JP7209466B2 - フロースルー式常磁性粒子をベースにした細胞分離および常磁性粒子除去 - Google Patents

Description

（技術分野）
本開示は、結合細胞と非結合細胞の両方を含有する細胞懸濁液中の常磁性粒子結合細胞のフロースルー式分離のためのシステムおよび方法、ならびに常磁性粒子結合細胞または非結合細胞を有する細胞懸濁液から常磁性粒子を除去するためのシステムおよび方法に関する。

いくつかの理由のため、細胞の外部環境中には粒子が存在することがある。たとえば、粒子は、多くの場合、混合細胞または単一細胞培養基内の応答細胞を成長および分裂させる成長誘発物質で被覆されている。粒子はまた、多くの場合、特定のタイプの細胞に付着してそのタイプの細胞を同じ混合細胞懸濁液中の他のタイプ細胞から分離することを可能にする結合剤で被覆されている。細胞タイプに基づくこの分離は、望ましい細胞を望ましくない細胞から分離することを可能にする。

粒子は、それらの意図される機能のために有用であるが、細胞製品中の粒子の存在は、後に有害となる可能性がある。たとえば、粒子自体が、細胞療法のための細胞製品を受けた患者に害を与えるリスクをもたらすことがある。他の場合、これらの粒子は、細胞のさらなる成長および分裂を阻むことがあり、またはこれらの粒子は、成長および分裂が遅くなるために、もしくは細胞が分化することを可能にするために、除去することが必要になることがある。

複数のやり方のうちのいずれかで、様々なタイプの粒子を細胞製品から除去することができるが、多くの場合、常磁性粒子が使用される。それは、磁石に対する常磁性粒子の引力により、常磁性粒子結合細胞の非結合細胞からの分離と、常磁性粒子結合細胞からの常磁性粒子の除去との両方が可能になるからである。

細胞分離のために常磁性粒子を使用する現在のシステムおよび方法では、常磁性粒子結合細胞を含有する細胞懸濁液をチャンバ内の懸濁流体に入れ、次いでチャンバ壁近傍に磁石を位置決めする。遊離の常磁性粒子および細胞に結合した常磁性粒子は、磁石に引き付けられ、したがって、磁石に隣接したチャンバの内壁上で位置が保持される。非結合細胞を含有する残りの懸濁流体は除去される。次いで磁石は、チャンバ壁から離れる方へ動かされ、常磁性粒子および常磁性粒子結合細胞を解放する。

そのようなシステムおよび方法は、常磁性粒子結合細胞の正または負の選択のために使用することができるが、いずれの場合も、これには多くの欠点がある。１つの欠点は、常磁性粒子および常磁性粒子結合細胞が、非結合細胞の出力画分を介して非結合細胞製品に入る可能性があることである。これは、これらをチャンバ壁上に収容する十分な表面積がないため、これらがチャンバ壁に到達することを他の細胞が妨害するため、チャンバ壁に磁気的に付着したままでいるには大きすぎる細胞集塊の一部であるため、または他の理由のためである。非結合細胞が臨床的に使用される場合、この汚染は健康にとって有害である。非結合細胞が廃棄物である場合、望ましい細胞が失われる。

別の欠点は、非結合細胞が、常磁性粒子結合細胞層内に閉じ込められる可能性があることであり、その結果、この場合も細胞は誤った細胞出力画分に入り、廃棄物または望ましくない汚染を招く可能性がある。

チャンバ壁上で細胞が層状になることは、こうして層状になることで細胞が集塊し、後の処理もしくは使用または細胞による栄養分へのアクセスに干渉する可能性があることから、さらに別の欠点を呈する。さらに、層状になることで、いくつかの細胞は押しつぶされ、望ましい細胞を破壊したり、細胞溶解による汚染物質を細胞懸濁液中へ導入したりすることがある。

類似のシステムおよび方法は、デビーディング（ｄｅｂｅａｄｉｎｇ）と呼ばれるプロセスで細胞から常磁性粒子を除去するために使用される。デビーディングでは、細胞懸濁液がチャンバ内に配置され、チャンバ壁近傍に位置決めされた磁石が、常磁性粒子を引き付ける。

そのようなシステムおよび方法にもまた、複数の欠点がある。これには、常磁性粒子を有する細胞が、通常は単に壁に引き付けられていなかったという理由で、非結合細胞画分、最終的には非結合細胞製品内に含まれる可能性が含まれる。たとえば、磁界は磁石からの距離の２乗に反比例するため、そのような細胞は、チャンバ壁から離れる方へ動くにつれて、むしろ急速に落下する。大きすぎるチャンバまたは弱すぎる磁石が使用される場合、常磁性粒子結合細胞が最終的に非結合細胞製品内に入る可能性がより高くなる。

これらの欠点の１つまたは複数に対処しながら、常磁性粒子結合細胞を分離またはデビーディングする（ｄｅｂｅａｄ）ことが可能なシステムおよび方法が必要とされている。

（要旨）
一態様では、本開示は、少なくとも１つの細胞懸濁液モジュールと、少なくとも１つの緩衝剤モジュールと、少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールと、少なくとも１つの非磁性出力モジュールと、少なくとも１つの磁性出力モジュールとを備える細胞処理システムを提供する。

本システムの一部のバリエーションでは、それは、少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの上流に戻る少なくとも１つの戻りループを、少なくとも２つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを並列で、少なくとも２つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを直列で少なくとも１つの追加のモジュールを、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。前記少なくとも１つの追加のモジュールは、少なくとも１つの回転膜デビーディングモジュールを、少なくとも２つの回転膜デビーディングモジュールを並列で、または少なくとも２つの回転膜デビーディングモジュールを直列で、含み得る。前記回転膜デビーディングモジュールは、円筒形の側壁と隣接するまたは近接する少なくとも１つの磁石を含み得る。

より具体的なバリエーションでは、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールが、壁によって画定され、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を有するチャンバと、前記ｙ方向に前記チャンバの対向端に配置された入口および出口と、前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間にゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも２つの磁石とを含む。

第１のより具体的なバリエーションと独立していてもよいし組み合わせてもよい別のより具体的なバリエーションでは、前記回転膜デビーディングモジュールが、円筒形の側壁によって部分的に画定されたデビーディングチャンバと、内部を有し、前記円筒形の側壁と同軸方向に配向された多孔質の回転膜と、試料入口と、前記回転膜の前記内部に接続された廃棄物出力モジュールと、前記デビーディングチャンバに接続された細胞出力モジュールとを含む。

別の態様では、本開示は、壁によって画定され、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を有するチャンバと、前記ｙ方向に前記チャンバの対向端に配置された入口および出口と、前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間にゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも２つの磁石とを含むフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを提供する。

このモジュールの一部のバリエーションでは、これは、少なくとも２つの入口および少なくとも２つの出口、前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間に少なくとも２つのゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも３つの磁石、前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に２つのアレイで配置された少なくとも４つの磁石、前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に２つのアレイで配置され、前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に１つの入口近傍から１つの出口近傍へｘ－ｙ平面内を横切るように配向された少なくとも４つの磁石、少なくとも２つの磁石にもまた隣接する前記チャンバの壁に隣接するサブ膜の注入ポート、および前記サブ膜に隣接する膜、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

別の態様では、本開示は、円筒形の側壁によって部分的に画定されたデビーディングチャンバと、内部を有し、前記円筒形の側壁と同軸方向に配向された多孔質の回転膜と、試料入口と、前記回転膜の前記内部に接続された廃棄物出力モジュールと、前記デビーディングチャンバに接続された細胞出力モジュールと、前記円筒形の側壁に隣接または近接する少なくとも１つの磁石とを含む回転膜デビーディングモジュールを提供する。

このモジュールの一部のバリエーションでは、これは、試薬モジュールを含んでもよく、デビーディングされるべき粒子のサイズより大きく、デビーディングするべき細胞のサイズより小さいポアサイズを有してもよく、または両方でもよい。

さらに別の態様では、本開示は、非結合細胞製品を作製するために、常磁性粒子結合細胞を含む細胞懸濁液をフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って流すステップによってフロースルー式細胞処理の方法を提供する。前記流すステップにより、前記常磁性粒子結合細胞が、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール内で動き続ける。前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールは、前記細胞懸濁液が通って流れる壁によって画定されたフローチャンバと、少なくとも１つの壁に隣接または近接して配置された少なくとも２つの磁石と
を含む。

このモジュールの一部のバリエーションでは、前記細胞懸濁液が、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って層流で流される、前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールに前記細胞懸濁液を流すことで、前記常磁性粒子結合細胞および前記非結合細胞を分離する、前記細胞懸濁液が、遊離の常磁性粒子をさらに含み、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールに前記細胞懸濁液を流すことで、前記遊離の常磁性粒子および前記非結合細胞を分離する、またはこれらの任意の組み合わせである。

方法はまた、戻りループを使用して、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って前記分離された非結合細胞を２回目または引き続く時間に流すステップ、戻りループを使用して、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って前記分離された常磁性粒子結合細胞を２回目または引き続く時間に流すステップ、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール内で前記常磁性粒子結合細胞を前記２回目または引き続く時間の間にデビーディングして、常磁性粒子およびデビーディングされた非結合細胞を得るステップ、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って前記作製された常磁性粒子およびデビーディングされた非結合細胞を３回目または引き続く時間に流して、前記常磁性粒子および前記デビーディングされた非結合細胞を分離するステップ、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。

他の全てと組み合わせ可能な別のバリエーションでは、前記磁石が、流れ方向を横切る１つのゼロ勾配線を確立するように配向され、常磁性粒子結合細胞が、１つの方向にのみ前記ゼロ勾配線へ引っ張られるが、２つの他の方向では前記磁石からの磁気力によって影響されない。

他の全てと組み合わせ可能な別のバリエーションでは、前記チャンバが、任意の常磁性粒子が通って前記フローチャンバに入る磁性入口と、非磁性入口と、前記非磁性入口に対向する磁性出口と、前記磁性入口に対向する非磁性出口と、をさらに含み、前記ゼロ勾配線が、すべての常磁性粒子およびあらゆる常磁性粒子結合細胞を前記磁性出口へ向ける。

前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含んでもよく、非磁性入口が、前記磁性入口より大きくてもよく、他方、前記非磁性出口が、磁性出口より大きく、そうすることで、前記非磁性入口から流れる流体が、前記非磁性出口を横切り、任意の非結合細胞が前記磁性出口内へ流れるのを防止する。

