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JP6908964B2 - Ｐｓｍａリガンドコンジュゲートによる併用療法 - Google Patents

Ｐｓｍａリガンドコンジュゲートによる併用療法 Download PDF

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Description

前立腺がんは、米国の男性において、最もよく見られる悪性腫瘍であり、主要ながん死亡原因の第２位である（非特許文献１）。限局性前立腺がんは、通常は、外科手術または放射線で治療され、再発性疾患は、アンドロゲン除去で一時的に制御することができる（非特許文献２）。しかしながら、ほぼすべての前立腺がんは、最終的には、ホルモン抵抗性になり、その後急速に進行する（非特許文献３）。ホルモン抵抗性またはアンドロゲン非依存性前立腺がんは、大体において、従来の化学療法に抵抗性であることが判明している。緩和ケアを除外すると、認可された唯一の化学療法は、プレドニゾンと併用したドセタキセルであり、より最近では、ＦＤＡが認可したカバジタキセル（Ｊｅｖｔａｎａ（登録商標））であり、これらは、中等度（２．４か月）の延命効果を与える（非特許文献４；非特許文献５）。
米国特許第５，１６２，５０４号明細書 米国特許第６，１０７，０９０号明細書 米国特許第６，６４９，１６３号明細書 米国特許第６，９６２，９８１号明細書 米国特許第５，５９１，６６９号明細書 米国特許第５，５９８，３６９号明細書 米国特許第５，５４５，８０６号明細書 米国特許第５，５４５，８０７号明細書 米国特許第６，１５０，５８４号明細書 米国特許第８，１１４，９６５号明細書 米国特許第８，４６５，７２５号明細書 米国特許第８，４８７，１２９号明細書 国際公開第２０１０／００５７２３号パンフレット 米国特許第５，１２４，４７１号明細書 米国特許第５，２８６，８５０号明細書 米国特許第５，４３４，２８７号明細書 米国特許第５，７５６，８２５号明細書 米国特許第６，０３４，０６５号明細書 米国特許第６，２３９，１０４号明細書 米国特許第５，９９４，２９２号明細書 米国特許出願公開第２００７−０１６０６１７−Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２０１１−０２５０２１６−Ａ号明細書 米国特許第６，２１４，３４５号明細書
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本発明は、少なくとも一部は、抗アンドロゲンと、抗がん剤または細胞傷害性薬剤（本明細書では、ＰＳＭＡリガンドに結合している場合、それぞれ「ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲート」または「ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲート」と呼ぶ）などの治療剤に結合した前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンド（本明細書では「ＰＳＭＡリガンドコンジュゲート」と呼ぶ）とが、相乗的に作用してＰＳＭＡ発現がん細胞の増殖を阻害することができるという驚くべき発見に関する。予想外にも、この相乗作用は、アンドロゲン依存性細胞およびアンドロゲン非依存性細胞の両方に生じる。さらに、ｍＴＯＲインヒビターとＰＳＭＡリガンドコンジュゲートもまた、相乗的に作用して、特にアンドロゲン非依存性細胞など、ＰＳＭＡ発現がん細胞の増殖を阻害することが発見された。さらに、プレドニゾンとＰＳＭＡリガンドコンジュゲートもまた、併用で相乗的に作用することが発見された。このようにして、ＰＳＭＡ発現細胞（例えば、前立腺がん細胞などのがん細胞）の増殖阻害または死滅を目的とする、またアンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現細胞など、ＰＳＭＡを発現することができる細胞をアンドロゲン療法に対して感作または再感作することを目的とする、方法、組成物、およびキットを本明細書に提供する。
本開示の一部の態様は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現がん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることと、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることとを含むことができる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物は抗アンドロゲンである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７を遮断する。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７Ａ１を遮断する。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンはアンドロゲン受容体アンタゴニストである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、ガレテロン、またはオルテロネルである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンはエンザルタミドまたはアビラテロンである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、ＰＳＭＡ発現をアップレギュレートするのに有効な量である。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンなど、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとは同時である。一部の実施形態では、抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとは逐次的である。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップは、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップの前である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップは、抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させたステップの１週間以内に行われる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも３日間接触させる。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも７日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも１４日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも２１日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも２８日間接触させる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、アンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞は、抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させたステップの後に、抗アンドロゲン療法に対して再感作される。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は腫瘍由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞はＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞である。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞はＰＳＭＡ発現の非前立腺がん細胞である。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、非前立腺がんまたは非前立腺腫瘍の新生血管由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は被験体由来である。一部の実施形態では、被験体は、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上のタキサンによる前化学療法を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの前処置にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの治療にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、以前に細胞傷害性化学療法を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、エンザルタミドよる前処置もアビラテロンによる前処置も受けたことがない。一部の実施形態では、エンザルタミドまたはアビラテロンなどの抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない被験体は、転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する被験体である。一部の実施形態では、被験体は、本明細書に記載の任意の被験体である。
本開示の他の態様は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現がん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、ｍＴＯＲインヒビターをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることと、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることとを含むことができる。
一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンである。
一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、ＰＳＭＡ発現をアップレギュレートするのに有効な量である。
一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとは同時である。
一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとは逐次的である。
一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップは、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップの前である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、ｍＴＯＲインヒビターに少なくとも７日間接触させる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、アンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞は、ｍＴＯＲインヒビターをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させたステップの後に、抗アンドロゲン療法に対して再感作される。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は腫瘍由来であってもよい。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞はＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞である。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞はＰＳＭＡ発現の非前立腺がん細胞である。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、非前立腺がんまたは非前立腺腫瘍の新生血管由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は被験体由来である。一部の実施形態では、被験体は、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上のタキサンによる前化学療法を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの前処置にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの治療にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、以前に細胞傷害性化学療法を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、エンザルタミドによる前処置もアビラテロンによる前処置も受けたことがない。一部の実施形態では、エンザルタミドまたはアビラテロンなどの抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない被験体は、転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する被験体である。一部の実施形態では、被験体は、本明細書に記載の任意の被験体である。
本開示のさらに他の態様では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現がん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、プレドニゾンをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることと、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることとを含むことができる。一部の実施形態では、この方法は、抗アンドロゲンなど、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることをさらに含む。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７を遮断する。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７Ａ１を遮断する。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンはアンドロゲン受容体アンタゴニストである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、ガレテロン、またはオルテロネルである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンはエンザルタミドまたはアビラテロンである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、ＰＳＭＡ発現をアップレギュレートするのに有効な量である。
一部の実施形態では、プレドニゾン、および／または抗アンドロゲンなど、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとは同時である。一部の実施形態では、プレドニゾン、および／または抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとは逐次的である。
一部の実施形態では、プレドニゾン、および／または抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップは、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップの前である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップは、抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させたステップの１週間以内に行われる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも３日間接触させる。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも７日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも１４日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも２１日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンなどの化合物に少なくとも２８日間接触させる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、アンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞は、抗アンドロゲンなどの化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させたステップの後に、抗アンドロゲン療法に対して再感作される。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は腫瘍由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞はＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞である。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞はＰＳＭＡ発現の非前立腺がん細胞である。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、非前立腺がんまたは非前立腺腫瘍の新生血管由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は被験体由来である。一部の実施形態では、被験体は、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上のタキサンによる前化学療法を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの前処置にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの治療にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、以前に細胞傷害性化学療法を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、エンザルタミドによる前処置もアビラテロンによる前処置も受けたことがない。一部の実施形態では、エンザルタミドまたはアビラテロンなどの抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない被験体は、転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する被験体である。一部の実施形態では、被験体は、本明細書に記載の任意の被験体である。
本開示のさらに他の態様は、被験体のＰＳＭＡ発現細胞への細胞傷害性薬剤の特異的送達方法を提供する。この方法は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を被験体に投与することと、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを被験体に投与することとを含むことができる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物は抗アンドロゲンである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７を遮断する。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７Ａ１を遮断する。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンはアンドロゲン受容体アンタゴニストである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、ガレテロン、またはオルテロネルである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンはエンザルタミドまたはアビラテロンである。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物はｍＴＯＲインヒビターである。一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンである。
一部の実施形態では、化合物を投与するステップと、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを投与するステップとは同時である。他の実施形態では、化合物を投与するステップと、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを投与するステップとは逐次的である。一部の実施形態では、化合物を投与するステップは、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを投与するステップの前である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを投与するステップは、化合物を投与したステップの１週間以内に行われる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞を、化合物に少なくとも３日間接触させる。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞を、化合物に少なくとも７日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞を、化合物に少なくとも１４日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞を、化合物に少なくとも２１日間接触させる。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞を、化合物に少なくとも２８日間接触させる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞は、アンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞は、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
