatggacgtc	300
tggggccaag	ggaccacggt	caccgtctcc	tcagcctcca	ccaagggccc	atcggtcttc	360
cccctggcgc	cctgctccag	gagcacctcc	gagagcacag	cggccctggg	ctgcctggtc	420
aaggactact	tccccgaacc	ggtgacggtg	tcgtggaact	caggcgctct	gaccagcggc	480
gtgcacacct <210> 121 <211> 458 <212> DNA <213> Human	tcccagctgt	cctacag				507
<400> 121 cagtctccat	cctccctgtc	tgcatctgta	ggagacagag	tcaccatcac	ttgccgggca	60
agtcagagca	ttaacaccta	tttaatttgg	tatcagcaga	aaccagggaa	agcccctaac	120
ttcctgatct	ctgctacatc	cattttgcaa	agtggggtcc	catcaaggtt	ccgtggcagt	180
ggctctggga	caaatttcac	tctcaccatc	aacagtcttc	atcctgaaga	ttttgcaact	240
tactactgtc	aacagagtta	cagtacccca	ttcactttcg	gccctgggac	caaagtggat	300
atcaaacgaa	ctgtggctgc	accatctgtc	ttcatcttcc	cgccatctga	tgagcagttg	360
aaatctggaa	ctgcctctgt	tgtgtgcctg	ctgaataact	tctatcccag	agaggccaaa	420
gtacagtgga <210> 122 <211> 501 <212> DNA <213> Human	aggtggataa	cgccctccaa	tcgggtaa			458
<400> 122 ggcgtggtcc	agcctgggag	gtccctgaga	ctctcctgtg	tagcgtctgg	attcatcttc	60
agtagtcatg	gcatccactg	ggtccgccag	gctccaggca	aggggctgga	gtgggtggca	120
gttatatggt	atgatggaag	aaataaagac	tatgcagact	ccgtgaaggg	ccgattcacc	180
atctccagag	acaattccaa	gaacacgctg	tatttgcaaa	tgaacagcct	gagagccgag	240
gacacggctg	tgtattactg	tgcgagagtg	gccccactgg	ggccacttga	ctactggggc	300
cagggaaccc	tggtcaccgt	ctcctcagcc	tccaccaagg	gcccatcggt	cttccccctg	360
gcgccctgct	ccaggagcac	ctccgagagc	acagcggccc	tgggctgcct	ggtcaaggac	420
tacttccccg	aaccggtgac	ggtgtcgtgg	aactcaggcg	ctctgaccag	cggcgtgcac	480
accttcccag <210> 123 <211>426 <212> DNA <213> Human	ctgtcctaca	g				501
<400> 123 tctccaggca	ccctgtcttt	gtctccaggg	gaaagagcca	ccctctcctg	cagggccagt	60
cagagtatta	gcagcaattt	cttagcctgg	taccagcaga	aacctggcca	ggctcccagg	120
ctcctcatct	atcgtccatc	cagcagggcc	actggcatcc	cagacagttt	cagtggcagt	180
gggtctggga	cagacttcac	tctcaccatc	agcagactgg	agcctgagga	ttttgcatta	240
tattactgtc	agcagtatgg	tacgtcacca	ttcactttcg	gccctgggac	caaagtggat	300
atcaagcgaa	ctgtggctgc	accatctgtc	ttcatcttcc	cgccatctga	tgagcagttg	360
aaatctggaa	ctgcctctgt	tgtgtgcctg	ctgaataact	tctatcccag	agaggccaaa	420
gtacag <210> 124 <211> 516 <212> DNA <213> Human						426
<400> 124 tcgggcccag	gactggtgaa	gccttcacag	atcctgtccc	tcacctgcac	tgtctctggt	60
ggctccatca	gcagtggtgg	tcactactgg	agctggatcc	gccagcaccc	agggaagggc	120
ctggagtgga	ttgggtacat	ctattacatt	gggaacacct	actacaaccc	gtccctcaag	180
agtcgagtta	ccatatcagt	agacacgtct	aagaaccagt	tctccctgaa	gctgagctct	240