代替的に、前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含んでもよく、前記非磁性入口および磁性入口が、実質的に同じサイズであってもよく、または前記非磁性出口および磁性出口が、実質的に同じサイズであってもよく、または両方であり、前記入口に入る前記流体のそれぞれの流速、前記出口から出る前記流体の前記それぞれの流速、または両方が、前記非磁性入口から流れる流体が前記非磁性出口を横切り、任意の非結合細胞が前記磁性出口内へ流れるのを防止するように調整されてもよい。

他の全てと組み合わせ可能な別のバリエーションでは、方法は、前記非結合細胞製品を作製するために、回転膜デビーディングモジュールを通って前記常磁性粒子結合細胞を流すステップを含んでもよい。前記回転膜デビーディングモジュールは、前記常磁性粒子結合細胞が通って流れる円筒形デビーディングチャンバであって、円筒形の側壁によって部分的に画定され、同軸の回転膜を収容するチャンバと、前記円筒形のデビーディングチャンバ内に少なくとも１つのゼロ勾配線を確立するように前記円筒形の側壁に隣接または近接して配置された少なくとも１つの磁石とを含み得る。

別の態様では、本開示は、細胞療法組成物を製造する方法であって、細胞集団を、前記細胞集団内の１つまたは複数の細胞タイプを増殖することを助ける１つまたは複数の作用物質で被覆された常磁性粒子に接触させるステップと、前記細胞集団内の細胞内へ核酸を導入するステップと、前記細胞集団内で細胞を増殖するステップと、上記のシステムまたは方法、あるいは本明細書に記載の任意の他のシステムまたは方法によって、前記細胞集団をデビーディングするステップと、前記細胞集団を細胞療法のために製剤化するステップと、による方法を提供する。

一部のバリエーションでは、１つまたは複数の細胞タイプを増殖させるのを助ける前記１つまたは複数の作用物質が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片、およびそれらの組合せを含んでもよく、前記核酸が、レンチウイルスまたはｍＲＮＡトランスダクションによって導入されてもよく、前記細胞療法が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法であってもよく、前記細胞療法が、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法である、またはこれらの任意の組み合わせである。

特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
少なくとも１つの細胞懸濁液モジュールと、
少なくとも１つの緩衝剤モジュールと、
少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールと、
少なくとも１つの非磁性出力モジュールと、
少なくとも１つの磁性出力モジュールと
を備える細胞処理システム。
（項目２）
少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの上流に戻る少なくとも１つの戻りループをさらに備える、項目１に記載の細胞処理システム。
（項目３）
少なくとも２つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを並列で備える、項目１に記載の細胞処理システム。
（項目４）
少なくとも２つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを直列で備える、項目１に記載の細胞処理システム。
（項目５）
少なくとも１つの追加のモジュールをさらに備える、項目１に記載の細胞処理システム。
（項目６）
前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの回転膜デビーディングモジュールを備える、項目５に記載の細胞処理システム。
（項目７）
少なくとも２つの回転膜デビーディングモジュールを並列で備える、項目６に記載の細胞処理システム。
（項目８）
少なくとも２つの回転膜デビーディングモジュールを直列で備える、項目６に記載の細胞処理システム。
（項目９）
前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの物理的分離モジュールを備える、項目５に記載の細胞処理システム。
（項目１０）
前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの磁性カラムモジュールを備える、項目９に記載の細胞処理システム。
（項目１１）
前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの培地交換モジュールを備える、項目５に記載の細胞処理システム。
（項目１２）
前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの細胞濃縮モジュールを備える、項目５に記載の細胞処理システム。
（項目１３）
前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの細胞洗浄モジュールを備える、項目５に記載の細胞処理システム。
（項目１４）
前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールが、
壁によって画定され、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を有するチャンバと、
前記ｙ方向に前記チャンバの対向端に配置された入口および出口と、
前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間にゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも２つの磁石とを備える、項目１に記載の細胞処理システム。
（項目１５）
前記回転膜デビーディングモジュールが、
円筒形の側壁によって部分的に画定されたデビーディングチャンバと、
内部を有し、前記円筒形の側壁と同軸方向に配向された多孔質の回転膜と、
試料入口と、
前記回転膜の前記内部に接続された廃棄物出力モジュールと、
前記デビーディングチャンバに接続された細胞出力モジュールとを備える、項目６に記載の細胞処理システム。
（項目１６）
前記回転膜デビーディングモジュールが、前記円筒形の側壁に隣接または近接する少なくとも１つの磁石をさらに備える、項目１５に記載の細胞処理システム。
（項目１７）
壁によって画定され、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を有するチャンバと、
前記ｙ方向に前記チャンバの対向端に配置された入口および出口と、
前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間にゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも２つの磁石と
を備えるフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール。
（項目１８）
少なくとも２つの入口および少なくとも２つの出口を備える、項目１７に記載のモジュール。
（項目１９）
前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間に少なくとも２つのゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも３つの磁石をさらに備える、項目１７に記載のモジュール。
（項目２０）
前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に２つのアレイで配置された少なくとも４つの磁石をさらに備える、項目１７に記載のモジュール。
（項目２１）
前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に２つのアレイで配置され、前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に１つの入口近傍から１つの出口近傍へｘ－ｙ平面内を横切るように配向された少なくとも４つの磁石をさらに備える、項目１８に記載のモジュール。
（項目２２）
少なくとも２つの磁石にもまた隣接する前記チャンバの壁に隣接するサブ膜の注入ポートと、
前記サブ膜に隣接する膜と
をさらに備える、項目１７に記載のモジュール。
（項目２３）
円筒形の側壁によって部分的に画定されたデビーディングチャンバと、
内部を有し、前記円筒形の側壁と同軸方向に配向された多孔質の回転膜と、
試料入口と、
前記回転膜の前記内部に接続された廃棄物出力モジュールと、
前記デビーディングチャンバに接続された細胞出力モジュールと、
前記円筒形の側壁に隣接または近接する少なくとも１つの磁石と
を備える回転膜デビーディングモジュール。
（項目２４）
試薬モジュールをさらに備える、項目２３に記載の回転膜デビーディングモジュール。
（項目２５）
前記多孔質の回転膜のポアサイズが、デビーディングされるべき粒子のサイズより大きく、デビーディングするべき細胞のサイズより小さい、項目２３に記載の回転膜デビーディングモジュール。
（項目２６）
非結合細胞製品を作製するために、常磁性粒子結合細胞を含む細胞懸濁液をフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って流すステップを含むフロースルー式細胞処理の方法であって、
前記流すステップにより、前記常磁性粒子結合細胞が、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール内で動き続け、
前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールが、
前記細胞懸濁液が通って流れる壁によって画定されたフローチャンバと、
少なくとも１つの壁に隣接または近接して配置された少なくとも２つの磁石と
を備える、方法。
（項目２７）
前記細胞懸濁液が、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って層流で流される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールに前記細胞懸濁液を流すことで、前記常磁性粒子結合細胞および前記非結合細胞を分離する、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞懸濁液が、遊離の常磁性粒子をさらに含み、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールに前記細胞懸濁液を流すことで、前記遊離の常磁性粒子および前記非結合細胞を分離する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
戻りループを使用して、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って前記分離された非結合細胞を２回目または引き続く時間に流すステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
戻りループを使用して、前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って前記分離された常磁性粒子結合細胞を２回目または引き続く時間に流すステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール内で前記常磁性粒子結合細胞を前記２回目または引き続く時間の間にデビーディングして、常磁性粒子およびデビーディングされた非結合細胞を得るステップをさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを通って前記作製された常磁性粒子およびデビーディングされた非結合細胞を３回目または引き続く時間に流して、前記常磁性粒子および前記デビーディングされた非結合細胞を分離するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記磁石が、流れ方向を横切る１つのゼロ勾配線を確立するように配向され、常磁性粒子結合細胞が、１つの方向にのみ前記ゼロ勾配線へ引っ張られるが、２つの他の方向では前記２つの磁石の磁気力によって影響されない、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
前記チャンバが、
任意の常磁性粒子が通って前記フローチャンバに入る磁性入口と、
非磁性入口と、
前記非磁性入口に対向する磁性出口と、
前記磁性入口に対向する非磁性出口と、をさらに備え、前記ゼロ勾配線が、すべての常磁性粒子およびあらゆる結合細胞を前記磁性出口へ向ける、項目２６に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、非磁性入口が、前記磁性入口より大きく、前記非磁性出口が、磁性出口より大きく、前記非磁性入口から流れる流体が、前記非磁性出口を横切り、任意の非結合細胞が前記磁性出口内へ流れるのを防止する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、前記非磁性入口および磁性入口が、実質的に同じサイズであるか、または前記非磁性出口および磁性出口が、実質的に同じサイズであるか、または両方であり、前記入口に入る前記流体のそれぞれの流速、前記出口から出る前記流体の前記それぞれの流速、または両方が、前記非磁性入口から流れる流体が前記非磁性出口を横切り、任意の非結合細胞が前記磁性出口内へ流れるのを防止するように調整される、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記非結合細胞製品を作製するために、回転膜デビーディングモジュールを通って前記常磁性粒子結合細胞を流すステップをさらに含み、前記回転膜デビーディングモジュールが、
前記常磁性粒子結合細胞が通って流れる円筒形デビーディングチャンバであって、円筒形の側壁によって部分的に画定され、同軸の回転膜を収容するチャンバと、
前記円筒形のデビーディングチャンバ内に少なくとも１つのゼロ勾配線を確立するように前記円筒形の側壁に隣接または近接して配置された少なくとも１つの磁石とを備える、項目２６に記載の方法。
（項目３９）
前記非結合細胞製品を作製するために、前記常磁性粒子結合細胞を磁性カラムモジュール通って流すステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目４０）
前記常磁性粒子結合細胞または前記非結合細胞製品を細胞洗浄モジュールを通って流すステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目４１）
前記常磁性粒子結合細胞または前記非結合細胞製品を培地交換モジュールを通って流すステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目４２）
前記常磁性粒子結合細胞または前記非結合細胞製品を細胞濃縮モジュールを通って流すステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目４３）
細胞療法組成物を製造する方法であって、
細胞集団を、前記細胞集団内の１つまたは複数の細胞タイプを増殖することを助ける１つまたは複数の作用物質で被覆された常磁性粒子に接触させるステップと、
前記細胞集団内の細胞内へ核酸を導入するステップと、
前記細胞集団内で細胞を増殖するステップと、
項目２６～４２のいずれかに記載の方法によって、または項目１～１６のいずれかに記載のシステム、もしくは項目１７～２５のいずれかに記載のモジュールを使用して、前記細胞集団をデビーディングするステップと、
前記細胞集団を細胞療法のために製剤化するステップと、を含む方法。
（項目４４）
１つまたは複数の細胞タイプを増殖させるのを助ける前記１つまたは複数の作用物質が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片、およびそれらの組合せを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記核酸が、レンチウイルスまたはｍＲＮＡトランスダクションによって導入される、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞療法が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法である、項目４３～４５のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記細胞療法が、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法である、項目４６に記載の方法。
本開示のより完全な理解および利点は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによって得ることができる。添付の図面は原寸に比例したものではない。添付の図面では、同様の数字は同様の特徴を指す。

