JP6925663B2

JP6925663B2 - 抗糖化剤

Info

Publication number: JP6925663B2
Application number: JP2020072085A
Authority: JP
Inventors: 怡商; 内沢　秀光; 秀光内沢
Original assignee: 地方独立行政法人青森県産業技術センター
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2021-08-25
Anticipated expiration: 2035-09-03
Also published as: JP2020125319A

Description

本発明は、化粧料や飲食品などで使用されるプロテオグリカンに係り、皮膚のタルミやシワ、ハリの改善等、皮膚の引きしめに有効なプロテオグリカンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮促進剤、抗糖化剤及び皮膚外用剤に関するものである。

加齢に伴い皮膚は弾力性が低下し、タルミやシワの発生等、いわゆる老徴を示す。

皮膚老化予防又は改善剤に関しては、従来、コラーゲンゲルの収縮を促進する薬剤としては、腐植土抽出物（特許文献１）、マルメロ種子抽出物（特許文献２）などが開示されているが、いずれも効果、安全性、安定性、価格等の観点において必ずしも十分であるとはいえなかった。

特開２０１２−１７１９２１号公報特開２０１２−２０６９５７号公報

本発明は、効果、安全性、安定性、価格の面で優れた、コラーゲンゲル収縮促進効果を有するコラーゲンゲル収縮促進剤、抗老化につながる抗糖化作用を有する抗糖化剤、及びこのコラーゲンゲル収縮促進剤や抗糖化剤を皮膚に適用することによって皮膚のタルミやシワを予防又は改善しうる皮膚外用剤を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために、本発明の一つの態様は、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとを１：０．９〜１：１．１のモル比で有し、サケ鼻軟骨から酢酸を用いて抽出した、分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプであるプロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする抗糖化剤であることを要旨とする。

本発明の他の態様は、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとを１：０．９〜１：１．１のモル比で有し、サケ鼻軟骨から酢酸を用いて抽出した、分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプであるプロテオグリカンを０．０１質量％〜１質量％含むことを特徴とする抗糖化剤であることを要旨とする。

本発明の更に他の態様は、（ａ）０．０１質量％〜１質量％のプロテオグリカンと、（ｂ）２０質量％〜９９質量％の水性成分と、（ｃ）０質量％〜８０質量％の油性成分と、（ｄ）０質量％〜２０質量％の界面活性剤と、を含む皮膚外用剤であって、（ｅ）プロテオグリカンが、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとを１：０．９〜１：１．１のモル比で有し、サケ鼻軟骨から酢酸を用いて抽出した、分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプであるプロテオグリカンであることを特徴とする皮膚外用剤であることを要旨とする。

本発明のコラーゲンゲル収縮促進効果を有するコラーゲンゲル収縮促進剤、抗老化につながる抗糖化作用を有する抗糖化剤、及びこのコラーゲンゲル収縮促進剤や抗糖化剤を用いた皮膚外用剤によれば、線維芽細胞コラーゲンマトリックスゲル構造の収縮を促すと共に糖化タンパク質の生成を抑制し、加齢に伴う皮膚の弾力やハリの低下、タルミやシワを予防又は改善することが可能である。

プロテオグリカン添加４８時間後におけるコラーゲンゲル収縮の様子を示す図である。プロテオグリカン添加４８時間後におけるコラーゲンゲル収縮率を示す図である。プロテオグリカン添加３０日後における糖化コラーゲン生成率を示す図である。

以下、実施の形態をより具体的に説明するが、本発明の技術的思想を具体化するための方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、下記のものに特定するものではない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された請求項が規定する技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。

本発明のコラーゲンゲル収縮促進剤は、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンを含む分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプのプロテオグリカンを０．０１質量％〜１質量％含むコラーゲンゲル収縮促進剤を含むものである。又、本発明の抗糖化剤は、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンを含む分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプのプロテオグリカンを０．０１質量％〜１質量％を含むものである。プロテオグリカンはコアタンパク質にコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン糖鎖が結合した糖とタンパク質の複合体であり、コラーゲンやヒアルロン酸等と共に存在する細胞外マトリックスを構成する成分の一つであるが、プロテオグリカンそのものにコラーゲンゲル収縮促進効果や抗糖化作用があるとの報告は全く見られず、新規な知見であると共に食経験のある素材であることから安全性の観点からも極めて有用性は高いと思われる。