gtgactgccg	cggacacggc	cgtgtattat	tgtgcgagag	atagtgggga	ctactacggt	300
atagacgtct	ggggccaagg	gaccacggtc	accgtctcct	cagcttccac	caagggccca	360
tccgtcttcc	ccctggcgcc	ctgctccagg	agcacctccg	agagcacagc	cgccctgggc	420
tgcctggtca	aggactactt	ccccgaaccg	gtgacggtgt	cgtggaactc	aggcgccctg	480
accagcggcg <210> 125 <211> 465 <212> DNA <213> Human	tgcacacctt	cccggctgtc	ctacaa			516
<400> 125 tctccagact	ttcagtctgt	gactccaaag	gagaaagtca	ccatcacctg	ccgggccagt	60
cagagcattg	gtagtagctt	acattggtat	cagcagaaac	cagatcagtc	tccaaagctc	120
ctcatcaagt	atgcttccca	gtccttctct	ggggtcccct	cgaggttcag	tggcagtgga	180
tctgggacag	atttcaccct	caccatcaat	agcctggaag	ctgaagatgc	tgcaacgtat	240
tactgtcatc	agagtagtag	tttaccgctc	actttcggcg	gagggaccaa	ggtggagatc	300
aaacgaactg	tggctgcacc	atctgtcttc	atcttcccgc	catctgatga	gcagttgaaa	360
tctggaactg	cctctgttgt	gtgcctgctg	aataacttct	atcccagaga	ggccaaagta	420
cagtggaagg <210> 126 <211>459 <212> DNA <213> Human	tggataacgc	cctccaatcg	ggtaactccc	aggag		465
<400> 126 cctgggaggt	ccctgagact	ctcctgtgca	gcgtctggat	tcaccttcag	tagtcatggc	60
atccactggg	tccgccaggc	tccaggcaag	gggctggagt	gggtggcagt	tatatggtat	120
gatggaagaa	ataaagacta	tgcagactcc	gtgaagggcc	gattcaccat	ctccagagac	180
aattccaaga	acacgctgta	tttgcaaatg	aacagcctga	gagccgagga	cacggctgtg	240
tattactgtg	cgagagtggc	cccactgggg	ccacttgact	actggggcca	gggaaccctg	300
gtcaccgtct	cctcagcctc	caccaagggc	ccatcggtct	tccccctggc	gccctgctcc	360
aggagcacct	ccgagagcac	agcggccctg	ggctgcctgg	tcaaggacta	cttccccgaa	420
ccggtgacgg <210> 127 <211>440 <212> DNA <213> Human	tgtcgtggaa	ctcaggcgct	ctgaccagc			459
<400> 127 cagtctccag	gcaccctgtc	tttgtctcca	ggggaaagag	ccaccctctc	ctgcagggcc	60
agtcagagtg	tcagcagcta	cttagcctgg	taccagcaga	aacctggcca	ggctcccagg	120
ctcctcatct	atggtgcatc	cagcagggcc	actggcatcc	cagacaggtt	cagtggcagt	180
gggtctggga	cagacttcac	tctcaccatc	agcagactgg	agcctgagga	ttttgcagtg	240
tattactgtc	aacagtatgg	taggtcacca	ttcactttcg	gccctgggac	caaagtagat	300
atcaagcgaa	ctgtggctgc	accatctgtc	ttcatcttcc	cgccatctga	tgagcagttg	360
aaatctggaa	ctgcctctgt	tgtgtgcctg	ctgaataact	tctatcccag	agaggccaaa	420
gtacagtgga <210> 128 <211> 503 <212> DNA <213> Human	aaggtggata					440
<400> 128 ggcgtggtcc	agcctgggag	gtccctgaga	ctctcctgtg	cagcgtctgg	attcaccttc	60
agtagctatg	gcatgcactg	ggtccgccag	gctccaggca	aggggctgga	gtgggtggca	120
gttatatggt	atgatggaag	taataaatac	tatgcagact	ccgtgaaggg	ccgattcacc	180
atctccagag	acaattccaa	gaacacgctg	tatctgcaaa	tgaacagcct	gagagccgag	240
gacacggctg	tgtattactg	tgcgagagat	ccgaggggag	ctacccttta	ctactactac	300
taccggtkgg	acgtctgggg	ccaagggacc	acggtcaccg	tctcctcagc	ctccaccaag	360
ggcccatcgg	tcttccccct	ggcgccctgc	tccaggagca	cctccgagag	cacagcggcc	420