図１Ａは、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを有する細胞処理システムの概略図である。 図１Ｂは、複数のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを並列で有する細胞処理システムの概略図である。 図１Ｃは、複数のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを直列で有する細胞処理システムの概略図である。 図１Ｄは、戻りループを有する細胞処理システムの概略図である。 図１Ｅは、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールに別個に接続された細胞懸濁液および緩衝剤モジュールを有する細胞処理システムの概略図である。 図１Ｆは、回転膜デビーディングモジュールを含む細胞処理システムの概略図である。 図１Ｇは、複数のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールおよび複数の回転膜デビーディングモジュールを含む細胞処理システムの概略図である。 図１Ｈは、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを有する細胞処理システムの別の概略図である。 図２Ａは、ｘ配向の磁石構成にあるフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの横断方向の断面概略図である。 図２Ｂは、図２Ａのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの半透明の３次元概略図である。 図３は、膜およびサブ膜の流体注入ポートを有するフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの長手方向の側面断面概略図である。 図４Ａは、ゼロ勾配構成にあるフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの横断方向の断面概略図である。 図４Ｂは、図４Ａのフロースルー式の磁気分離／デビーディングモジュールの半透明の３次元概略図である。 図４Ｃは、ゼロ勾配フィルタを作製するためのゼロ勾配構成にあるフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの長手方向の上面断面概略図である。 図４Ｄは、複数のゼロ勾配フィルタを作製するための複数ゼロ勾配構成にあるフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの長手方向の上面断面概略図である。 図５Ａは、回転膜デビーディングモジュールの長手方向の断面概略図である。 図５Ｂは、第１の磁石構成を有する回転膜デビーディングモジュールの横断方向の断面概略図である。 図５Ｃは、第２の磁石構成を有する回転膜デビーディングモジュールの横断方向の断面概略図である。 図６は、細胞にかかる流体力および磁気力の図である。 図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、磁気分離中に細胞が存在している図２Ｂのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、磁気分離中に細胞が存在している図２Ｂのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図８Ａおよび図８Ｂは、磁気デビーディング中に細胞が存在している図２Ｂのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図８Ａおよび図８Ｂは、磁気デビーディング中に細胞が存在している図２Ｂのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図９は、図２Ａおよび図２Ｂのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを使用したデビーディングの結果と、従来のストップフロー式モジュールを使用したデビーディングの結果とを比較するグラフである（ボックスは４分位数および中央値を表す）。 図１０Ａは、モジュール入口（左）近傍およびモジュール出口（右）近傍に常磁性粒子結合細胞が存在しているフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの長手方向の上面ｘ－ｙ断面概略図である。 図１０Ｂは、モジュール入口（左）近傍およびモジュール出口（右）近傍に常磁性粒子結合細胞が存在しているフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの長手方向の側面断面概略図である。 図１１は、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞の磁気分離中の図４Ａのものに類似しているフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図１２は、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞の磁気分離中に細胞が存在している図４Ｃのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図１３は、デビーディングされた非結合細胞からの常磁性粒子の磁気分離中に細胞が存在している図４Ｃのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの図である。 図１４は、デビーディング中に細胞が存在している図５の回転膜デビーディングモジュールの図である。 図１５は、入力細胞数の関数として非フロースルー式デビーディングプロセスおよびフロースルー式デビーディングプロセスに対する採取収率のグラフである。 図１６は、入力細胞数の関数として非フロースルー式デビーディングプロセスおよびフロースルー式デビーディングプロセスに対する採取収率の棒状グラフである。

（詳細な説明）
本開示は、細胞懸濁液中の常磁性粒子の存在下における常磁性粒子結合細胞または非結合細胞のフロースルー式分離、デビーディング、常磁性粒子分離、またはこれらの任意の組合せのためのシステムおよび方法に関する。これらのシステムおよび方法は、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール、回転膜デビーディングモジュール、または両方を使用する。本明細書に記載するシステムおよび方法は、任意のタイプの細胞から常磁性粒子を除去するために使用することができるが、細胞療法で使用される細胞から常磁性粒子を除去する際の使用に特によく適合されている。加えて、本説明のいくつかの部分は、デビーディングが典型的に正の選択方法中にのみ実行されるため、常磁性粒子結合細胞の正の選択に的を絞っているが、これらのシステムおよび方法はまた、負の選択に使用することもできる。負の選択に使用されるとき、典型的には、任意のデビーディングモジュールおよびステップは省かれ得る。

（分離およびデビーディングシステムおよびモジュール）
図１Ａは、細胞懸濁液中の常磁性粒子結合細胞のフロースルー式分離、デビーディング、常磁性粒子分離、またはこれらの任意の組合せのための細胞処理システム２の概略図である。システム２は、細胞懸濁液モジュール４、緩衝剤モジュール６、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８、非磁性出力モジュール１０、および磁性出力モジュール１２を含む。システム２はまた、任意選択で、少なくとも１つの追加のモジュール１６、少なくとも１つの戻りループ１４、または両方を含むことができる。

システム２は加えて、チューブもしくはホースなどの流体導管、コネクタ、バルブ、スイッチ、クランプ、溶接部、ハウジング、モータ、ポンプ、他の機械的機構、回路、監視デバイス、および制御デバイスを含むことができる。システム２は、システム２またはその任意の構成要素を制御してフロースルー式分離プロセス、フロースルー式デビーディングプロセス、フロースルー式常磁性粒子分離プロセス、またはこれらの任意の組合せを実行させるようにプログラムされたコンピュータをさらに含むことができる。

システム２は、静的構成を有することができ、または適合可能な構成を有することができる。１つの適合可能な構成は、モジュールの交換または追加のモジュールの挿入を可能にすることができる。別の適合可能な構成は、変更できないモジュールのセットを有することができるが、モジュールの少なくとも１つに対する流体経路指定の変更を可能にすることができる。他の適合可能な構成は、モジュールの交換および追加と流体経路指定の変更の両方を可能にすることができる。システム２の構成要素は、適合可能な構成を容易にすることができる。たとえば、システム２内のプログラムされたコンピュータは、どのモジュールが存在するか、またはそれが流体経路指定を制御することがで得るかに関する情報を検出もしくは使用することができる。加えて、システム２は、同じ位置での異なるモジュールの除去または挿入を可能にする添付のコネクタ、バルブ、クランプ、またはスイッチを備えたハウジングまたは流体導管を有することができる。モジュールまたは他の構成要素は、それらの有無を自動的に検出することを可能にするために、バーコードまたは無線周波識別（ＲＦＩＤ）チップなどの識別要素を収容することができる。モジュールまたは他の構成要素はまた、良好な製造慣行および他の安全基準に対する準拠を確保することができる１つまたは複数の指示要素を含むことができる。たとえば、温度感受性の指示要素は、モジュールもしくは他の構成要素が加熱滅菌されたこと、またはその完全性もしくは有効性を損ない得る温度にさらされていないことを示すことができる。指示要素はまた、使用されたモジュールまたは他の構成要素をはっきりと識別することができる。指示要素はまた、システム２によって自動的に検出することができ、それにより人的エラーを最小にするのに役立つ。

特定のプロセスにとって必要ないシステム２の構成要素は、不在とすることができ、切断することができ、または閉鎖することができる。たとえば、別個の非磁性出力モジュール１０および磁性出力モジュール１２ではなく、図１Ｈに示すように、単一の出力モジュールが存在することもできる。加えて、やはり図１Ｈに示すように、システム２の構成要素は、バルブ、クランプ、溶接部、スイッチ、およびコネクタの構成に応じて、図１Ａに示すものとは異なる経路および接続を有する流体導管を有することができる。

細胞懸濁液モジュール４は、懸濁流体中に懸濁している分離またはデビーディングすべき細胞を収容する。これらの細胞が分離される場合、典型的には、細胞懸濁液は、常磁性粒子結合細胞と非結合細胞の両方を含有する。常磁性粒子結合細胞は望ましい細胞である可能性があり、その場合、常磁性粒子結合細胞に対する正の選択がシステム２内で行われ、または常磁性粒子結合細胞は望ましくない可能性があり、その場合、常磁性粒子結合細胞に対する負の選択が行われる。

細胞がデビーディングされる場合、または常磁性粒子が細胞から分離される場合、常磁性粒子結合細胞は望ましい細胞である。これらの細胞は、システム２または別のシステムを使用して、望ましくない細胞から事前に分離されている可能性がある。望ましくない細胞の存在が問題にならないまたは分離すべき望ましくない細胞が存在しない例では、デビーディングすべきこれらの細胞は、分離プロセスを事前に受けていない可能性がある。

細胞は、血液などの生物試料または細胞培養から直接得ることができる。

懸濁流体は、分離、デビーディング、または粒子除去プロセス全体にわたって、細胞の生存能力を支持することが可能な任意の流体であり得る。たとえば、懸濁流体は、培養培地、ＤＭＳＯ含有流体などの凍結剤、設定もしくは制御されたｐＨを有する別の流体、または栄養分を有する別の流体であり得る。懸濁流体はまた、緩衝剤であり得、これは緩衝剤モジュール６内の緩衝剤と同じであっても異なってもよい。懸濁流体は、緩衝剤とは異なる粘性を有することができる。懸濁流体はまた、細胞がシステム２に入る培地とは異なる粘性を有することができ、これは高密度フィコールなど、非常に高密度であり得る。

