JP7238158B2 - 高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体 - Google Patents
高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7238158B2 JP7238158B2 JP2021557729A JP2021557729A JP7238158B2 JP 7238158 B2 JP7238158 B2 JP 7238158B2 JP 2021557729 A JP2021557729 A JP 2021557729A JP 2021557729 A JP2021557729 A JP 2021557729A JP 7238158 B2 JP7238158 B2 JP 7238158B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- maltotriose
- series
- amino acid
- mutant
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/90—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in food processing or handling, e.g. food conservation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
(a)親の451-572番目のアミノ酸がトランケートされ、アミノ酸配列が配列番号4で示された突然変異体;
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、47番目のロイシンをリジンまたはアルギニンに突然変異させて得られ、それぞれL47K、L47Rと命名された突然変異体;
(c)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、101番目のグリシンをセリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンに突然変異させて得られ、それぞれG101S、G101T、G101D、G101N、G101E、G101Qと命名された突然変異体;
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、103番目のグリシンをヒスチジンに突然変異させて得られ、G103Hと命名された突然変異体;
(e)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、153番目のグリシンをセリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、またはヒスチジンに突然変異させて得られた突然変異体をそれぞれG153S、G153D、G153N、G153E、G153Q、G153Hと命名された突然変異体。
LB培地(g/L):ペプトン 10、酵母エキス 5、NaCl 10。
TB培地(g/L):ペプトン 10、酵母粉末 24、グリセロール 5、K2HPO4・3H2O 16.43、KH2PO4 2.31。
酵素変換した試料を沸騰している水浴に10分間、置いて、12000r・min-1で10分間、遠心分離し、さらに最終濃度50%(体積比)のアセトニトリルで共沈殿させ、2時間放置した後、12000r・min-1で10分間、遠心分離し、上清を取り、シリンジで0.22μM濾過膜を通した。移動相を、アセトニトリル:水(74:26)の割合にて調製し、Agilent 1200 HPLCクロマトグラフィーおよびHYPERSIL APS2 アミノカラムを用いて、カラム温度を40℃、流速を0.8mL・min-1に設定して、試料を測定した。吸収ピーク面積とマルトトリオース標準品のピーク面積からマルトトリオースの生成量を算出した。
1)トランケート体ベクターと野生型ベクターの構築
1.Thermobifida fusca NTU22由来のマルトトリオース生成アミラーゼのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列(ヌクレオチド配列は配列番号2で示される)に基づき、トランケートされた後の遺伝子断片Tftfa-ΔML(ヌクレオチド配列は配列番号3で示される)と、ベクターpET20b(+)(発現ベクター上に、遺伝子発現を開始させるシグナルペプチドを有する)とを、シームレスクローニング酵素Exnase II(Vazyme Biotech Co.,Ltd)により連結し、組換えプラスミドpET20b(+)-Tftfa-ΔMLが構築された。
2.ヌクレオチド配列が配列番号2で示される遺伝子断片を上記同様の方法でベクターpET20b(+)と連結し、組換えプラスミドpET20b(+)-Tftfaが構築された。
1.組換えプラスミドpET20b(+)-Tftfa-ΔMLを宿主大腸菌BL21(DE3)のコンピテントセルに転換し、37℃で12時間~14時間培養してシングルコロニーを増殖させてから、シングルコロニーを抽出し、配列決定の検証を行った;正しいと検証された陽性転換体をLB液体培地(アンピシリン100μg/mLを含む)に接種し、37℃、200rpmで8-10時間培養し、シード発酵ブロスを5%接種量でTB液体培地(アンピシリン100μg/mL及びグリシン7.5g/Lを含む)に接種した;大腸菌を37℃のシェーカーでOD600=0.6-0.8まで培養し、最終濃度0.134mMのIPTGを添加して細胞外発現を誘導し、さらに25℃のシェーカーで発酵培養を48時間続けた後、発酵ブロスを4℃で、10000gで15分間、遠心分離し、菌体を除去し、上清を採集し、精製して、精製されたトランケート体酵素を得た。
2.組換えプラスミドpET20b(+)-Tftfaを、ステップ1.と同様の方法で宿主大腸菌BL21(DE3)のコンピテントセルに転換し、かつ培養、誘導して、精製された野生型酵素を得た。
1)部位特異的突然変異
プラスミドpET20b(+)-Tftfa-ΔMLを鋳型として、合成した突然変異プライマーを用いてPCRを行い、突然変異体を構築する。
正しく突然変異したと配列決定されたプラスミドを宿主大腸菌BL21(DE3)のコンピテントセルに転換し、転換された宿主大腸菌BL21(DE3)のシングルコロニーを抽出してLB液体培地(アンピシリン100μg/mLを含む)において37℃、200rpmで8~10時間培養し、シード発酵ブロスを5%接種量でTB液体培地(アンピシリン100μg/mL及びグリシン7.5g/Lを含む)に接種した;大腸菌を37℃のシェーカーでOD600=0.6-0.8まで培養し、最終濃度0.134mMのIPTGを添加して細胞外発現を誘導し、さらに25℃のシェーカーで発酵培養を48時間続けた後、発酵ブロスを4℃で、10000gで15分間、遠心分離し、菌体を除去し、上清を採集し、かつ精製して、精製された突然変異体酵素を得た。
酵素活性測定はDNS法を用い、系は次の通りである。
基質調製:1質量%濃度で可溶性澱粉を相応なバッファに懸濁させて、加熱撹拌し、糊化させた。
反応系: ブランク組:基質 1mL(2g/100mL可溶性澱粉)+バッファ 1mL。
対照組:基質 1mL+バッファ 0.9mL+適当な倍率に希釈した酵素液 0.1mL。
DE値5-7の5質量%濃度のマルトデキストリン溶液(pH5.5)を調製し、それぞれ一定量のマルトトリオース生成アミラーゼの野生酵素及び突然変異酵素を加え、それらのエンザイム量は60U・g-1基質であり、プルラナーゼをエンザイム量32U・g-1基質で反応系に添加し、回転数150rpm、温度55℃の水浴のシェーカーに置いて、11時間反応させた。試料を採取し、沸騰した水浴で10分間煮て、酵素を失活させ、遠心分離により上清を取り、生成物溶液が得られた。生成物溶液500μLをアセトニトリルと1:1にて混合し、室温で2時間放置して、高分子量のデキストリン又は限界デキストリンを沈殿させ、次いで12000rpmで20分間遠心分離し、上清をシリンジで0.22μM濾過膜を通して、HPLC分析が可能な試料を得た。移動相を、アセトニトリル:水(74:26)の割合で調製し、Agilent1200 HPLCクロマトグラフィーおよびHYPERSIL APS2 アミノカラムを用いて、カラム温度40℃および流速0.8mL・min-1に設定して、試料を測定した。吸収ピーク面積とG3標準品のピーク面積とからG3の生成量を算出した。