一部の実施形態では、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現細胞は、化合物を投与したステップの後に、抗アンドロゲン療法に対して再感作される。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞は腫瘍由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞はＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞である。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞はＰＳＭＡ発現の非前立腺がん細胞である。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞は、非前立腺がんまたは非前立腺腫瘍の新生血管由来である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は被験体由来である。一部の実施形態では、被験体は、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上のタキサンによる前化学療法を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの前処置にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの治療にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、以前に細胞傷害性化学療法を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、エンザルタミドによる前処置もアビラテロンによる前処置も受けたことがない。一部の実施形態では、エンザルタミドまたはアビラテロンなどの抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない被験体は、転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する被験体である。一部の実施形態では、被験体は、本明細書に記載の任意の被験体である。
本開示のさらに他の態様は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物およびＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートまたはＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを提供する。さらに他の態様では、プレドニゾンおよび本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物は抗アンドロゲンである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７を遮断する。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７Ａ１を遮断する。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンはアンドロゲン受容体アンタゴニストである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、ガレテロン、またはオルテロネルである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンはエンザルタミドまたはアビラテロンである。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物はｍＴＯＲインヒビターである。一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンである。
一部の実施形態では、組成物は薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤をさらに含む。
本開示のさらに他の態様は、ＰＳＭＡ発現細胞においてＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を含有する容器と、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートまたはＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを含有する容器とを含み得るキットを提供する。他の態様では、プレドニゾンを含有する容器と、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを含有する容器とを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を含む容器をさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物は抗アンドロゲンである。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７を遮断する。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは酵素シトクロムＣＹＰ１７Ａ１を遮断する。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンはアンドロゲン受容体アンタゴニストである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、ガレテロン、またはオルテロネルである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンはエンザルタミドまたはアビラテロンである。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物はｍＴＯＲインヒビターである。一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンである。
一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤をさらに含む。
一部の実施形態では、化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、水性媒体中にある。他の実施形態では、化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、凍結乾燥されている。
一部の実施形態では、キットは希釈剤をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを再構成するための説明書をさらに含む。他の実施形態では、キットは、プレドニゾンおよび／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／または化合物（そのようなキットが化合物をさらに含む場合）を再構成するための説明書をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを併用するための説明書をさらに含む。他の実施形態では、キットは、プレドニゾンおよび／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを併用するための説明書をさらに含む。さらに他の実施形態では、キットは、プレドニゾンを含む化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲート（そのようなキットが化合物をさらに含む場合）を併用するための説明書をさらに含む。
一部の態様では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現がん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、プレドニゾンをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることと、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させることとを含む。これらの方法の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、本明細書に提供する、任意の細胞であってよい。他の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、本明細書に提供する、任意のＰＳＭＡリガンドコンジュゲートである。他の態様では、プレドニゾンおよびＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを含む組成物を提供する。さらに別の態様では、プレドニゾンを含有する容器と、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを含有する容器とを含むキットを提供する。
これらの任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、コンジュゲートのＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。そのような実施形態では、ＰＳＭＡリガンドは、本明細書に提供する任意の抗体または抗原結合断片である。
これらの任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、コンジュゲートのＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡに特異的に結合する小分子リガンドを含む。そのような実施形態では、ＰＳＭＡリガンドは、本明細書に提供する任意の小分子リガンドである。
これらの任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉ１２４Ｂｒ７５、Ｂｒ７７、およびＦ１８からなる群から選択される細胞傷害性放射性核種にコンジュゲートしたＭＩＰ−１０９５またはＭＩＰ−１０７２を含む。
これらの任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの抗がん剤または細胞傷害性薬剤は、本明細書に提供する任意の抗がん剤または細胞傷害性薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は、アウリスタチン、ツブリシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、カリチアマイシン、コルヒチン、イスピネシブ、コンブレスタチンＡ４、マイタンシノイドＤＭ１、マイタンシノイドＤＭ４、ドキソルビシン、または細胞傷害性放射性核種を含む。一部の実施形態では、アウリスタチンは、モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンを含む。
これらの任意の方法の実施形態の一部では、方法は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をＰＳＭＡ発現細胞に接触させることをさらに含む。これらの任意の組成物またはキットの実施形態の一部では、組成物またはキットは、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物をさらに含む。一部の実施形態では、化合物は、抗アンドロゲンまたはｍＴＯＲインヒビターである。そのような実施形態では、抗アンドロゲンは、本明細書に提供する任意の抗アンドロゲンであってよい。一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、本明細書に提供する任意のｍＴＯＲインヒビターである。
これらの任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、抗アンドロゲンは、アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、ガレテロン、またはオルテロネルである。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、エンザルタミド、アビラテロン、またはＡＲＮ ５０９である。
提供する任意の方法の実施形態の一部では、接触させるステップは同時である。他の実施形態では、接触させるステップは逐次的である。一部の実施形態では、プレドニゾンおよび／または化合物をＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップは、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップの前である。
これらの任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、アンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現がん細胞を含む。
これらの任意の方法の実施形態の一部では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は被験体由来である。そのような実施形態では、被験体は、本明細書に提供する任意の被験体であってよい。
前述の任意の方法、組成物、またはキットの実施形態の一部では、抗アンドロゲンは、エンザルタミド、アビラテロン、またはＡＲＮ ５０９であり、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートはＰＳＭＡ ＡＤＣである。
前述の任意の組成物またはキットの実施形態の一部では、組成物またはキットは、薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤をさらに含む。
前述の任意のキットの実施形態の一部では、キットの任意の成分またはすべての成分は、水性媒体中にある。前述の任意のキットの実施形態の一部では、キットの任意の成分またはすべての成分は、凍結乾燥されている。
前述の任意のキットの実施形態の一部では、キットは、キットの任意の成分またはすべての成分を再構成するための説明書をさらに含む。前述の任意のキットの実施形態の一部では、キットは、キットの任意の成分またはすべての成分を併用するための説明書を含む。
前述の任意の組成物またはキットの実施形態の一部では、組成物またはキットは希釈剤をさらに含む。
前述の任意の態様または実施形態では、コンジュゲートのＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。一実施形態では、ＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡの細胞外部分に結合する抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡタンパク質二量体に結合する抗体またはその抗原結合断片である。さらに別の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡタンパク質単量体ではなく、ＰＳＭＡタンパク質二量体に優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡタンパク質単量体と比較して、ＰＳＭＡタンパク質二量体に、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の親和性で結合する。さらに別の実施形態では、ＰＳＭＡタンパク質二量体およびＰＳＭＡタンパク質単量体は、天然コンフォメーションなどの非変性形態で存在する。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ ３．７、ＰＳＭＡ ３．８、ＰＳＭＡ ３．９、ＰＳＭＡ ３．１１、ＰＳＭＡ ５．４、ＰＳＭＡ ７．１、ＰＳＭＡ ７．３、ＰＳＭＡ １０．３、ＰＳＭＡ １．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１からなる群から選択される抗体、またはそれらの抗原結合断片であり得る。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１５として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の３つの相補性決定領域と、（ｉｉ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域とを含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の３つの相補性決定領域と、（ｉｉ）配列番号２１として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域とを含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の３つの相補性決定領域と、（ｉｉ）配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域とを含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の３つの相補性決定領域と、（ｉｉ）配列番号２９として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域とを含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の３つの相補性決定領域と、（ｉｉ）配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域とを含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体ＰＳＭＡ １０．３、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７、またはそれらの抗原結合断片であり得る。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３、もしくはＪ５９１、またはＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２１０１、ＨＢ−１２１０９、ＨＢ−１２１２７、もしくはＨＢ−１２１２６のハイブリドーマにより産生される抗体、あるいはそれらの抗原結合断片であり得る。
前述の任意の態様または実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０６０（３Ｆ５．４Ｇ６）、ＨＢ１２３０９（３Ｄ７−１．１）、ＨＢ１２３１０（４Ｅ１０−１．１４）、ＨＢ１２４８９（１Ｇ３）、ＨＢ１２４９５（１Ｇ９）、ＨＢ１２４９０（２Ｃ７）、ＨＢ１２４９４（３Ｃ４）、ＨＢ１２４９１（３Ｃ６）、ＨＢ１２４８４（３Ｃ９）、ＨＢ１２４８６（３Ｅ６）、ＨＢ１２４８８（３Ｅ１１）、ＨＢ１２４８５（３Ｇ６）、ＨＢ１２４９３（４Ｄ４）、ＨＢ１２４８７（４Ｄ８）、ＨＢ１２４９２（４Ｃ８Ｂ９）、ＨＢ１２６６４（３Ｆ６）、ＨＢ１２６７８（２Ｅ４）、ＨＢ１２６６５（３Ｃ２）、ＨＢ１２６７２（２Ｄ４）、ＨＢ１２６６０（４Ｃ８Ｇ８）、ＨＢ１２６７５（２Ｃ４）、ＨＢ１２６６３（４Ｃ１１）、ＨＢ１２６６１（１Ｄ１１）、ＨＢ１２６６７（４Ｅ８）、ＨＢ１２６７４（２Ｇ５）、ＨＢ１２６２０（４Ｅ６）、ＨＢ１２６７７（１Ｆ４）、ＨＢ１２６６６（２Ｅ３）、ＨＢ１２６６２（３Ｄ８）、ＨＢ１２６６８（４Ｆ８）、ＨＢ１２６７３（３Ｄ２）、ＨＢ１２６７６（１Ｇ７）、ＨＢ１２６６９（３Ｄ４）、ＨＢ１２６７９（５Ｇ１０）、もしくはＨＢ１２６７１（５Ｅ９）のハイブリドーマにより産生される抗体、またはそれらの抗原結合断片であり得る。
前述の任意の態様または実施形態では、コンジュゲートのＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡに特異的に結合する小分子リガンドを含むことができる。一実施形態では、小分子リガンドは、ＰＳＭＡの酵素部位に結合するかまたはそれを阻害する。特定の実施形態では、小分子リガンドは、ＰＳＭＡ上のグルタメートカルボキシペプチダーゼＩＩ（ＣＣＰＩＩ）部位に結合するかまたはそれを阻害する。
前述の任意の態様または実施形態では、小分子リガンドは、ＭＩＰ−１０９５、ＭＩＰ−１０７２、ＧＬ２、またはＤＵＰＡを含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートは、ＥＣ１０６９またはＥＣ１７１９を含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲートは、ＢＩＮＤ−０１４を含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉ１２４Ｂｒ７５、Ｂｒ７７、およびＦ１８からなる群から選択される細胞傷害性放射性核種にコンジュゲートしたＭＩＰ−１０９５またはＭＩＰ−１０７２を含む。
前述の任意の態様または実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、１２３Ｉ−ＭＩＰ−１０９５または１２３Ｉ−ＭＩＰ−１０７２を含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、抗がん剤は、アウリスタチン、ツブリシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、カリチアマイシン、コルヒチン、イスピネシブ、コンブレスタチンＡ４、マイタンシノイドＤＭ１、マイタンシノイドＤＭ４、ドキソルビシン、または細胞傷害性放射性核種を含むことができる。
前述の任意の態様または実施形態では、アウリスタチンは、モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンを含むことができる。