緩衝剤モジュール６内の緩衝剤は、懸濁流体が細胞の生存能力を引き続き支持することを可能にしながら懸濁流体と組み合わせることができる任意の流体とすることができる。たとえば、緩衝剤は、設定または制御されたｐＨを有することができる。緩衝剤は、１つまたは複数の細胞適合性の塩を含むことができる。緩衝剤は、緩衝剤モジュール６内に別個に提供されているが、緩衝剤が細胞懸濁液と混合された後は懸濁流体の一部と見なされる。

懸濁流体または緩衝剤は、抗菌剤を含有することができるが、典型的には、細胞が後に患者に提供される場合、システム２が回転膜デビーディングモジュールもしくは別のモジュールなどを介してこれらの抗菌剤を除去しない限り、または追加のプロセス、モジュール、もしくはシステムによって抗菌剤が後に除去されない限り、抗菌剤を含有しない。

常磁性粒子は、金属または金属合金などの任意の常磁性および／または磁化可能な材料から形成することができる。典型的には、常磁性材料は、細胞もしくは後にそれらの細胞を受け取る患者にとって有毒ではなく、または毒性を回避するために被覆されている。常磁性材料は、高い飽和磁束密度（ｍ_ｓ）を実現するように選択することができる。概して、どの常磁性材料が適しているかは、これらの要素が常磁性材料を磁気飽和に駆動することに影響するため、システム２内で使用される磁石および磁石を使用するモジュールの構成によって影響される。

常磁性粒子は、結合剤、たとえば、成長因子、受容体もしくはリガンド、抗原、抗体、またはキメラ抗原受容体リガンドなどのそれらの任意の結合性断片もしくはキメラバリアントで被覆することができる。結合剤は、いくつかの例では、可逆性を有することができ、自発的にまたは特定の化学薬品を使用して常磁性粒子を切り離すことを可能にする。結合剤はまた、光切断性リンカーを含むことができ、その場合、システム２は、リンカーの光切断ならびに細胞および常磁性粒子の分離を可能にするために、光源、特に高出力光源をモジュールまたは別のモジュールの一部として含むことができる。いくつかの例では、被覆は、細胞と相互作用することができる。他の例では、被覆は、除去すべき、細胞懸濁液の少なくとも１つの望ましくない成分と相互作用することができる。この望ましくない成分は、活性または不活性であり得、事前に細胞または細胞懸濁液流体に対して有用な機能を担っていた可能性がある。例示的な望ましくない成分には、抗体、増殖因子、他のタンパク質、およびポリマーが含まれる。

いくつかの細胞懸濁液には、異なる結合剤を有するか、または異なる磁性材料から形成された粒子などの異なるタイプの常磁性粒子が存在することができ、結合剤の複雑な分離または反復除去を可能にする。さならる任意の結合剤で被覆することができる追加の非常磁性粒子も、細胞に結合することができる。

常磁性でない他の粒子もまた、細胞懸濁液内に存在することができ、常磁性粒子を被覆するために使用される任意のもので被覆することができる。

モジュールは、細胞貯蔵バッグなどの任意の生物学的に適合している材料から形成することができ、またはそのような材料で裏打ちすることができる。細胞懸濁液または緩衝剤に接触するシステム２の流体導管および任意の他の構成要素もまた、任意の生物学的に適合している材料から形成することができ、またはそのような材料で裏打ちすることができる。

細胞懸濁液または緩衝剤に接触するシステム２の構成要素は、細胞懸濁液に接触する前に滅菌することができる。

システム２の構成要素は、使い捨てとすることができる。細胞懸濁液に接触する構成要素は特に、汚染および滅菌性の問題を回避するために、使い捨てとすることができる。

図２Ａは、ｘ配向の磁石構成にあるフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８の横断方向の断面概略図であり、図２Ｂは、同じ構成にある同じ磁気分離モジュール８の半透明の３次元概略図である。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、壁５２によって画定されたフローチャンバ５０を含む。外部の双極子磁石５４が、磁力線５６を生じさせる。磁石５４は、可動プラットホーム６０上に収納される。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、入口６２および出口６４をさらに含み、入口６２および出口６４を介して、モジュール８を通ってｙ方向に細胞懸濁液を流すことができる。

図２Ａおよび図２Ｂは、磁石５４の１つのアレイを示すが、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、図４Ａに示すように、２つまたはそれ超のアレイを有することができ、アレイ内に３つ以上の磁石を有することができる。加えて、磁石５４は、恒久的な位置におくことができ、その場合、分離／デビーディングモジュール８は、可動プラットホーム６０を欠くことができ、または可動フローチャンバ５０を有することができる。さらに、磁石５４は、ｘ配向の構成で示されているが、ｙ配向またはｘ－ｙを横切る配向を含めて、ｘ－ｙ平面内で任意の角度とすることができる。

入口６２および出口６４は、チャンバ５０を通る細胞懸濁液の層流を確立するのに十分な任意の構成を有することができる。入口の幾何学的形状、出口の幾何学的形状、および流速はすべて、チャンバ５０を通る細胞懸濁液の流れに影響する。いくつかの例では、乱流も許容可能であり得る。

壁５２は、剛性の構造とすることができ、または可撓性を有することができる。たとえば、壁５２は、細胞貯蔵バッグまたは他の類似の構成要素の壁とすることができる。壁５２が可撓性を有するとき、ｚ方向におけるチャンバ５０の寸法は、チャンバ５０を通る細胞懸濁液の流速に応じて変動することができる。

ｚ方向におけるチャンバ５０の寸法は、５μｍ～１００μｍ、５μｍ～５００μｍ、もしくは５μｍ～１０００μｍ、５μｍ～１ｃｍ、または概して１００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、もしくは１ｃｍもしくはそれ未満とすることができる。ｘ、ｙ、およびｚ方向の両方における寸法は、チャンバ５０を通って細胞または常磁性粒子を動かすのに十分に高い流体力を実現するように制限することができる。

磁石５４は、高い磁界強度を有することができる。たとえば、磁石５４は、コバルトなどの別の金属で合金化されたネオジウムまたはサマリウムなどの希土類金属を含有することができる。磁石５４は、図示のように双極子磁石とすることができ、または４極子磁石などの他のタイプの磁石とすることができる。磁石５４は、調整可能な磁界強度を有することができる。たとえば、磁石５４は、電磁石とすることができる。磁石５４は、チャンバ５０の同じ側で磁石に対する磁気引力を最大にし、チャンバ５０の対向する側で磁石に対する磁気反発を最大にし、またはその両方になるように配置することができる。図２Ａは、特定の磁石構成を示すが、実現すべき効果に応じて、磁石の極性が逆であるか、または調和した構成を使用することもできる。

図３は、サブ膜の流体注入ポート７２および磁石５４の上に位置する膜７０を有するフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８の長手方向の側面断面概略図である。緩衝剤モジュール６または別の流体モジュールからの流体は、膜７０近傍に位置する細胞をデビーディングするのを助けるために、流体注入ポート７２を通って導入することができる。

可動プラットホーム６０は、ｚ方向に可動とすることができ、図２Ａおよび図２Ｂに示すようにチャンバ５０に隣接する位置またはチャンバ５０に近接する位置（図示せず）から、チャンバ５０から離れた位置（図７Ｃに示す）へのｚ方向における磁石５４の動きを可能にする。たとえば、チャンバ５０から離れた位置は、最も近い壁５２から少なくとも１ｃｍとすることができる。離れた位置は、磁石５４が磁界を介してチャンバ５０内の常磁性粒子に実質的な影響を与えるのを防止するのに十分である。磁石５４とチャンバ５０との間に磁気絶縁材料が挿入された場合、この位置距離は、実質的により小さくすることができる。磁石５４が調整可能な磁界強度を有する場合、チャンバ５０内の常磁性粒子に与える実質的な影響を回避するために、磁石５４を動かすのではなく、より低い磁界強度またはゼロの磁界強度へ単に調整することができる。

特にゼロ勾配構成を使用するとき、モジュール８は、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、磁石５４の上部アレイおよび磁石５４の下部アレイを有することができる。可動プラットホーム６０は、ｘ－ｙ平面内で回転可能とすることができ、または磁石５４は、図４Ｃのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８の長手方向の上面断面概略図に示すものなど、磁石５４がｘ－ｙを横切る配向の構成であるように、恒久的に配向することができる。ゼロ勾配構成で使用する場合、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、２つの入口６２、非磁性入口６２ａおよび磁性入口６２ｂ、ならびに２つの出口６４、磁性出口６４ａおよび非磁性出口６４ｂを有することができる。この例では、モジュール８が使用されているとき、ｘ－ｙを横切る配向の方向にあるゼロ勾配線５８は、ゼロ勾配フィルタを形成する。図４Ｄに示すように、追加の磁石５４を含むことで、同じモジュール８内に２つのゼロ勾配線５８ａおよび５８ｂを提供することができ、それにより異なる出口６４ａおよび６４ｂへの異なる常磁性粒子の分離を可能にし、またはバックアップフィルタを提供する。

ゼロ勾配線５８は、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、磁石５４が隣接しているのではなく互いから十分に隔置されている場合、ｘ方向の寸法を有するゼロ勾配帯とすることができる。

フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールとともに使用するための磁石は、細胞懸濁液が流れるチャンバの外部に位置することができるか、またはチャンバの内部に位置することができる。磁石が内部にある場合、これらの磁石を生体適合材料で被覆することができる。特に磁石が内部にある場合、これらの磁石を使い捨て可能とすることができる。

図１Ｂは、複数のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ａ、８ｂ、および８ｃを並列で含む細胞処理システム２の概略図である。３つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８のみが示されているが、複数は、３つ以上の任意の数とすることができる。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８が並列であるとき、これらのモジュールは、典型的には、各モジュールによって同じ機能が実行されるように、同じタイプであって、かつ同じ構成であり得る。並列のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、追加のモジュールと組み合わせたとき、急速な細胞懸濁液の処理または流体体積の管理にとって特に有用となることができる。加えて、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を並列に配置することで、モジュールがすべて同時に使用されるため、流体流の制御に柔軟性が提供される。

図１Cは、複数のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ａ、８ｂ、および８ｃを直列で含む細胞処理システム２の概略図である。３つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８のみが示されているが、複数は、３つ以上の任意の数とすることができる。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８が直列であるとき、これらは、各モジュールによって同じ機能が実行されるように、同じタイプであって、かつ同じ構成であり得るが、典型的には、これらは、各モジュールによって異なる機能が実行されるように、異なる同じタイプおよび構成である。たとえば、モジュール８ａは、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞を分離することができ、モジュール８ｂは、常磁性粒子結合細胞をデビーディングすることができ、モジュール８ｃは、より大きい磁界勾配下で常磁性粒子結合細胞をデビーディングすることができる。

図１Ｄは、戻りループ１４が常磁性粒子結合細胞を再びフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を通るように方向付ける細胞処理システム２の概略図である。そのようなシステムは、戻りループ１４のない類似のシステムと比較すると、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞のより良好な分離、または非結合細胞および常磁性粒子のより良好なデビーディングもしくは分離を実現するために使用することができる。流体は、バルブまたはスイッチによって戻りループ１４または磁性出力モジュール１２へ方向付けることができる。

図１Ｅは、細胞懸濁液モジュール４および緩衝剤モジュール６がフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８に別個に接続された細胞処理システム２の概略図である。そのようなシステムは、図５に図示し、それに関して説明したように、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８がｘ－ｙを横切る配向の構成で２つの入口６２および２つの出口６４ならびに磁石５４を有するとき、特に有用であり得る。

図１Ｆは、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８の下流に位置する回転膜デビーディングモジュール１８を有する細胞処理システム２の概略図である。回転膜デビーディングモジュール１８は、廃棄物出力モジュール２０および細胞出力モジュール２２に接続される。このシステム２では、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞を分離し、その一方、回転膜デビーディングモジュール１８は、すべてのデビーディングを行い、またはフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８も同様にデビーディングを行うことができる。任意選択で、回転膜デビーディングモジュール１８内の懸濁流体に化学薬品などの試薬が追加される場合、試薬モジュール２４が存在することができる。図１Ｆには１つの回転膜デビーディングモジュール１８が示されているが、システム２は、複数のモジュール１８を直列または並列で含むことができる。モジュール１８が直列であるとき、化学薬品への細胞の曝露を最小にするために、最後のモジュール１８にのみ化学薬品を追加することができる。

試薬モジュール２４内の試薬は、粒子と細胞との間の結合を弱くする任意の化学薬品とすることができる。粒子は、常磁性粒子とすることができ、または非常磁性粒子とすることができる。

図５Ａは、回転膜デビーディングモジュール１８の長手方向の断面概略図である。このモジュール１８は試料入口８０を含み、試料入口８０は、細胞懸濁液流体が円筒形のデビーディングチャンバ８２内へ流れることを可能にし、デビーディングチャンバ８２は、円筒形の側壁８４によって部分的に画定されており、同軸方向に配向された円筒形の回転膜８６を収容する。壁８４は外部が磁石８８で裏打ちされている。デビーディングチャンバ１８は、回転膜８６を通過した流体が廃棄物出力モジュール２０を介して出ることを可能にし、その一方、残りの流体および細胞は、細胞出力モジュール２２を通って出る。回転膜８６の平均ポアサイズは、細胞の平均直径より小さいが、デビーディングによって除去すべき非常磁性粒子より大きい。平均ポアサイズはまた、除去すべき任意の常磁性粒子より大きくすることができ、主要な粒子除去方法として、または磁気除去に対するバックアップとして、回転膜によるこれらの常磁性粒子の除去を可能にする。

磁石８８は、図５Ｂに示すように、壁８４を実質的に取り囲むことができ、または図５Ｃに示すように、壁８４に沿って間隔をあけることができる。磁石８８は、図５Ａ～図５Ｃに示すように壁８８に隣接または壁８８に近接する位置（図示せず）から、壁８４から離れた位置へ、磁石８８を動かすことを可能にするように、可動プラットホーム上に取り付けることができる。たとえば、離れた位置は、壁８４から少なくとも１ｃｍとすることができる。離れた位置へのこの動きは、磁石８８がそれらの磁界を介してチャンバ８２内の任意常磁性粒子に実質的な影響を与えるのを防止する。磁石８８とチャンバ８２との間に磁気絶縁材料が挿入された場合、離れた位置は、磁気絶縁材料が存在しなかった場合より小さくすることができる。磁石８８が調整可能な磁界強度を有する場合、チャンバ８２内の任意の常磁性粒子に与える実質的な影響を回避するために、磁石８８を動かすのではなく、より低い磁界強度またはゼロの磁界強度へ単に調整することができる。

図５には複数の磁石８８が示されているが、単一の磁石８８のみを有することも可能である。

磁石８８は、高い磁界強度を有することができる。たとえば、磁石８８は、コバルトなどの別の金属で合金化されたネオジウムまたはサマリウムなどの希土類金属を含有することができる。磁石８８は、双極子磁石、４極子磁石、または任意の他のタイプの磁石とすることができる。磁石８８は、調整可能な磁界強度を有することができ、たとえば電磁石とすることができる。磁石８８は、磁気引力を最大にするように、たとえば巻き付けた構成で配置することができる。

回転膜モジュールとともに使用するための磁石は、細胞懸濁液が流れるチャンバの外部に位置することができ、またはチャンバの内部に位置することができる。磁石が内部にある場合、これらの磁石を生体適合材料で被覆することができる。特に磁石が内部にある場合、これらの磁石を使い捨て可能とすることができる。

本明細書に開示するモジュールで使用するのに適した例示的な回転膜には、ＬＯＶＯ（登録商標）の細胞処理システム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｆｅｎｗａｌ、Ｌａｋｅ Ｚｕｒｉｃｈ、ＩＬ）で使用される４μｍトラックがエッチングされたポリカーボネート回転膜、およびＩＳＯＬＥＸ（登録商標）の磁気細胞分離システム（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）で使用される回転膜が含まれる。

図２～４に示すフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８または図５に示す磁気回転膜デビーディングモジュール１８を含む図１Ａ～図１Ｆからの要素は、実行すべき特有の細胞処理に応じて、細胞処理システム２内で互いに組み合わせることができる。これらの要素は、図示のように、または他の妥当な変形形態で、組み合わせることができる。たとえば、他の要素に関して図１Ａに示すシステム内に、別様に試薬モジュール２４を含むことができ、その結果、デビーディングに使用されるとき、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８内の懸濁流体に化学薬品を追加することができる。特にモジュール８および１８内で、適切な流体体積および流速を確保するために、追加の緩衝剤モジュールまたは出力モジュールを含むモジュールを配置および使用することができる。

図１Ｇには、複数のモジュールおよびループを組み合わせる１つの例示的な細胞処理システム２が示されている。このシステムは、第１のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ａに接続された細胞懸濁液モジュール４および緩衝剤モジュール６ａを含み、第１のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ａは、非磁性出力モジュール１０ａおよび磁性出力モジュール１２ａを有する。磁性出力モジュール１２ａは、第２の直列フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ｂに接続され、第２の直列フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ｂはまた、緩衝剤モジュール６ｂに接続されており、非磁性出力モジュール１０ｂおよび磁性出力モジュール１２、ならびに戻りループ１４ａを有する。戻りループ１４ａは、戻ってモジュール８ｂに至る。磁性出力モジュール１２ｂは第１の回転膜デビーディングモジュール１８ａにつながり、第１の回転膜デビーディングモジュール１８ａは、廃棄物出力モジュール２０ａおよび細胞出力モジュール２２ａを有する。細胞出力モジュール２２ａは、第２の直列回転膜デビーディングモジュール１８ｂにつながり、第２の直列回転膜デビーディングモジュール１８ｂはまた、試薬モジュール２４ならびに廃棄物出力モジュール２０ｂ、戻りループ１４ｂ、および細胞出力モジュール２２ｂに接続されている。戻りループ１４ｂは、戻って第２の直列フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ｂに至る。

図１Ｈには、特有の流体導管を備えた様々な追加のモジュールを有する別の例示的な細胞処理システム２が示されている。細胞懸濁液モジュール４および衛星モジュール３０が、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８に接続されており、衛星モジュール３０は、空のままとすることができ、または緩衝剤を収容することができる。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、緩衝剤モジュール６および貯蔵モジュール２６に別個に接続される。貯蔵モジュール２６は、回収モジュール２８にさらに接続される。多くの接続が、スパイク管材３２を使用して設けられる。システムは、様々な流体導管に沿って、ローラクランプ３４、溶接部位３６、スライドクランプ３８、およびピンチクランプ４０をさらに収容する。

細胞処理システム２は、磁性カラム、他の物理的分離モジュール、細胞洗浄モジュール、細胞濃縮モジュール、および培地交換モジュールなどの様々な追加のモジュール１６を収容することができる。

（細胞分離およびデビーディング方法）
システム２は、フロースルー式プロセスにおいて、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞の分離、磁性粒子結合細胞のデビーディング、常磁性粒子および非結合細胞の分離、またはこれらの任意の組合せを行うために使用することができる。フロースルー式プロセスでは、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８内にある間はすべての細胞が動き続ける。モジュール８を通過した常磁性粒子結合細胞のうち、壁５２に沿って止まるのは、ゼロ、０．０１％以下、もしくは０．０５％以下、または１％以下である。

（フロースルー式の磁気分離／デビーディングプロセス）
図１Ａのシステムを使用するフロースルー式プロセスでは、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、任意選択で、モジュール８を通って緩衝剤モジュール６からの緩衝剤を非磁性出力モジュール１０もしくは磁性出力モジュール１２または別の出力もしくは追加のモジュール１６へ流すことによって、プライミングすることができる。常磁性粒子結合細胞を含有する細胞懸濁液が、モジュール８を通って流される。

システム２が分離のために構成される場合、細胞懸濁液は、非磁性出力モジュール１０に方向付けられる。モジュール８は、緩衝剤６からの緩衝剤がモジュール８を通って磁性出力モジュール１２へ流れる間に常磁性粒子を引き付けないように、周期的に構成することができる。細胞のより良好な分離および高純度の磁性または非磁性細胞製品を確実にするために、細胞懸濁液は、モジュール８を２回目または引き続く通過のために、ループ１４を通って方向付けることができる。常磁性粒子結合細胞は、デビーディングのために構成されたフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８または回転膜デビーディングモジュール１８などの追加の構成要素１６に方向付けることができる。

