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JP7093728B2 - 化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集 - Google Patents

化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集 Download PDF

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Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１６年６月８日に出願した米国特許仮出願第６２／３４７５５３号および２０１７年４月２０日に出願した正規の米国特許出願第１５／４９３，１２９号の利益を主張するものであり、前記出願の全体の内容は、参照により本明細書の一部をなすものとする。
本発明は、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）技術に関する。
天然原核生物のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、一定の長さの可変配列が介在する短いリピートのアレイ（すなわち、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）、または「ＣＲＩＳＰＲ」）およびＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質を含む。転写されたＣＲＩＳＰＲアレイのＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質のサブセットによって小さいガイドＲＮＡへプロセシングされ、これは、一般に、以下に論じられるような２つの成分を有する。少なくとも６つの異なる系、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩ型がある。ＲＮＡの成熟したｃｒＲＮＡへのプロセシングに関与する酵素は、６つの系で異なっている。天然原核生物のＩＩ型系では、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）およびトランス作動性ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）と呼ばれる２つの短い非コーディングＲＮＡ種を含む。例示的な系では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼと複合体を形成する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）およびｇＲＮＡの部分と相補的である配列であるプロトスペーサーを有する標的ポリヌクレオチド配列と結合する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体による標的ポリヌクレオチドの認識および結合は、標的ポリヌクレオチドの切断を誘導する。天然ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、原核生物において、ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体が、真核生物におけるＲＮＡｉと類似の方法で外因性遺伝要素を認識し、サイレンシングし、それによって、プラスミドおよびファージなどの外因性遺伝要素に対する耐性を付与する免疫系として機能する。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが共有結合によって連結している単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）が、天然に存在するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ間で形成される複合体の代わりになることができることは実証されている。
ｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡの開発に関連する考慮として、特異性、安定性および機能性が挙げられる。特異性とは、特定のｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体が、所望の標的配列と結合し、ニックを入れ、および／またはそれを切断する能力を指し、所望の標的とは配列および／または位置が異なるポリヌクレオチドの結合、ニッキング、および／または切断は、ほとんどまたは全く生じない。したがって、特異性とは、ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体のオフターゲット効果を最小化することを指す。オフターゲット効果の低減を伴う標的ポリヌクレオチドに対する所望の結合親和性を有し、それにもかかわらず、所望のｇＲＮＡ機能性を有するｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを提供する必要がある。標的ポリヌクレオチドに対する所望の結合親和性および／または所望のオフターゲット低減の結合を有する、特異性が増強されたｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡを含む）を作製および使用するための改善された方法も必要である。
例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の説明図である。単一ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質によって複合体が形成され、その複合体が標的ポリヌクレオチドを認識し、結合する。Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列を認識する（ここで、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧの３ヌクレオチドの配列であり、ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであるが、ＮＡＧなどのその他のＰＡＭ配列も存在するとわかっている）。ｓｇＲＮＡは、ガイド配列、ｃｒＲＮＡ配列またはセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはセグメントを含む。ｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流のＤＮＡ標的とハイブリダイズする。 ｃｒＲＮＡセグメント２０３およびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント２０５を含む、例示的なガイドＲＮＡ２０１を示す図である。 ｃｒＲＮＡセグメント２０９およびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント２１１を含み、前記ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがループ２１３を介して連結される、例示的な単一ガイドＲＮＡ２０７を示す図である。 ガイドＲＮＡに含めることができる種々の化学修飾の一部についての構造を示す図である。もちろん、図３は、限定を意図したものではなく、本明細書において記載される多くのその他の修飾を使用することができる。 オリゴヌクレオチド二本鎖が加熱によって別個の鎖に分離するにつれて紫外線（ＵＶ）吸光度がどのように上昇するのかを示すグラフである。シグモイド曲線は、別個の鎖への二本鎖の解離を表し、シグモイド曲線の中点が、二本鎖のＴｍである。この曲線は、生理的塩濃度での２０ヌクレオチドＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度が、およそ５０℃であることを示す。 ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがハイブリダイズされた二本鎖を形成している、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２ピースのデュアルガイドＲＮＡ（「ｄｇＲＮＡ」）を示す図であって、ガイドＲＮＡの伸長領域、ロッキング領域、サンプリング領域、シード領域（通常、１０ｍｅｒ）、デュアルガイドステムまたは単一ガイドステム－ループ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域を示す図である。 ガイド配列と相補的ＤＮＡ配列とのシード部分間でのシード二本鎖の最初の形成後、ヌクレオチドの結合が、どうのようにして、サンプリング領域およびロッキング領域を通じて逐次的に進行して、融解温度を有するＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成するかを示す図である。 シード領域のヌクレオチドにおける化学修飾が、高い協同性レベルを維持しながら個々の塩基対の結合エネルギーを減少させ、それによって、サンプリング領域を伸長し、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度を低下させることができることを示す図である。図５Ｃは、サンプリング領域における化学修飾も示す。 ２０ヌクレオチドのガイド配列を有し、該ガイド配列内の種々の位置に組み込まれた種々の種類の化学修飾によって修飾されている例示的ｃｒＲＮＡポリヌクレオチドを示す図である。 修飾されていないｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す図である。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 ｘ軸上の負または正の整数によってそれぞれ示される、ガイド配列の漸増的な５’末端切除または５’ 末端伸長後の相補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされた（ｃｒＲＮＡ内の）ガイド配列の２０塩基対の二本鎖の融解温度の変化を示すグラフである。 ＣＬＴＡ１オンターゲット、ＣＬＴＡ１オフ１ターゲットおよびＣＬＴＡ１オフ３ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断ならびに「オフ１」および「オフ３」と呼ばれる２種の異なるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ１」配列に標的化されたｇＲＮＡの化学修飾の影響を示す図である。 図８Ａの切断結果を、アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比を算出したことに由来する図である。アッセイされたガイドＲＮＡごとに、それぞれのオンターゲット切断パーセンテージを各比に掛けることによって、「特異性スコア」も算出されている。陰付きの比および特異性スコアは、図８Ｂに示されている他のものより大きい値であることが注目に値する。 「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断ならびに「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」と呼ばれる３種の異なるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断（それぞれ、ＣＬＴＡ４オンターゲット、ＣＬＴＡ４オフ１ターゲット、ＣＬＴＡ４オフ２ターゲットおよびＣＬＴＡ４オフ３ターゲットを表す）に関する、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ４」配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置での２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾の影響を示す図である。 図９Ａの切断結果を、アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比を算出したことに由来する図である。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、１．５以上のスコアに陰が付けられている。オフターゲットポリヌクレオチドごとに３つの最高スコアが、より濃い陰を付けることによって示されている。 ＩＬ２ＲＧオンターゲットおよびＩＬ２ＲＧオフ３ターゲットをそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ３」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、２．０より大きいスコアに陰が付けられている。より濃い陰を付けることによって３つの最高スコアが示されている。 ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、２．０より大きいスコアに陰が付けられている。より濃い陰を付けることによって３つの最高スコアが示されている。 合成ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現プラスミドがトランスフェクトされたヒトＫ５６２細胞における、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡの種々の種類の修飾の影響であって、この図で「オン」と呼ばれる標的ゲノム遺伝子座の切断に関する影響を、「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」と呼ばれる３種の異なるオフターゲットゲノム遺伝子座の同時切断に関する影響を示す図であり、前記「オン」、「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」は、内因性ＨＢＢオンターゲット、ＨＢＢオフ１ターゲット、ＨＢＢオフ２ターゲットおよびＨＢＢオフ３ターゲット部位をそれぞれ表す。「Ｕｎｍｏｄｉｆ」は、化学修飾されていないｓｇＲＮＡを示す。「３ｘＭ」は、２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡ鎖の最初の３つおよび最後の３つのヌクレオチドに、すなわち、それぞれ５’および３’末端に組み込まれたことを示す。同様に、「３ｘＭＳ」は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端に同様に組み込まれたことを示し、それに対して「３ｘＭＳＰ」は、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端に同様に組み込まれたことを示す。すべてのｓｇＲＮＡを、トランスフェクトされた細胞における示されている遺伝子座の編集についてアッセイした。 図１１Ａに示されている同一のエントリー１～１７に関する結果を、該エントリーを特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけして、示す図である。エントリー１８～６４は、ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのさらなるＭＰ修飾の影響を示す。「１ｘＭＰ」は、５’末端と３’末端両方の末端ヌクレオチドが、ＭＰで修飾されていることを示す。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異性スコアは、図８Ｂについて説明したように算出されている。最高スコアに陰が付けられている。 内因性ＨＢＢオンターゲットゲノム遺伝子座およびＨＢＢオフ１ターゲット部位をそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドの切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットゲノム遺伝子座の同時切断に関する、トランスフェクト細胞におけるヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。合成ｓｇＲＮＡと組換えＣａｓ９タンパク質の複合体がトランスフェクトされた培養細胞において、どちらかまたは両方の部位で生じた切断のパーセンテージは、精製されたゲノムＤＮＡの別々のサンプルにおけるオンターゲットおよびオフターゲット遺伝子座をＰＣＲ増幅し、続いて、プールされたアンプリコンを次世代シークエンシングし、評価中のオンターゲットまたはオフターゲット切断部位付近にインデルが存在するか、存在しないかに従って配列リードをバイオインフォマティクスにより分割することによって、トランスフェクションの４８時間後に決定されている。トランスフェクトされた細胞の各サンプルにおいて生じたインデルは、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体ではなく、バッファーで処理されたｍｏｃｋトランスフェクト細胞の対照サンプルに対して正規化されている。標的部位インデルを示す配列リード数の、別途トランスフェクトされた各ｓｇＲＮＡについてのオフターゲット部位インデルを示すリード数に対する比が、算出されている。特異性スコアは、図８Ｂについて説明したように算出されている。「１ｘＭＰ」は、５’末端と３’末端両方の末端ヌクレオチドが、ＭＰで修飾されていることを示す。エントリー１～２１は、Ｋ５６２細胞にトランスフェクトし、該細胞を培養することによって得られた結果を示し、それに対してエントリー２２～４２は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知である）にトランスフェクトし、該細胞を培養することによって得られた結果を示す。エントリー１～１２は、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけされている。同様に、エントリー１３～１９、エントリー２２～３３、およびエントリー３４～４０は、特異性スコアによってグループごとに順位づけされている。２．０より大きい特異性スコアに陰が付けられている。 グループごとに最高比から最低比へと並べ替えられた、測定された比による図１２Ｂにおける結果の代替構成を示す図である。 図９Ａ、９Ｂ、１０および１１Ａに提示されている結果の比較を示す図である。図１３は、化学修飾されたガイドＲＮＡについての、Ｃａｓ系において標的ポリヌクレオチドを切断するために使用されたときの標的特異性に関する研究からの、いくつかの傾向を示す図である。これらの傾向によって裏付けられる概念は、オフターゲットポリヌクレオチドもＣａｓ系に存在するとき特に有用である。 Ｋ５６２細胞におけるＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡおよびＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡの種々のタイプの修飾の影響を示す図である。
本発明は、ｇＲＮＡへの特定の化学修飾が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系により許容され、Ｃａｓ：ｇＲＮＡの標的ポリヌクレオチドとの結合、標的ポリヌクレオチドのニッキングおよび／または切断の有効性を実質的に損なうことなく、Ｃａｓ：ｇＲＮＡ複合体形成のオフターゲット効果を低減するという予期しない発見に、少なくとも幾分かは基づいている。
本発明は、少なくとも１種の特異性を増強する修飾（特異性増強修飾）を含む合成ガイドＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、少なくとも１種の特異性増強修飾は、合成ガイドＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとの間の少なくとも１つのヌクレオチド対の会合を弱化もしくは強化し、および／または合成ガイドＲＮＡと少なくとも１種のオフターゲットポリヌクレオチドとの間の少なくとも１つのヌクレオチド対の会合を弱化し、ここで、前記オフターゲット弱化の少なくとも１つは、存在する場合にはオンターゲットの弱化より大きい。合成ガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡ機能性を有する。特異性増強修飾（複数でもよい）は、ガイド配列内に、例えば、ロッキング領域、サンプリング領域および／またはシード領域内に、位置し得る。特定の実施形態では、特異性増強修飾（複数でもよい）は、ｇＲＮＡと標的ポリヌクレオチド配列とオフターゲットポリヌクレオチド配列（複数でもよい）とによって形成される二本鎖の融解温度を低下させるか、またはｇＲＮＡ／標的二本鎖の融解温度を上昇させ、少なくとも１種のｇＲＮＡ／オフターゲット二本鎖の融解温度を低下させる。本発明は、これらの合成ガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体、前記合成ガイドＲＮＡを使用して標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れる、また結合するための方法、ならびに前記合成ガイドＲＮＡを含むセット、ライブラリー、キットおよびアレイも提供する。本発明は、合成ガイドＲＮＡを調製する方法も提供する。
［Ｉ．定義］
本明細書において、用語「ガイドＲＮＡ」とは、一般に、Ｃａｓタンパク質と結合し、Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子）内の特定の位置に対して標的化するのに役立ち得るＲＮＡ分子（または集合的に、ＲＮＡ分子の群）を指す。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含み得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むが、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。本明細書において、用語「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡセグメント」とは、ポリヌクレオチドを標的化するガイド配列、ステム配列（さらに明確にするために、該ステム配列は、単一ガイドＲＮＡ内でｔｒａｃｒＲＮＡの対応する部分を有するステムを形成する、ステム形成配列を包含する）、任意選択的に、５’－オーバーハング配列を含むＲＮＡ分子またはその一部を指す。本明細書において、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」とは、タンパク質結合セグメント（例えば、タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用可能である）を含むＲＮＡ分子またはその一部を指す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと部分的にまたは完全にハイブリダイズするセグメントも含む。用語「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、同一ＲＮＡ分子または鎖中に位置する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を包含する。また、用語「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、別個のＲＮＡ分子中に位置する２種以上のＲＮＡ分子の群を集合的に包含する。用語「ガイドＲＮＡ」は、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質）に結合するＲＮＡ分子または好適な分子セグメント群であって、標的ポリヌクレオチド内の相補的配列（または「標的配列」）に結合すること、ニックを入れることおよび／またはそれを切断することができるｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するためのＣａｓタンパク質結合を含むガイドＲＮＡの機能を有する、ＲＮＡの１本のまたはセグメント化された鎖内のガイド配列を備えている、ＲＮＡ分子または好適な分子セグメント群も包含する。
用語「ガイド配列」とは、標的ポリヌクレオチド内の標的配列と部分的または完全な相補性を有し、Ｃａｓタンパク質によって容易にされる塩基対形成によって標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドＲＮＡ内の連続ヌクレオチド配列を指す。図１に示されている例で説明されるように、標的配列は、ＰＡＭ部位（ＰＡＭ配列、およびＰＡＭ部位を一緒に構成する、他の鎖上のその相補的配列）に隣接している。ＰＡＭ配列（ｃａｓ９についてはＮＧＧ）のすぐ上流に、標的配列と相補的な配列（図１中の太字の、下部の鎖）がある。ガイド配列とハイブリダイズする標的配列は、ＰＡＭ配列の成分（ｃａｓ９についてはＣＣＮ）のすぐ下流にある。ガイド配列のヌクレオチド１（５’における最初のヌクレオチド）は、標的配列の最後のヌクレオチドと相補的であり、その一方で、ガイド配列の最後のヌクレオチド（図１中のガイド配列のヌクレオチド２０）は、ＰＡＭ部位の隣（およびＰＡＭ配列の相補体のすぐ下流）にある、標的配列の最初のヌクレオチドと相補的である。Ｃｐｆ１などの他の例では、ガイド配列とハイブリダイズする標的配列の位置は、ＰＡＭ配列の相補体の上流にあり得る。
ガイド配列は、約１０ヌクレオチド程度に短いこともあり、約３０ヌクレオチド程度に長いこともある。通常のガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４ヌクレオチド長である。合成ガイド配列は、通例は２０ヌクレオチド長であるが、より長くてもよく、またはより短くてもよい。ガイド配列が２０ヌクレオチドより短い場合、それは、通常、２０ヌクレオチドガイド配列と比較して５’末端からの欠失である。例として、ガイド配列は、標的配列と相補的な２０ヌクレオチドからなり得る。言い換えると、ガイド配列は、ＤＮＡとＲＮＡとの間のＡ／Ｕの相違を除いて、ＰＡＭ配列の上流の２０ヌクレオチドと同一である。このガイド配列が、５’末端から３ヌクレオチド、末端切除されると、２０ヌクレオチドガイド配列のヌクレオチド４は、この場合、その１７ｍｅｒのヌクレオチド１になり、２０ヌクレオチドのガイド配列であるヌクレオチド５は、この場合、その１７ｍｅｒのヌクレオチド２になる、等々。この新たな位置は、元の位置マイナス３である。同様に、ガイド配列は、標的部位における２０を超えるヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、これらのさらなるヌクレオチドは、ガイド配列の５’末端に位置する。なぜなら、ガイド配列の３’末端は、ＰＡＭ部位の隣の標的と相補的であるからである。かさねて例として、２２ヌクレオチドのガイド配列では、２０ｍｅｒにおける元のヌクレオチド１は、この場合、ヌクレオチド３になり、２０ｍｅｒにおける元のヌクレオチド２は、ヌクレオチド４になる、等々。この新たな位置は、元の位置プラス２、またはマイナス（－２）である。したがって、ガイド配列は、５’末端から数えると、ヌクレオチド１から「２０マイナスＮ」（２０－Ｎ）からなり、Ｎは、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整数である。ガイド配列内の所与のヌクレオチド位置は、「位置番号マイナスＮ（番号－Ｎ）」と記載されることになる。例えば、位置５におけるヌクレオチドは、ガイド配列が５’末端においてＮヌクレオチドだけ末端切除されたまたは伸長された場合に生じる、２０ヌクレオチドガイド配列から得られる参照位置からの位置５のシフトを示すために、「５－Ｎ」（５マイナスＮ）と記載されることになる。ヌクレオチド位置は、正の整数である。したがって、負またはゼロであるいずれの（番号－Ｎ）位置も非現実的であり、無視すべきである。ガイド配列は、ｇＲＮＡを構成する鎖（１つまたは複数）内のどこに位置してもよい。通常のガイド配列は、ｇＲＮＡ鎖の５’末端もしくは３’末端に、またはその付近に位置する。
用語「スキャフォールド」とは、実質的に同一であるか、または天然の生物学的種にわたって高度に保存されている配列を含むガイドＲＮＡ分子の一部を指す。スキャフォールドは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント、およびｃｒＲＮＡセグメントの３’末端にまたはその付近にポリヌクレオチドを標的化するガイド配列（リピート部分）以外のｃｒＲＮＡセグメントの一部を含む。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはその類似体を指す。本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドもしくはベクトルＤＮＡ、または合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子およびガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは合成ＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含む。さらに、本明細書において、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖形態を含む。当該技術分野での標準規定は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子の別個の鎖、および２つ以上のヌクレオチドを含む種々の核酸は、一般に、それらの５’末端から番号づけされ、この規定は、そのような分子に共有結合によって連結している５’伸長部または「オーバーハング」の事例を含めて、全体を通して使用される。
本明細書において「修飾」または「化学修飾」とは、最も一般的な４つの天然リボヌクレオチドであるアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンリボヌクレオチドに見られるものとは異なる化学部分、または化学構造の一部を指す。したがって、用語「修飾」とは、アデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンリボヌクレオチドの最も一般的な天然分子構造のまたはそのような天然分子構造に関する分子変化を指す。用語「修飾」は、核酸塩基のもしくは核酸塩基に関する変化、糖のもしくは糖に関する変化、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル連結の変化を指すことがある。用語「修飾」は、天然転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、例えば、これらに限定されないが、２’－Ｏ－メチル、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、１－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２－チオシトシン、５－メチルシトシン、５－フルオロシトシン、シュードリジン、ジヒドロウリジン、リボチミジンなどにおいて起こる化学修飾などの、自然に起こるリボヌクレオチドの化学構造変化を指すこともある。用語「修飾」は、通常は自然界に見られない化学修飾、例えば、これらに限定されないが、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－フェニルなどを指すこともある。用語「同一修飾」とは、糖のもしくは糖に関する、またはヌクレオチド間結合の、同一種類の化学修飾を指し、例えば、２’－Ｏ－メチルが、アデノシン、グアノシン、シチジンおよび／またはウリジンリボヌクレオチドの２’位に結合していることがあり、そのような修飾は、同一種類の修飾または「同一修飾」と呼ばれ得る。逆に言えば、核酸塩基への修飾は、修飾核酸塩基が同一の分子構造で構成されていた場合にのみ「同一修飾」と同定されることになる。例を挙げて差異を説明すると、１－メチルグアノシンおよび７－メチルグアノシンの両方は、最も一般的な天然グアノシンのメチル基修飾を有するが、修飾核酸塩基が異なる分子構造を有するため、「同一修飾」ではない。さらなる例では、ＲＮＡの鎖は、３つの修飾ヌクレオチド、例えば、各々が２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸によって修飾されている、グアノシンおよび２つのシチジンを含むことがあり、そのようなヌクレオチドは、同一の方法で修飾されたまたは同一修飾で修飾されたと的確に説明することができる。逆に言えば、ＲＮＡの異なる鎖は、５－メチルシチジン、および５－メチル置換基を欠くシチジンを含むこともあり、両方のシチジンヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸によって修飾されていることもあるが、それでもこれら２つのシチジンヌクレオチドは異なる修飾を有し、同一の方法で修飾されているとは言われないだろう。
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの関連において、用語「修飾」とは、これらに限定されないが、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾または３’末端修飾、（ｂ）塩基の置換または除去を含む、核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’および／または４’位での修飾を含む糖修飾、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または置換を含む骨格修飾を含む。用語「修飾されたヌクレオチド」とは、一般に、塩基、糖およびホスホジエステル連結またはヌクレオチドホスフェートを含む骨格部分のうち１種以上の化学構造への修飾を有するヌクレオチドを指す。ガイドＲＮＡへの化学修飾は、その全内容が参照により本明細書の一部をなす、２０１５年１２月３日に出願された米国特許出願第１４／７５７，２０４号に開示されている。
用語「ｘＡ」、「ｘＧ」、「ｘＣ」、「ｘＴ」、「ｘＵ」または「ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）」および「ｙＡ」、「ｙＧ」、「ｙＣ」、「ｙＴ」、「ｙＵ」または「ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）」とは、その内容が参照によって全文が本明細書の一部をなす、Ｋｒｕｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡｓ：Ｔｏｗａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，（２００７）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４０，１４１－５０によって記載されるようなヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体を指す。
用語「構造不定の核酸」または「ＵＮＡ」とは、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである米国特許第７，３７１，５８０号に記載されるような、ヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体を指す。構造不定の核酸またはＵＮＡ、修飾はまた、「偽相補性」ヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体とも呼ばれる（例えば、Ｌａｈｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：１０，３４０９－１９を参照のこと）。
用語「ＰＡＣＥ」および「チオＰＡＣＥ」とは、それぞれ、ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸基を含有するヌクレオチド間ホスホジエステル連結類似体を指す。これらの修飾は、ホスホノカルボン酸部分、ホスホノカルボン酸エステル部分、チオホスホノカルボン酸部分およびチオホスホノカルボン酸エステル部分を含む広いクラスの化合物に属する。これらの連結は、それぞれ一般式Ｐ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＯＯＲおよび（Ｓ）－Ｐ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＯＯＲによって記載することができ、式中、ｎは、０～６の整数であり、Ｒ１およびＲ２の各々は独立に、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルからなる群から選択される。これらの修飾の一部は、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものであるＹａｍａｄａ，Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：１５，５２５１－６１によって記載されている。
本開示の一部の場所では、特に、合成ガイドＲＮＡの構造および配列ならびにそのような合成ガイドＲＮＡに関する実験結果を開示する図では、特定の修飾を示すために特定の略語が使用される。「Ｍ」は、本明細書では２’－Ｏ－メチル修飾を示すために使用され、「Ｓ」は、本明細書では３’－ホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を示すために使用され、「Ｐ」は、本明細書では３’－ホスホノ酢酸（またはＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結修飾を示すために使用され、「ＭＳ」は、本明細書では２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を示すために使用され、「ＭＰ」は、本明細書では２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（または２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結修飾を示すために使用され、「ＭＳＰ」は、本明細書では２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結修飾を示すために使用される。
「糖パッカー」とは、糖５員環の１または２個の原子を平面から出させる立体斥力のために非平面である糖環を指す。リボフラノースの場合、平面Ｃ１’－Ｏ４’－Ｃ４’は、固定されている。エンドパッカーとは、Ｃ２’またはＣ３’が、この面から外にＯ５’方向へ変えられていることを意味する。エクソパッカーは、反対方向のシフトを記述するものである。Ｃ２’－エンドおよびＣ３’－エンドは、天然には平衡状態であるが、化学修飾は、その糖を好ましいパッカーに至らせることができる。ＲＮＡでは、Ｃ３’－エンドコンホメーションが優勢である。ＤＮＡは、両方のコンホメーションに適合することが可能であり、それらのコンホメーションを取ることができる。
用語「シード領域」とは、標的核酸配列と相補的であるガイド配列の領域であって、ガイド配列と標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを開始させる領域を指す。一部の事例では、シード領域は、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体によって補助される準安定性二本鎖を形成する。一般に、ｇＲＮＡのガイド配列内のシード領域という用語は、２０ヌクレオチドのガイド配列内の、該ガイド配列の５’末端から数えて、ヌクレオチド１１～２０からなるが、この領域は、ヌクレオチド配列およびこの領域内のＲＮＡヌクレオチドに対する化学修飾に依存して、または会合しているペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質複合体の修飾によって、より短いまたはより長い範囲にわたり得る。
用語「サンプリング領域」とは、シード領域に隣接する領域を指し、これらのヌクレオチドの結合は、二本鎖の結合エネルギーが、その結合が起こる温度と同等になるまで、進行する。一般に、ｇＲＮＡ内のサンプリング領域という用語は、別段の指示がない限り、２０ヌクレオチドガイド配列内の、該ガイド配列の５’末端から数えて、ヌクレオチド５～１０からなるが、１つまたは複数の修飾によってサンプリング領域が機能的に伸長され、その結果、ガイド配列内のヌクレオチド１～１０、あるいは２～１０、あるいは３～１０、あるいは４～１０、あるいは１～１１、あるいは２～１１、あるいは３～１１、あるいは４～１１、あるいは５～１１、あるいは１～１２、あるいは２～１２、あるいは３～１２を包含する場合もあり得る。
用語「ロッキング領域」とは、サンプリング領域に隣接する領域であって、形成される二本鎖の結合エネルギーが、その結合が起こる温度より高い領域を指す。一般に、ｇＲＮＡ内のロッキング領域という用語は、別段の指示がない限り、２０ヌクレオチドガイド配列内の、該ガイド配列の５’末端から数えて、ヌクレオチド１～４からなるが、１つまたは複数の修飾によって、ロッキング領域が、ガイド配列の５’末端のヌクレオチド１、あるいはヌクレオチド１～２、あるいはヌクレオチド１～３へと機能的に短縮される場合もあり得る。ロッキング領域は、１つまたは複数のヌクレオチドが、ガイド配列を通常の２０ヌクレオチドから２１ヌクレオチドに、あるいは２２ヌクレオチドに、あるいは２３ヌクレオチドに、あるは２４ヌクレオチドに、あるいは２５ヌクレオチド以上に伸長させるように、５’末端に共有結合によって連結された場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の通常のガイド配列の長さ２０ヌクレオチドを超えて伸長し得る。
本明細書において、用語「標的ポリヌクレオチド」または「標的」とは、標的核酸配列を含有するポリヌクレオチドを指す。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖である場合も二本鎖である場合もあり、特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡである。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである。本明細書において、「標的核酸配列」または「標的配列」とは、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して結合し、ニックを入れ、または切断するよう望む、特定の配列またはその相補配列を意味する。特定の実施形態では、２つ以上の標的配列は、例えば、相同組換えを目的として２つの特定の標的配列間の配列を置き換えるために、同一の反応で結合させる、ニックを入れる、または切断することができるように選択され得る。あるいは、２つ以上の標的配列は、複数の標的を同時に結合および濃縮すべき場合にも有用である。したがって、２つ以上の標的配列が使用される場合、それぞれの標的ポリヌクレオチドは、目的に依存して、同一遺伝子内にあってもよく、またはなくてもよい。
「オフターゲットポリヌクレオチド」または「オフターゲット」とは、意図される標的核酸と部分的に相同な酸配列を含有するポリヌクレオチドを指す。オフターゲットポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよく、特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡである。本明細書において「オフターゲット核酸配列」または「オフターゲット配列」とは、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して結合する、ニックを入れる、または切断することが望まれない、特定の配列またはその相補体であって、標的核酸配列と実質的な配列同一性を有するが同一ではない、特定の配列またはその相補体を意味する。例えば、オフターゲット核酸配列は、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９０～９５％、少なくとも約９７％、またはそれより高いヌクレオチド（またはアミノ酸）配列同一性を有する場合、標的核酸配列と実質的な配列同一性を有する。
用語「ＨＢＢポリヌクレオチド」、「ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド」、「ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド」、「ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド」、および「ＣＬＴＡ４ポリヌクレオチド」とは、遺伝子ＨＢＢ、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＬＴＡ１またはＣＬＴＡ４の少なくとも一部をそれぞれ含む任意のポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、または合成ポリヌクレオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは、そのような遺伝子に関連するゲノム内の遺伝子座に見られるポリヌクレオチド配列を含むことができ、したがって、そのような遺伝子の対立遺伝子および変異体を包含する。
用語「特異性」とは、ガイド配列が、オンターゲットポリヌクレオチドと１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドとを、どの程度十分に識別することができるかを指す。ガイドＲＮＡの特異性は、例えば、オンターゲット切断、結合またはニッキングパーセンテージおよびオフターゲット切断、結合もしくはニッキングパーセンテージの算出、オン：オフ比の算出、ならびに／または匹敵するオンおよびオフターゲットパーセンテージから導き出される特異性スコアによって、決定することができる（本開示の実施例を参照のこと）。用語「オンターゲットパーセンテージ」とは、アッセイサンプル中での標的ポリヌクレオチドの切断、ニッキングまたは結合のパーセンテージを指し、したがって、例として、ガイドＲＮＡは、アッセイ中に存在する標的ポリヌクレオチドの９０％の切断、ニッキングまたは結合をもたらす場合、９０％のオンターゲットパーセンテージを有する。用語「オン：オフ比」とは、アッセイされるガイドＲＮＡごとのオンターゲットパーセンテージ対オフターゲットパーセンテージの比を指し、例として、８０％のオンターゲットパーセンテージおよび８％のオフターゲットパーセンテージを有するガイドＲＮＡは、１０のオン：オフ比を有する。用語「特異性スコア」とは、アッセイされるガイドＲＮＡごとのオン：オフ比にそのそれぞれのオンターゲットパーセンテージを掛けることによって得られる数を指し、例として、８０％のオンターゲットパーセンテージおよび８％のオフターゲットパーセンテージを有するガイドＲＮＡは、１０のオン：オフ比となり、８の特異性スコアを有する。一部のアッセイでは、結合またはニッキングは、代替として切断を使用して評価され、例えば、標的部位でのインデル形成をシークエンシングによって定量して切断を評価するアッセイでは、そのようなアッセイを使用して、ｇＲＮＡの結合またはニッキング活性も評価することができる。
用語「連続する特異性増強修飾」とは、ガイドＲＮＡ内の互いに隣接する２以上の特異性増強修飾を指す。ガイドＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の連続する特異性増強修飾を含み得る。広く使用されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系におけるガイドＲＮＡは、ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０を含むガイド配列を含む。１つまたは複数の連続する特異性増強修飾は、例えば、ヌクレオチド１および２、ヌクレオチド１～３、ヌクレオチド１～４、ヌクレオチド１～５、ヌクレオチド１～６、ヌクレオチド１～７、ヌクレオチド１～８、ヌクレオチド１～９、ヌクレオチド１～１０、ヌクレオチド２および３、ヌクレオチド２～４、ヌクレオチド２～５、ヌクレオチド２～６、ヌクレオチド２～７、ヌクレオチド２～８、ヌクレオチド２～９、ヌクレオチド２～１０、ヌクレオチド３および４、ヌクレオチド３～５、ヌクレオチド３～６、ヌクレオチド３～７、ヌクレオチド３～８、ヌクレオチド３～９、ヌクレオチド３～１０などに、修飾を含み得る。
用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、完全にまたは部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖が、適したハイブリダイゼーション条件下で一緒になって、２つの成分鎖が水素結合によって接合される二本鎖構造または領域を形成するプロセスを指す。本明細書において、用語「部分ハイブリダイゼーション」は、二本鎖構造または領域が、１つまたは複数のバルジまたはミスマッチを含有する場合を含む。水素結合は、通常、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシル（ＡとＴまたはＡとＵ）またはシトシンとグアニン（ＣとＧ）の間に形成するが、その他の非標準塩基対が形成し得る（例えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照のこと）。修飾されたヌクレオチドは、非標準的な手法でハイブリダイゼーションを可能にする、または促進する水素結合を形成し得ることが考慮される。
用語「切断」または「切断すること」とは、ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格における共有ホスホジエステル連結の分断を指す。用語「切断」または「切断すること」は、一本鎖分断および二本鎖分断の両方を包含する。二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。
用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」とは、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片またはその突然変異体または変異体を指す。用語「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」とは、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質またはポリペプチド誘導体、例えば、１つまたは複数の点突然変異、挿入、欠失、末端切除、融合タンパク質またはそれらの組合せを有するタンパク質を指す。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に保持する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ヌクレアーゼドメインの一方または両方が不活性であるように突然変異されている。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ヌクレアーゼ活性を有する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、その野生型対応物のヌクレアーゼ活性の一部またはすべてを欠く。用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」は、原核生物の種々の種の野生型Ｃｐｆ１タンパク質（ならびにプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１リボ核タンパク質からの、クラスター化されて規則的な配置の短い回文配列リピートにちなんで名付けられたもの、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１リボ核タンパク質）、その断片、またはその突然変異体もしくは変異体も含む。
Ｃａｓタンパク質の用語「ヌクレアーゼドメイン」とは、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有するタンパク質内のポリペプチド配列またはドメインを指す。通常は、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列の上流の二本鎖切断を触媒する。ヌクレアーゼドメインは、単一ポリペプチド鎖中に含有され得、または切断活性は、２種（またはそれを超える）ポリペプチドの会合に起因し得る。単一ヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の２つ以上の単離されたアミノ酸のストレッチからなり得る。これらのドメインの例として、ＲｕｖＣ様モチーフ（配列番号１中のアミノ酸７－２２、７５９－７６６および９８２－９８９）およびＨＮＨモチーフ（アミノ酸８３７－８６３）が挙げられる。Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９：３９，Ｅ２５７９－Ｅ２５８６およびＷＯ２０１３１７６７７２を参照のこと。
「ｇＲＮＡ機能性」を有する合成ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と会合するなどの天然に存在するガイドＲＮＡの機能またはＣａｓタンパク質と関連してガイドＲＮＡによって実施される機能のうち１つまたは複数を有するものである。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを結合することを含む。特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、標的ポリヌクレオチドに標的化することを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質と会合することまたはそれと結合することを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質は、融合しているタンパク質またはその（それらの）一部によって１つまたは複数の機能が遂行されるように、１つまたは複数のタンパク質もしくはそれらの一部、例えば、転写因子エンハンサーまたはリプレッサー、デアミナーゼタンパク質などと融合された、「デッド」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）になるように遺伝子操作され得る。特定の実施形態では、機能性は、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質を有する人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、Ｃａｓタンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系における、ガイドＲＮＡの任意のその他の公知の機能である。特定の実施形態では、機能性は、天然ガイドＲＮＡの任意のその他の機能である。合成ガイドＲＮＡは、天然に存在するガイドＲＮＡより大きなまたは小さなｇＲＮＡ機能性を有し得る。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、同様の天然に存在するガイドＲＮＡとの比較において、ある特性についてより大きな機能性を、別の特性についてより小さな機能性を有し得る。