提供する任意の方法の実施形態の一部では、被験体は、抗アンドロゲンによる治療を受けて、抗アンドロゲン療法に対する感受性をまったく経験したことがないか、または最小限の感受性しか経験したことがない。提供する任意の方法の実施形態の一部では、被験体は、抗アンドロゲン療法に対する感受性の喪失を経験したことがある。抗アンドロゲン療法に対して感受性のある被験体は、循環がん細胞数もしくは腫瘍サイズの減少などのがん細胞数の減少、またはがんに関連した症候の軽減など、被験体のがんの評価可能な縮小を経験する被験体である。抗アンドロゲン療法に対する感受性は、例えば、治療後の被験体のがん細胞の増殖レベルを決定することにより測定することができ、一部の実施形態では、治療前のがん細胞の増殖レベルと比較することができる。抗アンドロゲン療法に対する感受性は、抗アンドロゲンによる治療の経過中に決定することができ、被験体のがんの縮小レベルがもはや評価可能なほど変化しないか、または被験体ががんの進行の望ましくない増強を経験する場合、被験体は、抗アンドロゲン療法に対する感受性の喪失を経験したと見なすことができる。一部の実施形態では、被験体のがんの増大は、がん細胞数もしくは腫瘍サイズの増加またはがんに関連した症候の増加を指す。抗アンドロゲン療法に対する感受性は、臨床医によりルーチン的な方法を使用して決定することができる。
本明細書に提供する任意の方法の実施形態では、被験体は、抗アンドロゲン療法に対してまったく感受性がないか、または最小限の感受性しかない被験体であり得る。加えて、本明細書に提供する任意の方法の実施形態では、被験体は、抗アンドロゲン療法に対する感受性の喪失を経験したことがある被験体である。本明細書に提供する任意の方法および組成物は、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートと同時にまたは逐次的に投与される場合の抗アンドロゲンによる治療に対して、そのような被験体を感作または再感作するために使用することができる。
本明細書に提供する任意の方法は、一部の実施形態では、抗アンドロゲン療法に対してまったく感受性がないか、もしくは最小限の感受性しかない被験体または抗アンドロゲン療法に対する感受性の喪失を経験したことがある被験体を同定するステップを含むことができる。本明細書に提供する任意の方法は、一部の実施形態では、抗アンドロゲンに対する被験体の感受性レベルを評価するステップを含むことができる。本明細書に提供する任意の方法は、一部の実施形態では、抗アンドロゲンに対する感受性が喪失されるまで抗アンドロゲンを投与するステップと、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートと同時にまたは逐次的に抗アンドロゲンを投与するステップとを含むことができる。
本明細書に提供する任意の方法は、被験体のがんの進行を評価するステップを含むことができる。進行はいくつかの方法で評価することができる。一部の実施形態では、進行は以下のいずれか１種または２種以上により評価される：ＰＳＡレベルの決定、骨転移の評価、および計測可能な疾患の評価。一部の実施形態では、骨転移の進行は、骨スキャン（ＣＴスキャン、ＭＲＩ）上での２つ以上の新しい骨病変の出現またはＸ線検査での新しい病変の出現である。進行はまた、ＲＥＣＩＳＴにより決定することができる（非特許文献６）。他の実施形態では、骨痛などの疼痛の増大がある場合に、がんの進行が起こっている。本明細書に提供する任意の方法では、進行の評価は、前述の任意の１種または２種以上の評価を含むことができる。
本明細書に提供する任意の方法の実施形態の一部では、ＰＳＭＡ発現がん細胞は被験体由来である。一部の実施形態では、被験体は、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上のタキサンによる前化学療法を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの前処置にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによるものなどの治療にもかかわらず進行し始めている前立腺がんを有する。一部の実施形態では、被験体は、以前に細胞傷害性化学療法を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、エンザルタミドによる前処置もアビラテロンによる前処置も受けたことがない。一部の実施形態では、エンザルタミドまたはアビラテロンなどの抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがない被験体は、転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する被験体である。一部の実施形態では、被験体は、本明細書に記載の任意の被験体である。
図１Ａは、ＰＳＭＡの発現を増大させる抗アンドロゲンの２つの例であるエンザルタミドおよびアビラテロンの構造を示す概略図であり、図１Ｂは、ＡＲＮ−５０９（ＭＷ＝４７７．４３）の化学構造を示す概略図であり、図１Ｃは、ガレテロン（ＴＯＫ−００１）（ＭＷ＝３８８．５５）の化学構造を示す概略図であり、図１Ｄは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（この実施形態では平均４つのＭＭＡＥ分子）にコンジュゲートしたＰＳＭＡ抗体（ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲート（ＰＳＭＡ ＡＤＣ））を含む、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの構造を示す概略図である。 図２は、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとエンザルタミド、アビラテロン、またはラパマイシンとを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図２Ａ）およびＣ４−２細胞（図２Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、３〜７回の独立したアッセイの平均値を表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。０と有意に異なる（Ｐ＜０．０５）Ｂｌｉｓｓパラメーターは、太文字および赤枠により強調し、対応するパーセント阻害値は、黒塗りかつ白文字により強調する。ＮＡ＝適用可能でない。図２Ｃは、漸増するエンザルタミド濃度の関数としてのＰＳＭＡ発現および細胞増殖阻害の増大を示すグラフである。 図３は、微小管インヒビターと抗アンドロゲンとを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図３Ａ）およびＣ４−２細胞（図３Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、３〜５回の独立したアッセイの平均値を表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。０と有意に異なる（Ｐ＜０．０５）Ｂｌｉｓｓパラメーターは、太文字および赤枠により強調し、対応するパーセント阻害値は、黒塗りかつ白文字により強調する。ＮＡ＝適用可能でない。 図４は、ラパマイシンとＭＭＡＥまたはエンザルタミドとを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図４Ａ）およびＣ４−２細胞（図４Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、３回の独立したアッセイの平均値を表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。０とは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）Ｂｌｉｓｓパラメーターは、太文字および赤枠により強調し、対応するパーセント阻害値は、黒塗りかつ白文字により強調する。ＮＡ＝適用可能でない。 図５は、ＰＳＭＡモノクローナル抗体とエンザルタミド、アビラテロン、またはラパマイシンとを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図５Ａ）およびＣ４−２細胞（図５Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、２回または３回の独立したアッセイの平均値を表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。Ｂｌｉｓｓパラメーターは、０と有意には異なっていなかった（Ｐ＜０．０５）。ＮＡ＝適用可能でない。 図６は、ＰＳＭＡ発現のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。種々の濃度のエンザルタミド、アビラテロン、もしくラパマイシンで７日間処理したか（図６Ａ〜Ｆ）または１μＭのエンザルタミドで種々の回数処理した（図６Ｇ）細胞について、ＰＳＭＡ発現をフローサイトメトリーにより測定した。図６Ａ〜Ｄでは、抗ＰＳＭＡ染色を、緑色（０．１２５μＭ）、ピンク色（０．５μＭ）、シアン色（１μＭ）、およびオレンジ色（５μＭ）のように、抗アンドロゲン濃度の関数として示す。図６Ｅ〜Ｆでは、緑色、ピンク色、およびシアン色のヒストグラムはそれぞれ、１、１０、および１００ｎＭのラパマイシン濃度を表す。紫色で塗りつぶされたヒストグラムは、未処理細胞を示し、青線は、アイソタイプ対照抗体によるバックグラウンド染色を示す。図６Ｇは、エンザルタミド処理Ｃ４−２細胞のＰＳＭＡ発現の時間経過を示すグラフである。縦棒は、左軸上の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示し、赤線は、右軸上の、未処理細胞と比較した、処理細胞におけるＰＳＭＡ発現の増加倍率を表す。（ＰＲ＝エンザルタミド除去後の日数。） 図７は、分析前に、未処理（Ｕｎｔ）のままであるか、またはエンザルタミド（Ｅｎｚａ）、アビラテロン（Ａｂｉ）、もしくはラパマイシン（Ｒａｐａ）で７日間処理したＬＮＣａＰ細胞（図７Ａ）またはＣ４−２細胞（図７Ｂ）の全細胞抽出物のウエスタンブロットタンパク質発現分析を示す写真である。 図８は、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとプレドニゾンまたはＡｋｔ、ＰＩ３Ｋ、もしくはキネシン紡錘体タンパク質のインヒビター（それぞれ、インヒビターＭＫ−２２０６、６ＤＣ−０９４１、およびＳＢ７４３９２１）とを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図８Ａ）およびＣ４−２細胞（図８Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、４回または５回の独立したアッセイの平均値を表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。０とは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）Ｂｌｉｓｓパラメーターは、太文字および赤枠により強調し、対応するパーセント阻害値は、黒塗りかつ白文字により強調する。ＮＡ＝適用可能でない。 図９は、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとＡＲＮ−５０９（Ａｒａｇｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、アンドロゲン受容体インヒビター）およびＴＯＫ−００１（Ｔｏｋａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＣＹＰ１７インヒビターおよびアンドロゲン受容体アンタゴニスト）とを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図９Ａ）およびＣ４−２細胞（図９Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、１回の独立したアッセイを表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。ＮＡ＝適用可能でない。 図１０は、Ｄ−γ−Ｇｌｕ Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｃｙｓリンカーについての化学構造を示す概略図である。 図１１は、ＰＳＭＡ小分子リガンドコンジュゲートであるＥＣ１０６９とエンザルタミドとを併用して接触させたＬＮＣａＰ細胞（図１１Ａ）およびＣ４−２細胞（図１１Ｂ）についてのパーセント細胞増殖阻害値およびＢｌｉｓｓ差を示す表である。各データポイントは、１回の独立したアッセイを表す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。ＮＡ＝適用可能でない。 図１２は、抗がん剤であるツブリシンを含むＰＳＭＡ小分子リガンドコンジュゲート（本明細書ではＥＣ１０６９とも呼ぶ）の構造を示す概略図である。 図１３は、ＰＳＭＡ ＡＤＣと、ＡＲＮ−５０９（Ａｒａｇｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、アンドロゲン受容体インヒビター）およびＴＯＫ−００１（Ｔｏｋａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＣＹＰ１７インヒビターおよびアンドロゲン受容体アンタゴニスト）との併用からのデータを示す表である。パーセント阻害値およびＢｌｉｓｓ差を、ＬＮＣａＰ細胞（図１３Ａ）およびＣ４−２細胞（図１３Ｂ）について示す。Ｂｌｉｓｓ差を、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となる値のヒートマップにより描写する。ＮＡ＝適用可能でない。ＡＲＮ−５０９およびＴＯＫ−００１は、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。 図１４は、増殖およびＰＳＭＡ発現に対するエンザルタミドの効果を示すグラフである。これらのデータは、ＬＮＣａＰ細胞では同様な濃度で増殖およびＰＳＭＡ発現に対する効果が現れる（しかし、Ｃ４−２細胞では分離している）ことを示す。 図１５は、エンザルタミドによる、ＰＳＭＡ発現の迅速、顕著でかつ用量依存的な増大を示すグラフである。この効果は、臨床的に意味のある用量範囲で示され、アンドロゲン依存性細胞（ＬＮＣａＰ）およびアンドロゲン非依存性細胞（Ｃ４−２）に対して認められた。 図１６は、さらに、エンザルタミドによるＰＳＭＡ発現の増大を示すグラフである。ＰＳＭＡ発現は３〜４週間曝露の後に最大となるが、エンザルタミド除去後１週間で基礎レベルに戻った。 図１７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、エンザルタミドとＰＳＭＡ ＡＤＣとの相乗的な抗がん活性を示す表である。結果は各条件につき４回の反復平均である。太字の値は、統計的に有意な相乗作用を示す。 図１８は、ＰＳＭＡ ＡＤＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでエンザルタミドと相乗作用を示すことを示す図である。相乗作用は、アンドロゲン依存性細胞とアンドロゲン非依存性細胞の両方で示され、ＰＳＭＡ発現の増大と関連していた。驚くべきことに、エンザルタミド単独では最小限の抗腫瘍活性しかない場合でも、相乗作用が観察された。 図１９（表２）は、異なる薬物の組み合せに対して観察された相乗性の概要を示す。
本発明は、少なくとも部分的には、前立腺がん、具体的には進行性の転移性前立腺がんなどのＰＳＭＡ発現がんの併用治療に関する。この治療は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）を標的とする薬剤と併用した、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与を含むことができる。本発明は、少なくとも部分的には、抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミドまたはアビラテロン）がＰＳＭＡ発現を顕著にかつ可逆的に増大させて、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの活性を増強するという驚くべき発見に基づいている。アンドロゲン非依存性細胞では、ＰＳＭＡ発現およびコンジュゲート活性に対する効果は相乗的であり、抗アンドロゲンのいかなる抗増殖効果とも分離されていた。腫瘍細胞増殖の相乗的な阻害は、抗アンドロゲン単独による処理に抵抗性である細胞においても、抗アンドロゲンによるＰＳＭＡ発現のアップレギュレーションと関連していた。同時処理は、実際において、抗アンドロゲン療法に対して細胞を再感作することができる。
エンザルタミドおよびアビラテロンは両方とも、一連の濃度範囲にわたって、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとの強力な相乗作用を示した。相乗作用は、抗アンドロゲン単独による処理に対して反応する細胞においても無反応の細胞においても観察された。アンドロゲン依存性ＬＮＣａＰ細胞では、抗アンドロゲンの薬理効果（例えば、抗増殖効果、遺伝子発現に対する効果、およびＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとの相乗作用）が、臨床に関連する濃度範囲と同様の範囲にわたって観察された。アンドロゲン非依存性Ｃ４−２細胞では、遺伝子発現および相乗作用に対する効果は、エンザルタミドまたはアビラテロンのいかなる評価可能な抗増殖活性とも分離されていた。したがって、これらの抗アンドロゲンは、Ｃ４−２細胞に対して薬理学的に活性なままである。しかしながら、これらの細胞は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遮断薬の存在し続ける中で、それらが増殖することを可能にする代償性の生存機序を取り入れている。
抗アンドロゲンとコンジュゲート成分（すなわち、遊離ＭＭＡＥおよび非改変ＰＳＭＡ ｍＡｂ）の間では、相乗作用はほとんど乃至まったく観察されなかった。抗アンドロゲンと併用した場合、遊離ＭＭＡＥは相加効果から弱い相乗効果を示した。抗アンドロゲンとドセタキセルの間には中程度の相乗作用があった。非改変ｍＡｂは、単独でも抗アンドロゲンとの併用でも抗増殖活性を示さなかった。したがって、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートで観察された強力な相乗作用は、コンジュゲートに特有であり、その成分の通過効果でも、クラスとして微小管インヒビターに一般化できるものでもない。
ＰＳＭＡ発現は、エンザルタミドによる７日間処理後に２倍、また２１日後に４倍高くなった。エンザルタミドまたはアビラテロンによるＰＳＭＡアップレギュレーションの大きさは、一連のホルモン、サイトカイン、および増殖因子が枯渇したチャコール処理血清により誘導されるものに近似していた（非特許文献７）。これらの発見は、本発明者らのシステムにおける、ほぼ最大のアンドロゲン抑制を示唆する。発現の時間経過をエンザルタミド処理細胞でモニターした。ＰＳＭＡ発現は３週間にわたる継続処理と共に増大したが、その後エンザルタミドを除去すると、ベースラインに迅速に戻った。これらの発見は、強力な抗アンドロゲンとＰＳＭＡ標的療法の併用および逐次的用法にとって意味がある。
加えて、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、ＰＳＭＡ発現の増大および微小管機能の破壊を含む多様な機序を介して、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路インヒビターと相乗作用を示した。Ｃ４−２細胞では、ラパマイシンは最小限の単剤活性しか示さなかったが、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの活性を増強し、ＰＩ３Ｋ経路活性化が、Ｃ４−２細胞における、ＡＤＣ処理に対する適応反応であることが示唆される。したがって、本発明はまた、部分的には、ラパマイシンなどのｍＴＯＲインヒビターが、ある場合に、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの活性と相乗作用を示すという驚くべき発見に基づいている。
本明細書で使用する場合、「ＰＳＭＡリガンドコンジュゲート」は、ＰＳＭＡの細胞外ドメインなどＰＳＭＡに特異的に結合し、かつ治療剤にコンジュゲートしている分子を含む。治療剤は抗がん剤であっても細胞傷害性薬剤であってもよい。したがって、「ＰＳＭＡリガンド」は、本明細書に記載のように、本明細書ではＰＳＭＡに特異的に結合する分子を指す。ＰＳＭＡリガンドが抗がん剤にコンジュゲートする場合、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、本明細書では、「ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲート」とも呼ばれる。ＰＳＭＡリガンドが細胞傷害性薬剤にコンジュゲートする場合、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、本明細書では、「ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲート」とも呼ばれる。
本明細書で使用する場合、「ＰＳＭＡ発現細胞」は、ＰＳＭＡを発現するか、またはＰＳＭＡ（例えば、ヒトＰＳＭＡ）を発現することができる細胞を指す。ＰＳＭＡは、前立腺組織で発現される１００ｋＤのＩＩ型膜糖タンパク質である（非特許文献８；特許文献１）。ＰＳＭＡは、トランスフェリンレセプター（非特許文献９）およびＮＡＡＬＡＤアーゼ活性（非特許文献１０）と配列同一性があるＩＩ型膜貫通型タンパク質として特徴づけられた。ＰＳＭＡは前立腺がんにおいて増加した量で発現する（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；および非特許文献１４）。がん性前立腺でのＰＳＭＡ発現は、正常前立腺よりもほぼ１０倍高い。正常前立腺での発現は、脳よりもほぼ１０倍高く、肝臓または腎臓よりも５０倍〜１００倍高い。ほとんどの正常組織では、ＰＳＭＡの発現は観察されない。
ＰＳＭＡ発現は、疾患進行と共に増大し、転移性ホルモン抵抗性疾患で最も高くなる。加えて、ＰＳＭＡは、膀胱、乳腺、結腸、膵臓、肉腫、黒色腫、腎臓、肝臓、肺（例えば、小細胞肺がん）、および腎臓の腫瘍を含む、種々の非前立腺腫瘍の新生血管上に豊富に発現するが、正常血管上には発現しない。したがって、「ＰＳＭＡ発現細胞」は、前立腺がん細胞などのＰＳＭＡ発現がん細胞、およびいくつかの非前立腺がんまたは非前立腺腫瘍の新生血管のＰＳＭＡ発現細胞（例えば、内皮細胞）を含む。