Claims (10)
- 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、マルトトリオース生成アミラーゼを親とし、親の47番目のロイシンがリジンに突然変異されていることを特徴とする、マルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体。
- 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、マルトトリオース生成アミラーゼを親とし、親の101番目、103番目、153番目のいずれか一つの位置にあるアミノ酸が突然変異されており、
下記(a)-(c)のいずれか一つであることを特徴とする、マルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体:
(a)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、101番目のグリシンがセリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンに突然変異されている;
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、103番目のグリシンがヒスチジンに突然変異されている;
(c)配列番号4で示されるアミノ酸配列において、153番目のグリシンがセリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミンまたはヒスチジンに突然変異されている。 - 請求項1又は2に記載の突然変異体をコードする遺伝子。
- 請求項3に記載の遺伝子を有している組換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターは、pETシリーズ、Duetシリーズ、pGEXシリーズ、pHY300シリーズ、pHY300PLKシリーズ、pPIC3Kシリーズ、又はpPIC9Kシリーズのいずれか一つのシリーズであることを特徴とする、請求項4に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項3に記載の遺伝子を有している微生物細胞。
- デキストリンを基質とし、請求項1又は2に記載の突然変異体を触媒として、マルトトリオースを生産することを特徴とする、マルトトリオースの生産特異性を向上させる方法。
- 前記デキストリンは米、トウモロコシ、小麦、水稲、ジャガイモ、サツマイモ、葛根及び/またはキャッサバを原料としていることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の突然変異体、または請求項4もしくは5に記載の組換え発現ベクターの、マルトトリオースを調製するための使用。
- 請求項7または8に記載の方法の、マルトトリオースを調製するための使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010507573.9A CN111718921B (zh) | 2020-06-05 | 2020-06-05 | 麦芽三糖淀粉酶突变体 |
CN202010507573.9 | 2020-06-05 | ||
PCT/CN2020/103021 WO2021243821A1 (zh) | 2020-06-05 | 2020-07-20 | 高特异性生产麦芽三糖的麦芽三糖淀粉酶突变体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022539641A JP2022539641A (ja) | 2022-09-13 |
JP7238158B2 true JP7238158B2 (ja) | 2023-03-13 |
Family
ID=72566096
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021557729A Active JP7238158B2 (ja) | 2020-06-05 | 2020-07-20 | 高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7238158B2 (ja) |
CN (1) | CN111718921B (ja) |
WO (1) | WO2021243821A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114457058B (zh) * | 2021-10-19 | 2024-05-14 | 安徽农业大学 | 一种饲用α淀粉酶的突变改良方法及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
WO2018222990A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Novozymes A/S | Improved yeast for ethanol production |
WO2020023411A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Novozymes A/S | Enzyme-expressing yeast for ethanol production |
WO2020076697A1 (en) | 2018-10-08 | 2020-04-16 | Novozymes A/S | Enzyme-expressing yeast for ethanol production |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07192A (ja) * | 1993-02-26 | 1995-01-06 | Nichiden Kagaku Kk | 澱粉糖の製造法 |
DE69931615T2 (de) * | 1998-02-27 | 2007-05-10 | Novozymes A/S | Varianten amylolytischer enzyme |
EP2546338A1 (en) * | 2008-01-02 | 2013-01-16 | Danisco US Inc. | A process of obtaining ethanol without glucoamylase using pseudomonas saccharophila g4-amylase and variants thereof |
EP2310521A2 (en) * | 2008-06-06 | 2011-04-20 | Danisco US Inc. | Production of glucose from starch using alpha-amylases from bacillus subtilis |
JP2012016309A (ja) * | 2010-07-08 | 2012-01-26 | Hayashibara Biochem Lab Inc | マルトトリオース生成アミラーゼとその製造方法並びに用途 |
US20150299622A1 (en) * | 2012-11-05 | 2015-10-22 | Novozymes A/S | Enzyme Compositions Enabling Re-use of Water in Laundry |
CN103695387B (zh) * | 2013-12-18 | 2015-05-06 | 广西大学 | 一种绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶突变体及其应用 |
CN104531636B (zh) * | 2015-01-19 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法 |
