JP2024528202A

JP2024528202A - 遺伝子修飾のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2024528202A
Application number: JP2024506631A
Authority: JP
Inventors: チャクラボーティ，ティルタ; パイク，エリザベス; リン，ミシェル; フェリシオ，ジュリアナ
Original assignee: Vor Biopharma Inc
Current assignee: Vor Biopharma Inc
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2024-07-26
Also published as: WO2023015182A9; CA3228272A1; AU2022324093A2; EP4381062A1; WO2023015182A1; AU2022324093A1

Abstract

本明細書で提供されるのは、複数の修飾（例えば、挿入又は欠失）を有する遺伝子操作細胞を作製する方法、当該方法によって産生される細胞及び細胞集団、かかる遺伝子操作細胞を、対象、例えば、造血器悪性腫瘍を有する対象に投与することを伴う方法である。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年８月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２２８，５４８号、２０２１年８月４日に出願された米国仮特許出願第６３／２２９，４８４号、２０２２年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／３４１，３４６号、及び２０２２年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／３４６，８１９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、その全体が参照により組み込まれる。

電子配列表の参照
電子配列表（Ｖ０２９１７００１８ＷＯ００－ＳＥＱ－ＣＥＷ．ｘｍｌ、サイズ：４７，７５２バイト、及び作成日：２０２２年８月２日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムは、細胞における標的遺伝子編集のためのプラットフォームを提供する。使用するシステム及び関連ツールの多用途性にもかかわらず、オフターゲット効果、転座事象のリスク、及び潜在的な悪性腫瘍などの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した遺伝子修飾に関連するいくつかの潜在的なリスクが存在する。これらの課題は、治療用途におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用に関する安全性の懸念である。

本開示の態様は、複数の遺伝子修飾を含む遺伝子操作細胞を生成するための方法を提供し、これは、例えば、治療アプローチの使用に使用され得る。本明細書で提供される方法は、細胞のゲノムにおいて複数の遺伝子修飾を行う有害な効果を低減することを目的とする。一態様では、本開示は、遺伝子修飾の連続的な順序が細胞中に複数の修飾を生じさせ、転座産物を生成するリスクを最小化するという発見に関する。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内でゲノムＤＮＡにおける複数の切断が共存する時間を低減させることは、転座産物の産生を減少し得ると考えられる。ゲノムＤＮＡの切断は、様々な細胞ＤＮＡ修復プロセスによって認識及び修復することができ、特定の切断（例えば、特定のゲノム遺伝子座の切断、特定の遺伝子編集プロセスによって産生される切断）は、特定の細胞ＤＮＡ修復プロセスによって優先的に認識され、他のＤＮＡ修復プロセスによって認識及び修復された切断と比較して、より迅速に修復され得ると考えられる。ゲノムＤＮＡの切断期間及び修復速度は、切断を認識／修復する細胞ＤＮＡ修復プロセスによって影響され得る。本開示は、部分的に、ゲノムＤＮＡ中に第１の切断を導入する第１の修飾ステップと、ゲノムＤＮＡ中に第２の切断を導入する第２の修飾ステップと、を含む、方法を対象とし、第１の切断は、第２の切断の導入前に実質的に修復又は分解される（例えば、遺伝子修飾が産生される）。いくつかの実施形態では、第１の切断は、例えば、他のＤＮＡ修復プロセスと比較して、切断を迅速に分解／修復するＤＮＡ修復プロセスによって認識される。いくつかの実施形態では、導入される第２の切断は、例えば、他のＤＮＡ修復プロセスと比較して、よりゆっくりと切断を分解／修復するＤＮＡ修復プロセスによって認識される。

本開示の態様は、ａ）複数の細胞を、（ｉ）第１の標的配列と結合する第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、それにより、第１のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成及び／又は維持し、第１のＲＮＰ複合体が第１の標的配列と結合するのに好適な条件下で、第１のＲＮＰ複合体を形成することと、ｂ）複数の細胞を、（ｉｉｉ）第２の標的配列と結合する第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ、及び（ｉｖ）第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第２のＲＮＰ複合体を形成及び／又は維持し、第２のＲＮＰ複合体が第２の標的配列と結合することと、を含み、それにより、第１の標的配列の遺伝子修飾及び第２の標的配列の遺伝子修飾を含む遺伝子操作細胞の集団を産生し、第１の標的化ドメインが、第２の標的化ドメインと同一ではない、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、第１の標的配列の遺伝子修飾は、第１のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位での若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなり、及び／あるいは第２の標的配列の遺伝子修飾は、第２のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位のすぐ近位での挿入又は欠失からなる。いくつかの実施形態では、方法は、転座産物細胞の集団を産生し、亜集団の各細胞は、第１の標的配列を含むゲノムの一部、第２の標的配列を含むゲノムの一部、又はその両方を含む転座産物を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、複数の細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、複数の細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する。

いくつかの実施形態では、（ｉ）及び（ｉｉ）を含む第１のＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象によって生成される遺伝子修飾をもたらす。いくつかの実施形態では、（ｉ）及び（ｉｉ）を含むＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合は、高速分解二本鎖切断を生じさせる。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む第２のＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合は、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）事象によって生成される遺伝子修飾をもたらす。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む第２のＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合は、緩徐分解二本鎖切断を生じさせる。

いくつかの実施形態では、第１の標的配列は、第１の遺伝子、それと作動可能に連結された転写制御要素、又は遺伝子及び転写制御要素の一部に存在する。いくつかの実施形態では、第１の標的配列のゲノム修飾は、第１の遺伝子によってコードされる産物の発現、若しくは第１の標的配列中にゲノム修飾を担持しない同じ細胞型の野生型細胞によって発現される産物のバリアントの発現の低減又は排除をもたらす。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、第１の系統特異的細胞表面抗原をコードする。いくつかの実施形態では、第１の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８、及びＢＣＭＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の標的配列は、第２の遺伝子、それと作動可能に連結された転写制御要素、又は遺伝子及び転写制御要素の一部に存在する。いくつかの実施形態では、第２の標的配列のゲノム修飾は、第２の遺伝子によってコードされる産物の発現、若しくは第２の標的配列中にゲノム修飾を担持しない同じ細胞型の野生型細胞によって発現される産物のバリアントの発現の低減又は排除をもたらす。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子は、第２の系統特異的細胞表面抗原をコードする。いくつかの実施形態では、第２の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８、及びＢＣＭＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、第２の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ５、又はＣＬＬ－１である。いくつかの実施形態では、第１の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ５である。いくつかの実施形態では、第２の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３である。

いくつかの実施形態では、第１の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３であり、第２の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＬＬ－１である。いくつかの実施形態では、第１の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＬＬ－１であり、第２の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３である。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間の時間間隔は、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６時間である。

いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び／又は（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ｓｐＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ｓａＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼであり、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、（ａ）の接触させることは、（ｉ）及び（ｉｉ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で細胞に導入することを含み、及び／又は（ｂ）の接触させることは、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、（ａ）の接触させることは、（ｉ）及び／若しくは（ｉｉ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／若しくは（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入することを含み、かつ／又は（ｂ）の接触させることは、（ｉｉｉ）及び／若しくは（ｉｖ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／若しくは（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入することを含む。

いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ及び／又は第２のｇＲＮＡは、化学修飾された１つ以上のヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のｇＲＮＡは、２’Ｏ－メチル部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のｇＲＮＡは、ホスホロチオエートを含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む。

いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、又は組織特異的幹細胞からなる群から選択される。

本開示の態様は、ａ）細胞を、（ｉ）第１の標的配列と結合する第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、それにより、（ｉ）の第１のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成及び／又は維持し、ＲＮＰ複合体が細胞のゲノム中の第１の標的配列と結合するのに好適な条件下で、第１のＲＮＰ複合体を形成することと、ｂ）細胞を、（ｉｉｉ）第２の標的配列と結合する第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ、及び（ｉｖ）第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、それにより、（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡが（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第２のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成及び／又は維持し、第２のＲＮＰ複合体が細胞のゲノム中の第２の標的配列と結合するのに好適な条件下で、第２のＲＮＰ複合体を形成することと、を含み、ステップ（ａ）及び（ｂ）が、時間間隔を隔てて、連続的に、時間的に近接して実施され、第１の標的化ドメインが、第２の標的化ドメインとは異なる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、第１の標的配列の遺伝子修飾は、第１のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位での若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなり、及び／あるいは第２の標的配列の遺伝子修飾は、第２のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位のすぐ近位での挿入又は欠失からなる。いくつかの実施形態では、方法は、転座産物細胞の亜集団を産生し、亜集団の各細胞は、第１の標的配列を含むゲノムの一部、第２の標的配列を含むゲノムの一部、又はその両方を含む転座産物を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する。

本開示の態様は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって産生される、遺伝子操作細胞、又はその子孫を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって取得される、又はそれによって取得可能である、複数の細胞を含む、細胞集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞若しくはその子孫、又は細胞集団のうちのいずれかを含む、医薬組成物を提供する。

本開示の態様は、投与することを必要とする対象に、本明細書に記載される細胞若しくはその子孫のうちのいずれか、又は本明細書に記載される細胞集団若しくは医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞若しくはその子孫、又は細胞集団の細胞は、野生型対応細胞と比較した第１の遺伝子に対する修飾、及び野生型対応細胞と比較した第２の遺伝子に対する修飾を含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする治療有効量の少なくとも１つの薬剤を対象に投与することを更に含み、薬剤は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物と結合する抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、本明細書に記載される細胞、若しくはその子孫のうちのいずれか、又は細胞集団のうちのいずれかの投与と同時に、あるいは時間的に近接して生じる。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、本明細書に記載される細胞、若しくはその子孫のうちのいずれか、又は細胞集団のうちのいずれかの投与後に生じる。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、本明細書に記載される細胞、若しくはその子孫のうちのいずれか、又は細胞集団のうちのいずれかの投与前に生じる。

いくつかの実施形態では、方法は、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする治療有効量の少なくとも１つの薬剤を対象に投与することを更に含み、薬剤は、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物と結合する抗原結合断片を含む。

いくつかの実施形態では、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、本明細書に記載される細胞、若しくはその子孫のうちのいずれか、又は細胞集団のうちのいずれかの投与と同時に、あるいは時間的に近接して生じる。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、本明細書に記載される細胞、若しくはその子孫のうちのいずれか、又は細胞集団のうちのいずれかの投与後に生じる。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、本明細書に記載される細胞、若しくはその子孫のうちのいずれか、又は細胞集団のうちのいずれかの投与前に生じる。

いくつかの実施形態では、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与と同時に、又は時間的に近接して生じる。

いくつかの実施形態では、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与後に生じる。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与前に生じる。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤、及び／又は第２の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、細胞傷害性薬剤である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、抗体－薬物複合体、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞である。

いくつかの実施形態では、対象は、修飾遺伝子又はその野生型コピーを発現する細胞に関連する疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、がん幹細胞に関連するがんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。

上記の要約は、本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用のいくつかを非限定的な様式で説明することを意図している。本明細書に開示される技術のその他の実施形態、利点、特徴、及び使用は、詳細な説明、図面、実施例、及び特許請求の範囲から明らかとなる。