本明細書に使用する場合、「アンドロゲン依存性ＰＳＭＡ発現細胞」は、抗アンドロゲンに反応する、がん細胞などのＰＳＭＡ発現細胞を指す。細胞の増殖が抗アンドロゲンにより実質的に阻害され得る場合に、その細胞は、本明細書では抗アンドロゲンに反応すると見なされる。
本明細書で使用する場合、「アンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現細胞」は、抗アンドロゲンに反応しない、がん細胞などのＰＳＭＡ発現細胞を指し、「抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現細胞」とも本明細書で呼ばれる。細胞の増殖が抗アンドロゲンにより実質的に阻害されない場合にその細胞は、本明細書では抗アンドロゲンに反応しないと見なされる。
一部の実施形態では、抗アンドロゲン療法に非感受性のＰＳＭＡ発現細胞は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物（例えば、抗アンドロゲンまたはｍＴＯＲインヒビター）にＰＳＭＡ発現細胞を接触させたステップの後に、抗アンドロゲン療法に対して感作される。次いで、そのような細胞を、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとさらに接触させることができ、そのような接触は、同時または逐次的に行うことができる。したがって、一部の実施形態では、抗アンドロゲンにそうでなければ反応しないアンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現細胞（例えば、がん細胞）が、抗アンドロゲンまたはｍＴＯＲインヒビターに接触させると反応性になり、したがって、抗アンドロゲンに対して感作されるようになることがあり、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートとさらに接触させて、細胞増殖阻害または細胞致死をもたらすことができる。そのような「感作された」ＰＳＭＡ発現がん細胞の増殖は、結果として実質的に阻害され得る。抗アンドロゲンに対するアンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現細胞の感作が、一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物と接触させた後、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日以上の日数以内に生じ得る。一部の実施形態では、抗アンドロゲンに対するアンドロゲン非依存性ＰＳＭＡ発現細胞の感作が２日未満で生じ得る。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞を、細胞表面上のＰＳＭＡの発現を増大させる（例えば、アップレギュレートする）のに十分な時間、ＰＭＳＡの細胞表面発現を増大させる化合物と接触させる。ＰＳＭＡの細胞表面発現をアップレギュレートするのに十分な時間は、種々のタンパク質発現アッセイにより決定することができ、これらのアッセイは、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロッティングを含めて、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現をアップレギュレートするのに十分な時間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日以上であり得る。一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現をアップレギュレートするのに十分な時間は１日未満であり得る。
本明細書に提供する使用のためのＰＳＭＡリガンドの例としては、限定はされないが、抗体またはその抗原結合断片およびＰＳＭＡに特異的に結合し、ＰＳＭＡ上の酵素部位の基質模倣体として作用し得る小分子リガンドが挙げられる。ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、本明細書では、「ＰＳＭＡ抗体」と呼ぶことができる。同様に、ＰＳＭＡに特異的に結合する小分子リガンドは、本明細書では、「ＰＳＭＡ小分子リガンド」と呼ぶことができる。
本明細書で使用する場合、「特異的結合」は、所定の標的（例えば、抗原）、この場合にはＰＳＭＡ（例えば、ヒトＰＳＭＡ）への分子（例えば、抗体）結合を指す。一部の実施形態では、ＰＳＭＡのその配列は、配列番号１として示される。典型的には、分子は、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡのアイソフォームもしくは変異体、または近縁の標的以外の標的である非特異的な標的（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）へのその結合親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する。
ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡに結合する（例えば、ＰＳＭＡのエピトープに特異的に結合する）任意の抗体またはその抗原結合断片であってよい。本明細書に提供する使用のためのＰＳＭＡ抗体の例としては、限定はされないが、表１に収載されたものが挙げられる。したがって、ＰＳＭＡ抗体およびその抗原結合断片には、ＰＳＭＡ ３．７、ＰＳＭＡ ３．８、ＰＳＭＡ ３．９、ＰＳＭＡ ３．１１、ＰＳＭＡ ５．４、ＰＳＭＡ ７．１、ＰＳＭＡ ７．３、ＰＳＭＡ １０．３、ＰＳＭＡ １．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、４．２４８．２、４．３６０．３、４．７．１、４．４．１、４．１７７．３、４．１６．１、４．２２．３、４．２８．３、４．４０．２、４．４８．３、４．４９．１、４．２０９．３、４．２１９．３、４．２８８．１、４．３３３．１、４．５４．１、４．１５３．１、４．２３２．３、４．２９２．３、４．３０４．１、４．７８．１、および４．１５２．１、ならびにそれらの抗原結合断片が含まれる。
一部の実施形態では、抗体は、本明細書でそれぞれ、ＰＳＭＡ ３．７（ＰＴＡ−３２５７）、ＰＳＭＡ ３．８、ＰＳＭＡ ３．９（ＰＴＡ−３２５８）、ＰＳＭＡ ３．１１（ＰＴＡ−３２６９）、ＰＳＭＡ ５．４（ＰＴＡ−３２６８）、ＰＳＭＡ ７．１（ＰＴＡ−３２９２）、ＰＳＭＡ ７．３（ＰＴＡ−３２９３）、ＰＳＭＡ １０．３（ＰＴＡ ３２４７ ＰＴＡ−３３４７）、ＰＳＭＡ １．８．３（ＰＴＡ−３９０６）、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３（ＰＴＡ−３９０４）、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１（ＰＴＡ−３９０５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２（ＰＴＡ−４４２７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３（ＰＴＡ−４４２８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１（ＰＴＡ−４４２９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１（ＰＴＡ−４５５６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３（ＰＴＡ−４５５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１（ＰＴＡ−４３５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３（ＰＴＡ−４３５８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３（ＰＴＡ−４３５９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２（ＰＴＡ−４３６０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３（ＰＴＡ−４３６１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１（ＰＴＡ−４３６２）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３（ＰＴＡ−４３６５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３（ＰＴＡ−４３６６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１（ＰＴＡ−４３６７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１（ＰＴＡ−４３６８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１（ＰＴＡ−４３６３）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１（ＰＴＡ−４３８８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３（ＰＴＡ−４３８９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３（ＰＴＡ−４３９０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１（ＰＴＡ−４３９１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１（ＰＴＡ−４６５２）、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１（ＰＴＡ−４６５３）と呼ばれるハイブリドーマにより産生される。
これらのハイブリドーマは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure）の要件に準拠し、かつ同要件を充足して、国際保管機関（International Depository Authority）としての米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（「ＡＴＣＣ」）（住所10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209）に寄託され、特許寄託名が付与された（表１）。
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ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの抗体またはその抗原結合断片は、一部の実施形態では、（ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の重鎖コード領域を含む核酸分子によりコードされる重鎖と、（ｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の軽鎖コード領域を含む核酸分子によりコードされる軽鎖とを含むことができる。
さらに、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートのＰＳＭＡリガンドとして使用するための、前述の抗体の抗原結合断片を提供する。
抗体ＰＳＭＡ １０．３、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドもＡＴＣＣに寄託され、上記表１に示される。本明細書で使用する場合、寄託されたハイブリドーマまたはプラスミドの名前は、抗体の名前と互換的に使用することができる。名前が抗体を指すように意図される場合、または名前が抗体をコードもしくは産生するプラスミドもしくはハイブリドーマを指す場合はそれぞれ、当業者には明白であろう。さらに、抗体名は表１に示される名前の簡略形でもよい。例えば、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６は、「ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６」、「ＰＧ１−ＸＧ１−００６」、「ＸＧ１−００６」、または「００６」と呼ぶことができる。別の例では、抗体ＰＳＭＡ ４．２３２．３は、「ＰＳＭＡ ４．２３２．３」、「４．２３２．３」、「４．２３２．３」、または「４．２３２」と呼ぶことができる。抗体の名前の変化形はすべて、異なる抗体ではなく、同じ抗体を指すことを意図するものである。
重鎖配列および軽鎖配列の特定のセットによりコードされる、ＰＳＭＡリガンドとして使用する抗体も提供する。一部の実施形態では、配列番号２および配列番号８として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６）を本明細書に提供する。他の実施形態では、配列番号３および配列番号９として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６）を本明細書に提供する。さらに他の実施形態では、配列番号４および配列番号１０として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１）を本明細書に提供する。さらに他の実施形態では、配列番号５および配列番号１１として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９）を本明細書に提供する。さらなる実施形態では、配列番号６および配列番号１２として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７）を本明細書に提供する。さらに他の実施形態では、配列番号７および配列番号１３として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる抗体（ＰＳＭＡ １０．３）を本明細書に提供する。これらの抗体の抗原結合断片も、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲート中のＰＳＭＡリガンドとして使用することを企図する。
一部の実施形態では、本明細書に提供するＰＳＭＡ抗体は、（ｉ）配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、または配列番号３０として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、または配列番号３２として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる軽鎖可変領域とを含むことができる。これらの抗体の抗原結合断片も、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲート中のＰＳＭＡリガンドとして使用することを企図する。
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の領域を指し；コード領域は、シグナルペプチドなど、後に切断除去されるタンパク質の一部をコードする領域を含むことができる。
本明細書に提供する核酸およびポリペプチドには、本明細書に提供するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が含まれることが、当業者には認識されよう。実例の一部では、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、シグナルペプチドをコードするかまたはシグナルペプチドである配列を含むことができる。シグナルペプチドをコードするかまたはシグナルペプチドである配列部分を含有するかまたは含有しないこれらの配列のそれぞれを、本明細書では企図する。
さらに、重鎖可変配列および軽鎖可変配列の特定のセットを含むＰＳＭＡ抗体を本明細書に提供する。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、配列番号１４および配列番号１６として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる免疫グロブリン可変配列を含む。同様に、ＰＳＭＡ抗体は、配列番号１５および配列番号１７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含むことができる。他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、配列番号１８および配列番号２０として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号１９および配列番号２１として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、配列番号２２および配列番号２４として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号２３および配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、配列番号２６および配列番号２８として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号２７および配列番号２９として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、配列番号３０および配列番号３２として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号３１および配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。これらの抗体の抗原結合断片も、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲート中のＰＳＭＡリガンドとして使用することを企図する。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、前述の核酸分子、アミノ酸分子にそれぞれ高度に相同性がある核酸分子またはアミノ酸分子によりコードされる。例えば、相同的な核酸分子またはアミノ酸分子は、本明細書に提供するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含み得る。別の例として、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本明細書に提供するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一である。相同性は、当業者には周知である、種々の公的に入手可能なソフトウェアを使用して計算することができる。代表的なツールとしては、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、（ｉ）配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、または配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号１７、２１、２５、２９、または３３として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。本明細書に別記するように、前述のもののＰＳＭＡ抗原結合断片も提供する。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、（ｉ）配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、または配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の３つの相補性決定領域と、（ｉｉ）配列番号１７、２１、２５、２９、または３３として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域とを含む。本明細書に別記するように、前述のもののＰＳＭＡ抗原結合断片も提供する。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は、（特許文献２）、（特許文献３）、および（特許文献４）に提供される抗体を含む。それらの抗体は、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ＰＳＭＡ抗体は、Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３、およびＪ５９１モノクローナル抗体；ＡＴＣＣ受入番号ＨＢ−１２１０１、ＨＢ−１２１０９、ＨＢ−１２１２７、およびＨＢ−１２１２６を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体；ならびにＡＴＣＣ受入番号ＨＢ１２０６０（３Ｆ５．４Ｇ６）、ＨＢ１２３０９（３Ｄ７−１．１）、ＨＢ１２３１０（４Ｅ１０−１．１４）、ＨＢ１２４８９（１Ｇ３）、ＨＢ１２４９５（１Ｇ９）、ＨＢ１２４９０（２Ｃ７）、ＨＢ１２４９４（３Ｃ４）、ＨＢ１２４９１（３Ｃ６）、ＨＢ１２４８４（３Ｃ９）、ＨＢ１２４８６（３Ｅ６）、ＨＢ１２４８８（３Ｅ１１）、ＨＢ１２４８５（３Ｇ６）、ＨＢ１２４９３（４Ｄ４）、ＨＢ１２４８７（４Ｄ８）、ＨＢ１２４９２（４Ｃ８Ｂ９）、ＨＢ１２６６４（３Ｆ６）、ＨＢ１２６７８（２Ｅ４）、ＨＢ１２６６５（３Ｃ２）、ＨＢ１２６７２（２Ｄ４）、ＨＢ１２６６０（４Ｃ８Ｇ８）、ＨＢ１２６７５（２Ｃ４）、ＨＢ１２６６３（４Ｃ１１）、ＨＢ１２６６１（１Ｄ１１）、ＨＢ１２６６７（４Ｅ８）、ＨＢ１２６７４（２Ｇ５）、ＨＢ１２６２０（４Ｅ６）、ＨＢ１２６７７（１Ｆ４）、ＨＢ１２６６６（２Ｅ３）、ＨＢ１２６６２（３Ｄ８）、ＨＢ１２６６８（４Ｆ８）、ＨＢ１２６７３（３Ｄ２）、ＨＢ１２６７６（１Ｇ７）、ＨＢ１２６６９（３Ｄ４）、ＨＢ１２６７９（５Ｇ１０）、およびＨＢ１２６７１（５Ｅ９）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を含む。これらの抗体の抗原結合断片も、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートのＰＳＭＡリガンドとして使用することを企図する。
さらに、ＰＳＭＡ抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子、ならびに本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを本明細書に提供する。提供するベクターは、本明細書に記載の特異性を有する、ＰＳＭＡ抗体およびその抗原結合断片を産生するように宿主細胞を形質転換または宿主細胞にトランスフェクトするために使用することができる。一部の実施形態では、産生されるＰＳＭＡ抗体およびその抗原結合断片は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１、ＡＢ−ＰＧ１、ＸＧ１−０６９、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７、およびＰＳＭＡ １０．３、ならびにそれらの抗原結合断片の特異性を有することになる。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる、上記に収載の抗体の重鎖をコードする単離した核酸分子を含むことができる。他の実施形態では、ベクターは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３として示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子によりコードされる、上記に収載の抗体の軽鎖をコードする単離した核酸分子を含むことができる。さらなる実施形態では、ベクターは、上記に収載の抗体の重鎖および軽鎖をコードする単離した核酸分子を含むことができる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片をコードするプラスミドを本明細書に提供する。そのようなプラスミドは、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６重鎖（配列番号２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６軽鎖（配列番号８）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６重鎖（配列番号３）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６軽鎖（配列番号９）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１重鎖（配列番号４）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１軽鎖（配列番号１０）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９重鎖（配列番号５）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９軽鎖（配列番号１１）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７重鎖（配列番号６）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７軽鎖（配列番号１２）、ＰＳＭＡ １０．３重鎖（配列番号７）、およびＰＳＭＡ １０．３ Ｋａｐｐａ（配列番号１３）からなる群から選択することができる。
本明細書で使用する場合、「抗体」は、ジスルフィド結合により相互連結された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられた保存性が高い領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変領域にさらに細分化することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。
本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合断片」は、抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは２つ以上の部分を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実行することができる。抗体の「抗原結合断片」という用語の範疇に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（非特許文献１５）；ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、ＶＬとＶＨ領域が対になって、一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、（非特許文献１６）；および（非特許文献１７）を参照のこと）として、それらが作製されることを可能にする合成リンカーにより、組換え法を使用して連結することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範疇に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献１８）に記載されるタンパク質分解断片化手順などの従来の手順を使用して、また当業者に公知の他の手法によって得られる。これらの断片は、インタクト抗体と同様な方法で、有用性に対してスクリーニングされる。
本明細書で使用する場合、「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＰＳＭＡに特異的に結合する単離抗体は、ＰＳＭＡ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＰＳＭＡのエピトープ、アイソフォーム、または変異体に特異的に結合する単離抗体は、一部の実施形態では、例えば他の種に由来する他の関連抗原（例えば、ＰＳＭＡ種ホモログ）に交差反応性を有することがある。さらに、単離抗体は、一部の実施形態では、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないことがあり得る。
本発明の単離抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの種々の抗体アイソタイプを包含する。本明細書で使用する場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。抗体は完全長であっても、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体定常ドメインおよび／もしくは可変ドメインなどの抗原結合断片のみを含むものであっても、あるいはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片からなるものであってもよい。
抗体は、一部の実施形態では、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の混合物であってもよい。抗体は、当技術分野で周知の種々の手法により産生することができる。ポリクローナル抗体を産生させるための手順は周知である。例えば、抗ＰＳＭＡポリクローナル抗体は、最初に採血して免疫前血清を得ているニュージーランドホワイトウサギにＰＳＭＡタンパク質を皮下投与することにより産生させることができる。典型的には１回または複数回の調整をして、６つの異なる部位に１部位当たり全量１００μｌでＰＳＭＡを注射することができる。次いで、第１回の注射２週間後にウサギから採血し、６週ごとに３回、同じ抗原で定期的に追加免疫する。各追加免疫の１０日後に血清試料を採取する。好ましくは抗体を捕捉するための、ＰＳＭＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリクローナル抗体を血清から回収する。ポリクローナル抗体を産生させるためのこの手順および他の手順は、参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献１９）に開示されている。モノクローナル抗体産生は、当技術分野でも周知の手法により達成することができる。
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体産生の方法は、目的の抗原でｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで予め免疫され、かつＢ細胞骨髄腫株との融合に適した、抗体を産生する能力を有する免疫体細胞、具体的には、Ｂ細胞を取得することを含む。哺乳動物リンパ球を、典型的には、所望のタンパク質またはポリペプチドによる、例えばＰＳＭＡによる、動物（例えば、マウス）のｉｎ ｖｉｖｏ免疫処置により免疫する。十分な抗体力価を得るために、最大数週間の間隔で、必要に応じてそのような免疫処置を反復する。一旦免疫されると、動物は抗体産生リンパ球の供給源として使用することができる。最後の抗原追加免疫後、動物を屠殺し、脾臓細胞を摘出する。マウスリンパ球は、マウス骨髄腫株（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）と高い割合で安定な融合体を形成する。他のマウス系統、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、およびカエルも、抗体産生細胞を調製するための宿主として使用することができる。（非特許文献２０）を参照されたい。例えば、本明細書に提供するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子がゲノムに挿入された（かつマウス免疫グロブリンを産生することができない）マウス系統を使用することができる。例としては、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより作製されたＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ系統、およびＡｂｇｅｎｉｘにより作製されたＸＥＮＯＭＯＵＳＥ系統が挙げられる。そのようなマウスは、免疫処置に応じてヒト免疫グロブリン分子を十分に産生する。
形質芽細胞分裂期にあるそれらの抗体産生細胞は、優先的に融合する。体細胞は、抗原刺激された動物のリンパ節、脾臓、および末梢血から得ることができ、選択されるリンパ細胞は、特定の融合系におけるその実験上の有用性に大部分依存する。次いで、抗体分泌リンパ球を、細胞培養で無制限に複製することができる（マウス）Ｂ細胞骨髄腫細胞または形質転換細胞と融合し、それによって不死の免疫グロブリン分泌細胞株を作製する。得られた融合細胞、すなわちハイブリドーマを培養し、得られたコロニーを、所望のモノクローナル抗体の産生に対してスクリーニングする。そのような抗体を産生するコロニーをクローン化し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで増殖させて、大量の抗体を産生させる。そのような細胞を融合させる理論的基礎および実際的方法論の説明は、参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献２１）に示されている。
あるいは、抗体を産生するヒト体細胞、具体的にはＢリンパ球は、骨髄腫細胞株との融合に適している。個体の脾臓生検試料、扁桃生検試料、またはリンパ節生検試料に由来するＢリンパ球を、より容易に入手可能な末梢血Ｂリンパ球と同様に使用することができる。これらのリンパ球は、前立腺がんまたは別のＰＳＭＡ発現がんと診断された患者に由来するものでもよい。加えて、ヒトＢ細胞は、エプスタイン‐バーウイルスにより直接不死化することができる（参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献２２））。体細胞雑種形成法が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を産生するための他の手法、例えばＢ細胞のウイルス形質転換または腫瘍化転換などを使用することができる。
ハイブリドーマ産生の融合手順における使用に適した骨髄腫細胞は、抗体産生をせず、高い融合効率を有し、かつ所望のハイブリドーマの増殖を支持する特定の選択培地ではそれらを増殖不能にする酵素欠損を有するものであり得る。融合細胞株の作製用に使用することができる、そのような骨髄腫細胞株の例としては、限定はされないが、すべてマウスに由来する、Ｐ３−Ｘ６３ μｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４．１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌ；ラットに由来する、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および４Ｂ２１０；ならびにすべてヒトに由来する、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６が挙げられる（非特許文献２３；非特許文献２４）。
哺乳動物骨髄腫細胞または細胞培養で無制限に複製することができる他の融合パートナーとの融合は、例えばポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または他の融合剤の使用により、標準的かつ周知の手法により達成される（参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献２５）を参照のこと）。
一部の実施形態では、組換え抗体を、本明細書に提供する使用のために企図する。本明細書で使用する場合、「組換え抗体」は、別の種の免疫グロブリン遺伝子にとってはトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えのコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、または免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体など、組換え手段により調製、発現、作製、または単離された抗体を指す。
さらに他の実施形態では、抗体はキメラ抗体であっても、ヒト化抗体であってもよい。本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」は、マウス可変領域または超可変領域とヒト定常領域または定常フレームワーク領域および可変フレームワーク領域とを連結した抗体を指す。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域と連結した、親抗体由来の抗原結合ＣＤＲのみを保持する抗体を指す（（非特許文献２６）を参照のこと）。マウス抗体の結合特異性を保持するこのようなキメラ抗体またはヒト化抗体は、本明細書に提供するように、診断、予防、または治療の用途のためにｉｎ ｖｉｖｏで投与された場合、低減した免疫原性を有することが期待される。
さらに他の実施形態では、本明細書に提供するモノクローナル抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体の形態になるように改変することができる。本明細書で使用する場合、「二重特異性抗体」は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃレセプター、に結合するかまたはこれらと相互作用する、２つの異なる結合特異性を有する任意の薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を含む。本明細書で使用する場合、「多重特異性抗体」は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃレセプター、および（ｃ）少なくとも１つの他の成分、に結合するかまたはこれらと相互作用する、２つ以上の異なる結合特異性を有する任意の薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を含む。したがって、本明細書に提供する抗体は、ＰＳＭＡなどの細胞表面抗原およびエフェクター細胞上のＦｃレセプターに向けられた、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、または他の多重特異性抗体であり得る。「二重特異性抗体」はまた、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、そこではＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現し、かつ短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対形成が起きないリンカーが使用され、それによって、それらのドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成するように仕向けられて２つの抗原結合部位が生成する（例えば、（非特許文献２７）；（非特許文献２８）を参照のこと）。
二重特異性抗体は、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的な抗原結合領域と、殺腫瘍活性または腫瘍阻害活性を有するエフェクター細胞に特異的な抗原結合領域とから形成することができる。二重特異性抗体の２つの抗原結合領域は、化学的に連結されるか、または二重特異性抗体を産生するように遺伝子操作された細胞によって発現され得るかのいずれかである。（一般に、（非特許文献２９）を参照のこと）。殺腫瘍活性を有する適切なエフェクター細胞としては、限定はされないが、細胞傷害性Ｔ細胞（主としてＣＤ８＋細胞）およびナチュラルキラー細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に提供する抗体はヒト抗体である。本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された変異）。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体（本明細書では「ヒト化抗体」と別に呼ばれる）を含むように意図するものではない。ＰＳＭＡに対するヒト抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系部分を保持するトランスジェニックマウスを使用して生成される。本明細書に提供するヒトＰＳＭＡ抗体は、細胞表面ＰＳＭＡおよび／またはｒｓＰＳＭＡ（組換え可溶性ＰＳＭＡ、すなわち、ＰＳＭＡの細胞外部分の配列を有する）に、ナノモル以下の親和性で特異的に結合する。本明細書に提供するヒトＰＳＭＡ抗体は、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、または１×１０−１１Ｍ以下の結合親和性を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に提供するヒトＰＳＭＡ抗体の結合親和性は、約５×１０−１０Ｍ未満である。
完全なヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することにより調製することができる。例えば、（特許文献５）、（特許文献６）、（特許文献７）、（特許文献８）、（特許文献９）、およびそれらの中に引用された参考文献を参照されたい。これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの動物は、内因性の（例えば、マウスの）抗体の産生に機能的な欠損があるように遺伝子改変されている。これらの動物の免疫処置が目的の抗原に対する完全なヒト抗体の産生をもたらすように、動物をさらに改変してヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有させる。これらのマウス（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ａｂｇｅｎｉｘ）およびＨＵＭＡＢマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫処置に続いて、標準的ハイブリドーマ技術に従って、モノクローナル抗体を調製する。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するため、ヒトに投与した場合、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を誘発することにはならない。
好ましくは、マウスは第１回の免疫処置時に６〜１６週齢である。例えば、ＰＳＭＡ抗原（例えば、組換えＰＳＭＡまたはＰＳＭＡ発現細胞）の精製または濃縮調製物を使用して、当業者に公知の免疫処置の他の経路も可能であるが、腹腔内投与（ＩＰ）でマウスを免疫する。完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと併用して、ＰＳＭＡ抗原を注射し、好ましくは、最初の注射後、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバント中の抗原による追加免疫を行う。免疫反応は、例えば後眼窩の採血により得られる血漿試料を用いて、免疫処置プロトコールの間モニターする。ＥＬＩＳＡにより血漿をスクリーニングし、十分な力価の抗ＰＳＭＡヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用する。屠殺および脾臓摘出の３日前に、抗原の静脈投与によりマウスを追加免疫する。
抗体またはその抗原結合断片は、例えば、排他的であることを意図しない、以下の基準に基づいて選択することができる。
１）ＰＳＭＡを発現する生細胞への結合；
２）ＰＳＭＡへの高親和性結合；
３）ＰＳＭＡ上のユニークなエピトープへの結合（併用して使用すると相補的活性を有する抗体が、同じエピトープへの結合に対して競合する可能性を除去するために）；
４）ＰＳＭＡを発現する細胞のオプソニン化；
５）エフェクター細胞の存在下における、ＰＳＭＡ発現細胞の増殖阻害、食作用、および／または死滅の媒介；
６）ＮＡＡＬＡＤアーゼ、葉酸ヒドロラーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、および／またはγ−グルタミルヒドロラーゼ活性の調節（阻害または増強）；
７）エフェクター細胞の非存在下における、増殖阻害、細胞周期停止、および／または細胞傷害；
８）ＰＳＭＡの内部移行；
９）ＰＳＭＡ上の立体構造エピトープへの結合；
１０）ＰＳＭＡを発現しない細胞または組織との最小の交差反応性；ならびに
１１）ＰＳＭＡの単量体形態よりもＰＳＭＡの二量体形態への優先的な結合。
本明細書に提供するＰＳＭＡ抗体およびその抗原結合断片は、典型的には、前述の基準の１つまたは２つ以上を満たし、一部の実例では、すべてを満たす。
一部の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡを発現する生細胞に結合するその能力に対して選択することができる。ＰＳＭＡを発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリーを使用することができる。例えば、ＰＳＭＡを発現する細胞株（標準増殖条件下で増殖した）またはＰＳＭＡを発現する前立腺がん細胞を、０．１％ＴＷＥＥＮ ８０および２０％マウス血清を含有するＰＢＳ中で、種々の濃度のモノクローナル抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、一次抗体染色と同じ条件下で、蛍光標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ヒト抗ＰＳＭＡ抗体を使用する場合）と細胞を反応させる。光および側方散乱特性を使用して単一細胞をゲートする蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）装置により、試料を解析することができる。蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを、フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはこれに代えて）使用することができる。細胞を上記のように正確に染色して、蛍光顕微鏡で検査することができる。この方法により、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて感度が低下することがある。ＰＳＭＡを発現する生細胞への抗体またはその抗原結合断片の結合により、細胞増殖の阻害または細胞溶解の媒介が起こり得る。細胞溶解は補体媒介性であることも、エフェクター細胞による媒介であることもある。一部の実施形態では、細胞溶解は生体の中、好ましくは哺乳動物の中で行われ、その生細胞は腫瘍細胞である。本明細書に提供するＰＳＭＡ抗体（例えば、ＰＳＭＡ抗体コンジュゲート）の標的となり得る腫瘍の例としては、前立腺、膀胱、膵臓、肺、結腸、腎臓、黒色腫、および肉腫などの、ＰＳＭＡを発現する任意の腫瘍が挙げられる。ＰＳＭＡを発現する腫瘍には、ＰＳＭＡを発現する新生血管を有する腫瘍が含まれる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、細胞上に発現されたＰＳＭＡに結合し、それと共に内部移行される。したがって、ＰＳＭＡ抗体を含むＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、細胞上に発現されたＰＳＭＡと共に内部移行され得る。この内部移行が起こる機序は、本発明の実施にとって重要ではない。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡの内部移行を誘導することができる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ分子の細胞外ドメイン内にある立体構造エピトープに結合する。ヒトＰＳＭＡ抗体が立体構造エピトープに結合するか否かを判定するために、それぞれの抗体を、天然タンパク質（例えば、非変性免疫沈降、細胞表面結合のフローサイトメトリー分析）および変性タンパク質（例えば、ウエスタンブロット、変性タンパク質の免疫沈降）を使用するアッセイで試験することができる。結果を比較すれば、抗体が立体構造エピトープに結合するか否かがわかる。天然タンパク質には結合するが変性タンパク質には結合しない抗体が、立体構造エピトープに結合するそれらの抗体であり、一部の実施形態では好ましい抗体である。
他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ上の二量体特異的なエピトープに結合する。一般に、二量体特異的なエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ単量体よりもＰＳＭＡ二量体に優先的に結合する。ＰＳＭＡ抗体がＰＳＭＡ二量体に特異的に結合するか否かを判定するために、抗体を、天然の二量体ＰＳＭＡタンパク質および解離した単量体ＰＳＭＡタンパク質を使用するアッセイ（例えば、免疫沈降に続くウエスタンブロッティング）で試験することができる。結果を比較すれば、抗体が二量体に優先的に結合するかまたは単量体に優先的に結合するかがわかる。ＰＳＭＡ二量体には結合するが、単量体ＰＳＭＡタンパク質には結合しない抗体が、一部の実施形態では好ましい抗体である。
本明細書に提供する、他のＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、第２の抗体により定義されるＰＳＭＡ上のエピトープに特異的に結合する抗体を含む。エピトープを決定するために、当技術分野で公知の標準エピトープマッピング法を使用することができる。例えば、第２の抗体に結合するＰＳＭＡ抗原の断片（ペプチド）（好ましくは、合成ペプチド）は、候補抗体が同じエピトープに結合するか否かを判定するために使用することができる。直線状エピトープの場合には、定義された長さ（例えば、８以上のアミノ酸）の重複ペプチドを合成する。ＰＳＭＡタンパク質配列の８アミノ酸をそれぞれカバーする一連のペプチドを調製するように、ペプチドを１アミノ酸だけオフセットすることが好ましい。ペプチドを少なくする場合は、より大きなオフセット、例えば２または３アミノ酸のオフセットをすることにより調製することができる。加えて、より長いペプチド（例えば９−、１０−、または１１−アミノ酸長）を合成することができる。抗体へのペプチドの結合は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）およびＥＬＩＳＡアッセイを含む標準的な方法論を使用して判定することができる。立体構造エピトープの検討の場合は、本明細書に提供するように、より大きなＰＳＭＡ断片を使用することができる。質量分析を使用して立体構造エピトープを明らかにする他の方法が記載されており、本明細書に提供するように使用することができる（例えば、（非特許文献３０）およびその中に引用された参考文献を参照のこと）。エピトープ決定のためのさらに他の方法が、（非特許文献３１）などの標準的な実験室参考資料に提供されている。公知のエピトープに点変異または点欠失を導入し、次いで１種または２種以上の抗体またはその抗原結合断片との結合を試験して、いずれの変異が、抗体またはその抗原結合断片の結合を低下させるかを決定することにより、エピトープを確認することができる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートのＰＳＭＡ抗体は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）タンパク質二量体、すなわち配列番号１の配列を有するＰＳＭＡタンパク質単量体のホモ二量体であるＰＳＭＡタンパク質二量体に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あり、この抗体または抗原結合断片は、参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１０）に記載されているように、（ｉ）生細胞に結合し、かつ（ｉｉ）ＰＳＭＡタンパク質二量体に、ＰＳＭＡ単量体よりも少なくとも２倍高い親和性で結合する。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体は放射性分子にコンジュゲートされる。したがって、そのようなＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの一例として、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）を介して１７７ルテチウム（１７７Ｌｕ）にコンジュゲートしたモノクローナルＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１を含有する１７７Ｌｕ−Ｊ５９１が挙げられる。
ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートのＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡに特異的に結合する任意の小分子リガンドであってよい。そのような小分子リガンドは、天然立体構造をとるＰＳＭＡ酵素部位に結合し得る。さらに、そのような小分子リガンドは、ＰＳＭＡ抗体リガンドについて上記に記載された特徴のいずれか１つまたは２つ以上を有することができる。
一部の実施形態では、小分子リガンドは、ＰＳＭＡ上の酵素部位に特異的に結合する、グルタメート−尿素−リジンヘテロ二量体（例えば、グルタメート−尿素−リジンアナログ）またはグルタメート−尿素−グルタメートをベースとする二量体に基づくものである。一部の実施形態では、そのような小分子リガンドは、抗がん剤または細胞傷害性薬剤としての放射性核種（例えば、細胞傷害性放射性核種または放射線治療同位体）にコンジュゲートされる。したがって、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの例として、１２３ＩＭＩＰ−１０９５（１２３ＩＭＩＰ−１４６６とも呼ばれる）および１２３ＩＭＩＰ−１０７２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）など、介在リンカーを介して放射性核種にコンジュゲートしたグルタメート−尿素−アミノ酸をベースとした小分子リガンドが挙げられる。ＰＳＭＡ小分子リガンドおよびＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの他の例は、参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１１）および（特許文献１２）に見出すことができる。一部の実施形態では、Ｉ１２３は、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉ１２４、ＢＲ７５、ＢＲ７７、およびＦ１８からなる群から選択されるものを含む他の放射性ハロゲンに置換することができる。
１２３Ｉ−ＭＩＰ−１０９５（すなわち、１２３Ｉ−（Ｓ）−２−（３−（（Ｓ）−１−カルボキシ−５−（３−（４−ヨードフェニル）ウレイド）ペンチル）ウレイド）ペンタン二酸）の化学構造は以下のとおりである。
Figure 0006908964
別の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、１２４Ｉ−ＭＩＰ−１０９５である。別の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、１３１Ｉ−ＭＩＰ−１０９５である。
１２３Ｉ−ＭＩＰ−１０７２（すなわち、１２３Ｉ−（Ｓ）−２−（３−（（Ｓ）−１−カルボキシ−５−（４−ヨードベンジルアミノ）ペンチル）ウレイド）ペンタン二酸）の化学構造は以下のとおりである。
Figure 0006908964
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの小分子リガンドは、（特許文献１３）に記載されるＧＬ２分子である。ＧＬ２分子を含む、本明細書に提供するいずれの小分子リガンドも、ナノ粒子（例えば、ポリマーベース、脂質ベースおよび／または核酸ベースのナノ粒子）を介して治療剤にコンジュゲートすることができる。そのような実施形態では、ナノ粒子は治療剤を含有することができる。したがって、一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、抗がん剤または細胞傷害性薬剤を含有するナノ粒子にコンジュゲートした小分子リガンドを含む。そのようなＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの例として、限定はされないが、（特許文献１３）に記載されるＢＩＮＤ−０１４（Ｂｉｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。これらのＰＳＭＡリガンドおよびＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＳＭＡ小分子リガンドは、一部の実施形態では、以下の化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ：
Figure 0006908964
 ならびにそれらの鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ体（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、０、１、２、または３であり；ｐは０または１であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択され；ならびにＲ３はＨまたはＣＨ３である）からなる群から選択することができ、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、またはＲ５は、ナノ粒子への共有結合点を含む。例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、またはＣＯ２Ｈで１回または複数回独立して置換されている、Ｃｉ１−６−アルキルもしくはフェニル、またはＣｉ１−６−アルキルもしくはフェニルの任意の組合せであってよく、そのアルキル基は、Ｎ（Ｈ）、Ｓ、またはＯにより割り込まれていてもよい。一部の実施形態では、例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して、ＣＨ２−Ｐｈ、（ＣＨ２）２−ＳＨ、ＣＨ２−ＳＨ、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｈ）（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｈ）（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｈ）（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｐｈ、Ｏ−ＣＨ２−Ｐｈ、またはＯ−（ＣＨ２）２−Ｐｈであり、ここで、Ｐｈはそれぞれ独立して、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＯ２Ｈ、またはＳＨで１回または複数回置換されていてもよい。
ＰＳＭＡ小分子リガンドは、他の実施形態では、
Figure 0006908964
 およびそれらの鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ体からなる群から選択することができ、ここで、ＮＨ２、ＯＨ、またはＳＨ基は、共有結合点として役立ち、あるいは、
Figure 0006908964
 およびそれらの鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ体（式中、Ｒは独立して、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、またはＣＯ２Ｈで置換されているＣｉ＿６アルキル、およびＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、またはＣＯ２Ｈで置換されているフェニル基からなる群から選択される）からなる群から選択することができ、ここで、Ｒは共有結合点として役立つ。
ＰＳＭＡ小分子リガンドは、さらに他の実施形態では、
Figure 0006908964
 およびそれらの鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ体からなる群から選択することができ、これらのいずれも、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているＣｉ１−６−アルキル、またはＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているフェニルでさらに置換されていてもよく、ここで、これらの官能基は共有結合点として役立つ。例えば、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、
Figure 0006908964
 およびそれらの鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ体であってよく、ここで、ＮＨ２基は共有結合点として役立つ。結合は、リンカー、ポリマー、粒子等への結合であってよい。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ上の酵素部位に結合する基質であるかまたはそれを模倣する分子を含むＰＳＭＡ小分子リガンドは、２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）ウレイド］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）を含む。一部の実施形態では、そのような小分子リガンドは、ツブリシンヒドラジド（ＴｕｂＨ）などの化学療法剤にコンジュゲートされる。そのようなＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの一例（ＥＣ１０６９）の合成および使用が、（非特許文献３２）；（非特許文献３３）に記載されている。ＥＣ１７１９は、ＴｕｂＨを含むＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの別の例である。ＥＣ１０６９およびＥＣ１７１９は、前立腺がん細胞上に発現されたＰＳＭＡ受容体を化学療法剤の標的にすることができる（エンドサイト（Ｅｎｄｏｃｙｔｅ））。ＤＵＰＡおよびＴｕｂＨを連結する他のＥＣ１０６９およびＥＣ１７１９のアナログもまた、前立腺がん細胞上で発現されたＰＳＭＡ受容体を標的にすることができる。こうして、ＥＣ１０６９のアナログおよびＥＣ１７１９のアナログもまた、本明細書で企図される。したがって、用語「ＥＣ１０６９」および「ＥＣ１７１９」は、ＥＣ１０６９、ＥＣ１７１９、およびそれらのアナログを包含する。これらのアナログのリンカーは、一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドであっても、または糖部分、アミド、またはエステルが結合したペプチドであってもよい。したがって、リンカーの一例は、Ｄ−γ−Ｇｌｕ Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｃｙｓである（図１０）。本明細書に提供するように、他のリンカーを使用することができる。
ＰＳＭＡリガンドへの１種または２種以上の治療剤のコンジュゲーションには、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、静電結合、および錯体形成など、多くの化学機序が含まれ得る。コンジュゲーションはカプセル化も含み、１つの成分が別の成分と関連し得る任意の機序を指すように意図するものである。コンジュゲーションは、ＰＳＭＡリガンドへの治療剤の直接コンジュゲーションであっても、またはリンカー、ポリマー、粒子等を介するものなど、間接的であってもよく、それは治療剤が結合しているリンカー、ポリマー、粒子等である。
共有結合は、既存の側鎖の直接縮合、または外部架橋分子の組み込みのいずれかによって達成することができる。多くの二価または多価の薬剤が、他のタンパク質、ペプチド、またはアミン官能基等にタンパク質分子をカップリングするのに有用である。例えば、文献には、カルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどのカップリング剤が豊富に載っている。このリストは、当技術分野で公知の種々のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、より一般的なカップリング剤を例示するものである。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドが抗体である場合、抗体を最初に誘導し、次いで治療剤を誘導産物に結合することを企図する。この方法で使用される適切な架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートおよびＳＭＰＴ、４−スクシニミジル−オキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエンが含まれる。
一部の実施形態では、薬剤がタンパク質毒素である場合、それを遺伝学的方法によりＰＳＭＡリガンドに融合させて、ハイブリッド免疫毒素融合タンパク質を形成させることができる。融合タンパク質は、例えばＰＳＭＡリガンドおよび毒素を機能的に結合させるペプチドスペーサーなどの追加のペプチド配列を、それが融合タンパク質のターゲティングまたは毒素活性に認識できるほどの影響を及ぼさない限り、含むことができる。当技術分野で周知のように、一部の実施形態では、これらのタンパク質を、グリシン−セリンスペーサーペプチドなどのペプチドリンカーもしくはスペーサー、またはペプチドヒンジにより結合させることができる。したがって、例えば、ＰＳＭＡリガンドがＰＳＭＡ抗体である場合、ＰＳＭＡ抗体のＣ末端をタンパク質毒素分子のＮ末端に融合させて、ＰＳＭＡ抗体の結合特性を保持する免疫毒素を形成させることができる。他の融合処理が、当業者には公知である。融合免疫毒素を発現させるために、融合タンパク質をコードする核酸を、標準的方法に従って、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞等で融合タンパク質を安定に発現させる発現ベクターに挿入する。融合タンパク質は、ＰＳＭＡアフィニティーカラムなどの標準的方法を使用して、細胞または培養上清から単離および精製することができる。
本明細書に提供する使用のための抗がん剤の例としては、限定はされないが、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、および腫瘍新生血管に作用する薬剤が挙げられる。細胞傷害性薬剤としては、これらに限定されないが、細胞傷害性放射性核種、化学毒素、およびタンパク質毒素が挙げられる。細胞傷害性放射性核種または放射線治療同位体としては、例えば、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、２２３Ｒａなどのアルファ放射同位体が挙げられる。細胞傷害性放射性核種または放射線治療同位体としては、例えば、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏなどのベータ放射同位体が挙げられる。一部の実例では、細胞傷害性放射性核種は、オージェ電子および／または低エネルギー電子を放射してもよく、同位体１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、および１８Ｆを含む。
放射性核種は、典型的には、キレート化により抗体またはその抗原結合断片にカップリングされる。例えば、金属性放射性核種の場合には、二官能性キレーターを通常使用して、目的の抗体または他のタンパク質に同位体を連結する。典型的には、最初にキレーターを抗体に結合させ、そしてキレーター−抗体コンジュゲートを金属性放射性同位元素に接触させる。いくつかの二官能性キレーターが、参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１４）、（特許文献１５）、および（特許文献１６）に記載されている、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）系列のアミノ酸を含めて、この目的のために開発されている。別の例として、ヒドロキサム酸をベースとした二官能性キレート剤が、その内容が本明細書に組み込まれる（特許文献１７）に記載されている。別の例は、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−オクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’，Ｎ’’’’’−ヘキサ酢酸）と名付けられたキレート剤（非特許文献３４）であり、これは、２２５Ａｃなどの放射性金属の有効なキレート剤である。さらに別の例は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）であり、これは、標識化し、次いでコンジュゲートする２段階法で使用することができる二官能性キレート剤である（（非特許文献３５）を参照のこと）。
化学毒素または化学療法剤としては、これらに限定されないが、カリチアマイシンおよびエスペラマイシンなどのエンジインファミリー分子のメンバーが挙げられる。化学毒素または化学療法剤としてはまた、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体（例えば、（非特許文献３６）に記載されている、ＳＪＧ−１３６、ＳＧ２０００、ＳＧ２２０２、ＳＧ２２８５）、カリチアマイシン、コルヒチン、イスピネシブ（キネシン紡錘体タンパク質の新規小分子インヒビター）、コンブレスタチン（例えば、コンブレスタチンＡ４）、マイタンシノイドＤＭ４（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）マイタンシン）およびマイタンシノイドＤＭ１（メルタンシン）などのマイタンシン誘導体、メトトレキセート、ドキソルビシン、メルファラン、クロランブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、および／または５−フルオロウラシルが挙げられる。他の抗腫瘍剤としては、ドラスタチン（特許文献１８および特許文献１９）およびその誘導体が挙げられる。ドラスタチンおよびその誘導体としては、ドラスタチン１０（ドラバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−ドラフェニン）およびその誘導体アウリスタチンＰＨＥ（ドラバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン−メチルエステル）（非特許文献３７；非特許文献３８）、アウラスタチン（ａｕｒａｓｔａｔｉｎ）Ｅ（例えば、モノメチルアウリスタチンノルエフェドリン）、アウラスタチンＦ（例えば、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン）等が挙げられる。毒素としてはまた、有毒レクチン、リシン毒素などの植物性毒素、アブリン毒素、モデッシン毒素、ボツリヌス毒素、およびジフテリア毒素が挙げられる。他の化学療法剤が当業者に公知であり、本明細書に提供するように使用することができる。
腫瘍血管に作用する薬剤としては、これらに限定されないが、ツブリシンおよびその誘導体などのチューブリン結合剤（例えば、抗チューブリン剤）（非特許文献３９）、コンブレスタチンＡ４（非特許文献４０）、アンジオスタチンおよびエンドスタチン（参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献４１）に総説がある）、ならびにインターフェロン誘導タンパク質１０（特許文献２０）が挙げられる。いくつかの他の血管新生インヒビターも企図され、以下のものが挙げられる。２ＭＥ２、アンジオスタチン、アンジオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）、抗ＶＥＧＦ ＲｈｕＭＡｂ、Ａｐｒａ（ＣＴ−２５８４）、アビシン（ａｖｉｃｉｎｅ）、ベネフィン、ＢＭＳ２７５２９１、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ４０４７、ＣＣ５０１３、ＣＣ７０８５、ＣＤＣ８０１、ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ ４１２）、ＣＭ１０１、コンブレタスタチンＡ−４プロドラッグ、ＥＭＤ １２１９７４、エンドスタチン、フラボピリドール、ゲニステイン（ＧＣＰ）、ＩＭ−８６２、ＩｍｍＴｈｅｒ、インターフェロンアルファ、インターロイキン１２、ゲフィチニブ（ＺＤ１８３９）、マリマスタット、メタスタット（Ｃｏｌ−３）、ネオバスタット、オクトレオチド、パクリタキセル、ペニシラミン、フォトフリン、フォトポイント、ＰＩ−８８、プリノマスタット（ＡＧ−３３４０）、ＰＴＫ７８７（ＺＫ２２５８４）、ＲＯ３１７４５３、ソリマスタット、スクアラミン、ＳＵ １０１、ＳＵ ５４１６、ＳＵ−６６６８、スラジスタ（ＦＣＥ ２６６４４）、スラミン（メタレット）、テトラチオモリブダート、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０、およびバイタクシン（ｖｉｔａｘｉｎ）。さらなる血管新生インヒビターが、参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献４２）に記載されている。このような薬剤は、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートでの使用が企図される。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートである。ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートの非限定例が、（特許文献２１）および（特許文献２２）に記載されており、これらそれぞれのそのような例は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、ドラスタチン１０誘導体、具体的には、ＭＭＡＥ（本明細書ではモノメチルアウリスタチンＥまたはモノメチルアウリスタチンノルエフェドリンとも呼ばれる）またはＭＭＡＦ（本明細書ではモノメチルアウリスタチンＦまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンとも呼ばれる）などのアウリスタチンにコンジュゲートされている。
抗体またはその抗原結合断片は、一部の実施形態では、次式（式１）：−Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−（式中、Ａはカルボン酸アシル単位であり；Ｙはアミノ酸であり；Ｚはアミノ酸であり；ＸおよびＷはそれぞれ自己犠牲スペーサーであり；ｎは０または１の整数であり；ｍは、０または１、２、３、４、５、もしくは６の整数である）の化合物によりＭＭＡＥまたはＭＭＡＦにコンジュゲートすることができる。ＡＤＣは、一部の実施形態では、式（式２）：Ｌ−｛Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−Ｄ｝ｐ（式中、ＬはＰＳＭＡに結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ＤはＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、ｐは１、２、３、４、５、６、７、または８の整数である）により表される。他の成分は上記のとおりである。一実施形態では、カルボン酸単位「Ａｎ」は、抗体または抗原結合断片からのイオウ原子を介して抗体または抗原結合断片に連結される。
Figure 0006908964
一実施形態では、Ａは
Figure 0006908964
 （式中、ｑは１〜１０である）である。したがって、一実施形態では、コンジュゲートは、
Figure 0006908964
 （式中、Ｌ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｗ、Ｄ、ｎ、ｍ、ｑ、およびｐは先に定義したとおりである）である。
別の実施形態では、Ａは、４−（Ｎ−スクシンイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル、ｍ−スクシンイミドベンゾイル、４−（ｐ−スクシンイミドフェニル）−ブチリル、４−（２−アセトアミド）ベンゾイル、３−チオプロピオニル、４−（１−チオエチル）−ベンゾイル、６−（３−チオプロピオニルアミド）−ヘキサノイル、またはマレイミドカプロイルである。さらなる実施形態では、Ａはマレイミドカプロイルである。種々のカルボン酸アシル単位の代表例ならびにそれらの合成および結合のための方法が（特許文献２３）に記載されており、その内容全体は、具体的には例ならびにそれらの合成および結合のための方法であるが、参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、Ｙは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはプロリンである。さらに別の実施形態では、Ｙはバリンである。さらなる実施形態では、Ｚは、リジン、アセチルもしくはホルミルで保護されたリジン、アルギニン、トシル基もしくはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルもしくはホルミルで保護されたオルニチン、またはシトルリンである。さらに別の実施形態では、Ｚはシトルリンである。一実施形態では、Ｙｍ−Ｚｍはバリン−シトルリンである。別の実施形態では、Ｙｍ−Ｚｍはプロテアーゼにより選択的に切断可能なタンパク質配列である。
さらなる実施形態では、Ｘは式
Figure 0006908964
 （式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳである）を有する化合物である。別の実施形態では、Ｘは式−ＨＮ−Ｒ１−ＣＯＴ（式中、Ｒ１はＣ１−Ｃ５アルキルであり、ＴはＯ、Ｎ、またはＳである）を有する化合物である。さらなる実施形態では、Ｘは式
Figure 0006908964
 （式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳであり、Ｒ２はＨまたはＣ１−Ｃ５アルキルである）を有する化合物である。一実施形態では、Ｘはｐ−アミノベンジルカルバモイルオキシである。別の実施形態では、Ｘはｐ−アミノベンジルアルコールである。さらなる実施形態では、Ｘはｐ−アミノベンジルカルバメートである。さらにさらなる実施形態では、Ｘはｐ−アミノベンジルオキシカルボニルである。別の実施形態では、Ｘはγ−アミノ酪酸；α，α−ジメチルγ−アミノ酪酸またはβ，βジメチルγ−アミノ酪酸である。
一部の実施形態では、Ｗは
Figure 0006908964
 （式中、ＴはＯ、Ｓ、またはＮである）である。
一実施形態では、式１の化合物はマレイミドカプロイルである。マレイミドカプロイルは、２つの特定のアウリスタチンを抗ＣＤ３０ ｍＡｂ（ＡＣ１０）にコンジュゲートするために使用されている（非特許文献４３）。マレイミドカプロイルはチオール基と反応してチオエテールを形成する。
ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦは、当技術分野で公知の方法（例えば、（非特許文献４４）を参照のこと）を使用して、または本明細書に記載のように、抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、２つ以上のＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が、抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされる。他の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が、抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされる。さらに他の実施形態では、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つのＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が、抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされる。さらなる実施形態では、２つ、３つ、４つ、または５つのＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が、抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、ＰＳＭＡ抗体（またはその抗原結合断片）−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリン、ＰＳＭＡ抗体（またはその抗原結合断片）−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリン、ＰＳＭＡ抗体（またはその抗原結合断片）−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリン、ＰＳＭＡ抗体（またはその抗原結合断片）−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ＰＳＭＡ抗体（またはその抗原結合断片）−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、またはＰＳＭＡ抗体（またはその抗原結合断片）−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。前述のいずれにおいても、ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に提供する抗体または抗原結合断片のいずれであってもよい。
ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、例えば、非ＰＳＭＡ発現細胞の死滅をＰＳＭＡ発現細胞の死滅と比較すると、特に高いレベルの選択性を有することが見出された。したがって、一部の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体−ＭＭＡＥコンジュゲートまたはＰＳＭＡ抗体−ＭＭＡＦコンジュゲートは、Ｃ４−２細胞またはＬＮＣａＰＴＭ細胞に対するＰＣ−３ＴＭ細胞の選択性が少なくとも２５０である。他の実施形態では、この選択性は、少なくとも３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１７５００、２００００以上である。一部の実施形態では、この選択性は、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜５０００、５０００〜１００００、１００００〜１５０００、または１５０００〜２００００の間である。「選択性」は、本明細書で定義する場合、Ｃ４−２細胞またはＬＮＣａＰＴＭ細胞（ＰＳＭＡ発現細胞）に対するＰＣ−３ＴＭ細胞（非ＰＳＭＡ発現細胞）における、ＰＳＭＡ抗体−ＭＭＡＥコンジュゲートまたはＰＳＭＡ抗体−ＭＭＡＦコンジュゲートのＩＣ５０値の比を指す。
ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、一部の実施形態では、ピコモル濃度またはその付近などの極めて低濃度で、ＰＳＭＡ発現細胞特異的な死滅を媒介する。ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、一部の実施形態では、約１×１０−１０Ｍ未満、約１×１０−１１Ｍ未満、または約１×１０−１２Ｍ未満の濃度のＩＣ５０を示す。一部の実施形態では、ＩＣ５０は、約１．５×１０−１１Ｍ未満の濃度で達成される。他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、１０〜２１０、４０〜２１０、６０〜２１０、または６５〜２１０ピコモル（ｐＭ）の間のＩＣ５０を示す。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、約１０、４０、６０、または８０ｐＭのＩＣ５０を示す。さらに他の実施形態では、ＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲートは、約１１、４２、６０、または８３ｐＭのＩＣ５０を示す。
細胞死滅のレベルは、本明細書に提供する方法、またはそうでなければ当技術分野で公知の方法のいずれによっても決定することができる。
「抗アンドロゲン」は、本明細書で使用する場合、アンドロゲンホルモン、およびアンドロゲンに調節される分子の作用を遮断する（例えば、阻害する）薬剤を指す。アドレナリン受容体アンタゴニストは、本明細書では抗アンドロゲンと見なされる。用語「抗アンドロゲン」は、抗アンドロゲン、抗アンドロゲンアナログ、および抗アンドロゲン誘導体を含む。前立腺がんでは、抗アンドロゲンは、テストステロンの活性を遮断し、それにより前立腺がんの増殖が通常遅延する。一部の実施形態では、抗アンドロゲンは、ＣＹＰ１７Ａ遺伝子によりコードされる酵素シトクロムＰ４５０ １７Ａ１を遮断する。抗アンドロゲンは、ステロイド性であっても、非ステロイド性（「純粋な」とも呼ばれる）であってもよい。本明細書に提供する使用のための抗アンドロゲンの例としては、限定はされないが、アビラテロン（ＺＹＴＩＧＡ（登録商標））、エンザルタミド（ＸＴＡＮＤＩ（登録商標））、ニルタミド（ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標））、フルタミド（ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標））、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標））、オルテロネル（ＴＡＫ−７００、Ｔｏｋａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。例えばエンザルタミド、アビラテロン、ＡＲＮ ５０９（Ａｒａｇｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、およびガレテロン（ＴＯＫ−００１またはＶＮ／１２４−１、Ｔｏｋａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）などの強力な抗アンドロゲン、これらは、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんに通常使用され、ＰＳＭＡ発現など、アンドロゲンに調節される多数の分子の発現に影響を及ぼす。
本明細書における、「強力な」抗アンドロゲンまたは「第２世代」抗アンドロゲンは、野生型の発現に対して増加したアンドロゲン受容体発現の細胞環境下で活性を保持する抗アンドロゲンを含む。強力な抗アンドロゲンは、去勢抵抗性前立腺がんの被験体において活性なものを含む。強力な抗アンドロゲンはまた、臨床的に使用される通常の抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）よりも高い相対親和性でアンドロゲン受容体に結合する抗アンドロゲンを含む。強力な抗アンドロゲンの例としては、限定はされないが、エンザルタミド、アビラテロン、ＡＲＮ−５０９、ガレテロン、およびジアリールチオヒダントインＲＤ１６２およびＭＤＶ３１０、３ベータ−ヒドロキシアンドロスタ−５，１６−ジエン（ＨＡＤ）、およびアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン−１７−エチレンケタール（ＯＡＫ）（参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献４５））が挙げられる。例えば、アビラテロンはＣＹＰ１７Ａ１酵素を阻害する。別の例として、エンザルタミン（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｎｅ）はアンドロゲン受容体アンタゴニストである。さらに別の例として、ガレテロンは選択的なＣＹＰ１７インヒビターであり、かつアンドロゲン受容体アンタゴニストである。強力な抗アンドロゲンを同定するために使用できる方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる（非特許文献４６）に記載されている。本明細書に記載する任意の抗アンドロゲンが、本明細書に提供する任意の方法に使用することができる。
ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物は、ｍＴＯＲインヒビターであってもよい。本明細書に提供する使用のためのｍＴＯＲインヒビターの例としては、限定はされないが、ラパマイシン、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）、ＺＯＲＴＲＥＳＳ（登録商標））、およびテニシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））が挙げられる。用語「ｍＴＯＲインヒビター」は、ｍＴＯＲインヒビター、ｍＴＯＲインヒビターアナログ、およびｍＴＯＲインヒビター誘導体を含む。