ctgggctgcc	tggtcaagga	ctacttcccc	gaaccggtga	cggtgtcgtg	gaactcaggc	480
gctctgacca <210> 129 <211> 417 <212> DNA <213> Human	gcggcgtgca	cac				503
<400> 129
ccatcctccc	tgtctgcatc	tgtaggagac	agagtcacca	tcacttgccg	ggcaagtcag	60
agcattaaca	gctatttaga	ttggtatcag	cagaaaccag	ggaaagcccc	taaactcctg	120
atctatgctg	catccagttt	gcaaagtggg	gtcccatcaa	ggttcagtgg	cagtggatct	180
gggacagatt	tcactctcac	catcagcagt	ctgcaacctg	aagattttgc	aacttactac	240
tgtcaacagt	attacagtac	tccattcact	ttcggccctg	ggaccaaagt	ggaaatcaaa	300
cgaactgtgg	ctgcaccatc	tgtcttcatc	ttcccgccat	ctgatgagca	gttgaaatct	360
ggaactgcct <210> 130 <211> 451 <212> DNA <213> Human	ctgttgtgtg	cctgctgaat	aacttctatc	ccagagaggc	caaagta	417
<400> 130 ggcgtggtcc	agcctgggag	gtccctgaga	ctctcctgtg	cagcgtctgg	attcaccttc	60
agtagctatg	gcatgcactg	ggtccgccag	gctccaggca	aggggctgga	gtgggtggca	120
gttatatggt	atgatggaag	tcataaatac	tatgcagact	ccgtgaaggg	ccgattcacc	180
atctccagag	acaattccaa	gaacacgctg	tatctgcaaa	tgaacagcct	gagagccgag	240
gacacggctg	tgtattactg	tgcgagaggc	gctgtagtag	taccagctgc	tatggacgtc	300
tggggccaag	ggaccacggt	caccgtctcc	tcagcctcca	ccaagggccc	atcggtcttc	360
cccctggcgc	cctgctccag	gagcacctcc	gagagcacag	cggccctggg	ctgcctggtc	420
aaggactact <210> 131 <211>402 <212> DNA <213> Human	tccccgaacc	ggtgacggtg	t			451
<220>
<400> 131 acccagtctc	catcctccct	gtctgcatct	gtaggagaca	gagtcaccat	cacttgccgg	60
gcaagtcaga	acattagcag	gtatttaaat	tggtatcaac	agaaaccagg	gaaagcccct	120
aagttcctga	tctatgttgc	atctattttg	caaagtgggg	tcccatcagg	gttcagtgcc	180
agtggatctg	ggccagattt	cactctnacc	atcagcagtc	tgcaacctga	agattttgca	240
acttactact	gtcaacagag	ttacagtacc	ccattcactt	tcggccctgg	gaccaaagtg	300
gatatcaaac	gaactgtggc	tgcaccatct	gtcttcatct	tcccgccatc	tgatgagcag	360
ttgaaatctg <210> 132 <211> 438 <212> DNA <213> Human	gaactgcctc	tgttgtgtgc	ctgctgaata	ac		402
<220>
<400> 132 gtggtccagc	ctgggaggtc	cctgagactc	tcctgtgcag	cgtctggatt	caccttcagt	60
agcngtggca	tgcactgggt	ccgccaggct	ccaggcaagg	ggctggagtg	ggtggcagtt	120
atatggtctg	atggaagtca	taaatactat	gcagactccg	tgaagggccg	attcaccatc	180
tccagagaca	attccaagaa	cacgctgtat	ctgcaaatga	acagcctgag	agccgaggac	240
acggctgtgt	attactgtgc	gagaggaact	atgatagtag	tgggtaccct	tgactactgg	300
ggccagggaa	ccctggtcac	cgtctcctca	gcctccacca	agggcccatc	ggtcttcccc	360
ctggcgccct	gctccaggag	cacctccgag	agcacagcgg	ccctgggctg	cctggtcaag	420
gactacttcc	ccgaaccg					438

<210> 133 <211> 451 <212> DNA <213> Human
<400> 133 acccagtctc	catcctccct	gtctgcatct	gtaggagaca	gagtcaccat	cacttgccgg	60
gcaagtcaga	gcatttgcaa	ctatttaaat	tggtatcagc	agaaaccagg	aaaagcccct	120
agggtcctga	tctatgctgc	atccagtttg	caaggtgggg	tcccgtcaag	gttcagtggc	180
agtggatctg	ggacagattg	cactctcacc	atcagcagtc	tgcaacctga	agattttgca	240
acttactact	gtcaacagag	ttacactacc	ccattcactt	tcggccctgg	gaccagagtg	300
gatatcgaac	gaactgtggc	tgcaccatct	gtcttcatct	tcccgccatc	tgatgagcag	360
ttgaaatctg	gaactgcctc	tgttgtgtgc	ctgctgaata	acttctatcc	cagagaggcc	420
aaagtacagt <210> 134 <211>562 <212> DNA <213> Human	ggaaggtgga	taacgcctat	t			451
<400> 134 tcctgtgcag	cgtctggatt	caccttcagt	tactatggcg	tctgggggag	gcgtggtcca	60
gcctgggagg	tccctgagac	tctcctgtgc	agcgtctgga	ttcaccttca	gtagctatgg	120
cgtgcactgg	gtccgccagg	ctccaggcaa	ggggctggag	tgggtggcag	ttatatggta	180
tgatggaagt	aataaatact	atgcagactc	cgtgaagggc	cgattcacca	tctccagaga	240
caattccaag	agcacgctgt	atctgcaaat	gaacagcctg	agagccgagg	acacggctgt	300
gtattattgt	gcgagagact	cgtattacga	tttttggagt	ggtcggggcg	gtatggacgt	360
ctggggccaa	gggaccacgg	tcaccgtctc	ctcagcctcc	accaagggcc	catcggtctt	420
ccccctggcg	ccctgctcca	ggagcacctc	cgagagcaca	gcggccctgg	gctgcctggt	480
caaggactac	ttccccgaac	cggtgacggt	gtcgtggaac	tcaggcgctc	tgaccagcgg	540
cgtgcacacc <210> 135 <211> 419 <212> DNA <213> Human	ttcccagctg	tc				562
<400> 135
ccactctccc	tgcccgtcac	ccttggacag	ccggcctcca	tctcctgcag	gtctagtcaa	60
agcctcgtat	acagtgatgg	aaacacctac	ttgaattggt	ttcagcagag	gccaggccaa	120
tctccaaggc	gcctaattta	taaggtttct	aactgggact	ctggggtccc	agacagattc	180
agcggcagtg	ggtcaggcac	tgatttcaca	ctgaaaatca	gcagggtgga	ggctgaggat	240
gttggggttt	attactgcat	gcaaggttca	cactggcctc	cgacgttcgg	ccaagggacc	300
aaggtggaaa	tcaaacgaac	tgtggctgca	ccatctgtct	tcatcttccc	gccatctgat	360
gagcagttga <210> 136 <211>490 <212> DNA <213> Human	aatctggaac	tgcctctgtt	gtgtgcctgc	tgaataactt	ctatcccac	419
<400> 136 gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	tgtgcagcgt	ctggattcac	cttcagtaac	60
tatgccatgc	actgggtccg	ccaggctcca	ggcaaggggc	tggagtgggt	ggtagttatt	120
tggcatgatg	gaaataataa	atactatgca	gagtccgtga	agggccgatt	caccatctcc	180
agagacaatt	ccaagaacac	gctgtatctg	caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	240
gctgtatatt	actgtgcgag	agatcagggc	actggctggt	acggaggctt	tgacttctgg	300
ggccagggaa	ccctggtcac	cgtctcctca	gcctccacca	agggcccatc	ggtcttcccc	360
ctggcgccct	gctccaggag	cacctccgag	agcacagcgg	ccctgggctg	cctggtcaag	420
gactacttcc	ccgaaccggt	gacggtgtcg	tggaactcag	gcgctctgac	cagcggcgtg	480
cacaccttcc <210> 137 <211> 419						490

<212> DNA <213> Human
<400> 137
cctggagagc	cggcttccat	ctcttgcagg	tctagtcaga	gcctcctgca	tagtaatgga	60
tacaactatt	tggattggta	cctgcagaag	ccaggacagt	ctccacagct	cctgatctat	120
ttgggttcta	atcgggcctc	cggggtccct	gacaggttca	gtggcagtgg	atcaggcaca	180
gattttacac	tgaaactcag	cagagtggag	gctgaggatg	ttggggttta	ttactgcatg	240
caagctctac	aaactcctct	cactttcggc	ggagggacca	aggtggagat	caaacgaact	300
gtggctgcac	catctgtctt	catcttcccg	ccatctgatg	agcagttgaa	atctggaact	360
gcctctgttg	tgtgcctgct	gaataacttc	tatcccagar	aggccaaagt	acattccat	419
<210> 138
<211> 1392
<212> DNA
<213> Human
<400> 138
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtgtagcgt	ctggattcac	cttcagtagc	catggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagaaataa	atactatgca	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtttctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	aggaggtcac	360
ttcggtcctt	ttgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	agcctccacc	420
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gageacagcg	480
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	540
ggcgctctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccagctgtcc	tacagtcetc	aggactctac	600
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcaacttcg	gcacccagac	ctacacctgc	660
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	cagttgagcg	caaatgttgt	720
gtcgagtgcc	caccgtgccc	agcaccacct	gtggcaggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	780
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacgtg	cgtggtggtg	840
gacgtgagcc	acgaagaccc	cgaggtccag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	900
cataatgcca	agacaaagcc	acgggaggag	cagttcaaca	gcacgttccg	tgtggtcagc	960
gtcctcaccg	ttgtgcacca	ggactggctg	aacggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	1020
aacaaaggcc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aaaccaaagg	gcagccccga	1080
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggaggaga	tgaccaagaa	ccaggtcagc	1140
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctacccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	1200
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccaca	cctcccatgc	tggactccga	cggctccttc	1260
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1320
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1380
ccgggtaaat	ga					1392
<210> 139
<211> 1999
<212> DNA
<213> Human
<400> 139
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtgtagcgt	ctggattcac	cttcagtagc	catggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagaaataa	atactatgca	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtttctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	aggaggtcac	360
ttcggtcctt	ttgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	agctagcacc	420
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gageacagcg	480
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	540
ggcgctctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccagctgtcc	tacagtcetc	aggactctac	600
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcaacttcg	gcacccagac	ctacacctgc	660
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	cagttggtga	gaggccagct	720
cagggaggga	gggtgtctgc	tggaagccag	gctcagccct	cctgcctgga	cgcaccccgg	780

ctgtgcagcc	ccagcccagg	gcagcaaggc	aggccccatc	tgtctcctca	cccggaggcc	840
tctgcccgcc	ccactcatgc	tcagggagag	ggtcttctgg	ctttttccac	caggctccag	900
gcaggcacag	gctgggtgcc	cctaccccag	gcccttcaca	cacaggggca	ggtgcttggc	960
tcagacctgc	caaaagccat	atccgggagg	accctgcccc	tgacctaagc	cgaccccaaa	1020
ggccaaactg	tccactccct	cagctcggac	accttctctc	ctcccagatc	cgagtaactc	1080
ccaatcttct	ctctgcagag	cgcaaatgtt	gtgtcgagtg	cccaccgtgc	ccaggtaagc	1140
cagcccaggc	ctcgccctcc	agctcaaggc	gggacaggtg	ccctagagta	gcctgcatcc	1200
agggacaggc	cccagctggg	tgctgacacg	tccacctcca	tctcttcctc	agcaccacct	1260
gtggcaggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	1320
cggacccctg	aggtcacgtg	cgtggtggtg	gacgtgagcc	acgaagaccc	cgaggtccag	1380
ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	cataatgcca	agacaaagcc	acgggaggag	1440
cagttcaaca	gcacgttccg	tgtggtcagc	gtcctcaccg	ttgtgcacca	ggactggctg	1500
aacggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	aacaaaggcc	tcccagcccc	catcgagaaa	1560
accatctcca	aaaccaaagg	tgggacccgc	ggggtatgag	ggccacatgg	acagaggccg	1620
gctcggccca	ccctctgccc	tgggagtgac	cgctgtgcca	acctctgtcc	ctacagggca	1680
gccccgagaa	ccacaggtgt	acaccctgcc	cccatcccgg	gaggagatga	ccaagaacca	1740
ggtcagcctg	acctgcctgg	tcaaaggctt	ctaccccagc	gacatcgccg	tggagtggga	1800
gagcaatggg	cagccggaga	acaactacaa	gaccacacct	cccatgctgg	actccgacgg	1860
ctccttcttc	ctctacagca	agctcaccgt	ggacaagagc	aggtggcagc	aggggaacgt	1920
cttctcatgc	tccgtgatgc	atgaggctct	gcacaaccac	tacacgcaga	agagcctctc	1980
cctgtctccg	ggtaaatga					1999
<210> 140
<211> 1392
<212> DNA
<213> Human
<400> 140
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtgtagcgt	ctggattcac	cttcagtagc	catggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagaaataa	atactatgca	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtttctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	aggaggtcac	360
ttcggtcctt	ttgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	agcctccacc	420
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gagcacagcg	480
gccctgggct	gectggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	540
ggcgctctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccagctgtcc	tacagtcctc	aggactctac	600
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcaacttcg	gcacccagac	ctacacctgc	660
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	cagttgagcg	caaatgttgt	720
gtcgagtgcc	caccgtgccc	agcaccacct	gtggcaggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	780
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacgtg	cgtggtggtg	840
gacgtgagcc	acgaagaccc	cgaggtccag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	900
cataatgcca	agacaaagcc	acgggaggag	cagttccaaa	gcacgttccg	tgtggtcagc	960
gtcctcaccg	ttgtgcacca	ggactggctg	aacggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	1020
aacaaaggcc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aaaccaaagg	gcagccccga	1080
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggaggaga	tgaccaagaa	ccaggtcagc	1140
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctacccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	1200
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccaca	cctcccatgc	tggactccga	cggctccttc	1260
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1320
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1380
ccgggtaaat	ga					1392
<210> 141
<211>708
<212> DNA
<213> Human
<400> 141
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgca	gggccagtca	gagtattagc	agcagcttct	tagcctggta	ccagcagaga	180

cctggccagg	ctcccaggct	cctcatctat	ggtgcatcca	gcagggccac	tggcatccca	240
gacaggttca	gtggcagtgg	gtctgggaca	gacttcactc	tcaccatcag	cagactggag	300
cctgaagatt	ttgcagtgta	ttactgtcag	cagtatggta	cctcaccctg	gacgttcggc	360
caagggacca	aggtggaaat	caaacgaact	gtggctgcac	catctgtctt	catcttcccg	420
ccatctgatg	agcagttgaa	atctggaact	gcctctgttg	tgtgcctgct	gaataacttc	480
tatcccagag	aggccaaagt	acagtggaag	gtggataacg	ccctccaatc	gggtaactcc	540
caggagagtg	tcacagagca	ggacagcaag	gacagcacct	acagcctcag	cagcaccctg	600
acgctgagca	aagcagacta	cgagaaacac	aaagtctacg	cctgcgaagt	cacccatcag	660
ggcctgagct	cgcccgtcac	aaagagcttc	aacaggggag	agtgttag		708
<210> 142
<211> 1395
<212> DNA
<213> Human
<400> 142
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtacagcgt	ctggattcac	cttcagtaac	tatggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagtaataa	acactatgga	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agtgacaatt	ccaagaacac	gctgtatctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	aggagagaga	360
ctggggtcct	actttgacta	ctggggccag	ggaaccctgg	tcaccgtctc	ctcagcctcc	420
accaagggcc	catcggtctt	ccccctggcg	ccctgctcca	ggagcacctc	cgagagcaca	480
gcggccctgg	gctgcctggt	caaggactac	ttccccgaac	cggtgacggt	gtcgtggaac	540
tcaggcgctc	tgaccagcgg	cgtgcacacc	ttcccagctg	tcctacagtc	ctcaggactc	600
tactccctca	gcagcgtggt	gaccgtgccc	tccagcaact	tcggcaccca	gacctacacc	660
tgcaacgtag	atcacaagcc	cagcaacacc	aaggtggaca	agacagttga	gcgcaaatgt	720
tgtgtcgagt	gcccaccgtg	cccagcacca	cctgtggcag	gaccgtcagt	cttcctcttc	780
cccccaaaac	ccaaggacac	cctcatgatc	tcccggaccc	ctgaggtcac	gtgcgtggtg	840
gtggacgtga	gccacgaaga	ccccgaggtc	cagttcaact	ggtacgtgga	cggcgtggag	900
gtgcataatg	ccaagacaaa	gccacgggag	gagcagttca	acagcacgtt	ccgtgtggtc	960
agcgtcctca	ccgttgtgca	ccaggactgg	ctgaacggca	aggagtacaa	gtgcaaggtc	1020
tccaacaaag	gcctcccagc	ccccatcgag	aaaaccatct	ccaaaaccaa	agggcagccc	1080
cgagaaccac	aggtgtacac	cctgccccca	tcccgggagg	agatgaccaa	gaaccaggtc	1140
agcctgacct	gcctggtcaa	aggcttctac	cccagcgaca	tcgccgtgga	gtgggagagc	1200
aatgggcagc	cggagaacaa	ctacaagacc	acacctccca	tgctggactc	cgacggctcc	1260
ttcttcctct	acagcaagct	caccgtggac	aagagcaggt	ggcagcaggg	gaacgtcttc	1320
tcatgctccg	tgatgcatga	ggctctgcac	aaccactaca	cgcagaagag	cctctccctg	1380
tctccgggta	aatga					1395
<210> 143
<211>702
<212> DNA
<213> Human
<400> 143
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgca	ggaccagtgt	tagcagcagt	tacttagcct	ggtaccagca	gaaacctggc	180
caggctccca	ggctcctcat	ctatggtgca	tccagcaggg	ccactggcat	cccagacagg	240
ttcagtggca	gtgggtctgg	gacagacttc	actctcacca	tcagcagact	ggagcctgaa	300
gattttgcag	tctattactg	tcagcagtat	ggcatctcac	ccttcacttt	cggcggaggg	360
accaaggtgg	agatcaagcg	aactgtggct	gcaccatctg	tcttcatctt	cccgccatct	420
gatgagcagt	tgaaatctgg	aactgcctct	gttgtgtgcc	tgctgaataa	cttctatccc	480
agagaggcca	aagtacagtg	gaaggtggat	aacgccctcc	aatcgggtaa	ctcccaggag	540
agtgtcacag	agcaggacag	caaggacagc	acctacagcc	tcagcagcac	cctgacgctg	600
agcaaagcag	actacgagaa	acacaaagtc	tacgcctgcg	aagtcaccca	tcagggcctg	660
agctcgcccg	tcacaaagag	cttcaacagg	ggagagtgtt	ag		702
<210> 144
<211> 1392
<212> DNA

<213> Human
<400> 144
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtcgagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtacagcgt	ctggattcac	cttcagtagt	tatggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagcaataa	acactatgca	240
gactccgcga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtatctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	agccggactg	360
ctgggttact	ttgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	agcctccacc	420
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gagcacagcg	480
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	540
ggcgctctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccagctgtcc	tacagtcctc	aggactctac	600
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcaacttcg	gcacccagac	ctacacctgc	660
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	cagttgagcg	caaatgttgt	720
gtcgagtgcc	caccgtgccc	agcaccacct	gtggcaggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	780
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacgtg	cgtggtggtg	840
gacgtgagcc	acgaagaccc	cgaggtccag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	900
cataatgcca	agacaaagcc	acgggaggag	cagttcaaca	gcacgttccg	tgtggtcagc	960
gtcctcaccg	ttgtgcacca	ggactggctg	aacggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	1020
aacaaaggcc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aaaccaaagg	gcagccccga	1080
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggaggaga	tgaccaagaa	ccaggtcagc	1140
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctacccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	1200
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccaca	cctcccatgc	tggactccga	cggctccttc	1260
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1320
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1380
ccgggtaaat	ga					1392
<210> 145
<211> 705
<212 > DNA
<213> Human
<400> 145
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgta	gggccagtca	aagtgttagc	agctacttag	cctggtacca	acagaaacct	180
ggccaggctc	ccaggcccct	catctatggt	gtatccagca	gggccactgg	catcccagac	240
aggttcagtg	gcagtgggtc	tgggacagac	ttcactctca	ccatcagcag	actggagcct	300
gaagattttg	cagtgtatta	ctgtcagcag	tatggtatct	caccattcac	tttcggccct	360
gggaccaaag	tggatatcaa	acgaactgtg	gctgcaccat	ctgtcttcat	cttcccgcca	420
tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	tctgttgtgt	gcctgctgaa	taacttctat	480
cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	tccaatcggg	taactcccag	540
gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	gcctcagcag	caccctgacg	600
ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	gcgaagtcac	ccatcagggc	660
ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	gttag		705
<210> 146
<211> 1413
<212> DNA
<213> Human
<400> 146
atggagtttg	ggctgagctg	ggttttcctc	gttgctcttt	taagaggtgt	ccagtgtcag	60
gtgcagctgg	tggagtctgg	gggaggcgtg	gtccagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	120
tgtgcagcgt	ctggattcac	cttcagtagc	tatggcatgc	actgggtccg	ccaggctcca	180
ggcaaggggc	tggagtgggt	ggcagttata	tggtatgatg	gaagtaataa	atactatgca	240
gactccgtga	agggccgatt	caccatctcc	agagacaatt	ccaagaacac	gctgtatctg	300
caaatgaaca	gcctgagagc	cgaggacacg	gctgtgtatt	actgtgcgag	agatccgagg	360
ggagctaccc	tttactacta	ctactacggt	atggacgtct	ggggccaagg	gaccacggtc	420
accgtctcct	cagcctccac	caagggccca	tcggtcttcc	ccctggcgcc	ctgctccagg	480
agcacctccg	agagcacagc	ggccctgggc	tgcctggtca	aggactactt	ccccgaaccg	540

gtgacggtgt	cgtggaactc	aggcgctctg	accagcggcg	tgcacacctt	cccagctgtc	600
ctacagtcct	caggactcta	ctccctcagc	agcgtggtga	ccgtgccctc	cagcaacttc	660
ggcacccaga	cctacacctg	caacgtagat	cacaagccca	gcaacaccaa	ggtggacaag	720
acagttgagc	gcaaatgttg	tgtcgagtgc	ccaccgtgcc	cagcaccacc	tgtggcagga	780
ccgtcagtct	tcctcttccc	cccaaaaccc	aaggacaccc	tcatgatctc	ccggacccct	840
gaggtcacgt	gcgtggtggt	ggacgtgagc	cacgaagacc	ccgaggtcca	gttcaactgg	900
tacgtggacg	gcgtggaggt	gcataatgcc	aagacaaagc	cacgggagga	gcagttcaac	960
agcacgttcc	gtgtggtcag	cgtcctcacc	gttgtgcacc	aggactggct	gaacggcaag	1020
gagtacaagt	gcaaggtctc	caacaaaggc	ctcccagccc	ccatcgagaa	aaccatctcc	1080
aaaaccaaag	ggcagccccg	agaaccacag	gtgtacaccc	tgcccccatc	ccgggaggag	1140
atgaccaaga	accaggtcag	cctgacctgc	ctggtcaaag	gcttctaccc	cagcgacatc	1200
gccgtggagt	gggagagcaa	tgggcagccg	gagaacaact	acaagaccac	acctcccatg	1260
ctggactccg	acggctcctt	cttcctctac	agcaagctca	ccgtggacaa	gagcaggtgg	1320
cagcagggga	acgtcttctc	atgctccgtg	atgcatgagg	ctctgcacaa	ccactacacg	1380
cagaagagcc	tctccctgtc	tccgggtaaa	tga			1413
<210> 147
<211> 714
<212> DNA
<213> Human
<400> 147
atggacatga	gggtccccgc	tcagctcctg	gggctcctgc	tactctggct	ccgaggtgcc	60
agatgtgaca	tccagatgac	ccagtctcca	tcctccctgt	ctgcatctgt	aggagacaga	120
gtcaccatca	cttgccgggc	aagtcagagc	attaacagct	atttagattg	gtatcagcag	180
aaaccaggga	aagcccctaa	actcctgatc	tatgctgcat	ccagtttgca	aagtggggtc	240
ccatcaaggt	tcagtggcag	tggatetggg	acagatttca	ctctcaccat	cagcagtctg	300
caacctgaag	attttgcaac	ttactactgt	caacagtatt	acagtactcc	attcactttc	360
ggccctggga	ccaaagtgga	aatcaaacga	actgtggctg	caccatctgt	cttcatcttc	420
ccgccatctg	atgagcagtt	gaaatctgga	actgcctctg	ttgtgtgcct	gctgaataac	480
ttctatccca	gagaggccaa	agtacagtgg	aaggtggata	acgccctcca	atcgggtaac	540
tcccaggaga	gtgtcacaga	gcaggacagc	aaggacagca	cctacagcct	cagcagcacc	600
ctgaegctga	gcaaagcaga	ctacgagaaa	cacaaagtct	acgcctgcga	agtcacccat	660
cagggcctga	gctcgcccgt	cacaaagagc	ttcaacaggg	gagagtgtta	gtga	714
Ekvivalenty