図１は、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を解凍して４０時間インキュベートし、次いで、「ＥＰ１」と呼ばれる第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションする例示的な実験デザインの概略図を示す。３０時間後、細胞に、ＥＰ２と呼ばれる第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした。次いで、細胞を収集して、例えば、定性的及び定量的の両方の転座アッセイを使用して、オンターゲット編集及び転座産物の存在を評価する。図２Ａ及び２Ｂは、図１に示される実験デザインに基づいて、ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて測定された生存率及び編集効率を示す。細胞群を、図１に示すように、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼと同時に、若しくは第１のｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ、続いて第２のｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼで連続してエレクトロポレーションするか、又はモックエレクトロポレーションした。図２Ａは、第１のエレクトロポレーション（「第１のｚａｐ」）後の示された時点での生存率分析を示す。図２Ｂは、ＣＤ１９又はＣＤ３３のオンターゲット編集効率のパーセントを示す。「ＳｉＣＤ３３＋ＣＤ１９」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、並びにＣＤ１９及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とするｇＲＮＡと同時にエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅＣＤ３３＞ＣＤ１９」は、ＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第１のｇＲＮＡ、続いてＣＤ１９及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第２のｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅＣＤ１９＞ＣＤ３３」は、ＣＤ１９及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第１のｇＲＮＡ、続いてＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第２のｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する。あるいは、細胞に、ＣＤ１９又はＣＤ３３、及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とするｇＲＮＡをエレクトロポレーションし、３０時間又は６０時間で評価した。細胞の各群に対するオンターゲット編集効率のパーセントを、各カラムの上方に示す。図２Ｂでは、各編集スキームについて、左のカラムはＣＤ１９編集（アスタリスクで示す）に対応し、右のカラムはＣＤ３３編集に対応する。図３は、２つのゲノム遺伝子座での遺伝子編集によって産生される二本鎖切断間のＤＮＡ修復事象によって産生される可能性のある転座産物の概略図を示す。左に、ＣＤ１９をコードする染色体領域及びＣＤ３３をコードする染色体領域を示す。それぞれの標的を標的とするｇＲＮＡの位置は、三角形で示されている。標的領域にわたるプライマー対の位置を矢印で示し、ＣＤ１９については３及び２、ＣＤ３３については５及び８として標識する。右には、アセントリック、ダイセントリック、及びバランス型などを含む潜在的な転座産物が示されており、産物の各々を識別するために使用されるプライマー対を示している。図４Ａ～４Ｃは、図１に示す実験デザインに基づいて、ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて測定された転座分析及び編集効率を示す。図４Ａは、ＨＰＲＴに対して正規化された標的を用いた定性的転座分析の結果を示す。図４Ｂは、基準に対して正規化された転座種のパーセンテージを示す。転座分析については、細胞の各群について、左のカラムはプライマー５及び２を使用して検出された転座産物（ダイセントリック転座産物）に対応し、右のカラムはプライマー８及び２を使用して検出された転座産物（バランス型転座産物）に対応する。図４Ｃは、ＣＤ１９又はＣＤ３３のオンターゲット編集効率のパーセンテージを示す。「ＳｉＣＤ３３＋ＣＤ１９」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、並びにＣＤ１９及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とするｇＲＮＡと同時にエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅＣＤ３３＞ＣＤ１９」は、ＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第１のｇＲＮＡ、続いてＣＤ１９及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第２のｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅＣＤ１９＞ＣＤ３３」は、ＣＤ１９及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第１のｇＲＮＡ、続いてＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第２のｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する。図５Ａ及び５Ｂは、ＣＤ３３及びＣＤ１９遺伝子編集の対立遺伝子頻度を示す。図５Ａは、高頻度の－１インデルを有し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を示す、示されたｇＲＮＡによるＣＤ３３遺伝子編集から生じる対立遺伝子のアラインメントを示す。図５Ｂは、高頻度の－６及び－９インデルを有し、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）修復を示す、示されたｇＲＮＡによるＣＤ１９遺伝子編集から生じる対立遺伝子のアラインメントを示す。図６Ａ～６Ｃは、遺伝子編集の時系列及び編集反応の動態が転座産物の産生において役割を果たし得る、予測シナリオの概略図を示す。図６Ａは、第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡが同時に（左）又は連続的に（右）細胞に送達される予測シナリオを示す。左では、第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む第１のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ１）、並びに第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む第２のＲＮＰ複合体（ＲＮＰ２）の送達により、２つの二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じ、これは異なる動態で修復され、第１の標的（標的１）及び第２の標的（標的２）でインデルを産生し、並びに２つのＤＳＢ間の潜在的なトランスペアリングを生じさせる。右では、第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む第１のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ１）の送達により、二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じ、これは第１の標的（標的１）でインデルを産生するように修復され、続いて第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む第２のＲＮＰ複合体（ＲＮＰ２）の送達の動態学的距離により、第２の標的（標的２）で二本鎖切断（ＤＳＢ）及び修復がもたらされる。図６Ｂは、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＤ１９を標的とする第２のｇＲＮＡを使用する連続的な編集を示す。ＣＤ３３ｇＲＮＡで生成されたＤＳＢは、ＮＨＥＪによって修復され、ＣＤ１９を標的とするｇＲＮＡが送達される時間であるエレクトロポレーション後の３０時間までにほぼ完了したと考えられる。図６Ｃは、ＣＤ１９を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡを使用する連続的な編集を示す。ＣＤ１９ｇＲＮＡで生成されたＤＳＢは、ＭＭＥＪによって修復され、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡが送達される時間であるエレクトロポレーション後の３０時間までにほぼ完了しないと考えられるため、２つのＤＳＢ間の潜在的なマイクロホモロジートランスペアリングが可能となる。図６Ｂ及び６Ｂの概略図の下に示されるｇＲＮＡ配列は、マイクロホモロジーペアリング（例えば、ＧＧＴペアリング）に基づく予想される切断及び潜在的な転座シナリオを示す。図７Ａ及び７Ｂは、同時又は連続的に編集された細胞の編集の持続性及び長期再構成を評価するための例示的な実験デザインを示す。図７Ａは、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を解凍して４０時間インキュベートし、次いで、「ＥＰ１」と呼ばれる第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションする、例示的な実験デザインの概略図を示す。３０時間後、細胞に、ＥＰ２と呼ばれる第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした。次いで、細胞を、２００センチグレイ（ｃＧｙ）の放射線で処置した免疫不全マウス（例えば、ＮＯＤ－ｓｃｉｄＩＬＲガンマヌル（「ＮＳＧ（商標）」）マウス）に投与した。図７Ｂは、細胞の実験群を示す：群１は、ＰＢＳを受けた対照群（「ＰＢＳＣｔｒｌ」）に対応する；群２はエレクトロポレーションを行わなかった対照群（「ＥＰなし」）に対応する；群３は、対照ｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションした対照群（「Ｓｉ－ｇＣｔｒｌ」）に対応する；群４は、対照ｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした対照群（「Ｓｅ－ｇＣｔｒｌ」）に対応する；群５は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、続いて対照ｇＲＮＡ（「ｇＣｔｒｌ」）を連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する；群６は、ＣＤ５を標的とするｇＲＮＡ、続いて対照ｇＲＮＡ（「ｇＣｔｒｌ」）を連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する；群７は、低濃度（１５μｇ）のＣａｓ９ヌクレアーゼ（「ＳｉＬｏＣａｓ９」）を用いて、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ及びＣＤ５を標的とするｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションした細胞に対応する；群８は、高濃度（３０μｇ）のＣａｓ９ヌクレアーゼ（「ＳｉＨｉＣａｓ９」）を用いて、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ及びＣＤ５を標的とするｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションした細胞に対応する；群９は、連続的に、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡをエレクトロポレーションし、続いてＣＤ５を標的とするｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞に対応する；群１０は、同時に、ＣＤ５を標的とするｇＲＮＡをエレクトロポレーションし、続いてＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図８Ａ及び８Ｂは、図１２Ａに示す実験デザインに基づいて、ＮＧＧ（商標）マウスに投与する前にＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて測定された生存率及び編集効率を示す。図８Ａは、エレクトロポレーション１（ＥＰ１）後の示された時間（時間）での細胞の生存率分析を示す。実験群をｘ軸に示す。図８Ｂは、ＮＧＧ（商標）マウスに投与する前の細胞の編集効率のパーセントを示す。ｘ軸に示される各実験群について、左のカラムはＣＤ３３の編集に対応し、右のカラムはＣＤ５の編集に対応する。各編集スキームについて、左のカラムはＣＤ３３編集（アスタリスクで示す）に対応し、右のカラムはＣＤ５に対応する。図９は、図７Ａに示す実験デザインに基づいて、ＮＧＧ（商標）マウスに投与する前に細胞において検出されたオンターゲット転座産物のパーセンテージ（１９番染色体（Ｃｈ１９）に対して正規化したもの）を示す。ｘ軸に示される各実験群について、積み重ねられたカラムは、上から下への、アセントリック転座、バランス型Ｂ、バランス型Ａ、及びダイセントリック転座に対応する。右パネルは、４つの別個の転座種の各々の概略図を示す。転座種を評価するために使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの位置を矢印で示す。図１０は、図１２Ａに示す実験デザインに基づいて、マウス骨髄からのインプット及びアウトプット試料におけるオンターゲット転座産物のパーセンテージ（１９番染色体（Ｃｈ１９）に対して正規化したもの）を示す。各列について、第１の番号は、図７Ｂの群に対応し、第２の番号は、個々の動物に対応する。図１１は、図７Ａに示される実験デザインに基づいて、編集されたＣＤ３４＋細胞をＮＳＧ（商標）マウスに投与した後１６週間でのヒト骨髄キメリズムのパーセンテージを示す。結果は、ＣＤ３４＋細胞適合性が、Ｃａｓ９多重エレクトロポレーション又はＣＤ５編集によって影響を受けなかったことを示す。図１２Ａ～１２Ｃは、図７Ａに示される実験デザインに基づいて、編集されたＣＤ３４＋細胞をＮＳＧ（商標）マウスに投与した後１６週間での特定の血液細胞型のパーセンテージ（ｈＣＤ４５＋細胞の割合として）を示す。図１２Ａは、示される細胞群についてのＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）のパーセンテージを示す。図１２Ｂは、示される細胞群についてのＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。図１２Ｃは、示される細胞群についてのＣＤ３３＋細胞（骨髄細胞）のパーセンテージを示す。結果は、Ｂ細胞系統及びＴ細胞系統が、ＣＤ３３及びＣＤ５の多重遺伝子編集（連続的又は同時に）によって影響を受けない一方で、骨髄系細胞（ｈＣＤ３３＋）のパーセンテージが、ＣＤ３３遺伝子編集を標的とすることによるＣＤ３３の喪失に起因して低いこと示す。図１３Ａ～１３Ｃは、図１２Ａに示される実験デザインに基づいて、編集されたＣＤ３４＋細胞をＮＳＧ（商標）マウスに投与した後１６週間の時点でのマウスの胸腺における特定のＴ細胞型のパーセンテージを示す。図１３Ａは、ＣＤ３＋細胞のパーセンテージ（ｈＣＤ４５＋細胞の割合として）を示す。図１３Ａは、ＣＤ４＋細胞のパーセンテージ（ＣＤ３＋細胞の割合として）を示す。図１３Ａは、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージ（ＣＤ３＋細胞の割合として）を示す図１４は、第１のエレクトロポレーション（「第１のｚａｐ」）後の示された時点でのＣＤ３４＋ＨＳＣの生存率分析を示す。「ＳｉＣａｓ９＋Ｃｐｆ１」は、第１及び第２のｇＲＮＡ、並びにＣａｓ９及びＣｐｆ１ヌクレアーゼを同時にエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅＣａｓ９＞Ｃｐｆ１」は、ＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第１のｇＲＮＡ、続いてＣＤ１９及びＣｐｆ１ヌクレアーゼを標的とする第２のｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅＣｐｆ１＞Ｃａｓ９」は、ＣＤ１９及びＣｐｆ１ヌクレアーゼを標的とする第１のｇＲＮＡ、続いてＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とする第２のｇＲＮＡを連続的にエレクトロポレーションした細胞に対応する。あるいは、細胞に、ＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とするｇＲＮＡ、又はＣＤ１９及びＣｐｆ１ヌクレアーゼを標的とするｇＲＮＡをエレクトロポレーションした。対照細胞は、エレクトロポレーションしていない（ＥＰなし）か、又はモックエレクトロポレーション（モックＥＰ）かのいずれかであった。図１５Ａ及び１５Ｂは、エレクトロポレーション１（ＥＰ１）後の指示された時間（時間）でＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて測定された編集効率を示す。実験群をｘ軸に示す。ｘ軸に示される各実験群について、左のカラムはＣＤ３３の編集（アスタリスクで示される）に対応し、右のカラムはＣＤ１９の編集に対応する。図１５Ａ及び１５Ｂは、エレクトロポレーション１（ＥＰ１）後の指示された時間（時間）でＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて測定された編集効率を示す。実験群をｘ軸に示す。ｘ軸に示される各実験群について、左のカラムはＣＤ３３の編集（アスタリスクで示される）に対応し、右のカラムはＣＤ１９の編集に対応する。図１６は、ＨＰＲＴに対して正規化された標的を基準として転座分析の結果を示す。細胞群のエレクトロポレーション条件を、転座産物を評価するために使用したプライマー対とともにｘ軸上に示す。図１７は、単一の標的編集細胞（すなわち、非多重、上のパネル）と比較した、多重編集（下のパネル）の例示的な実験デザインの概略図を示す。多重編集について、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を解凍し、サイトカインを補充した無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）中で２４時間培養し、次いで、「ＥＰ１」と呼ばれるＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした。細胞を３０時間インキュベートし、次いで、「ＥＰ２」と呼ばれるＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした。６３時間後、細胞を収集し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して選別し、配列決定に供した。図１８Ａ～１８Ｃは、ドナーに由来する様々な細胞型におけるＣＤ３３編集頻度の結果を示す。図１８Ａは、各ドナーからの示される細胞型におけるオンターゲットＣＤ３３編集効率のパーセンテージを示す。図１８Ｂ及び１８Ｃは、それぞれ、ドナーＳＤ０１０００５１０及びＢ０１００１３３５に由来する細胞における編集頻度のパーセンテージとして表されるＣＤ３３インデル分析を示す。図１８Ｂ及び１８Ｃは、それぞれ、ドナーＳＤ０１０００５１０及びＢ０１００１３３５に由来する細胞における編集頻度のパーセンテージとして表されるＣＤ３３インデル分析を示す。「ＳｅｑＣＤ３３：ＣＬＬ１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲＣａｓ９ヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲＣａｓ９ヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＬＴ－ＨＳＣ」は、長期造血幹細胞に対応する。「ＣＭＰ」は、骨髄性共通前駆幹細胞に対応する。「ＭＰＰ」は、多能性前駆細胞に対応する。「ＭＬＰ」は、多リンパ前駆細胞に対応する。「ＣＤ４９ｆ」は、ＣＤ４９ｆ抗体を使用して精製された造血幹細胞に対応する。各ドナー又はインデル位置について、カラムは、ＳｅｑＣＤ３３：ＣＬＬ１、ＬＴ－ＨＳＣ、ＣＭＰ、ＭＰＰ、ＭＬＰ、及びＣＤ４９ｆに対応する。図１９Ａ～１９Ｃは、ドナーに由来する様々な細胞型におけるＣＬＬ－１編集頻度を示す。図１９Ａは、各ドナーからの示される細胞型におけるオンターゲットＣＬＬ－１編集効率のパーセンテージを示す。図１９Ｂ及び１９Ｃは、それぞれ、ドナーＳＤ０１０００５１０及びＢ０１００１３３５に由来する細胞における編集頻度パーセントとして表されるＣＬＬ－１インデル分析を示す。図１９Ｂ及び１９Ｃは、それぞれ、ドナーＳＤ０１０００５１０及びＢ０１００１３３５に由来する細胞における編集頻度パーセントとして表されるＣＬＬ－１インデル分析を示す。「ＳｅｑＣＤ３３：ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲＣａｓ９ヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＬＴ－ＨＳＣ」は、長期造血幹細胞に対応する。「ＣＭＰ」は、骨髄性共通前駆細胞に対応する。「ＭＰＰ」は、多能性前駆細胞に対応する。「ＭＬＰ」は、多リンパ前駆細胞に対応する。「ＣＤ４９ｆ」は、ＣＤ４９ｆ抗体を使用して精製された造血幹細胞に対応する。各ドナー又はインデル位置について、カラムは、ＳｅｑＣＤ３３：ＣＬＬ－１、ＬＴ－ＨＳＣ、ＣＭＰ、ＭＰＰ、ＭＬＰ、及びＣＤ４９ｆに対応する。図２０は、多重編集後のドナーに由来する示される細胞型の生存率を示す。「ＬＴ－ＨＳＣ」は、長期造血幹細胞に対応する。「ＳＴ－ＨＳＣ」は、短期造血幹細胞に対応する。「ＣＭＰ」は、骨髄性共通前駆幹細胞に対応する。「ＣＤ４９ｆ」は、ＣＤ４９ｆ抗体を使用して精製された造血幹細胞に対応する。「ＭＬＰ」は、多リンパ前駆細胞に対応する。「ＭＰＰ」は、多能性前駆細胞に対応する。図２１Ａ～２１Ｄは、多重編集後のＨＬ６０細胞におけるＣＤ３３編集及び発現分析を示す。図２１Ａは、示される時点でのＴＩＤＥ分析によって決定されたＣＤ３３の編集頻度のパーセンテージを示す。図２１Ｂは、エレクトロポレーション後の示される時点（培養日数）での、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ（ｇ８１１）又は対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）をエレクトロポレーションした細胞におけるＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＤ３３転写産物の発現を示す。ＣＤ３３転写物発現は、０日目での発現のパーセントとして表示される。図２１Ｃは、示される時点にわたるフローサイトメトリー分析によって評価されたＣＤ３３表面発現を示す。図２１Ｄは、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析に使用されるＣＤ３３転写産物及び代表的なプライマーの位置の概略図を示す。「ＴＩＤＥ」は、分解によるインデルの追跡を指す。「ＲＴ－ｑＰＣＲ」は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＴＣ１は、時間経過１を指し、ＴＣ２は、時間経過２を指す。図２２Ａ～２２Ｄは、多重編集後のＨＬ６０細胞におけるＣＬＬ－１編集及び発現分析を示す。図２２Ａは、示される時点でのＴＩＤＥ分析によって決定されたＣＬＬ－１の編集頻度のパーセンテージを示す。図２２Ｂは、エレクトロポレーション後の示される時点での、ＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ（ｇ６）又は対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）をエレクトロポレーションした細胞におけるＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＬＬ－１転写産物の発現を示す。図２２Ｃは、示される時点でのフローサイトメトリー分析によって評価されたＣＬＬ－１表面発現を示す。図２２Ｄは、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析に使用されるＣＬＬ－１転写産物及び代表的なプライマーの位置の概略図を示す。図２３は、連続的な多重編集のための例示的な実験デザインの概略図を示す。細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を４０時間解凍し、次いで、２日目（Ｄ２）には「ＥＰ１」、３日目（Ｄ３）には「ＥＰ２」と呼ばれる、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を連続的にエレクトロポレーションした。ＥＰ２の２６時間後、細胞を、表現型及び機能的特徴付け（例えば、フローサイトメトリー、食作用、及びサイトカイン放出アッセイ）の前に、８日目（Ｄ８）、１１日目（Ｄ１１）、及び１８日目（Ｄ１８）での細胞計数／分割を含む１４日間にわたって骨髄分化培養条件に供した。図２４Ａ及び２４Ｂは、示される時点での細胞分化中の増殖速度分析を示す。図２４Ａは、顆粒球分化中の生細胞数としての増殖率を示す。図２４Ｂは、単球分化中の生細胞数としての増殖率を示す。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図２５Ａ及び２５Ｂは、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）における顆粒球分化に対する連続的な多重編集の効果を示す。図２５Ａは、示される時点でのＣＤ１５＋細胞のパーセンテージを示す。図２５Ｂは、示される時点でのＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージを示す。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図２６Ａ及び２６Ｂは、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）における単球分化に対する連続的な多重編集の効果を示す。図２６Ａは、示される時点でのＣＤ１４＋細胞のパーセンテージを示す。図２６Ｂは、示される時点でのＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージを示す。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図２７Ａ及び２７Ｂは、示される時点で骨髄分化全体を通して維持されたＣＬＬ－１編集頻度を示す。図２７Ａは、顆粒球分化全体を通したＣＬＬ－１の編集頻度のパーセンテージを示す。図２７Ｂは、単球分化全体を通したＣＬＬ－１の編集頻度のパーセンテージを示す。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図２８Ａ及び２８Ｂは、示される時点で骨髄分化全体を通して維持されたＣＤ３３編集頻度を示す。図２８Ａは、顆粒球分化全体を通したＣＤ３３の編集頻度のパーセンテージを示す。図２８Ｂは、単球分化全体を通したＣＤ３３の編集頻度のパーセンテージを示す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰ、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰを受けた細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ１＞ＣＤ３３」は、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰ、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰを受けた細胞に対応する。図２９Ａ～２９Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＬＬ－１タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図２９Ａ及び２９Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ｂ及び２９Ｄは、示される時点での単球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ａ～２９Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＬＬ－１タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図２９Ａ及び２９Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ｂ及び２９Ｄは、示される時点での単球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ａ～２９Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＬＬ－１タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図２９Ａ及び２９Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ｂ及び２９Ｄは、示される時点での単球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ａ～２９Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＬＬ－１タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図２９Ａ及び２９Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＬＬ－１発現を示す。図２９Ｂ及び２９Ｄは、示される時点での単球におけるＣＬＬ－１発現を示す。ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによるエレクトロポレーションは、矢印で示すように、２日目及び３日目で生じた。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図３０Ａ～３０Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＤ３３タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図３０Ａ及び３０Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ｂ及び３０Ｄは、示される時点での単球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ａ～３０Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＤ３３タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図３０Ａ及び３０Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ｂ及び３０Ｄは、示される時点での単球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ａ～３０Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＤ３３タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図３０Ａ及び３０Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ｂ及び３０Ｄは、示される時点での単球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ａ～３０Ｄは、フローサイトメトリー分析によって評価された、ＣＤ３３タンパク質発現に対する多重編集の効果を示す。図３０Ａ及び３０Ｃは、示される時点での顆粒球におけるＣＤ３３発現を示す。図３０Ｂ及び３０Ｄは、示される時点での単球におけるＣＤ３３発現を示す。ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによるエレクトロポレーションは、矢印で示すように、２日目及び３日目で生じた。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図３１Ａ及び３１Ｂは、多重編集後１８日目の分化骨髄細胞におけるＣＬＬ－１及びＣＤ３３発現のフローサイトメトリー分析を示す。図３１Ａは、顆粒球におけるＣＬＬ－１及びＣＤ３３発現分析を示す。図３１Ｂは、単球におけるＣＬＬ－１及びＣＤ３３発現分析を示す。グラフの各個々のバーのセグメントは、上から下へ、ＣＬＬ－１＋ＣＤ３３＋、ＣＬＬ－１＋ＣＤ３３－、ＣＬＬ－１－ＣＤ３３＋、及びＣＬＬ－１－ＣＤ３３－に対応する。右端の２本のバーの上の楕円は、ＣＬＬ－１及びＣＤ３３発現が欠損していた細胞のパーセンテージを示す。「ＳｅｑＣＤ３３：ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１：ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図３２Ａ及び３２Ｂは、多重編集後の分化骨髄細胞の食作用能力を示す。食作用能力を、ｐＨｒｏｄｏ＋Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又はｐＨｒｏｄｏ＋Ｅ．ｃｏｌｉ及びサイトカラシンＤ（「ＣｙｔｏＤ」）に供されたｐＨｒｏｄｏ＋細胞のパーセントとして分析した。図３２Ａは、食作用を顆粒球中のｐＨｒｏｄｏ＋細胞のパーセントとして示す。図３２Ｂは、食作用を単球中のｐＨｒｏｄｏ＋細胞のパーセントとして示す。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図３３は、系統分化を評価するための例示的な実験デザインの概略図を示す。新たにエレクトロポレーションした細胞を、メチルセルロース系分化培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標））中で混合し、次いで播種した。１４日間インキュベートした後、細胞を画像化して、スコア化した。「ＢＦＵ－Ｅ」は、赤芽球バースト形成単位を指す。「ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ」は、コロニー形成単位－顆粒球／マクロファージを指す。「ＣＦＵ－ＧＥＭＭ」は、顆粒球、赤血球、マクロファージ、及び巨核球を生成する多能性骨髄前駆細胞のコロニー形成単位を指す。図３４Ａ及び３４Ｂは、多重編集細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）分析を示す。図３４Ａは、細胞を２００細胞／ウェルの希釈で播種した場合に形成されたコロニーの数を示す。図３４Ｂは、細胞を３００細胞／ウェルの希釈で播種した場合に形成されたコロニーの数を示す。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＧＥＭＭ」は、顆粒球、赤血球、マクロファージ、及び巨核球を生成する多能性骨髄前駆細胞を指す。「Ｇ／Ｍ／ＧＭ」は、顆粒球、マクロファージを指す。「ＢＦＵ－Ｅ」は、赤芽球バースト形成単位を指す。各編集条件について、バーのセグメントは、上から下へ、ＧＥＭＭ、Ｇ／Ｍ／ＧＭ、及びＢＦＵ－Ｅに対応する。図３５Ａ及び３５Ｂは、多重編集細胞により形成されたＣＦＵのコロニー分布分析を示す。図３５Ａは、２００細胞／ウェルの希釈で播種した細胞によって形成されたＣＦＵの分布を示す。図３５Ｂは、３００細胞／ウェルの希釈で播種した細胞によって形成されたＣＦＵの分布を示す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰ、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰを受けた細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰ、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰを受けた細胞に対応する。「モック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を指す。「ＧＥＭＭ」は、顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球を指す。「Ｇ／Ｍ／ＧＭ」は、顆粒球、マクロファージを指す。「ＢＦＵ－Ｅ」は、赤芽球バースト形成単位を指す。図３６Ａ及び３６Ｂは、多重編集造血細胞の長期生着を評価するための例示的な実験デザインを示す。図３６Ａは、左パネルで、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）がインビトロで編集され、ＮＳＧ（商標）マウスに生着される、例示的な多重編集及び生着アプローチの概略図を示す。移植後８週で、血液試料を採取し、フローサイトメトリー細胞選別（ＦＡＣＳ）によって評価した。移植後１６週で、血液試料及び骨髄を採取し、ＦＡＣ、配列決定（ｇＤＮＡ）、及び生存率によって評価した。図３６Ｂは、実験条件のリストの一例を示す。「ｅＨＳＣ」は、胚性幹細胞を指す。「Ｎ」は、示される治療群におけるマウスの数を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰ、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰを受けた細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰ、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＥＰを受けた細胞に対応する。「ＳｉＨｉＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、及びＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ、及び高濃度のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ（使用したｇＲＮＡ当たり３０μｇのＣａｓヌクレアーゼ、合計６０μｇのＣａｓヌクレアーゼ）を同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。「Ｓｅモック＞モック」は、連続的なモックエレクトロポレーションを受けた細胞を指す。「ＥＰなし」は、エレクトロポレーションしていない細胞を指す。図３７は、凍結保存前（凍結前）及び解凍後（解凍後）の細胞の細胞数及び生存率を示す表である。図３８は、多重編集細胞の生着から１６週後の骨髄（ＢＭ）キメリズムの分析を示す。「ＥＰなし」は、エレクトロポレーションしていない細胞を指す。「ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｅｑＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｉＨｉＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、高濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ及びＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。図３９Ａ～３９Ｈは、生着後のマウスモデルから採取した骨髄系細胞及びリンパ系系統細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図３９Ａは、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｂは、単球（ＣＤ１４＋／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｃは、好中球（ＣＤ１５＋／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｄは、マスト／好塩基球細胞（ＣＤ２０３＋／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｅは、Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｆは、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ、ＣＤ３４＋／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｇは、古典的な樹状細胞（ｃＤＣ、ｃＤＣ／ｈＣＤ４５＋）を示す。図３９Ｈは、形質細胞様樹状細胞（ｐＣＤ、ｐＤＣ／ｈＣＤ４５＋）を示す。「ＳｃＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｃＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｉＨｉＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、高濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ及びＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。図４０Ａ～４０Ｆは、生着後のマウスから採取した細胞の骨髄系細胞及びリンパ系系統細胞のフローサイトメトリー分析におけるＣＤ３３及びＣＬＬ－１タンパク質の発現レベルを示す。図４０Ａは、全ヒトＣＤ４５＋細胞における発現を示す。図４０Ｂは、単球（ＣＤ１４＋細胞）上の発現を示す。図４０Ｃは、好中球（ＣＤ１５＋細胞）を示す。図４０Ｄは、マスト／好塩基球細胞（ＣＤ２０３＋細胞）を示す。図４０Ｅは、古典的な樹状細胞（ｃＤＣ）を示す。図４０Ｆは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を示す。「ＥＰなし」は、エレクトロポレーションしていない細胞を指す。「ＳｃＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｃＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＳｉＨｉＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、高濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ及びＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。各編集条件について、バーのセグメントは、上から下へ、ＣＤ３３－ＣＬＬ－１－、ＣＤ３３－ＣＬＬ－１＋、ＣＤ３３＋、ＣＬＬ－１－、及びＣＤ３３＋ＣＬＬ－１＋に対応する。図４１Ａ及び４１Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、生着後１６週のマウスから採取したＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ３３及びＣＬＬ－１タンパク質の発現レベルを示す。図４１Ａは、エレクトロポレーション対照細胞を示さず、細胞の９１．５％がＣＤ３３＋及びＣＬＬ－１＋であった。図４１Ｂは、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞（ＳｅｑＣＤ３３＞ＣＬＬ－１）を示し、細胞の９８．３％がＣＤ３３－及びＣＬＬ－１陰性であった。図４２は、エレクトロポレーション後５６時間時点での、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって評価されたオンターゲット編集、及びＣＤ３３標的化ｇＲＮＡを使用したＣＤ３３での編集効率（ＣＤ３３ｇ８１１；左のカラム）、及びＣＬＬ－１標的化ｇＲＮＡを使用したＣＬＬ－１での編集効率（ＣＬＬ－１ｇ６、右のカラム）を示す。「ＳｉＨｉ」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、ＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ、及び高濃度のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ（使用したｇＲＮＡ当たり３０μｇのＣａｓヌクレアーゼ、合計６０μｇのＣａｓヌクレアーゼ）を同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。オンターゲット編集を、標的アンプリコン配列決定（ｒｈＡｍｐＳｅｑ（商標））によって評価した。「ＣＤ３３ｇ８１１＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ（ｇ８１１）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。「ＣＬＬ－１＞ＣＤ３３ｇ８１１」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ（ｇ８１１）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞に対応する。図４３Ａ及び４３Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ編集（ＩＣＥ）分析の推論によって評価された、エレクトロポレーション（ＥＰ）後の指定された時点での編集を示す。図４３Ａは、３０時間、５０時間、及び５６時間の時点での、ＣＤ３３標的化ｇＲＮＡ、ＣＤ３３ｇ８１１、及びＣＬＬ－１標的化ｇＲＮＡ、ＣＬＬ－１ｇ６を使用した編集効率を示す。図４３Ｂは、図４３Ａに反映される５６時間の時点での編集効率を示す。「ＳｉＨｉＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、ＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ、及び高濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼで同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。「ＳｅＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞を指す。「ＳｅＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞を指す。図４４は、例示的な転座事象の概略図を示す。図４５は、「ＥＰ１」と呼ばれる、第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによるエレクトロポレーションの５６時間後での、多重編集造血細胞における転座事象の分析を示す。“各編集条件について、カラムは、左から右に、ダイセントリック、バランス型１、バランス型２、及びアセントリック転座に対応する。「ＳｅＭｏｃｋ＞Ｍｏｃｋ」は、モックエレクトロポレーション細胞を指す。「ＳｉＨｉＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、ＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ、及び高濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼで同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。「ＳｅＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞を指す。「ＳｅＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞を指す。図４６は、ｒｈＡＭＰ－Ｓｅｑ（商標）によって評価した、生着後１６週での骨髄（ＢＭ）細胞の編集効率を示す。各編集条件について、左のデータポイントは、ＣＤ３３標的化ｇＲＮＡｇ８１１（ＣＤ３３ｇ８１１）を使用したＣＤ３３での編集効率に対応し、右のデータポイントは、ＣＬＬ－１標的化ｇＲＮＡｇ６（ＣＬＬ－１ｇ６）を使用したＣＬＬ－１での編集効率に対応する。正方形のデータポイントは、インプット試料を示す。「ＣＤ３３＞ＣＬＬ－１」は、連続的に、ＣＤ３３を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＬＬ－１を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞を指す。「ＣＬＬ－１＞ＣＤ３３」は、連続的に、ＣＬＬ－１を標的とする第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションし、続いて、ＣＤ３３を標的とする第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼをエレクトロポレーションした細胞を指す。「ＣＤ３３＋ＣＬＬ－１」は、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、ＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ、及び高濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼで同時にエレクトロポレーションした細胞を指す。図４７は、ＣＬＬ－１を標的とするｇＲＮＡ（ＣＬＬ１－ｇ６）及びＣａｓＯＦＦｉｎｄｅｒを使用して決定されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによる細胞のエレクトロポレーション後のオフターゲット編集事象の分析を示す。図４８は、ＣＬＬ－１標的化ｇＲＮＡ、ｇ６を使用した、３つの造血細胞ドナーＨＣ１、ＨＣ２、及びＨＣ３にわたるオンターゲット編集頻度の分析を示す。編集頻度は、ＩＣＥ（左のカラム）及びハイブリッド捕捉（右のカラム）の両方を使用して決定した。「ＩＣＥ」は、ＣＲＩＳＰＲ編集分析の推論を指す。図４９は、ＣＬＬ－１標的化ｇＲＮＡ（ｇ６）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによるエレクトロポレーションの結果として、ＣＬＬ－１遺伝子において予測されるオフターゲット編集事象を示す。図５０は、ＣＬＬ－１標的化ｇＲＮＡｇ６を使用した編集後の例示的な挿入欠失（インデル）スペクトルを示す。図５１は、ＣＤ３３又はＣＬＬ－１を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞とのインキュベーション後の標的造血細胞の生存を示す。標的造血細胞は、野生型（ＷＴ）、ＣＤ３３における欠損（ＣＤ３３^Ｄｅｌ）、ＣＬＬ－１における欠損（ＣＬＬ－１^Ｄｅｌ）、又はＣＤ３３及びＣＬＬ－１の両方における欠損（ＣＤ３３^ＤｅｌＣＬＬ－１^Ｄｅｌ）である。図５２Ａ～５２Ｄは、対照の未編集細胞（「ＣＴＲ」）と比較した、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１の多重編集（「ＭＰＸ」）後の分化骨髄細胞のサイトカイン産生を示す。図５２Ａは、ＩＬ－６産生を示す。図５２Ｂは、ＩＬ－８産生を示す。図５２Ｃは、ＴＮＦα産生を示す。図５２Ｄは、ＭＩＰ－１βの産生を示す。サイトカイン産生を、基礎レベル、及びリポ多糖（ＬＰＳ）又はレシキモド（Ｒ８４８）による刺激の２４時間後に評価した。Ｎ＝３。データは、平均＋／－標準偏差として示される。図５３は、ＭＰＸ編集又はＣＴＲ編集ｈＨＳＰＣを用いた移植後１６週でのＮＳＧマウスからのインプット細胞（ＣＤ３４＋’「インプットＣＤ３４＋細胞」）及びアウトプット異種移植骨髄細胞（「アウトプットＢＭ」）における転座のパーセントとして総転座事象を示す。「ＣＴＲ」は、対照細胞を指し、「ＭＰＸ」は、多重編集細胞を指す。Ｎ＝群当たり１２匹のマウス。図５４Ａ～５４Ｄは、ＡＭＬ患者由来芽球及び白血病幹細胞（ＬＳＣ）におけるＣＤ３３並びにＣＬＬ－１の発現を示す。図５４Ａは、ＡＭＬ芽球（Ｎ＝３３）におけるフローサイトメトリーによるＣＤ３３－陽性及びＣＬＬ－１陽性細胞のパーセンテージ（抗原陽性％）を示す。図５４Ｂは、ＡＭＬＬＳＣ（Ｎ＝２７）におけるフローサイトメトリーによるＣＤ３３－陽性及びＣＬＬ－１陽性細胞のパーセンテージ（抗原陽性％）を示す。図５４Ｃは、フローサイトメトリーによって定量化された、ＡＭＬ芽球の細胞表面上のＣＤ３３及びＣＬＬ－１の抗原密度を示す（Ｎ＝３１）。図５４Ｄは、フローサイトメトリーによって定量化された、ＡＭＬＬＳＣの細胞表面上のＣＤ３３及びＣＬＬ－１の抗原密度を示す（Ｎ＝２５）。

遺伝子修飾をもたらすためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用は、多用途かつ適応性のあるプラットフォームを提示するが、オフターゲット効果、転座事象のリスク、及び潜在的な悪性腫瘍などの治療用途におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用に関連するいくつかの潜在的なリスクが存在する。遺伝子修飾を導入する場合、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、ＤＮＡの切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ））が細胞のゲノムに導入され、標的配列の近位での切断及び挿入又は欠失（インデル）の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復をもたらす。このプロセスは、遺伝子のフレームシフト及び不活性化をもたらし得るが、２つの染色体又は染色体の断片が不適切に結合された場合に染色体転座を更にもたらし得る。染色体転座は、例えば、新しい融合タンパク質の発現、がん遺伝子の発現又は誤制御などを介して、ゲノムの不安定性及び様々な種類のがんと関連する。例えば、Ｂｒｕｎｅｔｅｔａｌ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（２０１８）１０４４：１５－２５、ＧｈｅｚｒａｏｕｉＨ，ｅｔａｌ．（２０１４）ＭｏｌＣｅｌｌ５５（６）：８２９－８４２、Ｂｏｔｈｍｅｒｅｔａｌ．ＣＲＩＳＰＲＪｏｕｒｎａｌ（２０２０）３（３）を参照されたい。複数の遺伝子修飾が細胞に導入される多重遺伝子編集は、特に、複数のＤＮＡ切断（例えば、ＤＳＢ）が同時に、又は実質的に同時に存在する場合、転座事象の潜在的なリスクを増加させ得る。潜在的な有害作用を最小化又は低減するために、遺伝子修飾の導入を調節する機構、例えば、転座事象のリスクを低減する機構が望まれる。

本開示の態様は、細胞において複数の遺伝子修飾を生成し、転座事象（例えば、転座産物の産生）のリスクを低減するのに有効な遺伝子編集方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、細胞又は細胞集団（複数の細胞）を、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させて、第１の遺伝子修飾をもたらし、続いて、細胞又は細胞集団（複数の細胞）を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させて、細胞中に第２の遺伝子修飾をもたらすことを伴い、接触ステップは、時間間隔を隔てて連続的に実施される。また、本明細書に記載される方法によって産生される細胞、及び本明細書に記載される方法によって産生される遺伝子操作細胞又はその子孫のうちのいずれかを対象に投与することを含む方法もまた本明細書で提供される。

当業者によって理解されるように、細胞のゲノムにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）の生成は、ＤＮＡ修復機構を動員して、切断部位でのＤＮＡ修復を促進する。概して、ＤＮＡ修復は、主な経路、相同性指向性修復（ＨＤＲ、「相同組換え」とも呼ばれる）、非相同末端結合（「ＮＨＥＪ」、古典的非相同末端結合（「ｃ－ＮＨＥＪ」）とも呼ばれる）、及びマイクロホモロジー媒介末端結合（「ＭＭＥＪ」、代替末端結合（「ａｌｔ－ＥＪ」）とも呼ばれる）である、いくつかの修復経路のうちのいずれかを通って進行し得る。

ＨＤＲは、切断を補正するために使用される相同鋳型の存在を伴い、典型的には、精密な（エラーのない）修復をもたらすと考えられる。ＮＨＥＪ機構は、挿入及び欠失（インデル）を産生し、相同鋳型を伴わない、効率的であるがエラーが発生しやすい修復機構である。ＮＨＥＪは、二本鎖切断の末端の直接的なライゲーションを含み、ＤＮＡリガーゼＩＶ複合体を含む部位に追加のＮＨＥＪタンパク質を動員するＫｕタンパク質を伴う。ＭＭＥＪ修復機構は、二本鎖切断（典型的には１～２５個のヌクレオチド）の末端内のマイクロホモロジーを伴う。ＭＭＥＪは、マイクロホモロジーの領域がアニーリングされ、ヌクレオチドの異種「フラップ」が除去され、その後ギャップの埋め込み合成及びライゲーションが続く一連のステップを経て進行する。この機序はエラーが発生しやすく、ＤＳＢに隣接するヌクレオチドの欠失と関連している。例えば、Ｚａｂｏｉｋｉｎｅｔａｌ．ＰＬｏｓＯｎｅ（２０１７）１２（１）：ｅ０１６９９３１、Ｗａｎｇｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ＆Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）７：６；Ｄｅｒｉａｎｏｅｔａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１３）４７：４３３－４５５を参照されたい。

本明細書で使用される「変異」という用語は、参照配列、例えば、そのような変異を有していない細胞の対応する配列、又は対応する野生型核酸配列と比較して、核酸における遺伝的変化（例えば、挿入、欠失、逆位、又は置換）を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生される細胞は、参照配列、例えば、そのような変異を有していない細胞の対応する配列、又は対応する野生型核酸配列と比較して、２つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の変異を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子（例えば、標的遺伝子）に対する変異は、変異を保有する細胞において、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子（例えば、標的遺伝子）における変異は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のバリアント形態の発現をもたらす。

本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される遺伝子操作細胞、例えば、タンパク質の発現若しくは調節、及び／又はタンパク質のバリアント形態の発現の喪失をもたらす修飾など、そのゲノム中に１つを超える修飾を含む遺伝子操作細胞を生成するための組成物及び方法を提供する。本明細書で提供されるそのような組成物及び方法は、限定されるものではないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドヌクレアーゼ、及びそのようなＲＮＡガイドヌクレアーゼと結合し、それらを細胞のゲノム中の好適な標的部位に標的化してゲノム修飾をもたらすことができる好適なガイドＲＮＡを使用することによる、細胞を遺伝子操作するための好適な戦略及びアプローチが含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作細胞は、細胞のゲノムに「編集」とも呼ばれる標的化された変化を導入することができる任意の技術を含むゲノム編集技術を介して生成される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、細胞のゲノム中に複数の編集を含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される遺伝子操作細胞を生成するための組成物及び方法を提供する。１つの例示的な好適なゲノム編集技術は、細胞のゲノムに標的一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断を導入するためのＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの使用を含む、「細胞編集」であり、これは、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（「代替ＮＨＥＪ」若しくは「ａｌｔ－ＮＨＥＪ」と称されることもあるＭＭＥＪ）、又は典型的には（例えば、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列挿入、欠失、逆位、又は置換を介して）ヌクレアーゼ切断の部位に、又はそのすぐ近位に改変された核酸配列をもたらす相同誘導型修復（ＨＤＲ）などの細胞修復機構を誘起する。Ｙｅｈｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１９）２１：１４６８－１４７８、例えば、Ｈｓｕｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１４）１５７：１２６２－１２７８、Ｊａｓｉｎｅｔａｌ．ＤＮＡＲｅｐａｉｒ（２０１６）４４：６－１６、Ｓｆｅｉｒｅｔａｌ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２０１５）４０：７０１－７１４を参照されたい。

別の例示的な好適なゲノム編集技術は、「塩基編集」であり、これは、塩基編集、例えば、具体的な核酸塩基、例えば、細胞ミスマッチ修復機構を介して、ＣヌクレオチドからＴヌクレオチドへの変化、又はＡヌクレオチドからＧヌクレオチドへの変化をもたらす、Ｃ又はＡヌクレオチドのシトシン又はアデノシン核酸塩基を標的とし、脱アミン化する、デアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ損傷又は部分的ヌクレアーゼ損傷ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の使用を含む。例えば、Ｋｏｍｏｒｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３：４２０－４２４、Ｒｅｅｓｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１８）１９（１２）：７７０－７８８、Ａｎｚａｌｏｎｅｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）３８：８２４－８４４を参照されたい。

更に別の例示的な好適なゲノム編集技術には、触媒的に損なわれた又は部分的に触媒的に損なわれたＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、操作された逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを使用した、新しい遺伝情報、例えば、改変されたヌクレオチド配列の特異的に標的化されたゲノム部位への導入を含む、「プライム編集」が含まれる。Ｃａｓ／ＲＴ融合は、所望の編集をコードする核酸配列も含み、ＲＴのためのプライマーとして機能することができる、ガイドＲＮＡによってゲノム内の標的部位に標的化される。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）５７６（７７８５）：１４９－１５７を参照されたい。

ゲノム編集技術の使用は、典型的には、いくつかの実施形態では、例えば、塩基編集又はプライム編集のために、触媒的に損なわれるか、又は部分的に触媒的に損なわれ得る、好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼの使用を特徴とする。好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼの例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用されるＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、ＤＮＡに二本鎖切断を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用されるＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、低減されたヌクレアーゼ活性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞を遺伝子操作する方法で使用するのに好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。

別の例について、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞を遺伝子操作する方法での使用に好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ（「Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ」とも呼ばれる）である。本明細書で使用される場合、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ｉ）ＰＡＭ部位の遠位で切断されるＩＩ型クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに由来するポリペプチド、及びｉｉ）好適なｇＲＮＡと組み合わせて、標的核酸配列（標的配列）と結合することができるポリペプチドを指す。例示的に好適なＣａｓ１２ヌクレアーゼには、限定されるものではないが、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＰａＣａｓ１２ａ、他のＣａｓ１２ａオルソログ、及びＭＡＤ７（商標）システム（ＭＡＤ７（商標）、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，Ｉｎｃ．）、又はＡｌｔ－ＲＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｕｌｔｒａヌクレアーゼ（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ１２ａＵｌｔｒａ、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などのＣａｓ１２ａ誘導体が含まれる。例えば、Ｇｉｌｌｅｔａｌ．ＬＩＰＳＣＯＭＢ２０１７．ＩｎＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ：ＩｎｓｃｒｉｐｔａＩｎｃ．、Ｐｒｉｃｅｅｔａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０２０）１１７（６０）：１８０５－１８１６、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１６６３４０号、同第ＷＯ２０１７／１５５４０７号、同第ＷＯ２０１８／０８３１２８号、同第ＷＯ２０１６／２０５７１１号、同第ＷＯ２０１７／０３５３８８号、同第ＷＯ２０１７／１８４７６８号、同第ＷＯ２０１９／１１８５１６号、同第ＷＯ２０１７／１８４７６８号、同第ＷＯ２０１８／０９８３８３号、同第ＷＯ２０２０／１４６２９７号、及び同第ＷＯ２０２０／１７２５０２号を参照されたい。

本明細書に記載される方法は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼが標的部位と結合して、細胞のゲノムＤＮＡを切断するのに好適な条件下で、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）を、細胞のゲノム中の好適な標的部位に標的化し、続いて、第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼが標的部位と結合して、細胞のゲノムＤＮＡを切断するのに好適な条件下で、第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）を細胞のゲノム中の第２の好適な標的部位に標的化することを伴う。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、同じ種類のヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのものであり、例えば、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼの両方が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、異なる種類のヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのものであり、例えば、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、異なる種類のヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのものであり、例えば、第１のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼであり、第２のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。好適なＲＮＡガイドヌクレアーゼは、好適なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってゲノム内の特定の標的部位に標的化され得る。本開示の態様に従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを標的とするための好適なｇＲＮＡが本明細書で提供され、例示的な好適なｇＲＮＡ（すなわち、ｇＲＮＡ）が、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれかは、好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと複合体化され得る。例示的な好適なヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼ及びＣａｓ９ヌクレアーゼが含まれる。

様々なＣａｓ９ヌクレアーゼは、本開示の態様に従ってゲノム編集をもたらし、例えば、ＣＤ３０遺伝子にゲノム修飾を作製するために、本明細書で提供されるｇＲＮＡと使用するのに好適である。典型的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）の形成に好適な形態及び条件下で提供され、これはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と呼ばれることがあり、細胞のゲノム上の標的部位を標的とする。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体を遺伝子座内の所望の標的部位配列に標的化するために、所望のＰＡＭ特異性を示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが使用される。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体は、例えば、インビトロで形成され、標的細胞は、例えば、細胞へのＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体のエレクトロポレーションを介して、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体と接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡと別々に接触し、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体が細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸、又はその両方と接触する。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼのクラス２のＶ型に属するＣａｓヌクレアーゼが使用される。クラス２のＶ型Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、及びＶ－Ｕ型として更に分類することができる。例えば、Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ｂ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃ２ｃ１である。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．ＭｏｌＣｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム編集の方法で使用されるＣａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ａ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）ヌクレアーゼである。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作細胞は、好適なゲノム編集技術を使用して生成され、ゲノム編集技術は、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼの使用によって特徴付けられる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作細胞は、好適なゲノム編集技術を使用して生成され、ゲノム編集技術は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、化膿連鎖球菌（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）、若しくはストレプトコッカス・サーモフィルス（ｓｔＣａｓ９）のものであるか、又はそれらに由来する。追加の好適なＣａｓ９分子としては、髄膜炎菌（ＮｍＣａｓ９）、アシドボラキス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘａｖｅｎａｅ）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバシラス・スイス、アクチノマイセス種、シクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・ジェジュニ（ＣｊＣａｓ９）、カンピロバクター・ラリ、カンジダツス・プニセイスピリルム（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウエルシュ菌、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌、コリネバクテリウム・マツルショッティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア科細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスチス種、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラヴェセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌａｃｔａｍｉｃａ）、髄膜炎菌、ナイセリア種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス種、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、連鎖球菌属種、サブドリグラヌルム属種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｐ．）、若しくはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒｅｉｓｅｎｉａｅ）のもの、又はそれらに由来するものが含まれる。いくつかの実施形態では、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼの触媒的に損なわれた、又は部分的に損なわれたバリアントが、使用され得る。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼ、及びヌクレアーゼバリアントが、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。本開示は、この点に関して限定されない。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ、参照配列、例えば、最も類似する天然に存在するＣａｓ９分子、又は参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１５７０７０号の表５０の配列と異なる、操作、改変、又は修飾されたＣａｓ分子である。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼのクラス２のＶ型に属するＣａｓヌクレアーゼが使用される。クラス２のＶ型Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、及びＶ－Ｕ型として更に分類することができる。例えば、Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ｂ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃ２ｃ１である。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．ＭｏｌＣｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム編集の方法で使用されるＣａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ａ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）ヌクレアーゼである。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム編集の方法で使用されるＣａｓヌクレアーゼは、プレボテーラ属種（Ｐｒｏｖｅｔｅｌｌａｓｐｐ．）、若しくはフランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｓｐｐ．）、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＬｐＣｐｆ１）、又はユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ）に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＭＡＤ７（商標）（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの天然に存在するバリアント及び修飾バリアントの両方が、本開示の態様による使用に好適である。例えば、ｄＣａｓ又はニッカーゼバリアント、改変されたＰＡＭ特異性を有するＣａｓバリアント、及び改善されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓバリアントが、本開示のいくつかの実施形態によって包含される。

いくつかの例示的で非限定的な好適なＣａｓヌクレアーゼのいくつかの特徴が、いかなる特定の理論にも拘束されることを所望することなく、本明細書により詳細に記載される。

天然に存在するＣａｓ９ヌクレアーゼは、典型的には、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブ及びヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、その各々は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号、例えば、その中の図９Ａ～９Ｂ（その出願が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）に記載されるドメインを更に含む。

ＲＥＣローブは、アルギニン豊富ブリッジヘリックス（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、及びＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９特異的機能ドメインであると考えられる。ＢＨドメインは、長いアルファヘリックス及びアルギニン豊富領域であり、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の配列のアミノ酸６０～９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡの反復：抗反復二本鎖の認識に関与する。ＲＥＣ１ドメインは、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の配列のアミノ酸９４～１７９及び３０８～７１７に２つのＲＥＣ１モチーフを含む。これら２つのＲＥＣ１ドメインは、線形一次構造ではＲＥＣ２ドメインによって分離されているが、三次構造に集合し、ＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメイン又はその一部はまた、反復：抗反復二本鎖の認識において役割を果たし得る。ＲＥＣ２ドメインは、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１８０～３０７を含む。

ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも称される）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも称される）、及びＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれ、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１～５９、７１８～７６９、及び９０９～１０９８において、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（当技術分野ではしばしば、ＲｕｖＣＩドメイン、又はＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインとして一般的に称される、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩ）から組み立てられる。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内の他のドメインによって直線的に分離されるが、三次構造では、３つのＲｕｖＣモチーフは、集合してＲｕｖＣドメインを形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の相補鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ－ＩＩＩモチーフの間に存在し、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の配列のアミノ酸７７５～９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１０９９～１３６８を含む。

結晶構造が、天然に存在する細菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）３４３（６１７６）：１２４７９９７を参照されたい）、及びガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合）を有する化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）１５６：９３５－９４９、及びＡｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３５７９）について決定されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子は、標的部位に、又はその直接近位に二本鎖ＤＮＡ切断の導入をもたらす、ヌクレアーゼ活性を示す。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼの触媒残基のうちの１つを不活化するように修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ニッカーゼであり、一本鎖切断を生じる。例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａｅｔａｌ．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）１２（７５）を参照されたい。酵素のＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン内の１つ以上の変異が、Ｃａｓ９効率を改善し得ることが示されている。例えば、Ｓａｒａｉｅｔａｌ．ＣｕｒｒｅｎｔｌｙＰｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、第２のドメイン、例えば、ＤＮＡ又はクロマチンを修飾するドメイン、例えば、デアミナーゼ又はデメチラーゼドメインと融合される。いくつかのそのような実施形態では、Ｃａｓ９分子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を排除するように修飾される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、相同性指向修復（ＨＤＲ）のための鋳型と一緒に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、ＨＤＲ鋳型を伴わずに投与される。

いくつかの実施形態では、酵素の特異性を増強する（例えば、オフターゲット効果を低減し、強固なオンターゲット切断を維持する）ように修飾されたＣａｓ９ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、増強された特異性Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、高忠実度Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９：４９０－４９５を参照されたい。

様々なＣａｓヌクレアーゼが、当技術分野で公知であり、様々な供給源から入手され、及び／又は酵素の１つ以上の活性若しくは特異性を調節するように操作／修飾され得る。好適なＣａｓヌクレアーゼ、例えば、好適なＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ｓｐＣａｓ９及びｓａＣａｓ９などのＰＡＭ配列の優先度及び特異性が、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼが操作／修飾を伴わずに認識するＰＡＭ配列とは異なる１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、酵素のオフターゲット活性を低減するように操作／修飾されている。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性の特異性を改変する（例えば、オフターゲット切断を低減し、細胞内のエンドヌクレアーゼ活性又は存続期間を減少させ、相同誘導型組換えを増加させ、非相同末端結合を低減する）ように更に修飾される、Ｃａｓヌクレアーゼが使用される。例えば、Ｋｏｍｏｒｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１７）１６８：２０－３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識又は選好を改変するように修飾される、Ｃａｓヌクレアーゼが使用される。例えば、ＳｐＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＧＧを認識する一方で、１つ以上の修飾を含むＳｐＣａｓ９のいくつかのバリアント（例えば、ＶＱＲＳｐＣａｓ９、ＥＱＲＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲＳｐＣａｓ９）は、バリアントＰＡＭ配列、例えば、ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、及び／又はＮＧＣＧを認識し得る。別の例について、ＳａＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識する一方で、１つ以上の修飾を含むＳａＣａｓ９のいくつかのバリアント（例えば、ＫＫＨＳａＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴを認識し得る。別の実施例では、ＦｎＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識する一方で、ＦｎＣａｓ９のバリアントは、１つ以上の修飾（例えば、ＲＨＡＦｎＣａｓ９）を含み、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。別の実施例では、置換変異Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒを含むＣａｓ１２ａヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。別の実施例では、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、及びＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えば、Ｇａｏｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）３５（８）：７８９－７９２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、塩基編集を使用して、細胞中にゲノム修飾が作製される。塩基編集体は、典型的には、機能ドメイン、例えば、デアミナーゼドメインに融合された触媒的に不活性又は部分的に不活性なＣａｓヌクレアーゼを含む。例えば、Ｅｉｄｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４、Ｒｅｅｓｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓヌクレアーゼは、「不活性Ｃａｓ」又は「ｄＣａｓ」と称される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基編集（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ分子は、低減した活性を有し、例えば、ニッカーゼである。

好適な塩基編集体の例としては、限定されるものではないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、及びＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰが含まれる。塩基編集体の追加の例は、例えば、米国公開第２０１８／０３１２８２５Ａ１号、米国公開第２０１８／０３１２８２８Ａ１号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１６５６２９Ａ１号で見出すことができ、これらは、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる。

本開示のいくつかの態様は、例えば、本明細書で提供されるようなＲＮＡガイドヌクレアーゼを細胞のゲノム中の標的部位に標的化するのに好適なガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞のゲノム中に修飾（例えば、挿入、変異、欠失）をもたらす。こうした修飾は、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現及び／若しくは調節の喪失、又はｇＲＮＡによって標的化される遺伝子によってコードされる遺伝子のバリアント形態の発現をもたらし得る。

「ｇＲＮＡ」及び「ガイドＲＮＡ」という用語は、全体を通じて互換的に使用され、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特異的標的化又はホーミングを促進する核酸を指す。ｇＲＮＡは、本明細書で時にｓｇＲＮＡと称される単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）、又はモジュール（１つより多い、通常は２つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ｇＲＮＡは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と結合し得る。ｇＲＮＡ（例えば、その標的化ドメイン）は、標的配列に対して部分的又は完全に相補的であり得る。ｇＲＮＡはまた、（例えば、ｇＲＮＡ配列の標的化ドメインによって）ｇＲＮＡ配列と結合された標的配列にＣａｓ９分子を動員する、「足場配列」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含み得る。足場配列は、少なくとも１つのステムループ構造を含み、エンドヌクレアーゼを動員し得る。例示的な足場配列は、例えば、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０９３６９４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に見出すことができる。

いくつかの例示的な好適なＣａｓ９ｇＲＮＡ足場配列が本明細書で提供され、追加の好適なｇＲＮＡ足場配列が、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような追加の好適な足場配列には、限定されるものではないが、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０９３６９４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に記載されているものが含まれる。

例えば、天然に存在するｓｐＣａｓ９ｇＲＮＡの結合ドメインは、典型的には、ｃｒＲＮＡ（部分的に）及びｔｒａｃｒＲＮＡという２つのＲＮＡ分子を含む。ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含む単一ＲＮＡ分子のみを含むｓｐＣａｓ９ｇＲＮＡのバリアントは、例えば、テトラループを介して、又はクリック化学タイプの共有結合を介して、互いに共有結合され、操作され、一般に「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」として言及される。標的部位を標的化するために好適なｇＲＮＡは、多数のドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが使用されるいくつかの実施形態では、単分子ｓｇＲＮＡは、５’から３’まで、
標的遺伝子座中の標的部位配列に対応する標的化ドメイン、
第１の相補性ドメイン、
結合ドメイン、
第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインと相補的である）、
近位ドメイン、及び
任意選択的に、テイルドメイン、を含む。

天然に存在するＣａｓ１２ａガイドＲＮＡが単一のＲＮＡ分子を含むため、他のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼとともに使用するための好適なｇＲＮＡは、典型的には、単一のＲＮＡ分子のみを含む。したがって、好適なｇＲＮＡは、本明細書ではｓｇＲＮＡと称されることもある、単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）、又はモジュール式（１つより多く、典型的には、２つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。

いくつかの例示的な好適なＣａｓ１２ａｇＲＮＡ足場配列が本明細書で提供され、追加の好適なｇＲＮＡ足場配列が、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼが使用されるいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’から３’まで、
近位ドメイン、
第１の相補性ドメイン、
結合ドメイン、及び
第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインと相補的である）を含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、並びに
標的部位配列に対応する標的化ドメインを含む。

これらのドメインの各々が、ここでより詳細に記載される。

本明細書で提供されるｇＲＮＡは、典型的には、細胞のゲノム中の標的部位と結合する標的化ドメインを含む。標的部位は、典型的には、ＰＡＭ配列と、ＰＡＭ配列と同一の鎖上に、かつそれに直接隣接して、標的配列とを含む、二本鎖ＤＮＡ配列である。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、時として１つ以上のミスマッチを伴う標的化ドメインの配列に類似するが、典型的には、ＤＮＡ配列の代わりにＲＮＡを含むという点で標的配列に対応する、ＲＮＡ配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、（完全又は部分的相補性で）標的配列の配列に相補的である二本鎖標的部位の配列と、したがって、ＰＡＭ配列を含む鎖に相補的である鎖と塩基対合する。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、ＰＡＭ配列を含まないことが理解されるであろう。ＰＡＭの場所は、採用されるヌクレアーゼに応じて、標的部位配列の５’又は３’であり得ることが更に理解されるであろう。例えば、ＰＡＭは、典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについては標的配列の３’、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼについては標的配列の５’である。ＰＡＭの場所及び標的部位に結合するｇＲＮＡの機構の例証については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｎｅｇａｓｅｔａｌ．，ＦｕｎｇａｌＢｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１９）６：６の図１を参照されたい。ＲＮＡガイドヌクレアーゼを標的部位に標的化するｇＲＮＡの機構の追加の例証及び説明については、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、ＦｕＹｅｔａｌ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１４）（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）、及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇＳＨｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）を参照されたい。

標的化ドメインは、標的配列の配列に対応するヌクレオチド配列、すなわち、ＰＡＭ配列に直接隣接するＤＮＡ配列（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の５’、又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の３’）を含み得る。標的化ドメイン配列は、典型的には、１７～３０個のヌクレオチドを含み、標的配列に完全に対応する（すなわち、いかなるミスマッチヌクレオチドも伴わない）か、又は１つ以上であるが典型的には４つ以下のミスマッチを含み得る。標的化ドメインが、ＲＮＡ分子の一部であるため、ｇＲＮＡが、典型的には、リボヌクレオチドを含む一方で、ＤＮＡ標的化ドメインは、デオキシリボヌクレオチドを含むであろう。

２２個のヌクレオチド標的ドメイン及びＮＧＧＰＡＭ配列を含むＣａｓ９標的部位、並びに標的ドメインに完全に対応する（したがって、標的ドメイン及びＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する）標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。

典型的なＣａｓ１２ａｇＲＮＡの構造は、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３（３）：７５９－７７１の図１に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２２個のヌクレオチド標的ドメイン及びＴＴＮＰＡＭ配列を含むＣａｓ１２ａ標的部位、並びに標的ドメインに完全に対応する（したがって、標的ドメイン及びＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する）標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａＰＡＭ配列は、５’－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｖ－３’である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａＰＡＭ配列は、５’－Ｔ－Ｔ－Ｖ－３’である。

理論によって拘束されることを所望しないが、少なくともいくつかの実施形態では、標的化ドメインの長さ及び標的配列との相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、長さが５～５０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５～２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８～２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９～２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１６個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２４個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ミスマッチを伴わずに、本明細書で提供される標的ドメイン配列又はその一部に完全に対応する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、本明細書で提供される標的ドメイン配列に対して１つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメイン配列に対して２つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、標的ドメインは、標的ドメイン配列に対して３つのミスマッチを含む。

いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、例えば、参照によりその全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号に記載されるように、コアドメイン及び二次標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端から約８～約１３個のヌクレオチド（例えば、標的化ドメインの最も３’位の８～１３個のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に位置付けられる。いくつかの実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列又はその一部に完全に対応する。他の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列の対応するヌクレオチドとミスマッチである、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ｇＲＮＡが提供されるいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、第１の相補性ドメインと、第２の相補性ドメインを含み、第１の相補性ドメインは、第２の相補性ドメインと相補的であり、少なくともいくつかの実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために、第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインは、長さが５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、５’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、中央サブドメインは、長さが１、２、又は３、例えば、１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。第１の相補性ドメインは、天然の第１の相補性ドメインと相同性を共有することができ、又はそれから由来することができる。一実施形態では、それは、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、又はストレプトコッカス・サーモフィルスの第１の相補性ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。

上述のドメインの配列及び配置は、その中の８８～１１２頁を含む、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号により詳細に記載されている。

結合ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補性ドメインを第２の相補性ドメインと結合する役割を果たし得る。結合ドメインは、第１及び第２の相補性ドメインを共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。いくつかの実施形態では、結合は、共有結合である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間に介在する共有結合であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、１つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１２６１７６号に開示される、少なくとも１つの非ヌクレオチド結合を含む。

いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、少なくとも部分的に、第１の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループを作る配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、長さが５～２７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性領域よりも長い。一実施形態では、相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、５’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、中央サブドメインは、長さが１、２、３、４、又は５個、例えば、３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメイン及び３’サブドメインは、それぞれ、第２の相補性ドメインの３’サブドメイン及び５’サブドメインと相補的、例えば、完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、近位ドメインは、長さが５～２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。一実施形態では、それは、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、又はストレプトコッカス・サーモフィルス由来の近位ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。

広範囲のテイルドメインが、ｇＲＮＡで使用するために好適である。いくつかの実施形態では、テイルドメインは、長さが０（不在）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テイルドメインヌクレオチドは、天然に存在するテイルドメインの５’末端からの配列に由来するか、又はそれと相同性を共有する。いくつかの実施形態では、テイルドメインは、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する配列を含む。いくつかの実施形態では、テイルドメインは、存在しないか、又は長さが１～５０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テイルドメインは、天然に存在する近位テイルドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、テイルドメインは、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、又はストレプトコッカス・サーモフィルス由来のテイルドメインと少なくとも５０％の相同性／同一性を有する。いくつかの実施形態では、テイルドメインは、３’末端に、インビトロ又はインビボ転写の方法に関連するヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、
例えば、５’から３’の方向に、
標的化ドメイン（標的遺伝子座内の標的ドメインに対応する）、及び
第１の相補性ドメイン、を含む、第１の鎖と、
例えば、５’から３’の方向に、
任意選択的に、５’拡張ドメイン、
第２の相補性ドメイン、
近位ドメイン、及び
任意選択的に、テイルドメイン、を含む、第２の鎖と、を含む。

表１では、「ＳｐＣａｓ９」は、化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを指す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡのうちのいずれかは、化学的に修飾されている１つ以上のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの化学修飾は、以前に記載されており、好適な化学修飾には、ｇＲＮＡ機能のために有益であり、所与のｇＲＮＡの任意の望ましくない特性、例えば、標的外効果を計測可能に増加させない、任意の修飾が含まれる。好適な化学修飾としては、例えば、ｇＲＮＡがエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ触媒活性の影響をあまり受けなくするものが挙げられ、限定されるものではないが、ホスホロチオエート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾（例えば、３’及び５’末端の一方又は両方における）、２’Ｆ修飾、二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによるリボース糖の置き換え、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）修飾、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。追加の好適なｇＲＮＡ修飾が、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、そのような好適なｇＲＮＡ修飾としては、限定されるものではないが、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｒａｈｄａｒｅｔａｌ．ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（５１）Ｅ７１１０－Ｅ７１１７、及びＨｅｎｄｅｌｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）；３３（９）：９８５－９８９に記載されているものが挙げられる。

例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端の両方に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及び３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸塩結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾及び３’－リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、１つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非架橋酸素原子は、硫黄原子に置き換えられている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、１つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、又は６個の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、３つの末端位置及び５’末端のうちの１つ以上に、並びに／又は３つの末端位置及び３’末端のうちの１つ以上に、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、参照によりそれらの全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／２１４４６０号、同第ＷＯ２０１６／０８９４３３号、及び同第ＷＯ２０１６／１６４３５６号に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。

本明細書で提供されるｇＲＮＡは、好適な任意の様式において細胞に送達され得る。例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと結合したｇＲＮＡを含むＲＮＰを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達のための様々な好適な方法が記載されており、例示的な、好適な方法は、限定されないが、細胞中へのＲＮＰのエレクトロポレーション、細胞中へのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのエレクトロポレーション、様々なタンパク質又は核酸トランスフェクション方法、及びウイルスベクター、例えば、例えば、レトロウイルス（例、レンチウイルス）ベクターなどを介したコードＲＮＡ又はＤＮＡの送達を含む。任意の好適な送達方法が、本開示によって包含され、本開示は、この点に関して限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位配列に誘導し、標的部位配列でＤＮＡの一方又は両方の鎖の切断を誘導することができる。

遺伝子操作細胞及び関連する組成物
本開示の態様は、連続的な様式で細胞のゲノムにおいて遺伝子修飾（例えば、変異）をもたらすための方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、連続的に、第１の標的部位での編集と、それに続く第２の標的部位での編集などから生じる１つを超える遺伝子修飾（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）を有する遺伝子操作細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞又は細胞集団を、（ｉ）第１の標的配列と結合する標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、第１の標的配列と結合するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合は、第１の標的配列での又はその近位でのＤＮＡの二本鎖切断を生じさせる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞又は細胞集団を、（ｉ）第２の標的配列と結合する標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、第２の標的配列と結合するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することを含み、細胞又は細胞集団を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させること、並びに細胞又は細胞集団を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることが、時間間隔を隔てて連続的に実施される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合は、第２の標的配列での又はその近位でのＤＮＡの二本鎖切断を生じさせる。いくつかの実施形態では、第１の標的化ドメイン及び第２の標的化ドメインは、異なり、例えば、同じヌクレオチド配列を有さず、同じ標的配列と結合しない。

本明細書に記載されるように、及び当業者に明らかであるように、例えば、細胞を、細胞のゲノム中の標的化配列を標的とするｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることによる、細胞のＤＮＡ中の二本鎖切断（ＤＳＢ）の生成は、任意の適用可能なＤＮＡ修復機構を使用して細胞によって修復され得る。概して、ＤＳＢは、例えば、（「ＮＨＥＪ」、古典的非相同末端結合（「ｃ－ＮＨＥＪ」とも呼ばれる）、マイクロホモロジー媒介末端結合（「ＭＭＥＪ」、代替末端結合（「ａｌｔ－ＥＪ」）とも呼ばれる）、又は相同性指向性組換え（「ＨＤＲ」）経路によって修復され得る。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、第１の標的配列に修飾を導入することを伴い、修飾は、細胞ＤＮＡ修復機構によって認識／分解される二本鎖切断を行い、次いで、第２の標的配列に修飾を導入することを含み、修飾は、細胞ＤＮＡ修復機構によって認識／分解される二本鎖切断を行うことを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、異なる細胞ＤＮＡ修復機構に関連する動態は、ゲノムＤＮＡの切断が修復される速度、すなわち切断がどれくらいの時間持続するか（例えば、細胞をｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させた後）を決定すると考えられる。例えば、Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．（２０１７）１８（８）：４９５－５０６、及びＫｏｃｈａｎｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１７）Ｄｅｃ１５；４５（２２）：１２６２５－１２６３７を参照されたい。理論に束縛されることを望むものではないが、ＮＨＥＪは、他の修復経路よりもより迅速に二本鎖切断を修復すると考えられている。更に、二本鎖切断を認識及び修復するために使用されるＤＮＡ修復経路は、結果として生じる修飾（例えば、挿入、欠失、転座）及び当該修飾のサイズ（例えば、挿入、欠失されたヌクレオチドの数）に影響を与える。本明細書に開示される方法の細胞がそのゲノムＤＮＡに複数の切断を含む時間を最小限に抑え、したがって転座事象のリスクを低減／最小限に抑えるために、修飾される第１の標的配列は、第２の標的配列における修飾の前に、ＤＮＡ修復機構によってＤＳＢが優先的に認識／修復されるように選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団と接触する第１のｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼで生成されたＤＳＢが、細胞又は細胞集団を第２のｇＲＮＡと接触させる前に、ＤＮＡ修復機構によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾の順序は、ＤＳＢのＤＮＡ修復の予測速度に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、より速い速度で分解／修復されると予測されるＤＳＢは、より遅い速度で分解／修復されると予測されるＤＳＢの前の第１の遺伝子修飾として選択される。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることは、高速分解二本鎖切断をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることは、高速分解二本鎖切断をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることは、緩徐分解二本鎖切断をもたらす。理論に束縛されることを望むものではないが、二本鎖切断の性質（例えば、３’及び／又は５’オーバーハングの有無、オーバーハングの長さ、平滑末端の存在）は、細胞ＤＮＡ修復プロセスによって二本鎖切断が認識及び／又は分解される（例えば、挿入又は欠失を生成する）速度に影響を与えると考えられる。

本明細書で使用される場合、高速分解二本鎖切断は、細胞又は細胞の集団を切断生成因子（例えば、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ）と接触させた後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、又は４８時間未満で検出可能である二本鎖切断である。いくつかの実施形態では、高速分解二本鎖切断は、細胞又は細胞集団を切断生成因子（例えば、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ）と接触させた後、１４、１２、１０、８、６、４、２、若しくは１時間未満で細胞又は細胞集団において検出可能である。いくつかの実施形態では、高速分解二本鎖切断は、細胞又は細胞集団を切断生成因子（例えば、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ）と接触させた後、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、若しくは１分未満で細胞又は細胞集団において検出可能である。

本明細書で使用される場合、緩徐分解二本鎖切断は、細胞又は細胞集団を切断生成因子（例えば、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ）と接触させた後、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、又は７２時間で検出可能である二本鎖切断である。いくつかの実施形態では、緩徐分解二本鎖切断は、細胞又は細胞集団を切断生成因子（例えば、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ）と接触させた後、少なくとも２４、２８、３２、３６、若しくは４０時間で細胞又は細胞集団において検出可能である。理論に束縛されることを望むものではないが、第１の標的配列及び／又は第１のｇＲＮＡを選択して、第１の標的配列に対する修飾が高速分解二本鎖切断を含むように行うことによって、第２の標的配列に対する修飾に関連して、細胞がゲノム中に２つの二本鎖切断を含む重複時間が最小限に抑えられるか、又は排除され、それによって転座産物のレベルが低減するか、又は転座産物のリスクが排除される。

いくつかの実施形態では、修飾される第１の標的配列は、ＤＳＢがＮＨＥＪ修復機構によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団と接触する第１のｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼを用いて生成されたＤＳＢがＮＨＥＪ修復機構によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。

いくつかの実施形態では、修飾される第２の標的配列は、ＤＳＢがＮＨＥＪ又は非ＮＨＥＪ修復機構（例えば、相同組換え又はＭＭＥＪ）によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。いくつかの実施形態では、改変される第２の標的配列は、ＤＳＢがＭＭＥＪ修復機構によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団と接触する第２のｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼを用いて生成されたＤＳＢがＮＨＥＪ又は非ＮＨＥＪ修復機構（例えば、相同組換え又はＭＭＥＪ）によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団と接触する第２のｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼを用いて生成されたＤＳＢがＭＭＥＪ修復機構によって優先的に認識／修復されるように選択され得る。

いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させること、並びに細胞又は細胞集団を第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることは、時間間隔を隔てる。時間間隔は、例えば、第１の標的ドメインへの修飾に関連するＤＮＡの切断が、第２の標的ドメインへの修飾に関連するＤＮＡの異なる切断の形成前に、実質的に（例えば、完全に）修復される（例えば、挿入又は欠失を生成する）ことを保証する因子に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、時間間隔は、細胞又は細胞集団を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる前に、ＤＳＢの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％が修復されるのに十分である。

いくつかの実施形態では、第１の二本鎖切断生成ステップ（例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる間）と、第２の二本鎖切断生成ステップ（例えば、細胞を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる）との間の時間間隔は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００時間（及び任意選択で、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０時間以下）である。いくつかの実施形態では、第１の二本鎖切断生成ステップ（例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる間）と、第２の二本鎖切断生成ステップ（例えば、細胞を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる）との間の時間間隔は、１０～１００、１２～１００、１５～１００、１８～１００、２０～１００、２４～１００、２８～１００、３０～１００、３６～１００、４２～１００、４８～１００、５４～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、１０～８０、１２～８０、１５～８０、１８～８０、２０～８０、２４～８０、２８～８０、３０～８０、３６～８０、４２～８０、４８～８０、５４～８０、６０～８０、７０～８０、１０～６０、１２～６０、１５～６０、１８～６０、２０～６０、２４～６０、２８～６０、３０～６０、３６～６０、４２～６０、４８～６０、５４～６０、１０～５４、１２～５４、１５～５４、１８～５４、２０～５４、２４～５４、２８～５４、３０～５４、３６～５４、４２～５４、４８～５４、１０～４８、１２～４８、１５～４８、１８～４８、２０～４８、２４～４８、２８～４８、３０～４８、３６～４８、４２～４８、１０～４２、１２～４２、１５～４２、１８～４２、２０～４２、２４～４２、２８～４２、３０～４２、３６～４２、１０～３６、１２～３６、１５～３６、１８～３６、２０～３６、２４～３６、２８～３６、３０～３６、１０～３０、１２～３０、１５～３０、１８～３０、２０～３０、２４～３０、２８～３０、１０～２８、１２～２８、１５～２８、１８～２８、２０～２８、２４～２８、１０～２４、１２～２４、１５～２４、１８～２４、２０～２４、１０～２０、１２～２０、１５～２０、１８～２０、１０～１８、１２～１８、１５～１８、１０～１５、１２～１５、又は１０～１２時間である。いくつかの実施形態では、第１の二本鎖切断生成ステップ（例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる間）と、第２の二本鎖切断生成ステップ（例えば、細胞を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる）との間の時間間隔は、約３０時間である。

本明細書に記載されるように、本開示は、部分的に、連続的な遺伝子修飾が行われる順序及び／又はタイミングが、細胞又は細胞集団中で産生される望ましくない転座産物のレベルに寄与し得るという発見に基づく。理論に束縛されることを望むものではないが、複数のゲノムＤＮＡ修飾を含む遺伝子操作細胞を産生することが望ましいが、実質的に同時に細胞のゲノムＤＮＡに複数の切断（例えば、二本鎖切断）が存在することは、細胞のＤＮＡ修復機構が転座産物を産生する様式で切断を修復する可能性を低減するために減少又は回避されるべきであると考えられる。

「転座産物」という用語は、互いに近接して自然には発生しないゲノムＤＮＡの少なくとも２つの部分を含む核酸を指すために本明細書で使用される。例えば、第１の染色体の一部及び第２の染色体の一部が結合され、その結果、第１の染色体及び第２の染色体の融合が生じ得る（例えば、染色体再配列）。あるいは、染色体の第１の部分及び同じ染色体の第２の部分は、逆位などの自然に存在しない配向で結合され得る。例えば、ＭｏｄｅｒｎＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ．“ＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＲｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ”ＧｒｉｆｆｉｔｈｓＡＪＦ，ＧｅｌｂａｒｔＷＭ，ＭｉｌｌｅｒＪＨ，ｅｔａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；１９９９を参照されたい。いくつかの実施形態では、転座産物は、ゲノムＤＮＡの複数の切断を修復する細胞ＤＮＡ修復機構によって形成される。図３は、アセントリック、ダイセントリック、及びバランス型産物を含む、いくつかの例示的な転座産物を示す。いくつかの実施形態では、転座産物は、１つの天然に存在する染色体若しくは２つの天然に存在する染色体の大部分又は全てを含む。いくつかの実施形態では、転座産物は、天然に存在する染色体の５０、４０、３０、２０、又は１０％未満を含む。いくつかの実施形態では、転座産物は、単一のセントロメアを含む。いくつかの実施形態では、転座産物は１つを超えるセントロメア、例えば、２つのセントロメアを含む（すなわち、転座産物はダイセントリックである）。いくつかの実施形態では、転座産物は、セントロメアを含まない（すなわち、転座産物はアセントリックである）。いくつかの実施形態では、転座産物は、バランス型であり、遺伝子情報が除去又は複製されないことを意味する。バランス型転座産物の例には、相互転座及び逆位体が含まれる。相互転座では、２つの染色体の２つのアセントリック断片が交替する（図３、「バランス型」の概略図を参照されたい）。逆位転座では、染色体の２つを超える断片が生成され、断片は逆位配向に配置される。いくつかの実施形態では、転座産物は、欠失（遺伝子情報の喪失）及び重複（遺伝子情報の重複）などの不均衡である。

「転座産物細胞」という用語は、１つ以上の転座産物を含む細胞を指すために本明細書で使用される。転座産物の存在、及び転座産物の種類（例えば、アセントリック、ダイセントリック、及びバランス型）は、当技術分野で公知の方法、例えばＤＮＡ配列決定、産物のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって評価され得る。

本開示の方法は、転座産物及び当該転座産物を含む転座産物細胞の形成を減少又は排除するための１つ以上の手段を採用し得る。例えば、本明細書に記載の方法は、第１のステップで第１の標的ドメインに修飾を導入すること、及び第２のステップで第２の標的ドメインに修飾を導入することを伴い、２つのステップは時間間隔（例えば、二本鎖切断の重複発生を低減又は排除するように選択される）を隔てる。更なる例として、本明細書に記載される方法は、第１の標的ドメインに修飾を導入することを伴い得、修飾は、ＮＨＥＪによって認識／分解される二本鎖切断を行い、次いで、第２の標的ドメインに修飾を導入することを含み、修飾は、任意の細胞ＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪ又は非ＮＨＥＪ経路、例えば、相同組換え又はＭＭＥＪ）によって認識／分解される二本鎖切断を行うことを含む。更なる例として、本開示の方法は、第１の標的ドメインに修飾を導入し得、修飾は、高速分解二本鎖切断を行い、次いで、第２の標的ドメインに修飾を導入することを含み、修飾は、高速又は緩徐分解二本鎖切断（例えば、緩徐分解二本鎖切断）を行うことを含む。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、第１の系統特異的細胞表面抗原をコードする配列を含む第１の標的ドメインに修飾を導入することと、次いで、系統特異的細胞表面抗原をコードする配列を含む第２の標的ドメインに修飾を導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、第２の系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＬＬ－１、又はＣＤ５である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、転座産物細胞の亜集団を産生する。いくつかの実施形態では、各転座産物細胞は、少なくとも１つの転座産物を含む。いくつかの実施形態では、転座産物は、第１の標的ドメイン又はその一部、及び第２の標的ドメイン又はその一部を含む、核酸（例えば、ゲノムの一部）を含む。転座産物は、第１の標的ドメイン又はその一部を第２の標的ドメイン又はその一部に接続する様式で、第１の標的ドメインでの又はその近位での二本鎖切断、及び第２の標的ドメインでの又はその近位での二本鎖切断の細胞ＤＮＡ修復によって形成され得る。例えば、図３を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、第１の標的配列に修飾を導入する（例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡと接触させる）前に、第２の標的配列に修飾を導入する（例えば、細胞を、第２のｇＲＮＡと接触させる）方法を使用して産生される転座産物細胞の数（又はパーセンテージ）と比較して、少なくとも１、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、第１の標的配列に修飾を導入する（例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡと接触させる）前に、第２の標的配列に修飾を導入する（例えば、細胞を、第２のｇＲＮＡと接触させる）方法を使用して産生される転座産物細胞の数（又はパーセンテージ）と比較して、１～１０％、１～２０％、１～３０％、１～４０％、１～５０％、１～６０％、１～７０％、１～８０％、１～９０％、１～１００％、１０～２０％、１０～３０％、１０～４０％、１０～５０％、１０～６０％、１０～７０％、１０～８０％、１０～９０％、１０～１００％、２０～３０％、２０～４０％、２０～５０％、２０～６０％、２０～７０％、２０～８０％、２０～９０％、２０～１００％、３０～４０％、３０～５０％、３０～６０％、３０～７０％、３０～８０％、３０～９０％、３０～１００％、４０～５０％、４０～６０％、４０～７０％、４０～８０％、４０～９０％、４０～１００％、５０～６０％、５０～７０％、５０～８０％、５０～９０％、５０～１００％、６０～７０％、６０～８０％、６０～９０％、７０～１００％、７０～８０％、７０～９０％、７０～１００％、８０～９０％、８０～１００％、又は９０～１００％少ない転座産物細胞を産生する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、実質的に同じ時間（例えば、同時に）に第１の標的配列及び第２の標的配列に修飾を導入することを伴う方法、例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡと実質的に同じ時間に接触させることを使用して産生された転座産物細胞の数（又はパーセンテージ）と比較して、少なくとも１、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％少ない転座産物細胞を産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、実質的に同じ時間（例えば、同時に）に第１の標的配列及び第２の標的配列に修飾を導入する方法、例えば、細胞を、第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡと実質的に同じ時間に接触させることを使用して産生された転座産物細胞の数（又はパーセンテージ）と比較して、１～１０％、１～２０％、１～３０％、１～４０％、１～５０％、１～６０％、１～７０％、１～８０％、１～９０％、１～１００％、１０～２０％、１０～３０％、１０～４０％、１０～５０％、１０～６０％、１０～７０％、１０～８０％、１０～９０％、１０～１００％、２０～３０％、２０～４０％、２０～５０％、２０～６０％、２０～７０％、２０～８０％、２０～９０％、２０～１００％、３０～４０％、３０～５０％、３０～６０％、３０～７０％、３０～８０％、３０～９０％、３０～１００％、４０～５０％、４０～６０％、４０～７０％、４０～８０％、４０～９０％、４０～１００％、５０～６０％、５０～７０％、５０～８０％、５０～９０％、５０～１００％、６０～７０％、６０～８０％、６０～９０％、７０～１００％、７０～８０％、７０～９０％、７０～１００％、８０～９０％、８０～１００％、又は９０～１００％少ない転座産物細胞を産生する。

遺伝子操作細胞、及び当該細胞を含むか、又はそれと関連する組成物
一部の態様では、本開示は、転座事象（転座産物）又は転座事象のリスクを低減させる様式で、細胞のゲノムに複数の（例えば、少なくとも２、３、４、５、又はそれ以上）遺伝子修飾（例えば、変異）を効果的に生成する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、遺伝子操作細胞又は複数の遺伝子操作細胞を含む、細胞及び細胞集団を対象とし、遺伝子操作細胞は、第１のゲノム修飾及び第２のゲノム修飾を含み、第１の標的ドメインは、第２の標的ドメインとは異なり、第１のゲノム修飾は、第２のゲノム修飾の前に行われる。いくつかの実施形態では、第１のゲノム修飾は、遺伝子操作細胞のゲノム中の第１の標的ドメイン内若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなる。いくつかの実施形態では、第１のゲノム修飾は、ＮＨＥＪによって生成される挿入又は欠失（例えば、二本鎖切断のＮＨＥＪ修復）である。いくつかの実施形態では、第２のゲノム修飾は、遺伝子操作細胞のゲノム中の第３の標的ドメイン内若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなる。いくつかの実施形態では、第２のゲノム修飾は、ＮＨＥＪ若しくは非ＮＨＥＪ修復プロセス（例えば、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）又は相同組換え）（例えば、二本鎖切断のＮＨＥＪ若しくは非ＮＨＥＪ修復）によって生成される挿入又は欠失である。

いくつかの実施形態では、第１のゲノム修飾は、遺伝子操作細胞のゲノム中の第１の標的ドメイン内若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなり、挿入又は欠失は、高速分解二本鎖切断（例えば、高速分解二本鎖切断の修復）によって産生される。いくつかの実施形態では、第２のゲノム修飾は、遺伝子操作細胞のゲノム中の第２の標的ドメイン内若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなり、挿入又は欠失は、高速分解二本鎖切断又は緩徐分解二本鎖切断（例えば、高速分解二本鎖切断又は緩徐分解二本鎖切断の修復）によって産生される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生された細胞は、第２のゲノム修飾後に第１のゲノム修飾を行うことにおいて、他の方法の同様の細胞よりも少ない転座産物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生された細胞集団は、第２のゲノム修飾後に第１のゲノム修飾を行うことにおいて、他の方法の同様の細胞集団よりも少ない転座産物細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生された細胞は、第１のゲノム修飾及び第２のゲノム修飾を実質的に同じ時間（例えば、同時に）に行うことにおいて、他の方法の同様の細胞よりも少ない転座産物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生された細胞は、細胞を第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡと接触させるのと実質的に同じ時間（例えば、同時に）に、細胞を第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡと接触させることにおいて、他の方法の同様の細胞よりも少ない転座産物を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生された細胞集団は、第１のゲノム修飾及び第２のゲノム修飾を実質的に同じ時間（例えば、同時に）に行うことにおいて、他の方法の同様の細胞集団よりも少ない転座産物細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生された細胞集団は、細胞集団を第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡと接触させるのと実質的に同じ時間（例えば、同時に）に、細胞集団を第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡと接触させることにおいて、他の方法の同様の細胞集団よりも少ない転座産物を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団の細胞の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、又は０．１％未満（例えば、０％）が、転座産物細胞である。

したがって、本明細書に記載される方法を使用して（例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを使用して）産生される、遺伝子操作細胞、その集団、及びそれらに由来する細胞が本明細書に提供される。また、当該細胞、例えば、１つ以上の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物も提供される。

本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して遺伝子操作することができる任意の細胞又は細胞型に適用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞又はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象などの対象から取得され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、造血器悪性腫瘍などの疾患又は障害を有するヒト対象などのヒト対象から取得され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、健康なドナーから取得される。造血幹細胞などの哺乳動物細胞を取得する方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７３３９に記載されており、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、ウシ、ブタ、ウマ、又は家畜である。

いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞がその後に投与される対象から取得される。細胞が取得された同じ対象に投与される細胞は、自己細胞と称される一方で、細胞が投与される対象ではない対象から取得される細胞は、同種異系細胞と称される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、臍帯血幹細胞、又は羊水幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、又は皮膚幹細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、幹細胞に由来し、複数の細胞型に分化することができる、前駆細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）又は造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、造血幹細胞又は造血前駆細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、典型的には、骨髄系前駆細胞及びリンパ系前駆細胞の両方を生じさせることができ、それら前駆細胞はそれぞれ、更に骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）及びリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を生じさせる。ＨＳＣは、ＨＳＣの特定及び／又は単離に使用され得る細胞表面マーカーＣＤ３４の発現（例えばＣＤ３４＋）、及び細胞系統への関与に関連する細胞表面マーカーの不在によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、アルファ／ベータＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ガンマ／デルタＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

当業者は、しかし、そのような例の提供は、一部の特定の実施形態を例証する目的のためであり、追加の適切な細胞及び細胞型が、本開示に基づいて当業者に明らかであろうが、それは、この点において限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作細胞は、１つを超えるゲノム修飾、例えば、タンパク質、例えば、標的部位配列によってコードされるか、若しくは調節されるタンパク質、又はタンパク質のバリアント形態の発現の低減又は喪失をもたらす１つを超えるゲノム修飾を含む。本明細書で提供される遺伝子編集方法は、標的遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子においてゲノム修飾をもたらし得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座の両方の対立遺伝子におけるゲノム修飾を含む、遺伝子操作細胞が好ましい。

いくつかの実施形態では、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子に影響を及ぼす遺伝子修飾は、本明細書では、「二対立遺伝子」修飾と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子編集アプローチは、標的遺伝子座の二対立遺伝子欠失をもたらす。二対立遺伝子欠失をもたらす編集手順を受け得る標的遺伝子座の例としては、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１が挙げられ、いくつかの実施形態では、二対立遺伝子欠失は、所与の集団における細胞の割合がＣＤ３３及び／又はＣＬＬ－１の二対立遺伝子欠失を含むことを反映する遺伝子分析により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、二対立遺伝子欠失を検出又は特徴付けするために使用される遺伝子分析は、ＮＧＳデータのＴＩＤＥ分析を使用したインデル分析を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、標的遺伝子座としてＣＤ３３及び／又はＣＬＬ－１対して向けられたＲＮＰでエレクトロポレーションされた集団中の細胞の８０％を超える細胞において、ＣＤ３３及び／又はＣＬＬ－１の二対立遺伝子欠失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３及び／又はＣＬＬ－１の二対立遺伝子欠失を含む集団中の細胞の８０％超が、集団中の細胞の約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％に所望の編集結果が存在することを意味する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作細胞は、２つ以上のゲノム修飾を含む。例えば、遺伝子操作細胞の集団は、複数の異なる変異、例えば、細胞中の同じ又は異なる遺伝子座における２つ以上の変異を含み得る。

当業者にとって明らかであるように、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、例えば、タンパク質コード配列、非タンパク質コード配列、染色体配列、及び染色体外配列を含む、細胞中の任意の遺伝子座位が修飾され得る。したがって、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＰＡＭ配列に隣接する標的部位配列などの任意の遺伝子座位（すなわち、標的部位配列）を標的とするように設計され得る。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化ドメイン（例えば、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ）は、０型、１型、又は２型細胞表面タンパク質などの細胞表面タンパク質を標的とする。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０６６７６０号を参照されたい。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１、本明細書ではＣＬＬ１とも呼ばれる）、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、及び／又はＣＤ２６を標的とする。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ）の標的化ドメインは、腫瘍性若しくは悪性の疾患又は障害、例えば、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（一般的な（プレＢ）急性リンパ性白血病及び悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ２６（上皮及びリンパ系悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱ（リンパ系悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科がん、胆管腺がん、及び膵臓の管腺がん）、並びに前立腺特異的膜抗原などの特定の種類のがんに関連する細胞表面タンパク質を標的とする。

細胞表面タンパク質の追加の非限定的な例としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、又はＣＤ３６３が含まれる。

細胞表面タンパク質（例えば、系統特異的抗原）をコードする遺伝子の遺伝子編集及び／又は阻害のための組成物及び方法（例えば、例示的なｇＲＮＡ）は、当業者に公知であり、ＰＣＴ公開刊行物ＷＯ２０１７／０６６７６０、ＷＯ２０２０／０４７１６４Ａ１、ＷＯ２０２０／１５０４７８Ａ１、ＷＯ２０２０／２３７２１７Ａ１、ＷＯ２０２１／０４１９７１Ａ１、及びＷＯ２０２１／０４１９７７Ａ１に教示されるものが含まれるが、これらに限定されず、その全体が参照により組み込まれる。遺伝子編集及び／又は遺伝子の阻害のための追加の組成物並びに方法（例えば、例示的なｇＲＮＡ）は、当業者に公知であり、ＰＣＴ公開刊行物ＷＯ２０１７／１８６７１８Ａ１及びＷＯ２０１８／０８３０７１Ａ１、並びにＭａｎｄａｌｅｔａｌ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．（２０１４）１５（５）：６４３－５２に教示されるものが含まれるが、これらに限定されず、その全体が参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ３３中の標的配列と結合する標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の標的配列は、ＣＤ３３をコードする遺伝子内にあるか、又はそれと関連する。いくつかの実施形態では、第２のｇＲＮＡは、第２の系統特異的細胞表面抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、及び／又はＣＤ２６から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ３３中の標的配列と結合し、第２のｇＲＮＡは、ＣＤ１９中の標的配列と結合する。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ３３中の標的配列と結合し、第２のｇＲＮＡは、ＣＤ５中の標的配列と結合する。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ３３中の標的配列と結合し、第２のｇＲＮＡは、ＣＬＬ－１中の標的配列と結合する。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＬＬ－１中の標的配列と結合し、第２のｇＲＮＡは、ＣＤ３３中の標的配列と結合する。

いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ５中の標的配列と結合する標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の標的配列は、ＣＤ５をコードする遺伝子内にあるか、又はそれと関連する。いくつかの実施形態では、第２のｇＲＮＡは、第２の系統特異的細胞表面抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、及び／又はＣＤ２６から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ５中の標的配列と結合し、第２のｇＲＮＡは、ＣＤ３３中の標的配列と結合する。

本開示の方法は、細胞をｎ個の異なるｇＲＮＡと接触させることを含み得、ｎは、２以上の整数であり、ｎ個の異なるｇＲＮＡの各々は、標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０（及び任意選択で、３０、２５、２０、１５、又は１０以下）である。いくつかの実施形態では、ｎ個の異なるｇＲＮＡの各々は、異なる標的配列に相補的な標的化ドメインを含み、各々は、時間間隔（例えば、前のＤＮＡ切断が分解／修復されるか、又は実質的に分解／修復され、それにより、転座事象のリスクを最小限に抑えるのに十分な時間間隔）によって隔てられる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法によってもたらされる変異、例えば、標的遺伝子における変異は、標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の機能の喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、機能の喪失は、遺伝子産物の発現のレベルの低減、例えば、より低いレベルの発現への低減、又は遺伝子産物の発現の完全な無効化である。いくつかの実施形態では、変異は、非機能性バリアント、又は野生型対応物と比較して異なる機能を有するバリアントなどの遺伝子産物のバリアントの発現をもたらす。例えば、コード配列、短縮遺伝子産物において未成熟終止コドンを生成する変異の場合、又はナンセンス若しくはミスセンス変異を生成する変異の場合、遺伝子産物は、遺伝子産物を非機能的にする改変されたアミノ酸配列によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の機能は、結合パートナーを結合又は認識するものである。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質、第２のタンパク質、又は両方の発現の低減は、野生型又は操作されていない対応細胞におけるレベルの５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、又は１％以下である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞（例えば、遺伝子操作造血細胞）上での、第１の標的配列を含む第１の遺伝子によってコードされるタンパク質、第２の標的配列を含む第２の遺伝子によってコードされるタンパク質、又はその両方の発現は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上での対応するタンパク質、又はその両方の発現と比較される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞（例えば、遺伝子操作造血細胞）における第１のタンパク質、第２のタンパク質、又は両方の発現は、天然に存在する細胞（例えば、野生型の対応する造血細胞）における第１のタンパク質、第２のタンパク質、又は両方の発現と比較される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然に存在する細胞（例えば、野生型の対応する造血細胞）における第１のタンパク質、第２のタンパク質、又はその両方の発現と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％だけのタンパク質、第２のタンパク質、又は両方の発現レベルにおける減少をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞（例えば、遺伝子操作造血細胞）は、天然に存在する細胞（例えば、野生型の対応する造血細胞）と比較して、第１のタンパク質、第２のタンパク質、又はその両方の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を発現する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞（例えば、遺伝子操作造血細胞）上での、第１の系統特異的細胞表面抗原、第２の系統特異的細胞表面抗原、又は両方の発現は、天然に存在する細胞（例えば、野生型の対応する造血細胞）上での、第１の系統特異的細胞表面抗原、第２の系統特異的細胞表面抗原、又は両方の発現と比較される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然に存在する細胞（例えば、野生型の対応する造血細胞）での、第１の系統特異的細胞表面抗原、第２の系統特異的細胞表面抗原、又は両方の発現と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％だけの第１の系統特異的細胞表面抗原、第２の系統特異的細胞表面抗原、又はその両方の発現レベルにおける減少をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞（例えば、遺伝子操作造血細胞）は、天然に存在する細胞（例えば、野生型の対応する造血細胞）と比較して、第１の系統特異的細胞表面抗原、第２の系統特異的細胞表面抗原、又はその両方の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を発現する。

投与を必要とする対象への投与の方法
本開示のいくつかの態様は、投与することを必要とする対象に、本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される方法を介して遺伝子操作された細胞、細胞の集団若しくはその子孫、又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。細胞、細胞の集団、又はその子孫は、野生型細胞と比較して１つ以上の修飾（例えば、遺伝子修飾）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫は、同じ型の野生型細胞と比較して、第１の遺伝子に対する修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫は、同じ型の野生型細胞と比較して、第２の遺伝子に対する修飾を含む。修飾された遺伝子は、本明細書に記載される方法によって標的化可能な任意の遺伝子座、例えば、本明細書に記載される細胞表面タンパク質をコードする遺伝子に対応し得る。

いくつかの実施形態では、方法は、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする治療有効量の少なくとも１つの薬剤を対象に投与することを更に伴う。理論に束縛されることを望むものではないが、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤を、修飾遺伝子を含む細胞、細胞集団、又はその子孫と組み合わせて投与することによって、細胞、細胞集団、若しくはその子孫を標的としない、又はより低い程度で標的とする一方で、薬剤で対象内の細胞（例えば、疾患細胞、例えば、がん細胞）を標的とすることが可能である。例えば、そのような方法は、対象における標的細胞集団を選択的に切除又は殺傷させると同時に、薬剤に対して脆弱でない新しい細胞を対象に補充するために組み合わせて使用され得る。更なる例として、そのような方法は、細胞、細胞集団、又はその子孫（例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法）の一部として薬剤を投与することができ、したがって、細胞フラトリサイドを回避又は減少させるであろう。いくつかの実施形態では、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、細胞、集団、若しくはその子孫、又は医薬組成物の投与と同時に、あるいは時間的に近接して生じる。いくつかの実施形態では、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、細胞、集団、若しくはその子孫、又は医薬組成物の投与後に生じる。いくつかの実施形態では、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、細胞、集団、若しくはその子孫、又は医薬組成物の投与前に生じる。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫が、同じ型の野生型細胞と比較して、第１の遺伝子及び第２の遺伝子に対する修飾を含む場合、方法は、第１の遺伝子及び第２の遺伝子の産物（例えば、第１の遺伝子及び第２の遺伝子の野生型コピー）を標的とする１つ以上（例えば、２つの薬剤）を投与することを含み得る。

投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、第１の遺伝子及び／若しくは第２の遺伝子の産物を標的とする免疫療法を受けているか、又は受けようとしている対象である。投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、がん（例えば、がん幹細胞の存在に関連するがん、造血器悪性腫瘍、第１及び／又は第２の遺伝子の産物の発現を特徴とするがんなどの悪性腫瘍を有するか、又はそれを有すると診断されている対象である。いくつかの実施形態では、そのような悪性腫瘍を有する対象は、第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子の産物を標的とする免疫療法剤などの薬剤の投与の候補であり得るが、有害なオンターゲット、疾患外効果のリスクが、対象にとって予期又は観察される利益を上回り得る。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作細胞の投与は、本明細書に提供される遺伝子操作細胞が薬剤によって効率的に標的とされないため、有害なオンターゲット、疾患外効果の改善をもたらす。

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、血液悪性腫瘍、又は血液のがんである。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、リンパ性の悪性腫瘍又は骨髄性の悪性腫瘍である。

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、自己免疫疾患又は障害である。自己免疫障害の例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、白血病、移植片対宿主病、ループス、及び乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、移植片対宿主疾患である。

また、本開示の範囲内には、再発性又は難治性血液悪性腫瘍などの再発性及び／又は難治性とみなされる悪性腫瘍がある。投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子の産物を標的とする免疫エフェクター細胞療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けているか、又は受けるであろう対象であり、免疫エフェクター細胞は、産物を標的とするＣＡＲを発現し、免疫エフェクター細胞の少なくともサブセットは、それらの細胞表面上でも産物を発現する。本明細書で使用される場合、「フラトリサイド」は、自己殺傷を指す。例えば、細胞の集団の細胞は、同じ集団の細胞を殺傷する、又はその殺傷を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞治療の細胞は、免疫エフェクター細胞治療の他の細胞を殺傷する、又はその殺傷を誘導する。

そのような実施形態では、フラトリサイドは、所望の臨床転帰、例えば、対象内で産物を発現する悪性細胞のアブレーションが達成できる前に、免疫エフェクター細胞の一部又は全集団をアブレーションする。いくつかのそのような実施形態では、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を使用して、本明細書で提供されるように、例えば、産物を発現しない、又はＣＡＲにより認識される産物のバリアントを発現しない免疫エフェクター細胞が、免疫エフェクター細胞治療の基礎を形成する免疫エフェクター細胞として、そのようなフラトリサイド及び治療転帰に対する関連する負の影響を回避し得る。そのような実施形態では、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書で提供されるように、例えば、産物を発現しない、又はＣＡＲにより認識される産物のバリアントを発現しない免疫エフェクター細胞は、また、薬剤（例えば、産物を標的とするＣＡＲ）も発現するように更に修飾され得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、例えば、Ｔリンパ球、例えば、アルファ／ベータＴリンパ球、ガンマ／デルタＴリンパ球、又はナチュラルキラーＴ細胞などであってもよい。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、それらのゲノムに修飾を含む、本明細書に記載される有効数の遺伝子操作細胞は、それを必要とする対象、例えば、第１の遺伝子及び／若しくは第２の遺伝子の産物を標的とする療法を受けているか、又は受けるであろう対象に投与され、療法は、例えば、産物を発現する対象における健康な細胞に向けた細胞傷害性の形態で、有害なオンターゲット、疾患外効果に関連するか、又は関連するリスクがある。いくつかの実施形態では、有効数のそのような遺伝子操作細胞は、第１の遺伝子又は第２の遺伝子によってコードされる産物を標的とする薬剤と組み合わせて対象に投与され得る。

遺伝子修飾細胞、及び第１の遺伝子又は第２の遺伝子によってコードされる産物を標的とする薬剤（例えば、免疫療法剤）を組み合わせて投与する場合、細胞及び薬剤は、同じ時間に投与され得るか、又は異なる時間に、例えば、時間的に近接して投与され得ることが理解される。

例えば、いくつかの実施形態では、組み合わせての投与には、同じ治療過程での投与、例えば、産物を標的とする薬剤（例えば、免疫療法）で対象を治療する過程での投与が含まれ、対象は、有効な数の遺伝子操作された細胞が同時に、同時発生的に、又は連続的に、例えば、薬剤による治療前、治療中、治療後に、並びに／又は相互に、及び細胞、細胞集団、若しくはその子孫に関して任意の順序で投与され得る。更に、細胞及び薬剤は、混合されてもよく、又は別々の容量若しくは投与形態において混合されてもよい。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、免疫療法剤である。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物と結合する抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子によってコードされる産物又はその野生型コピーを標的とする薬剤は、第２の遺伝子によってコードされる産物又はその野生型コピーに結合する抗原結合断片を含む。

いくつかの実施形態では、薬剤は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによって産生される産物と結合することができる抗原結合断片（例えば、単鎖抗体）を含む、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞である。いくつかの実施形態では、薬剤は、第２の遺伝子又はその野生型コピーによって産生される産物と結合することができる抗原結合断片（例えば、単鎖抗体）を含む、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞である。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞）又はＮＫ細胞であり得る。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、刺激分子に由来するものを含む、組換えポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激分子、例えば４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／又はＣＤ２８、又はそれらの分子の断片から由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、第１の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物、第２の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物、又はその両方と結合する抗体断片を含み得る。抗体断片は、１つ以上のＣＤＲ、可変領域（又はその一部）、定常領域（又はその一部）、又は前述のうちのいずれかの組み合わせを含むことができる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には、（例えば、ＣＤ８又はＣＤ２８からの）ヒンジ領域、（例えば、ＣＤ８又はＣＤ２８からの）膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ）、及びシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）を含み得る、例えば、ＣＡＲフレームワークに融合された抗体断片を含む、抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲドメイン及び構成要素の例示的な配列は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１７８３８２号において、及び以下の表２に提供される。

いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される、本明細書で提供される遺伝子操作細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）の数は、１０^６～１０^１１の範囲内である。しかし、この例示的な範囲を下回る又は上回る量も、本開示の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）の数は、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、又は約１０^１１である。いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）の数は、１０^６～１０^９の範囲内、１０^６～１０^８の範囲内、１０^７～１０^９の範囲内、１０^７～１０^１０の範囲内、１０^８～１０^１０の範囲内、又は１０^９～１０^１１の範囲内である。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。ＡＤＣは、毒素又は薬物分子とコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合断片５を含む分子であり得る。対応する抗原との抗体又はその断片の結合は、細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、標的細胞）への毒素又は薬物分子の送達を可能にし、それによって、標的細胞の死をもたらす。

抗体－薬物複合体での使用に適合する毒素又は薬物は、当技術分野で公知であり、当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｔａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５、Ｂｅｃｋｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）１６：３１５－３３７、Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏｅｔａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１１：８、Ｅｌｇｕｎｄｉｅｔａｌ．ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１２２：２－１９を参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体は、抗体及び薬物分子を付着させるリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）を更に含み得る。

抗体－薬物複合体のための好適な毒素又は薬物の例としては、限定されるものではないが、ブレンツキシマブベドチン、グレンバツムマブベドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキシズマブマホドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンフォルトマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、チソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファスツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラブタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラブタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラブタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラブタンシン／ＢＡＹ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラブタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ１７２、ＡＭＧ５９５、ＬＯＰ６２８、バダスツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン／ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイキサドチン／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１に含まれる毒素及び薬物が挙げられる。抗ＣＤ３０抗体薬物複合体は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂｒａｄｌｅｙｅｔａｌ．Ａｍ．Ｊ．ＨｅａｌｔｈＳｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．（２０１３）７０（７）：５８９－９７、Ｓｈｅｎｅｔａｌ．ｍＡｂｓ（２０１９）１１（６）：１１４９－１１６１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質（例えば、細胞表面系統特異的細胞表面タンパク質）のエピトープとの抗体－薬物複合体の結合は、抗体－薬物複合体の内部化を誘発し、薬物（又は毒素）は、細胞内に放出され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープとの抗体－薬物複合体の結合は、毒素又は薬物の内部化を誘発し、それによって、毒素又は薬物は、系統特異的タンパク質（標的細胞）を発現する細胞を殺傷することが可能になる。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープとの抗体－薬物複合体の結合は、毒素又は薬剤の内部化を誘発し、それによって、毒素又は薬剤は、系統特異的タンパク質（標的細胞）を発現する細胞の活性が調節され得る。本明細書に記載される抗体－薬物複合体で使用される毒素又は薬物の種類は、いかなる特定の種類にも限定されない。

本開示の態様はまた、キット、例えば、遺伝子操作細胞を産生するための試薬を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、第１のｇＲＮＡ、及び第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼは、細胞又は複数の細胞のゲノム中の第１の標的ドメインと結合するのに好適な条件下で、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。いくつかの実施形態では、キットは、第２のｇＲＮＡ、及び第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼは、第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと同じである。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼは、第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼとは異なる（例えば、別個の形態及び／又はそれに加えて供給される）。いくつかの実施形態では、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼは、細胞又は複数の細胞のゲノム中の第２の標的ドメインと結合するのに好適な条件下で、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

いくつかの実施形態では、キットは、細胞又は複数の細胞を、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ、並びに第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる方法に関する説明書を含み、説明書は、細胞又は複数の細胞を、第２のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させる前に、第１のｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させることを規定する（例えば、第１の標的ドメインへの修飾が、第２の標的ドメインへの修飾の前に導入されるように）。いくつかの実施形態では、説明書は、例えば、転座アッセイによって測定されるように、複数の細胞を、第１のｇＲＮＡと接触させる前に、細胞又は複数の細胞を、第２のｇＲＮＡと接触させる他の同様の方法よりも、より少ない転座産物細胞を含む複数の細胞を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、キットは、細胞又は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞又は複数の細胞を含まない（例えば、説明書に列挙された細胞又は複数の細胞は、他の手段によって取得される）。

本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用のうちのいくつかが、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。実施例は、本開示の利益のうちのいくつかを例証し、かつ特定の実施形態を説明することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。

実施例１：ＣＤ３４＋造血細胞におけるＣＤ３３及びＣＤ１９の多重編集
本実施例は、複数のゲノム編集ＲＮＰ（第１の系統特異的細胞表面抗原、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９を含む第１のＲＮＰ、並びに第２の系統特異的細胞表面抗原、ＣＤ１９を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９を含む第２のＲＮＰ）を用いたｃＣＤ３４＋ＨＳＣの処置の順序が、二重に遺伝子修飾されたＣＤ３４＋ＨＳＣを産生するプロセスで産生される転座産物の量に寄与することを示す。特に、本実施例は、ＣＤ３３を標的とするＲＮＰでの処置とそれに続くＣＤ１９を標的とするＲＮＰでの処置が、実質的に同じ時間又は逆の順序でのいずれかの処置よりも少ない転座産物を産生することを示す。実施例は、処置の順序又は同時性が、細胞の生存率又はいずれかの標的の編集効率に影響を及ぼさなかったことを示す。

方法
動員された末梢血（ｍＰＢ）に由来する凍結されたＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｈｅｍａｃａｒｅ又はＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒから購入し、製造元の指示に従って解凍した。ＨＳＣを編集するために、図１に示すように、第１のＲＮＰ及び第２のＲＮＰによるエレクトロポレーションの前に、ＨＳＣを解凍し、約４０時間培養した。ＣＤ３３及びＣＤ１９標的化ｇＲＮＡの標的化ドメイン配列を表１に示す。

ＨＳＣをエレクトロポレーションするために、１．５×１０^５個の細胞をペレット化し、２０μＬのＬｏｎｚａＰ３溶液中に再懸濁し、１０μＬのＣａｓ９ＲＮＰと混合した。ＣＤ３４＋ＨＳＣを、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２（プログラムＤＵ－１００）及びＨｕｍａｎＰ３ＣｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＶＰＡ－１００２、Ｌｏｎｚａ）を使用して、エレクトロポレーションした。細胞を、第１のＲＮＰによる第１のエレクトロポレーションに供し、第２のＲＮＰによる第２のエレクトロポレーションの前に３０時間インキュベートした。細胞を、第２のエレクトロポレーションの２４時間後及び３０時間後に収集し、生存率、オンターゲット編集、及び転座産物の存在について評価した。編集率を、ＴＩＤＥ分析により評価されたように、％インデルにより決定した。編集効率を、フローサイトメトリー分析により決定した。エクスビボ編集後の様々な時点で、生存可能な、編集された生存細胞及び対照細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリー及び７ＡＡＤ生存色素を使用して定量した。

結果
図２Ａは、細胞に対する第１のエレクトロポレーション後の示される時点でのＣＤ３４＋ＨＳＣの生存率を示す。細胞群を、ＣＤ３３及びＣＤ１９を標的とするＲＮＰを同じ時間にエレクトロポレーションし（ＳｉＣＤ３３＋ＣＤ１９）、細胞を第１にＣＤ３３を標的としたＲＮＰ、続いて第２にＣＤ１９を標的としたＲＮＰで連続的に処理し（ＳｅＣＤ３３＞ＣＤ１９）、細胞を第１にＣＤ１９を標的としたＲＮＰ、続いて第２にＣＤ３３を標的としたＲＮＰで連続的に処理し（ＳｅＣＤ１９＞ＣＤ３３）、又はモックエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの順序又は同時性に基づいて、生存率に有意な差は観察されなかった。

図２Ｂは、各細胞群におけるＣＤ３３編集及びＣＤ１９編集の編集効率を示す。結果は、処置の順序に基づいて、編集効率に有意な差がないことを示す。

本明細書で論じるように、例えば、二本鎖切断の生成を伴う遺伝子編集は、転座産物の産生をもたらし得る。図３を参照されたい。ＣＤ３３を標的とするＲＮＰ及びＣＤ１９を標的とするＲＮＰによって産生される二本鎖切断間のＤＮＡ修復事象によって産生される転座産物は、特定のカテゴリに分類されると予測することができる（図３を参照されたい）。プライマー対を、ＰＣＲ分析を使用して特定の転座産物を検出するために選択し、各々のおおよその位置が図３に示されている。これらのＰＣＲ反応の産物を、ゲル電気泳動を介して定性的に、及びｄｄＰＣＲアッセイを使用して定量的に分析した。

図４Ａは、転座産物（本実験では、プライマー対５及び２又は８及び２をそれぞれ使用した、ダイセントリック及びバランス型転座産物）の定性的転座分析の結果を示す。細胞を、ＣＤ３３を標的とするＲＮＰ、続いてＣＤ１９を標的とするＲＮＰでエレクトロポレーションした場合に、逆の順序又は実質的に同じ時間に処置した場合と比較して、有意に少ない転座産物が検出された。図４Ｂは、ｄｄＰＣＲによる転座産物の定量的転座分析（転座事象％）の結果を示し、定性的分析（図４Ａ）と一致して、細胞を、ＣＤ３３を標的とするＲＮＰ、続いてＣＤ１９を標的とするＲＮＰでエレクトロポレーションした場合に、逆の順序又は実質的に同じ時間に処置した場合よりも、検出される転座産物が有意に少ないことを示した。分析はまた、編集効率が処置の順序又は同時性によって影響を受けないことを示した。図４Ｃを参照されたい。

ＣＤ３３を標的とするＲＮＰ及びＣＤ１９を標的とするＲＮＰによる編集から得られた産物を、それぞれ、図５Ａ及び５Ｂに示し、ＲＮＰによる処置後に検出された挿入又は欠失（インデル）の位置を示す。インデルデータは、ｇ６０ｇＲＮＡでＣＤ３３を標的化することが、多数の－１位インデルを産生することを示し、これは、それらのインデルに関連する二本鎖切断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって認識及び修復されたことを示唆している。対照的に、インデルデータは、ｇ１８ｇＲＮＡでＣＤ１９を標的化することが、多数の－６位及び－９位のインデルを産生することを示し、これは、それらのインデルに関連する二本鎖切断が、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）によって認識及び修復されたことを示唆している。理論に束縛されることを望むものではないが、主にＮＨＥＪによって認識される二本鎖切断は、主に非ＮＨＥＪ機構（例えば、ＭＭＥＪ）によって認識される二本鎖切断よりも速く修復され得る。最初にＮＨＥＪによって主に認識される二本鎖切断を誘導し、続いて主に非ＮＨＥＪ機構（例えば、ＭＭＥＪ）によって認識される二本鎖切断を誘導し、第１の二本鎖切断が、第２の二本鎖切断が生じる前に実質的に修復され（例えば、インデルを形成する）得、それにより、２つの二本鎖切断からの転座産物の量が減少するか、又は形成が防止されると仮定される（図６Ａ～６Ｃを参照されたい）。

実施例２：ＣＤ３４＋造血細胞におけるＣＤ３３及びＣＤ５の多重編集
本実施例は、複数のゲノム編集ＲＮＰ（第１の系統特異的細胞表面抗原、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９を含む第１のＲＮＰ、並びに第２の系統特異的細胞表面抗原、ＣＤ５を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９を含む第２のＲＮＰ）を用いたＣＤ３４＋ＨＳＣの処置の順序が、二重に遺伝子修飾されたＣＤ３４＋ＨＳＣを産生するプロセスで産生される転座産物のレベルに重要であることを示す。特に、本実施例は、ＣＤ５を標的とするＲＮＰによる処置、続いてＣＤ３３を標的とするＲＮＰによる処置が、観察された転座頻度に関して特に好ましいことを示す。実施例は、処置の順序又は同時性が、細胞の生存率又はいずれかの標的の編集効率に影響を及ぼさなかったことを示す。更に、本実施例は、多重編集細胞の免疫不全マウスモデル（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（「ＮＯＤｓｃｉｄガンマ」又は「ＮＳＧ」としても知られる）マウス）への生着及び分化の成功を示す。

方法
動員された末梢血（ｍＰＢ）に由来する凍結されたＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｈｅｍａｃａｒｅ又はＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒのから購入し、製造元の指示に従って解凍した。図７Ａに示すように、第１のＲＮＰ及び第２のＲＮＰによるエレクトロポレーションの前に、ＨＳＣを解凍し、約４０時間培養した。ＣＤ３３及びＣＤ５標的化ｇＲＮＡの標的化ドメイン配列を表１に示す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐｙＣａｓ９）で使用するための対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）の標的化ドメイン配列を以下に提供する。
ｇ対照（ＳｐｙＣａｓ９）
ＧＣＣＧＡＣＧＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＣＧＮＲＧ（配列番号９）

ＨＳＣをエレクトロポレーションするために、細胞をペレット化し、ＬｏｎｚａＰ３溶液中に再懸濁し、Ｃａｓ９ＲＮＰと混合した。ＣＤ３４＋ＨＳＣを、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２（プログラムＤＵ－１００）及びＨｕｍａｎＰ３ＣｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＶＰＡ－１００２、Ｌｏｎｚａ）を使用して、エレクトロポレーションした。細胞を、第１のＲＮＰによる第１のエレクトロポレーションに供し、第２のＲＮＰによる第２のエレクトロポレーションの前に３０時間インキュベートした。細胞を、第２のエレクトロポレーションの１８時間後に収集し、生存率、オンターゲット編集、及び転座産物の存在について評価した。編集率を、ＴＩＤＥ分析により評価されたように、％インデルにより決定した。編集効率を、フローサイトメトリー分析により決定した。エクスビボ編集後の様々な時点で、生存可能な、編集された生存細胞及び対照細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリー及び７ＡＡＤ生存色素を使用して定量した。細胞群及びそれぞれの処置を図７Ｂに示し、実験パラメータを表３に示す。

第２のＲＮＰのエレクトロポレーション後、細胞を、２００センチグレイ（ｃＧｙ）の放射線照射で処置した３週齢のＮＳＧマウスに注射した。レシピエントＮＳＧマウスに、修飾ＨＳＣを注射する前に、全身ガンマ線を照射した。注射当たり１×１０^５個のＣＤ３４＋細胞を、各マウスの外側尾静脈に注射した。ＨＳＣを注射してから１６週間（１６）後、レシピエントマウスの骨髄のヒトキメリズムをフローサイトメトリーによって評価した。

結果
図８Ａは、細胞に対する第１のエレクトロポレーション後の示される時点でのＣＤ３４＋ＨＳＣの生存率を示す。全ての群は、マウスへの遺伝子修飾細胞の注射時に７０％を超える生存率を有した。エレクトロポレーションの順序又は同時性に基づいて、生存率に有意な差は観察されなかった。

図８Ｂは、各細胞群におけるＣＤ３３編集及びＣＤ５編集の編集効率を示す。結果は、連続的な編集と比較して、２つのＲＮＰを同時にエレクトロポレーションした細胞において、オンターゲット編集効率のわずかな増加があったことを示す。

実施例１で上述したように、ＰＣＲ分析を使用して特定の転座産物を検出するためにプライマー対を選択し、各々のおおよその位置が図９の右の概略図に示されている。これらのＰＣＲ反応の産物を、ゲル電気泳動を介して定性的に、及びｄｄＰＣＲアッセイを使用して定量的に分析した。

図９は、オンターゲット転座産物のパーセントを示し、観察された各種類の転座産物の相対量を示す。細胞を２つのＲＮＰで連続的に処置した場合、実質的に同じ時間に２つのＲＮＰをエレクトロポレーション場合と比較して、インプット細胞（ＮＳＧマウスに注射される編集された細胞）で検出される転座産物はより少なかった。図１０は、オンターゲット転座産物のパーセント（１９番染色体に対して正規化したもの）を示し、観察された各種類の転座産物の相対量を示す。「インプット」試料は、エレクトロポレーションされ、マウスに注射される細胞を指す。他の示される群は、様々な群の動物から収集され、次いで分析された細胞に対応する。例えば、群９からのインプット（ＳｅＣＤ３＞ＣＤ５）は、群１０のインプット（ＳｅＣＤ５＞ＣＤ３３）と比較して、転座（インプット「９」）の頻度が低いことが見出された。しかしながら、移植後に収集された細胞（群９ＳｅＣＤ３３＞ＣＤ５）は、持続的な転座を有する一部の動物（例えば、９－１、９－３、及び９－６）があるように見えたが、群１０（ＳｅＣＤ５＞ＣＤ３３）の動物から収集された細胞は、いかなる転座も維持していないように見えた。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これらの結果は、（インプットで測定されたように）発生した任意の転座が動物に対して選択された可能性があることを示唆し得る。概して、細胞を２つのＲＮＰで連続的に処置した場合、実質的に同じ時間に２つのＲＮＰをエレクトロポレーション場合と比較して、インプット試料（ＮＳＧマウスに注射される細胞）で検出される転座産物はより少なかった。ＣＤ３３標的化ＲＮＰ、続いてＣＤ５標的化ＲＮＰを連続的にエレクトロポレーションした細胞と比較して、ＣＤ５標的化ＲＮＰ、続いてＣＤ３３標的化ＲＮＰを連続的にエレクトロポレーションした細胞で検出される転座産物の量はわずかに減少した。

ＮＳＧマウスへの編集されたＣＤ３４＋細胞の注射の１６週間後、細胞を、編集された細胞の生着の指標として、ヒトキメリズムについて分析した。結果は、ＣＤ３４＋細胞適合性が、Ｃａｓ９多重エレクトロポレーション又はＣＤ３３及びＣＤ５編集によって影響を受けなかったことを示す。図１１を参照されたい。

細胞を更に評価して、多重編集が、異なる細胞系統に分化する細胞の能力に影響を与えるかを決定した。図１２Ａ～１２Ｃは、Ｂ及びＴ細胞系統が多重遺伝子編集の影響を受けない（連続的な編集対同時編集なし）一方で、骨髄系細胞（ｈＣＤ３３＋）のパーセンテージは、遺伝子編集によるＣＤ３３の除去に起因して低かったことを示す。最後に、Ｔ細胞前駆細胞のサブセットも評価した。図１３Ａ～１３Ｃは、マウス系統が胸腺の発達が不十分であるにもかかわらず、本実験におけるＴ細胞前駆細胞の検出を示す。ＣＤ５編集群は、予想通り、より低いレベルのＣＤ５タンパク質発現を示し、検出可能なレベルのＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を有した。

実施例３：Ｃａｓ９及びＣｐｆ１ヌクレアーゼを使用したＣＤ３４＋造血細胞におけるＣＤ３３及びＣＤ１９の多重編集
本実施例は、複数のゲノム編集ＲＮＰ（第１の系統特異的細胞表面抗原、ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ９を含む第１のＲＮＰ、並びに第２の系統特異的細胞表面抗原、ＣＤ１９を標的とするｇＲＮＡ、及びＣｐｆ１を含む第２のＲＮＰ）を用いたｃＣＤ３４＋ＨＳＣの処置の順序が、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１を使用して編集されたＣＤ３４＋ＨＳＣを産生するプロセスで産生される転座産物の量に寄与することを示す。特に、本実施例は、連続的な編集（Ｃａｓ９及びＣｐｆ１を使用）を用いた処置が、実質的に同じ時間に編集するよりも少ない転座産物を産生することを示す。実施例は、処置の順序又は同時性が、細胞の生存率又はいずれかの標的の編集効率に影響を及ぼさなかったことを示す。

方法
動員された末梢血（ｍＰＢ）に由来する凍結されたＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｈｅｍａｃａｒｅ又はＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒのから購入し、製造元の指示に従って解凍した。ＨＳＣを編集するために、図１に示すように、第１のＲＮＰ及び第２のＲＮＰによるエレクトロポレーションの前に、ＨＳＣを解凍し、約４０時間培養した。ＣＤ３３及びＣＤ１９標的化ｇＲＮＡの標的化ドメイン配列を表１に示す。

結果
図１４は、細胞に対する第１のエレクトロポレーション後の示される時点でのＣＤ３４＋ＨＳＣの生存率を示す。細胞群を、ＣＤ３３及びＣａｓ９ヌクレアーゼを標的とするＲＮＰ、並びにＣＤ１９及びＣｐｆ１を標的とするＲＮＰを同じ時間にエレクトロポレーションし（ＳｉＣａｓ９＋Ｃｐｆ１）、細胞を第１にＣＤ３３及びＣａｓ９を標的としたＲＮＰ、続いて第２にＣＤ１９及びＣｐｆ１を標的としたＲＮＰで連続的に処理し（ＳｅＣａｓ９＞Ｃｐｆ１）、細胞を第１にＣＤ１９及びＣｐｆ１を標的としたＲＮＰ、続いて第２にＣＤ３３及びＣａｓ９を標的としたＲＮＰで連続的に処理し（ＳｅＣｐｆ１＞Ｃａｓ９、単一のＲＮＰ（Ｃａｓ９ＣＤ３３又はＣｐｆ１ＣＤ１９のいずれか）、エレクトロポレーションしなかった、又はモックエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの順序又は同時性に基づいて、生存率に有意な差は観察されなかった。

図１５Ａ及び図１５Ｂは、各細胞群におけるＣＤ３３編集及びＣＤ１９編集の編集効率を示す。結果は、処置の順序に基づいて、編集効率に有意な差がないことを示す。

本明細書で論じるように、例えば、二本鎖切断の生成を伴う遺伝子編集は、転座産物の産生をもたらし得る。図３を参照されたい。ＣＤ３３を標的とするＲＮＰ及びＣＤ１９を標的とするＲＮＰによって産生される二本鎖切断間のＤＮＡ修復事象によって産生される転座産物は、特定のカテゴリに分類されると予測することができる（図３を参照されたい）。図１６の右パネルに示すように、プライマー対を選択し、ＰＣＲ分析を使用して特定の転座産物を検出した。これらのＰＣＲ反応の産物を、ゲル電気泳動を介して定性的に、及びｄｄＰＣＲアッセイを使用して定量的に分析した。

図１６は、示されるプライマー対の各々を使用したＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の定量化（ＩｍａｇｅＪソフトウェアによる）を示す。評価した転座産物種の各々について、細胞をＲＮＰで連続的にエレクトロポレーションした場合に、同時にエレクトロポレーションした場合と比較して、より少ない転座産物が検出された。最初にＣＤ１９及びＣｐｆ１を標的とするＲＮＰ、続いてＣＤ３３及びＣａｓ９を標的とするＲＮＰをエレクトロポレーションした細胞で産生された転座産物の大部分は、逆の順序と比較してわずかに低減した。

実施例４：血液疾患の治療
急性骨髄性白血病に対する本明細書に記載される方法、細胞、及び薬剤を使用した治療レジメンの例を以下に提供する。
１）造血細胞移植（ＨＣＴ）を受ける候補となるＡＭＬを有する患者を特定する；
２）標準的な方法及び技術を使用して、一致するＨＬＡハプロタイプを有するＨＣＴドナーを特定する；
３）ドナーから骨髄を抽出する；
４）ドナー骨髄細胞をエクスビボで遺伝子操作する。簡潔に述べると、本明細書に記載されるように、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９，Ｃｐｆ１置換）を使用して、系統特異的細胞表面抗原の標的修飾（欠失、置換）を連続的に導入した。細胞は、分化する能力、及び患者に生着し、移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を媒介する能力を決定するための特徴について評価され得る。

任意のステップ５～７：
いくつかの実施形態では、以下に提供されるステップ５～７は、本明細書に記載される例示的な治療方法で（１回又は複数回）実施され得る：
５）化学療法剤（例えば、エトポシド、シクロホスファミド）の注入及び／又は放射線照射などの標準的な技術を使用して、ＡＭＬ患者を前処置する；
６）操作ドナー骨髄をＡＭＬ患者に投与し、生着の成功を可能にする；
７）キメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ細胞）又は抗体－薬物複合体を発現する免疫細胞などの細胞傷害性薬剤によるフォローアップ、細胞傷害性薬剤が結合するエピトープは、修飾されたエピトープと同じであり、ドナー操作骨髄移植片にはもはや存在しない。したがって、標的療法は、エピトープが存在しない骨髄移植片を同時に除去することなく、系統特異的細胞表面抗原を特異的に標的とする必要がある。

任意のステップ８～１０：
いくつかの実施形態では、ステップ８～１０は、本明細書に記載される例示的な治療方法で（１回又は複数回）実施され得る：
８）キメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）又は系統特異的細胞表面抗原のエピトープを標的とする抗体－薬物複合体などの細胞傷害性薬剤の投与。この標的療法は、がん細胞及び患者の非がん細胞の両方を除去することが期待される。
９）化学療法剤の注入などの標準的な技法を使用して、ＡＭＬ患者を前処置する；
１０）操作ドナー骨髄をＡＭＬ患者に投与し、生着の成功を可能にする。

ステップ８～１０は、標的タンパク質を発現する患者のがん細胞及び正常細胞の除去をもたらし、一方で標的療法に耐性のあるドナー細胞を正常細胞集団に補充する。

実施例５：ヒト造血幹細胞におけるＣＬＬ－１及びＣＤ３３の多重編集
ＣＬＬ－１及びＣＤ３３は、ＡＭＬ患者由来芽球／白血病幹細胞（ＬＳＣ）において高度に発現される。図５４Ａ～５４Ｄを参照されたい。しかしながら、これらの抗原を標的とすることは、正常な造血細胞上での共通発現に起因して、血球減少につながる可能性がある。本実施例は、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１の発現を低減又は排除した細胞を生成するためのヒトＨＳＣの多重編集を示す。

方法
多重編集のために、ヒトＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を解凍し、サイトカインを補充したＳＦＥＭ中で２４時間培養した。次いで、細胞に、第１のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質複合体（「ＥＰ１」と呼ばれる）をエレクトロポレーションした。第２のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含む第２のリボ核タンパク質複合体（「ＥＰ２」と呼ばれる）による第２のエレクトロポレーションステップの前に、細胞を３０時間インキュベートした。６３時間培養した後、細胞を収集し、フローサイトメトリーを使用して選別し、配列決定分析に供した。図１７を参照されたい。

骨髄分化研究については、ヒトＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を解凍し、４０時間培養した。フローサイトメトリー分析を使用して、０、１、及び２日目のＣＬＬ－１並びにＣＤ３３の発現を確認した。次いで、上で論じた連続的なエレクトロポレーション手順のために、細胞を、０．５ｘ１０^６細胞／ｍＬ～１ｘ１０^６細胞／ｍＬの濃度で調製した。ここで、細胞をＥＰ１とＥＰ２との間で３０時間インキュベートした。ＥＰ２の２６時間後、細胞を５×１０^４細胞／ｍＬの濃度で調製し、補充培地中で４日間インキュベートして、骨髄分化を促進した。細胞を骨髄分化培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＭｙｅｌｏｉｄＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＩ又はＭｙｅｌｏｉｄＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＩＩ）中で１４日間培養し、その間、８日目、１１日目、及び１４日目に、細胞を計数し、分割し、１×１０^５細胞／ｍＬの濃度で播種した。１１日目に、細胞を細胞忌避処理プレートに切り替え、１８日目まで維持した。１８日目に、細胞を収集し、食作用及びサイトカイン放出アッセイなどの表現型及び機能的アッセイに供して、分化を特徴付けた。３、４、５、６、８、１１、１４、及び１８日目の実験全体を通して、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１発現レベルのフローサイトメトリー分析に細胞試料を使用し、下流ｇＤＮＡ及び転写物分析のために細胞ペレットを収集した。図２３を参照されたい。

系統分化を評価するために、エレクトロポレーション細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）と混合し、合計３枚のプレートにわたって２００細胞／ウェル及び３００細胞／ウェルの密度で、ＳｍａｒｔＤｉｓｈ（商標）中に二重に播種した。細胞を１４日間インキュベートした後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の画像化及びスコアリングを行った。図３３を参照されたい。

結果
多重編集細胞を、亜集団に分類して、様々な細胞型：ＬＴ－ＨＳＣ、ＣＭＰ、ＭＰＰ、ＭＬＰ、及びＣＤ４９ｆにおける編集頻度を評価した。図１８Ａ～１８Ｃ及び図１９Ａ～１９Ｃは、それぞれ、２つの独立した骨髄ドナーに由来するヒトＨＳＣにおけるＣＤ３３編集頻度及びＣＬＬ－１編集頻度を示す。ＣＤ３３及びＣＬＬ－１の両方の編集頻度は、細胞亜集団間で同等であり、バルク編集細胞集団で観察された編集頻度と同等であることが見出された。

図２０は、多重編集骨髄細胞の生存率分析を示し、多重編集ヒトＨＳＣが対照細胞と同様の生存率レベルを示すことを示した。

多重編集後、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１の発現動態並びにタンパク質安定性について細胞を分析した。図２１Ａ及び図２２Ａは、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１編集頻度の非常に効率的な遺伝子編集が、多重編集後少なくとも５日間維持されたことを示す。これはまた、それぞれ、図２１Ｂ及び２２Ｂに示すように、対照細胞と比較して、編集後わずか１日で、エレクトロポレーション後のＣＤ３３及びＣＬＬ－１ｍＲＮＡレベルの急速な減少をもたらした。転写レベルの低減に加えて、編集細胞は、対照ｇＲＮＡで編集された細胞と比較して、エレクトロポレーション後２日以内にＣＤ３３及びＣＬＬ－１表面タンパク質発現の有意な低下を示した。図２１Ｃ及び図２２Ｃ。重要なことに、転写物及びタンパク質レベルの減少が、経時的に維持された。