一本鎖「ニッキング」活性を有するＣａｓタンパク質とは、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、ｄｓＤＮＡの２つの鎖のうち一方を切断する能力が低減した、Ｃａｓ突然変異体またはＣａｓ変異体を含むＣａｓタンパク質を指す。例えば、特定の実施形態では、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（またはＨＮＨドメイン）の機能を低減し、結果として、標的ＤＮＡの一方の鎖を切断する能力を低減する突然変異（例えば、アミノ酸置換）を有する。このような変異体の例は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｈ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａおよび／またはＮ８６３Ａ置換を含み、また、その他の種のＣａｓ９酵素中の同等の部位での同一または同様の置換を含む。
「結合」活性を有する、または標的ポリヌクレオチドに「結合する」Ｃａｓタンパク質とは、ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓタンパク質を指し、そのような複合体中にあるとき、前記ガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列などの別のポリヌクレオチドと、前記ガイドＲＮＡとその他のポリクレオチドの塩基間の水素結合によってハイブリダイズして、塩基対を形成する。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成によって起こることもあり、または任意のその他の配列特異的な方法で起こることもある。そのハイブリッドは、二本鎖を形成する２本の鎖を含むこともあり、多重鎖の三本鎖（ｍｕｌｔｉ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｒｉｐｌｅｘ）を形成する３本以上の鎖を含むこともあり、またはこれらの任意の組合せを含むこともある。
「ＣＲＩＳＰＲ機能」とは、ＣＲＩＳＰＲ系によって達成され得る任意の機能または効果を意味し、そのような機能または効果には、これらに限定されないが、遺伝子編集、ＤＮＡ切断、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合、遺伝子発現の調節、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、およびｃａｓタンパク質を別のエフェクターに連結させることによって達成され得る任意のその他の機能であって、それによってｃａｓタンパク質により認識される標的配列に対するエフェクター機能を達成することができる機能が含まれる。例えば、ヌクレアーゼを含まないｃａｓタンパク質を転写因子、デアミナーゼ、メチラーゼなどに融合させることができる。結果として得られる融合タンパク質を標的のためのガイドＲＮＡの存在下で使用して、標的の転写を調節すること、標的を脱アミノ化することまたはメチル化することができる。
本明細書において、用語、配列の「一部」または「断片」とは、完全配列よりも小さい配列の任意の一部（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を指す。ポリヌクレオチドの一部は、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００または５００またはそれを超えるヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列の一部は、ガイド配列の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、例えば、ガイド配列の３分の１またはそれより短い、例えば、７、６、５、４、３または２ヌクレオチドの長さであり得る。
分子との関連において、用語「に由来する」とは、親分子または親分子に由来する情報を使用して単離された、または作製された分子を指す。例えば、Ｃａｓ９単一突然変異体ニッカーゼおよびＣａｓ９二重突然変異体ヌル－ヌクレアーゼ（不活性化されたＣａｓ９、「デッド」Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９としても知られる）は、野生型Ｃａｓ９タンパク質に由来する。
２種以上のポリヌクレオチド（または２種以上のポリペプチド）との関連において、用語「実質的に同一の」とは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって最大限対応するように比較されアラインされた場合に、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約９０～９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超えるヌクレオチド（またはアミノ酸）配列同一性を有する配列または部分配列を指す。好ましくは、ポリヌクレオチド間の「実質的な同一性」は、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さの、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さの、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約２００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約３００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約５００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドの領域にわたって、またはポリヌクレオチドの全長にわたって存在する。好ましくは、ポリペプチド間の「実質的な同一性」は、少なくとも約５０個のアミノ酸残基の長さの、少なくとも約１００個のアミノ酸残基の長さのポリペプチドの領域にわたって、またはポリペプチドの全長にわたって存在する。
本明細書において開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。また、その範囲の上限と下限の間に介在する値は各々、下限の単位の少数第１位まで、具体的に考慮されることが理解される。述べられた範囲によって包含される、より小さい範囲または介在する値も各々、具体的に考慮される。用語「約」とは、一般に、示された数のプラスまたはマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示し得、「約２０」は、１８～２２を意味し得る。四捨五入することなど、「約」のその他の意味は、文脈から明らかとなり得、そのため、例えば、「約１」は、０．５～１．４を意味することもある。
［ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ媒介性の配列特異的結合および／もしくは切断またはニッキング］
図１に示されるものは、ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性の配列特異的切断の図である。ガイドＲＮＡは、５’ドメイン内の例示的な２０ヌクレオチド（または２０ｎｔ、ヌクレオチドはしばしば「ｎｔ」と略される）のガイド配列（その他のガイド配列は、例えば、約１５～約３０ｎｔの長さであり得る）、内部に位置する塩基対形成しているステム、および３’ドメインを有するｓｇＲＮＡとして表されている。ガイド配列は、ＤＮＡ標的中の例示的な２０ｎｔ標的配列に対して相補的である。ステムは、ｃｒＲＮＡ中のリピート配列に対応し、ｔｒａｃｒＲＮＡ中の配列に対して相補的である。ガイドＲＮＡの３’ドメインは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと結合するｔｒａｃｒＲＮＡの３’ドメインに対応する。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡ配列またはＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列のすぐ上流のプロトスペーサーと結合し、切断する。図１では、３ｎｔのＰＡＭ配列が例示されているが、４ｎｔ、５ｎｔおよびさらに長いＰＡＭ配列を含むその他のＰＡＭ配列が公知である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集のためのガイドＲＮＡは、ＲＮＡ－タンパク質複合体で機能し、該複合体で、ＲＮＡは、タンパク質のスキャフォールドとしても、二本鎖ＤＮＡ標的の配列認識としても働く。複合体は、先ずヌクレオチドＰＡＭ配列をスキャンすることによって、ゲノムＤＮＡを認識する。ＰＡＭ配列が同定されると、ＲＮＡ－タンパク質複合体は、ゲノムＤＮＡ標的とガイドＲＮＡのガイド配列間でのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の形成を試みる。この二本鎖は、先ず、ｇＲＮＡの「シード領域」のＣａｓタンパク質媒介性の塩基対形成によって開始され、前記シード領域は、およそ１０ヌクレオチドの長さであると考えられる。シード領域の結合後、安定したＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖が、ガイドＲＮＡの５’末端に残存ヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成され、これは、通常、２０ヌクレオチドのＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖をもたらし、続いてタンパク質複合体による標的ＤＮＡの二本鎖切断が起きる。
ゲノム編集に対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク質複合体の有用性を可能にするための重要な態様は、配列特異性である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク質複合体は、修復または組換えによって遺伝子を不活性化または修飾するためのプロセスの第１段階として、ゲノムＤＮＡを切断する。このプロセスでは、意図していない「オフターゲット」部位でのゲノムＤＮＡの切断は、そのゲノム内の他の位置で配列突然変異を生じさせるなどの、望ましくない結果をもたらし得る。現在、これらのオフターゲット切断事象は、スクリーニング技術によって検出されるか、育種技術によって除去されるか、または無視される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク質複合体は、原核生物において適応免疫系として進化した。これらの複合体の配列特異性の改善は、真核生物ゲノムにおけるツールとして幅広い有用性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク質複合体に向けての有意な前進および技術革新となるだろう。
配列特異性は、生物の全ゲノム内の標的部位または連続するヌクレオチドの連なりをスキャンし、検出し、それと結合することができるｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって始まる。これを行うために、標的配列は、連続するヌクレオチドの連なりまたは配列が、対象の生物の全ゲノム内に１つだけ存在し、かつ所望のゲノム編集部位に位置するのに十分な長さである必要がある。ゲノム内での唯一性を付与するために必要な連続するヌクレオチドの連なり、またはポリヌクレオチドの長さは、その特定のポリヌクレオチドの「情報内容」によって決まる。大部分の真核細胞および生物について、標的ポリヌクレオチドは、全ゲノムにおいて唯一無二であるために十分な情報内容を有するために長さが１８～２２ヌクレオチドの範囲である必要がある（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６），１８８，４１５－４３１）。一般に、標的ポリヌクレオチドが長いほど、情報内容は多く、その配列がゲノム内に１つだけ存在する可能性が高くなり、１９ヌクレオチド配列は、１８ヌクレオチド配列より多くの情報内容を有し、２０ヌクレオチド配列は、１９ヌクレオチド配列より多くの情報内容を有する、等々である。しかし、唯一無二な２０ヌクレオチド配列は、そのゲノム内のどこかの異なる２０ｎｔ配列中の１ヌクレオチドではなく全ヌクレオチドの配列とマッチする可能性もあり、単一のミスマッチを含有する配列は、オフターゲット部位を含む。２０ヌクレオチドターゲット配列に対するオフターゲット配列へのガイド配列の相対的結合は、ガイド配列とオンターゲット配列の間およびオフターゲット配列の間のそれぞれの結合エネルギーおよび速度論的平衡によって制御される。
オリゴヌクレオチドの結合エネルギー差は制御され、ＤＮＡおよびＲＮＡ結合の協同効果によって最大化され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡ結合についてハイブリダイゼーション中の協同性が２つの方法で定義されている。第一に、オリゴヌクレオチドが、その個々のヌクレオチドサブユニットに結合し始めた場合、ヌクレオチドサブユニットの相補的核酸塩基との結合は、オリゴヌクレオチド配列内の次の隣接サブユニットの逐次的結合にプラスの効果をもたらす。同時に、個々のヌクレオチドの結合解除は、次の隣接ヌクレオチドの結合にマイナスの効果をもたらす。ミスマッチが塩基対形成を試みた場合、ミスマッチ対の結合解除は、隣接ヌクレオチド対の結合にマイナスの効果をもたらし、同様に、マッチしたヌクレオチド対がうまく結合した場合、それは、隣接ヌクレオチド対の結合にプラスの効果をもたらす。全体的なエネルギーの観点から、オリゴヌクレオチドが、漸増するいくつもの段階を踏んで結合し、かつ結合解除を起こす個々のヌクレオチドサブユニットとして結合し始めた場合、中間状態は、それらの段階が互いに独立して起こるシステムと比較して確率的に割合が少なくなる。言い換えると、結合状態または非結合状態以外の動力学的状態の自由度はわずかであり、数もわずかである。分子の観点から、ヌクレオチドの連なりは、やや剛性であり、ヌクレオチドが結合すると、隣接ヌクレオチドには、結合につながるもの以外に採用することができるエネルギーの確証（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎｓ）がほとんどない。ＤＮＡとＲＮＡの協同的結合を保持するための分子の剛性の必要性は、ほぼ３０年前にＺ．Ａ．Ｓｈａｂａｒｏｖａ（１９８８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．１４：１２，１６５６－６２によって初めて実証された。化学ライゲーションを使用することによって１，３－ジアミノプロパンまたは１，３－プロパンジオール結合により共有結合によって連結された、各々が７ヌクレオチドの長さの２つのオリゴヌクレオチドから、１４ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドが構築された。その可動性オリゴヌクレオチドを、相補的な１４ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合させ、結合エネルギーが測定された。天然ＤＮＡ主鎖の剛性がないとき、可動性１４ヌクレオチドＤＮＡの一本鎖は、協同性を欠く２つの独立した７ヌクレオチドＤＮＡオリゴヌクレオチドであるかのごとく、有意により低いエネルギーで結合した。協同性として公知のこの観察された現象は、非協同的な系で見られるであろうものより高いマッチ対ミスマッチの区別を可能とするものであり、およびヌクレオチド配列の特異性を増大させるための重要な構成要素である。Ｃａｓタンパク質は、シード領域の１０ヌクレオチドをＡ型ヘリックスの一本鎖部分に事前に秩序づけることが結晶構造によって示されてきた。ＲＮＡのＡ型ヘリックスへの事前の秩序づけは、ｇＲＮＡのガイド配列が採ることができる動力学的状態の数を制限し、したがって、シード領域におけるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションの協同性を増大させる。
ヌクレオチドの連なりと前記ヌクレオチドの相補的な連なりとの全結合エネルギーは、通常は融解温度（Ｔｍ）によって定義される。融解温度は、結合している２本のヌクレオチドの連なりまたは鎖（すなわち、塩基対形成またはハイブリダイゼーションによって結合しているもの）を、それらが５０％結合しており、５０％非結合であるところまで解離させるのに必要な温度である。融解温度は、濃色効果として公知の現象によって測定される。ＵＶ吸収は、２本の結合しているオリゴヌクレオチド鎖が加熱によって分離されているときに増大される。オリゴヌクレオチドの熱変性に起因して二重ヘリックス構造が巻き戻されて一本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。溶液中の結合している２つのオリゴヌクレオチドが、それらの融解温度より高い温度に加熱されると、二本鎖は巻き戻って、二本鎖より多くの光を吸収する２本の一本鎖を形成する。ＵＶ吸光度が、温度の関数としてグラフに描かれる場合、二本鎖が解離し始める時点でシグモイド曲線が得られ、そのシグモイド曲線の中点がＴｍとして定義される。
図４は、オリゴヌクレオチド二本鎖が加熱によって別個の鎖に分離するにつれてＵＶ吸光度がどのように上昇するのかを実証するグラフである。シグモイド曲線は、別個の鎖への二本鎖の解離を表し、シグモイド曲線の中点が、二本鎖のＴｍである。この曲線は、生理的塩濃度での２０ヌクレオチドＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度が、およそ５０℃であることを示す。
オリゴヌクレオチド二本鎖は、二本鎖の５０％しか形成されない融解温度で最大のマッチ対ミスマッチ特異性を有する。この温度で、二本鎖の結合および結合解除が高い協同度を有するか、または急勾配のシグモイド曲線を示す場合、オフターゲットポリヌクレオチドでの単一のミスマッチによって、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが阻止されることになる。遺伝子編集実験が３７℃で実施される場合には、その標的との結合が３７℃のＴｍを有することになるガイドＲＮＡを使用してマッチ対ミスマッチの最良の判別が達成されることになる。ここでの問題点は、この態様が、一本鎖核酸の熱力学のみに基づいており、これとは対照的に、３７℃のＴｍを有するガイドＲＮＡが、その二本鎖標的と部分的にしか結合せず、その結果、低い全活性または遺伝子編集をもたらすことになる点である。それでもなお、活性をモニターしながら漸進的にガイドＲＮＡのその標的への全Ｔｍを低下させることによって、特異性は増大されるはずである。この原理は、Ｙａｎｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，２７９－２８４によって、ガイドＲＮＡを２０ヌクレオチドから１７ヌクレオチドの長さに末端切除することによって実証され、彼らは、オンターゲットゲノム変種効率を犠牲にすることなく特定のオフターゲット部位での特異性の５，０００倍増大を主張した。生理的塩条件でのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖中のＲＮＡの末端切除は、その二本鎖のＴｍを塩基対あたり約２℃低下させる。ｇＲＮＡ中のガイド配列の１７ヌクレオチドへの末端切除は、およそ６℃、結合エネルギーを減少させ、その結果として二本鎖Ｔｍはおよそ４２℃になる。しかし、ガイド配列が２０ヌクレオチドから１７ヌクレオチドに末端切除された場合、有意な情報内容が失われ、その結果、全ゲノムにわたって１７ｎｔガイド配列と同一または同様のオフターゲット部位数の増加をより容易に見いだすことができる。より有用なアプローチは、結合と結合解除の協同性を保持しながら化学修飾によって２０ヌクレオチドＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の結合エネルギーを減少させるアプローチであるだろう。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集のためのガイドＲＮＡ、または標的ポリヌクレオチドの切断またはニッキングのためのガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡまたは２ピースデュアルガイドＲＮＡのいずれかとして存在し、前記２ピースは、ｃｒＲＮＡ（クラスター化したリピートＲＮＡ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｐｅａｔ ＲＮＡ））およびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化性のクラスター化したリピートＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｐｅａｔ ＲＮＡ））とも称される。上記図２Ａおよび２Ｂを参照のこと。図５Ａもまた、単一ガイドＲＮＡまたは２ピースのデュアルガイドＲＮＡ５０１（この場合、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ハイブリダイズされた二本鎖を形成する）を示す。左から右へ（すなわち、ガイドＲＮＡの５’末端から３’末端へ）進めて、図５Ａは、一般に、ガイドＲＮＡ上の伸長部５０３（オーバーハングと称されることもある）と、サンプリングおよびロッキング領域５０５と、Ｃａｓタンパク質結合シード領域５０７（通常は１０ｎｔ部分）と、デュアルガイドステム５０９またはシングルガイドステムループ５１１と、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域５１３とを示す。Ｃａｓ９タンパク質は、おそらく５０３を除いて、これらのｇＲＮＡ領域のいずれかまたはすべてに結合することができる。ガイド配列は、ロッキング、サンプリングおよびシード領域を含む。単一ガイドＲＮＡとデュアルガイドＲＮＡの両方について、ガイドＲＮＡの５’末端上の約２０ヌクレオチドのガイド配列は、標的ＤＮＡと結合し、安定した二本鎖を形成するものである。同様の配列のその他の部位との競合ハイブリダイゼーションに対するこのハイブリダイゼーション結合が、標的に対するｇＲＮＡの全特異性、およびしたがってｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によるゲノム編集またはゲノム不活性化の特異性を決める。
ガイドＲＮＡのそれらの標的ポリヌクレオチドとの結合は、ガイド配列の３’末端により開始されるＣａｓ９媒介性シードＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖形成によって起こる。最初のシード二本鎖が形成されると、ｇＲＮＡは、その５’末端に向かってジッパーのようにハイブリダイズし続けるはずである。
図５Ｂは、ｇＲＮＡ５０１およびゲノムＤＮＡ５１５からのシード二本鎖５１７の最初の形成後にヌクレオチドの結合が続いてサンプリング領域を通って進行する方法を示す。サンプリング領域は、シード領域に隣接する領域であり、これらのヌクレオチドのハイブリダイゼーション結合は、二本鎖の結合エネルギーが、その結合が起こる温度とほぼ同等になるまで、進行する。この領域における結合および結合解除の速度は、結合対非結合ＲＮＡ（例えば、５０１対５１９、または５０１対５２１）のより大きい平衡によって制御され、この平衡もまた、Ｃａｓ９タンパク質の相互作用によって制御される。生理的塩濃度かつ３７℃においてゲノムＤＮＡとともにＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成するガイドＲＮＡの場合、通常のサンプリング領域は、１５～１６ヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖がおおよそ３７℃のＴｍを有するという事実に基づいて、１０ヌクレオチドのシード領域のすぐ５’側の５～６ヌクレオチドにわたる。結合ヌクレオチド数がＴｍ閾値を超えると、結合は、ロッキング領域を通って、ガイド配列の２０ヌクレオチドが結合した状態になるまで、逐次的に継続し、標的相補的伸長部または５’ハングがガイド配列の５’末端に存在する場合、結合はさらに進行し得る。結合がロッキング領域に達すると、結合ＲＮＡ対非結合ＲＮＡ（例えば、５０１対５２３）間の平衡は、その結合解除、または標的ポリヌクレオチドの放出が、そのときには有意に結合またはハイブリダイズ状態の方向にある結合対非結合ＲＮＡの全平衡によってマイナスの影響を受けるように、変化する。結合対非結合ＲＮＡのより大きい平衡が特異性にもたらす効果が、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６），“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，８４－８によって明らかにされた。Ｓｌａｙｍａｋｅｒらは、タンパク質の核酸結合溝（またはｎｔ溝）中の正の電荷を有するアミノ酸を、中性電荷を有するアラニン残基に変換することによって、オフターゲットのインデル形成が減少したＣａｓ９タンパク質を遺伝子操作により作製したことを報告した。これらの変化は、Ｃａｓ９によって媒介されるガイドＲＮＡの二本鎖標的ＤＮＡに対する全親和性を低下させ、塩基対認識を含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションに親和性がより大きく依存するようにさせる。
図５Ｃは、個々の塩基対の結合エネルギーを減少させるが、高い協同性レベルを保持するヌクレオチドの化学修飾を、ｇＲＮＡ５２５のシードおよびサンプリング領域において使用して、５または６ヌクレオチドを超えてサンプリング領域を伸長する方法を示す。この効果は、化学修飾が、結合が起こる温度と同等のハイブリダイゼーション結合エネルギーを獲得するために必要なヌクレオチドの数を増加させるので、ガイドＲＮＡ５２５のゲノムＤＮＡ５１５との結合の特異性を有意に増大させることができる。同様の効果で、結合対非結合ＲＮＡ（５２５対５２７、または５３１対５３３）のより大きい平衡をシフトさせるために必要なヌクレオチドの総数が増加され、これは、配列特異性の全体的増加が結果として得られるように計算される。
ヌクレオチド修飾を使用して、複素環式核酸塩基、糖、およびヌクレオチド間リン酸連結の、ガイド配列部分内の３つの異なるモチーフのいずれかによって、部分的に相補的なオフターゲットポリヌクレオチドに向けてのｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の活性を減少させることができるという発見は、驚くべきことであり、予期されなかった。化学修飾（複数でもよい）を有するｇＲＮＡでは、修飾が、非特異的結合を有意に増加させないことまたはハイブリダイゼーションの協同性を有意に低下させないことが重要である。どちらかまたは両方ともが、Ｃａｓタンパク質によるオフターゲット結合、ニッキングまたは切断を促進することができ、これは望ましくないからである。
ガイド配列中の核酸塩基の中で、塩基対形成に利用可能な原子の数を減少させ、このようにして、ハイブリダイゼーションを駆動する水素結合の可能性を低下させることができる。しかし、水素結合の可能性を低下させることはまた、代替塩基対形成によるオフターゲットポリヌクレオチド配列の認識を増加させ得る。これを回避するために、ガイド配列中の高特異性塩基対形成を使用することが重要である。高い特異性を促進するための核酸塩基の修飾の例は、ガイド配列中のウリジンの代わりに２－チオウリジンを組み込むことである。２つの水素結合によってアデノシンヌクレオチドと通常は結合するウリジンヌクレオチドは、その代わりにグアニンヌクレオチドと結合して、かなり弱い塩基対を生じさせることができ、この塩基対は、Ｇ－Ｕゆらぎ対と称されることが多い。２－チオウリジンがウリジンの代わりに使用される場合、２－チオウリジンは、安定したＧ－Ｕゆらぎ対を形成するとしても少数のみである。なぜなら、ウラシル塩基のＣ２位の硫黄置換基は水素結合アクセプターとして役立つことができないからである。
Figure 0007093728000001
この同一の戦略は、例えば、２－チオシチジンまたは４－チオグアノシンのどちらかを使用することにより、可能性ある水素結合の数を３から２に低減させることによって、通常のグアノシン／シチジン塩基対の水素結合の可能性を低下させるために使用することができる。修飾Ｇ－Ｃ塩基対中で水結合を形成するそれらの減少の可能性が、ここで例証される。
Figure 0007093728000002
リボヌクレオチドの糖部分の修飾もまた、相補的ＤＮＡ鎖へのガイド配列の親和性を低下させるために使用することができる。これは、２つの方法で行うことができ、第１の方法は、糖パッカーを変化させる方法であり、第２の方法は、立体的な混み合いによってＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を変形させる方法である。一般に、糖パッカーは、２’－エンド（ｓｏｕｔｈ、ＤＮＡ様）糖パッカー、または３’－エンド（ｎｏｒｔｈ、ＲＮＡ様）糖パッカーの、２つの状態のうちのどちらか一方であるするように記載される。２’－エンドパッカーは、塩基対形成に対する不安定化効果があると考えられ、これは、グリコシド結合のねじれ角の変化の結果であり、したがって、親和性が最も高い塩基スタッキング構造の形成を防止すると考えられる。塩基対形成に対する不安定化効果を生じさせる結果となり得るＲＮＡへの修飾の例は、デオキシリボース、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル、２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル、２’－Ｏ－フェニル、２’－チオフェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノおよび２’－Ｏ－置換フェニル置換基である。
ヌクレオチド間結合の修飾は、塩基対ハイブリダイゼーションの協同性を維持しながらヌクレオチドの結合親和性を低下させることもできる。これらの例は、ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノカルボン酸、チオホスホノカルボン酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピオン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネート、およびボラノホスホネートである。
特定の実施形態では、全ガイドＲＮＡの結合エネルギーを増加または減少させる糖修飾または核酸塩基修飾を加えて、ガイドＲＮＡへのその他の修飾の組込みからの結合エネルギーを調節またはさらに微調整することができる。一例として、２’－Ｏ－メチル－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）の組込みは、非修飾ガイド配列と比較して≒１．５度、ガイドＲＮＡの結合エネルギーを減少させることになる。２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、ガイド配列の他の箇所に組み込まれると、全結合エネルギーを≒０．２度増加させることになり、結果として得られるガイドＲＮＡは、非修飾ガイドＲＮＡと比較して≒１．３度の全結合エネルギーの減少を有することになる。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含み、これは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知である。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－ハロ、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌ、または２’－Ｉを含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－Ｈ（例えば、２’－デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－ＬＮＡまたは２’－ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む。
特定の実施形態では、全ガイドＲＮＡの結合エネルギーを増加または減少させるヌクレオチド糖修飾または核酸塩基修飾を同一ヌクレオチドに組み込むことができ、この場合、修飾ヌクレオチドの結合エネルギーを調節するためにホスホジエステル連結が修飾される。一例として、３’－ホスホノカルボン酸連結を、糖修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｆ、または２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）とともに使用することができる。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含み、これは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知である。特定の実施形態では、糖は、２’－ハロ、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌ、または２’－Ｉを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｈ（例えば、２’－デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＬＮＡまたは２’－ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む。
［ＩＩＩ．ガイドＲＮＡ］
少なくとも１つの態様では、本発明は、ガイドＲＮＡ機能性を有する化学修飾されたガイドＲＮＡを含む。化学修飾されたガイドＲＮＡは、少なくとも１つの特異的増強性修飾を含み、特異性増強より多くの機能または特異性増強とは異なる機能を有するその他の化学修飾を含むこともある。
非天然であるか天然であるかに関わらず４種の標準リボヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ以外の任意のヌクレオチド（例えば、シュードリジン、イノシンまたはデオキシヌクレオチド）を含むガイドＲＮＡは、化学修飾されたガイドＲＮＡである。同様に、天然ホスホジエステルヌクレオチド間連結以外の任意の骨格またはヌクレオチド間連結を含むガイドＲＮＡは、化学修飾を有し、従って、化学修飾されたガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、保持される機能性として、Ｃａｓタンパク質と結合することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、標的ポリヌクレオチドと結合することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を、標的ポリヌクレオチドに標的化することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって標的ポリヌクレオチドにニックを入れることが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって標的ポリヌクレオチドを切断することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性は、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質を有する人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、Ｃａｓタンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系におけるガイドＲＮＡの任意のその他の公知の機能である。特定の実施形態では、保持される機能性は、天然ガイドＲＮＡの任意のその他の機能である。
［Ａ．例示的修飾］
特定の実施形態では、特異性増強修飾は、デオキシリボースヌクレオチド；２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシルヌクレオチド；２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシルヌクレオチド；２’－Ｏ－フェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノもしくは２’－Ｏ－置換フェニルを有する糖；またはそれらの組合せである。特定の実施形態では、特異性増強修飾は、ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピオン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネートもしくはボラノホスホネート、または前述のもののいずれかの組合せである。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド糖修飾は、デオキシリボース；２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル；２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル；ならびに２’－Ｏ－フェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノおよび２’－Ｏ－置換フェニルを有する糖からなる群から選択される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれるヌクレオチド間連結修飾は、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ））、ホスホノ酢酸「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））などのホスホノカルボン酸（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、チオホスホノ酢酸「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））などのチオホスホノカルボン酸（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）などのアルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））およびジチオリン酸（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド間連結修飾は、ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピオン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネートおよびボラノホスホネートからなる群から選択される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる核酸塩基（「塩基」）修飾は、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－エチニルシトシン、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、構造不定の核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「イソＧ」）、イソシトシン（「イソＣ」）［“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｉｎｔｏ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｐｈａｂｅｔ．”Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，Ｊ．Ａ．；Ｋｒａｕｃｈ，Ｔ．；Ｍｏｒｏｎｅｙ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３，３３に記載されるような］、５－メチル－２－ピリミジン（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ，Ｈ．Ｐ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３０４７に記載されるような）、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）およびｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、１種または複数の同位体的修飾が、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル連結および／またはヌクレオチドホスフェート上に導入される。このような修飾として、トレーサーとして使用される１種または複数の１５Ｎ，１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子またはその他の原子または元素を含むヌクレオチドが挙げられる。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる「末端」修飾は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ，Ｓ，Ｎ）置換炭化水素スペーサー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト－、カルボキシル－、アミド－、チオニル－、カルバモイル－、チオノカルバマオイル含有炭化水素スペーサーを含む）、スペルミンリンカー、例えば、６－フルオレセイン－ヘキシルなどのリンカーと結合している蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）を含む色素、クエンチャー（例えば、ダブシル、ＢＨＱ）およびその他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチドおよび／またはタンパク質）からなる群から選択される。特定の実施形態では、「末端」修飾は、ガイドＲＮＡの、オリゴヌクレオチド（デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンおよび／またはその他の分子を含む別の分子とのコンジュゲーション（または連結）を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる「末端」修飾は、例えば、ホスホジエステル連結として組み込まれており、ガイドＲＮＡ中の２つのヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカー（以下に表される）などのリンカーを介してガイドＲＮＡ配列中の内部に位置する。
Figure 0007093728000003
その他のリンカーとして、例えば、例として、これに限定されないが
Figure 0007093728000004
 を含む。
特定の実施形態では、末端修飾は、アミン、チオール（またはスルフヒドリル）、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲンまたは官能基で終端したリンカーなどの末端官能基を含み、そのいずれかは続いて、所望の部分、例えば、蛍光色素または非蛍光標識またはタグまたは例えば、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンなどの任意のその他の分子とコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、これらに限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、ＤＣＣ（またはＤＣＩ）を介したカップリングを含む当技術分野で周知の標準化学および／または任意のその他の標準方法を使用する。
特定の実施形態では、標識または色素は、ｇＲＮＡ中の修飾されたヌクレオチドに結合またはコンジュゲートされる。蛍光色素または非蛍光標識もしくはタグ（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１５Ｎ，１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉなどといった同位体標識を含有する部分）などのその他の部分または例えば、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンもしくはその他の分子などの任意のその他の分子のコンジュゲーションは、いわゆる「クリック」ケミストリーまたはいわゆる「スクレート」コンジュゲーションケミストリーを使用して実現され得る。「クリック」ケミストリーとは、例えば、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである、Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒ，Ａ．Ｈ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．“Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ”，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１０，３９，１３８８－１４０５ ａｎｄ Ｍｏｊｉｂｕｌ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ ＸｉａｏＨｕａ，Ｐ．，ＤＮＡ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｃｉ．Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍ．，２０１４，５７：２，２１５－３１に記載されるような以下のスキーム：
Figure 0007093728000005
 によって示されるような２つの部分間のトリアゾロ連結につながる、アジド部分を用いるアルキン部分の［３＋２］環化付加を指す。
特定の実施形態では、コンジュゲーションは、π－コンジュゲートジエン部分の、アルケン部分を用いるディールズ・アルダー［４＋２］環化付加などの代替的な環化付加によって実現され得る。
「スクアレート」コンジュゲーションケミストリーは、スクアレート誘導体を介し、それぞれがアミンを有している２つの部分を連結して、スクアレート部分を含有するスクアレートコンジュゲートをもたらす（例えば、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである、Ｔｉｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１２４，１２１５－２１を参照のこと）。例えば、以下のスキームに記載されるように、リンカーアミンを含有するフルオレセインが、スクアレートリンカーを介してアミンを含有するオリゴリボヌクレオチドにコンジュゲートされる。スクアレートリンカーの一例は、以下のスキーム中に表されている。
Figure 0007093728000006
［Ｂ．少なくとも１つの特異性増強修飾を有するガイドＲＮＡ］
一態様では、本技術は、修飾されたｇＲＮＡおよび任意選択的に特異性増強修飾により構成される、少なくとも１つの特性増強性修飾を有するガイドＲＮＡを提供する。
特定の実施形態では、少なくとも１つの特異性増強修飾は、ガイドＲＮＡのガイド配列またはｃｒＲＮＡセグメント内にある。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡのガイド配列内にある。特定の実施形態では、修飾は、ガイド配列またはｃｒＲＮＡセグメントの５’末端の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、修飾は、ガイド配列またはｃｒＲＮＡセグメントの最初の４つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、修飾は、ガイド配列またはｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、修飾はまた、ｃｒＲＮＡセグメントの５’－オーバーハング内にある。ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整数である、特定の実施形態では、少なくとも１つの特異性増強修飾は、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド５－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１０－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１９－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１８－Ｎ内にある。特定の実施形態では、修飾は、ヌクレオチド４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、またはそれらの組合せにおけるものである。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのガイド配列部分に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の特異性増強修飾されたヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡの他の部分またはセグメントに１００以下のさらなる修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、ガイド配列部分上に５’伸長部またはオーバーハングを含み、前記伸長部は、１～２０ヌクレオチドの長さであり、これは、ｇＲＮＡのガイド配列部分中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の特異性増強修飾されたヌクレオチドに加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の特異性増強修飾されたヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡの他の部分に１００以下のさらなる修飾されたヌクレオチドを任意選択的に含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡのすべてのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、すべての修飾は同一である。特定の実施形態では、すべての修飾されたヌクレオチドは、同一種類の修飾を有する。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、異なって修飾されたヌクレオチドの組合せを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、２つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、３つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは連続して配置される。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。修飾されたヌクレオチドは各々、１種または複数の種類の修飾を独立に含み得る。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡの配列中、修飾されたヌクレオチドは連続しないか、すべてではなく一部が連続している。
特定の実施形態では、化学修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内である。ガイドＲＮＡが、デュアルガイドＲＮＡである場合、５’部分内の化学修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメントの５’部分内の修飾を指し、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの５’部分内の修飾を指さない。ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである場合、そのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメント内に位置する１つの５’部分を有する。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの内部領域内（すなわち、５’末端と３’末端の間）である。