システム２がデビーディングのために構成される場合、モジュール８を通って流れた後、細胞懸濁液は、非磁性出力モジュール１０へ方向付けられる。別法として、細胞懸濁液は、非磁性出力モジュール１０へ方向付けられる前に、モジュール８を２回目または引き続く通過のために、ループ１４を通って方向付けられることができる。

フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を使用するプロセスは、少なくとも１つの結合された常磁性粒子１０２を有する各常磁性粒子結合細胞１００を、流体力（せん断力または流体抵抗）１０４にかける。各細胞１００はまた、図６に示すように、磁気力１０６にかけられる。常磁性粒子１０２が常磁性粒子結合細胞１００に結合されたままになるように流体力１０４および磁気力１０６を組み合わせて、細胞１００を非結合細胞から分離することを可能にすることができる。流体力１０４および磁気力１０６はまた、常磁性粒子１０２を常磁性粒子結合細胞から切り離すように組み合わせて、細胞１００のデビーディングを可能にすることもできる。拡散および重力などの２次的な力もまた、常磁性粒子１０２に作用するが、デビーディングに対するそれらの影響は、典型的には、流体力および磁気力よりはるかに小さく、モジュールを通る適切な流速を計算するときに無視されることが多い。

システム２は、概して、可能な限り迅速に、望ましい細胞がモジュールの通過にかけられなくなるように構成することができ、それにより細胞の損傷を低減させる。たとえば、デビーディング構成では、磁性出力モジュール１２のみが、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８への戻りループを収容することができ、それにより、より容易にデビーディングされた細胞が、より強固に結合された常磁性粒子を有する細胞より少ない回数だけ、モジュール８を通過することを可能にする。

フロースルー式モジュール８は、層流または乱流とすることができる。磁気力１０６は、常磁性粒子１０２の飽和磁束（ｍ_ｓ）によって影響される。磁気力１０６はまた、常磁性粒子１０２がさらされる磁界５６の強度によって影響され、これは、磁石５４の強度ならびにｚ方向におけるチャンバ５０の深さ、およびそのチャンバ内の細胞１００の位置によって影響される。磁気力１０６は、チャンバ５０を通って動くときに常磁性粒子１０２がさらされる磁界勾配によってさらに影響され、これは、磁石５４の強度および配置ならびに磁石５４に対する常磁性粒子１０２の位置によって影響される。

加えて、流体力は、流体の流速によって影響され、これは、典型的には、チャンバの中心で最も速く、壁でゼロになる。これは、壁に付着した細胞が、常磁性粒子から切り離されるのに十分な流体力を受けることができず、壁に沿って位置する細胞が、ほとんど静止した状態になり、下流の細胞を流体力から遮蔽する可能性があることを意味する。この結果、望ましい細胞の損失が生じるが、これはチャンバ５０を通って細胞懸濁液を連続して流すことによって回避される。この損失は、細胞が磁気力によって静止状態にならないフロースルー式の手法によって回避することができる。これはまた、流体の流速がチャンバ中で均一であるプラグフロー式モジュールなど、壁での速度がゼロまたはゼロ近傍にならないモジュールによって回避することができる。

（フロースルー式分離プロセス）
フロースルー式分離プロセスは、図２Ａおよび図２Ｂに示す構成のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を使用して行うことができる。流速は、流体力１０４および磁気力１０６により、常磁性粒子１０２が細胞１００に結合したままでいることを可能にするようになっている。流速はまた、細胞１００が流体力によって溶解されないようになっている。

図７Ａは、常磁性粒子結合細胞１００および非結合細胞１１０がチャンバ５０に入ったばかりのときの図２Ｂのモジュール８を示す。図７Ｂでは、細胞１００は停止しているが、非結合細胞１１０は元の速度のまま進んでいる。図７Ｃでは、磁石が離され、細胞１００は動き続けるが、非結合細胞１１０はチャンバ５０から出ている。

磁石５４がチャンバ５０に隣接または近接している間にチャンバ５０から出た懸濁流体は、非磁性出力モジュール１０に入る。周期的に、磁石５４がチャンバ５０から離れる方へ動かされている間に、細胞懸濁液モジュール４からの細胞懸濁液流を停止し、緩衝剤を緩衝剤モジュール６からチャンバ５０内へ流して、常磁性粒子結合細胞１００が緩衝剤によって磁性出力モジュール１２内へ押し流されることを可能にする。

このフロースルー式分離プロセスは、特にモジュール８を通って細胞の複数の通過を可能にするために繰り返されたとき、非磁性出力モジュール１０に入る前に、常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を細胞懸濁液から除去することができる。細胞がモジュール８を一度だけ通過する単一通過プロセスの場合、効率はより低くなることがある。たとえば、単一通過プロセスでは、モジュール８は、非磁性出力モジュール１０に入る前に、常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも２５％または少なくとも５０％を細胞懸濁液から除去することができる。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を通って非磁性出力または磁性出力を１回または複数回通過する結果、１％以下の非結合細胞１１０を有し、フロースルー式分離プロセス前に細胞懸濁液中に見られる常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも９９％を含有する常磁性粒子結合細胞製品、１％以下の常磁性粒子結合細胞１００を有し、フロースルー式プロセス前に細胞懸濁液中に見られる非結合細胞１１０の少なくとも９９％を含有する非結合細胞製品、または両方を得ることができる。

（フロースルー式デビーディングプロセス）
フロースルー式デビーディングプロセスはまた、図２Ａおよび図２Ｂに示す構成のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を使用して行うことができる。流速は、流体力１０４および磁気力１０６により、細胞１００がチャンバ５０を通過している間に、細胞懸濁液中の細胞の平均で、少なくとも１つの常磁性粒子１０２が細胞１００から切り離されるようになっている。流速はまた、細胞が流体力によって溶解されないようになっている。

図８Ａは、常磁性粒子結合細胞１００ａおよび１００ｂがチャンバ５０に入ったばかりのときの図２Ｂのモジュール８を示す。細胞１００ａは、１つの常磁性粒子１０２を有し、その一方、細胞１００ｂは、２つの常磁性粒子１０２を有する。図８Ｂでは、１つの常磁性粒子１０２がそれぞれ、細胞１００ａと細胞１００ｂの両方から切り離されて、壁５２で静止しており、細胞１００ａおよび１００ｂは、引き続きチャンバ５０を通過している。細胞１００ａは、常磁性粒子１０２を有していないが、細胞１００ｂは、１つの常磁性粒子１０２を保持している。細胞１００ｂは、この第２の常磁性粒子１０２を除去するためにモジュール８を２回に通過することができる。別法として、モジュール８は、細胞１００ａがチャンバ５０から出ていくのに対して、図７の常磁性粒子結合細胞と同様に、細胞１００ｂがチャンバ５０内に残るように構成することができる。

このフロースルー式デビーディングプロセスは、常磁性粒子の少なくとも９９％を細胞から除去することができる。

磁性出力モジュール１２からの再循環ループ１４を収容するシステム２を使用して、ＣＬＴ０１１９ Ｔ細胞をデビーディングしたとき、磁性出力内の細胞を緩衝剤モジュール６からの緩衝剤中に再懸濁させ、モジュール８を２回、次いで再び３回に通過させた。図９には、このプロセスの結果と従来のストップフロー式プロセスの結果との比較が提供されている。図９は、末端間収率を示し、これは、最終製品中の細胞の数と、デビーディングシステムに入った細胞の数との比である。

図３に示すフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８は、図２Ａおよび図２Ｂに示すモジュール８と同様に細胞をデビーディングするために使用することができる。ポート７２を通って導入される流体は、膜７０から細胞１００を追い払うのに十分な力を細胞１００に供給する。懸濁流体の速度が膜７０近傍でゼロに近づくため、これらの細胞は、普通なら分離もしくはデビーディングされない可能性があり、または失われる可能性がある。

このフロースルー式デビーディングプロセスもまた、常磁性粒子の少なくとも９９％を細胞から除去することができる。

（フロースルー式ゼロ勾配フィルタプロセス）
フロースルー式分離プロセスは、図４Ａおよび図４Ｂに示す構成のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を使用して行うことができる。流速は、流体力１０４および磁気力１０６により、常磁性粒子１０２が細胞１００に結合したままでいることを可能にするようになっている。流速はまた、細胞１００がチャンバ５０内で止まらず、流体力によって溶解されないようになっている。図１０～図１３には、様々な構成が示されており、これらの構成は、異なるゼロ勾配フィルタプロセスで使用するために、たとえば入口６２および出口６４の数および比例サイズを調整するように、修正することができる。たとえば、異なるサイズの入口６２および出口６４を有することによって実現されるのと同じ効果がまた、同じサイズの入口および出口を通って、典型的にはポンプによって制御される異なる流速を提供することによって実現される。

図１０は、常磁性粒子結合細胞１００がゼロ勾配構成でどのようにモジュール８を通って流れるかに関する基本的な説明を示す。図１０Ａに示すように、モジュール８に入った後の細胞１００（左図）は、モジュール８からほぼ出る時点（右図）まで、ゼロ勾配線５８に向かってｘ方向に引っ張られる。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、細胞１００は、モジュール８に入るとき（左図）、または出口に近接したとき（右図）でも、ｙ方向またはｚ方向においては磁気力の作用を受けない。

図１１は、図４Ａに示すように磁石５４が配向されたゼロ勾配モジュール８を示す。このモジュールでは、流体は、入口６２を介して入る。磁性粒子１０２を有する細胞１００は、ゼロ勾配線５８をたどり、磁性出口６４ｂへ方向付けられる。非結合細胞１１０は、ゼロ勾配線５８によって影響されず、非磁性出口６４ａおよび６４ｃへ流れる。この構成では、いくつかの非結合細胞１１０も磁性出口６４ｂに入る。

図１２は、図４Ｃのモジュール８を通って動いている細胞を示す。常磁性粒子１０２を有する細胞１００は、ゼロ勾配線５８をたどり、磁性出口６４ａへ方向付けられる。非結合細胞１１０は、ゼロ勾配線５８によって影響されず、非磁性出口６４ｂへ流れる。したがって、ゼロ勾配線５８は、すべての細胞が壁５２の方へ押されることなくチャンバ５０を通って動き続けることを可能にしながら、磁気フィルタとして作用する。図示のように、非磁性入口６２ａは磁性入口６２ｂより大きく、非磁性出口６４ｂは磁性出口６４ａより大きい。モジュール８内の流体流が層流である場合、非磁性入口６２ａからの流体は、非磁性出口６４ｂまで横切り、それにより任意の非結合細胞１１０が磁性出口６４ａに入るのを防止する。この方法はまた、乱流でも使用することができるが、磁性出口６４ａへ進む非結合細胞の損失のため、効率は低くなる。