プロテオグリカンの原料としては、ウシ、ブタ、ニワトリ、クジラ等の哺乳類や、サケ、サメなどの魚類等の軟骨や皮などがあり、その構造にはアグリカン、バーシカン、デコリンなど様々なタイプが知られているが、本発明が基礎とするプロテオグリカンは、サケの鼻軟骨由来のものであり、より好ましくはサケ鼻軟骨を原料に酢酸を抽出溶媒として用いて得られたアグリカンタイプのものである。その製法をはじめとする詳細については、特許第３７３１１５０号明細書に記載されており、また本発明で用いられるプロテオグリカンは、株式会社角弘プロテオグリカン研究所から「プロテオグリカン」の商品名で市販されている。

本発明に係るプロテオグリカンは、サケ鼻軟骨を原料に酢酸を抽出溶媒として得られたものであるが、その分子量は、標準分子量マーカー（Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｐｕｌｌｕｌａｎ）、昭和電工）を用いた高速液体クロマトグラフにより（カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＧ５０００ＰＷＸＬ７．８×３００,ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎＰＷＸＬ６．０×４０、溶出液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、流速：０．５ｍｌ/ｍｉｎ、カラム温度：４０℃）約５０万と見積もられた。本発明者らの糖鎖工学を専門とする研究者等の経験則によれば、分子量２０万〜２００万程度であれば、同様な効果が得られると推定できる。更に、分子量４０万〜１００万程度のプロテオグリカンであることが好ましい。

本発明に係るプロテオグリカンの成分分析においては、糖組成分析の結果、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンの比は１：０．９乃至１：１．１であった。また、加水分解後、ニンヒドリン法によるアミノ酸分析装置（ＪＬＣ５００／Ｖ、日本電子社製）を用いてアミノ酸組成分析を行った結果、タンパク質含量は６〜７質量％であった。

本発明のコラーゲンゲル収縮促進効果及び抗糖化作用を有する皮膚外用剤は、０．０１質量％〜１質量％のプロテオグリカンと、２０質量％〜９９質量％の水性成分（水、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール等）と、０質量％〜８０質量％の油性成分（ワセリン、スクワラン、ロウ等）と、０質量％〜２０質量％の界面活性剤（アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤）と、を含む。ここで、この皮膚外用剤に含まれるプロテオグリカンは、上述したように、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンを含む分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプである。上記必須成分であるサケ鼻軟骨を原料に酢酸を抽出溶媒として用いて得られたプロテオグリカン以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、紫外線吸収剤、美白剤、各種皮膚栄養剤に加えて、油性成分や水等を必要に応じて適宜配合することができる。また本発明は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に化粧料に広く適用することが可能であり、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、美容液、パックやマスク等、様々な剤型において広く適用することが可能である。またさらには、メーキャップ化粧品としてのファンデーションや、ボディーソープや石けん等のトイレタリー製品、医薬部外品であれば軟膏など、広く適用でき、これらに限定されるものではない。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（サケ鼻軟骨由来酢酸抽出プロテオグリカンのコラーゲンゲル収縮促進効果）
線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルの収縮率を本発明の被験物質の添加時と非添加時で比較し、コラーゲンゲル収縮促進作用を評価した。氷冷下で、コラーゲンＩ−ＰＣ溶液（高研株式会社）を終濃度１ｍｇ／ｍｌ、３×ＤＭＥＭ培地を終濃度１倍、１×ＤＭＥＭ培地で調製した正常ヒト皮膚線維芽細胞の細胞懸濁液１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（終濃度）を泡立てないように穏やかに混合した後、２４ウェルプレートの各ウェルに０．８ｍｌずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化させた。その後、異なる濃度のプロテオグリカン（添加濃度０、２００、４００、６００、８００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地を加え、ウェル壁面からゲルを剥離しコラーゲンゲル収縮を行った。４８時間培養後、コラーゲンゲルの写真を撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪによって画像解析してサンプル添加培養後のコラーゲンゲルの面積を測定した。ゲルの収縮状態を撮影した画像を図１に示す。無添加時のゲル収縮率を対照として、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により５％有意水準で各サンプルのゲル収縮率を比較した。ゲルの収縮率を評価した結果を図２に示す。