KR101706451B1 (ko) * | 2015-04-22 | 2017-02-15 | 동아대학교 산학협력단 | 마이크로불비퍼 속 유래 말토트리오스 생성용 아밀라아제 및 이를 이용한 말토트리오스 생산방법 |
CN110157688B (zh) * | 2019-05-31 | 2020-12-01 | 江南大学 | 一种产麦芽五糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体 |
-
2020
- 2020-06-05 CN CN202010507573.9A patent/CN111718921B/zh active Active
- 2020-07-20 JP JP2021557729A patent/JP7238158B2/ja active Active
- 2020-07-20 WO PCT/CN2020/103021 patent/WO2021243821A1/zh active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
WO2018222990A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Novozymes A/S | Improved yeast for ethanol production |
WO2020023411A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Novozymes A/S | Enzyme-expressing yeast for ethanol production |
WO2020076697A1 (en) | 2018-10-08 | 2020-04-16 | Novozymes A/S | Enzyme-expressing yeast for ethanol production |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Definition: Thermobifida fusca strain NTU22 alpha-amylase (amy13) gene, complete cds.,Database DDBJ/EMBL/GenBank [online],Accession No. DQ473479,2009年,[retrieved on 2022-10-17],https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ473479 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022539641A (ja) | 2022-09-13 |
WO2021243821A1 (zh) | 2021-12-09 |
CN111718921B (zh) | 2022-03-25 |
CN111718921A (zh) | 2020-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111424047B (zh) | 一种4,6-α-葡萄糖基转移酶及其在抗性糊精生产中的应用 | |
JP6706636B2 (ja) | マルトトリオシル転移酵素の新規用途 | |
AU2007339488A1 (en) | Novel slowly digestible storage carbohydrate | |
JP5828589B2 (ja) | 環状構造保有分岐状グルカンの工業的製造方法 | |
WO2021169096A1 (zh) | 一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法 | |
JP4187305B2 (ja) | 耐熱性アミロマルターゼ | |
CA3025953C (en) | Method of producing alpha glucans containing alpha 1-3 linked d-glucose units, and alpha glucans | |
JP7238158B2 (ja) | 高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体 | |
CN109486791B (zh) | 一种麦芽糖淀粉酶突变体的制备及其应用 | |
Ye et al. | Expression and characterization of 1, 4-α-glucan branching enzyme from Microvirga sp. MC18 and its application in the preparation of slowly digestible starch | |
CN112553270A (zh) | 一种制备α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精的方法 | |
CN112553271A (zh) | 一种含α-1,2糖苷键低热量糊精的制备方法 | |
JP2000316581A (ja) | 高度耐熱性ブランチングエンザイムによる環状グルカンの製造方法 | |
CN108026185A (zh) | 支化α葡聚糖 | |
CN109370973B (zh) | 一种麦芽糖淀粉酶生产菌株 | |
CN109439641B (zh) | 一种生麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用 | |
Zheng et al. | Deletion of α-amylase genes via CRISPR/Cas9 decreases the side effects of hydrolysis towards nonreducing maltoheptaose preparation | |
CN109251912B (zh) | 一种提高麦芽糖淀粉酶产量的方法 | |
CN114317565A (zh) | 一种粘细菌来源的淀粉分支酶及其基因,含有该基因的工程菌及其应用 | |
CN109439607B (zh) | 一种麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用 | |
CN109321481B (zh) | 一种生麦芽糖淀粉酶生产菌株 | |
CN116334159A (zh) | 一种提高麦芽四糖产量的方法 | |
EP3757209A1 (en) | Enzymatic production of levan-based, prebiotic fructooligosaccharides | |
CN117165548A (zh) | 一种利用突变型糖原分支酶制备支化淀粉的方法 | |
Bai et al. | Lactobacillus reuteri strains convert starch and maltodextrins into homo-exopolysaccharides using a cell-associated 4, 6-α-glucanotransferase enzyme |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211221 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221025 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230120 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230207 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230301 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7238158 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |