JP7021245B2 - 多重特異性抗体を生産するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は多重特異性抗体の生産に関し、とりわけ、それらの鎖の一方にドメイン交差を含むそのような多重特異性抗体に関する。本明細書に記載する方法では、既にトランスフェクトまたは形質導入された細胞に、ドメイン交換された鎖のための追加発現カセットを導入することによって、多重特異性抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞の発現収率が改良される。

背景
US 5,958,727には、ポリペプチドの生産方法であって、前記ポリペプチドの生産に資する条件下で変異型細胞を培養する工程、ここで、変異型細胞は、前記ポリペプチドをコードする第1DNA配列を含む親細胞と、親細胞のゲノムの、第1DNA配列内ではなく、前記ポリペプチドの転写、翻訳または分泌を負に調節するタンパク質をコードする第2DNA配列内でもなく、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解するプロテアーゼをコードする第3DNA配列内でもない座位への核酸コンストラクトの導入によって関係づけられ、変異型細胞は、両細胞を前記条件下で培養した場合に、親細胞よりも多くの前記ポリペプチドを生産する、および前記ポリペプチドを回収する工程を含む方法が記載されている。

Genzel,Y.らは、グルタミンをピルビン酸で代用すると、アンモニア形成と哺乳動物細胞の成長阻害が低減することを記載している（Biotechnol.Prog.21（2005）58-69）。De la cruz Edmonds,M.C.らは、CHOK1 SV細胞システムのためのトランスフェクションプロトコールおよび高生産細胞スクリーニングプロトコールの開発を報告した（Mol.Biotechnol.34（2006）179-190）。WO 2007/036291には、改良された細胞培養培地が記載されている。EP 1482031には、無血清哺乳動物細胞培養培地とその使用が記載されている。Link,T.らは、CHO-K1細胞によって発現される組換えMUC1融合タンパク質をタンパク質フリー培地において生産するためのバイオプロセス開発について記載している（J.Biotechnol.110（2004）51-62）。EP 0481791にはCHO細胞および適応細胞のための培養培地が記載されている。US 2007/161079には、安定性が増加している組換え細胞クローンならびにそれらの作製方法および使用方法が記載されている。EP 0659880には、動物細胞または抗体生産細胞を培養するための方法が記載されている。Butler,M.らは非アンモニア生成培地への哺乳動物細胞の適応を記載している（Cytotechnol.15（1994）87-94）。Altamirano,C.らはCHO細胞培養培地処方の改良、すなわちグルコースとグルタミンの同時置換を記載している（Biotechnol.Prog.16（2000）69-75）。

EP 0569678には、腫瘍転移の免疫予防のための細胞ワクチンとしてのMHC遺伝子の二重トランスフェクタントが記載されている。WO 97/08342には、レポーター遺伝子を使って哺乳動物細胞におけるプロモーター配列の活性を測定するための改良された方法が記載されている。RhoA合成またはRhoC合成を特異的に阻害するための抗RhoA siRNAおよび抗RhoC siRNAの使用はWO 2005/113770に記載されている。酵母細胞における変異型真核生物アルカリホスファターゼの組換え生産または組換え発現のための方法はUS 7,202,072に記載されている。WO 2001/038557には、蛍光タンパク質の2シストロン性発現を使って多重形質転換細胞をスクリーニングする方法が記載されている。複数種の関心対象タンパク質または関心対象RNAを発現する組換え真核細胞株を生産するための方法はWO 1999/47647に記載されている。コード化された担体を使ってトランスフェクション材料を細胞にトランスフェクトするための、方法、組成物およびキットを含むシステムは、WO 2003/076588に記載されている。US 5,089,397には、ヒトメタロチオネインIIプロモーターの制御下に所望のタンパク質をコードする配列を有するDNA配列で形質転換されたCHO細胞を含む、所望のタンパク質を組換え生産するための発現系が記載されている。組換えタンパク質の生産方法がUS 2003/0040047に記載されている。Lamangoら（Lamango, N.S. et al., Arch. Biochem. Biophys. 330（1996）238-250）は、プロホルモン変換酵素2の生産の、神経内分泌ポリペプチド7B2の存在に対する依存性を記載している。非組込み型複製性BPV-1ゲノムを内包している細胞へのBPV-1系発現ベクターのトランスフェクションは、Waldenstroem, M. et al., Gene 120（1992）175-181に記載されている。US 4,912,038には、イヌおよびヒトの32K肺胞サーファクタントタンパク質を得るための方法およびベクターが記載されている。

WO 89/10959には、組換えDNA技法および遺伝子改変真核細胞における哺乳動物ポリペプチドの発現が記載されている。ヒト成長ホルモン用の発現ベクターと選択マーカー遺伝子用の発現ベクターとの反復共移入が、DD 287531に記載されている。WO 93/01296には、ワクシニアウイルス感染細胞における抗体生産が記載されている。WO 95/17513には糸状菌の再形質転換が記載されている。WO 89/00999には、抗体遺伝子のモジュール組み立て、それによって調製される抗体および使用が記載されている。US 2003/096341には酵母におけるアルカリホスファターゼの発現が記載されている。

EP 1453966には、組換えポリペプチドを生産するための方法が記載されている。WO 03/046187には、組換えポリペプチドを生産するための方法が記載されている。US 5,550,036には、ヒト細胞におけるヒトプロテインC遺伝子の共増幅方法が記載されている。EP 0921194にはTNFリガンドファミリー遺伝子が記載されている。EP 0319206には遺伝子増幅が記載されている。Lin,F.K.らはヒトエリスロポエチン遺伝子のクローニングと発現を記載している（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82（1985）7580-7584）。WO 00/28066には組換えヒトエリスロポエチンを発現する宿主細胞が記載されている。Chen,S.らは（Curr.Prot.Prot.Sci.（1998）5.10.1-5.10.41において）哺乳動物細胞における組換えタンパク質の生産について記載している。

WO 89/00605には、遺伝子が反対向きに配向されているベクターを含有するトランスフェクト細胞およびそれらを得る方法が記載されている。US 5,420,019には、安定な殺細菌性/透過増進性タンパク質産物およびそれらを含有する薬学的組成物が記載されている。US 5,639,275には、生物学的に活性な分子を送達するための遺伝子改変細胞を含有する生体適合性免疫隔離カプセルが記載されている。Kemball-Cook,G.らは、新しい哺乳類発現ベクターを使ったヒト血液凝固因子VIIおよびXIの高レベル生産を記載している（Gene 139（1994）275-279）。EP 1010758には、組換えヒトエリスロポエチンを生産するための発現系、分泌されたヒトエリスロポエチンを生成するための方法およびそれらの使用が記載されている。

Mulligan,R.C.およびBerg P.は、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする大腸菌（Escherichia coli）遺伝子を発現させる動物細胞の選択を記載している（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78（1981）2072-2076）。Colosimo,A.らは、哺乳動物細胞における外来遺伝子の移入および発現を記載している（BioTechniques 29（2000）314-331）。Maruyama,K.らは、哺乳類発現ベクターによる培養哺乳動物細胞のトランスフェクションを記載している（Meth.Nucleic Acids Res.（1991）283-305）。Wang,D.Z.らは、静脈内tPAによる急性卒中患者の処置について記載している（Stroke 31（2000）77-81）。Sakamoto,T.らは、活性化プロテインCによる血栓溶解後の動脈再閉塞の防止を記載している（Circulation 90（1994）427-432）。Lee,G.M.らは、統計的設計を使った、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞の浮遊培養によってエリスロポエチンを生産するための無血清培地の開発を記載している（J.Biotechnol.69（1999）85-93）。Lusky,M.およびBotchan,M.R.はウシパピローマウイルスベクター維持配列の特徴づけを記載している（Cell 36（1984）391-401）。

US 2014/0242079には、HEK細胞における一過性発現のための単一発現カセットベクターについて、1:2:1:1というベクター比が記載されている。

WO 2015/052230は多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体を開示している。

WO 2012/023053は多重特異性多価抗体を生成させるための方法を開示している。

WO 2005/072112は多重特異性抗体を生産および同定するための方法を開示している。

WO 02/079255はGnTIIIと共発現する組換え抗体を開示している。

US 2002/06210は、ヘテロ多量体構成要素および共通構成要素を有する多重特異性抗体の作製方法を開示している。

US 2013/045888は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの形質転換微生物における抗体などのマルチサブユニットタンパク質の高力価高純度生産のためのマルチコピー戦略を開示している。

Frenzelらは、Front.Immunol.4（2013）Article 217において、組換え抗体の発現について報告した。

Wurmらは培養哺乳動物細胞における組換えタンパク質治療薬の生産について報告した（Nat.Biotechnol.22（2004）1393-1398）。

概要
ヘテロ二量体型抗体、すなわち多重特異性抗体を生産するための細胞株の生成には、ただ一つの抗体鎖発現カセットとして軽鎖発現カセットを含む発現ベクターをトランスフェクションに使用すると有利であることが、見いだされた。このベクターは、共トランスフェクションにおいて他の発現ベクターと一緒に使用するか、第2の後続トランスフェクション工程において単独で使用することができる。このアプローチにより、改良された生成物プロファイルで、すなわち生成物の増加と生成物関連不純物の低減とを伴って、ヘテロ二量体型抗体を生産する、生産細胞株を得ることができる。

本明細書に開示する一局面は、少なくとも3つの異なるポリペプチドを含む/で構成される/を含有する多重特異性抗体を生産するための方法であって、
- 哺乳動物細胞を培養培地において（多重特異性抗体の発現に適した条件下で）培養する工程であって、該哺乳動物細胞が、
（a）（抗体を発現しない）哺乳動物細胞に第1発現ベクターと1種、2種または3種のさらなる発現ベクターとをトランスフェクトするステップ、および
（b）選択培養条件下で成長する、ステップ（a）において（安定に）トランスフェクトされた細胞を選択するステップ
によって生成され、
該第1発現ベクターが、多重特異性抗体のポリペプチドをコードする厳密に1つの核酸配列を含み、かつ該1、2または3種のさらなる発現ベクターが、多重特異性抗体の異なるポリペプチド鎖をそれぞれコードする少なくとも2つの核酸配列をそれぞれ含み、
該第1発現ベクターの厳密に1つの核酸配列が、多重特異性抗体の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列であり、
該第1発現ベクターによるトランスフェクションが、該1種、2種または3種のさらなる発現ベクターによるトランスフェクションと同時、その前またはその後のいずれかである、工程；ならびに
- 該細胞または該培養培地から多重特異性抗体を回収する工程
を含み、それによって多重特異性抗体を生産する方法である。

本明細書に開示する一局面は、少なくとも3つの異なるポリペプチドを含む/で構成される多重特異性抗体を（安定に）発現する（能力を有する）哺乳動物細胞を生成させ/生産し/得るための方法であって、
（a）（抗体を発現しない）哺乳動物細胞に第1発現ベクターと1種、2種または3種のさらなる発現ベクターとをトランスフェクトするステップであって、
該第1発現ベクターが、多重特異性抗体のポリペプチドをコードする厳密に1つの核酸配列を含み、かつ該1、2または3種のさらなる発現ベクターは、多重特異性抗体の異なるポリペプチド鎖をそれぞれコードする少なくとも2つの核酸配列をそれぞれ含み、
該第1発現ベクターの厳密に1つの核酸配列が、多重特異性抗体の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列であり、
該第1発現ベクターによるトランスフェクションが、該1種、2種または3種のさらなる発現ベクターによるトランスフェクションと同時、その前またはその後のいずれかである、ステップ；ならびに
（b）選択培養条件下で成長する、ステップ（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択するステップ
を含み、それによって多重特異性抗体を（安定に）発現する哺乳動物細胞を生成させ/生産し/得る方法である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、多重特異性抗体のポリペプチドのうちの2つは（コグネイト）ドメイン交換を含む/有する。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、第1発現ベクターの厳密に1つの核酸は、多重特異性抗体の、ドメイン交換を有する軽鎖ポリペプチドをコードする。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、ステップ（a）は、（抗体を発現しない）哺乳動物細胞に第1発現ベクターと1種、2種または3種のさらなる発現ベクターとを共トランスフェクトすることを含む。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、ステップ（a）は、（i）哺乳動物細胞に1種、2種または3種のさらなる発現ベクターを（同時にまたは逐次的に）トランスフェクトすること、任意で（ii）（安定に）トランスフェクトされた細胞を選択すること、（iii）（i）または（ii）の細胞に第1発現ベクターをトランスフェクトすること、および任意で（iv）（安定に）トランスフェクトされた細胞を選択することを含む。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、選択は発現収率および/または生成物関連副産物/不純物の量に基づく。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、選択は、最小量（分率）の生成物関連副産物/不純物を生産する、（安定に）トランスフェクトされた細胞の選択である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、選択は、最小量（分率）の生成物関連副産物/不純物を生産しかつ最も高い収率を有する、（安定に）トランスフェクトされた細胞の選択である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、哺乳動物細胞は多重特異性抗体を安定に発現する。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、ドメイン交換はCH1-CL交差またはVH-VL交差である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、多重特異性抗体は
（a）第1抗原に特異的に結合する完全長抗体の第1軽鎖および第1重鎖、
（b）第1軽鎖とペアを形成した場合に第1抗原に特異的に結合する完全長抗体の第2重鎖、および
（c）（a）または（b）の重鎖のうちの一方のC末端にペプチドリンカーを介して融合された、第2抗原に特異的に結合するFabフラグメントであって、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、Fabフラグメント
を含む、三価二重特異性抗体である。

本明細書に開示する一局面は、本明細書に記載する方法で得られる（安定にトランスフェクトされた）哺乳動物細胞である。

本明細書に開示する一局面は、多重特異性抗体を生産するための方法であって、
- 培養培地において本明細書に開示する（安定にトランスフェクトされた）細胞を（多重特異性抗体の発現に適した条件下で）培養する工程、
- 細胞または培養培地から多重特異性抗体を回収する工程、
- 任意で、回収された抗体を1つまたは複数のクロマトグラフィー工程で精製する工程
を含み、それによって多重特異性抗体を生産する方法である。

本明細書に開示する一局面は、生成物関連不純物が少ない/低減した多重特異性抗体調製物を生産するための方法であって、
- 本明細書に開示する方法で、多重特異性抗体を（安定に）発現する（安定にトランスフェクトされた）哺乳動物細胞を得る/生産する/生成させる工程、
- 得られた/生産された/生成させた哺乳動物細胞を培養培地において培養する工程、
- 細胞または培養培地から抗体調製物を回収する工程、
- 任意で、回収された抗体を1つまたは複数のクロマトグラフィー工程で精製する工程
を含み、それによって、生成物関連不純物が少ない/低減した多重特異性抗体調製物を生産する方法である。

本明細書に開示する一局面は、多重特異性抗体調製物中の生成物関連不純物を低減するための、本明細書に記載する方法の使用である。

本明細書には、ドメイン交差を有する鎖を少なくとも1つは含む多重特異性抗体の、組換え哺乳動物細胞における生産方法を記載する。本方法は改良されたプロセスをもたらし、ここでの改良は、なかんずく、生成物関連副産物の低減および正しく折りたたまれた/正しく組み立てられた多重特異性抗体の量の増加である。

本明細書に開示する一局面は、（ドメイン交差を有するポリペプチド鎖を少なくとも1つは含む）多重特異性抗体を生産するための方法であって、
（a）多重特異性抗体を（安定に）発現する（安定にトランスフェクトされた）哺乳動物細胞を用意する工程、
（b）工程（a）の哺乳動物細胞に、ドメイン交差を有する多重特異性抗体のポリペプチド鎖をコードする発現カセットをトランスフェクトする工程、
（c）工程（b）の細胞を培養し、細胞または細胞培地から抗体を回収することによって、多重特異性抗体を生産する工程、および
（d）任意で、回収された抗体を1つまたは複数のクロマトグラフィー工程で精製する工程
を含む方法である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体を発現する哺乳動物細胞は多重特異性抗体を安定に発現する。

一態様において、工程（b）の発現カセットは発現ベクター中にある。

すべての局面の一態様において、ドメイン交差を有する多重特異性抗体のポリペプチド鎖は抗体軽鎖である。

すべての局面の一態様において、ドメイン交差はCH1-CL交差またはVH-VL交差である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は二価二重特異性抗体または三価二重特異性抗体または四価二重特異性抗体である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体を発現する哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞に多重特異性抗体をコードする1種または複数種の核酸分子をトランスフェクトし、安定にトランスフェクトされた細胞を選択することによって得られる。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する完全長抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する完全長抗体の第2（修飾）軽鎖および第2（修飾）重鎖であって、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられており、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2（修飾）軽鎖および第2（修飾）重鎖
を含み、
（c）1つまたは2つのさらなる抗原（すなわち第3および/または第4抗原）に特異的に結合する1～2つの抗原結合ペプチドが、（a）および/または（b）の軽鎖または重鎖のC末端またはN末端にペプチドリンカーを介して融合している、
三重特異性または四重特異性抗体である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する（そして2つのFabフラグメントを構成する）、抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖、
（b）第2抗原に特異的に結合する、抗体の2つの追加Fabフラグメント、ここで、該追加Fabフラグメントは、（a）の重鎖のC末端またはN末端のいずれかに、どちらもペプチドリンカーを介して融合されている、
を含む二重特異性四価抗体であって、
Fabフラグメントでは以下の修飾が行われている
（i）（a）の両Fabフラグメントまたは（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（ii）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられ、
かつ
（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられるか、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（iii）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられるか、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられ、
かつ
（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（iv）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ（b）の両Fabフラグメントでは、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（v）（a）の両Fabフラグメントでは、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられ、かつ（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられる。

一態様において、Fabフラグメントでは以下の修飾が行われる:
（i）（a）の両Fabフラグメントまたは（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合し、第1VH-CH1ドメインペアを含む、第1抗体の（修飾）重鎖、ここで、該重鎖のC末端は該第1抗体の第2VH-CH1ドメインのN末端にペプチドリンカーを介して融合されている、
（b）（a）の該第1抗体の2つの軽鎖、
（c）第2抗原に特異的に結合し、第1VH-CLドメインペアを含む、第2抗体の（修飾）重鎖、ここで、該重鎖のC末端は該第2抗体の第2VH-CLドメインペアのN末端にペプチドリンカーを介して融合されている、および
（d）それぞれがCL-CH1ドメインペアを含む、（c）の該第2抗体の2つの（修飾）軽鎖、
を含む、二重特異性四価抗体である。

本明細書に記載するすべての局面において、第1軽鎖はVLドメインおよびCLドメインを含み、第1重鎖はVHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。

すべての局面の一態様において、本明細書に記載する方法において生産される抗体は、少なくとも2つの重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とする多重特異性抗体である。

一態様において、完全長抗体は
（a）ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
（b）ヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
（c）変異L234A、L235AおよびP329Gを持つヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
（d）変異S228P、L235EおよびP329Gを持つヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
（e）両重鎖に変異L234A、L235AおよびP329Gを持ち、かつ一方の重鎖に変異T366WおよびS354CまたはY349Cならびにそれぞれの他方の重鎖に変異T366S、L368A、Y407VおよびY349CまたはS354Cを持つヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
（f）両重鎖に変異S228PおよびP329Gを持ち、かつ一方の重鎖に変異T366WおよびS354Cならびにそれぞれの他方の重鎖に変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを持つヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
（g）両重鎖に変異L234A、L235A、P329G、I253A、H310AおよびH435Aを持ち、かつ一方の重鎖に変異T366WおよびS354Cならびにそれぞれの他方の重鎖に変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを持つヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、または
（h）両重鎖に変異L234A、L235A、P329G、M252Y、S254TおよびT256Eを持ち、かつ一方の重鎖に変異T366WおよびS354Cならびにそれぞれの他方の重鎖に変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを持つヒトサブクラスIgG1の完全長抗体
である。

本明細書に開示する一局面は、本明細書に開示する方法で得られる二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞である。

本明細書に開示する一局面は、本明細書に開示する多重特異性抗体を生産する方法であって、
（a）多重特異性抗体を生産/発現する本明細書に開示の細胞を培養する工程、および
（b）細胞または培養培地から多重特異性抗体を回収する工程
を含み、それによって、本明細書に記載する多重特異性抗体を生産する方法である。

本明細書に開示する一局面は、本明細書に記載する方法で生産される抗体である。

本明細書に開示する一局面は、本明細書に開示する方法で生産される抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤である。

本明細書に開示する一局面は、医薬として使用するための、本明細書に開示する方法で生産される抗体である。

本明細書に開示する一局面は、医薬の製造における、本明細書に開示する方法で生産される二重特異性抗体の使用である。

すべての局面の一態様において、二重特異性抗体は、抗Aベータ/トランスフェリン受容体抗体、抗CD20/トランスフェリン受容体抗体、抗PD1/Tim3抗体および抗FAP/DR5抗体からなる二重特異性抗体の群から選択される。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する（そして2つのFabフラグメントを構成する）、抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖、
（b）第2抗原に特異的に結合する、抗体の2つの追加Fabフラグメント、ここで、該追加Fabフラグメントのそれぞれは、（a）の重鎖の一方の個々のC末端にペプチドリンカーを介して融合されている、
を含む二重特異性四価抗体であって、
追加Fabフラグメントでは以下の修飾:
（b）の両追加Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
が行われており、
（i）第1抗原はDR5であり、かつ第2抗原はFAPであるか、（ii）第1抗原はFAPであり、かつ第2抗原はDR5であり、
第1抗原に特異的に結合する、抗体の2つの重鎖は、変異L234A、L235AおよびP329Gを持つヒトサブクラスIgG1である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む二価二重特異性抗体であって、
（i）第1抗原はPD1であり、かつ第2抗原はTim3であるか、（ii）第1抗原はTim3であり、かつ第2抗原はPD1であり、
第1重鎖および第2重鎖はどちらも、変異L234A、L235AおよびP329Gを持ち、かつ一方の重鎖に変異T366Wおよび任意でS354CまたはY349Cならびにそれぞれの他方の重鎖に変異T366S、L368A、Y407Vおよび任意でY349CまたはS354Cを持つヒトサブクラスIgG1の重鎖であって、末端グリシンまたはグリシン-リジンジペプチドは存在しなくてもよく、
第1軽鎖は定常軽鎖ドメイン（CL）の123番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに;E123R変異）および124番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに;Q124K変異）を含み（ナンバリングはKabatに従う）、
第1重鎖は第1定常重鎖ドメイン（CH1）の147番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに;K147E変異）および213番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに;K213E変異）を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する（そして2つのFabフラグメントを構成する）、抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖、
（b）第2抗原に特異的に結合する1つの追加Fabフラグメント、ここで、該追加Fabフラグメントは（a）の重鎖の一方のC末端にペプチドリンカーを介して融合されている、
を含む三価二重特異性抗体であって、
追加Fabフラグメントでは以下の修飾:
可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
が行われており、
（i）第1抗原はAベータであり、かつ第2抗原はトランスフェリン受容体であるか、（ii）第1抗原はCD20であり、かつ第2抗原はトランスフェリン受容体である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）それぞれが完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖とのペアである2つのペアを含む1つの完全長抗体、ここで、完全長重鎖と完全長軽鎖とのペアのそれぞれによって形成される結合部位は第1抗原に特異的に結合する、および
（b）1つの追加Fabフラグメント、ここで、追加Fabフラグメントは完全長抗体の一方の重鎖のC末端に融合されており、追加Fabフラグメントの結合部位は第2抗原に特異的に結合する、
を含む二重特異性抗体であって、
完全長抗体軽鎖のそれぞれは、定常軽鎖ドメイン（CL）の123番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに;E123R変異）および124番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに;Q124K変異）を含み（ナンバリングはKabatに従う）、
完全長抗体重鎖のそれぞれは、第1定常重鎖ドメイン（CH1）の147番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに;K147E変異）および213番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに;K213E変異）を含み（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
第2抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）と定常重鎖ドメイン1（CH1）とが互いによって置き換えられるようにドメイン交差を含み、
第1抗原はヒトA-ベータタンパク質であり、かつ第2抗原はヒトトランスフェリン受容体である。

すべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、
（a）それぞれが完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖とのペアである2つのペアを含む1つの完全長抗体、ここで、完全長重鎖と完全長軽鎖とのペアのそれぞれによって形成される結合部位は第1抗原に特異的に結合する、および
（b）1つの追加Fabフラグメント、ここで、追加Fabフラグメントは完全長抗体の一方の重鎖のC末端に融合されており、追加Fabフラグメントの結合部位は第2抗原に特異的に結合する、
を含む二重特異性抗体であって、
完全長抗体軽鎖のそれぞれは、定常軽鎖ドメイン（CL）の123番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに;E123R変異）および124番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに;Q124K変異）を含み（ナンバリングはKabatに従う）、
完全長抗体重鎖のそれぞれは、第1定常重鎖ドメイン（CH1）の147番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに;K147E変異）および213番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに;K213E変異）を含み（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
第2抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）と定常重鎖ドメイン1（CH1）とが互いによって置き換えられるようにドメイン交差を含み、
第1抗原はヒトCD20であり、かつ第2抗原はヒトトランスフェリン受容体である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、各ポリペプチドは、それぞれが5'から3'に向かってプロモーター、ポリペプチドをコードする構造遺伝子、ポリアデニル化配列および任意でターミネーター配列を含む発現カセット内にある。一態様において、すべての発現カセットは同じプロモーター、同じポリアデニル化部位および任意で同じターミネーター配列を含む。一態様において、プロモーターはヒトCMV（サイトメガロウイルス）プロモーターである。一態様において、CMVプロモーターはイントロンAを含む。一態様において、ポリアデニル化部位はBGH（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化部位を含む。一態様では、ターミネーターが存在し、それがHGT（ヒト成長ホルモンターミネーター）である。一態様において、プロモーターは、イントロンAを含んでもよいCMVプロモーターであり、ポリアデニル化部位はBGHポリアデニル化部位である。一態様において、プロモーターは、イントロンAを含んでもよいCMVプロモーターであり、ポリアデニル化部位はBGHポリアデニル化部位であり、ターミネーターはHGTである。

一態様において、さらなる発現ベクターは、またはさらなる発現ベクターのそれぞれは、それぞれが多重特異性抗体の異なるポリペプチド鎖をコードする少なくとも2つの核酸配列を含み、各コード核酸はそれぞれのベクターに1回だけ存在する/含有される。
[本発明1001]
少なくとも3つの異なるポリペプチドを含む多重特異性抗体を生産するための方法であって、
- 哺乳動物細胞を培養培地において培養する工程であって、該哺乳動物細胞が、
（a）哺乳動物細胞に第1発現ベクターと1種、2種または3種のさらなる発現ベクターとをトランスフェクトするステップ
によって生成され、
該第1発現ベクターが、多重特異性抗体のポリペプチドをコードする厳密に1つの核酸配列を含み、かつ該1、2または3種のさらなる発現ベクターが、多重特異性抗体の異なるポリペプチド鎖をそれぞれコードする少なくとも2つの核酸配列をそれぞれ含み、
該第1発現ベクターの厳密に1つの核酸配列が、多重特異性抗体の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列である、工程；
- 該細胞または該培養培地から多重特異性抗体を回収する工程
を含み、それによって、多重特異性抗体を生産する方法。
[本発明1002]
多重特異性抗体のポリペプチド鎖のうちの2つがドメイン交換を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第1発現ベクターの厳密に1つの核酸が、多重特異性抗体の、ドメイン交換を有する軽鎖ポリペプチドをコードする、本発明1002の方法。
[本発明1004]
ステップ（a）が、第1発現ベクターと1、2または3種のさらなる発現ベクターとを共トランスフェクトするステップである、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
哺乳動物細胞に1、2または3種のさらなる発現ベクターをトランスフェクトした後、第1発現ベクターをトランスフェクトする、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
哺乳動物細胞が多重特異性抗体を安定に発現する、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
哺乳動物細胞がCHO細胞である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ドメイン交換がCH1-CL交差またはVH-VL交差である、本発明1002～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
多重特異性抗体が、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む二価二重特異性抗体である、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
多重特異性抗体が、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む二価二重特異性抗体である、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
多重特異性抗体が
（a）第1抗原に特異的に結合する完全長抗体の第1軽鎖および第1重鎖、
（b）第1軽鎖とペアを形成した場合に第1抗原に特異的に結合する完全長抗体の第2重鎖、および
（c）（a）または（b）の重鎖のうちの一方のC末端にペプチドリンカーを介して融合された、第2抗原に特異的に結合するFabフラグメントであって、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、Fabフラグメント
を含む三価二重特異性抗体である、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1012]
生成物関連不純物が少ない/低減した多重特異性抗体調製物を生産するための、本発明1001～1011のいずれかの方法。

発明の詳細な説明
ノブズ・イントゥ・ホールズ（knobs into holes）二量体化モジュールおよび抗体工学におけるそれらの使用は、Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.:Immunotechnology,Volume 2,Number 1,February 1996,pp.73-73（1）に記載されている。

ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に与えられている。

本明細書において、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647～660頁参照）を使用し、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661～723頁参照）を使用する（この場合、本明細書では、「ナンバリングはKabat EUインデックスに従う」ということによって、これをさらに明確にする）。

本発明の実行に有用な方法および技法は、例えばAusubel, F.M.（ed.）, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I～III（1997）、Glover, N.D. and Hames, B.D. ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes IおよびII（1985）, Oxford University Press、Freshney, R.I.（ed.）, Animal Cell Culture-a practical approach, IRL Press Limited（1986）、Watson, J.D. et al, Recombinant DNA, Second Edition,CHSL Press（1992）、Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y.,VCH Publishers（1987）、Celis,J. ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press（1998）、Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R.Liss, Inc., N.Y.（1987）に記載されている。

組換えDNA技術の使用により、核酸の誘導体を生成させることが可能になる。そのような誘導体は、例えば、個々のヌクレオチド位置またはいくつかのヌクレオチド位置が、置換、改変、交換、欠失または挿入によって修飾されたものであることができる。そのような修飾および誘導体化は、例えば部位特異的変異誘発法を使って実行することができる。当業者は、そのような修飾を容易に実行することができる（例えばSambrook,J. et al, Molecular Cloning: A laboratory manual（1999）Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA、Hames, B.D. and Higgins,S.G., Nucleic acid hybridization-a practical approach（1985）IRL Press, Oxford, England参照）。

定義
「多重特異性抗体」は、同じ抗原上または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体は、完全長抗体もしくは抗体フラグメント（例えばF（ab'）₂二重特異性抗体）またはそれらの組合せ（例えば完全長抗体＋追加のscFvまたはFabフラグメント）として調製することができる。2つ、3つまたはそれ以上（例えば4つ）の機能的抗原結合部位を持つ改変抗体も報告されている（例えばUS 2002/0004587 A1参照）。

本明細書において使用する用語「正しく折りたたまれた/正しく組み立てられた」は、抗体が正しい化学量論を有すること、すなわち一致した数およびコピーの個々の/それぞれの軽鎖および重鎖を含むことを表す。例えば「ネイティブヒトIgG抗体」は、単離された分子が2つの軽鎖ポリペプチドと2つの重鎖ポリペプチドとを含む場合に、正しく折りたたまれ/正しく組み立てられている。例えば多重特異性抗体が二価であるなら、二重特異性ネイティブヒトIgG抗体は、単離された分子が、第1抗原に結合するコグネイト第1軽鎖とコグネイト第1重鎖との第1ペア、および第2抗原に結合するコグネイト第2軽鎖とコグネイト第2重鎖との第2ペアからなる場合に、すなわち4つの異なるポリペプチドからなる場合に、正しく折りたたまれ/正しく組み立てられている。正しく折りたたまれ/正しく組み立てられていない抗体、すなわち、必要な数より少ないまたは多い鎖を含むおよび/または間違って会合した鎖を含む、すなわち重鎖と軽鎖とのコグネイトペアを形成していない抗体はすべて、「生成物関連副産物」と呼ばれる。

本明細書において使用する用語「ドメイン交差」は、抗体重鎖VH-CH1フラグメントとその対応するコグネイト抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体結合アームにおいて（すなわちFabフラグメントにおいて）、少なくとも1つの重鎖ドメインがその対応軽鎖ドメインで置換され、その逆の置換もなされている点で、ドメイン配列が天然配列から逸脱していることを表す。ドメイン交差には3つの一般的タイプ、（i）VL-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVH-CLドメイン配列を持つドメイン交差重鎖フラグメント（またはVH-CL-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を持つ完全長抗体重鎖）とをもたらすCH1ドメインとCLドメインとの交差、（ii）VH-CLドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVL-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差重鎖フラグメントとをもたらすVHドメインとVLドメインとのドメイン交差、および（iii）VH-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVL-CLドメイン配列を持つドメイン交差重鎖フラグメントとをもたらす完全軽鎖（VL-CL）と完全VH-CH1重鎖フラグメントとのドメイン交差（「Fab交差」）がある（上述のドメイン配列はいずれもN末端からC末端に向かう方向に示されている）。

対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して本明細書において使用する用語「互いによって置き換えられ」るとは、上述のドメイン交差を指す。したがって、CH1ドメインとCLドメインとが「互いによって置き換えられ」ている場合、それは、項目（i）で述べたドメイン交差と、その結果生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列とを指す。したがって、VHとVLとが「互いによって置き換えられ」ている場合、それは、項目（ii）で述べたドメイン交差を指し、CH1ドメインとCLドメインが「互いによって置き換えられ」かつVH1ドメインとVLドメインとが「互いによって置き換えられ」ている場合、それは、項目（iii）で述べたドメイン交差を指す。ドメイン交差を含む二重特異性抗体は、例えばWO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254およびSchaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108（2011）11187-11192に記載されている。

本明細書に記載する方法で生産される多重特異性抗体は、本質的に、上記項目（i）で述べたCH1ドメインとCLドメインとのドメイン交差または上記項目（ii）で述べたVHドメインとVLドメインとのドメイン交差を含むFabフラグメントを含む。同じ抗原に特異的に結合するFabフラグメントは、同じドメイン配列を持つように構築される。したがって、あるドメイン交差を有するFabフラグメントが多重特異性抗体に2つ以上含まれている場合、それらのFabフラグメントは同じ抗原に特異的に結合する。

本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、さまざまな抗体構造、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、包含する。

「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）₂、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばscFv）、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁およびIgA₂に分類されうる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。

本明細書において使用する用語「Fc受容体」は、受容体に付随する細胞質ITAM配列の存在を特徴とする活性化受容体を指す（例えばRavetch,J.V.and Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19（2001）275-290参照）。そのような受容体はFcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIIAである。「FcγRの結合がない」という用語は、10μg/mlの抗体濃度で、本明細書に記載する方法において生産された抗体の、NK細胞への結合が、WO 2006/029879に記載されている抗OX40L抗体LC.001について見いだされる結合の10％以下であることを表す。

IgG4は低減したFcR結合を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。ただし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc糖質の喪失）、Pro329および234、235、236および237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435は、改変されると、やはり低減したFcR結合を与える残基である（Shields, R.L. et al. J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604、Lund, J. et al, FASEB J.9（1995）115-119、Morgan, A. et al, Immunology 86（1995）319-324およびEP 0307434）。一態様では、本明細書に記載する方法において生産される抗体が、IgG1サブクラスまたはIgG2サブクラスの抗体であって、変異PVA236、GLPSS331および/またはL234A/L235Aを含む。一態様では、本明細書に記載する方法において生産される抗体がIgG4サブクラスの抗体であって、変異L235Eを含む。一態様では、抗体が変異S228Pをさらに含む。

「Fc領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末領域を規定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Fc領域および変異型Fc領域を包含する。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226から、またはPro230から、カルボキシル末端までにわたる。ただし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書において別段の指定がある場合を除き、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）, NIH Publication 91-3242に記載の、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。

本明細書に記載する方法において生産される抗体はFc領域を含み、一態様ではヒト由来のFc領域を含む。一態様において、Fc領域は、ヒト定常領域のすべてのパーツを含む。抗体のFc領域は、補体活性化、C1q結合、C3活性化およびFc受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は一定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc領域中の所定の結合部位が引き起こす。そのような結合部位は、現在の技術水準では公知であり、例えばLukas, T.J. et al, J. Immunol. 127（1981）2555-2560、Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16（1979）907-917、Burton, D.R. et al, Nature 288（1980）338-344、Thommesen, J.E. et al, Mol. Immunol. 37（2000）995-1004、Idusogie, E.E. et al, J. Immunol. 164（2000）4178-4184、Hezareh, M. et al., J. Virol. 75（2001）12161-12168、Morgan, A. et al, Immunology 86（1995）319-324およびEP 0307434によって記載されている。そのような結合部位は、例えばL234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331およびP329である（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う;本明細書において別段の指定がある場合を除き、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed.,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）, NIH Publication 91-3242に記載の、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う）。サブクラスIgG1、IgG2およびIgG3の抗体が、通常、補体活性化、C1q結合およびC3活性化を示すのに対し、IgG4は補体系を活性化せず、C1qに結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者には周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。一態様において、Fc領域はヒトFc領域である。一態様において、Fc領域は、変異S228Pおよび/またはL235E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含むヒトIgG4サブクラスのFc領域である。一態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aを含むヒトIgG1サブクラスのFc領域である（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

「完全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では、ネイティブ抗体の構造に実質的に類似する構造を有する抗体または本明細書において定義するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、相互可換的に使用される。「完全長抗体」は、抗原に結合する可変領域と、軽鎖定常ドメイン（CL）ならびに重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3とを含む抗体である。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体でありうる。より詳しく述べると、完全長抗体は、2つの抗体軽鎖（それぞれが軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む）と2つの抗体重鎖（それぞれが重鎖可変ドメイン、ヒンジ領域ならびに重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3を含む）とを含む。C末端アミノ酸残基KまたはGKは、完全長抗体の2つの重鎖において、互いに独立して、存在しても存在しなくてもよい。

「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という用語は相互可換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。細胞には「形質転換体」および「形質転換細胞」が包含され、これらは初代形質転換細胞と、継代数を問わず、そこから派生する子孫とを包含する。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、ここに包含される。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。一定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換または逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman, S.et al., J.Chromatogr.B 848（2007）79-87を参照されたい。

本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の変異を含有する変異型抗体、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる変異型抗体などといった考えうる変異型抗体を除けば（そのような変異体の存在量は一般に少量である）、前記集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しているのであって、何か特定の方法による抗体の生産を必要とするとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン座位の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などといった、さまざまな技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法は、本明細書において説明する。

「ネイティブ抗体」とは、さまざまな構造を持つ天然の免疫グロブリン分子を指す。例えばネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合された2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体型糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう可変領域（VH）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2およびCH3）とを有し、第1定常ドメインと第2定常ドメインとの間にヒンジ領域が位置する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう可変領域（VL）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てることができる。「ネイティブ様」抗体は「ネイティブ抗体」と同じ構造を有するが、結合特異性が異なっている。

本明細書において使用する用語「ベクター」は、それが連結されたもう一つの核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも包含する。一定のベクターは、それらが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」という。

「発現カセット」という用語は、少なくとも含まれている核酸を細胞中で発現させるために必要な調節要素、例えばプロモーターおよびポリアデニル化部位を含有しているコンストラクトを表す。

「発現ベクター」という用語は、含まれる構造遺伝子を細胞中で発現させるために必要な要素をすべて提供する核酸を表す。典型的には、発現ベクターは、複製起点を含む原核生物プラスミド増殖単位、例えば大腸菌（E.coli）用のもの、および選択マーカー、真核生物選択マーカー、ならびにそれぞれがプロモーター核酸、構造遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む関心対象の構造遺伝子を発現させるための1つまたは複数の発現カセットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーター核酸の制御下に置かれ、そのような構造遺伝子を、プロモーター核酸に「機能的に連結され」ているという。同様に、調節要素とコアプロモーター核酸は、調節要素がコアプロモーター核酸の活性を調整するのであれば、機能的に連結されている。

「機能的に連結される」という用語は、2つ以上の構成要素の並置であって、そのように記載された構成要素がそれらの意図どおりに機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えばプロモーターおよび/またはエンハンサーは、それがシスに作用することで、連結された配列の転写を制御または調整するのであれば、コード配列に機能的に連結されている。必ずというわけではないが、一般的には、「機能的に連結された」DNA配列は連続しており、分泌リーダーとポリペプチドなどといった2つのタンパク質コード配列を接合する必要がある場合には、連続していて、しかも（読み）枠が合っている。ただし、機能的に連結されたプロモーターは、一般的にはコード配列の上流にあるものの、必ずしもそれと連続しているわけではない。エンハンサーは連続している必要がない。エンハンサーは、エンハンサーがコード配列の転写を増加させるのであれば、コード配列と機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、コード配列内またはコード配列の下流に位置することができ、プロモーターからかなりの距離に位置することができる。ポリアデニル化部位は、それがコード配列の下流端に位置して、転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列へと進行するようになっているのであれば、コード配列に機能的に連結されている。翻訳停止コドンは、それがコード配列の下流端（3'端）に位置して、翻訳がコード配列を通って停止コドンまで進行し、そこで停止するようになっているのであれば、エクソンの核酸配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えばPCR法を使って、かつ/または好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。好都合な制限部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。

「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接合されたアミノ酸からなるポリマーを表し、天然の産物であるか、合成的に生産されたものかは問わない。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」ということができ、一方、2つ以上のポリペプチドからなる分子または100アミノ酸残基を上回る1つのポリペプチドを含む分子は「タンパク質」ということができる。ポリペプチドは、糖質基、金属イオンまたはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸構成要素も含みうる。非アミノ酸構成要素は、ポリペプチドが発現する細胞によって付加される場合があり、細胞のタイプによって変動しうる。ポリペプチドは、本明細書では、それらのアミノ酸主鎖構造またはそれをコードする核酸によって規定される。糖質基などの付加物は一般的には明示されないが、それでもなお存在しうる。

「生産する」という用語は、発現カセットに挿入された構造遺伝子の、細胞における発現を表す。この用語は核酸の転写および翻訳のプロセスを包含する。生産は、適当な原核細胞または真核細胞で行われ、発現された、すなわち生産されたポリペプチドは、溶解後の細胞からまたは培養上清から回収することができる。

「プロモーター核酸」という用語は、それが機能的に連結されている遺伝子/構造遺伝子または核酸配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を表す。プロモーター核酸は、RNAポリメラーゼの結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーター核酸は、選択された構造遺伝子の発現が企図される細胞において機能的であるだろう。当技術分野では、多種多様な供給源からの構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび抑制可能なプロモーターなど、多数のプロモーター核酸が周知であり（そしてGenBankなどのデータベースにおいて確認され）、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはその中に入っている状態で、（例えばATCCなどの受託機関および他の商業的または個人的供給源から）入手することができる。

通例、プロモーター核酸は、遺伝子の5'非コード領域、すなわち非翻訳領域中に、構造遺伝子の転写開始部位に近接して位置する。転写の開始において機能するプロモーター核酸内の配列要素は、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とすることが多い。これらの要素として、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素（differentiation-specific element）（DSE）、サイクリックAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE）、グルココルチコイド応答要素（GRE）、ならびにCRE/ATF、AP2、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB）およびオクタマー因子などといった他の転写因子のための結合部位が挙げられる。プロモーター核酸が、CMVプロモーター核酸とそれに続く2つのtetオペレーター部位、メタロチオネインプロモーター核酸および熱ショックプロモーター核酸など、誘導性プロモーター核酸であるなら、転写の速度は誘導性作用因子に応答して増加する。プロモーター核酸が構成的に活性なプロモーター核酸である場合、転写の速度は誘導性作用因子によって調節されない。発現のための強いプロモーター核酸であると同定されている真核プロモーター核酸には、SV40初期プロモーター核酸、アデノウイルス主要後期プロモーター核酸、マウスメタロチオネインIプロモーター核酸、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1アルファ（CHEF-1）、ヒトEF-1アルファ、ユビキチンおよびヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター核酸（hCMV MIE）がある。

「選択マーカー」という用語は、それを保持する細胞を、対応する選択剤の存在下（選択的培養条件下での培養）で、正または負に特異的に選択することを可能にする核酸を表す。通例、選択マーカーは、それが導入される細胞において、薬剤に対する耐性を付与するか、代謝的または異化的欠陥を補うことになる。選択マーカーは正、負または二機能性であることができる。有用な正の選択マーカーは、それで形質転換された細胞を、対応する選択剤、例えば抗生物質の存在下で選択することを可能にする、抗生物質耐性遺伝子である。非形質転換細胞は、選択条件下で、すなわち選択剤の存在下で、成長または生残することができない。負の選択マーカーでは、そのマーカーを保持する細胞を選択的に排除することが可能になる。真核細胞と共に使用される選択マーカーとしては、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）をコードする構造遺伝子、例えばハイグロマイシン（hyg）、ネオマイシン（neo）およびG418選択マーカーなど、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、チミジンキナーゼ（tk）、グルタミンシンテターゼ（GS）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（選択作用物質インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（選択作用物質ヒスチジノールD）、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシンおよびミコフェノール酸に対する耐性を付与する核酸が挙げられる。

方法
本発明は、少なくとも部分的には、ヘテロ二量体型抗体生産のための細胞株を生成させるには、トランスフェクションにおいて、ただ一つの（抗体）ポリペプチドコード核酸として軽鎖ポリペプチドコード核酸を含む発現ベクターを使用すること、すなわちベクターはただ一つの抗体ポリペプチド発現カセットとして軽鎖発現カセットを含むことが有利であるという発見に基づく。このベクターは、共トランスフェクションにおいて、さらなる発現ベクターと一緒に使用されるか、第2の後続トランスフェクション工程において単独で使用される。このアプローチにより、改良された生成物プロファイルで、すなわち生成物の増加と生成物関連不純物の低減とを伴って、ヘテロ二量体型抗体を生産する、生産細胞株を得ることができる。

多重特異性抗体を設計するためのアプローチの一つは「CrossMab技術」として公知である。このアプローチは、重鎖と軽鎖の間のドメイン交差により、特異性が異なる重鎖と軽鎖について、異なるドメイン配置を作り出すことに基づいている（例えばドメイン交差を有する二価二重特異性IgG抗体に関するWO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、Schaefer, W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）11187-11192を参照されたい;WO 2010/145792およびWO 2010/145792はドメイン交差を有する四価抗原結合タンパク質に関する）。

WO 2009/080252に記載されている、軽鎖のミスペアリングを防止するために1つの結合部位にVH/VLの置き換え/交換を有する多重特異性抗体（CrossMabVH-VL）（Schaefer,W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191も参照されたい）は、第1抗原に対する軽鎖と第2抗原に対する間違った重鎖とのミスマッチが引き起こす副生成物を（そのようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較して）明らかに低減させる。しかしそれらの調製物は副産物を全く含まないわけではない。主要副産物は間違った軽鎖とドメイン交換された重鎖とのベンス・ジョーンズ型相互作用に基づく（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191のSupplementの図S1Iも参照されたい）。

WO 2015/101588 A1は血液脳関門シャトルモジュールに関する。WO 2015/101588 A1は、CH1/CL境界面に変異を持つ結合アームの1つにVH/VLドメイン交差を有する二価二重特異性抗体に言及している。WO 2015/101588 A1は該変異の技術的効果には言及していない。

四鎖ホモ二量体型二価抗体、すなわちネイティブ様抗体を生産するための細胞株を生成させる方法は、種々知られている。そのような細胞株の生産性を増加させるために、これらの方法の一部は、いわゆる「スーパートランスフェクション」アプローチに依拠する。そこでは、中間体細胞株の選択を伴って、細胞に少なくとも2回のトランスフェクションが行われる。スーパートランスフェクションアプローチにおいて使用されるベクターは、それぞれ通常は、発現させようとする抗体に関する全コード情報、すなわち軽鎖のコード情報および重鎖のコード情報を含む。いくつかの特別なスーパートランスフェクション法では、ゲノムの公知の生産領域への近隣組込み（close-by integration）を達成するために、極めて類似しているベクター、または選択マーカーだけが異なる同一のベクターが使用される。DHFRを用いる遺伝子増幅法のように、スーパートランスフェクション法も、細胞中の機能的発現カセットの数を増加させることによって、発現収率を増加させることを目指している。

ヘテロ二量体型Fc領域といわゆるドメイン交換は、どちらも鎖のミスペアリングを制限し、さらには排除することによって、正しく折りたたまれ組み立てられた多重特異性抗体の取得収率を増加させるために導入されるが、それらをどちらも含む複雑な新規三価二重特異性抗体フォーマットのために、それぞれが単一の発現カセットを含む3～4種のベクターを異なるベクター比で共トランスフェクトする複雑な手順が報告されている（例えばWO 2013/026833参照）。

本発明は、少なくとも部分的には、組換え細胞の多重特異性抗体の発現収率が、その細胞に、該多重特異性抗体の軽鎖を発現させるための発現カセットを再トランスフェクトすると、改良されうるという発見に基づく。これは、多重特異性抗体が、ドメイン交差を有する変異体重鎖および軽鎖を含む場合には、とりわけ有用である。

本明細書に開示する一局面は、以下の工程を含む、（ドメイン交差を有するポリペプチドを少なくとも1つは含む）多重特異性抗体を生産するための方法である:
（a）前記抗体を発現する哺乳動物細胞を用意する工程、
（b）（a）の哺乳動物細胞に、ドメイン交差を有する前記抗体のポリペプチドをコードする発現カセットを含む発現ベクターをトランスフェクトする工程、
（c）（b）の細胞を培養し、細胞または細胞培地から抗体を回収することによって、多重特異性抗体を生産する工程。

本明細書に記載する方法で得られる修飾細胞は、正しく折りたたまれ組み立てられた形態の多重特異性抗体をより多く「分泌」し、本明細書では、これを、細胞外の培地に放出される正しく折りたたまれ正しく組み立てられた多重特異性抗体の量が親細胞と比較して増加している細胞と定義する。イムノブロット分析、生物学的活性アッセイおよび物理化学的分離方法を使って、修飾細胞と親細胞とによって放出される正しく折りたたまれ組み立てられた多重特異性抗体の絶対量を定量しうる。

本明細書に開示する一局面は、以下の工程を含む多重特異性抗体の生産方法である:
（a）修飾細胞を多重特異性抗体の生産に適した/資する条件下で培養する工程であって、
（i）該修飾細胞が、多重特異性抗体をコードする第1DNA配列を含む親細胞と、親細胞のゲノムの第1DNA配列内ではない座位への核酸の導入によって関係づけられ、
（ii）該修飾細胞が、両細胞を同じ条件下で培養した場合に、親細胞よりも多くの多重特異性抗体を生産する、工程；ならびに
（b）ポリペプチドを回収する工程。

ドメイン交差を有する抗体フォーマット
本明細書に記載する方法は、別々にコードされた重鎖および軽鎖を含む任意の多重特異性抗体の生産に、一般に適している。

一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

（a）の抗体は（b）に記載する修飾を含有せず、（a）の重鎖および軽鎖は孤立した鎖である。

（b）の抗体において、
軽鎖内では、
可変軽鎖ドメインVLが該抗体の可変重鎖ドメインVHで置き換えられており、
かつ
重鎖内では、
可変重鎖ドメインVHが該抗体の可変軽鎖ドメインVLで置き換えられている。

一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられており、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

（a）の抗体は（b）に記載する修飾を含有せず、（a）の重鎖および軽鎖は孤立した鎖である。

（b）の抗体において、
軽鎖内では、
可変軽鎖ドメインVLが該抗体の可変重鎖ドメインVHで置き換えられ、定常軽鎖ドメインCLが該抗体の定常重鎖ドメインCH1で置き換えられており、
かつ
重鎖内では、
可変重鎖ドメインVHが該抗体の可変軽鎖ドメインVLで置き換えられ、定常重鎖ドメインCH1が該抗体の定常軽鎖ドメインCLで置き換えられている。

一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する抗体の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖および第2重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。

（a）の抗体は（b）に記載する修飾を含有せず、（a）の重鎖および軽鎖は孤立した鎖である。

（b）の抗体において、
軽鎖内では、
定常軽鎖ドメインCLが該抗体の定常重鎖ドメインCH1で置き換えられており、
かつ重鎖内では、
定常重鎖ドメインCH1が該抗体の定常軽鎖ドメインCLで置き換えられている。

一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する完全長抗体の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する完全長抗体の第2（修飾）軽鎖および第2（修飾）重鎖であって、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられており、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられている、第2（修飾）軽鎖および第2（修飾）重鎖
を含み、
（c）1つまたは2つのさらなる抗原（すなわち第3および/または第4抗原）に特異的に結合する1～4つの抗原結合ペプチドが、（a）および/または（b）の軽鎖または重鎖のC末端またはN末端にペプチドリンカーを介して融合している、
三重特異性または四重特異性抗体である。

（a）の抗体は（b）に記載する修飾を含有せず、（a）の重鎖および軽鎖は孤立した鎖である。

一態様において、三重特異性または四重特異性抗体は、c）の下で、1つまたは2つのさらなる抗原に特異的に結合する1つまたは2つの抗原結合ペプチドを含む。

一態様において、抗原結合ペプチドは、scFvフラグメントおよびscFabフラグメントの群から選択される。

一態様において、抗原結合ペプチドはscFvフラグメントである。

一態様において、抗原結合ペプチドはscFabフラグメントである。

一態様において、抗原結合ペプチドは（a）および/または（b）の重鎖のC末端に融合されている。

一態様において、三重特異性または四重特異性抗体は、（c）の下で、1つのさらなる抗原を特異的に結合する1つまたは2つの抗原結合ペプチドを含む。

一態様において、三重特異性または四重特異性抗体は、（c）の下で、第3抗原に特異的に結合する2つの同一抗原結合ペプチドを含む。好ましい一態様において、そのような2つの同一抗原結合ペプチドは、（a）および（b）の重鎖のC末端に、どちらも同じペプチドリンカーを介して融合されている。好ましい一態様において、前記2つの同一抗原結合ペプチドはscFvフラグメントまたはscFabフラグメントのいずれかである。

一態様において、三重特異性または四重特異性抗体は、（c）の下で、第3抗原および第4抗原に特異的に結合する2つの抗原結合ペプチドを含む。一態様において、該2つの抗原結合ペプチドは、（a）および（b）の重鎖のC末端に、どちらも同じペプチドコネクターを介して融合されている。好ましい一態様において、該2つの抗原結合ペプチドはscFvフラグメントまたはscFabフラグメントのいずれかである。

一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合する（そして2つのFabフラグメントを構成する）、抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖、
（b）第2抗原に特異的に結合する、抗体の2つの追加Fabフラグメント、ここで、該追加Fabフラグメントは、（a）の重鎖のC末端またはN末端のいずれかに、どちらもペプチドリンカーを介して融合されている、
を含む二重特異性四価抗体であって、
Fabフラグメントでは以下の修飾が行われている
（i）（a）の両Fabフラグメントまたは（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（ii）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられ、
かつ
（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられるか、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（iii）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられるか、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられ、
かつ
（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（iv）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、かつ（b）の両Fabフラグメントでは、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる、
または
（v）（a）の両Fabフラグメントでは、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられ、かつ（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられる。

一態様において、該追加Fabフラグメントは、（a）の重鎖のC末端または（a）の重鎖のN末端のいずれかに、どちらもペプチドリンカーを介して融合されている。

一態様において、該追加Fabフラグメントは（a）の重鎖のC末端にどちらもペプチドリンカーを介して融合されている。

一態様において、該追加Fabフラグメントは、（a）の重鎖のN末端にどちらもペプチドコネクターを介して融合されている。

一態様において、Fabフラグメントでは以下の修飾が行われる:
（i）（a）の両Fabフラグメントまたは（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる。

一態様において、Fabフラグメントでは以下の修飾が行われる:
（i）（a）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる。

一態様において、Fabフラグメントでは以下の修飾が行われる:
（i）（a）の両Fabフラグメントでは、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる。

一態様において、Fabフラグメントでは以下の修飾が行われる:
（i）（b）の両Fabフラグメントでは、可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる。

一態様において、Fabフラグメントでは以下の修飾が行われる:
（i）（b）の両Fabフラグメントでは、定常ドメインCLおよびCH1が互いによって置き換えられる。

一態様において、多重特異性抗体は、
（a）第1抗原に特異的に結合し、第1VH-CH1ドメインペアを含む、第1抗体の（修飾）重鎖、ここで、該重鎖のC末端には該第1抗体の第2VH-CH1ドメインのN末端がペプチドリンカーを介して融合されている、
（b）（a）の第1抗体の2つの軽鎖、
（c）第2抗原に特異的に結合し、第1VH-CLドメインペアを含む、第2抗体の（修飾）重鎖、ここで、該重鎖のC末端には該第2抗体の第2VH-CLドメインペアのN末端がペプチドリンカーを介して融合されている、および
（d）それぞれがCL-CH1ドメインペアを含む、c）の該第2抗体の2つの（修飾）軽鎖
を含む、二重特異性四価抗体である。

一態様において、多重特異性抗体は
（a）第1抗原に特異的に結合する第1完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
（b）第2抗原に特異的に結合する第2完全長抗体の重鎖および軽鎖、ここで、重鎖のN末端は軽鎖のC末端にペプチドリンカーを介して接続されている、
を含む、二重特異性抗体である。

（a）の抗体は（b）に記載する修飾を含有せず、重鎖および軽鎖は孤立した鎖である。

本明細書に記載するすべての局面において、第1軽鎖はVLドメインおよびCLドメインを含み、第1重鎖はVHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。

一態様において、本明細書に記載する方法において生産される抗体は、少なくとも2つの重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とする多重特異性抗体である。

ヘテロ二量体化をサポートすることを目的とするCH3修飾のためのいくつかのアプローチは、例えばWO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。通例、当技術分野において公知のアプローチでは、1つの改変CH3ドメインを含む重鎖が同じ構造のもう一つの重鎖とはもはやホモ二量体化できない（例えば、CH3改変第1重鎖はもう一つのCH3改変第1重鎖とはもはやホモ二量体化できず、CH3改変第2重鎖はもう一つのCH3改変第2重鎖とはもはやホモ二量体化できない）ように、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインをどちらも相補的に改変する。これにより、1つの改変CH3ドメインを含む重鎖は、相補的に改変されたCH3ドメインを含むもう一つの重鎖とのヘテロ二量体化を強いられる。本発明のこの態様のために、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインは、第1重鎖と第2重鎖とがヘテロ二量体化を強いられ、一方、第1重鎖および第2重鎖は（例えば立体的理由で）もはやホモ二量体化することができないように、アミノ酸置換によって相補的に改変される。

上で言及し上に含めた、重鎖ヘテロ二量体化をサポートするための当技術分野において公知のさまざまなアプローチは、第1抗原に特異的に結合する第1抗体由来の「非交差型Fab領域」と第2抗原に特異的に結合する第2抗体由来の「交差型Fab領域」とを本発明に関して上述した特定アミノ酸置換と組み合わせて含む本発明の多重特異性抗体において使用される、さまざまな代替的選択肢であると考えられる。

本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体のCH3ドメインは、例えばWO 96/027011、Ridgway, J.B. et al, Protein Eng. 9（1996）617-621およびMerchant, A.M. et al, Nat. Biotechnol. 16（1998）677-681にいくつか例を挙げて詳述されている「ノブ・イントゥ・ホールズ（knob-into-holes）」技術によって、改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面が、これら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化が増加するように、改変される。（2つの重鎖の）2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、その場合、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant, A.M. et al, Nature Biotech. 16（1998）677-681、Atwell, S. et al, J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、収量を増加させる。

好ましい一態様において、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、「ノブズ鎖（knobs chain）」のCH3ドメイン中にT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。例えば「ノブズ鎖」のCH3ドメインにY349C変異を導入し、「ホール鎖」のCH3ドメインにE356C変異またはS354C変異を導入することなどによって、CH3ドメイン間に追加の鎖間ジスルフィド架橋を使用することもできる（Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681）。したがって、別の好ましい一態様において、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349CおよびT366W変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にE356C、T366S、L368AおよびY407V変異を含むか、または本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349CおよびT366W変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含む（一方のCH3ドメイン中の追加Y349C変異と他方のCH3ドメイン中の追加E356CまたはS354C変異とが鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。

ただし、上記に代えてまたは上記に加えて、EP 1870459A1に記載されている他のノブズ-イン-ホールズ（knobs-in-holes）技術を使用することもできる。一態様において、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。

一態様において、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、「ノブズ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S、L368AおよびY407V変異を含み、さらに「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。

一態様において、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349CおよびT366W変異を、また2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含むか、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349CおよびT366W変異を、また2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含み、加えて「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。

「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）技術」とは別に、多重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを修飾してヘテロ二量体化を強制するための他の方法も、当技術分野では公知である。これらの技術、とりわけWO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO2012/058768、WO 2013/157954およびWO 2013/096291に記載されているものは、ここでは、本明細書に記載する方法において生産される多重特異性抗体との組合せで、「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替的選択肢として考えられる。

本明細書に記載するすべての局面および態様の一態様において、多重特異性抗体は二重特異性抗体または三重特異性抗体である。本発明の好ましい一態様において、多重特異性抗体は二重特異性抗体である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、抗体は二価または三価抗体である。一態様において、抗体は二価抗体である。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、多重特異性抗体は、IgGタイプ抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1の多重特異性抗体または変異L234AおよびL235Aを持つヒトサブクラスIgG1の多重特異性抗体であることを特徴とする。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG2の多重特異性抗体であることを特徴とする。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG3の多重特異性抗体であることを特徴とする。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG4の多重特異性抗体または追加変異S228Pを持つヒトサブクラスIgG4の多重特異性抗体であることを特徴とする。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1またはヒトサブクラスIgG4の多重特異性抗体であることを特徴とする。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異L234AおよびL235Aを持つヒトサブクラスIgG1の多重特異性抗体であることを特徴とする（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異L234A、L235AおよびP329Gを持つヒトサブクラスIgG1の多重特異性抗体であることを特徴とする（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異S228PおよびL235Eを持つヒトサブクラスIgG4の多重特異性抗体であることを特徴とする（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本明細書に記載するすべての局面のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異S228P、L235EおよびP329Gを持つヒトサブクラスIgG4の多重特異性抗体であることを特徴とする（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。

本明細書に記載するすべての局面の一態様において、本明細書に明示するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む。本明細書に記載するすべての局面の一態様において、本明細書に明示するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む。

二重特異性三価抗ヒトA-ベータ/ヒトトランスフェリン受容体抗体
この抗体は、完全長コア抗体と、一定のドメインが交差的に交換されている融合されたFabフラグメントとからなる、二重特異性抗体である。したがって、結果として生じる二重特異性抗体は非対称である。そこで、ノブズ-イントゥ-ホールズと呼ばれるヘテロ二量体化技術を使用し、いわゆるノブ変異を持つ第1重鎖（HCノブ）といわゆるホール変異を持つ第2重鎖（HCホール）とを使って、この二重特異性抗体を生産する。

この実施例では共トランスフェクションを使用した。

抗体0012、抗体0015、抗体0020および抗体0024はWO 2017/055540 A1に記載されている（それぞれWO 2017/055540 A1のSEQ ID NO:06～09、SEQ ID NO:01～03およびSEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11～13およびSEQ ID NO:14～17）。

抗体0012は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはFabのVLがリンカーを介して融合されており、そのFabではVHドメインとVLドメインとが交換されている（VH-VLドメイン交差）。ドメイン交差を伴わない完全長抗体のFabはどちらも、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

抗体0015は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはFabのVHがリンカーを介して融合されており、そのFabではCH1ドメインとCLドメインとが交換されている（CH-CLドメイン交差）。ドメイン交差を伴わない完全長抗体のFabはどちらも、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

抗体0020は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖を含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端には単鎖FabのVLがリンカーを介して融合されている（ドメイン交差なし）。ドメイン交差を伴わないFabはどちらも、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

抗体0024は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはFabのVHがリンカーを介して融合されており、そのFabではCH1ドメインとCLドメインとが交換されている（CH-CLドメイン交差）。

二重特異性抗体の組換え生産には、異なる発現ベクターへの各ポリペプチドの異なる割り当て/組合せを使用し、結果として生じるベクターを異なる比で使用し、異なるトランスフェクション順序を使用した。

LC＋HCホール:ホール変異を持つ重鎖および軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC交差＋HCノブ:ノブ変異を持つ重鎖およびドメイン交差を有する軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC:軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC交差:ドメイン交差を有する軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

HCノブ:ノブ変異を持つ重鎖および融合されたscFabのための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

CHO-K1細胞における結果を以下の表に提示する。

二重特異性抗体をCHO-S細胞において小規模生産し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いる第1精製工程後および分取用サイズ排除クロマトグラフィーを用いる第2精製工程後に、副生成物分布を分析した。結果を以下の表に提示する。

このアプローチにより、改良された生成物プロファイルで、すなわち生成物の増加と生成物関連不純物の低減とを伴って、ヘテロ二量体型抗体を生産する、生産細胞株を得ることができる。

安定生産細胞株の生成には、軽鎖のためのただ一つの抗体鎖発現カセットを含む発現プラスミドによる共トランスフェクションを使用した。

CHO-K1細胞に、1（LC）:1（LC＋HCホール）:3（LC交差＋HCノブ）のプラスミド比で、トランスフェクトした。外来DNAをゲノムに安定に組み込んでいる細胞をメトトレキサートで選択した。安定細胞株を単離し、生成物の品質について4日間のバッチ培養で評価した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使って生成物を単離し、CE-SDSで分析した。

二重特異性三価抗ヒトCD20/ヒトトランスフェリン受容体抗体
この抗体は、完全長コア抗体と、一定のドメインが交差的に交換されている融合されたFabフラグメントとからなる、二重特異性抗体である。したがって、結果として生じる二重特異性抗体は非対称である。そこで、ノブズ-イントゥ-ホールズと呼ばれるヘテロ二量体化技術を使用し、いわゆるノブ変異を持つ第1重鎖（HCノブ）といわゆるホール変異を持つ第2重鎖（HCホール）とを使って、この二重特異性抗体を生産する。

この実施例では共トランスフェクションを使用した。

抗体0039、抗体0041、抗体0040および抗体0042はWO 2017/055542 A1に記載されている（それぞれWO 2017/055542 A1のSEQ ID NO:06～09、SEQ ID NO:01～03およびSEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11～13およびSEQ ID NO:22、ならびにSEQ ID NO:14～17）。

抗体0038は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖を含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはscFabのVLがリンカーを介して融合されている。通常のFabアームはどちらも正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

抗体0039は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはFabのVLがリンカーを介して融合されており、そのFabではVHドメインとVLドメインとが交換されている（VH-VLドメイン交差）。元のままのドメインを持つFabはどちらも、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

抗体0041は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはFabのVHがリンカーを介して融合されており、そのFabではCH1ドメインとCLドメインとが交換されている（CH-CLドメイン交差）。完全長抗体の重鎖と軽鎖のペアはどちらも、Fabと同様に、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。元のままのドメインを持つFabはどちらも、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

抗体0040は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖のC末端にはFabのVHがリンカーを介して融合されており、そのFabではCH1ドメインとCLドメインとが交換されている（CH-CLドメイン交差）。

抗体0042は、ホール変異を持つ1つの重鎖とノブ変異を持つ1つの重鎖とを含む完全長抗体であって、ノブ変異を持つ重鎖にはFabのCH1がリンカーを介してN末端に融合されており、融合された重鎖のFabでは、VHドメインとVLドメインとが交換されている（VH-VLドメイン交差）。元のままのドメインを持つFabはどちらも、正しい組み立てを助けるために電荷を含むように修飾されている。

二重特異性抗体の組換え生産には、異なる発現ベクターへの各ポリペプチドの異なる割り当て/組合せを使用し、結果として生じるベクターを異なる比で使用し、異なるトランスフェクション順序を使用した。

LC＋HCホール:ホール変異を持つ重鎖および軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC交差＋HCノブ:ノブ変異を持つ重鎖およびドメイン交差を有する軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC:軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC交差:ドメイン交差を有する軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

HCノブ:ノブ変異を持つ重鎖および融合されたscFabのための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

HEK細胞における二重特異性抗体の組換え生産には、異なる発現ベクターへの各ポリペプチドの異なる割り当て/組合せを使用し、結果として生じるベクターを異なる比で使用した。結果を以下の表に提示する。

CHO-K1細胞における二重特異性抗体の組換え生産には、異なる発現ベクターへの各ポリペプチドの異なる割り当て/組合せを使用し、結果として生じるベクターを異なる比で使用した。結果を以下の表に提示する。

二重特異性抗体をCHO-S細胞において小規模生産し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いる第1精製工程後および分取用サイズ排除クロマトグラフィーを用いる第2精製工程後に、副生成物分布を分析した。結果を以下の表に提示する。

二重特異性抗体を異なる細胞株で生産した。結果を以下の表に提示する。

このアプローチにより、改良された生成物プロファイルで、すなわち生成物の増加と生成物関連不純物の低減とを伴って、ヘテロ二量体型抗体を生産する、生産細胞株を得ることができる。

二重特異性二価抗ヒトPD1/ヒトTim3抗体
この抗体は、Fc領域中にノブ・イントゥ・ホール変異を持ち、CH3ドメイン間に人工的ジスルフィド架橋を持つ完全長抗体からなる二重特異性抗体であって、PD1に対する結合部位を形成している重鎖と軽鎖のペアでは、VHドメインとVLドメインが互いによって置き換えられている。したがって、結果として生じる二重特異性抗体は非対称である。そこで、ノブズ-イントゥ-ホールズと呼ばれるヘテロ二量体化技術を使用し、いわゆるノブ変異を持つ第1重鎖（HCノブ）といわゆるホール変異を持つ第2重鎖（HCホール）とを使って、これらの二重特異性抗体を生産する。配列についてはWO 2017/055404 A1を参照されたい。

この実施例では共トランスフェクションを使用した。

ここでは、上記の抗体を発現する細胞株を生成させるために、異なる型の発現プラスミドをいくつか組み合わせた。これらのアプローチは、プラスミドの組合せこそ相違するが、抗体は相違しない。

0516トランスフェクションの場合は、第1軽鎖（LC-1）およびホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）のための発現カセットを含むベクター1と、ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）およびノブ変異を持つドメイン交換されたIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）のための発現カセットを含むベクター2とを、1:1の比で共トランスフェクトした。

0517トランスフェクションの場合は、第1軽鎖（LC-1）およびホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）のための発現カセットを含むベクター1、ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）およびノブ変異を持つドメイン交換されたIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）のための発現カセットを含むベクター2、およびドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）のための発現カセットを含むベクター3を、1:1:1の比で共トランスフェクトした。

0518トランスフェクションの場合は、ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）およびホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）のための発現カセットを含むベクター1と、第1軽鎖（LC-1）およびノブ変異を持つドメイン交換されたIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）のための発現カセットを含むベクター2を、1:1の比で共トランスフェクトした。

0519トランスフェクションの場合は、ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）およびホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）のための発現カセットを含むベクター1、第1軽鎖（LC-1）およびノブ変異を持つドメイン交換されたIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）のための発現カセットを含むベクター2、およびドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）のための発現カセットを含むベクター3を、1:1:1の比で共トランスフェクトした。結果を以下の表に提示する。

正しく組み立てられた抗体は、A＝ノブ変異を持つIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）、B＝ホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）、C＝ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）およびD＝第1軽鎖（LC-1）として、ABCDという化学量論を有する。

形成される主要化合物関連副産物は間違って組み立てられた抗体であった。2つの主要副生成物はどちらも4鎖抗体であった。1つ目は、交差軽鎖が非交差型軽鎖で置き換わっているヘテロ-ホール-ノブ-HC二量体（ABD2）であった。2つ目は、ホモ-ホール-ホールハーフ抗体二量体（B2D2）であった。

唯一の発現カセットとしてドメイン交換された軽鎖のための発現カセットを含む追加プラスミドを使用するトランスフェクションでは、改良された結果、すなわち生成物関連副産物の存在量が少ないという結果が得られることがわかる（図1A～1D参照）。

図1からわかるように、生成物関連副産物、とりわけABD2副産物を低減させることができる。これは同時に、後続の精製工程中の生成物損失を低減させる。例えば、必要な精製工程数を低減することができるか、ピークの重なりと分画ゆえの生成物の損失を低減することができるか（ピークは分離度が増すので、切り取る際の生成物損失を低減することができる）、またはその両方である。これにより、得られうる収量を増加させることができる。

このアプローチにより、改良された生成物プロファイルで、すなわち生成物の増加と生成物関連不純物の低減とを伴って、ヘテロ二量体型抗体を生産する、生産細胞株を得ることができる。

二重特異性四価抗ヒトFAP/DR5抗体
FAP結合ドメインをDR5 IgG重鎖にC末端で（G4S）4リンカーを介して融合することによって、二重特異性FAP-DR5抗体を生成させた。DR5部分は、ドロジツマブ（US 2007/003141401参照）またはファージディスプレイによって生成させた新規DR5抗体の可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）からなった。軽鎖ミスペアリング副産物を最小限に抑えるために、ドメイン交差によるCrossMab技術を使用した。FAP結合ユニットを、VHが定常軽鎖（CL）ドメインに融合され、VLがCH1（定常重鎖1）ドメインに融合されている交差型Fabとして改変した。配列についてはWO 2016/055432を参照されたい。

この実施例では逐次的トランスフェクションを使用した。

各ポリペプチド発現カセットを異なる発現ベクターに分配した。

LC＋HCホール:ホール変異を持つ重鎖および軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC交差＋HCノブ:ノブ変異を持つ重鎖およびドメイン交差を有する軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC:軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

LC交差:ドメイン交差を有する軽鎖のための1つの発現カセットを含む発現ベクター。

二重特異性抗体（重鎖の各C末端に1つのCH1/CL交差Fabが取り付けられている完全長抗体）を発現させるための発現カセットをそれぞれが2つずつ含む標準的な2プラスミドトランスフェクションによって、クローン131を得た。

このクローンは以下の組成物を生産した。

このクローンを、FAP結合部位の交差軽鎖だけを含むプラスミドによる第2トランスフェクションのための基礎クローンとして使用した。

結果として生じたいくつかの例示的クローンの特徴を以下の表に示す。

CE-SDSの結果を以下の表（231＝5/6抗体;242＝単量体）および図2に提示する。

このアプローチにより、改良された生成物プロファイルで、すなわち生成物の増加と生成物関連不純物の低減とを伴って、ヘテロ二量体型抗体を生産する、生産細胞株を得ることができる。

抗体を生産するための一般的組換え法および組成物
抗体は、例えばUS 4,816,567に記載されている組換え法および組成物を使って生産しうる。これらの方法では、抗体をコードする1つまたは複数の単離された核酸が用意される。

ネイティブ抗体またはネイティブ抗体フラグメントの場合、2つの核酸、すなわち軽鎖またはそのフラグメント用に1つと、重鎖またはそのフラグメント用に1つとが必要である。そのような核酸は抗体のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体のVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードする。これらの核酸は同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上に存在することができる。

ヘテロ二量体型重鎖を持つ二重特異性抗体の場合、4つの核酸、すなわち第1軽鎖用に1つ、第1ヘテロ単量体Fc領域ポリペプチドを含む第1重鎖用に1つ、第2軽鎖用に1つ、および第2ヘテロ単量体Fc領域ポリペプチドを含む第2重鎖用に1つが必要になる。例えば、ヘテロ二量体型重鎖の一方は、いわゆる「ノブ変異」（T366Wおよび任意でS354CまたはY349Cのうちの一つ）を含み、他方はいわゆる「ホール変異」（T366S、L368AおよびY407Vならびに任意でY349CまたはS354C）を含む（例えばCarter, P. et al, Immunotechnol. 2（1996）73参照）。そのような核酸は、抗体の第1VLを含むアミノ酸配列および/または抗体の第1ヘテロ単量体Fc領域を含んでいる第1VHを含むアミノ酸配列および/または抗体の第2VLを含むアミノ酸配列および/または抗体の第2ヘテロ単量体Fc領域を含んでいる第2VHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の第1および/もしくは第2軽鎖ならびに/または第1および/もしくは第2重鎖）をコードする。これらの核酸は同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上に存在することができ、通常これらの核酸は2つまたは3つの発現ベクター上に位置する。すなわち、1つのベクターがこれらの核酸のうちの2つ以上を含みうる。これらの二重特異性抗体の例はCrossMabおよびT細胞二重特異性抗体である。

一態様では、本明細書に記載する方法において使用される抗体をコードする単離された核酸が提供される。

さらなる一態様では、（1つまたは複数の）そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。

さらなる一態様では、（1つまたは複数の）そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。

そのような一態様において、宿主細胞は、以下のベクターを含む（例えば以下のベクターで形質転換されている）:
-ネイティブ抗体またはネイティブ抗体フラグメントの場合:
（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または
（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクター、
-ヘテロ二量体型重鎖を持つ二重特異性抗体の場合:
（1）一方は抗体の第1VLを含み他方は抗体の第1VHを含むアミノ酸配列をコードする核酸の第1ペアを含む第1ベクターと、一方は抗体の第2VLを含み他方は抗体の第2VHを含むアミノ酸配列をコードする核酸の第2ペアを含む第2ベクター、または
（2）可変ドメインのうちの1つ（好ましくは軽鎖可変ドメイン）を含むアミノ酸配列をコードする第1核酸を含む第1ベクター、一方は軽鎖可変ドメインを含み他方は第1重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸のペアを含む第2ベクター、および一方は、第2ベクターの場合と同様に、それぞれ他の軽鎖可変ドメインを含み他方は第2重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸のペアを含む第3ベクター、または
（3）抗体の第1VLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクター、抗体の第1VHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクター、抗体の第2VLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第3ベクター、および抗体の第2VHを含むアミノ酸配列をコードする第4ベクター。

一態様において、宿主細胞は真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。一態様では、抗［［PRO］］抗体を作製する方法であって、上で用意された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、および任意で抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収する工程を含む方法が提供される。

抗［［PRO］］抗体を組換え生産するには、抗体をコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使って（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定すること、または組換え法によって生産すること、または化学合成によって得ることができる。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要でない場合は特に、細菌中で生産しうる。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えばUS 5,648,237、US 5,789,199およびUS 5,840,523を参照されたい。（大腸菌における抗体フラグメントの発現が記載されているCharlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology、Vol.248,Lo,B.K.C.（ed.）,Humana Press,Totowa,NJ（2003）,pp.245-254も参照されたい。）発現後に、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離して、さらに精製することができる。

原核生物だけでなく、糸状菌または酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを持つ抗体の生産をもたらす真菌株および酵母株を含めて、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22（2004）1409-1414およびLi, H. et al, Nat. Biotech. 24（2006）210-215参照。

グリコシル化された抗体を発現させるための適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用しうる（特にスポドプテラ-フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用することができる）バキュロウイルス株は、数多く同定されている。

植物細胞培養も宿主として利用することができる。例えばUS 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978およびUS 6,417,429（トランスジェニック植物における抗体生産のためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照されたい。

脊椎動物細胞も宿主として使用しうる。例えば、浮遊状態での成長に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（例えばGraham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36（1977）59-74などに記載の293または293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（例えばMather,J.P.,Biol.Reprod.23（1980）243-252などに記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK、バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍（MMT 060562）、Mather, J.P. et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383（1982）44-68などに記載のTRI細胞、MRC5細胞およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、DHFR-CHO細胞（Urlaub, G.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生産に適した一定の哺乳動物宿主細胞株を概観するには、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.（ed）, Humana Press, Totowa, NJ（2004）pp.255-268を参照されたい。

（A）トランスフェクション0516に関する脱グリコシル化ESI-MSトータルイオンクロマトグラム。A:ノブ変異を持つIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）、B:ホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）、C:ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）、D:第1軽鎖（LC-1）。 （B）トランスフェクション0517に関する脱グリコシル化ESI-MSトータルイオンクロマトグラム。A:ノブ変異を持つIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）、B:ホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）、C:ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）、D:第1軽鎖（LC-1）。 （C）トランスフェクション0518に関する脱グリコシル化ESI-MSトータルイオンクロマトグラム。A:ノブ変異を持つIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）、B:ホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）、C:ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）、D:第1軽鎖（LC-1）。 （D）トランスフェクション0519に関する脱グリコシル化ESI-MSトータルイオンクロマトグラム。A:ノブ変異を持つIgG1サブクラスの第2重鎖（交差HC-2-ノブ）、B:ホール変異を持つIgG1サブクラスの第1重鎖（HC-1-ホール）、C:ドメイン交換された第2軽鎖（交差LC-2）、D:第1軽鎖（LC-1）。 CE-SDSによって決定したリファレンスクローン0131および本明細書に記載の方法で得られたクローンの相対的単量体含量（A）。 CE-SDSによって決定したリファレンスクローン0131および本明細書に記載の方法で得られたクローンの5/6抗体副産物（B）。

以下は本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的説明を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施しうることは理解される。

材料および一般方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に与えられている。抗体鎖のアミノ酸はKabatによるナンバリングに従ってナンバリングし、言及する（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））。

組換えDNA技法
Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的方法を使ってDNAを操作した。分子生物学的試薬は製造者の説明書に従って使用した。

遺伝子合成
化学合成によって作製したオリゴヌクレオチドから所望の遺伝子セグメントを調製した。他にはない制限エンドヌクレアーゼ切断部位で挟まれた長い遺伝子セグメントを、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによって組み立てた後、表示の制限部位を使ってクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列をDNAシークエンシングによって確認した。遺伝子合成フラグメントは所与の仕様書に従ってGeneart（ドイツ・レーゲンスブルク）に注文した。

DNA配列決定
DNA配列は、MediGenomix GmbH（ドイツ・マルティンスリート）またはSequiServe GmbH（ドイツ・ファターシュテッテン）において、両鎖シークエンシングによって決定された。

DNA配列およびタンパク質配列の分析ならびに配列データの管理
配列の生成、マッピング、解析、アノテーションおよび図解には、GCG（Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン）のソフトウェアパッケージ・バージョン10.2およびInfomaxのVector NT1 Advanceスイート・バージョン8.0を使用した。

発現ベクター
記載した二重特異性抗体の発現には、CMV-イントロンAプロモーターを持つもしくは持たないcDNA編成またはCMVプロモーターを持つゲノム編成のいずれかに基づく（例えばHEK293細胞における）一過性発現用の発現ベクターを応用することができる。

ベクターは、抗体発現カセットの他にも、
-大腸菌におけるこのベクターの複製を可能にする複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。

抗体遺伝子の転写単位は以下の要素で構成される:
-5'端のユニークな制限部位
-ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
-cDNA編成の場合はイントロンA配列
-ヒト抗体遺伝子由来の5'-非翻訳領域、
-免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-cDNAとしての、またはゲノムのエクソン-イントロン編成を持つ、各抗体鎖をコードする核酸、
-ポリアデニル化シグナル配列を持つ3'非翻訳領域、および
-3'端のユニークな制限部位。

抗体鎖をコードする融合遺伝子を、PCRおよび/または遺伝子合成によって生成させ、例えば各ベクター中のユニークな制限部位を使うなどして、一致する核酸セグメントを接続することにより、公知の組換え方法および組換え技法によって組み立てる。サブクローニングされた核酸配列はDNAシークエンシングによって検証される。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌培養物からのベクター調製によって、より多量のベクターを調製する（Nucleobond AX、Macherey-Nagel）。

すべてのコンストラクトに、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と、それに対応する第2CH3ドメイン中のホール置換（（T366S、L368AおよびY407V）（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349'C）（上記各対応重鎖（HC）配列に含まれている）とによる、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術を使用した。

細胞培養技法
Current Protocols in Cell Biology（2000）,Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.（eds.）,John Wiley＆Sons,Incに記載の標準的な細胞培養技法を使用する。

HEK293-Fシステムにおける一過性トランスフェクション
二重特異性抗体は一過性発現によって生産される。そこで、HEK293-Fシステム（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用することで、各ベクターによるトランスフェクションを行う。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽中、無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）において浮遊状態で成長するHEK293-F細胞（Invitrogen）に、各発現ベクターと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）との混合物を使って、トランスフェクションを行う。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0×10⁶細胞/mLの密度で600mLに播種し、120rpm、8％CO₂でインキュベートした。翌日、細胞に、およそ1.5×10⁶細胞/mLの細胞密度で、（A）600μgの全ベクターDNA（1μg/mL）を含む20mLのOpti-MEM培地（Invitrogen）と（B）1.2mLの293fectinまたはfectin（2μl/mL）を補足した20mlのOpti-MEM培地との、およそ42mLの混合物を使って、トランスフェクションを行う。発酵中は、グルコース消費に応じて、グルコース溶液を加える。分泌された抗体を含有する上清を5～10日後に収穫し、抗体を上清から直接精製するか、あるいは上清を凍結して保存する。

タンパク質量の決定
精製抗体および精製誘導体のタンパク質濃度は、Pace et al., Protein Science 4（1995）2411-1423に従ってアミノ酸配列に基づいて算出されるモル吸光係数を使用し、280nmにおける光学密度（OD）を決定することによって決定した。

上清中の抗体濃度の決定
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、プロテインAアガロースビーズ（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム）による免疫沈降によって見積もった。それゆえに、60μLのプロテインAアガロースビーズをTBS-NP40（150mM NaClおよび1％Nonidet-P40を補足した50mM Tris緩衝液、pH7.5）中で3回洗浄した。次に、1～15mLの細胞培養上清を、TBS-NP40中で前平衡化したプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間のインキュベーション後に、Ultrafree-MCフィルターカラム（Amicon）上でビーズを、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝食塩水（2xPBS、Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム）で2回、そして0.5mLの100mM Na-クエン酸緩衝液（pH5.0）で手短に4回洗浄した。結合した抗体を、35μlのNuPAGE（登録商標）LDS試料緩衝液（Invitrogen）の添加によって溶出させた。試料の半分をそれぞれ、NuPAGE（登録商標）試料還元剤と合わせるか、還元せずにそのままにしておき、70℃で10分間加熱した。次に、5～30μlを4-12％NuPAGE（登録商標）Bis-Tris SDS-PAGEゲル（Invitrogen）に適用し（非還元SDS-PAGEにはMOPS緩衝液、還元SDS-PAGEにはNuPAGE（登録商標）酸化防止泳動緩衝液添加剤（Invitrogen）を含むMES緩衝液を使用）、クーマシーブルーで染色した。

細胞培養上清中の抗体の濃度を、アフィニティーHPLCクロマトグラフィーによって定量的に測定した。簡単に述べると、プロテインAに結合する抗体を含有する細胞培養上清を、200mM KH₂PO₄、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.4中のApplied Biosystems Poros A/20カラムに適用しAgilent HPLC 1100システムで、200mM NaCl、100mMクエン酸、pH2.5を使って溶出させた。溶出した抗体をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製標準IgG1抗体を標準とした。

あるいは、細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、サンドイッチIgG-ELISAによって測定した。簡単に述べると、StreptaWell High Bind Streptavidin A-96ウェルマイクロタイタープレート（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム）を、0.1μg/mLのビオチン化抗ヒトIgG捕捉分子F（ab'）2＜h-Fcγ＞BI（Dianova）100μL/ウェルを使って、室温で1時間あるいは4℃で一晩コーティングし、次に200μL/ウェルのPBS、0.05％Tween（PBST、Sigma）で、3回洗浄した。その後、各抗体含有細胞培養上清のPBS（Sigma）中の希釈系列100μL/ウェルを、ウェルに加え、振とう機上、室温で1～2時間インキュベートした。ウェルを200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄し、検出抗体として0.1μg/mLのF（ab'）2＜hFcγ＞POD（Dianova）100μlを使って、振とう機上、室温で1～2時間インキュベートすることによって、結合している抗体を検出した。200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄することによって、結合していない検出抗体を除去した。100μL ABTS/ウェルの添加とそれに続くインキュベーションによって、結合している検出抗体を決定した。吸光度の決定は、405nmの測定波長（リファレンス波長492nm）においてTecan Fluor Spectrometerで行った。

分取用抗体精製
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清から抗体を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインA Sepharoseカラム（GE healthcare）に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後、直ちに中和した。凝集したタンパク質を、PBSまたは150mM NaClを含む20mMヒスチジン緩衝液（pH6.0）におけるサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200、GE Healthcare）によって、単量体型抗体から分離した。単量体型抗体画分をプールし、（必要であれば）例えばMILLIPORE Amicon Ultra（30MWCO）遠心分離濃縮器を使って濃縮し、凍結し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析などによる後続のタンパク質分析および分析的特徴づけに供した。

SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）プレキャストゲルシステム（Invitrogen）を製造者の指示に従って使用した。具体的には、10％または4-12％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRISプレキャストゲル（pH6.4）およびNuPAGE（登録商標）MES（還元ゲル、NuPAGE（登録商標）酸化防止泳動緩衝液添加物を含む）またはMOPS（非還元ゲル）泳動緩衝液）を使用した。

CE-SDS
純度および抗体の完全性は、マイクロ流体Labchip技術（PerkinElmer、米国）を使用して、CE-SDSによって分析した。それゆえに、HT Protein Express試薬キットを製造者の説明書に従って使用することで、5μlの抗体溶液をCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Expressチップを使って、LabChip GXIIシステムで分析した。データはLabChip GXソフトウェアを使って分析した。

分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、プロテインA精製抗体を、Dionex Ultimate（登録商標）システム（Thermo Fischer Scientific）で、300mM NaCl、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄緩衝液（pH7.5）中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、Dionex HPLCシステムで、2×PBS中のSuperdex 200カラム（GE Healthcare）に適用した。溶出した抗体をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRadゲル濾過標準151-1901を標準とした。

質量分析
この項では、二重特異性抗体の特徴づけを、それらの正しい組み立てに重点をおいて記載する。脱グリコシル化インタクト抗体の、そして特別な例では脱グリコシル化/制限LysC消化抗体の、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって、予想される一次構造を分析した。

抗体を、リン酸緩衝液またはTris緩衝液中、1mg/mlのタンパク質濃度において、37℃で最大17時間、N-グリコシダーゼFで脱グリコシル化した。制限LysC（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム）消化は、100μgの脱グリコシル化抗体を使って、Tris緩衝液（pH8）中、室温で120時間、または37℃で40分間、それぞれ行った。質量分析に先だち、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCによって、試料を脱塩した。TriVersa NanoMateイオン源（Advion）を装着したmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）でのESI-MSによって、全質量を決定した。

実施例1
発現および精製
上記一般材料および方法の項で述べたように、二重特異性抗体を生産した。

プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの組合せにより、二重特異性抗体を上清から精製した。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および安定性などの分析的特性について特徴づけた。

予想される一次構造は、一般方法の項で述べたように、脱グリコシル化インタクト抗体および脱グリコシル化/プラスミン消化抗体、あるいは脱グリコシル化/制限LysC消化抗体の、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。

追加の分析方法（例えば熱安定性、質量分析および機能評価）は、プロテインAおよびSEC精製後にのみ適用した。

実施例2
ELISAによるインビトロでのAβ1-40線維への結合の決定
原線維Aβへの二重特異性抗体の結合はELISAアッセイによって測定される。簡単に述べると、Aβ（1-40）を、PBS中、7μg/mLにして、Maxisorbプレートに37℃で3日間コーティングすることで、原線維Aβを生産した後、室温で3時間乾燥する。そのプレートをPBS中の1％CroteinCおよび0.1％RSA（ブロッキング緩衝液）で室温で1時間ブロッキングし、次に洗浄緩衝液で1回洗浄する。二重特異性抗体または対照を、ブロッキング緩衝液中、100nMまでの濃度で加え、4℃で一晩インキュベートする。4回の洗浄工程後に、ブロッキング緩衝液で1:10,000希釈した抗ヒト-IgG-HRP（Jackson Immunoresearch）を添加し（1 RT）、次に6回洗浄し、TMB（Sigma）中でインキュベートすることによって、コンストラクトを検出する。1N HClで発色を停止してから、450nmで吸光度を読み取る。

実施例3
インビトロでのトランスフェリン受容体への結合の決定
マウストランスフェリン受容体への二重特異性抗体の結合は、マウスX63.AG8-563骨髄腫細胞でのFACS分析によって試験される。Aβ抗体がAg8細胞に非特異的に結合する傾向をある程度示す場合には、20倍過剰の抗マウスTfR抗体との共インキュベーションによって、特異的結合を定量することができる。細胞を遠心分離によって収穫し、PBSで1回洗浄し、5x10⁴細胞を、200nM抗マウスTfR抗体を添加したまたは添加しないポリペプチド融合物の1.5pM～10nMの希釈系列と共に、100μLのRPMI/10％FCS中、氷上で1.5時間インキュベートする。RPMI/10％FCSで2回洗浄した後、細胞を、RPMI/19％FCS中、希釈度1:600の、フィコエリトリンにカップリングされたヤギ抗ヒトIgG（Jackson Immunoresearch）と共に、氷上で1.5時間インキュベートする。細胞を再び洗浄し、RPMI/10％FCSに再懸濁し、フィコエリトリンの蛍光をFACS-Array計器（Becton-Dickinson）で測定した。

実施例4
ヒトTfR-抗体相互作用に関する表面プラズモン共鳴に基づく結合アッセイ
販売者のマニュアルに従い標準的なアミンカップリング化学手順を使って抗ヒトFab抗体（GE Healthcare、カタログ番号28-9583-25）で前処理したC1センサーチップ（GE Healthcare、カタログ番号BR1005-35）を装着したBIAcore B 4000（GE Healthcare）で、結合実験を実行した。

速度論的測定のために、25℃のリン酸緩衝液食塩水pH7.4、0.05％Tween 20中、60秒の接触時間および10μL/分の流速を適用して、試料抗体を固定化した。組換えHis6タグ付きヒトトランスフェリン受容体（R＆D systems、カタログ番号2474-TR-050）を、濃度を増加させながら適用して、経時的にシグナルをモニタリングした。30μL/分の流速で会合時間150秒および解離時間600秒の平均時間枠を記録した。1:1結合モデル（ラングミュア等温式）を使ってデータをフィッティングした。

実施例5
本明細書に記載する方法において生産される二重特異性抗体を使った間接的免疫蛍光法による、アルツハイマー病患者の脳切片からのネイティブヒトβ-アミロイド斑の染色
間接的免疫蛍光法を使った免疫組織化学的分析によってネイティブヒトβ-アミロイド斑を染色する能力について、二重特異性抗体を試験することができる。真性のヒトβ-アミロイド斑の特異的かつ高感度な染色を実証することができる。アルツハイマー病陽性と診断された患者から剖検で得られた側頭皮質からの未固定組織のクライオスタット切片を、間接的免疫蛍光法によって標識する。Alexa 555色素にコンジュゲートされたアフィニティー精製ヤギ抗ヒト（GAH555）IgG（H＋L）（Molecular Probes）によって顕在化される結合した二重特異性抗体を検出するために、2工程インキュベーションを使用する。対照は、無関係なヒトIgG1抗体（Sigma）および二次抗体のみを含むことができ、それらはすべて陰性結果を与えるはずである。

実施例6
アルツハイマー病のマウスモデルにおける、本明細書に記載する方法において生産される二重特異性抗体によるインビボβ-アミロイド斑デコレーション
AD関連アミロイドーシスのマウスモデルであるAPP/PS2二重トランスジェニックマウス（Richards,J.Neuroscience,23（2003）8989-9003）において、二重特異性抗体を、インビボのβ-アミロイド斑をイムノデコレートするその能力について、試験することができる。これにより、脳透過性とアミロイドβ斑への結合の程度を評価することが可能になった。融合ポリペプチドは、裸の抗Aβモノクローナル抗体と比べて異なる用量で投与することができ、6日後に動物をリン酸緩衝食塩水で灌流し、脳をドライアイスで凍結し、凍結切片用に調製する。

β-アミロイド斑に結合する抗体の存在は、濃度15μg/mlの、Alexa555色素にコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG（H＋L）（GAH555）（Molecular Probes）を使った、室温で1時間の一重標識間接免疫蛍光法によって、未固定クライオスタット切片を使って評価することができる。アミロイド斑の対比染色は、濃度0.5μg/mlの、Alexa 488にコンジュゲートされたAβに対するマウスモノクローナル抗体であるBAP-2と共に、室温で1時間インキュベートすることによって行うことができる。スライドを蛍光用封入剤（S3023、Dako）に包埋し、共焦点レーザー顕微鏡法でイメージングを行う。

明解に理解されるように、上述の発明を、図解と実施例を使って多少詳しく説明したが、これらの説明および実施例が、本発明の範囲を限定していると解釈してはならない。本明細書において言及する特許文献および科学文献はすべて、それらの全体が参照により特に本明細書に組み入れられる。

実施例7
ドメイン交換された軽鎖のための発現カセットを含む発現ベクターによる、二重特異性抗DR5/FAP抗体を発現する安定細胞株のトランスフェクション
ドメイン交差を有する軽鎖のための発現カセットを1つ含む交差LC発現ベクターを、クローン0131細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、ヌクレオフェクション（Amaxa）および0.6/1.2/2.4pM（合計）プラスミドを使用し、合成培地中で直線化したDNAを使って行い、生じた2×3細胞プールを別々に選択した。

トランスフェクトされたクローンプールを、10mmol/Lグルタミンを補足した合成培地中で、250nM MTX（DHFR用）＋500nMおよび700nMハイグロマイシンBによって選択した。3週間後にプールを、サイドピークの低減と主要ピークの増加について、CE-SDSおよびHICによって分析した。

これらの結果に基づいて、250nM MTXおよび700 nM HygBによって選択された3つのプール（0314、0316、0318）を、限界希釈（LD）と、10mmol/Lグルタミンを補足した合成培地ならびにMTX濃度250nmol/Lおよび700nM HygBによるそれぞれ3×384ウェルプレートのプレーティングのために選んだ。

1週間後に3×384ウェルプレートの上清をDR5およびFAPへの結合についてELISAおよびDR5-FAPブリッジングELISAによって試験した。良好な力価および両抗原に対して高い反応性を持つ158のクローンを拾い、24ウェルプレートを経て6ウェルまで拡大培養してから、ELISAおよびブリッジングELISAによる標的結合、成長、生産性およびCE-SDSによって評価される副産物プロファイルに関して、4日間のバッチ実験（「シードトレイン力価（seed train titer）」）において評価した。最大830μg/mlの力価と許容できる生成物品質とを持つそのうちの46クローンを、Ambr15システムにおける14日間の流加培養でさらに特徴づけ、標的結合、成長特性、ならびにCE-SDSおよびHICによる副産物プロファイルに関して分析した。そのうちの20クローンを選択し、質量分析（MS）によってさらに試験した。選択されたそのうちの10クローンを合成培地中、振とうフラスコで培養し、PSBとして寄託した。

Claims (7)

1. 少なくとも3つの異なるポリペプチドを含む多重特異性抗体を生産するための方法であって、
   該方法が、
   - 哺乳動物細胞を培養培地において培養する工程であって、該哺乳動物細胞が、
   （a）哺乳動物細胞に第1発現ベクターと2種のさらなる発現ベクターとをトランスフェクトするステップ
   によって生成され、
   該第1発現ベクターが、多重特異性抗体の、ドメイン交換を有する第2軽鎖ポリペプチドをコードする厳密に1つの核酸配列を含み、かつ
   該2種のさらなる発現ベクターが、多重特異性抗体の異なるポリペプチド鎖をそれぞれコードする2つの核酸配列をそれぞれ含み、該2種のさらなる発現ベクターの全ての核酸は一緒に多重特異性抗体の全てのポリペプチド鎖をコードしている、工程；および
   - 該細胞または該培養培地から多重特異性抗体を回収し、それによって、多重特異性抗体を生産する工程
   を含み、
   該多重特異性抗体が、ヒトIgG1サブクラスの多重特異性抗体であり、かつ
   該多重特異性抗体が、
   第1抗原に特異的に結合する抗体の
   ・第1軽鎖、および
   ・第1ヘテロ単量体Fc領域ポリペプチドを含む第1重鎖と、
   第2抗原に特異的に結合する抗体の
   ・第2軽鎖、および
   ・第2ヘテロ単量体Fc領域ポリペプチドを含む第2重鎖
   であって、該第2軽鎖および該第2重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いによって置き換えられておりドメイン交換を生じている、第2軽鎖および第2重鎖と
   を含む二価二重特異性抗体である、
   前記方法。
2. ステップ（a）が、第1発現ベクターと2種のさらなる発現ベクターとを共トランスフェクトするステップである、請求項1記載の方法。
3. 哺乳動物細胞に2種のさらなる発現ベクターをトランスフェクトした後、第1発現ベクターをトランスフェクトする、請求項1記載の方法。
4. 哺乳動物細胞が多重特異性抗体を安定に発現する、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
5. 哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
6. ドメイン交換がCH1-CL交差またはVH-VL交差である、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
7. 生成物関連不純物が少ない/低減した多重特異性抗体調製物を生産するための、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。

Images