特定の実施形態では、化学修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの５’部分または３’部分中に、特に、５’部分の最初の５もしくは１０のヌクレオチド内に、または３’部分の最後の５もしくは１０のヌクレオチド内に組み込まれる。いくつかのその他の実施形態では、修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの５’部分および３’部分の両方中に、特に、５’部分の最初の５または１０のヌクレオチド内および３’部分の最後の５または１０ヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、２以上の種類の修飾が、ガイドＲＮＡの５’部分および３’部分の両方中に存在する。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端に、３’末端におよび内部配列内に位置する。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’部分中に４０個以下の、あるいは２０個以下の、あるいは１５個以下の、あるいは１０個以下の、あるいは５個以下の、あるいは３個以下のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。ガイドＲＮＡが、デュアルガイドである場合、各ＲＮＡ分子は、５’末端、３’末端、または両方に修飾を含むことができる。特定の実施形態では、末端（５’、３’、または両方）の連続するヌクレオチド、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの連続するヌクレオチドが、修飾されている。
一般に、ガイド配列は、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎは、－１０から１０の間（任意選択的に１０～６の間）の整数である。Ｎは、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択することができる。例えば、ガイド配列は、２０ヌクレオチド長（Ｎ＝０）、１９ヌクレオチド長（Ｎ＝１）、２１ヌクレオチド長（Ｎ＝－１）などであり得る。特定の実施形態では、ガイド配列は、ヌクレオチド位置（ガイド配列の５’末端から出発して）４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎもしくは１６－Ｎ、またはそれらの組合せの位置に少なくとも１つの特異性増強修飾を含む。２、３の例が下記で説明される。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０からなり、位置４、５、７、９、１０および１１から選択される少なくとも１つのヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１９からなり、位置３、４、６、８、９および１０から選択される少なくとも１つのヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１８からなり、位置２、３、５、７、８、および９から選択される少なくとも１つのヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１７からなり、位置１、２、４、６、７および８から選択される少なくとも１つのヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１６からなり、位置１、３、５、６および７から選択される少なくとも１つのヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１５からなり、位置２、４、５および６から選択される少なくとも１つのヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２１からなり、ヌクレオチド５、６、８、１０、１１および１２のうちの少なくとも１つに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２２からなり、ヌクレオチド６、７、９、１１、１２および１３のうちの少なくとも１つに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド２０－Ｎ（ここでのＮは、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整数である）からなり、４－Ｎ～２０－Ｎの任意のヌクレオチドに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎから選択される少なくとも２つのヌクレオチドに修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、ヌクレオチド４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎ、または１６－Ｎに少なくとも１つの修飾を含み、４－Ｎ～２０－Ｎから選択される（しかし１５－Ｎではない）ヌクレオチドに少なくとも別の修飾も含む。特定の実施形態では、４－Ｎ～２０－Ｎから選択されるヌクレオチドは、５－Ｎ、６－Ｎ、７－Ｎ、８－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１６－Ｎ、または１７－Ｎである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾をさらに含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０からなり、位置５、６、７、８、９、１０、１６および１７から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０およびヌクレオチド１７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレオチド１７にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１９からなり、位置４、５、６、７、８、９、１５および１６から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレオチド１６にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１８からなり、位置３、４、５、６、７、８、１４および１５から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１５にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１７からなり、位置２、３、４、５、６、７、１３および１４から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１４にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１６からなり、位置１、２、３、４、５、６、１２および１３から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１３にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１５からなり、位置１、２、３、４、５、１１および１２から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１２にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１４からなり、位置１、２、３、４、１０および１１から選択されるヌクレオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド１１にある。
特定の実施形態では、化学修飾は、５’末端修飾または３’末端修飾などの末端修飾を含む。末端修飾の例として、これらに限定されないが、リン酸化（例えば、アルキルホスホネート、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ボラノホスホネート、ホスホロチオエート、ジチオリン酸などといった、天然リン酸基またはポリリン酸基としてまたは修飾されたリン酸基として）、ビオチン化、コンジュゲート化またはコンジュゲートされた分子、リンカー、色素、標識、タグ、官能基（例えば、これらに限定されないが、５’－アミノ、５’－チオ、５’－アミド、５’カルボキシなど）、逆連結、またはエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エステル、ヒドロキシル、アリール、ハロ、ホスホジエステル、二環式、複素環式もしくはその他の有機官能基を含み得る炭化水素部分を含む。特定の実施形態では、末端修飾は、ジメトキシトリチルを含む。
特定の実施形態では、化学修飾は、修飾された塩基を含む。本明細書において、「非修飾」塩基として、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された塩基の例は、これらに限定されないが、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシルおよび５－アミノアリル－シトシンなどの合成および天然塩基を含む。特定の実施形態では、修飾は、脱塩基ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾は、ＺまたはＰ、イソＣまたはイソＧ、ＵＮＡ、５－メチルピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）またはｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）などの非標準プリンまたはピリミジン構造を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の修飾された塩基を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての塩基が、修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された糖を含む。修飾された糖の例は、これらに限定されないが、２’位に修飾または４’位に修飾を有する糖を含む。例えば、特定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）などの２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知である２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）などの２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌまたは２’－Ｉなどの２’－ハロを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｈ（例えば、デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＬＮＡまたは２’－ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾された糖を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された骨格（すなわち、天然ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。修飾されたヌクレオチド間連結の例は、これらに限定されないが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、キラルホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結などのＣ１－４アルキルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結などのホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結などのホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、例えば、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結などのチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結などのチオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべてのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ＭｅＣ、５－ＭｅＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシン、脱塩基ヌクレオチド、Ｚヌクレオチド、Ｐヌクレオチド、ＵＮＡ、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）ヌクレオチド、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）ヌクレオチド、３’－ホスホロチオエート基、３’－ホスホノ酢酸基、３’－ホスホノ酢酸エステル基、３’－チオホスホノ酢酸基、３’－チオホスホノ酢酸エステル基、３’－メチルホスホネート基、３’－ボラノホスホネート基、もしくは３’－ホスホロジチオリン酸基またはそれらの組合せである、またはこれらを含む。
特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、Ｚ塩基を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、Ｐ塩基を含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（Ｉ）
Ｗ－ＹまたはＹ－Ｗ（Ｉ）
［式中、Ｗは、少なくとも１つの特異性増強修飾を含むオリゴヌクレオチドのヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチを表し、Ｙは、オリゴヌクレオチドの非修飾部分を表す］によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの５’部分内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の４つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にヌクレオチド４～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド５～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１０～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１９内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１８内にある。
特定の実施形態では、Ｗは、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ＭｅＣ、５－ＭｅＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシン、脱塩基ヌクレオチド、Ｚヌクレオチド、Ｐヌクレオチド、ＵＮＡ、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。
特定の実施形態では、Ｗは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは各々、同一修飾を含む。特定の実施形態では、Ｗは、多様に修飾されたヌクレオチドの組合せを含む。特定の実施形態では、Ｗは、２以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ｗは、３以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して配置されない、または少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、連続して配置される。特定の実施形態では、Ｗは、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも３つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも４つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも５つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
特定の実施形態では、修飾は、安定性変更性修飾である。安定性とは、ヌクレアーゼなどの酵素ならびに細胞内および細胞外環境中に存在するその他の物質による分解に抵抗するｇＲＮＡの能力を指す。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増大し、したがって、ガイドＲＮＡの安定性を増強する。特定の実施形態では、安定性を変更する修飾は、安定性を増強する修飾（安定性増強修飾）である。例えば、特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌまたは２’－Ｉなどの２’－ハロヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－ＭＯＥまたは２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－ＮＨ２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－Ｈ（または２’－デオキシ）ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、４’－チオリボシル糖部分を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－チオホスホノ酢酸基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－メチルホスホネート基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－ボラノホスフェート基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－ジチオリン酸基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。
特定の実施形態では、修飾は、特異性を変更する修飾（特異性変更修飾）である。いくつかの実施形態では、特異性の増強は、オンターゲット結合および／もしくは切断を増強すること、またはオフターゲットの結合および／もしくは切断を低減すること、または両方の組合せによって達成され得る。いくつかのその他の実施形態では、特異性の低減は、例えば、オンターゲット結合および／もしくは切断を低減すること、またはオフターゲットの結合および／もしくは切断を増大すること、または両方の組合せによって達成され得る。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２’－Ｏ－メチルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２’－フルオロなどの２’－ハロを含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－チオウラシル塩基（２－チオＵ）を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－チオＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、４－チオＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、６－チオＧを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－アミノＡを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－アミノプリンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、シュードウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ヒポキサンチンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、７－デアザグアニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、７－デアザ－８－アザグアニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、７－デアザアデニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、７－デアザ－８－アザアデニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－メチルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－メチルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－ヒドロキシメチルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－ヒドロキシメチルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５，６－デヒドロウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－プロピニルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－プロピニルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－エチニルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－エチニルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－アリルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－アリルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－アミノアリルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－アミノアリルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、脱塩基ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、Ｚ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、Ｐ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ＵＮＡ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、イソＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、イソＧを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－メチル－ピリミジンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）を含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、メチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ボラノホスフェートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ＬＮＡを含む。
特定の実施形態では、修飾は、例えば、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）を変更することによって、ＲＮＡ塩基対形成を変更する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのＴｍを低下させる。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのＴｍを上昇させる。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、ガイド配列は、修飾を有しない同様の二本鎖と比較して、ｇＲＮＡ：標的ポリヌクレオチド二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を変更することによって、標的ポリヌクレオチド内のガイド配列の塩基対形成を変更する、１つまたは複数の修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しない同様の二本鎖と比較して、ｇＲＮＡ：標的ポリヌクレオチド二本鎖のＴｍを低下させる。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる。特定の実施形態では、特異性増強修飾は、ガイドＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとを含む第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、例えば、該Ｔｍを約１℃～約１３℃、あるいは約１℃～約６℃低下させることによって、少なくとも約１℃、あるいは少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、および／または約６℃以下、あるいは約８℃以下、あるいは約１０℃以下、あるいは約１３℃以下、低下させる。特定の実施形態では、特異性増強修飾は、ガイドＲＮＡとのオフターゲットポリヌクレオチドとを含む第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、例えば、該Ｔｍを約１℃～約１３℃、あるいは約１℃～約６℃低下させることによって、少なくとも約１℃、あるいは少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、および／または約６℃以下、あるいは約８℃以下、あるいは約１０℃以下、あるいは約１３℃以下、低下させる。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を変更する化学修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を増大させる。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を減少させる。特定の実施形態では、修飾は、リン酸上の陰イオン電荷を中和し、細胞への受動拡散を可能にする。特定の実施形態では、電荷中和性修飾は、ホスホノ酢酸メチルエステルヌクレオチド間連結などのホスホノ酢酸アルキルエステルヌクレオチド間連結を含む。ｇＲＮＡの開発に関連するさらなる考慮事項としては、トランスフェクト能力および免疫賦活特性が挙げられる。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、細胞への、特に真核細胞の核への効率的で滴定可能なトランスフェクト能力を促進する、およびトランスフェクトされた細胞における免疫賦活特性を低減させる、化学修飾を含む。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、意図される細胞、組織、体液または生物内に有効に送達すること、および所望のｇＲＮＡ機能性を可能にするのに十分な期間、そこで維持することを促進する、化学修飾を含む。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの免疫賦活性効果を変更する化学修飾を含む。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性と特異性の両方を増強する化学修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性とトランスフェクション効率の両方を増強する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの特異性とトランスフェクション効率の両方を増強する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの全体的な有効性を増強する。
特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、１より大きい特異性スコアを有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．１の特異性スコアを有する。したがって、特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．１、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、または少なくとも約５５の特異性スコアを有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約２～約６０の特異性スコアを有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約１０～約６０の特異性スコアを有する。
特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１％のオンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約５％のオンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１０％のオンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、少なくとも約３０％のオンターゲット切断を有する。したがって、特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のオンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約２５％～約９９．９％のオンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約５０％～約９９．９％のオンターゲット切断を有する。
特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、１より大きいオン：オフ比を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．１：１のオン：オフ比を有する。したがって、特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．１：１、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約４５：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約７０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約９０：１、少なくとも約９５：１、または少なくとも約９９：１のオン：オフ比を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．５：１～約９９．９：１のオン：オフ比を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１０：１～約９９．９：１のオン：オフ比を有する。
［Ｃ．修飾の組合せを有するガイドＲＮＡ］
一態様では、本技術は、２以上の修飾の組合せを有するガイドＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、２つの修飾は、同一ヌクレオチド上にある（例えば、１つのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸部分を含む）。その他の実施形態では、２つの修飾は、２つの異なるヌクレオチド上にある（例えば、１つのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル基を有し、別のヌクレオチドが３’－ホスホノ酢酸部分を有する）。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中の各修飾は、同一である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中の少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡ中のその他の修飾の少なくとも１つとは異なっている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、異なる種類の修飾の組合せを含み、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、ガイドＲＮＡ中の複数の場所に存在する。特定の実施形態では、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、ガイドＲＮＡ中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回現れる。
特定の実施形態では、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、２つ以上の修飾されたヌクレオチド中に現れる。特定の実施形態では、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、３つ以上の修飾されたヌクレオチドに現れる。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して配置されない、または少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、連続して配置される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、同一種類の連続する修飾されたヌクレオチドのストレッチを含む。特定の実施形態では、ストレッチは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の修飾されたヌクレオチドを有する。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された糖を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の修飾された糖を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されている。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された骨格（すなわち、天然ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべてのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、連続する修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の連続する化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ヌクレオチド１および２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、２および３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、または２～１０にある。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アミノ、２’－デオキシ、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、２－チオウラシル、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、５－アミノアリルウラシル、Ｚ塩基、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノ酢酸、３’－ホスホノ酢酸エステル、３’－チオホスホノ酢酸、３’－チオホスホノ酢酸エステル、３’－メチルホスホネート、３’－ボラノホスホネート、３’－ジチオリン酸またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ、Ｚ塩基、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｆ、２－チオＵ、４－チオＵ、２－アミノＡ、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－アミノアリルＵまたはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、末端ホスフェート、ＰＥＧ、末端アミン、炭化水素リンカーなどの末端リンカー、置換炭化水素リンカー、スクアレートリンカー、トリアゾロリンカー、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーなどの内部リンカー、色素とコンジュゲートしているリンカー、非蛍光標識とコンジュゲートしているリンカー、タグとコンジュゲートしているリンカーまたは例えば、ビーズもしくはマイクロアレイなどの固相支持体とコンジュゲートしているリンカーなどの「末端」修飾である。特定の実施形態では、組合せ中の修飾の少なくとも２つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結または２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾の少なくとも２つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。その他の実施形態では、組合せ中の修飾は、２－チオウラシル、２－チオシトシン、４－チオウラシル、６－チオグアニン、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、シュードウラシル、イノシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル、５－アリルシトシン、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシンまたは脱塩基ヌクレオチドをさらに含む。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。少なくとも２つまたは３つの修飾の可能性ある組み合わせは、それぞれ、図６および図７に表されており、参照により本明細書の一部をなすものとする。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）
Ｗ－Ｙ－Ｑ（ＩＩＩ）、または
Ｙ－Ｗ－Ｘ－Ｑ（ＩＶ）
［式中、ＱおよびＷは各々独立に、少なくとも１つの特異性増強修飾を含むオリゴヌクレオチドのヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチを表し、ＹおよびＸは各々独立に、オリゴヌクレオチドの非修飾部分を表す］
によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡ５’部分内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの内部領域（すなわち、５’末端と３’末端の間）内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にヌクレオチド４～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド５～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１０～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１９内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１８内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性および特異性を増強する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性およびトランスフェクション効率を増強する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの特異性およびトランスフェクション効率を増強する。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡの二次構造を変更する。この修飾は、ガイドＲＮＡ中のＲＮＡ／ＲＮＡ内部二本鎖のいずれかの塩基対形成を変更する。これらの修飾のうちいくつかは、ＲＮＡ／ＲＮＡ構造の塩基対形成を増大するか、あるいは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを増大するのに対し、その他の修飾は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖（複数でもよい）の塩基対形成（またはＴｍ）を減少させる。このような修飾は、塩基修飾されたヌクレオチド、特に、２－チオウリジンおよび２－アミノアデノシン対などのＵＮＡヌクレオチド、Ｚ／Ｐヌクレオチド対、イソＣ／イソＧ対、６－チオＧ／５－メチルピリミジン対および糖上に修飾を有するヌクレオチドまたは上記で開示されるようなヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、組合せは、特異性を増大する（すなわち、オフターゲット効果を低減する）少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを上昇させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する、少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを低下させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセット、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡ中のいずれかの場所でのいくつかの塩基対形成のＴｍを減少させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡのＣａｓタンパク質との結合を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡのＣａｓタンパク質との結合を減少させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、異なる種類の修飾の組合せを含む。
［Ｄ．ガイドＲＮＡ構造］
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と複合体を形成できる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるポリヌクレオチド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型の系によって提供されるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９突然変異体またはＣａｓ９変異体である。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡまたは合成ガイドＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質複合体は、修飾されたヌクレオチドを有しない天然ガイドＲＮＡまたは複合体の機能性を維持する。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドと結合することを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの核酸内にある。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞のゲノム内にある（生物から単離された培養された細胞（複数でもよい）の中など）。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ中のプロトスペーサーである。
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、２５から８０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、標的配列とハイブリダイズ可能であるガイド配列を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、標的配列またはその一部と相補的である。特定の実施形態では、ガイド配列は、１５から３０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、ステム配列を含む。特定の実施形態では、ステム配列は、１０から５０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、５’－オーバーハング配列を含む。特定の実施形態では、５’－オーバーハング配列は、１から１０ヌクレオチド、あるいは、１～５ヌクレオチド、あるいは、１、２または３ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズ可能であるガイド配列および（ｉｉ）ステム配列の両方を含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）５’－オーバーハング配列、（ｉｉ）標的配列とハイブリダイズ可能であるガイド配列および（ｉｉｉ）ステム配列を含む。ｃｒＲＮＡセグメントがステム配列を含む特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡセグメントのステム配列と部分的にまたは完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、少なくとももう１つの二本鎖構造を含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがループＬを介して連結されている単一ガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、ループＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ループＬは、ＧＮＲＡのヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒは、ＡまたはＧを表す。特定の実施形態では、ループＬは、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２以上のループを含む。
ガイドＲＮＡは、５’部分（すなわち、５’の半分）および３’部分（すなわち、３’の半分）を含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの５’（すなわち、上流）である。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡセグメントに対して５’である。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つの別個のＲＮＡ鎖、例えば、ｃｒＲＮＡ鎖および別個のｔｒａｃｒＲＮＡ鎖を含む。例えば、図２Ａを参照のこと。特定の実施形態では、鎖の各々は、１つまたは複数の修飾を含む合成鎖である。特定の実施形態では、鎖の少なくとも一方は、１つまたは複数の修飾を含む合成鎖である。特定の実施形態では、鎖は一緒に機能して、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質による標的ポリヌクレオチドの結合、ニッキングまたは切断をガイドする。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、別個の鎖上にあり、２つの相補的配列によって互いにハイブリダイズし、ステムまたは二本鎖を形成する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一ガイドＲＮＡである。例えば、図２Ｂを参照のこと。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ループ配列または「ループ」によって接続される。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、５’部分および３’部分を含み、ここで、ｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の上流である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含まないｃｒＲＮＡを含み。
特定の実施形態では、２つのＲＮＡ片の総長は、約５０～２２０（例えば、約５５～２００、６０～１９０、６０～１８０、６０～１７０、６０～１６０、６０～１５０、６０～１４０、６０～１３０および６０～１２０）ヌクレオチドの長さ、例えば、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００または２２０ヌクレオチドの長さであり得る。同様に、単一ガイドＲＮＡ（例えば、図２Ｂ）は、約５０～２２０（例えば、約５５～２００、６０～１９０、６０～１８０、６０～１７０、６０～１６０、６０～１５０、６０～１４０、６０～１３０および６０～１２０）ヌクレオチドの長さ、例えば、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００または２２０ヌクレオチドの長さであり得る。
図２Ａおよび２Ｂに示されるように、合成ガイドＲＮＡは、（ｉ）（ａ）核酸中の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列（例えば、セグメントＧ１～Ｇｎ、式中、各Ｇは、ガイド配列中のヌクレオチドを表す）、（ｂ）第２のステム配列と部分的または完全にハイブリダイズ可能な第１のステム配列（例えば、セグメントＸ１～Ｘｎ、式中、各Ｘは、第１のステム配列中のヌクレオチドを表す）および任意選択的に、（ｃ）５’－オーバーハング配列（例えば、セグメントＯ１～Ｏｎ、式中、各Ｏは、オーバーハング配列中のヌクレオチドを表す）を含むｃｒＲＮＡ配列と、（ｉｉ）第２のステム配列（例えば、セグメントＹ１～Ｙｎ、式中、各Ｙは、第２のステム配列中のヌクレオチドを表す）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、セグメントＴ１～Ｔｎ（式中、各Ｔは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のヌクレオチドを表す）をさらに含む。図２Ａ中に示される合成ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含む。同様に、図２Ｂ中に示される合成ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡセグメント、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントおよび任意選択的に、ループを含む単一ガイドＲＮＡの長さに沿って任意の点に位置する。特定の実施形態では、図２Ａおよび２Ｂに示される合成ガイドＲＮＡ中のＯ、Ｇ、Ｘ、ＹまたはＴによって表される任意のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであり得る。図２Ｂ中に示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、配列ＧＮＲＡを有するループによって接続しており、Ｎが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒが、ＡまたはＧを表す単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を表す。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメントは、２５～７０（例えば、３０～６０、３５～５０または４０～４５）ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ガイド配列は、１２～３０（例えば、１６～２５、１７～２０または１５～１８）ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの５’部分は、標的配列とハイブリダイズしないか、または部分的にしかハイブリダイズしない。例えば、ｃｒＲＮＡセグメント上に５’－オーバーハングがあり得る。
特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントのステム配列、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントのステム配列および任意選択的に、ｃｒＲＮＡセグメントをｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと共有結合によって接続するループを含む中央部分を含む。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡの中央セグメントは、８～６０（例えば、１０～５５、１０～５０または２０～４０）ヌクレオチドの長さである。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、１０～１３０（例えば、１０～１２５、１０～１００、１０～７５、１０～５０または１０～２５）ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、中央セグメント中の任意のヘアピンまたは二本鎖構造に加えて、１つまたは複数のヘアピンまたは二本鎖構造を含む。
［Ｅ．ガイドＲＮＡの合成］
特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡを含むガイドＲＮＡが、合成有機化学の技術分野を使用する化学合成によって製造される。非天然であるか天然であるかに関わらず、シュードリジン、イノシンまたはデオキシヌクレオチドなどの、４種の主なリボヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ以外の任意のヌクレオチドを含むガイドＲＮＡは、ＲＮＡ中の４種の主なヌクレオチドのいずれかと、化学的に／構造的に異なるヌクレオチドに化学修飾または置換を有する。
本明細書において記載される合成ガイドＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法（例えば、ＴＢＤＭＳ化学、ＴＯＭ化学、ＡＣＥ化学など）を使用して化学合成することができる。例えば、合成ガイドＲＮＡは、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものであるＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３，１１５４０、米国特許第８，２０２，９８３号、および米国特許出願第２０１０／００７６１８３Ａ１号に記載された方法によってＴＣケミストリーを使用して合成され得る。「ＴＣケミストリー」とは、チオノカルバメート保護基によって２’－ヒドロキシル部分で保護されたＲＮＡ単量体ヌクレオチド前駆体を使用して、非修飾ＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡを合成する組成物および方法を指す。ＴＣ－ＲＮＡケミストリーを使用して比較的長いＲＮＡ（２００マー以上にも及ぶ）を化学的に合成する能力によって、４種の主なリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）によって可能となるものをしのぐことが可能な、特別な特徴を有するガイドＲＮＡを製造することが可能となる。本明細書に記載されたいくつかの合成ガイドＲＮＡはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および細胞ベースの発現を含む当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。例えば、細胞ベースの発現によって製造された合成ガイドＲＮＡ中に、２’－フルオロＮＴＰを組み込むことができる。
ガイドＲＮＡの合成はまた、ＲＮＡ配列の化学的または酵素的合成によって達成され得、その後、これが酵素によって一緒にライゲートされるか、またはこれらに限定されないが、臭化シアンケミストリー、Ｒ．Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９，６８５９－６４によって公開されたような「クリック」ケミストリーまたは「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題されたＷＯ２０１３１７６８４４においてＫ．Ｈｉｌｌによって記載されたようなスクアレートコンジュゲーションケミストリーを含む化学ライゲーションによってライゲートされる。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡを調製するための方法が提供される。方法は、ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと、ゲノム内の１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドを同定するステップと、前記標的ポリヌクレオチドと前記オフターゲットポリヌクレオチドの両方に存在する１つまたは複数の共有ヌクレオチド残基を同定するステップと、ガイド配列が特異性増強修飾を含む合成ガイドＲＮＡを設計するステップとを含む。方法は、設計されたガイドＲＮＡを合成するステップを含むことができる。特定の実施形態では、オフターゲットポリヌクレオチドは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｍ．ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ．ｅｄｕ／Ｏｆｆ－Ｓｐｏｔｔｅｒ；もしくはｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで見付けられるものなどの、オフターゲット部位はもちろんそれらの重要度も予測するためのアルゴリズム；またはＴｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１８７－９７；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－９１；Ｆｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１７９－８６において開示されているような、実際の事例でオフターゲット部位の活性化を同定および定量するためのその他の技術によって、同定される。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドの配列間の少なくとも１つの識別位置であって、前記標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドが異なるヌクレオチド残基を有する、少なくとも１つの識別位置を同定するステップと、および前記標的ポリヌクレオチド内の前記少なくとも１つの識別位置におけるヌクレオチドとマッチする（すなわち、それと相補的である）ヌクレオチドを合成ガイドＲＮＡに含めるステップとをさらに含む。
以下にさらに記載されるように、修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含むものを含む、本明細書において開示されるガイドＲＮＡを使用して、細胞不含アッセイにおいて、インタクトな細胞において、または全生物においてなど、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの種々のＣＲＩＳＰＲ媒介性機能（これらに限定されないが、遺伝子を編集すること、遺伝子発現を調節すること、標的配列を切断することおよび標的配列と結合することを含む）を実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ適用のために、ＲＮＡを、当技術分野で公知の任意の方法で細胞または全生物中に送達することができる。
［ライブラリーおよびアレイ］
一態様では、本発明は、複数のガイドＲＮＡのセットまたはライブラリーを提供する。特定の実施形態では、ライブラリーは、本明細書において開示される２つ以上のガイドＲＮＡを含有する。ライブラリーは、約１０～約１０７の個々のメンバー、例えば、約１０～約１０２、約１０２～約１０３、約１０３～約１０５、約１０５～約１０７のメンバーを含有し得る。ライブラリーの個々のメンバーは、ライブラリーのその他のメンバーとは、少なくとも、ガイド配列、すなわち、ｇＲＮＡのＤＮＡを標的化するセグメントにおいて異なる。他方、特定の実施形態では、ライブラリーの各個々のメンバーは、ライブラリーのすべてのその他のメンバーとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントについて同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を含有し得る。このような方法で、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド中の異なるポリヌクレオチドまたは異なる配列を標的化するメンバーを含み得る。
特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０３種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０６種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０７種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０３種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０６種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０７種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。
特定の実施形態では、ライブラリーは、ライブラリー中のメンバーの配列を横断する連続的にシフトしたウィンドウ中に同一配列および同一修飾を有するガイドＲＮＡの収集物を含む。特定の実施形態では、ウィンドウは、ＲＮＡの全長を集合的に対象とする。
特定の実施形態では、ライブラリーによって、ハイスループット、多重標的ゲノム操作および分析を実施することが可能となる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡにおけるＤＮＡを標的化するセグメントのみが変わり、Ｃａｓタンパク質結合セグメントは同一である。特定の実施形態では、ライブラリーの第１の部分は、特定のＣａｓタンパク質を認識し、それと結合し、それを指向するＣａｓ結合セグメントを有するガイドＲＮＡを含み、ライブラリーの第２の部分は、異なるＣａｓタンパク質（例えば、異なる種に由来するＣａｓタンパク質）を認識し、それと結合し、それを指向する異なるＣａｓ結合性セグメントを含み、それによって、ライブラリーが、２種以上の直交性Ｃａｓタンパク質とともに機能することが可能となる。特定の実施形態では、第１の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現は、第１の直交性Ｃａｓタンパク質と相互作用するライブラリーの一部を利用する。特定の実施形態では、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現は、それぞれ、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質と相互作用するライブラリーの一部を利用する。特定の実施形態では、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現は、異なる時点で起こる。したがって、具体的には、ライブラリーにおいて特定されるような複数の標的を遺伝子操作することまたは修飾することによって、大規模な遺伝子編集または遺伝子調節を実施することができる。
特定の実施形態では、ライブラリーは、「アレイド」ライブラリー、すなわち、アドレス可能な配置中の異なる特徴または特徴のプールの収集物である。例えば、アレイの特徴を、選択的に切断し、プレート中の各ウェルが、公知の特徴または公知の特徴のプールを含有するようにマイクロタイタープレートに移すことができる。いくつかのその他の実施形態では、ライブラリーは、４８ウェルまたは９６ウェルマイクロタイタープレート形式で、または３８４ウェルプレート中で合成される。
特定の実施形態では、本発明のガイドＲＮＡの合成は、化学物質が結合し得る表面を有する固相支持体上で実施され得る。いくつかの実施形態では、合成されているガイドＲＮＡが、同一固相支持体に直接的または間接的に結合され、アレイの部分を形成し得る。「アレイ」は、各配列の位置が公知であるように、空間的に規定され、物理的にアドレス可能な方法で固相支持体上に各々配置された公知の単量体配列の別個の分子の収集物である。本明細書において同義的に使用される「アレイ」または「マイクロアレイ」は、その領域と会合している特定の化学部分（複数でもよい）（リガンド、例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列（核酸）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水化物、脂質などといったバイオポリマーなど）を有する、アドレス可能な領域の任意の１次元の、２次元のまたは実質的に２次元の（ならびに３次元の）配置を含む。アレイは、アレイ上の特定の所定の位置（すなわち「アドレス」）で、領域（すなわち、アレイの「特徴」）が、特定の標的または標的のクラスを検出するように（特徴は、その特徴の非標的を偶発的に検出し得るが）、異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）の複数の領域を有する場合に「アドレス可能」である。アレイ特徴は、通常、介在する空間によって分かれているが、必要ではない。アレイ上に含有され得る特徴の数は、大きくは、基板の表面積、特徴のサイズおよび特徴間の間隔によって決定される。アレイは、２，５００～２００，０００特徴／ｃｍ２など、１ｃｍ２あたり最大数十万以上の特徴の密度を有し得る。特徴は、共有結合によって基板と結合される場合もされない場合もある。
適した固相支持体は、種々の形態および組成を有し、天然に存在する材料、相性的に修飾されている天然に存在する材料または合成材料に由来し得る。適した支持材料の例は、これらに限定されないが、シリカ、ケイ素および酸化ケイ素、テフロン（登録商標）、ガラス、アガロース（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のセファロース（登録商標））およびデキストラン（例えば、同様にＰｈａｒｍａｃｉａ製のセファデックス（登録商標）およびセファシル（登録商標））などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、メタクリル酸ヒドロキシエチルおよびメタクリル酸メチルのコポリマーなどを含む。いくつかの実施形態では、固相支持体は、複数のビーズである。
基板表面上で合成されるべきガイドＲＮＡの最初の単量体をリンカーと結合することができ、これは、順に、シリカ基板上に存在する表面親水基、例えば、表面ヒドロキシル部分と結合する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルリンカーを使用する。いくつかのその他の実施形態では、最初の単量体を、表面ヒドロキシル部分、表面アミノまたはその他の反応性の官能基と直接反応させる。あるいは、ガイドＲＮＡを、本発明に従ってまず合成することができ、合成後、当技術分野で公知の任意の方法によって固体基板と結合させる。したがって、本発明を使用して、オリゴヌクレオチドがアレイ上で合成されるか、または合成後にアレイ基板に結合される、ガイドＲＮＡのアレイを調製できる。その後、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのプールもしくは複数のプールを、アレイ基板から任意かつ選択的に切断し、ライブラリー（複数でもよい）として使用できる。
［Ｆ．ｃｒＲＮＡ］
本発明は、本明細書において記載されるような、ガイドＲＮＡについて記載されるような化学修飾（複数でもよい）を含む多様なｃｒＲＮＡも提供する。ｃｒＲＮＡは、デュアルガイドなどの、マルチセグメントガイドＲＮＡにおいて機能することができる。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、例えばＣｐｆ１系において、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがないガイドＲＮＡとして機能する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列と、（ｉｉ）ステム配列とを含む合成ｃｒＲＮＡであって、前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０～６の間）の整数であり；前記ガイド配列が、少なくとも１つの修飾を含み、合成ｃｒＲＮＡが、修飾を有しない対応するｃｒＲＮＡより、標的ポリヌクレオチドに対する高い特異性、または高いｇＲＮＡ機能性をもたらす、合成ｃｒＲＮＡを提供する。ここで、ｃｒＲＮＡは、該ｃｒＲＮＡが、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ：ｃａｓタンパク質複合体に含まれているとき、前記ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ：ｃａｓタンパク質複合体が、ｃｒＲＮＡが修飾を欠く対応するガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ：ｃａｓタンパク質複合体より、標的ポリヌクレオチドに対する高い特異性、または高いｇＲＮＡ機能性を有する場合、修飾を有しない対応するｃｒＲＮＡより、標的ポリヌクレオチドに対する高い特異性、または高いｇＲＮＡ機能性をもたらす。
ガイド配列の、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎにおけるまたは４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択される少なくとも１つのヌクレオチドにおける少なくとも１つの修飾を含むがこれらに限定されない、対象の修飾は、本開示の他の場所で説明される。特定の修飾（複数でもよい）および標的ポリヌクレオチドの種々の実施形態も、本明細書において記載される。
［ＩＶ．Ｃａｓタンパク質］
上記のように、機能的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はまた、標的結合または標的ニッキング／切断などの所望の活性を提供するタンパク質成分（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼであり得るＣａｓタンパク質）を必要とする。特定の実施形態では、所望の活性は、標的結合である。特定の実施形態では、所望の活性は、標的ニッキングまたは標的切断である。特定の実施形態では、所望の活性はまた、本明細書において開示されるようなＣａｓタンパク質と共有結合によって融合しているポリペプチドによって提供される機能を含む。特定の実施形態では、所望の活性はまた、本明細書において開示されるようなヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質と共有結合によって融合しているポリペプチドによって提供される機能を含む。このような所望の活性の例として、以下に記載されるような転写調節活性（活性化または抑制のいずれか）、エピジェニック修飾活性または標的可視化／同定活性が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、精製もしくは非精製（ｉ）Ｃａｓタンパク質または（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質の発現のためにコードされるｍＲＮＡまたは（ｉｉｉ）タンパク質の発現のためにコードされる直鎖もしくは環状ＤＮＡとしてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ系の中に導入され得る。Ｃａｓタンパク質を提供するこれらの３種の方法のいずれも当技術分野で周知であり、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質の使用の言及が本明細書においてなされる場合には、同義的に暗示される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡから構成的に発現される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＤＮＡからのＣａｓタンパク質の発現が誘導可能であるか、または誘導される。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は化学合成される（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３を参照のこと）か、または本明細書において記載されるように組換えＤＮＡ技術によって製造される。さらなる指針については、当業者は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００３；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参考にしてもよい。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製された、または単離された形態で提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の純度で提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、組成物の一部として提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ反応のための組成物として使用するのに、または組成物中に含めるのに適した水性組成物中で提供される。当業者は、このようなヌクレアーゼ反応組成物中に含まれ得る種々の物質を十分に承知している。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、組換えポリペプチドとして提供される。特定の実施例では、組換えポリペプチドは、融合タンパク質として調製される。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、融合パートナー、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ－ＨｉｓエピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質をコードする別の核酸と連結される。適した宿主細胞は、融合タンパク質を発現するために使用され得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法によって単離される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合パートナーを除去してＣａｓタンパク質を得るために、例えば、酵素消化によってさらに処理され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質：ｇＲＮＡ複合体は、当技術分野で公知の宿主細胞系またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳転写系を使用して組換え技術を用いて作成され得る。このような系および技術の詳細は、例えば、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである、ＷＯ２０１４１４４７６１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およびＵＳ２０１４０２７３２３３に見出すことができる。
［野生型Ｃａｓタンパク質］
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるポリヌクレオチド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有する、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型の系に由来するタンパク質を含む。適したＣａｓタンパク質の限定されない例として、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕ１９６６が挙げられる。例えば、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである、ＷＯ２０１４１４４７６１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およびＵＳ２０１４０２７３２３３を参照のこと。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＷＯ２０１４１４４７６１において同定されるものを含む、細菌Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種またはブドウ状球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種のＣａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。
特定の実施形態では、野生型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（配列番号１１５）である。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１１５の断片を含み得る、それからなり得るまたは本質的にそれからなり得る。
一般に、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用する、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の核酸結合親和性および／または特異性を増大し、酵素活性を変更し、および／または別の特性を変化させるように修飾される。例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾、突然変異、欠失または不活性化され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の機能にとって必須ではないドメインを除去するように末端切除型であり得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、エフェクタードメインの活性を最適化するように、末端切除型であるか、または修飾され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮＬＳタグが付けられたＣａｓタンパク質の生存細胞の核への移入を達成する核局在性配列（ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つ以上の修飾を含む。
［突然変異体Ｃａｓタンパク質］
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）またはその断片の突然変異体であり得る。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、突然変異体Ｃａｓタンパク質に由来し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の１つまたは複数の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、結合親和性、プロテアーゼに対する安定性など）を変更するように修飾され得る。あるいは、ＲＮＡによってガイドされる切断に関与していないＣａｓ９タンパク質のドメインは、修飾されたＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ9タンパク質より小さいように、タンパク質から排除され得る。例えば、Ｃａｓ９コード配列のサイズの低減によって、そうでなければ、中でもＡＡＶベクターなどの野生型配列に適応させることができないトランスフェクションベクター内に適合することが可能となる。いくつかの実施形態では、本系は、細菌中にコードされるような、または真核細胞における発現のためにコドン最適化された、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。野生型化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質配列のアミノ酸配列（配列番号１１５、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９ＺＷ２で入手可能）が、以下に示される。
Figure 0007093728000007
Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、少なくとも２種のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ）ドメインを有する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを有し得る。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは一緒に働いて、標的部位中の両鎖を切断し、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を作製する（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－２１）。特定の実施形態では、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、１つのみの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）を含有するように修飾される。例えば、特定の実施形態では、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうち１つが、欠失または突然変異され、その結果、もはや機能的ではない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように修飾される。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性であるいくつかの実施形態では、突然変異体は、二本鎖ポリヌクレオチド中にニックを導入可能である（このようなタンパク質は、「ニッカーゼ」と呼ばれる）が、二本鎖ポリヌクレオチドを切断できない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの（Ｈ８４０Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるアスパラギン（ａｒｓｐａｒａｇｉｎｅ）からアラニンへの（Ｎ８６３Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの両方が、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質が、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることができない、または切断できないように修飾されるか、または排除される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９由来タンパク質のすべてのヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ９由来タンパク質が、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾されるか、または排除される。特定の実施形態では、それにもかかわらず、一部のまたはすべてのヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質は、野生型対応物と比較して、標的認識活性をより高いまたはより低い程度に維持する。
上記の実施形態のいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインのいずれかまたはすべてが、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発および全遺伝子合成並びに当技術分野で公知のその他の方法などの周知の方法を使用する１つまたは複数の欠失突然変異、挿入突然変異および／または置換突然変異によって不活性化され得る。
特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、配列番号１１５に対して少なくとも５０％（例えば、５０％から１００％の間（両端を含む）の任意の数字、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％）同一である。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）と結合する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ＲＮＡ分子を介して特定のポリヌクレオチド配列に標的化される。
［融合タンパク質］
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質と異種の別のタンパク質またはポリペプチドと融合されて、融合タンパク質が作製される。特定の実施形態では、異種配列は、切断ドメイン、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメインまたはエピジェニック修飾ドメインなどの１つまたは複数のエフェクタードメインを含む。エフェクタードメインのさらなる例は、核局在性シグナル、細胞透過性または転位置ドメインまたはマーカードメインを含む。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端にまたは内部位置中に位置する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、すべてのヌクレアーゼドメインが不活性化または欠失されている、修飾された、または突然変異されたＣａｓタンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠く、修飾された、または突然変異されたＣａｓタンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメインは、もはやヌクレアーゼ活性を有しないように修飾される、または突然変異される。
［切断ドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、切断ドメインである。本明細書において、「切断ドメイン」とは、ＤＮＡを切断するドメインを指す。切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの限定されない例として、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログ、またはＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３７９－８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１種または複数を、切断ドメインの供給源として使用できる。
特定の実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを、通常、エンドヌクレアーゼのＤＮＡ認識部位から数塩基対離れた部位で特異的に切断し、そのようなものとして、分離可能な認識および切断ドメインを有する。これらの酵素は、一般に、一時的に会合して二量体を形成し、捻じれた位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。適したＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼの限定されない例として、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏｌＩおよびＳａｐＩが挙げられる。特定の実施形態では、融合タンパク質の切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたはその断片または誘導体であるＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，７７８－８５；Ｓｚｃｚｐｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，７８６－９３；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８，７４－８１を参照のこと。
［転写活性化ドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメインである。一般に、転写活性化ドメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写を増大および／または活性化する。特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメインまたはＮＦＡＴ（活性化されたＴ細胞の核因子）活性化ドメインである。特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４またはＬｅｕ３である。転写活性化ドメインは、野生型であり得る、または元の転写活性化ドメインの修飾された型もしくは末端切除型であり得る。
［転写リプレッサードメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。一般に、転写リプレッサードメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用して、遺伝子の転写を減少させるおよび／または妨げる。特定の実施形態では、転写リプレッサードメインは、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐＩ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサーまたはＭｅＣＰ２である。
［エピジェニック修飾ドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、エピジェニック修飾ドメインである。一般に、エピジェニック修飾ドメインは、ヒストン構造および／または染色体構造を修飾することによって遺伝子発現を変更する。特定の実施形態では、エピジェニック修飾ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインまたはＤＮＡデメチラーゼドメインである。
［さらなるドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなるドメインをさらに含む。適したさらなるドメインの限定されない例として、核局在性シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性または転位置ドメインおよびマーカードメインが挙げられる。ＮＬＳは、一般に、塩基性アミノ酸のストレッチを含む。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，５１０１－５を参照のこと。例えば、特定の実施形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１６）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１１７）などのモノパータイト（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列である。特定の実施形態では、ＮＬＳは、ビパータイト（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列である。特定の実施形態では、ＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１１８）である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含む。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１のＴＡＴタンパク質に由来する細胞透過性ペプチド配列である。例として、ＴＡＴの細胞透過性配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１９）であり得る。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２０）、これはヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞透過性ペプチド配列である。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２１またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２２）である。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２３）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチドまたはポリアルギニンペプチド配列である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのマーカードメインを含む。マーカードメインの限定されない例は、蛍光タンパク質、精製タグおよびエピトープタグを含む。特定の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質である。適した蛍光タンパク質の限定されない例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）および任意のその他の適した蛍光タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグである。例示的タグとして、これらに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）およびカルモジュリンが挙げられる。
［Ｖ．使用および方法］
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質を用いて切断する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させることを含む。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に一本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質を含む複合体は、配列によって標的化される一本鎖ＤＮＡ切断、すなわち、ニッキングのために使用される。
一態様では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドを、Ｃａｓタンパク質を用いて切断する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を接触させることを含む。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に一本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質を含む複合体は、配列によって標的化される一本鎖ＤＮＡ切断、すなわち、ニッキングのために使用される。
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質と結合するための方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させて、標的ポリヌクレオチドのＣａｓタンパク質との結合をもたらすことを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓ変異体は、対応物野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、一部またはすべてのヌクレアーゼ活性を欠く。
一態様では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質と結合させる方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させて、標的ポリヌクレオチドのＣａｓタンパク質との結合をもたらすことを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓ変異体は、対応物野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、一部またはすべてのヌクレアーゼ活性を欠く。
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチドに標的化するための方法を提供する。方法は、Ｃａｓタンパク質を、本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットと接触させるステップを含む。特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の形成をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の突然変異体または変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ欠損突然変異体）である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質（例えば、（ｉ）Ｃａｓタンパク質および（ｉｉ）異種ポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部である。
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質を、２種以上の標的ポリヌクレオチドに標的化するための方法を提供する。方法は、Ｃａｓタンパク質を、本明細書において記載されるガイドＲＮＡ分子のセットと接触させるステップを含む。特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の形成をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の突然変異体または変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ欠損突然変異体）である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質（例えば、（ｉ）Ｃａｓタンパク質またはおよび（ｉｉ）異種ポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部である。
一態様では、本発明は、合成ガイドＲＮＡを選択する方法を提供する。方法は、ＭＰ修飾の位置に起因して特異性を増強するガイド配列内の位置（１つまたは複数）を同定するための、ｇＲＮＡのガイド配列部分を横断するＭＰ修飾の「ウォーキング」を含む。オンターゲット対オフターゲット切断比、標的部位での切断パーセンテージ、および１つもしくは複数のオフターゲット部位での切断パーセンテージ、ならびに／または特異性スコアを用いて試験した各位置について特異性増強の大きさを評価し、このようにして、ｇＲＮＡの特異性を変更する修飾位置（１つまたは複数）および変更する程度を決定することができる。ガイド配列を横断する単一ＭＰの漸進的なウォーキングによって、試験した位置の中から、化学修飾の１つまたは複数の組合せの結果として生じる特異性の可能性ある相乗的改善のための位置を同定することもできる。
ある実施形態では、方法は、少なくとも第１の合成ガイドＲＮＡおよび第２の合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（前記合成ガイドＲＮＡの両方は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとを含み、前記第１の合成ガイドＲＮＡは、前記ガイド配列の第１の位置にＭＰ修飾を含み、前記第２の合成ガイドＲＮＡは、前記ガイド配列の第２の位置にＭＰ修飾を含む）；Ｃａｓタンパク質と前記第１の合成ガイドＲＮＡとを含む第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成し、前記標的ポリヌクレオチドを前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと；Ｃａｓタンパク質と前記第２のガイドＲＮＡとを含む第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成し、前記標的ポリヌクレオチドを前記第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと；前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合することにおける、前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体および前記第２の合成ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の特異性を判定するステップと；ガイドＲＮＡのどちらが前記標的ポリヌクレオチドに対してより大きい特異性を有するかを同定するステップとを含む。特定の実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、例えば第１および第２のｇＲＮＡを異なるフルオロフォアで標識することによって、競合アッセイで一緒に試験される。特定の実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、並行してまたは逐次的にアッセイされる同等のまたは別々のサンプルにおいて、個々に試験される。
一態様では、本発明は、特異性増強修飾を含むガイドＲＮＡなどの、ガイドＲＮＡを使用することによって遂行される、ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を分析するための方法を提供する。方法は、サンプル中の標的配列および１つまたは複数のオフターゲット配列を同定するステップと（ここで、前記標的配列は、標的ポリヌクレオチドに含まれ、前記オフターゲット配列は、１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドに含まれている）；ガイドＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ機能を遂行するステップと；前記標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドベイトのライブラリーを使用することによって、標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドを捕捉するステップと；捕捉されたポリヌクレオチドを単離し、分析して、標的配列およびオフターゲット配列がＣＲＩＳＰＲ機能に起因して変化したかどうかを評価するステップとを含む。標的配列と非標的配列間の変化の相対的な程度は、ガイドＲＮＡによって媒介されるＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を示す。一部の実施形態では、捕捉されたポリヌクレオチドは、シークエンシングによって分析される。
ポリヌクレオチドベイトは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイト、およびオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイトを含む。ベイトは、標的（またはオフターゲット）配列と直接ハイブリダイズすることができ、または標的（もしくはオフターゲット）配列の５’もしくは３のいずれかにまたは両方における、標的（もしくは非標的）配列付近の配列、例えば、標的（もしくはオフターゲット）配列の２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０もしくは２０塩基対以内の配列とハイブリダイズすることができることが企図される。一部のベイトは、部分的に標的（またはオフターゲット）配列と、および部分的に標的（またはオフターゲット）配列外と、ハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、ベイトのライブラリーは、標的（またはオフターゲット）配列とハイブリダイズするベイト、および標的（またはオフターゲット）配列付近とハイブリダイズするベイトの両方を含むことができる。一部の実施形態では、ライブラリーは、標的（またはオフターゲット）配列付近とハイブリダイズする標的のみを含み、標的（またはオフターゲット）配列とハイブリダイズするベイトを含まないか、または逆に、標的（またはオフターゲット）配列とハイブリダイズするベイトのみを含み、標的（またはオフターゲット）配列付近とハイブリダイズするベイトを含まない。一部の実施形態では、ベイトは、標的配列を中心とする約１０００ｂｐの領域、および各オフターゲット配列を中心とする約１０００ｂｐの領域とハイブリダイズする。一部の実施態様では、ベイトは、タイリングされる。