コラーゲンゲルの収縮率は次式により算出した。

ゲル収縮率（％）＝１００−サンプル添加４８時間培養後のゲル面積／サンプル添加前のゲル面積×１００

サンプル添加前のコラーゲンゲル面積を１．９ｃｍ^２（ウェル底の直径：１５．６ｍｍ）とした。

図１より明らかなように、プロテオグリカンの濃度依存的にコラーゲンゲルを収縮した。ＩｍａｇｅＪによって画像解析してコラーゲンゲルの面積を定量した結果を図２に示す。無添加コントロール群と比較した結果、プロテオグリカンの濃度依存的に有意なコラーゲンゲル収縮効果が認められた。したがって、プロテオグリカンには皮膚のシワやタルミを予防し、改善する効果があると考えられ、化粧品への応用が可能である。

（サケ鼻軟骨由来酢酸抽出プロテオグリカンの抗糖化効果）
コラーゲン抗糖化アッセイキット（コスモ・バイオ）を用い、本発明に係るプロテオグリカン添加時と非添加時を比較検討することで、抗糖化作用を評価した。氷冷下、９６ウェルプレートに中和したコラーゲン溶液を５０μｌ／ウェルに分注し、３７℃インキュベーターで一晩静置しゲル化させた。コラーゲンゲル上に緩衝液もしくはフルクトース溶液を５０μｌ／ウェル重層した。その後、アミノグアニジン溶液（２２μｇ／ｍｌ）を陽性コントロールとして、異なる濃度のプロテオグリカン（０、１６０、４００、８００μｇ／ｍｌ）を添加し、プレートミキサーで攪拌後、３７℃インキュベーターで３０日間静置した後、蛍光強度（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）を測定し、各蛍光強度から糖化コラーゲン生成率を求めた。

プロテオグリカンの糖化コラーゲン生成率を図３に示す。無添加コントロール群と比較した結果、プロテオグリカンにおいて濃度依存的に有意な抗糖化効果が認められた。したがって、プロテオグリカンには皮膚の老化を予防する効果があると考えられ、化粧品への応用が可能である。

老化により皮膚の弾力性やハリが低下し、タルミやシワの原因となるが、コラーゲンゲル収縮促進効果には、皮膚を引き締める作用が期待される。また抗糖化は、抗老化につながりアンチエイジング効果が期待されるものである。本発明の皮膚外用剤は、コラーゲンゲル収縮促進効果及び抗糖化作用を有し、それ自体が皮膚の改善、タルミ予防又は改善、皮膚引き締めに有効であり、あるいは皮膚老化予防又は改善のための化粧品、医薬品外品、医薬品であってもよく、化粧品、医薬品外品、医薬品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。

Claims

グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとを１：０．９〜１：１．１のモル比で有し、サケ鼻軟骨から酢酸を用いて抽出した、分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプであるプロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする抗糖化剤。
グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとを１：０．９〜１：１．１のモル比で有し、サケ鼻軟骨から酢酸を用いて抽出した、分子量２０万〜２００万のアグリカンタイプであるプロテオグリカン
を０．０１質量％〜１質量％含むことを特徴とする抗糖化剤。
前記プロテオグリカンのニンヒドリン法でのアミノ酸組成分析によるタンパク質含量が６〜７質量％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗糖化剤。
前記プロテオグリカンを約０．０８質量％含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗糖化剤。
前記プロテオグリカンのみを有効成分とすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗糖化剤。