多重編集細胞を、インビトロ分化で機能的骨髄細胞に分化する能力について特徴付けた。図２４Ａ及び２４Ｂは、多重編集細胞が、モック編集対照細胞と比較して、顆粒球及び単球への分化中に同等の増殖速度を示し、顆粒球分化（図２５Ａ及び２５Ｂ）又は単球分化（図２６Ａ及び２６Ｂ）に影響を及ぼさなかったことを示し、図２７Ａ～２８Ｂは、達成された高レベルのＣＬＬ－１及びＣＤ３３編集が骨髄分化を通じて維持されたことを示す。

図２９Ａ～３０Ｄは、検出可能な表面ＣＬＬ－１及びＣＤ３３タンパク質レベルが多重編集後に失われ、骨髄細胞分化の過程全体を通じて有意に減少したままであったことを示す。図３１Ａ及び３１Ｂは、顆粒球及び単球の集団の大部分がＣＬＬ－１及びＣＤ３３の両方を欠損する細胞を含むことを示す。図３２Ａ及び３２Ｂは、多重編集ヒトＨＳＣから分化した顆粒球及び単球が食作用活性を保持していることを示し、モック編集細胞と同等のＥ．ｃｏｌｉ食作用レベルを示す。図５２Ａ～５２Ｄは、ＬＰＳ又はＲ８４８による刺激後のサイトカイン産生によって評価した、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１多重編集ｈＨＳＣＰに由来する分化細胞が、対照細胞と同等の機能を維持したことを示す。

図３４Ａ～３５Ｂは、多重編集細胞が、赤血球系細胞、顆粒球、マクロファージ、及び巨核球を含むコロニー単位を形成することができたことを示す。

多重編集細胞も、ＣＤ３３又はＣＬＬ－１を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞などのＣＤ３３及びＣＬＬ－１標的療法に対する生存について評価した。図５１は、ＣＤ３３又はＣＬＬ－１を標的とするＣＡＲが、野生型抗原（例えば、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１）を発現する細胞の細胞傷害性を誘導したが、ＣＤ３３又はＣＬＬ－１を欠く細胞は、同族のＣＡＲ発現細胞に対して耐性であったことを示す。ＣＤ３３及びＣＬＬ－１を欠く多重編集細胞は、ＣＤ３３標的化ＣＡＲ及びＣＬＬ－１標的化ＣＡＲの両方に対する生存の増加を示した。これらの結果は、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１の多重編集が、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１を標的とする療法に対して細胞を耐性にしたことを示す。

実施例６：多重編集細胞のマウスモデルへのインビボ生着
本実施例は、多重編集ヒトＨＳＣをマウスモデルに長期的に生着させることができることを示す。特に、本実施例は、生着した多重編集細胞が、生着したマウスの血液及び骨髄組織を安定的に再配置することを示す。本実施例はまた、多重編集細胞の生着が骨髄及びリンパ分化に有意に影響を与えなかったことを示す。

方法
図３６Ａに示すように、細胞を解凍し、上述のように連続的にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション２（ＥＰ２）の２６時間後、細胞を収集し、１７５ｃＧＹの線量で亜致死量の放射線を照射したＮＳＧ（商標）マウスに注射した。生着後８週時点での暫定分析のために血液試料を取得し、生着後１６週時点での分析のために血液及び骨髄試料を取得した。図３６Ｂは、生着試験のための治療群を示す。

結果
図３７は、凍結保存前又は解凍後の細胞数並びに細胞の生存率分析を示す。図３８は、生着マウスにおける骨髄キメリズムの分析を示し、エレクトロポレーションしていない（ＥＰなし）対照群と比較して、多重編集群における骨髄キメリズムのレベルが同様であることを示す。図３９Ａ～３９Ｈは、エレクトロポレーションしていない対照群と比較して、多重編集が骨髄系及びリンパ系に有意な影響を与えなかったことを示す。また、高レベルのＣＤ３３及びＣＬＬ－１を発現する細胞（例えば、単球、マスト細胞、好塩基球、ｃＤＣ、及びｐＤＣ）においても、多重化編集が高度に効果的であることが観察された。図４０Ａ～４０Ｆを参照されたい。ＣＤ３３及びＣＬＬ－１の両方の発現の減少も、生着後少なくとも１６週の時点で持続した。図４１Ａ及び図４１Ｂ。

多重編集細胞を、生着後の配列決定分析によって更に特徴付け、インビボでの編集の持続性及び任意の転座事象を評価した。図４２に示すように、ｒｈＡｍｐＳｅｑを使用したオンターゲット編集分析は、ＥＰ１後５６時間の時点で全ての治療群にわたって高レベルの編集が達成されたことを示した。追加の時点（例えば、ＥＰ１後、３０時間、５０時間、５６時間）での更なる分析は、ＩＣＥ分析を使用した。図４３Ａ及び図４３Ｂ。ＩＣＥ分析は、高いレベルの編集効率を確認し、多重編集細胞のｒｈＡＭＰ－Ｓｅｑ分析は、生着後１６週で生着マウスモデルから採取されたヒトＨＳＣの高いレベルの編集効率も明らかにした。図４６を参照されたい。

染色体転座事象は、多重編集の結果として生じ得る。図４４を参照されたい。しかしながら、図４５及び５３に示すように、連続的なエレクトロポレーション後のインプット試料において非常に低い頻度の転座事象が検出された。加えて、生着の１６週後のマウスから採取した細胞の分析は、連続的に編集された「インプット」試料と比較して、「アウトプット」骨髄試料では編集効率が同等レベルであり、オフターゲット編集事象は低いレベルであることを示した。図４６及び４８～５１を参照されたい。まとめると、これらのデータは、高いレベルの二重欠失生着ヒトＨＳＣが、リンパ系及び骨髄系細胞の再構成に大きく影響しない様式で生着後に持続することを示す。

参考文献
例えば、発明の背景、概要、詳細な説明、実施例、及び／又は参考文献のセクションにおける、本明細書に記述される全ての刊行物、特許、特許出願、公表、及びデータベースエントリー（例えば、配列データベースエントリー）は、個々の刊行物、特許、特許出願、公表、及びデータベースエントリーが、参照により具体的に及び個別に本明細書に組み込まれるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先する。

均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される実施形態の多くの均等物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの記事は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ又は複数を意味する場合がある。群の２つ以上のメンバーの間に「又は」を含む、請求項又は明細書は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、又は全てが存在する場合に満たされるとみなされる。２つ以上の群のメンバーの間に「又は」を含む群の開示は、群の正確に１つのメンバーが存在する実施形態、群の１つより多くのメンバーが存在する実施形態、及び群のメンバーの全てが存在する実施形態を提供する。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張され又は否定され得ることが理解されよう。

本発明は、特許請求の範囲の１つ以上、又は明細書の１つ以上の関連部分からの、１つ以上の制限、要素、節、又は説明用語が別の請求項に導入される、全ての変形、組み合わせ、及び順列を包含することが理解されるべきである。例えば、別の請求項に依存する請求項は、同じ基本請求項に依存する任意の他の請求項において見出される限定のうちの１つ以上を含むように改変され得る。更に、特許請求の範囲が組成物を列挙している場合、別段の指示がない限り、又は矛盾若しくは不一致が生じることが当業者に明白である場合を除き、本明細書に開示される作成若しくは使用方法のいずれかによる、又はもしあれば当技術分野に公知の方法による、組成物を作製若しくは使用する方法が含まれると理解されるべきである。

要素が、例えば、マーカッシュ群形式でリストとして提示される場合、要素の可能性のある全ての部分集団も開示されており、任意の要素又は要素の部分集団を群から削除できることが理解されるべきである。また、「含む」という用語は、開放的であることを意図し、追加の要素又はステップの包含を可能にすることにも留意されたい。一般的に、実施形態、製品、又は方法が、特定の要素、特徴、又はステップを含むと言及される場合、そのような要素、特徴、若しくはステップからなる、又はそれらから本質的になる実施形態、製品、又は方法も同様に提供されることが理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張され又は否定され得ることが理解されよう。

範囲が与えられる場合、エンドポイントが含まれる。更に、別段の指示がない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に別段に指示しない限り、いくつかの実施形態では、範囲の下限の単位の１／１０まで、記載された範囲内の任意の特定の値を想定し得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は、本明細書には個別に詳述されていないが、これらの値の各々は、本明細書に提供され、具体的に主張され又は否認され得ることが理解されよう。また、別段で指示されない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、部分範囲の終点は範囲の下限の単位の１／１０と同程度の精度で表される。

更に、本発明の任意の特定の実施形態は、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。本明細書中に記載される組成物及び／又は方法の任意の実施形態、要素、特徴、適用、又は態様を、任意の１つ以上の特許請求から除外することができる。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、又は態様が除外される実施形態の全ては、本明細書に明示的に記載されていない。

Claims

ａ）複数の細胞を、（ｉ）第１の標的配列と結合する第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、それにより、第１のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成及び／又は維持し、第１のＲＮＰ複合体が第１の標的配列と結合するのに好適な条件下で、第１のＲＮＰ複合体を形成することと、
ｂ）複数の細胞を、（ｉｉｉ）第２の標的配列と結合する第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ、及び（ｉｖ）第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第２のＲＮＰ複合体を形成及び／又は維持し、第２のＲＮＰ複合体が第２の標的配列と結合することと、を含み、
それにより、第１の標的配列の遺伝子修飾及び第２の標的配列の遺伝子修飾を含む遺伝子操作細胞の集団を産生し、
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、時間間隔を隔てて、連続的にかつ時間的に近接して実施され、
第１の標的化ドメインが、第２の標的化ドメインと同一ではない、前記方法。
第１の標的配列の遺伝子修飾が、第１のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位での若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなり、及び／あるいは第２の標的配列の遺伝子修飾が、第２のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位のすぐ近位での挿入又は欠失からなる、請求項１に記載の方法。
方法が、転座産物細胞の集団を産生し、亜集団の各細胞が、第１の標的配列を含むゲノムの一部、第２の標的配列を含むゲノムの一部、又はその両方を含む転座産物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
方法が、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、複数の細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する、請求項３に記載の方法。
方法が、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、複数の細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する、請求項３又は４に記載の方法。
方法が、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する、請求項３に記載の方法。
方法が、複数の細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する、請求項３又は６に記載の方法。
（ｉ）及び（ｉｉ）を含む第１のＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象によって生成される遺伝子修飾をもたらす、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）及び（ｉｉ）を含むＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合が、高速分解二本鎖切断を生じさせる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む第２のＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合が、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）事象によって生成される遺伝子修飾をもたらす、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む第２のＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合が、緩徐分解二本鎖切断を生じさせる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
第１の標的配列が、第１の遺伝子、それと作動可能に連結された転写制御要素、又は遺伝子及び転写制御要素の一部に存在する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
第１の標的配列のゲノム修飾が、第１の遺伝子によってコードされる産物の発現、若しくは第１の標的配列中にゲノム修飾を担持しない同じ細胞型の野生型細胞によって発現される産物のバリアントの発現の低減又は排除をもたらす、請求項１２に記載の方法。
第１の遺伝子が、第１の系統特異的細胞表面抗原をコードする、請求項１２又は１３に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８、及びＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
第２の標的配列が、第２の遺伝子、それと作動可能に連結された転写制御要素、又は遺伝子及び転写制御要素の一部に存在する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
第２の標的配列のゲノム修飾が、第２の遺伝子によってコードされる産物の発現、若しくは第２の標的配列中にゲノム修飾を担持しない同じ細胞型の野生型細胞によって発現される産物のバリアントの発現の低減又は排除をもたらす、請求項１６に記載の方法。
第２の遺伝子が、第２の系統特異的細胞表面抗原をコードする、請求項１６又は１７に記載の方法。
第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８、及びＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３である、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ５、又はＣＬＬ－１である、請求項２０に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ５である、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３である、請求項２２に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３であり、第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＬＬ－１である、請求項２０又は２１に記載の方法。
ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間の時間間隔が、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６時間である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び／又は（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓｐＣａｓヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓａＣａｓヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼであり、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）の接触させることが、（ｉ）及び（ｉｉ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で細胞に導入することを含み、及び／又は（ｂ）の接触させることが、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で細胞に導入することを含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される、請求項３５に記載の方法。
（ａ）の接触させることが、（ｉ）及び／若しくは（ｉｉ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／若しくは（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入することを含み、かつ／又は
（ｂ）の接触させることが、（ｉｉｉ）及び／若しくは（ｉｖ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／若しくは（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入することを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸が、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸が、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
第１のｇＲＮＡ及び／又は第２のｇＲＮＡが、化学修飾される１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
第１及び／又は第２のｇＲＮＡが、２’Ｏ－メチル部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
第１及び／又は第２のｇＲＮＡが、ホスホロチオエートを含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
第１及び／又は第２のｇＲＮＡが、チオＰＡＣＥ部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、造血細胞である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、造血幹細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、造血前駆細胞である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、リンパ球である、請求項１～４４及び４７のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、Ｔリンパ球である、請求項１～４４、４７及び４８のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１～４４、４７及び４８のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、幹細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、又は組織特異的幹細胞からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
ａ）細胞を、（ｉ）第１の標的配列と結合する第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）第１のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、それにより、（ｉ）の第１のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成及び／又は維持し、ＲＮＰ複合体が細胞のゲノム中の第１の標的配列と結合するのに好適な条件下で、第１のＲＮＰ複合体を形成することと、
ｂ）細胞を、（ｉｉｉ）第２の標的配列と結合する第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ、及び（ｉｖ）第２のｇＲＮＡと結合するＲＮＡガイドヌクレアーゼと接触させ、それにより、（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡが（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼと第２のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成及び／又は維持し、第２のＲＮＰ複合体が細胞のゲノム中の第２の標的配列と結合するのに好適な条件下で、第２のＲＮＰ複合体を形成することと、を含み、
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、時間間隔を隔てて、連続的に、時間的に近接して実施され、
第１の標的化ドメインが、第２の標的化ドメインとは異なる、前記方法。
第１の標的配列の遺伝子修飾が、第１のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位での若しくはそのすぐ近位での挿入又は欠失からなり、及び／あるいは第２の標的配列の遺伝子修飾が、第２のｇＲＮＡと結合したときにＲＮＡガイドヌクレアーゼによって切断される部位のすぐ近位での挿入又は欠失からなる、請求項５３に記載の方法。
方法が、転座産物細胞の亜集団を産生し、亜集団の各細胞が、第１の標的配列を含むゲノムの一部、第２の標的配列を含むゲノムの一部、又はその両方を含む転座産物を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
方法が、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する、請求項５５に記載の方法。
方法が、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡと接触させる前に、細胞を（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する、請求項５５又は５６に記載の方法。
方法が、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、より少ない転座産物細胞を産生する、請求項５５に記載の方法。
方法が、細胞を（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡと実質的に同時に接触させることを含む方法と比較して、少なくとも１０％少ない転座産物細胞を産生する、請求項５５又は５８に記載の方法。
（ｉ）及び（ｉｉ）を含む第１のＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象によって生成される遺伝子修飾をもたらす、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）及び（ｉｉ）を含むＲＮＰ複合体の第１の標的配列との結合が、高速分解二本鎖切断を生じさせる、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む第２のＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合が、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）事象によって生成される遺伝子修飾をもたらす、請求項５３～６１のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む第２のＲＮＰ複合体の第２の標的配列との結合が、緩徐分解二本鎖切断を生じさせる、請求項５３～６２のいずれか一項に記載の方法。
第１の標的配列が、第１の遺伝子、それと作動可能に連結された転写制御要素、又は遺伝子及び転写制御要素の一部に存在する、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の方法。
第１の標的配列のゲノム修飾が、第１の遺伝子によってコードされる産物の発現、若しくは第１の標的配列中にゲノム修飾を担持しない同じ細胞型の野生型細胞によって発現される産物のバリアントの発現の低減又は排除をもたらす、請求項６４に記載の方法。
第１の遺伝子が、第１の系統特異的細胞表面抗原をコードする、請求項６４又は６５に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８、及びＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
第２の標的配列が、第２の遺伝子、それと作動可能に連結された転写制御要素、又は遺伝子及び転写制御要素の一部に存在する、請求項５３～６７のいずれか一項に記載の方法。
第２の標的配列のゲノム修飾が、第２の遺伝子によってコードされる産物の発現、若しくは第２の標的配列中にゲノム修飾を担持しない同じ細胞型の野生型細胞によって発現される産物のバリアントの発現の低減又は排除をもたらす、請求項６８に記載の方法。
第２の遺伝子が、第２の系統特異的細胞表面抗原をコードする、請求項６８又は６９に記載の方法。
第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３８、及びＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３である、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。
第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ５、又はＣＬＬ－１である、請求項７１又は７２に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ５である、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。
第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３である、請求項７４に記載の方法。
第１の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３であり、第２の系統特異的細胞表面抗原が、ＣＬＬ－１である、請求項７１又は７２に記載の方法。
ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間の時間間隔が、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６時間である、請求項５３～７６のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び／又は（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項５３～７７のいずれか一項に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓｐＣａｓヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓａＣａｓヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項５３～７８のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼであり、（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項５３～８３のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項５３～８２のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項５３～８３のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）の接触させることが、（ｉ）及び（ｉｉ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で細胞に導入することを含み、及び／又は（ｂ）の接触させることが、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で細胞に導入することを含む、請求項５３～８６のいずれか一項に記載の方法。
予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される、請求項８７に記載の方法。
（ａ）の接触させることが、（ｉ）及び／若しくは（ｉｉ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／若しくは（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入することを含み、かつ／又は
（ｂ）の接触させることが、（ｉｉｉ）及び／若しくは（ｉｖ）を、（ｉ）のｇＲＮＡ及び／若しくは（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入することを含む、請求項５３～８８のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）の第１のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｉ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸が、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である、請求項５３～８９のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉｉ）の第２のｇＲＮＡ及び／又は（ｉｖ）のＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸が、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である、請求項５３～９０のいずれか一項に記載の方法。
第１のｇＲＮＡ及び／又は第２のｇＲＮＡが、化学修飾された１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項５３～９１のいずれか一項に記載の方法。
第１及び／又は第２のｇＲＮＡが、２’Ｏ－メチル部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項５３～９２のいずれか一項に記載の方法。
第１及び／又は第２のｇＲＮＡが、ホスホロチオエートを含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項５３～９３のいずれか一項に記載の方法。
第１及び／又は第２のｇＲＮＡが、チオＰＡＣＥ部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項５３～９４のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、造血細胞である、請求項５３～９５のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、造血幹細胞である、請求項５３～９６のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、造血前駆細胞である、請求項５３～９６のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項５３～９５のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、リンパ球である、請求項５３～９５及び９９のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、Ｔリンパ球である、請求項５３～９５、９９及び１００のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、ＮＫ細胞である、請求項５３～９５、９９及び１００のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、幹細胞である、請求項５３～９５のいずれか一項に記載の方法。
幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、又は組織特異的幹細胞からなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法によって産生される、遺伝子操作細胞、又はその子孫。
請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法によって取得される、又はそれによって取得可能である、複数の細胞を含む、細胞集団。
請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、又は請求項１０６に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
投与することを必要とする対象に、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、又は請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
細胞若しくはその子孫、又は細胞集団の細胞が、野生型対応細胞と比較した第１の遺伝子に対する修飾、及び野生型対応細胞と比較した第２の遺伝子に対する修飾を含む、請求項１０８に記載の方法。
第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする治療有効量の少なくとも１つの薬剤を対象に投与することを更に含み、薬剤が、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物と結合する抗原結合断片を含む、請求項１０８又は１０９に記載の方法。
第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物の投与と同時に、あるいは時間的に近接して生じる、請求項１１０に記載の方法。
第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物の投与後に生じる、請求項１１０又は１１１に記載の方法。
第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物の投与前に生じる、請求項１１０又は１１１に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする治療有効量の少なくとも１つの薬剤を対象に投与することを更に含み、薬剤が、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物と結合する抗原結合断片を含む、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物の投与と同時に、あるいは時間的に近接して生じる、請求項１１４に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物の投与後に生じる、請求項１１４又は１１５に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、請求項１０５に記載の細胞若しくはその子孫、請求項１０６に記載の細胞集団、又は請求項１０７に記載の医薬組成物の投与前に生じる、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与と同時に、又は時間的に近接して生じる、請求項１１４～１１７のいずれか一項に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与後に生じる、請求項１１４～１１８のいずれか一項に記載の方法。
第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与が、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与前に生じる、請求項１１４～１１８のいずれか一項に記載の方法。
第１の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤、及び／又は第２の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤が、細胞傷害性薬剤である、請求項１１０～１２０のいずれか一項に記載の方法。
細胞傷害性薬剤が、抗体－薬物複合体、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞である、請求項１２１に記載の方法。
対象が、修飾遺伝子又はその野生型コピーを発現する細胞に関連する疾患を有する、請求項１０８～１２２のいずれか一項に記載の方法。
対象が、がん幹細胞に関連するがんを有する、請求項１０８～１２３のいずれか一項に記載の方法。
対象が、造血器悪性腫瘍を有する、請求項１０８～１２４のいずれか一項に記載の方法。
対象が、自己免疫疾患を有する、請求項１０８～１２３のいずれか一項に記載の方法。