Opis vynálezu a príklady výhodných uskutočnení predstavujú podľa pôvodcov najvýhodnejšie uskutočnenie vynálezu. Je ale zrejmé, že vynález možno uskutočniť rôznymi ekvivalentnými spôsobmi. Predmet vynálezu je definovaný nasledujúcimi patentovými nárokmi a ich ekvivalentmi.

Claims (12)

1. Monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na antigén 4 cytotoxických T-lymfocytov (CTLA-4) alebo jej fragment viažuci antigén, pričom uvedená protilátka zahrnuje variabilný úsek ťažkého reťazca aspoň na 85 % identický s variabilným úsekom ťažkého reťazca v sekvencii SEQ ID NO: 63 a pričom uvedená protilátka zahrnuje variabilný úsek ľahkého reťazca aspoň na 90 % identický s variabilným úsekom ľahkého reťazca v sekvencii SEQ ID NO: 65.

2. Protilátka alebo fragment podľa nároku 1, pričom uvedená protilátka zahrnuje variabilný úsek ťažkého reťazca aspoň na 90 % identický s variabilným úsekom ťažkého reťazca v sekvencii SEQ ID NO: 63.

3. Protilátka alebo fragment podľa nároku 1 alebo 2, pričom uvedená protilátka alebo fragment sa viažu na CTLA-4 s K_D 10⁹ M alebo vyššou afinitou.

4. Protilátka alebo fragment podľa nároku 1 alebo 2, pričom uvedená protilátka alebo fragment inhibuje väzbu medzi CTLA-4 a B7-2 s IC₅₀ 100 nM alebo nižšou.

5. Spôsob výroby protilátky podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:

a) imunizácie cicavca iného než ľudského pôvodu s imunogénom zahrnujúcim CTLA-4, pričom cicavec je schopný expresie humánnych protilátok v jeho B-lymfocytoch;

b) izolácie B-lymfocytov z cicavca;

c) skríningu uvedených B-lymfocytov alebo z nich odvodených bunkových línií na protilátky, ktoré sa viažu na CTLA-4;

d) kultivácie bunkovej línie exprimujúcej protilátky, ktoré sa viažu na CTLA-4; a

e) izolácie protilátok, ktoré sa viažu na CTLA-4.

6. Larmaceutická kompozícia zahrnujúca farmaceutický prijateľný nosič, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahrnuje protilátku alebo fragment podľa nároku 1.

5

7. Bunková línia, ktorá produkuje protilátku alebo fragment podľa nároku 1.

8. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny zahrnujúca sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment viažuci antigén a sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment viažuci antigén protilátky podľa nároku 1.

9. Hostiteľská bunka zahrnujúca sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ťažký reťazec alebo jeho 10 fragment viažuci antigén a sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment viažuci antigén protilátky podľa nároku 1.

10. Transgénny cicavec iného než ľudského pôvodu alebo rastlina zahrnujúca sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment viažuci antigén a sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment viažuci antigén protilátky podľa nároku 1, pričom transgénny ci15 cavec alebo rastlina exprimujú uvedené nukleové kyseliny.

11. Použitie protilátky alebo fragmentu podľa nároku 1 alebo farmaceutickej kompozície podľa nároku 6 na prípravu liečiva na liečenie rakoviny.

12. Použitie kombinácie zahrnujúcej

a) protilátku alebo fragment podľa nároku 1 alebo farmaceutickú kompozíciu podľa nároku 6, a 20 b) bunky exprimujúce faktor stimulujúci granulocyto-makrofágové kolónie na prípravu liečiva na liečenie tumoru.