このフロースルー式分離プロセスは、非磁性出力モジュール１０に入る前に、常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を細胞懸濁液から除去することができる。フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を通って非磁性出力または磁性出力のいずれかを複数回通過する結果、１％以下の非結合細胞１１を有し、フロースルー式分離プロセス前に細胞懸濁液中に見られる常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも９９％を含有する常磁性粒子結合細胞製品、１％以下の常磁性粒子結合細胞１００を有し、フロースルー式プロセス前に細胞懸濁液中に見られる非結合細胞１１０の少なくとも９９％を含有する非結合細胞製品、または両方を得ることができる。

（フロースルー式のゼロ勾配常磁性粒子分離プロセス）
フロースルー式常磁性粒子分離プロセスはまた、図４Ｃに示す構成のフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８を使用して行うことができる。図１３は、モジュール８を通って動いているデビーディングされた非結合細胞１１０および常磁性粒子１０２を示す。細胞１１０は、たとえば回転膜デビーディングモジュール１８、非回転膜デビーディングモジュール、またはデビーディング構成の同じもしくは別個のモジュール８によって、事前にデビーディングされている。別法として、細胞１１０は、すでに常磁性粒子１０２の存在下にあるが、常磁性粒子１０２に結合されていない可能性もある。常磁性粒子１０２は、ゼロ勾配線５８をたどり、磁性出口６４ａへ方向付けられる。デビーディングされた非結合細胞１１０は、ゼロ勾配線５８によって影響されず、非磁性出口６４ｂへ流れる。したがって、ゼロ勾配線５８は、細胞１１０が任意の壁５２に向かって押されることなくチャンバ５０を通って動き続けることを可能にしながら、磁気フィルタとして作用する。

このフロースルー式常磁性粒子分離プロセスは、ビーズの少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を細胞懸濁液から除去することができる。

このプロセスは、常磁性粒子を除去するとともに、細胞懸濁液の望ましくない成分も同様に除去することができる。

細胞分離プロセスおよび粒子分離プロセスについて上記では別個に説明したが、これらのプロセスをどちらも同じモジュールまたはシステム内で同時に行うこともできる。たとえば、分離モジュールは、典型的には、常磁性粒子結合細胞と遊離の常磁性粒子の両方を細胞懸濁液から除去し得る。

（回転膜デビーディングプロセス）
図１Ｆのシステム２を使用するフロースルー式プロセスでは、分離された常磁性粒子結合細胞１００は、図１４に示すように、試料入口８０を介して回転膜モジュール１８内へ方向付けられる。デビーディングチャンバ８２内で、回転膜８６は、再循環するテイラー－クエット流を細胞懸濁液中に生成し、それにより、入口８０から出口２０および２２へチャンバ８２を通る流れによって生成される流体力に加えて、流体力を引き起こす。その結果、常磁性粒子１０２は依然として流体力および磁気力を受けるが、これらの力の関係およびこれらの力がどのようにデビーディングを引き起こすかは、モデル化するのが困難になる。しかし、流体力は、少なくとも回転膜８０のサイズおよび回転速度、チャンバ８２を通る細胞懸濁液の流速、ならびに懸濁流体の粘性によって影響される。磁気力は、常磁性粒子１０２の性質、磁石８８の性質、およびモジュール１８の設計、特に細胞１００と磁石８８との間の距離によって影響される。流体力は、典型的には、細胞を溶解させるほど高くない。テイラー－クエット流は、細胞を壁８４および回転膜８６から離して接触しないようにするのに十分である。

細胞１００から除去された常磁性粒子１０２は、壁８４へ移動し、特に壁８４に沿ってゼロ勾配線またはゼロ勾配帯へ移動する。流体力だけによって、任意の非常磁性粒子１２０も細胞１００から除去される。非常磁性粒子１２０は、回転膜８６内の孔を通過し、次いで廃棄物出口モジュール２０を介してチャンバ８２から出る。任意選択の試薬チャンバ２４から追加された化学薬品１２２もまた、回転膜８６内の孔を通過し、廃棄物出口モジュール２０を介してチャンバ８２から出る。これにより、化学薬品１２０に対する細胞１００の曝露が制限される。デビーディングされた非結合細胞１１０は、細胞出口モジュール２２を介してチャンバ８２を出る。

常磁性粒子１０２は、たとえばチャンバ８２を通る細胞懸濁液流を止め、磁石８８を壁８４から離れた位置へ動かし、次いでチャンバ８２を通って緩衝剤を流すことによって、壁８４から周期的に除去することができる。

一部の常磁性粒子１０２も、回転膜８０を通過して、除去される可能性がある。磁石８８がない場合、またはチャンバ８２から十分に離れている場合、回転膜８０によってすべての常磁性粒子の除去を実現することができる。

このフロースルー式デビーディングプロセスもまた、常磁性粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９９％の細胞からの除去、すべての非常磁性粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の細胞からの除去、または両方を行うことができる。

回転膜はまた、常磁性粒子１０２を非結合細胞１０２から分離するために使用することができる。

回転膜８６は、細胞懸濁液中のすべての細胞を除外するのに十分に小さいポアサイズを有することができる。

回転膜モジュール１８はまた、望ましくない成分を細胞懸濁液から除去するために使用することができる。これらの成分は、回転膜８８によって単に濾過することができ、または常磁性粒子１０２、非常磁性粒子１２０、もしくは両方の被覆と相互作用して、粒子とともに除去することができる。デビーディングおよび望ましくない成分の除去は、別個にまたは同時に行うことができる。

（他のデビーディングおよび常磁性粒子分離プロセス）
システム２は、そのモジュール設計に起因して、他のデビーディングおよび常磁性粒子分離プロセスにも適合している。適当な追加のモジュール１６を挿入するだけでよい。たとえば、多くの場合、細胞をデビーディングするために、磁性カラムを含むカラムおよび物理的分離方法が使用され、追加のモジュール１６として含むことができる。

（他の一体型プロセス）
システム２は、そのモジュール設計に起因して、他の一体型プロセスにも適合している。これらのプロセスは、少なくとも１つの追加のモジュール１６内で行うことができる。たとえば、細胞を洗浄するために、モジュールを使用することができる。また、細胞を濃縮するために、モジュールを使用することができる。細胞が位置する培地を交換するために、モジュールを使用することができる。１つのモジュールをこれらのステップの２つ以上に使用することができる。

（複数モジュールのフロースルー式プロセス）
図１Ｇに示すシステム２は、複数モジュールのフロースルー式プロセスで使用することができる。任意選択で、フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ａを通って、そして意選択でモジュール８ｂ、１８ａ、および１８ｂの１つまたは複数を通って、緩衝剤モジュール６ａからの緩衝剤を流すことができる。望ましい常磁性粒子および非常磁性粒子結合細胞ならびに望ましくない非結合細胞を含有する細胞懸濁液が、モジュール８ａを通って流され、モジュール８ａは、分離のために図４に示すように構成されているが、別法として分離のために図２Ａおよび図２Ｂに示すように構成することもできる。非結合細胞は、廃棄物として非磁性出力モジュール１０ａへ方向付けられる。常磁性粒子結合細胞は、磁性出力モジュール１２ａを介してフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュール８ｂへ方向付けられる。モジュール８ｂは、デビーディングのために図２Ａおよび図２Ｂに示すように構成される。常磁性粒子結合細胞は、廃棄物として磁性出力モジュール１２ｂに入る前に、少なくとも１回、戻りループ１４ａを通って流される。デビーディングされた非結合細胞は、非磁性出力モジュール１０ｂを介して回転膜デビーディングモジュール１８ａへ送られる。残りの常磁性粒子および非常磁性粒子は除去され、非常磁性粒子は、廃棄物出力モジュール２０ａ内へ流れ、その一方、非結合常磁性粒子は、モジュール１８内に残り、非結合細胞および常磁性粒子を有する細胞、非常磁性粒子、または両方は、細胞出力モジュール２２ａ内へ流れる。細胞出力モジュール２２ａは、第２の回転膜モジュール１８ｂに至る。常磁性粒子もしくは非常磁性粒子のいずれか、または両方の細胞からの除去を容易にすることが可能な化学薬品が、試薬モジュール２４から追加される。非常磁性粒子および化学薬品は、廃棄物モジュール２０ｂ内へ流れる。常磁性粒子は、モジュール１８内に残る。非結合細胞、および常磁性粒子、非常磁性粒子のいずれか、または両方を有する細胞は、フロースルー式プロセスの最終細胞製品として細胞出力モジュール２２ｂへ送られる前に、少なくとも１回、戻りループ１４ｂ内へ流れる。

（臨床応用）
本明細書のプロセスはすべて、ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃＧＭＰ）基準に従って行うことができる。

これらのプロセスは、特に製造プロセスの最初の生の出発原料（特に細胞）の採取中、ならびに細胞療法のための細胞の選択または増殖のための製造プロセス中、細胞の精製、高濃度化、採取、洗浄、濃縮、または細胞培地の交換に使用することができる。

細胞は、任意の複数の細胞を含むことができる。細胞は、同じ細胞タイプであり得、または混合細胞タイプであり得る。加えて、細胞は、細胞療法の場合、自家ドナーまたは単一の同種異系ドナーなどの１人のドナー由来であり得る。細胞は、たとえば、白血球搬出法またはアフェレーシスによって患者から得ることができる。細胞は、Ｔ細胞を含むことができ、たとえば５０％超のＴ細胞、６０％超のＴ細胞、７０％超のＴ細胞、８０％超のＴ細胞、または９０％超のＴ細胞を有する集団を含むことができる。

選択プロセスは、培養および増殖前に細胞を選択する際に特に有用となることができる。たとえば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８で被覆された常磁性粒子は、増殖のため、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他のタンパク質をコードする核酸の導入のためのＴ細胞を選択するために使用することができる。そのようなプロセスは、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）の治療のためのＣＴＬ０１９ Ｔ細胞を作製するために使用される。