特定の実施形態では、特異性増強修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、化学修飾は、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される。特定の実施形態では、第１および第２の合成ガイドＲＮＡは、ガイド配列部分内の異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を含む。特定の実施形態では、特異性は、オンターゲット切断活性、オフターゲット切断活性、オン：オフ比、特異性スコア、またはそれらの組合せに基づいて判定される。特定の実施形態では、方法は、ガイド配列部分内の異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を含む第１～第２０の合成ガイドＲＮＡを用意するステップと；前記合成ガイドＲＮＡの各々を使用してｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断するか、それにニックを入れるかまたは結合させ、各合成ガイドＲＮＡの特異性を測定するステップと；最大の特異性増強をもたらす１つまたは複数の修飾された部分を同定するステップとを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、安定性増強性末端修飾をさらに含む。特定の実施形態では、安定性増強性末端修飾は、ｇＲＮＡの５’末端および／または３’末端に２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、またはそれらの組合せを含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、トランスフェクションによって細胞中に導入される。ＲＮＡトランスフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを含む。ＲＮＡトランスフェクションのための有効な技術は、主に、細胞型に応じて変わる。例えば、ＨＴＣ－１１６結腸癌細胞のトランスフェクションを記載し、商業的に得られた修飾されたｍｉＲＮＡまたは前駆体ｍｉＲＮＡのトランスフェクションのためにオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する、Ｌｕｊａｍｂｉｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｆｅｂ．２００７を参照のこと。また、Ｋ５６２細胞のトランスフェクションを記載し、転写されたｓｇＲＮＡ（約６０ｎｔ長）のトランスフェクションのために４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）（Ｌｏｎｚａ）エレクトロポレーションを使用する、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ．）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒ．２０１３も参照のこと。ＲＮＡのトランスフェクションの技術もまた、当技術分野で公知である。例えば、治療用ＲＮＡは、インベイシンタンパク質を用いてコーティングされた非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に送達されており（β－１インテグリンタンパク質を発現する細胞中への取り込みを容易にするために）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｓｈＲＮＡが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から細胞質へ通過することを可能にするリステリオリシンＯ孔形成性タンパク質を発現するようにコードされる。Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ．）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒ．２０１３も参照のこと。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞中に導入され、送達される。ガイドＲＮＡの送達のために使用され得る技術として、生分解性ポリマー、リポソームまたはナノ粒子によるカプセル封入を利用するものが挙げられる。このようなポリマー、リポソームおよびナノ粒子は、静脈内に送達され得る。特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、ガイドＲＮＡは、組織部位中に注射される場合も、または全身に投与される場合もある。ｉｎ ｖｉｖｏ送達はまた、その全文が参照により本明細書の一部をなす、米国特許第５，０３２，４０１号および同５，６０７，６７７号および米国特許出願第２００５／０２８１７８１号に記載されるものなどのβグルカン送達系によって達成され得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含有する送達ビヒクルは、特定の組織または身体コンパートメントに標的化される。例えば、特定の実施形態では、外因性ＲＮＡをその他の組織に標的化するために、合成担体は、受容体取り込みのために細胞特異的リガンドまたはアプタマーを用いて修飾される（例えば、ＰＥＧを用いてコーティングされ、腫瘍細胞において高度に発現されるトランスフェリン受容体を介した取り込みのためにヒトトランスフェリンタンパク質を用いて官能基付与されたシクロデキストリンナノ粒子中に包まれたＲＮＡ）。さらなるアプローチが、本明細書において以下に記載されているか、または当技術分野で公知である。
本発明は、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３３：９，９８５－９（その全文が本願の一部をなす）に記載されるようにヒト細胞において試験されている。引用された文献では、修飾されたガイドＲＮＡは、Ｋ５６２細胞、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）中に導入される。修飾されたガイドＲＮＡは、非修飾ガイドＲＮＡと比較して、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含むヒト細胞におけるゲノム編集効率を大幅に増強した。
その他の使用の例として、以下に記載されるようなゲノム編集および遺伝子発現調節が挙げられる。
［ゲノム編集］
一態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、限定されるものではないが、無細胞系、細胞溶解物、細胞の単離された成分、および生存している生物の外側の細胞を含む）において、ＤＮＡ配列を修飾するためにゲノム編集するための方法を提供する。ＤＮＡ配列は、染色体配列、エピソーム配列、プラスミド、ミトコンドリアＤＮＡ配列またはエンハンサー配列または非コーディングＲＮＡのＤＮＡ配列などの機能的遺伝子間配列を含み得る。方法は、ＤＮＡ配列を、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットと（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質とを接触させるステップを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞外にて接触する。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞内のゲノム中に位置し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて接触する。特定の実施形態では、細胞は、生物または組織内にある。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、単細胞生物または胚である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、ＤＮＡ配列中の標的化される部位に標的化するのに役立つ。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的化される部位でＤＮＡ配列の少なくとも１つの鎖を切断する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的化される部位でＤＮＡ配列の両鎖を切断する。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質を細胞または別の系の中に導入することをさらに含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製された、または精製されていないタンパク質として導入される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡによって導入される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする直鎖または環状ＤＮＡによって導入される。特定の実施形態では、細胞または系は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含む。
特定の実施形態では、二本鎖切断は、エラーが起こりやすい（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）非相同末端結合（「ＮＨＥＪ」）の修復プロセスによって修復され得る。特定の実施形態では、二本鎖切断は、相同性指向修復（ＨＤＲ）プロセスによって修復され得、その結果、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれるか、それと交換され得る。
特定の実施形態では、方法は、少なくとも１種のドナーポリヌクレオチドを細胞または系の中に導入するステップをさらに含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列中の標的化される部位のいずれかの側の配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１種の相同配列を含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは相同組換えなどの相同性指向修復によって、ＤＮＡ配列中に組み込まれる、またはそれと交換されるドナー配列を含む。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、上流相同配列および下流相同配列を含み、その各々は、それぞれ、ＤＮＡ配列中の標的化される部位の上流および下流に位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する。これらの配列類似性によって、例えば、ドナーポリヌクレオチドと標的化されるＤＮＡ配列間の相同組換えが可能となり、その結果、ドナー配列が、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ得る（またはそれと交換され得る）。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列中の標的部位（複数でもよい）は、障害を引き起こすか、またはそれと関連し得る、突然変異、例えば、点突然変異、転位置または逆位に広がるか、または隣接する。特定の実施形態では、方法は、細胞または系の中に、（ｉ）突然変異の野生型対応物と（ｉｉ）ＤＮＡ配列中の標的化される部位の片側上の配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの相同配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドとを導入することによって、突然変異を補正するステップを含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列中の標的化される部位の両鎖上の配列と実質的な配列同一性を有する相同配列を含む。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えなどの相同性指向修復プロセスによって、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ得るまたはそれと交換され得る外因性配列を含む。特定の実施形態では、外因性配列は、任意選択的に、外因性プロモーター制御配列と作動可能に連結されるタンパク質コーディング遺伝子を含む。したがって、特定の実施形態では、外因性配列の組込みの際に、細胞は、組み込まれた遺伝子によってコードされるタンパク質を発現し得る。特定の実施形態では、外因性配列は、レシピエント細胞または系におけるその発現が外因性プロモーター制御配列によって調節されるように、標的化されたＤＮＡ配列中に組み込まれる。標的化されたＤＮＡ配列中への外因性遺伝子の組込みは、「ノックイン」と呼ばれる。その他の実施形態では、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコード配列などであり得る。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、標的化される部位の、またはその付近のＤＮＡ配列の一部と本質的に同一であるが、少なくとも１つのヌクレオチド変更を含む配列を含む。例えば、特定の実施形態では、ドナー配列は、標的化される部位の、またはその付近のＤＮＡ配列の修飾された、または突然変異された型を含み、その結果、標的化される部位の組込みまたはそれとの交換の際に、得られた標的化される部位の配列は、少なくとも１つのヌクレオチド変更を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド変更は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、１つまたは複数のヌクレオチドの置換またはそれらの組合せである。修飾された配列の組込みの結果として、細胞は、標的化されたＤＮＡ配列から修飾された遺伝子産物を生成し得る。
特定の実施形態では、方法は、マルチプレックス適用のためのものである。特定の実施形態では、方法は、細胞または系の中にガイドＲＮＡライブラリーを導入することを含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１，０００，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００，０００種の異なる配列を標的化する。
［ヒトおよび哺乳動物細胞におけるゲノム編集］
本発明の実施形態は、哺乳動物細胞において、標的ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ配列を修飾するためのゲノム編集するための方法において有用である。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、染色体配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、タンパク質コード配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、エンハンサー配列または非コード配列などの機能的遺伝子間配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡは、ヒト遺伝子の一部である。いくつかのこのような実施形態では、ヒト遺伝子は、クラスリン軽鎖（ＣＬＴＡ１）遺伝子、ヒトインターロイキン２受容体γ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＬＴＡ４）遺伝子、ヒト血管内皮増殖因子Ａ遺伝子（ＶＥＧＦＡ）、または、鎌形赤血球貧血およびサラセミアに関与する突然変異を有し得るヒトヘモグロビンβ（ＨＢＢ）遺伝子である。したがって、特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＨＢＢポリヌクレオチド、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、またはＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドである。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＬＴＡ１、ＶＥＧＦＡまたはＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、ガイド配列を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎからなり、Ｎは、－１０から０の間の整数であり、前記ガイド配列は、ヌクレオチド４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎまたは１６－Ｎに少なくとも１つの特異性増強修飾を含む。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド１１－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド５－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド７－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド１０－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド９－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド４－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、Ｎは、ゼロである。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１９からなり、ヌクレオチド３、４、６、８、９または１０のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１８からなり、ヌクレオチド２、３、５、７、８または９のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１７からなり、ヌクレオチド１、２、４、６、７または８のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１６からなり、ヌクレオチド１、３、５、６または７のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１５からなり、ヌクレオチド２、４、５または６のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１４からなり、ヌクレオチド１、３、４または５のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、化学修飾は、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾；およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される。
特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかのこのような実施形態では、ヒト細胞は、初代ヒト細胞である。さらなる実施形態では、初代ヒト細胞は、ヒト初代Ｔ細胞である。ヒト初代Ｔ細胞は、刺激されている場合も、刺激されていない場合もある。特定の実施形態では、ヒト細胞は、ＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）などの幹／前駆体細胞である。特定の実施形態では、ヒト細胞は、培養細胞株、例えば、商業的に得ることができるものなどに由来する。例示的な細胞株としては、ヒト骨髄性白血病株であるＫ５６２細胞が挙げられる。
特定の実施形態では、細胞は、生存生物の内部にある。特定のその他の実施形態では、細胞は、生存生物の外部にある。
方法は、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と、ＤＮＡ配列を接触させるステップを含む。
特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡを細胞中に導入または送達するステップをさらに含む。いくつかのこのような実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞中にトランスフェクションによって導入される。ＲＮＡトランスフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが挙げられる。その他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞（より詳しくは、細胞核）中にヌクレオフェクションによって導入される。ヌクレオフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂまたはＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒなどのヌクレオフェクション装置および関連試薬を利用し得る。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質を細胞中に導入または送達するステップをさらに含む。いくつかのこのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製または非精製タンパク質として導入される。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡによって導入される。いくつかのこのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中にトランスフェクションによって導入される。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞（より詳しくは、細胞核）中にヌクレオフェクションによって導入される。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質が、ガイドＲＮＡとの複合体で細胞中に導入されるようなリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達を使用する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体でガイドＲＮＡと複合体形成され得、これは、ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の同時送達を可能にする。例えば、Ｃａｓ：ｇＲＮＡ複合体は、細胞中にヌクレオフェクトされ得る。
特定の実施形態では、方法は、すべてのＲＮＡ送達プラットフォームを使用する。例えば、いくつかのこのような実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、同時にまたは実質的に同時に細胞中に導入される（例えば、同時トランスフェクションまたは同時ヌクレオフェクションによって）。特定の実施形態では、ＣａｓのｍＲＮＡおよび修飾されたｇＲＮＡの同時送達は、ＣａｓのｍＲＮＡおよび非修飾ｇＲＮＡの同時送達と比較して、より高い編集頻度をもたらす。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してより高い編集頻度を提供する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中に逐次導入される、すなわち、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中に異なる時点で導入される。各薬剤の導入間の期間は、数分（またはそれ未満）から数時間または数日で変わり得る。例えば、いくつかのこのような実施形態では、ｇＲＮＡは最初に送達され、続いて、ＣａｓのｍＲＮＡが４、８、１２または２４時間後に送達される。その他のこのような実施形態では、ＣａｓのｍＲＮＡが最初に送達され、続いて、ｇＲＮＡが４、８、１２または２４時間後に送達される。いくつかの特定の実施形態では、最初の修飾されたｇＲＮＡの送達、続いてＣａｓのｍＲＮＡの送達が、非修飾ｇＲＮＡとそれに続くＣａｓのｍＲＮＡの送達と比較して、より高い編集頻度をもたらす。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞中に、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドと一緒に導入される。いくつかのこのような実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドは、細胞中にヌクレオフェクションによって導入される。いくつかの特定の実施形態では、ＲＮＰベースの送達プラットフォームまたは全ＲＮＡ送達プラットフォームは、ＤＮＡプラスミドベースの送達系よりも、初代細胞において低い細胞毒性を提供する。
特定の実施形態では、方法は、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含むヒト細胞において大幅に増強されたゲノム編集効率を提供する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、変異原性ＮＨＥＪおよび遺伝子破壊を示し得る、挿入または欠失（インデル）の頻度を増大する。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有する修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してインデルの頻度を増大する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡおよびＣａｓのｍＲＮＡの、ヒト初代Ｔ細胞への同時送達は、非修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓのｍＲＮＡの同時送達と比較して、インデルの頻度を増大する。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有する修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、ヒト初代Ｔ細胞においてインデルの頻度を増大する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してｇＲＮＡ安定性を改善する。１つの例として、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡを上回って、ヌクレアーゼに対する安定性を中程度に改善し、また塩基対形成の熱安定性を改善する。別の例として、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、ヌクレアーゼに対する安全性を劇的に改善する。ｇＲＮＡ末端修飾は、エキソヌクレアーゼに対する細胞内安定性を増強し、従って、ＣａｓのｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、細胞または細胞溶解物中に同時送達されるか、逐次送達される場合にゲノム編集の有効性の増大を可能にすることが考慮される。特定の実施形態では、末端における安定性増強修飾は、ガイド配列が同一の末端を含む場合、特異性増強修飾としても役立つことができる。特定の実施形態では、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－３’－ホスホノ酢酸、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－チオホスホノ酢酸、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－３’－ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを含む末端修飾は、本発明の方法の安定性および特異性を増大させる。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、標的遺伝子組換えを刺激し、これは、順に、例えば、相同組換えまたはＮＨＥＪによる遺伝子編集を可能にする。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡよりも高いレベルの相同組換えを刺激する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、高い特異性を保持する。特定の実施形態では、非修飾ｇＲＮＡと比較されるように、修飾されたｇＲＮＡを用いた場合に、オンターゲット対オフターゲットのインデル頻度の比は改善される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質とのＲＮＰ複合体で送達された修飾されたｇＲＮＡは、ＤＮＡプラスミドベースの送達系と比較して大幅に良好なオンターゲット対オフターゲット比を提供する。
［遺伝子発現調節］
特定の実施形態では、本明細書において記載されるガイドＲＮＡは、対象の遺伝子の転写または発現を調節するために使用される。例えば、特定の実施形態では、遺伝子の転写を増大するために、Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）および転写アクチベーターポリペプチドを含む融合タンパク質が使用される。同様に、特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）およびリプレッサーポリペプチドを含む融合タンパク質は、遺伝子の転写を干渉することによって遺伝子発現をノックダウンするために使用される。
少なくとも１つの態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで対象の遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。方法は、細胞または別の系の中に、（ｉ）本明細書において記載される合成ガイドＲＮＡおよび（ｉｉ）融合タンパク質を導入するステップを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメインまたはエピジェニック修飾ドメインなどのエフェクタードメインを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヌルヌクレアーゼであるＣａｓ９タンパク質などの突然変異したＣａｓタンパク質を含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａおよび／またはＮ８６３Ａなどの１つまたは複数の突然変異を含有する。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、精製または非精製タンパク質として細胞または系の中に導入される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡによって細胞または系の中に導入される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする直鎖または環状ＤＮＡによって細胞または系の中に導入される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、融合タンパク質を、染色体配列、エピソーム配列、プラスミド、ミトコンドリアＤＮＡ配列またはエンハンサーなどの機能的遺伝子間配列または非コーディングＲＮＡのＤＮＡ配列を含む特定の標的ポリヌクレオチドに指向させるのに役立つ。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、標的ポリヌクレオチドにおいて配列の発現を調節する。遺伝子発現を調節するためのガイドＲＮＡは、機能的ＲＮＡをコードする任意の所望の内因性遺伝子または配列を標的化するように設計され得る。ゲノム標的配列は、内因性遺伝子の転写開始部位の付近で、あるいは、内因性遺伝子の翻訳開始部位の付近で選択され得る。特定の実施形態では、標的配列は、遺伝子の「プロモーター近位」領域と伝統的に呼ばれるＤＮＡの領域中にある。特定の実施形態では、標的配列は、転写開始部位の約１，０００塩基対上流から転写開始部位の約１，０００塩基対下流の領域中にある。特定の実施形態では、標的配列は、遺伝子（例えば、別の染色体上の）の転写のための開始部位から離れている。
特定の実施形態では、方法は、マルチプレックス適用のためのものである。特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡのライブラリーを細胞または系の中に導入することを含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも１，０００，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００，０００種の異なる配列を標的化する。
［キット］
一態様では、本発明は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を製造するステップ、および／または標的ポリヌクレオチドを結合、ニッキングもしくは切断するためのその活性を支持するステップを含む、上記の方法を実施するための試薬を含有するキットを提供する。特定の実施形態では、本明細書において開示される方法の１種または複数の反応成分、例えば、１種または複数のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、使用のためのキットの形態で供給され得る。特定の実施形態では、キットは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸および本明細書において記載される１種または複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのライブラリーのセットを含む。特定の実施形態では、キットは、１種または複数のその他の反応成分を含む。特定の実施形態では、１種または複数の反応成分の適当な量が、１つまたは複数の容器中で提供されるか、または基板上に保持される。
特定の実施形態では、本発明は、異なる修飾、またはガイド配列内の異なる位置での修飾を除いて同一である、少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡを含む合成ガイドＲＮＡを選択するためのキットを提供する。各ガイドＲＮＡは、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとを含み；前記ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎ（Ｎは、－１０から１０の間、任意選択的に１０から６の間の整数である）を含み、および該ガイド配列内のヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、前記少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの異なる特異性増強修飾を有する点、または前記ガイド配列内の少なくとも１つの異なる位置に特異性増強修飾を有する点で、互いに異なる。キットはまた、Ｃａｓタンパク質を含むか、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、キット内の各合成ガイドＲＮＡは、異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を含む。特定の実施形態では、キットは、各々のものがガイド配列内の異なるヌクレオチド位置に修飾を有する、一連の合成ガイドＲＮＡを含む。特定の実施形態では、キットは、ガイド配列内のヌクレオチドの数と同数の異なるガイドＲＮＡを有する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。特定の実施形態では、特異性増強修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、もしくは２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、特異性増強修飾は、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、合成単一ガイドＲＮＡである。
キットのさらなる成分の例は、これらに限定されないが、１種または複数の異なるポリメラーゼ、１種または複数の宿主細胞、外来核酸を宿主細胞中に導入するための１種または複数の試薬、ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出するための、または標的核酸の状態を確認するための１種または複数の試薬（例えば、プローブまたはＰＣＲプライマー）およびバッファー、トランスフェクション試薬または反応のための培養培地（１×またはより濃縮された形態の）を含む。特定の実施形態では、キットは、生化学的および物理的支持体、終結、修飾および／または消化試薬、浸透圧調節物質ならびに反応、トランスフェクションおよび／または検出のための装置の成分のうち、１種または複数を含む。
使用される反応成分は、種々の形態で提供され得る。例えば、成分（例えば、酵素、ＲＮＡ、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に懸濁されるか、またはビーズに結合されるか、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥された粉末もしくはペレットとしてであり得る。後者の場合には、成分は、再構成されると、アッセイにおいて使用するための成分の完全混合物を形成する。本発明のキットは、任意の適した温度で提供され得る。例えば、液体中にタンパク質成分またはその複合体を含有するキットの貯蔵のためには、それらが０℃未満で、好ましくは、約－２０℃で、おそらくは、グリセロールまたはその他の適した凍結防止剤を含有する凍結耐性溶液中で提供され、維持されることが好ましい。
キットまたは系は、少なくとも１種のアッセイにとって十分な量で、本明細書において記載される成分の任意の組合せを含有し得る。いくつかの適用では、１種または複数の反応成分は、個々の、通常、ディスポーザブルのチューブまたは同等の容器中に予め測定された単回使用量で提供され得る。このような配置を用いて、標的核酸または標的核酸を含有するサンプルもしくは細胞を、個々のチューブに直接添加することによってＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ反応が実施され得る。キット中に供給される成分の量は任意の適当な量であり得、製品が向けられる市場に応じて変わり得る。成分が供給される容器（複数でもよい）は、供給された形態を保持可能である任意の従来の容器、例えば、マイクロチューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、ボトルまたは流体装置、カートリッジ、ラテラルフローまたはその他の同様の装置などの複合的試験装置であり得る。
キットはまた、容器または容器の組合せを保持するためのパッケージング材料を含み得る。このようなキットおよび系の通常のパッケージング材料は、種々の立体配置のいずれかの中に（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイ中など）反応成分または検出プローブを保持する固体マトリクス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子など）を含む。キットは、成分の使用のための有形の形態で記録された使用説明書をさらに含み得る。
［実施例１］
生理的塩条件で結合エネルギーに対する化学修飾の効果を評価するために、２０ヌクレオチドガイド配列を有する４３ヌクレオチドのｃｒＲＮＡを作製した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各末端上に突出している１０ヌクレオチドを含む相補的４０ヌクレオチドＤＮＡオリゴヌクレオチドとｃｒＲＮＡを混合することによって、二本鎖を形成した。その二本鎖の融解温度（「Ｔｍ」）を測定した。サンプリングおよびロッキング領域にいくつかの連続する修飾を有し、２０ｎｔガイド配列内の位置１０に介在または「スペーサー」ヌクレオチドを有する、７つのさらなる４３ｎｔのｃｒＲＮＡを作製した。図６Ａは、修飾の種類および配置を示す。エキソヌクレアーゼ耐性修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）であり、スペーサーは、非修飾ＲＮＡヌクレオチドであった。各修飾ｃｒＲＮＡ６０１を、相補的な４０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド６０３と混合することによって二本鎖を個々に形成し、ＲＮＡ鎖に修飾を含有する各ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖６０５の融解温度を測定して、種々の修飾が生理的塩条件下で結合エネルギーにもたらす効果を定量した。
修飾が二本鎖融解の協同性にもたらす効果は、融解曲線の傾きを測定することによって定量的に評価することができ、より大きい傾きは、結合解除に関して（およびしたがって、平衡可逆性の十分に確証されている原理に従って逆過程中には同じく結合に関して）より大きい協同性を示す。図６Ｂは、非修飾ｇＲＮＡについての融解曲線を示し、図６Ｃ～６Ｇは、２０ｎｔガイド配列部分中のヌクレオチド６～９における種々の種類の修飾についての融解曲線を示す。２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）および２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート（「ＭＳ」）の付加は、修飾あたり約０．２℃、結合エネルギーを増加させたが、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）は、修飾あたり１℃、Ｔｍを低下または結合エネルギーを減少させ、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）は、修飾あたり１．４℃、Ｔｍを低下させた。図７は、ｇＲＮＡを、１７、１８もしくは１９ヌクレオチドに末端切除した、または２１もしくは２２ヌクレオチドの長さに伸長したときの、２０塩基対ｇＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度の変化を示すグラフである。測定は、生理的塩濃度で実施した。測定は、２０ヌクレオチドガイド配列の伸長または末端切除について塩基対あたり約２℃の融解温度の変化を示した。
［実施例２］
ｃｒＲＮＡのガイド配列内のヌクレオチド９にリンカーまたはリンカー様修飾を含有する実験的ｃｒＲＮＡを使用して、さらなる融解温度測定を実施した。リンカーまたはリンカー様修飾は、ＵＬＮＡ（アンロックド核酸）、脱塩基スペーサー、－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２）ｍ－ＰＯ４Ｙ－を含むアルキレンスペーサー、または（－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２ＣＲ３ ２Ｏ）ｎ－ＰＯ３Ｙ－）を含むエチレングリコールスペーサー（前記式中、ｍは、２、３または４であり、ｎは、１、２または３であり、各Ｒ３は、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルからなる群から独立に選択され、各Ｙは、Ｈまたは負の電荷である）を含んだ。例えば、特定の実施形態では、アルキレンスペーサーは、ｍが３である、「Ｃ３スペーサー」である。その他の実施形態では、エチレングリコールスペーサーは、ｎが３である、「トリＰＥＧスペーサー」である。これらの修飾はまた、ハイブリダイゼーションの協同性を低下させる、鎖へのより大きい可動性の付与によって、結合エネルギーを減少させる。
Figure 0007093728000008
これらの融解温度測定の結果を表１に示す。
Figure 0007093728000009
［実施例３～７］
化学合成されたガイドＲＮＡの、ＤＮＡ標的配列に結合し、切断する能力を評価するために、およびＣａｓ９媒介性切断に対する種々の修飾の効果を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用した。簡単に述べると、表２および７に示す標的ポリヌクレオチド配列（オン）またはオフターゲットポリヌクレオチド（オフ）を含む、ＰＡＭによりアドレス可能な（ＰＡＭ－ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）ＤＮＡ構築物を、種々の標的遺伝子のプラスミドにより保持されるヒト配列の分取ＰＣＲ増幅によって調製した。遺伝子を選択的に編集する本組成物および方法の能力を実証するための例示的な遺伝子として、ヒトクラスリン軽鎖ＣＬＴＡ遺伝子、ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）遺伝子、ヒトインターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、およびヒト細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＬＴＡ４）遺伝子を、標的遺伝子として使用した。これらは、標的遺伝子を評価および編集するための本明細書において開示される一般的アプローチの代表である。
表３～６は、合成ガイドＲＮＡを示す。ガイドＲＮＡの大部分において、５’末端の最初の２０ヌクレオチドは、標的ＤＮＡ内の標的配列と相補的であり、つまりこれらの相補的ヌクレオチドがガイド配列を構成する。一部のガイドＲＮＡには、標的配列と相補的でないオーバーハングまたは伸長部が、ガイド配列の５’末端に存在した。一部のガイドＲＮＡでは、ガイド配列の５’末端を、ヌクレオチド１、または１および２、または１および２および３が存在しないように末端切除した。オンターゲット構築物（「オン」）は、２０ｎｔ標的配列を含む。オフターゲット構築物（「オフ」）は、１、２または３ヌクレオチド異なる、標的ＤＮＡとほぼ同一の２０ヌクレオチドを含む。したがって、ｇＲＮＡは、オフターゲット構築物の配列と完全にではないがほぼ相補的であった。オフターゲット構築物は、ヒトゲノム内に存在することが公知の遺伝子配列に基づいている。
ｇＲＮＡを、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３３，１１５４０－５６に記載される手順に従って２’－Ｏ－チオノカルバメート保護されたヌクレオシドホスホラミダイトを使用してＡＢＩ ３９４ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で合成した。２’－Ｏ－メチルホスホラミダイトを、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護されたホスホラミダイトと同一の条件下でＲＮＡオリゴマー中に組み込んだ。チオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）修飾されたＲＮＡの合成のために使用された２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ酢酸－１，１－ジメチルシアノエチルエステル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルヌクレオシドは、公開された方法に本質的にしたがって合成した。Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，９４０－５０およびＴｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０，７４－５４を参照のこと。
すべてのオリゴヌクレオチドを、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ｑ－ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ系を使用する液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。ｓｇＲＮＡの合成および精製の収率は、ＬＣ－ＭＳ由来の総イオンクロマトグラムから得られた質量分析スペクトルの逆重畳積分を使用して推定した。１００マーのｓｇＲＮＡの化学合成は、通常、名目上１マイクロモル規模の合成から２５～３５％全長生成物をもたらした。イオン対形成バッファー条件を使用する逆相ＨＰＬＣ精製は、通常、粗生成物からの２０％の収率を与え、最終ｓｇＲＮＡの推定される純度は、９０％～９５％の範囲にある。
ＤＮＡ標的構築物は、表２に示す標的配列（オンターゲット配列としても公知であり、「ＯＮ」として特定される）およびオフターゲット配列（「オフ」）を含んだ。オフターゲット配列中の標的配列と異なる部分は、太字のイタリック体であり、ＰＭＡ配列（示される場合）は、下線付きである。
Figure 0007093728000010
ＨＢＢオフ１は、可能性ある標的配列の最初の３つのヌクレオチドがＨＢＢオンと異なることに留意されたい。したがって、１７ｎｔのガイド配列を得るためにその２０ｎｔのガイド配列の５’末端の３ヌクレオチドを末端切除したｇＲＮＡは、ＨＢＢ－オン標的配列とＨＢＢ－オフ１標的配列間の識別ができない。実施例３～７において使用したＤＮＡ標的構築物の完全配列を下記の表８に示す。
比較のために、２０ヌクレオチドから１８または１７ヌクレオチドへのｇＲＮＡのガイド配列の末端切除を有するガイドＲＮＡを、標的遺伝子部位の切断の公知オフターゲット部位の切断に対する比の評価とともに含める。Ｙａｎｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）による教示および結論とは対照的に、末端切除は、特定のオフターゲット部位の切断には効果があるが、その他のオフターゲット部位での切断には効果がないことが分った。Ｙａｎｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）の教示にもかかわらず、本発明者らは、増強された特異性を有し、ガイド配列の末端切除を有しない、標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓのための新規化合物および方法を模索し、同定した。
２０μＬの反応容量中で、２．５ｎＭの線形化ＤＮＡ標的を、５０ｎＭのｓｇＲＮＡ、４０ｎＭの組換え精製Ｃａｓ９タンパク質（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ａｇｉｌｅｎｔ製）および０．８ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ７．６で、３７℃で１時間インキュベートした。完了し次第、０．５μＬのＲＮａｃｅ Ｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）を添加し、インキュベーションを３７℃で５分間、次いで、７０℃で１５分間継続した。粗生成物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２２００で分析のためにＤＮＡ １０００もしくはＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐにロードするか、またはＡｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ２２００もしくは４２００での分析のためにゲノムＤＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅもしくはＤ５０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅにロードした。精密検査ステップは、標的ＤＮＡとの結合からＣａｓ９を解放させるのに役立ち、これを切断についてアッセイした。
切断収率は、式ａ／（ａ＋ｂ）×１００（式中、ａは、２種の切断生成物のバンド強度の合計であり、ｂは、存在する場合、残存する未切断ＤＮＡである）によって算出した。１００％の切断パーセンテージは、検出限界内で、標的ＤＮＡ構築物のすべてが切断されたことを意味する。
［実施例３］
ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ１」遺伝子座を標的とする３２個の一連のｓｇＲＮＡを作製した。簡単に言えば、個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全長鎖の純度および質量分析による化学組成に基づいて品質管理承認した。表３は、種々のＣＬＴＡ１－ｓｇＲＮＡの配列を示す。表３は、ｓｇＲＮＡの配列をエントリー１～３１として示し、この表は、１つまたは複数の特異性増強修飾を含有する本ｇＲＮＡの特定の実施形態を開示する。エントリー１は、修飾されておらず、比較例として役立つ。エントリー２は、ガイド配列内のヌクレオチド１、２および３にＭＳ修飾を含有する。エントリー３は、ガイド配列内のヌクレオチド１、２および３にＭＳＰ修飾を含有する。エントリー４は、ガイド配列のヌクレオチド１にＭＳＰ修飾を含有する。エントリー５および６は、その２０ｎｔガイド配列が５’末端で１８ヌクレオチドガイド配列または１７ヌクレオチドガイド配列へと末端切除されたｇＲＮＡをそれぞれ有する比較例である。エントリー７および８は、２０ｎｔガイド配列の５’末端にそれぞれ１または２ヌクレオチドオーバーハングがある非修飾ｇＲＮＡを有する比較例である。エントリー９、１０、１１、１２および１３は、ガイド配列内のヌクレオチド１、ヌクレオチド１～２、ヌクレオチド１～３、ヌクレオチド１～４、およびヌクレオチド１～５にそれぞれＭＰ修飾を含有する。エントリー１４および１５は、ヌクレオチドを一般にポリクレオチドの５’末端から数えることに留意して、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ内の、ｓｇＲＮＡの３’末端から数えてヌクレオチド２～５、またはｓｇＲＮＡの３’末端から数えてヌクレオチド２～６に、ＭＰ修飾をそれぞれ含有する。したがって、エントリー１４および１５について記載する数え方は、通則の例外である。エントリー１６および１７は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～２にＭＰ修飾を含有し、ＭＰ修飾されたＣまたはＧヌクレオチドオーバーハングをそれぞれ有する。エントリー１８および１９は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～３にＭＰ修飾を含有し、ＭＰ修飾されたＵＣまたはＡＧジヌクレオチドオーバーハングをそれぞれ有する。エントリー２０および２１は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～４にＭＰ修飾を含有し、ＭＰ修飾されたＣＵＣまたはＧＡＧトリヌクレオチドオーバーハングをそれぞれ有し、加えて、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ内の、ｓｇＲＮＡの３’末端にＭＰ修飾を有する。エントリー２２～２５は、ガイド配列内のヌクレオチド２０、１９、１８または１７にＭＰ修飾を含有する。エントリー２６は、ガイド配列内のヌクレオチド１８および１７にＭＰ修飾をそれぞれ含有する。エントリー２７～２９は、ガイド配列内のヌクレオチド１９、１８または１７にＭ修飾をそれぞれ含有する。エントリー３０は、ガイド配列内のヌクレオチド１８および１７にＭ修飾を含有する。エントリー３１は、ガイド配列内のヌクレオチド１～２０にＭ修飾を含有する。エントリー３２は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～７、９～１１、１３～１４および２０にＭ修飾を含有し、加えて、ｓｇＲＮＡ配列の残部にわたっていくつかの選ばれた位置に、特に、ヌクレオチド３０～３１、３３、３５～３６、３９、４２、４５、４７、５０、６０、６５～６６、７０、７１、７６～７７、８０～８２、９０、９３、９５～９６、１００～１０１、１０４、および１０６～１１２に、Ｍ修飾を含有する。
Figure 0007093728000011
図８Ａは、Ｃａｓ９媒介性標的ポリヌクレオチド切断対オフターゲットポリヌクレオチド切断に関しての表３からのｇＲＮＡ（配列番号１２～４２および１２４）における化学修飾の影響を示す。より詳細には、ＣＬＴＡ１標的ポリヌクレオチド配列（オンターゲット配列、または「オン」）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ１およびオフ３）の切断パーセンテージを数値によっておよび棒グラフ形式で示す。アッセイした各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号１２～４２および１２４）について算出した、切断された標的ポリヌクレオチドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比を用いて、図８Ａの結果から図８Ｂを導き出す。アッセイしたｓｇＲＮＡごとにそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを各比に掛けることによって、特異性スコアも算出する。図８Ｂのエントリー６、１２、１３、２０、２１および３１の陰付きの値は、標的ポリヌクレオチド配列（ＯＮ１）についての切断収率のわずかな乃至は相当な低減の結果として得られる。重要なこととして、オフターゲットポリヌクレオシドの一方または両方について低減がさらに大きく、２．０より大きいオン：オフ切断比が得られた。陰付きの値は、特異性の少なくとも２倍の改善を得ることができることを示す。この実験で試験した種々の化学修飾および組合せの中で、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾は、特に、ガイド配列内の最適な数の位置にそれを組み込んだとき、高いオンターゲット切断レベルを保持しながら最大の所望されるオフターゲット切断減少効果をもたらした。これらの実施例は、本教示の実施形態として役立つ。
［実施例４］
図９Ａに示す例について、オフターゲット切断活性に対するオンターゲット切断活性によって判断して特異性の改善を生じさせる修飾位置が分るように、２０ｎｔガイド配列を横断して単一または三重のＭＰ修飾の「ウォーキング」を行った。表４に列挙するように、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ４」遺伝子座を標的とする２８個の一連のｓｇＲＮＡ（配列番号４３～７０）を作製し、これらの実験的ｓｇＲＮＡは、最後の（すなわち最も３’側の）ヌクレオチド間連結を含むｓｇＲＮＡの３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ領域内の、ヌクレオチド１および最後から２番目のヌクレオチドにもＭＰ修飾を有することに加えて、ガイド配列内の１つまたは複数の位置に２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾を含有した。したがって、そのような修飾ｓｇＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる切断から保護するように、末端ヌクレオチド間連結の修飾を設計した。個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全長鎖純度および質量分析による化学組成に基づいて品質管理承認した。ＣＬＴＡ４標的ポリヌクレオチド配列（「オン」）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ１、オフ２およびオフ３）の切断パーセンテージを数値によっておよび棒グラフ形式で図９Ａに示す。アッセイした各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号４３～７０）について算出した、切断された標的ポリヌクレオチドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比を用いて、図９Ａの結果から図９Ｂを導き出す。「ラージ」と記録されている比は、オフターゲットＤＮＡポリヌクレオチドの切断がそれらの個別のアッセイにおいて検出されなかったことを示す。上記の図８Ｂについての説明の中で述べたように、特異性スコアは、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。図９Ｂによって示される例では、特異性スコア≧２．０に陰を付けて、陰付きでないスコアに対する特異性の改善を示す。陰を付けることで、特異性の少なくとも２倍の改善をもたらしたガイド配列内のＭＰ位置を示す。エントリー１～１８におけるＭＰウォーキングの結果は、ウォーキングを行ったＭＰ修飾の配置に特異性に対する効果があることを示し、アッセイしたオフターゲット部位ごとの特異性スコアの各セットについて、エントリー３～１８と比較してエントリー１および２で分るように、ガイド配列の５’末端付近のＭＰ修飾のほうがガイド配列内のその他の位置でのＭＰより大きく特異性を増強することを示す傾向が明らかである。この傾向は、図８Ｂにおけるエントリー１２～１３および２０～２１の陰付きスコアによって示されるように、ＣＬＴＡ１－ｓｇＲＮＡの５’末端に加えられたＭＰ修飾が特異性を増強した、ＣＬＴＡ１標的配列に標的化されたｇＲＮＡのＭＰ修飾について観察された特異性増強傾向と、一致する。あらゆる事例に有効であるわけではおそらくないが、特異性を改善するための一般戦略は、ｇＲＮＡ内のガイド配列の５’末端における連続するホスホジエステルヌクレオチド間連結に１、２、３、４または５つのＭＰ修飾を組み込むことである。
Figure 0007093728000012
［実施例５］
図１０に示す実施例では、オフターゲット切断活性に対するオンターゲット切断活性によって判断して特異性の改善を生じさせる修飾位置が分るように、２０ｎｔガイド配列を横断して単一または三重のＭＰ修飾の「ウォーキング」を行った。表５に列挙するように、ヒトＩＬ２ＲＧ遺伝子内の遺伝子座を標的とする３０個の一連のｓｇＲＮＡ（配列番号７１～８６および１７３～１８６）を作製した。実験的ｓｇＲＮＡは、最後の（すなわち最も３’側の）ヌクレオチド間連結を含むｓｇＲＮＡの３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ領域内の、ヌクレオチド１および最後から２番目のヌクレオチドにもＭＰ修飾を有することに加えて、ガイド配列内の１つまたは複数の位置に２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾を含有した。したがって、ｓｇＲＮＡをエキソヌクレアーゼから保護するように、末端ヌクレオチド間連結の修飾を設計した。個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全長鎖純度および質量分析による化学組成に基づいて品質管理承認した。ＩＬ２ＲＧ標的ポリヌクレオチド配列（オン）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ３）の切断パーセンテージを数値によって図１０に示す。この図は、アッセイした各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号７１～８６および１７３～１８６）について算出した、切断された標的ポリヌクレオチドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比も示す。特異性スコアは、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。特異性スコア≧２．０に陰を付けて、陰付きでないスコアに対する特異性の改善を示し、したがって、陰を付けることで、特異性の少なくとも２倍の改善をもたらしたガイド配列内のＭＰ位置を示す。図１０には、特異性の最大の改善をもたらしたガイド配列内の位置を、濃い陰を付けることによって示す。位置７、１４または１６のＭＰ修飾からの結果をエントリー６、１３および１５に関してそれぞれ示す。そのような組成物を有するガイドＲＮＡは、特に、臨床的に重要なＩＬ２ＲＧ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの種々のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓへの応用のために、ＭＰ修飾を欠くｇＲＮＡなどの、その他の一般に使用される組成物と比較して、特異性の性能を増強することができる。図１０によって表される実施例は、ウォーキングを行うＭＰ修飾位置に起因して特異性増強が生じる位置（１つまたは複数）を同定するための、ｇＲＮＡのガイド配列部分を横断するＭＰ修飾の本新規「ウォーキング」方法も示す。特異性増強の大きさを、試験した各位置についてのオンターゲット対オフターゲット切断比によって評価し、実施者は、そのような値を、ｇＲＮＡの全般的性能に恩恵をもたらす可能性が高いＭＰ修飾位置（１つまたは複数）を決定する際に、各設計のために測定されるオンターゲット切断のパーセンテージとともに考慮することができる。ガイド配列を横断する単一ＭＰの漸進的ウォーキングによって、ウォーキングにより試験した位置でのＭＰ修飾の１つまたは複数の組合せの結果として生じる特異性の可能性ある相乗的改善のための配列内の位置を同定することもできる。
Figure 0007093728000013
［実施例６］
図１１Ａに示すようにヒトＨＢＢ遺伝子に標的化されたガイド配列を横断して漸進的な位置にＭＰ修飾を組み込むことで修飾「ウォーキング」を行って、２０ｎｔガイド配列内の種々の部位が、オンターゲット部位の実質的切断、およびオフターゲット部位の切断減少をもたらすことができるかどうかを見た。表６に列挙するようなＨＢＢ遺伝子を標的とする６５個の一連のｓｇＲＮＡを作製し、この場合の実験的ｓｇＲＮＡは、最後の（すなわち最も３’側の）ヌクレオチド間連結を含むｓｇＲＮＡの３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ領域内の、ヌクレオチド１および最後から２番目のヌクレオチドにもＭＰ修飾を有することに加えて、ガイド配列内の１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置に２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾を含有した。したがって、ｓｇＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するように、末端ヌクレオチド間連結の修飾を設計した。個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全長鎖純度および質量分析による化学組成に基づいて品質管理承認した。ＨＢＢ標的ポリヌクレオチド配列（オン）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ１）の切断パーセンテージを数値によって図１１Ａに示す。この図は、アッセイした各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号８７～１０３）について算出した、切断された標的ポリヌクレオチドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比も示す。特異性スコアは、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。特異性スコア≧２．０に陰を付けて、陰付きでないスコアに対する特異性の改善を示し、したがって、陰を付けることで、特異性の少なくとも２倍の改善をもたらしたガイド配列内のＭＰ位置を示す。図１１Ａでは、エントリー２、６および８にそれぞれ示されているように位置５、９または１１のＭＰ修飾の結果として生じた特異性の最大の改善をもたらしたガイド配列内の位置を、濃い陰を付けることによって示す。そのような組成物を有するガイドＲＮＡは、特に、臨床的に重要なＨＢＢ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの種々のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓへの応用のために、ＭＰ修飾を欠くｇＲＮＡなどの、その他の一般に使用される組成物と比較して、特異性を増強することができる。図１１Ａによって表される実施例はまた、ウォーキングを行うＭＰ修飾位置に起因して特異性増強が生じる位置（１つまたは複数）を同定するための、ｇＲＮＡのガイド配列部分を横断するＭＰ修飾の本発明者らの「ウォーキング」方法を例示する。特異性増強の大きさを、試験した各位置についてのオンターゲット対オフターゲット切断比によって評価し、実施者は、そのような値を、ｇＲＮＡの全般的性能に恩恵をもたらす可能性が高いＭＰ修飾位置（１つまたは複数）を決定する際に、各設計のために測定されるオンターゲット切断のパーセンテージとともに考慮することができる。ガイド配列を横断する単一ＭＰの漸進的ウォーキングによって、ウォーキングにより試験した位置でのＭＰ修飾の１つまたは複数の組合せの結果として生じる特異性の可能性ある相乗的改善のための配列内の位置を同定することもできる。
同一の２０ｎｔガイド配列を有するＨＢＢ ｓｇＲＮＡを使用する関連実験では、Ｋ５６２細胞内のゲノムＨＢＢ標的遺伝子座の編集についての特異性を評価し、このｉｎ ｖｉｖｏでの２０塩基対標的配列は、表１１Ａでｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチド構築物において試験したのと同一であった。図１１Ｂは、各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号１８７～１９０）をＣａｓ９ ｍＲＡＮとともに同時トランスフェクトし、標的遺伝子座の切断、および図１１Ａにおいて評価したのと同一のオフターゲット配列オフ１を含む３つのオフターゲット遺伝子座の切断を測定することによって、Ｋ５６２細胞内のヒトＨＢＢゲノムを標的とするｓｇＲＮＡにおける種々の種類の修飾の影響を示す。アッセイした各合成ｓｇＲＮＡについて、切断された標的ポリヌクレオチド（オン）の切断されたオフターゲットポリヌクレオチド（オフ１）に対する比を算出する。特異性スコアは、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。結果は、ガイド配列におけるＰＡＣＥ修飾が、試験した種々の種類の修飾について、特に、主要オフターゲット活性（オフ１でのもの）に関して、特異性スコアによって評価して、特異性の実質的改善を生じたことを示す。
Figure 0007093728000014
［実施例７］
ＭＰ修飾に起因するオンターゲット対オフターゲット特異性増強を判定するためのさらなる実験を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して溶液中で、または２つの型の培養ヒト細胞において、実施した。２つの細胞型は、Ｋ５６２細胞および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知である）であった。個々のウェルの中で、組換えＣａｓタンパク質と予め複合体を形成しているＭＰ修飾されたｇＲＮＡを培養細胞にトランスフェクトした。ゲノムＨＢＢ標的遺伝子座についての編集の特異性を評価し、この培養細胞内の２０塩基対標的配列は、図１１Ａおよび１２Ａにおいて評価したポリヌクレオチド構築物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイしたのと同一であった。図１２Ａのエントリー１～１７（配列番号８７～１０３）は、図１１Ａと同一の結果を示す。図１２Ａのデータは、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけしたものである。エントリー１８～６４（配列番号１２５～１７１）は、ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイした切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置におけるさらなるＭＰ修飾の影響を示す。すべてのエントリーについて、アッセイした各合成ｓｇＲＮＡについての切断された標的ポリヌクレオチド（オン）の切断されたオフターゲットポリヌクレオチド（オフ１）に対する比を算出した。特異性スコアは、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出した。エントリー１８～６４は、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけしたものである。最高スコアを有するエントリーに陰を付ける。
図１２Ｂは、図１２Ａについてポリヌクレオチド構築物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験したのと同一の２０塩基対配列を有するゲノムＨＢＢ標的の編集結果を示す。図１２Ｂについて、ゲノムＨＢＢ標的部位は、試験したヒトＫ５６２細胞およびｉＰＳ細胞において内因性である。結果を、２０ｎｔガイド配列に組み込まれたＭＰ修飾の数によってグループ分けする。図１２Ａ中のエントリー１～１７ならびに図１２Ｂ中のエントリー１～１２および２２～３３は、５’末端の最初のヌクレオチド間連結におけるＭＰ修飾、およびエキソヌクレアーゼ分解から各ｓｇＲＮＡを保護するための各ｓｇＲＮＡの３’末端の最後のヌクレオチド間連結における別のＭＰに加えて、２０ｎｔガイド配列内の種々の位置における単一の内部ＭＰについての試験を表す。図１２Ｂのエントリー１～１２および２２～３３について試験したｓｇＲＮＡは、配列番号８８、９０、９２～９４、９６、９７、９９、１００、１０３、１７１および１７２であった。図１２Ｂのエントリー１３～１９および３４～４０について試験したｓｇＲＮＡは、配列番号１２８、１２９、１３３、１４１、１６０、１６５および１６８であった。これらのグループに、図１２Ａ中のエントリー１４ならびに図１２Ｂ中のエントリー７～９および２９～３１に示すものなどの、内部ＭＰ修飾を欠く対照の結果を含める。結果のその他のグループを、図１２Ａでエントリー１８～６４ならびに図１２Ｂでエントリー１３～１９および３４～４０について示すように、ｓｇＲＮＡの各末端にエキソヌクレアーゼを阻害するための単一のＭＰ修飾を有することに加えて、２０ｎｔガイド配列内の種々の位置に２つの内部修飾を有するｓｇＲＮＡのために作製した。それらの種々のグループを、これらの図中で太い黒線によって分ける。これらの図は、図１２Ａ中のエントリー１～２ならびに図１２Ｂ中のエントリー１～２および２２～２３に示すように、最大の特異性増強をｉｎ ｖｉｔｒｏでもたらす内部ＭＰ位置が、両方の細胞型における最大の増強をもたらす位置と同一であることを示す。図１２Ａ中でエントリー３～５ならびに図１２Ｂ中のエントリー３～５および２４～２６に示すように、より明るい陰を付けることによって、内部ＭＰ修飾に起因する特異性増強のすぐ下の階層を示す。ＨＢＢ ｓｇＲＮＡにおける内部ＭＰ修飾の位置の結果として生じる特異性増強の相対順位は、図１２Ａ中のエントリー１～１７ならびに図１２Ｂ中のエントリー１～１２および２２～３３に示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにわたって顕著に一致する。
１対の内部ＭＰ修飾についての結果を、図１２Ａ中のエントリー１８～６４に関してならびに図１２Ｂ中のエントリー１３～１９および３４～４０に関して別々にグループ分けしたところ、特異性スコアによって順位付けしたこれらの設計のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの相対性能は、種々のアッセイおよび細胞型にわたって顕著に一致する。特異性増強を評価するわずかに異なる方法は、図１２Ａおよび１２Ｂ中のＨＢＢ例についてのオン：オフ１である、オンターゲット対オフターゲット比を単に考慮する方法である。この代替測定基準を使用して、グループごとに最高比から最低比へと並べ替えた、測定された比による図１２Ｂ中のグループの再順位付けを、図１２Ｃに示す。これらの図中の種々のグループを太い黒線によって分ける。図１２Ｂ中の特異性スコアについての本発明者らの観察結果に匹敵して、図１２Ｃに提示するオン：オフ１比による特異性のより単純な評価は、両方の細胞型にわって同様の結果を示す。実施例６および７は、特異性増強が、ＨＢＢ遺伝子を標的とする２０ｎｔガイド配列におけるＭＰ修飾の位置に依存することを実証する。
表５中のＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡの一部を使用する実験で、Ｋ５６２細胞におけるゲノムＩＬ２ＲＧ標的遺伝子座についての編集の特異性を評価した。また、表７（下に示す）のＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡを使用して、Ｋ５６２細胞におけるゲノムＶＥＧＦＡ標的遺伝子座の編集についての特異性も評価した。
Figure 0007093728000015
このようにして、２０ｎｔガイド配列をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。図１４は、Ｋ５６２細胞におけるＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡおよびＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡの種々のタイプの修飾の影響を示す。各合成ｓｇＲＮＡをＣａｓ９のｍＲＮＡとともに同時トランスフェクトし、標的遺伝子座の切断およびオフターゲット遺伝子座オフ２の切断を測定した。アッセイした各合成ｓｇＲＮＡについて、切断された標的ポリヌクレオチド（オン）の切断されたオフターゲットポリヌクレオチド（オフ２）に対する比を算出する。特異性スコアは、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。
図１４における結果は、ＩＬ２ＲＧおよびＶＥＧＦＡを標的とする合成ｇＲＮＡのガイド配列における修飾が、試験した種々の種類の修飾について、特に、オフターゲット活性（オフ２でのもの）に関して、特異性スコアによって評価して、特異性の実質的改善をもたらしたことを示す。エントリー１とは対照的に、エントリー２は、５’および３’末端ヌクレオチド間連結が修飾される、ＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡの両末端におけるＭＰ修飾の結果として生じる有意な特異性増強を示す。エントリー１および２とは対照的に、エントリー３および４は、ＩＬ２ＲＧガイド配列内の内部位置に、すなわち、それぞれ位置５または１１にＭＰ修飾を有するＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡについて、強い印象を与える特異性増強を示す。さらに、位置５のＭＰ修飾は、図１４中のエントリー１～４の中で最も大きい特異性増強をもたらした。
エントリー５とは対照的に、エントリー６～１０は、ＶＥＧＦＡガイド配列内の内部位置に、すなわち、それぞれ位置５、７、９、１０または１１にＭＰ修飾を有するＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡについて、有意な特異性増強を示す。エントリー５～１０にわたって増強を比較したとき、エントリー６について、２０ｎｔガイド配列の位置５におけるＭＰ修飾がＶＥＧＦＡに対する特異性の最大の増強をもたらしたことは、注目に値する。
異なるＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡ内のガイド配列を横断してＭＰウォーキングを行い、実施例４～７において提示したようにｉｎ ｖｉｔｒｏでオンターゲットおよびオフターゲットポリヌクレオチドの切断をアッセイすることによって、特異性増強をもたらす種々のガイド配列内のＭＰ修飾位置の複合マップを図１３に示す。詳細には、図１３は、図９Ａ、９Ｂ、１０および１１Ａからのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断の結果の比較を示す。図１３は、いくつかの重要な傾向を示す。第１に、図１３中のすべてのその他のエントリーとは対照的に、エントリー１２に示すように、それらの２０ｎｔガイド配列内の位置１５にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡは、Ｃａｓ９媒介性切断活性の実質的喪失を被った。これは、位置１５が、Ｃａｓ９媒介性切断に対するＭＰ修飾に対して特に不耐性であったことを示唆する。第２に、陰付き特異性スコアによって示すように、エントリー１～２を通して特異性増強傾向がある。この傾向は、種々の２０ｎｔガイド配列の５’末端へのまたはその付近へのＭＰ修飾の組込みが、ｇＲＮＡの標的特異性を増強するための一般に有用な設計戦略であり得ることを示唆する。このアプローチの有用性の別の例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＬＴＡ１遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの５’末端におけるＭＰ修飾に関して図８Ａおよび８Ｂに提示する結果について、上記実施例３で論じた。この一般アプローチの有用性のさらなる例は、図１１Ｂに示すように、トランスフェクトＫ５６２細胞におけるＨＢＢ遺伝子を標的とするｇＲＮＡの５’末端でのＭＳＰ修飾に関して、上記実施例６で論じた。ＭＰ修飾の特異性効果に関する第３の例は、別様に標的化された２０ｎｔガイド配列内の位置６のＭＰ修飾の結果として得られる特異性スコアが、上述の位置１５についての異常効果を無視すれば、ＭＰウォーキングあたりの最低スコアになる、図１３のエントリー３で明らかである。ＣＬＴＡ４オフ３、ＩＬ２ＲＧオフ３およびＨＢＢオフ１を含む一連のＭＰウォーキング各々について、位置６のＭＰ修飾に起因する特異性増強の最低点は、特に顕著であり、これは、同一ガイド配列内の隣接位置、すなわち、位置４、５または７（エントリー１、２または４を通して陰付きスコアとしてそれぞれ示す）のＭＰ修飾の結果として得られる特異性スコアとは対照的である。
実施例３～７は、ｇＲＮＡ内の多くの配列位置での修飾がオンターゲットポリヌクレオチドの標的特異的切断を妨げなかったので、ガイド配列内の特定の位置に修飾を含有するｇＲＮＡが、活性Ｃａｓタンパク質、およびｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって許容されることを実証する。実施例３～７は、本ｇＲＮＡ、複合体および方法が、少なくとも１．２、あるいは少なくとも１．５、あるいは少なくとも２、あるいは少なくとも２．５、あるいは少なくとも３、あるいは少なくとも３．５、あるいは少なくとも４、あるいは少なくとも４．５、あるいは少なくとも５のオンターゲット対オフターゲット比を達成することができること、および／または前記比が、１０、１２、１５もしくは２０以下であることも実証する。多くの場合、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾は、特異性増強のために所望どおりの高いオンターゲット切断レベルを保持しながらオフターゲット切断レベルを低下させることによって、比にプラスの効果をもたらした。
これらの実験の結果として、ガイド配列全体にわたって特定の部位における結合エネルギーを減少させる複数の修飾の組込みは、公知および未知のオフターゲット切断事象を減少させることになると予測される。
上述の実施例３～７において使用したＤＮＡ構築物の完全配列を表８に示す。標的ポリヌクレオチドまたはオフターゲット配列をＰＡＭ配列とともに太字で示し、ＰＡＭ配列には下線も付ける。
Figure 0007093728000016
Figure 0007093728000017
Figure 0007093728000018
Figure 0007093728000019
Figure 0007093728000020
Figure 0007093728000021
Figure 0007093728000022
Figure 0007093728000023
Figure 0007093728000024
Figure 0007093728000025
Figure 0007093728000026
［実施例８］
この実施例は、本開示による合成ｇＲＮＡを使用してＣａｓ９切断によって刺激される相同性指向修復（ＨＤＲ）を実証する。両方の染色体（Ｃｈｒ１１）対上に正常ＨＢＢ遺伝子を有するＫ５６２細胞を用意した。鎌状赤血球症（ＳＣＤ）突然変異を有するＨＤＲ用のＤＮＡドナー鋳型も用意した。実験は、ヘテロ接合細胞株を作出するためにＳＣＤ突然変異を付加またはノックインするようにＫ５６２細胞内のＨＢＢ遺伝子を編集しようするものであった。そのような細胞株は、ＳＣＤ疾患のモデル化に有用であるだろう。
化学修飾を有するまたは有しないｓｇＲＮＡを使用した。より詳細には、非修飾ｇＲＮＡ（Ｕｎｍｏｄｉｆ）、５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（１ｘＭＰ）、位置５ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（５ＭＰ＿１ｘＭＰ）、位置１１ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（１１ＭＰ＿１ｘＭＰ）、ならびにｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の代わりにバッファーで処理したｍｏｃｋトランスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ）の、２０ｎｔ合成ガイドＲＮＡを用いて実験を実行した。ＨＢＢ標的部位でのＨＤＲのための修復鋳型として役立てるためのｓｓＤＮＡオリゴとともに、Ｋ５６２細胞に（エレクトロポレーションによって）トランスフェクトするために、各ｓｇＲＮＡを別々に予めＣａｓ９タンパク質との複合体にした。各グループに関して、ドナーＤＮＡ鋳型を用いて（図１５におけるドナー＋）、およびドナーＤＮＡ鋳型を用いずに（図１５におけるドナー－）、実験を実行した。標的部位をｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体によって切断して、二本鎖切断を形成した。ドナーＤＮＡ鋳型の配列が、切断されたＤＮＡ標的配列の修復を方向づけるためにトランスフェクト細胞内の内因性ＤＮＡ修復酵素より使用されるように、ＨＤＲプロセスによって、切断を修復した。
修復鋳型として役立てるためにＫ５６２細胞にトランスフェクトした一本鎖ドナーＤＮＡ鋳型の配列は、
ＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＴＡＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴｇｔａＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣ（配列番後２００）
であった。
このオリゴヌクレオチドは、１５８ヌクレオチド長であり、小文字の「ｇｔａ」は、ＨＤＲによってノックインされることになるＳＣＤ突然変異のためのコドンである。トランスフェクト細胞を培養し、その後、トランスフェクションの４８時間後に回収した。ゲノムＤＮＡを単離し、ＨＢＢ遺伝子座およびその主オフターゲット遺伝子座を、両方とも、ディープシークエンシングのためにＰＣＲによって増幅して、（ｉ）Ｃａｓ９誘導インデル（図１５におけるオンターゲットインデルおよびオフターゲットインデル）の形成と、（ｉｉ）部分的ＨＤＲ（部分的オンターゲットＨＤＲ）と、（ｉｉｉ）ＳＤＣコドンを組込む完全ＨＤＲ（オンターゲットＨＤＲおよびオフターゲットＨＤＲ）とを含む編集結果を定量した。３種類すべての編集をオンターゲット部位（図１５における遺伝子座オン）で測定し、３種類のうちの２種類の編集が、Ｃｈｒ９上のゲノム内の主オフターゲット部位（図１５における遺伝子座オフ）で検出された。
図１５は、ヒトＫ５６２細胞におけるＨＢＢ遺伝子の相同性指向修復（ＨＤＲ）のこれらの実験からの結果を要約するものである。「遺伝子座オン」について報告する結果は（左から右へ）、オンターゲットＨＤＲ％、部分的オンターゲットＨＤＲ％、およびオンターゲットインデル％である。「遺伝子座オフ」について報告する結果は（左から右へ）、オフターゲットＨＤＲ％およびオフターゲットインデル％である。
この実験は、２０ｎｔガイド配列内の位置５および位置１１における特異性を増強するための化学修飾、特にＭＰ修飾が、オフターゲットインデルの形成をかなり大幅に低減させたばかりでなく、オフターゲットＨＤＲ活性も有意に低減させたことを実証する。この実験では、オフターゲット部位はまた、ＨＤＲ編集を受けるために十分なｓｓＤＮＡ修復鋳型との配列類似性も有したことに、注目された。
［実施例９］
この実験では、合成ガイドＲＮＡによるオフターゲット活性を２つの異なる、しかし補完的な方法で評価した。実施例７および図１２Ｂに関して上で説明したのと同一のｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してＨＢＢ標的部位およびオフターゲット部位に結合し、それを切断するために、いくつかの化学合成したガイドＲＮＡを使用した。したがって、第１の評価のために、ヒトＫ５６２細胞からのゲノムＤＮＡ内の実施者指定ポリヌクレオチド配列または遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、第２の評価のために、前記ゲノムＤＮＡの断片内の約１，０００のポリヌクレオチド配列または遺伝子座（実施者によって指定されたもの）のライブラリーを、市販の遺伝子座濃縮キットを使用することによって濃縮した。より詳細には、第１の評価では、ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行って、ＨＢＢ内の２０ｂｐ標的配列に関して３個以下のミスマッチを有し、かつ標的配列と比較して位置２１～２３にＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列（このようなＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９認識に必要である）のどちらかも含む、ヒトゲノム内の配列を構成する１６のオフターゲット部位を増幅した。第２の評価では、標的部位およびオフターゲット部位を捕捉するためにビオチン化オリゴヌクレオチドベイト（Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ）をＫ５６２細胞からのゲノムＤＮＡに対して使用することによって、オフターゲット活性を評価した。ＨＢＢ内の２０ｂｐ標的配列に関して５個以下のミスマッチを有し、かつ位置２１～２３にＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列のどちらかも有する、ヒトゲノム内の配列（合計おおよそ９６０配列）を選択的に捕捉するように、ベイトを設計した。オンターゲット配列およびオフターゲット配列は、次のとおりであった。
Figure 0007093728000027
両方の評価に、非修飾ｇＲＮＡ（Ｕｎｍｏｄｉｆ）、５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（１ｘＭＰ）、位置５ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（５ＭＰ＿１ｘＭＰ）、ならびにｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の代わりにバッファーで処理したｍｏｃｋトランスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ）の、２０ｎｔ合成ガイドＲＮＡを使用した。第１の評価は、位置１１ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（１１ＭＰ＿１ｘＭＰ）も含んだ。
前記実施例で使用したのと同じ手順を使用して、ヒトＫ５６２細胞にｇＲＮＡおよびＣａｓ９をトランスフェクトした。より詳細には、ヒトＫ５６２細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ成長血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）を補充したＰＲＭＩ１６４０培地で培養した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター（９６ウェルシャトルデバイス、プログラムＦＦ－１２０）を製造業者の使用説明書に従って使用して、Ｋ５６２細胞（継代数３～９以内）へのヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクション条件は、Ｌｏｎｚａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅキット（Ｖ４ＳＣ－２９６０）を、２０μＬの培地中の細胞２００，０００個、１２５ピコモルの化学修飾されたｓｇＲＮＡ、および５０ピコモルの組換えＣａｓ９タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）を使用するものであった。細胞を３７℃で、周囲酸素および５％二酸化炭素で培養した。培養した細胞を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。
第２の評価のために、標的濃縮ベイトを含むライブラリーを、ＨＢＢ標的部位にほぼ中心があるゲノムＤＮＡの１Ｋｂｐセグメントを捕捉するために重複する配列カバー範囲（「タイリング」とも称される）を有するように（ＡｇｉｌｅｎｔからのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ濃縮プラットフォームを使用して）設計した。このライブラリーは、ヒトゲノム内の９６０の個別のオフセット部位に中心がある１Ｋｂｐセグメントを捕捉するための、同様にタイリングされたベイトも含んだ。９６０のオフターゲット部位は、ＨＢＢにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化のための２０ｂｐ標的配列に関して５個以下のミスマッチを有し、かつＣａｓ９認識および結合などを可能にするために必要となるような２０ｂｐオフターゲット配列に隣接するＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列のいずれかも有する、ヒトゲノム内のすべての配列を構成すると考えられる。ゲノムＤＮＡを処理ごとの三つ組みサンプルごとに単離し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨｉＳｅｑプロトコールに従って各単離物を処理した。
両方の評価のために、増幅または捕捉されたＤＮＡを、ペアードエンド２ｘ１５０ｂｐシークエンシングリードのためのＩｌｌｕｍｉｎａ試薬を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００シークエンサーでシークエンシングした。オンまたはオフターゲット配列ごとにＣａｓ９切断部位のいずれかの側の少なくとも３０ｂｐまでにオンまたはオフターゲット部位を重複しないリードを破棄することによって、ＨｉＳｅｑ生データを再処理した。ヒトゲノムへのリードのマッピングは、デフォルトパラメータに設定したＢＷＡ－ＭＥＭ（ｂｗａ－０．７．１０）ソフトウェアを使用して実施した。一貫性のないペアードエンドマッピング、低品質のマッピング、または二次マッピングを生じさせるリードを分析から破棄した。インデルを有する場合、またはＣａｓ９切断についてマッピングされた切断部位の１０ｂｐ以内に配列の挿入または欠失（すなわち、インデル）を有するかどうかによらずに、各々の保持されたマッピングリードのスコアを生成した。オンまたはオフターゲット部位ごとのマッピングされたリードを、インデルを有したか否かに従ってビニング処理し、ビンごとのリードの集計を使用して、オンターゲット部位でおよび同様に９６０のオフターゲット部位の各々で形成された％インデルを算出した。それらの％インデル結果を使用して、オン：オフ標的切断比および特異性スコアを算出した（データは省略）。
図１６は、修飾または非修飾ｓｇＲＮＡについてＨＢＢオンターゲット部位および１６の同様のオフターゲット部位でのインデルの形成を測定した、第１の評価からの結果を要約するものである。ＰＣＲアンプリコンのディープシークエンシングによって、処理ごとに単離されたゲノムＤＮＡを使用して１７部位（前記オンターゲット部位と１６のオフターゲット部位）について配列リードを生成した。修飾または非修飾ｓｇＲＮＡのすべてが、オンターゲット部位での高いインデルパーセンテージをもたらした。オフ１部位では、非修飾ｇＲＮＡおよび１ｘＭＰのｇＲＮＡもまた高いインデルパーセンテージを生じたが、対照的に、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡおよび１１ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡは、はるかに低いインデルパーセンテージをもたらした。オフ５部位では、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡおよび１１ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡおよび１ｘＭＰのｇＲＮＡよりはるかに低いインデルパーセンテージを生じた。他のオフ部位では、ｇＲＮＡのすべてが、非常に低いインデルパーセンテージを生じた。この評価は、特異性を増強するための化学修飾、特に、２０ｎｔガイド配列内の位置５および位置１１におけるＭＰ修飾が、ＨＢＢ内の２０ｂｐオンターゲット配列に関して３個以下のミスマッチを有し、かつ位置２１～２３にＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列のどちらかも有する、ヒトゲノム内の配列において、オフターゲットインデルの形成をかなり大幅に低減させたことを示す。
図１７は、両方の評価からの増幅されたＤＮＡ遺伝子座（ＰＣＲ）または捕捉されたＤＮＡ遺伝子座（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）のディープシークエンシング分析からの結果を要約するものである。図１７は、非修飾ｇＲＮＡ（ＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））、５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（ＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））、位置５ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（ＨＢＢ＿５ｘＭＰ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿５ｘＭＰ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））、ならびにｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の代わりにバッファーで処理されたｍｏｃｋトランスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ（ＰＣＲ）およびＭｏｃｋ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））の、２０ｎｔ合成ガイドＲＮＡでの実験からの、ＨＢＢ標的部位（ＨＢＢオン）および３つのオフターゲット部位（オフ１、オフ５およびオフ９）で測定されたインデル形成パーセンテージを示す。検出されたインデルのパーセンテージは、２つの評価間で一致し、ＰＣＲによって増幅された個別のＤＮＡ遺伝子座の分析において見られたのと同様のインデルパーセンテージがＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ濃縮による捕捉ＤＮＡの分析で見られた。修飾または非修飾ｓｇＲＮＡのすべてが、ＨＢＢオンターゲット部位での高いインデルパーセンテージをもたらした。オフ１部位では、ＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）実験とＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）実験の両方が、高いインデルパーセンテージを示した。対照的に、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡおよび１１ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡは、ＰＣＲおよびＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ評価によって、はるかに低いインデルパーセンテージを示した。オフ５部位では、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡ（すなわち、ＨＢＢ＿５ｘＭＰのｇＲＮＡ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿５ｘＭＰのｇＲＮＡ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））を使用する両方の評価が、非修飾ｇＲＮＡおよびＨＢＢ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡよりはるかに低いインデルパーセンテージを生じた。オフ９部位では、試験したｇＲＮＡのすべてが、非常に低いインデルパーセンテージを有した。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ濃縮によって評価した残りの９５７のオフターゲット遺伝子座のうち、３２のみが、０．１％の検出限界より高いレベルでインデルを生じ（結果は示されていない）、これらの中で最高のインデル％は、０．５％未満であった。したがって、特異性を増強する化学修飾、特に、２０ｎｔガイド配列内の位置５でのＭＰ修飾は、オフターゲットインデルの形成をかなり大幅に低減させた。このような特異性増強は、ＰＣＲによって増幅されたゲノム遺伝子座、またはＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔなどの標的化ライブラリー濃縮キットを使用することにより濃縮されたゲノム遺伝子座によって実証することができる。
［例示的実施形態］
本明細書において開示される対象に従って提供される例示的実施形態として、これらに限定されないが、特許請求の範囲および以下の実施形態を含む。
Ａ１．（ａ）（ｉ）標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）ステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
ガイド配列が、少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、合成ガイドＲＮＡがｇＲＮＡ機能性を有する、合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ５．ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端または両末端に少なくとも１つの安定性増強修飾をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ６．ガイド配列が、ロッキング領域、サンプリング領域、およびシード領域を含み、少なくとも１つの特異性増強修飾が、サンプリング領域に、および／またはシード領域に存在する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、シード領域内に、および／またはサンプリング領域内に、および／またはロッキング領域内に存在する、実施形態Ａ６の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド間連結修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、化学修飾された核酸塩基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、少なくとも１つのヌクレオチド糖部分内に位置する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１１．少なくとも１つの特異性増強修飾が、３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、３’－ホスホノ酢酸メチルエステルヌクレオチド間連結、３’－メチルホスホネートヌクレオチド間連結、３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、３’－メチルチオホスホネートヌクレオチド間連結、３’－ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、またはそれらの組合せを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１２．Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、
（ａ）２’－デオキシリボース；２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル；２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル；２’－Ｏ－フェニル、２’－チオフェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノもしくは２’－Ｏ－置換フェニルを有するリボースなどの糖；またはそれらの組合せ；
（ｂ）ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピオン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネートもしくはボラノホスホネート、またはそれらの組み合わせ；あるいは
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ
を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１４．２’－Ｏ－メチル修飾をさらに含む、実施形態Ａ８、Ａ９、Ａ１１またはＡ１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、構造不定の核酸（「ＵＮＡ」）、アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）、脱塩基ヌクレオチド、または－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２）ｍ－ＰＯ４Ｙ－を含むアルキレンスペーサー、または（－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２ＣＲ３ ２Ｏ）ｎ－ＰＯ３Ｙ－）を含むエチレングリコールスペーサーであり、ｍは、２、３または４であり、ｎが、１、２または３であり、各Ｒ３が、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルからなる群から独立に選択され、各Ｙが、Ｈまたは負の電荷である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、核酸塩基修飾を含まない、実施形態Ａ１～Ａ９、Ａ１１～Ａ１３、またはＡ１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノプリン、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－エチニルシトシン、５－アミノアリルＵ、５－アミノアリルＣ、脱塩基ヌクレオチド、ＵＮＡ塩基、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される核酸塩基である、実施形態Ａ１～Ａ１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、５－ニトロインドール、ネブラリン、イノシン、ジアミノプリン、脱塩基性連結、および脱塩基性フルオロフォア連結、例えば３－Ｏ－イル－２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロピル－１－Ｏ－イル－ホスホジエステルからなる群から選択される、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、合成ガイドＲＮＡおよび標的ポリヌクレオチドによって形成される第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を、特異性増強修飾を有しない二本鎖のＴｍと比較して低下させる修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｔｍを修飾あたり約０．５℃、あるいは修飾あたり約０．５～１．０℃、あるいは修飾あたり約１．０～２．０℃、あるいは修飾あたり２～８℃低下させる、実施形態Ａ１９の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２１．ガイド配列が、２０ヌクレオチドを含み、任意選択的に５’－オーバーハング配列を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０と、ヌクレオチド１での、あるいはヌクレオチド１および２での、あるいはヌクレオチド１、２および３での、あるいはヌクレオチド１、２、３および４での、あるいはヌクレオチド１、２、３、４および５での少なくとも１つの特異性増強修飾とを含むか、またはそれらからなる、実施形態Ａ２１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の整数であり、少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド５－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１０－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１９－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１８－Ｎ内にある、実施形態Ａ２１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整数であり、前記ガイド配列が、ヌクレオチド１１－Ｎ、１２－Ｎ、１３－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、１７－Ｎ、１８－Ｎ、１９－Ｎまたは２０－Ｎに位置する、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、１７－Ｎ、１８－Ｎ、１９－Ｎまたは２０－Ｎに位置する、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、１７－Ｎ、または１８－Ｎに位置する１つの特異性増強修飾を含む、実施形態Ａ２１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２５．ガイドＲＮＡの５’末端のヌクレオチド１から始まる少なくとも１つの安定性増強修飾、および３’末端の５つの末端ヌクレオチド内の少なくとも１つの安定性増強修飾をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１．前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体であって、標的ポリヌクレオチドを切断することができるか、それにニックを入れるもしくは結合することができるか、または切断活性、ニッキング活性および／もしくは結合活性を有するｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体。
Ｃ１．標的ポリヌクレオチドを切断するか、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
前記標的ポリヌクレオチドを実施形態Ｂ１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断するか、それにニックを入れるまたは結合するステップと
を含む方法。
Ｃ２．少なくとも１つの特異性増強修飾を含む合成ガイドＲＮＡが、非修飾ｇＲＮＡと比較してオフターゲットポリヌクレオチドの切断、ニッキングまたは結合を減少させる、実施形態Ｃ１の方法。
Ｃ３．少なくとも１つのオフターゲットポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質により切断され、ニックを入れられ、または結合を受け；切断された、ニックを入れられた、または結合を受けた標的ポリヌクレオチドの、切断された、ニックを入れられた、または結合を受けたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比が、少なくとも１．２、あるいは少なくとも１．５、あるいは少なくとも２、あるいは少なくとも２．５、あるいは少なくとも３、あるいは少なくとも３．５、あるいは少なくとも４、あるいは少なくとも４．５、あるいは少なくとも５または少なくとも１０、１２、１５もしくは２０である、実施形態Ｃ２の方法。
Ｄ１．合成ガイドＲＮＡを調製する方法であって、
ゲノム内の、それぞれのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを、選択するステップと；
ゲノム内の、それぞれのヌクレオチド配列を含むオフターゲットポリヌクレオチドを、同定するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドの配列を前記オフターゲットポリヌクレオチドの配列とアラインして、両方の鎖の１つまたは複数の同一部分を同定するステップと；
合成ガイドＲＮＡを設計するステップと（設計される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、同定された同一部分のうちの１つと相補的なその配列の部分内に特異性増強修飾を含む）
を含む方法。
Ｄ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ５．設計されたガイドＲＮＡを合成するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｄ６．オフターゲットポリヌクレオチドが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｍ．ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ．ｅｄｕ／Ｏｆｆ－Ｓｐｏｔｔｅｒ；もしくはｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで見付けられるものなどの、オフターゲット部位を予測するためのアルゴリズム；またはＴｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１８７－９７；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－９１；および／もしくはＦｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１７９－８６において開示されているような、実際の事例でオフターゲット部位の活性化を同定および定量するためのその他の技術によって、同定される、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｄ７．標的ポリヌクレオチドとオフターゲットポリヌクレオチド間の少なくとも１つの識別ヌクレオチド位置であって、前記標的ポリヌクレオチドとオフターゲットポリヌクレオチドとが異なるヌクレオチド基を有する少なくとも１つの識別ヌクレオチド位置を同定するステップと、
前記標的ポリヌクレオチド内の前記少なくとも１つの識別位置におけるヌクレオチドとマッチするヌクレオチドを合成ガイドＲＮＡに含めるステップと
をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｄ８．特異性増強修飾が、合成ガイドＲＮＡのガイド配列と標的ポリヌクレオチドとによって形成される第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（「Ｔｍ」）を、特異性増強修飾を有しない二本鎖のＴｍと比較して低下させる、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｄ９．特異性増強修飾が、第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、修飾あたり約０．５℃、あるいは修飾あたり約０．５～１℃、あるいは修飾あたり約１～２℃、あるいは修飾あたり約２～８℃低下させる、実施形態Ｄ８の方法。
Ｄ１０．特異性増強修飾が、第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、例えば、該Ｔｍを約１℃～約１３℃、あるいは約１℃～約６℃低下させることによって、少なくとも約１℃、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、および／または約６℃以下、あるいは約８℃以下、あるいは約１０℃以下、あるいは約１３℃以下、低下させる、実施形態Ｄ８の方法。
Ｄ１１．特異性増強修飾が、合成ガイドＲＮＡのガイド配列と少なくとも１つオフターゲットポリヌクレオチドとによって形成された第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを低下させる、実施形態Ｄ８の方法。
Ｄ１２．第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍが、第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍより高く、例えば、少なくとも少なくとも約０．５℃高く、あるいは少なくとも約１℃高い、実施形態Ｄ８の方法。
Ｅ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意および／または設計するステップと（用意および／または設計される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、特異性増強修飾を含む）；
前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチドとのＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を算出するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と、前記Ｔｍの１０℃以内、あるいは前記Ｔｍの５℃以内、あるいはほぼ前記Ｔｍである温度で接触させるステップと；
接触させることによって、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと
を含む方法。
Ｆ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意および／または設計するステップと（用意および／または設計される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、少なくとも１つの特異性増強修飾を含む）；
前記修飾または修飾の組合せを、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチドとのＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）が２５℃から４９℃の間になるように、選択するステップと；
Ｃａｓタンパク質と設計された合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と、前記Ｔｍの１２℃以内、あるいは前記Ｔｍの８℃以内、あるいは前記Ｔｍの５℃以内、あるいはほぼ前記Ｔｍである温度で接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは前記標的ポリヌクレオチドに結合するステップと
を含む方法。
Ｇ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを、用意および／または設計するステップと（用意および／または設計される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、少なくとも１つの特異性増強修飾を含む）；
前記修飾もしくは修飾の組合せを、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチドとのＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）が、非修飾ｇＲＮＡ／標的二本鎖のＴｍより少なくとも０．５℃～１℃低く、もしくは少なくとも１～３℃低く、もしくは少なくとも１～１２℃低くなるように選択する、またはそのような修飾もしくは修飾の組合せを前記ガイド配列に含めるステップと；
Ｃａｓタンパク質と設計された合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と、前記Ｔｍの１２℃以内、あるいは前記Ｔｍの８℃以内、あるいは前記Ｔｍの５℃以内、あるいはほぼ前記Ｔｍである温度で接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと
を含む方法。
ＥＦＧ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、前記実施形態Ｅ１、Ｆ１またはＧ１のいずれか１つの方法。
ＥＦＧ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｅ１、Ｆ１またはＧ１のいずれか１つの方法。
ＥＦＧ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｅ１、Ｆ１またはＧ１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｈ１．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ２．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ３．細胞が、標的ポリヌクレオチドをｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させる前に多細胞供給源から単離される、実施形態Ｈ２の方法。
Ｈ４．供給源が、植物、動物、多細胞原生生物または真菌である、実施形態Ｈ３の方法。
Ｈ５．細胞、またはそれに由来する細胞が、標的ポリヌクレオチドをｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させた後、供給源に戻される、実施形態Ｈ２～Ｈ４のいずれか１つの方法。
Ｈ６．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ７．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ８．切断するまたはニックを入れるステップが、遺伝子編集をもたらす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ９．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、遺伝子発現の変更をもたらす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１０．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、標的遺伝子の機能的ノックアウトをもたらす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１１．切断された標的ポリヌクレオチドを、外因性または内因性鋳型ポリヌクレオチドを用いる相同性指向修復によって修復するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１２．外因性または内因性鋳型ポリヌクレオチドが、切断部位のいずれかの側の配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含む、実施形態Ｈ１１の方法。
Ｈ１３．切断された標的ポリヌクレオチドを非相同末端結合によって修復するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１４．修復ステップが、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換をもたらす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１５．挿入、欠失または置換が、標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子から発現されるタンパク質における１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらす、実施形態Ｈ１４の方法。
Ｉ１．前記実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡを２種以上含む合成ガイドＲＮＡ分子のセットまたはライブラリー。
Ｊ１．前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡおよび１種または複数のそのほかの成分を含むキット。
Ｋ１．前記実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡを２種以上含むＲＮＡ分子のアレイ。
Ｌ１．ｃｒＲＮＡセグメントとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの両方を含む単一ＲＮＡ鎖を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２．２つのＲＮＡ鎖を含み、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、異なるＲＮＡ鎖中にある、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ３．合成ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、ループＬを介して連結されている、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ４．ループＬが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｌ３の合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ５．ループＬが、ＧＮＲＡのヌクレオチド配列を含み、Ｎが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒが、ＡまたはＧを表す、実施形態Ｌ３またはＬ４の合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ６．ループＬが、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｌ３～Ｌ５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ７．ループＬが、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、実施形態Ｌ３～Ｌ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ８．ループＬが、蛍光色素を含む、実施形態Ｌ３～Ｌ７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ９．１つまたは複数の同位体標識を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１０．１つまたは複数の蛍光標識を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１１．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ）ヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１２．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２－チオＵを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１３．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの６－チオＧを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１４．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２－チオＣを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１５．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１６．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１７．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－フェニルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１８．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－チオフェニルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１９．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｓ－チオフェニルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２０．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－メチルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２１．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－エチルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２２．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－プロピルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２３．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－アリルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２４．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－アリルフェニルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２５．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－メチルヒドロキシリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２６．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－メチルオキシメチルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２７．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－カルバミン酸リボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２８．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－エチルアミノリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ２９．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－アリルアミノリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ３０．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－プロピルアミノリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ３１．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－置換フェニルリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ３２．合成ガイドＲＮＡのガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の整数であり、ヌクレオチド６－Ｎ～１４－Ｎの領域が、特異性増強修飾（複数でもよい）を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｍ１．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
標的ポリヌクレオチド内のＨＢＢ遺伝子座における標的配列を選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ＨＢＢポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎは－１０から１０の間の整数であり、前記ガイド配列は、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ＨＢＢポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと
を含む方法。
Ｍ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｍ１の方法。
Ｍ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｍ１またはＭ２のいずれか１つの方法。
Ｍ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｍ１～Ｍ３のいずれか１つの方法。
Ｍ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｍ１～Ｍ４のいずれか１つの方法。
Ｍ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｍ１～Ｍ５のいずれか１つの方法。
Ｍ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｍ１～Ｍ６のいずれか１つの方法。
Ｍ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せでの修飾を含む、実施形態Ｍ１～Ｍ７のいずれか１つの方法。
Ｍ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾；ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾；およびそれらの組合せから選択される、実施形態Ｍ１～Ｍ７のいずれか１つの方法。
Ｍ１０．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｍ９の方法。
Ｍ１１．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施形態Ｍ１～Ｍ１０のいずれか１つの方法。
Ｍ１２．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、実施形態Ｍ１～Ｍ１０のいずれか１つの方法。
Ｍ１３．ガイド配列が、その５’末端、３’末端または両方に修飾、任意選択的に、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、またはそれらの組合せから選択される１つまたは複数の安全性増強性修飾をさらに含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１２のいずれか１つの方法。
Ｍ１４．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態Ｍ１～Ｍ１３のいずれか１つの方法。
Ｍ１５．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｍ１～Ｍ１４のいずれか１つの方法。
Ｍ１６．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１５のいずれか１つの方法。
Ｍ１７．標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１５のいずれか１つの方法。
Ｍ１８．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１５のいずれか１つの方法。
Ｍ１９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記方法の特異性を増大させる、実施形態Ｍ１～Ｍ１８のいずれか１つの方法。
Ｎ１．（ａ）（ｉ）標的ＨＢＢポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが－１０から１０の間の整数であり、前記ガイド配列が、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、
前記合成ガイドＲＮＡがｇＲＮＡ機能性を有する、合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｎ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｎ１またはＮ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｎ１～Ｎ３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｎ１～Ｎ４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｎ１～Ｎ５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｎ１～Ｎ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む、実施形態Ｎ１～Ｎ７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾；ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾；およびそれらの組合せから選択される、実施形態Ｎ１～Ｎ８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１０．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｎ９の合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１１．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ＨＢＢポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｎ１～Ｎ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｎ１～Ｎ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ＨＢＢポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｎ１～Ｎ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１４．合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｎ１～Ｎ１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０からなる、実施形態Ｎ１～Ｎ１４のいずれか１つの方法。
Ｏ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが－１０から１０の間の整数であり、前記ガイド配列は、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと
を含む方法。
Ｏ２．標的ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態Ｏ１の方法。
Ｏ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｏ１またはＯ２の方法。
Ｏ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｏ１～Ｏ３のいずれか１つの方法。
Ｏ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｏ１～Ｏ４のいずれか１つの方法。
Ｏ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｏ１～Ｏ５のいずれか１つの方法。
Ｏ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｏ１～Ｏ６のいずれか１つの方法。
Ｏ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｏ１～Ｏ７のいずれか１つの方法。
Ｏ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せでの修飾を含む、実施形態Ｏ１～Ｏ８のいずれか１つの方法。
Ｏ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｏ１～Ｏ８のいずれか１つの方法。
Ｏ１１．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｏ１０の方法。
Ｏ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記方法の特異性を増大させる、実施形態Ｏ１～Ｏ１１のいずれか１つの方法。
Ｏ１３．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施形態Ｏ１～Ｏ１２の方法。
Ｏ１４．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、実施形態Ｏ１～Ｏ１２の方法。
Ｏ１５．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態Ｏ１～Ｏ１４のいずれか１つの方法。
Ｏ１６．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｏ１～Ｏ１５のいずれか１つの方法。
Ｏ１７．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｏ１～Ｏ１６のいずれか１つの方法。
Ｏ１８．標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｏ１～Ｏ１６のいずれか１つの方法。
Ｏ１９．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｏ１～Ｏ１６のいずれか１つの方法。
Ｏ２０．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０からなる、実施形態Ｏ１～Ｏ１９のいずれか１つの方法。
Ｐ１．（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが－１０から１０の間の整数であり、前記ガイド配列が、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、
前記合成ガイドＲＮＡがｇＲＮＡ機能性を有する、合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ２．標的ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態Ｐ１の合成ガイド。
Ｐ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｐ１またはＰ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｐ１～Ｐ３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｐ１～Ｐ４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｐ１～Ｐ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｐ１～Ｐ７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ９．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１１．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｐ１０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｐ１～Ｐ１２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１５．合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ１４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１６．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０からなる、実施形態Ｐ１～Ｐ１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｑ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、少なくとも２つの連続する特異性増強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドをｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと
を含み、
前記少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、方法。
Ｑ２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１および２に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２および３に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３および４に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３、４、および５に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ６．ガイド配列が、連続する特異性増強修飾を５’末端に含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ７．連続する特異性増強修飾が、ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３または４で始まる、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ８．標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢポリヌクレオチド、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態Ｑ１～Ｑ７のいずれか１つの方法。
Ｑ９．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ８のいずれか１つの方法。
Ｑ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ８のいずれか１つの方法。
Ｑ１１．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｑ１０の方法。
Ｑ１２．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施形態Ｑ１～Ｑ１１のいずれか１つの方法。
Ｑ１３．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、実施形態Ｑ１～Ｑ１１のいずれか１つの方法。
Ｑ１４．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１３のいずれか１つの方法。
Ｑ１５．標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１３のいずれか１つの方法。
Ｑ１６．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１３のいずれか１つの方法。
Ｑ１７．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｑ１～Ｑ１６のいずれか１つの方法。
Ｑ１８．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０を含むか、またはそれからなる、実施形態Ｑ１～Ａ１７のいずれか１つの方法。
Ｒ１．（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列が、少なくとも２つの連続する特異性増強修飾を含む、合成ガイドＲＮＡであって、
ｇＲＮＡ機能を有し；
前記少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１および２に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２および３に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３および４に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３、４および５に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ６．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えられる連続する特異性増強修飾をその５’末端に含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ７．連続する特異性増強修飾が、ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３または４で始まる、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ８．ガイド配列が、３つの連続する特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ９．ガイド配列が、４つの連続する特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１０．標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢポリヌクレオチド、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態Ｒ１～Ｒ９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１１．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む、実施形態Ｒ１～Ｒ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾；ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾；およびそれらの組合せから選択される、実施形態Ｒ１～Ｒ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１３．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｒ１２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｒ１～Ｒ１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｒ１～Ｒ１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｒ１～Ｒ１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１７．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｒ１～Ｒ１６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１８．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０を含むか、またはそれからなる、実施形態Ｒ１～Ｒ１７のいずれか１つの方法。
Ｓ１．合成ガイドＲＮＡを選択する方法であって、
少なくとも第１の合成ガイドＲＮＡおよび第２の合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡの各々は、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、
前記ガイド配列の各々は、該ガイド配列の５’末端から数えて２０－Ｎヌクレオチド（Ｎは、－１０から１０の間の整数である）からなり、
前記第１の合成ガイドＲＮＡは、前記ガイド配列内の第１の位置に特異性増強修飾を含み、前記第２の合成ガイドＲＮＡは、前記ガイド配列内の第２の位置に特異性増強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記第１の合成ガイドＲＮＡとを含む第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成し、前記標的ポリヌクレオチドを前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記第２の合成ガイドＲＮＡとを含む第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成し、前記標的ポリヌクレオチドを前記第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合する点での、前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体および前記第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の特異性を判定するステップと；
第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体および第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体のどちらが前記標的ポリヌクレオチドに対してより大きい特異性を有するかを同定するステップと
を含む方法。
Ｓ２．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む、実施形態Ｓ１の方法。
Ｓ３．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）を含む、実施形態Ｓ２の方法。
Ｓ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾；およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｓ１の方法。
Ｓ５．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｓ４の方法。
Ｓ６．第１および第２の合成ガイドＲＮＡが、異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を含む、実施形態Ｓ１～Ｓ５のいずれか１つの方法。
Ｓ７．特異性が、オンおよび／もしくはオフターゲット切断、結合もしくはニッキングパーセンテージ、オン：オフ比、特異性スコア、またはそれらの組合せから選択される、実施形態Ｓ１～Ｓ６のいずれか１つの方法。
Ｓ８．ガイド配列部分内の異なるヌクレオチド部分に特異性増強修飾を含む第１～第２０の合成ガイドＲＮＡを用意するステップと；前記合成ガイドＲＮＡの各々を使用してｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；前記標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと；前記標的ポリヌクレオチドを切断し、それにニックを入れまたは結合し、各合成ガイドＲＮＡの特異性を測定するステップと；最大の特異性増強をもたらす１つまたは複数の修飾された部分を同定するステップとを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ７のいずれか１つの方法。
Ｓ９．ガイド配列が、５’末端および３’末端に、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、またはそれらの組合せでの修飾をさらに含む、実施形態Ｓ１～Ｓ８のいずれか１つの方法。
Ｓ１０．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ９のいずれか１つの方法。
Ｓ１１ 標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ９のいずれか１つの方法。
Ｓ１２．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ９のいずれか１つの方法。
Ｓ１３．第１および第２のガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｓ１～Ｓ１２のいずれか１つの方法。
Ｔ１．合成ガイドＲＮＡを選択するためのキットであって、
少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡ
（該少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、前記ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド２０－Ｎ（ここでのＮは、－１０から１０の間の整数である）からなり、前記ガイド配列内のヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、および
該少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの異なる特異性増強修飾を有する点、または前記ガイド配列内の少なくとも１つの異なる位置に特異性増強修飾を有する点で、互いに異なる）；および
Ｃａｓタンパク質、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むキット。
Ｔ２．少なくとも２０の合成ガイドＲＮＡを含む、実施形態Ｔ１のキット。
Ｔ３．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態Ｔ１またはＴ２のキット。
Ｔ４．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、または２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３のいずれか１つのガイドＲＮＡ。
Ｔ５．特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３のいずれか１つのキット。
Ｔ６．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｔ５のキット。
Ｔ７．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｔ１～Ｔ６のいずれか１つのキット。
Ｕ１．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、１より大きい、好ましくは少なくとも１．１、より好ましくは少なくとも１．５、よりいっそう好ましくは少なくとも２、よりいっそう好ましくは少なくとも５、よりいっそう好ましくは少なくとも１０、または最適には少なくとも２０の特異性スコアを有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ２．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、約２～約６０、または好ましくは約１０～約６０の特異性スコアを有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ３．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、または最適には少なくとも９０％のオンターゲット切断を有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ４．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、約２５％～９９．９％、または好ましくは約５０％～約９９．９％のオンターゲット切断を有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ５．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、１より大きい、好ましくは少なくとも１．１：１、より好ましくは少なくとも１．５：１、よりいっそう好ましくは少なくとも３：１、よりいっそう好ましくは少なくとも１０：１、よりいっそう好ましくは少なくとも２０：１、または最適には少なくとも４０：１のオン：オフ比を有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ６．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、約１．５：１～約９９．９：１、または好ましくは約１０：１～約９９．９：１のオン：オフ比を有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ１．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１９からなり、位置３、４、６、８、９および１０から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１８からなり、位置２、３、５、７、８および９から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１７からなり、位置１、２、４、６、７および８から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１６からなり、位置１、３、５、６および７から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１５からなり、位置２、４、５および６から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ６．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１４からなり、位置１、３、４および５から選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
下記の例示的実施形態において、「Ｘ実施形態」とは、番号がＸで始まるすべての実施形態を意味する。同様に、下記の例示的実施形態において、「Ｘｎ実施形態」とは、番号がＸｎで始まるすべての実施形態を意味する。例として、「Ｘ９実施形態」は、いずれの請求項に記載される場合も、「Ｘ９」、および存在する場合には「Ｘ９ａ」から「Ｘ９ｚ」までを意味する。
Ｘ．（ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間の整数であり、
前記ガイド配列が、少なくとも１つの修飾を含む、合成ガイドＲＮＡ。
Ｘ１．（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、ガイド配列と、
（ｉｉ）ステム配列と
を含む合成ｃｒＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間の整数であり、
前記ガイド配列が、少なくとも１つの修飾を含む、合成ｃｒＲＮＡ。
Ｘ１ａ．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１－Ｎでの修飾を含む、実施形態ＸまたはＸ１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１ｂ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置２－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１ｃ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置３－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置４－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置５－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置６－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置７－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置８－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ５．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置９－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ６．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１０－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１１－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１２－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｂ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１３－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｃ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１４－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｄ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｅ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１６－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｆ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１７－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｇ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１８－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｈ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１９－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｉ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置２０－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ８．少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、任意選択的にホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ８ａ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、任意選択的にホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ８ｂ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノプロピオン酸ヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、任意選択的にチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ａ．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノプロピオン酸ヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｂ．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、任意選択的にチオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｃ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｄ．前記少なくとも１つの修飾が、キラルホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｅ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホロジチオエートヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｆ．前記少なくとも１つの修飾が、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｇ．前記少なくとも１つの修飾が、Ｃ１－４アルキルホスホネートヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｈ．前記少なくとも１つの修飾が、メチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む、Ｘ９ｇ実施形態の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｉ．前記少なくとも１つの修飾が、メチルチオホスホネートヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０．前記少なくとも１つの修飾が、修飾された糖を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ａ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシリボース（２’－デオキシ）である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｂ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－ＮＨ２である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｃ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－アラビノフラノシル（２’－アラビノ）である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｄ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル（２’－Ｆ－アラビノ）である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｅ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－ＬＮＡである、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｆ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－ＵＬＮＡである、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｇ．前記少なくとも１つの修飾が、４’－チオリボシルである、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｈ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルである、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｉ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルである、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｊ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－フェニル、２’－チオフェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノ、および２’－Ｏ－置換フェニルから選択される、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｋ．前記少なくとも１つの修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーコンホメーションを付与する２’修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１１．前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｘ１０ｋの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１１ａ．前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチルである、実施形態Ｘ１１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１１ｂ．前記２’修飾が、２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル（２’－フルオロ）である、実施形態Ｘ１１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１１ｃ．前記２’修飾が、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）である、実施形態Ｘ１１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１２．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１３．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１４．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１５．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１６．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置４－Ｎ～２０－Ｎのいずれか１つの位置にホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含み、前記修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎにはない、実施形態ＸまたはＸ１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１６ａ．前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間連結修飾を含み、位置１５－Ｎが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）を含まない、実施形態ＸまたはＸ１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１７．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置４－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ１６ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１８．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置５－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ１７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１９．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置６－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ１８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２０．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置７－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ１９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２１．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置８－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２２．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置９－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２３．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１０－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２４．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１１－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２５．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１２－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２６．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１３－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２７．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１４－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２７ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６ａ～Ｘ２６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２８．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１６－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２９．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１７－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３０．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１８－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ２９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３１．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１９－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３２．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置２０－Ｎでのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３３．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３４．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３５．前記ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結が、ホスホノ酢酸連結（Ｐ）である、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３６．前記ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結が、チオホスホノ酢酸連結（ＳＰ）である、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３７．前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾をさらに含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３８．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｘ３７の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３８ａ．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｘ３７の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３９．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢポリヌクレオチド内に位置する、実施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４０．前記標的ポリヌクレオチドが、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド内に位置する、実施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４１．前記標的ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド内に位置する、実施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４２．前記標的ポリヌクレオチドが、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド内に位置する、実施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４３．前記標的ポリヌクレオチドが、ＣＬＴＡ４ポリヌクレオチド内に位置する、実施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４４．標的ポリヌクレオチドが、ＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡを含む、実施形態Ｘ３９の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４５．標的ポリヌクレオチドが、ＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡを含む、実施形態Ｘ４０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４６．標的ポリヌクレオチドが、ＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、実施形態Ｘ４１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４７．標的ポリヌクレオチドが、ＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＣを含む、実施形態Ｘ４２の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８．標的ポリヌクレオチドが、ＧＡＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡを含む、実施形態Ｘ４３の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ａ．少なくとも１つの修飾が、修飾された塩基を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｂ．修飾された塩基が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリルＵ、５－アミノアリルＣ、脱塩基ヌクレオチド、ＵＮＡ塩基、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、およびそれらの組合せから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｃ．修飾された塩基が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵおよび６－チオＵから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｄ．修飾された塩基が、２－アミノＡおよび２－アミノプリンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｅ．修飾された塩基が、シュードウラシルおよびヒポキサンチンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｆ．修飾された塩基が、イノシンである、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｇ．修飾された塩基が、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、および７－デアザ－８－アザアデニンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｈ．修飾された塩基が、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシルおよび５－メチル－ピリミジンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｉ．修飾された塩基が、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシンおよび５－エチニルウラシルから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｊ．修飾された塩基が、５－アリルウラシル、５－アリルシトシン、５－アミノアリルウラシルおよび５－アミノアリルシトシンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｋ．修飾された塩基が、脱塩基ヌクレオチドである、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｌ．修飾された塩基が、イソＣおよびイソＧから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｍ．修飾された塩基が、ＵＮＡ塩基である、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４９．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強するための方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
前記Ｘ実施形態のいずれか１つの少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを用意するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドと前記ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとのハイブリダイゼーション、およびＣＲＩＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと
を含む方法。
Ｘ４９ａ．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強するための方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
前記Ｘ実施形態のいずれか１つの少なくとも１つの合成ｃｒＲＮＡを用意するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ｃｒＲＮＡとを含むｃｒＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを前記ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと
を含む方法。
Ｘ４９ｂ．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を分析するための方法であって、
（１）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドと（２）オフターゲット配列を含む１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドとを含むサンプルを用意するステップと；
前記標的配列のための前記Ｘ実施形態のいずれか１つの少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを用意するステップと；
タンパク質としてまたは前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして用意されるＣａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、およびＣＲＩＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記サンプルと前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体とを接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイトと、１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイトとを含む、オリゴヌクレオチドベイトのライブラリーを添加して、前記標的ポリヌクレオチドおよび前記１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドを捕捉するステップと；
前記捕捉された標的ポリヌクレオチドおよび前記捕捉されたオフターゲットポリヌクレオチドを単離および分析して、前記ＣＲＩＳＰＲ機能に起因する変化を同定し、前記標的ポリヌクレオチドおよび前記オフターゲットポリヌクレオチドにおける相対変化を判定し、それによって前記ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を評価するステップと
を含む方法。
Ｘ４９ｃ．前記サンプルが、標的配列を各々が含む２つ以上の標的ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ４９ｂの方法。
Ｘ４９ｄ．前記ガイドＲＮＡが、任意の前記Ｘ実施形態の合成ｃｒＲＮＡであり、前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、ｃｒＲＮＡ：Ｃｐｆ１複合体である、実施形態Ｘ４９ｂの方法。
Ｘ５０．接触させるステップが、細胞内で実施される、実施形態Ｘ４９の方法。
Ｘ５１．細胞が、初代細胞である、実施形態Ｘ５０に記載の方法。
Ｘ５２．Ｃａｓタンパク質が、タンパク質として、または該Ｃａｓタンパク質を発現するポリヌクレオチドとして用意される、実施形態Ｘ４９～５１のいずれか１つの方法。
Ｘ５２ａ．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態Ｘ４９～５２のいずれか１つの方法。
Ｘ５２ｂ．Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１である、実施形態Ｘ４９～５２のいずれか１つの方法。
Ｘ５３．ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、実施形態Ｘ５２の方法。
Ｘ５４．前記形成するステップが、細胞外で実施される、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５５．ＣＲＩＳＰＲ機能が、遺伝子編集である、前記実施Ｘ形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５５ａ．ＣＲＩＳＰＲ機能が、遺伝子編集であり、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを相同性指向修復のためのドナー鋳型として用意するステップをさらに含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５６．ＣＲＩＳＰＲ機能が、ＣＲＩＳＰＲａである、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５７．ＣＲＩＳＰＲ機能が、ＣＲＩＳＰＲｉである、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５７ａ．捕捉されたポリヌクレオチドを分析するステップを含み、分析するステップが、シークエンシングによって実施される、実施形態Ｘ５５～Ｘ５７のいずれか１つの方法。
Ｘ５７ｂ．遺伝子発現レベルを測定することによって、任意選択的にｑＲＴ－ＰＣＲによって、前記ＣＲＩＳＰＲ機能を分析するステップをさらに含む、実施形態Ｘ５６またはＸ５７の方法。
Ｘ５７ｃ．遺伝子発現レベルの前記測定が、マイクロアレイを用いて実施される、実施形態Ｘ５７ｂの方法。
Ｘ５８．ＣＲＩＳＰＲ機能が、遺伝子発現の調節である、前記実施Ｘ形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５９．Ｎが０であり、ガイド配列が、２０ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６０．Ｎが１であり、ガイド配列が、１９ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６１．Ｎが２であり、ガイド配列が、１８ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６２．Ｎが３であり、ガイド配列が、１７ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６３．Ｎが４であり、ガイド配列が、１６ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６４．Ｎが５であり、ガイド配列が、１５ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６５．Ｎが－１であり、ガイド配列が、２１ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６６．Ｎが－２であり、ガイド配列が、２２ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６７．Ｎが－３であり、ガイド配列が、２３ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６８．Ｎが－４であり、ガイド配列が、２４ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６９．Ｎが－５であり、ガイド配列が、２５ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７０．ガイド配列内の１０以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７１．ガイド配列内の９以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７２．ガイド配列内の８以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７３．ガイド配列内の７以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７４．ガイド配列内の６以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７５．ガイド配列内の５以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７６．ガイド配列内の４以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７７．ガイド配列内の３以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７８．ガイド配列内の２以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７９．ガイド配列の最初の４つのヌクレオチドが、すべて修飾されている場合、それらが同一の方法で修飾されていない、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８０．ガイド配列の最初の５つのヌクレオチドが、すべて修飾されている／される場合、それらが同一の方法で修飾されていない／されない、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８１．ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたは方法。
Ｘ８２．ガイドＲＮＡが、修飾を有しない対応するガイドＲＮＡより、標的ポリヌクレオチオに対する高い特異性、または高いｇＲＮＡ機能性を有する、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８３．少なくとも２つの異なる合成ガイドＲＮＡが、２つの異なる標的ポリヌクレオチドのために用意される、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ８４．２つの異なる標的ポリヌクレオチドが、同じ遺伝子内に位置する、実施形態Ｘ８３の方法。
Ｘ８５．Ｎが、－１０から６の間であり、ガイド配列が、１４～３０ヌクレオチドからなる、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８６．Ｎが、－５から６の間であり、ガイド配列が、１４～２５ヌクレオチドからなる、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８７．Ｎが、－４から３の間であり、ガイド配列が、１７～２４ヌクレオチドからなる、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８８．前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）を含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８９．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ９０．２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）を含む少なくとも１つの修飾を、５’末端、３’末端または両末端に含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ９１．２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）を含む少なくとも１つの修飾を、５’末端、３’末端または両末端に含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｙ１．（ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間、任意選択的に１０～６の間の整数であり、
前記ガイド配列が、前記ガイド配列の位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎ、もしくは１６－Ｎ、またはそれらの組合せに位置する、少なくとも１つの修飾をさらに含む、合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ２．単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ３．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）；チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）；およびＣ３’－エンド糖パッカーコンホメーションを付与する２’修飾；またはそれらの組合せから選択される、実施形態Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ４．前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｙ３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ５．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）から選択される、実施形態Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ６．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置５－Ｎもしくは１１－Ｎ、またはそれらの組合せに位置する、実施形態Ｙ５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ７．前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾をさらに含む、実施形態Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ８．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｙ７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ９．５’末端、３’末端または両末端に、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）またはそれらの組合せから独立に選択される少なくとも１つの修飾をさらに含む、実施形態Ｙ５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１０．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、またはＶＥＧＦＡ遺伝子内に位置する、実施形態Ｙ５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１１．標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子のＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡ、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡ、またはＶＥＧＦＡ遺伝子のＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、実施形態Ｙ１０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１２．前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡであり、前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｙ１０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１３．（ａ）（ｉ）ＰＡＭ配列に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間、任意選択的に１０～６の間の整数であり、
前記ガイド配列が、前記ガイド配列の位置４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に少なくとも１つのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾をさらに含み、前記修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎにはない、合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１４．前記ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結が、ホスホノ酢酸連結（Ｐ）およびチオホスホノ酢酸連結（ＳＰ）から選択される、実施形態Ｙ１３の合成ガイドＲＮＡ．
Ｙ１５．前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾をさらに含む、実施形態Ｙ１３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１６．単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｙ１３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１７．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｙ１５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１８．ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列を含む合成ｃｒＲＮＡであって、前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間、任意選択的に１０～６の間の整数であり、前記ガイド配列が、前記ガイド配列の位置４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に少なくとも１つのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾をさらに含み、前記修飾が、前記ガイド配列の位置１５－Ｎにはない、合成ｃｒＲＮＡ。
Ｙ１９．前記ｃｒＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾をさらに含む、実施形態Ｙ１８の合成ｃｒＲＮＡ。
Ｙ２０．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強する方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
実施形態Ｙ１３の少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡを用意するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと
を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質として、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして用意される、方法。
Ｙ２１．前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２２．前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾をさらに含む、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２３．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｙ２２の方法。
Ｙ２４．前記ガイドＲＮＡが、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結およびチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せから選択される少なくとも１つの修飾を含む、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２５．前記ガイドＲＮＡが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）から選択される少なくとも１つの修飾を含む、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２６．前記ポリヌクレオチド標的の前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体との前記接触が、細胞内で実施される、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２７．前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、実施形態Ｙ２６の方法。
Ｙ２８．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、またはＶＥＧＦＡ遺伝子内に位置する、実施形態Ｙ２７の方法。
Ｙ２９．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子のＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡ、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡ、またはＶＥＧＦＡ遺伝子のＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、実施形態Ｙ２８の方法。
Ｙ３０．前記形成が、細胞外で実施される、実施形態Ｙ２０の方法。
例示的または好ましい実施形態の前述の記載は、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の制限としてではなく、例示ととられなければならない。容易に理解されるであろうが、特許請求の範囲において示されるような本発明から逸脱することなく、上記で示される特徴の多数の変更および組合せが利用され得る。このような変更は、本発明の範囲からの逸脱と見なされず、すべてのこのような変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照により全文が本明細書の一部をなすものとする。

Claims (8)

  1. （ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
    （ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
    を含む合成ガイドＲＮＡであって、
    前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から３の間の整数であり、
    前記ガイド配列が、前記ガイド配列の５’末端を起点とした番号付けで４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎまたは１６－Ｎの位置に位置する少なくとも１つの修飾を含み、
    前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）から選択される、合成ガイドＲＮＡ。
  2. 単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１に記載の合成ガイドＲＮＡ。
  3. ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列を含む合成ｃｒＲＮＡであって、前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から３の間の整数であり、前記ガイド配列が、前記ガイド配列の５’末端を起点とした番号付けで４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎまたは１６－Ｎの位置に位置する少なくとも１つの修飾を含み、
    前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）から選択される、合成ｃｒＲＮＡ。
  4. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイド配列の位置５－Ｎもしくは１１－Ｎ、またはそれらの組合せに位置する、請求項１～３のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  5. 前記ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に１つまたは複数の修飾をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  6. 前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、またはＶＥＧＦＡ遺伝子内に位置する、請求項１～５のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  7. ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強するインビトロの方法であって、
    標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
    請求項１～６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡを用意するステップと；
    Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
    前記ｇＲＮＡの前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、およびＣＲＩＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと
    を含み、
    前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質として、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして用意される、方法。
  8. 前記ポリヌクレオチオチド標的の前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体との前記接触が、細胞内で実施され、前記複合体の前記形成が、細胞外または内で実施される、請求項７に記載の方法。
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