本明細書に開示するデビーディングプロセスおよびモジュールは、細胞療法のための細胞の製造で、たとえば培養および増殖の前または後に細胞を精製する際に、特に有用となることができる。たとえば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体で被覆された常磁性粒子は、Ｔ細胞、たとえば、ＣＡＲがＴ細胞によって発現されるように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他のタンパク質をコードする核酸の導入によって修飾されたまたは修飾されるＴ細胞を選択的に増殖するために使用することができる。そのようなＴ細胞の製造中、デビーディングプロセスまたはモジュールは、Ｔ細胞を常磁性粒子から分離するために使用することができる。そのようなデビーディングプロセスまたはモジュールは、たとえば、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）の治療のためのＣＴＬ０１９ Ｔ細胞を作製するために使用される。

ここで例として示す１つのそのようなプロセスでは、細胞、たとえばＴ細胞は、アフェレーシス（たとえば、白血球搬出法）を介してドナー（たとえば、自家性のキメラ抗原受容体Ｔ細胞製品によって治療すべき患者）から採取される。次いで、採取された細胞は、任意選択で、たとえば、エルトリエーションステップによって精製することができる。次いで、常磁性粒子、たとえば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で被覆された常磁性粒子を細胞集団に追加して、Ｔ細胞を増殖させることができる。このプロセスはまた、トランスダクションステップを含むことができ、１つまたは複数の所望のタンパク質、たとえばＣＡＲ、たとえばＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードする核酸が、細胞内へ導入される。核酸は、レンチウイルスベクターによって導入することができる。次いで、細胞、たとえばレンチウイルスによってトランスダクションを生じさせた細胞は、数日間、たとえば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、またはそれより多い日数にわたって、たとえば適した培地の存在下で増殖させることができる。増殖後、本明細書に開示するデビーディングプロセス／モジュールを使用して、所望のＴ細胞を常磁性粒子から分離することができる。このプロセスは、本開示のプロセスによる１つまたは複数のデビーディングステップを含むことができる。次いで、デビーディングされた細胞は、患者に投与するために製剤化することができる。ＣＡＲ Ｔ細胞およびその製造の例は、たとえば、全体として参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１２／０７９０００にさらに記載されている。本開示のシステムおよび方法は、ＷＯ２０１２／０７９０００に記載されまたはそれに関連する任意の細胞分離／精製／デビーディングプロセスに使用することができる。

本明細書のシステムおよび方法は、従来のシステムおよび方法と比較すると、廃棄する望ましい細胞をより少なくし、細胞の損傷をより少なくし、そして化学薬品へのより少ないまたはゼロの曝露で磁性および非常磁性粒子を細胞からより確実に除去することによって、他の細胞療法製品にも同様に利益を与えることができる。

以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明全体を包含することを意図するものではない。本実施例の態様は、上述した本発明の他の態様と組み合わせることができる。

本実施例では、Ｔ細胞を培養基で９日間増殖し、次いで先行技術の手順による非フロースルー式デビーディングプロセスまたは本開示によるフロースルー式デビーディングプロセスを使用して採取およびデビーディングした。試料は、約１ｅ８の核形成（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）生存細胞～約３ｅ１０の核形成生存細胞を有した。核形成生存細胞に対する常磁性粒子の比は約３：１～１：３であり、より少ない総核形成生存細胞を有する試料は、より高い常磁性粒子と核形成生存細胞の比を呈した。常磁性粒子と細胞の比は、細胞回収の有意な要因であった。核形成生存細胞に対する常磁性粒子の比がより高いことで、核形成生存細胞が常磁性粒子に結合し、常磁性粒子除去プロセス中に失われる可能性が増大した。

非フロースルー式デビーディングプロセスでは、試料は、１リットルの血小板バッグ（Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）内に採取し、平床型の磁性板（ＤＹＮＡＭＡＧ（商標）ＣＴＳ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上に、０度で５分間、続いて３０度の勾配で１分間、静的に配置した。次に、非磁性画分を含有するバッグ内の液体をバッグからそらせて、最終製品を形成した。磁性画分は、廃棄物としてバッグ内に残した。

フロースルー式デビーディングプロセスでは、平床型の磁性板（ＤＹＮＡＭＡＧ（商標）ＣＴＳ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上に配置されたＣＳＤ４００Ｙ９ ＣＲＹＯＳＴＯＲＥ（商標）Ｃｏｎｉｃａｌ Ｂａｇ（ＯｒｉＧｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を通って、試料を連続して流した。バッグを通って磁石の上を連続して流れたため、試料は動的にデビーディングされ、常磁性粒子は、バッグを通って動くにつれて、生存核形成細胞から外れた。バッグを通過した後しばらくたった液体から、最終製品を形成した。磁性画分は、廃棄物としてバッグ内に残した。磁性画分内に捕捉された生存核形成細胞はほとんどなかった。これは、常磁性粒子に結合された生存核形成細胞が磁石に引き付けられて廃棄物中に失われた非フロースルー式デビーディングプロセスとは対照的である。

３８回の非フロースルー式デビーディングプロセスの実行および３６回のフロースルー式デビーディングプロセスの実行のメタデータ分析は、フロースルー式デビーディングプロセスが使用されたときの生存核形成細胞の回収の大幅な増大を示した。図１５では、生存核形成細胞の回収の増大は、試料中の細胞の数がより少ないとき（１．６ｅ９未満の総生存核形成細胞などの）に特に顕著であった。そのような総生存核形成細胞数では、フロースルー式デビーディングプロセスは、非フロースルー式デビーディングプロセスに対するわずか３４％の平均回収率と比較すると、７６％の平均回収率を示した。図１６では、試料中の細胞の数がより多いときでも、回収率の１０～２０％の増大が見られた。

この回収率の違いは、フロースルー式デビーディングプロセスが生存核形成細胞から常磁性粒子を動的に除去することが可能であり、その結果、これらの細胞は、採取前に初めは常磁性粒子に結合されていた場合でも失われないことによる。

本開示の例示的な実施形態についてのみ、上記で具体的に説明したが、開示の精神および意図される範囲から逸脱することなく、これらの例の修正形態および変形形態が可能であることが理解されよう。たとえば、磁気モジュールおよびそれらを収容するシステムは、記載したものに加えて、様々な構成で配置および使用することができる。加えて、システムおよび方法は、本明細書に具体的に記載していない追加の構成要素およびステップを含むことができる。たとえば、方法は、気泡を除去して細胞懸濁液または緩衝剤の動きに対する抵抗を低減させるための構成要素内へ流体が最初に導入されるプライミングを含むことができる。さらに、実施形態は、本明細書に記載する方法で使用するために、本明細書に記載するシステムの一部分のみを含むことができる。たとえば、実施形態は、細胞を分離またはデビーディングして細胞製品を作製することが可能な完全なシステムを形成するために、使い捨てでない機器内で使用できる使い捨てのモジュール、ホースなどに関することができる。

Claims (22)

1. 少なくとも１つの細胞懸濁液モジュールと、
   少なくとも１つの緩衝剤モジュールと、
   少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールと、
   少なくとも１つの非磁性出力モジュールと、
   少なくとも１つの磁性出力モジュールと、
   少なくとも１つの回転膜デビーディングモジュールと
   を備える細胞処理システムであって、前記少なくとも１つの回転膜デビーディングモジュールが、前記少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの下流に位置し、前記少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの磁性出力モジュールからの出力をデビーディングするように構成され、前記出力は、常磁性粒子結合細胞を含み、前記少なくとも１つの回転膜デビーディングモジュールは少なくとも１つの磁石を備え、前記常磁性粒子結合細胞をデビーディングして、常磁性粒子と、デビーディングされた非結合細胞とを生成する、細胞処理システム。
2. 少なくとも１つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールの上流に戻る少なくとも１つの戻りループをさらに備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
3. 少なくとも２つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを並列で備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
4. 少なくとも２つのフロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールを直列で備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
5. 少なくとも１つの追加のモジュールをさらに備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
6. 少なくとも２つの回転膜デビーディングモジュールを並列で備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
7. 少なくとも２つの回転膜デビーディングモジュールを直列で備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
8. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの物理的分離モジュールを備える、請求項５に記載の細胞処理システム。
9. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの磁性カラムモジュールを備える、請求項８に記載の細胞処理システム。
10. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの培地交換モジュールを備える、請求項５に記載の細胞処理システム。
11. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの細胞濃縮モジュールを備える、請求項５に記載の細胞処理システム。
12. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの細胞洗浄モジュールを備える、請求項５に記載の細胞処理システム。
13. 前記フロースルー式磁気分離／デビーディングモジュールが、
    壁によって画定され、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を有するチャンバと、
    前記ｙ方向に前記チャンバの対向端に配置された入口および出口と、
    前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間にゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも２つの磁石とを備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
14. 前記回転膜デビーディングモジュールが、
    円筒形の側壁によって部分的に画定されたデビーディングチャンバと、
    内部を有し、前記円筒形の側壁と同軸方向に配向された多孔質の回転膜と、
    試料入口と、
    前記回転膜の前記内部に接続された廃棄物出力モジュールと、
    前記デビーディングチャンバに接続された細胞出力モジュールとを備える、請求項１に記載の細胞処理システム。
15. 前記回転膜デビーディングモジュールが、前記円筒形の側壁に隣接または近接する少なくとも１つの磁石をさらに備える、請求項１４に記載の細胞処理システム。
16. 少なくとも２つの入口および少なくとも２つの出口を備える、請求項１３に記載の細胞処理システム。
17. 前記チャンバの壁に隣接または近接し、前記チャンバ内で前記入口と前記出口との間に少なくとも２つのゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも３つの磁石をさらに備える、請求項１３に記載の細胞処理システム。
18. 前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に２つのアレイで配置された少なくとも４つの磁石をさらに備える、請求項１３に記載の細胞処理システム。
19. 前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に２つのアレイで配置され、前記ｚ方向に前記チャンバの対向する側に１つの入口近傍から１つの出口近傍へｘ－ｙ平面内を横切るように配向された少なくとも４つの磁石をさらに備える、請求項１６に記載の細胞処理システム。
20. 少なくとも２つの磁石にもまた隣接する前記チャンバの壁に隣接するサブ膜の注入ポートと、
    前記サブ膜に隣接する膜と
    をさらに備える、請求項１３に記載の細胞処理システム。
21. 試薬モジュールをさらに備える、請求項１４に記載の細胞処理システム。
22. 前記多孔質の回転膜のポアサイズが、デビーディングされるべき粒子のサイズより大きく、デビーディングするべき細胞のサイズより小さい、請求項１４に記載の細胞処理システム。

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