さらに、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲート、またはこの２つの組合せを含む組成物、例えば医薬組成物を本明細書に提供する。一部の実施形態では、組成物を被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与する。一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを含む組成物を被験体に投与し、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を含む別の組成物を被験体に逐次的または同時のいずれかで別個に投与する。あるいは、一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよびＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物の両方を含む組成物を被験体に投与する。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を含む組成物を被験体に最初に投与し、次いで、直後に、１時間以内に、数時間以内に、１日以内に、２日以内に、３日以内に、４日以内に、５日で、６日以内に、または１週間以上の内に、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを含む組成物を被験体に投与する。いずれの組成物も、１回または２回以上（例えば、２回、３回等）投与することができる。
本明細書で使用する場合、「ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物」は、ＰＳＭＡ発現細胞の正常な細胞表面発現に比較してまたはそのような化合物の非存在下での細胞表面発現に比較して、ＰＳＭＡの細胞表面発現を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％以上増大させる化合物を指す。例えば、抗アンドロゲンは、一部の実施形態では、がん細胞上のＰＳＭＡの細胞表面発現を少なくとも２０％以上増大させることができる。
組成物は、一部の実施形態では、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートと組み合わせて、生理学的または薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または安定剤を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る担体」または「生理学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合する、任意およびすべての塩、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。「薬学的に許容し得る担体」は、本明細書で使用する場合、ヒトへの投与に適した、１種または２種以上の適合性のある固体または液体の充填剤、希釈剤、または被包物質を指す。用語「担体」は、活性成分と組み合わせてその適用を促進する、天然または合成の有機成分または無機成分を示す。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与（例えば、注射または点滴による）に適することができる。
一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容し得る量で、かつ薬学的に許容し得る組成で被験体に投与することができる。用語「薬学的に許容し得る」は、活性成分（例えば、ＰＳＭＡリガンド、抗がん剤、細胞傷害性薬剤、抗アンドロゲン、ｍＴＯＲインヒビター）の生物活性の有効性を妨げない無毒物質を意味する。そのような組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、および場合によっては、アジュバント、ケモカイン、およびサイトカインを含む補助的な免疫増強剤などの他の治療剤を含有することができる。医薬で使用する場合、塩は薬学的に許容し得るべきであるが、薬学的に許容されない塩を好都合に使用して、その薬学的に許容し得る塩を調製してもよく、それは排除されるものではない。
塩は、親化合物の所望の生物活性を保持し、いかなる所望されない毒物学的効果も及ぼさない（例えば、（非特許文献４７）を参照のこと）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の無毒性無機酸に由来するもの、ならびに例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等の無毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属に由来するもの、ならびに例えばＮ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の無毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。医薬組成物は、塩中の酢酸；塩中のクエン酸；塩中のホウ酸；および塩中のリン酸を含む、適切な緩衝剤を含有することができる。
一部の実施形態では、組成物は、塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベン、および／またはチメロサールなど、適切な防腐剤を含有することができる。
一部の実施形態では、組成物は、単位投与剤形中に好都合に提供することができ、薬学技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。すべての方法は、活性化合物（複数可）（例えば、ＰＳＭＡリガンド、抗がん剤、細胞傷害性薬剤、および／またはＰＳＭＡの細胞表面発現をアップレギュレートする化合物）を、１種または２種以上の副成分を構成する担体と合わせるステップを含む。一部の実施形態では、活性化合物を、液体担体、微粉固体担体、またはその両方と均一かつ密接に合わせ、次いで必要に応じてその生成物を成形することにより、組成物を調製する。
非経口投与に適した組成物は、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／またはＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物（例えば、抗アンドロゲン、ｍＴＯＲインヒビター）の無菌の水性または非水性調製物を好都合に含むが、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張である。この調製物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の方法に従って製剤化することができる。無菌注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液のように、非経口的に許容し得る無毒な希釈剤または溶媒の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容し得るビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、および等張食塩水がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として従来通りに使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、（非特許文献４８）に見出すことができる。本明細書に提供する組成物はいずれも無菌であり得る。
活性化合物（例えば、ＰＳＭＡリガンド、抗がん剤、細胞傷害性薬剤、および／またはＰＳＭＡの細胞表面発現をアップレギュレートする化合物）は、植込剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む除放製剤など、迅速な放出から化合物を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が特許化され、当業者には一般に公知である。例えば、（非特許文献４９）を参照されたい。
注射または時間をかけた緩除な点滴によるものを含む、任意の従来の経路によって、組成物を投与することができる。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、腫瘍内、または経皮であってもよい。組成物を治療的に使用する場合、好ましい投与経路には静脈内および肺エアロゾルによるものが含まれる。抗体を含有するエアロゾル送達システムを調製するための手法は当業者に周知である。一般に、そのようなシステムは、パラトープ結合能などの抗体の生物特性を顕著に損なうことがない成分を利用するべきである（例えば、（非特許文献５０）を参照のこと。参照により組み込まれる）。当業者は、過度の実験作業に頼ることなく、抗体エアゾール剤を製造するための種々のパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
本明細書に提供する組成物は、一部の実施形態では、有効量で投与することができる。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と一緒に所望の反応をもたらす、例えば、ＰＳＭＡ発現細胞の細胞増殖を阻害し、かつ／またはＰＳＭＡ発現細胞を死滅させる、活性化合物（例えば、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／またはＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物）の量である。がんの場合には、これは、例えば一時的にがんの進行を単に遅延させることを含むことがあるが、より好ましくは、それはがんの進行を永続的に停止させることを含む。これはルーチン的な方法によりモニターすることができる。がんまたは他の疾患もしくは症状の治療に対する所望の反応はまた、発症の遅延であってよく、がんまたは他の疾患もしくは症状の発症の予防であってもよい。
そのような有効量は、治療される特定の症状（例えば、ＰＳＭＡを発現するがん）、症状の重症度、年齢、健康状態、大きさおよび体重を含む個々の患者のパラメーター、治療期間、併用療法（もしあれば）の性質、具体的な投与経路、および医療実務者の知識および専門技術の範囲内の要因などに、当然依存することになる。これらの要因は、当業者には周知であり、単なるルーチン的実験作業で取り組むことができる。個々の成分またはそれらの組合せの最大用量、すなわち、健全な医療判断による最大安全用量を使用することが一般に好ましい。しかしながら、患者／被験体が、医学的理由、心理的理由のために、または実質的には他の任意の理由のために、より低用量または耐用量を主張することがあることは、当業者には理解されよう。
本明細書に提供する組成物は、一部の実施形態では、無菌であり、患者／被験体への投与に適した重量または容量単位で所望の反応をもたらすための、有効量のＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／またはＰＳＭＡなどの細胞表面発現を増大させる化合物等を含有する。この反応は、例えば、腫瘍の退縮または病徴の軽減など、組成物の生理的効果を決定することにより測定することができる。他のアッセイが当業者に公知であり、反応レベルを測定するために使用することができる。
被験体に投与する組成物の用量は、種々のパラメーターに従って、具体的には、使用する投与方法および被験体の状態に従って、選ぶことができる。他の要因として、所望の治療期間が含まれる。被験体の反応が初回適用量で不十分な場合には、より高用量（または異なる、より局所的な送達経路による効果的な高用量）を患者の忍容性が許す範囲で使用することができる。
ＰＭＳＡリガンドコンジュゲートと抗アンドロゲンまたはｍＴＯＲインヒビターなど本明細書に提供する化合物との種々の併用により得られる相乗効果は、併用のいずれかの成分が単独で使用されたときに有効性のために必要とされる用量よりも少ない、有効性のある用量をもたらすことができる。用量低減効果のさらなる利点は、より広い安全性プロファイル、すなわちより少ない有害副作用のさらなる恩恵を受けることができることである。
例えば、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／またはＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物の用量は、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００，０００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。組成物に応じて、持続性ポンプによるなど持続的に、または間欠的に用量を送達することができる。特定の組成物の複数回投与の望ましい時間間隔は、過度の実験作業をすることなく、当業者により決定することができる。投与量、投与スケジュール、投与部位、投与方法等が前述のものとは異なる、組成物投与の他のプロトコールが、当業者には公知である。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの用量は、静脈内に投与される。そのような実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、一部の実施形態では、静脈内投与されるＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの用量は、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、静脈内投与されるＰＳＭＡリガンドコンジュゲートの用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜２．３ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートはＰＳＭＡ ＡＤＣであり、ＰＳＭＡ ＡＤＣは、約１．８ｍｇ／ｋｇ〜２．３ｍｇ／ｋｇの用量で提供される。
ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートが静脈内投与される時間の長さは異なり得る。一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、８５分間、または９０分間静脈内投与することができる。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、例えば、合計４、６、または８用量になるまで、１週間に１回、２週間に１回、または３週間に１回などの反復間隔で静脈内投与される。一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、１週間に２回以上静脈内投与される。
一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、合計８用量まで、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜２．３ｍｇ／ｋｇの用量で３週間に１回、約６０分間静脈内投与することができる。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンなどの本明細書に提供する化合物は、経口カプセル剤の形態で投与される。そのような実施形態では、そのような化合物の用量は、約４０ｍｇ〜約１６０ｍｇ（例えば、カプセル剤当たり２０ｍｇまたは４０ｍｇ）であり得る。例えば、一部の実施形態では、経口投与されるそのような化合物の用量は、４０ｍｇ、６０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、または１６０ｍｇである。一部の実施形態では、そのような化合物の経口用量は、約２１日〜約２８日の間、１日１回または１日２回投与される。一部の実施形態では、そのような化合物の用量は、８０ｍｇ（例えば、２つの経口カプセル剤、それぞれ４０ｍｇ）〜１６０ｍｇ（例えば、４つの経口カプセル剤、それぞれ４０ｍｇ）であり、２８日間、１日１回（ＯＤ）投与される。一部の実施形態では、そのような化合物は、８０ｍｇ（例えば、２つの経口カプセル剤、それぞれ４０ｍｇ）〜１６０ｍｇ（例えば、４つの経口カプセル剤、それぞれ４０ｍｇ）用量のエンザルタミド（ｅｎｚｕｌａｔａｍｉｄｅ）であり、２８日間、１日１回（ＯＤ）投与される。
一部の実施形態では、抗アンドロゲンなどの本明細書に提供する化合物の経口用量は、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇであり得る。例えば、一部の実施形態では、経口投与されるそのような化合物の用量は、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、または１０００ｍｇである。一部の実施形態では、そのような化合物の経口用量は、約２１日〜約２８日の間、１日１回または１日２回投与される。一部の実施形態では、そのような化合物の用量は５００〜１０００ｍｇであり、２８日間、１日１回（ＯＤ）投与される。一部の実施形態では、そのような化合物は、５００ｍｇ〜１０００ｍｇ用量のアビラテロンまたは酢酸アビラテロンであり、２８日間、１日１回（ＯＤ）投与される。
一部の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、１週間に１回の間隔で約５〜２５ｍｇのＩ．Ｖ．用量で投与される。別の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、１週間に１回の間隔で５〜１０ｍｇのＩ．Ｖ．用量で投与される。一実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、１週間に１回の間隔で３０〜６０分間にわたり２５ｍｇＩ．Ｖ．投与されるテニシロリムス（Ｔｏｒｅｓａｌ（登録商標））である。
一般に、本明細書に提供するＰＳＭＡリガンドコンジュゲートにより送達される放射性核種の用量は、約０．０１ｍＣｉ／ｋｇ〜約１０ｍＣｉ／ｋｇの範囲であり得る。一部の実施形態では、放射性核種の用量は、約０．１ｍＣｉ／ｋｇ〜約１．０ｍＣｉ／ｋｇの範囲である。一実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートは、約１〜１０ＧＢｑのＩ．Ｖ．用量で提供される１３１Ｉ−ＭＩＰ−１０９５である。別の実施形態では、１３１Ｉ−ＭＩＰ−１０９５は、２〜８ＧＢｑの用量範囲で提供される。さらに別の実施形態では、平均線量は約５ＧＢｑである。所与の同位体の至適線量は、当業者に周知の簡単なルーチン的滴定実験により実験的に決定することができる。
例えば試験目的または獣医学的治療目的のために、ヒト以外の哺乳動物に本明細書に提供する組成物を投与することは、上記と実質的に同じ条件下で実施される。
本明細書に提供する組成物（例えば、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／またはＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を含む）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの化合物を、培養中の細胞に、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、または被験体に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで投与して、がんまたは他の疾患もしくは症状の治療、予防、または診断を行うことができる。本明細書で使用する場合、用語「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図するものである。好ましい被験体は、ＰＳＭＡの発現、典型的には異常発現（例えば、過剰発現）によって特徴づけられる障害を有するヒト患者を含む。
本明細書に提供する組成物は、一部の実施形態では、他の治療的処置療法と併せて使用することができる。そのような他の治療法には、外科手術、放射線、凍結手術、温熱療法、ホルモン療法、化学療法、ワクチン、および他の免疫療法が含まれる。
前立腺がんの被験体は、一部の実施形態では、ホルモン療法を受けたことがあるか、受けているか、または受ける予定がある。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供する組成物は、前立腺がんの場合などで、ホルモン療法の後に、それと一緒に、またはその前に被験体に投与することができる。前立腺がんのホルモン療法の例としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト（例えば、リュープロリド、ゴセレリン、およびブセレリン）、これらは精巣がテストステロンを生成するのを停止させることができる；本明細書の他の箇所で論述した抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド、およびニルタミド）、これらは、テストステロンなどのアンドロゲンの作用を遮断することができる；副腎がアンドロゲンを生成するのを防ぐことができる薬物（例えば、ケトコナゾールおよびアミノグルテチミド）；精巣摘出、これは、テストステロンなどの男性ホルモンの主な供給源である精巣の一方または両方を摘出して、産生されるホルモン量を減少させる外科的処置である；ならびにエストロゲン、これは精巣がテストステロンを生成するのを防ぐことができる。
多数の被験体が、本明細書に提供する方法および組成物から恩恵を受けることができる。一部の実施形態では、そのような被験体は、去勢体レベルの血清テストステロン（例えば、５０ｍｇ／ｄＬ未満）にもかかわらず、またドセタキセルによる前化学療法を受けたことがあるにもかかわらず、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有している。他の実施形態では、被験体は、転移性の去勢抵抗性前立腺がんを有し、タキサン化学療法による前処置を受けたことがあり、かつアビラテロンおよび／またはエンザルタミドの投与が進行中である。さらに他の実施形態では、被験体は、去勢体レベルの血清テストステロンにもかかわらず進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有し、アビラテロンおよび／またはエンザルタミドによる前処置を受けたことがあるが、細胞傷害性化学療法による前処置を受けたことがない。さらに他の実施形態では、被験体は、去勢体レベルの血清テストステロンにもかかわらず進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有し、アビラテロンおよび／またはエンザルタミドによる１回の前処置を受けたことがある。さらなる実施形態では、被験体は、去勢体レベルの血清テストステロンにもかかわらず進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有し、アビラテロンおよび／またはエンザルタミドによる前処置を受けたことがない。さらなる実施形態では、被験体は、去勢体レベルの血清テストステロンにもかかわらず、無症候性であるか、または最小限の症候性しか示さない転移性の去勢抵抗性前立腺がんを有し、アビラテロンおよび／またはエンザルタミドによる前処置を受けたことがない。一部の実施形態では、被験体は、安定な転移性去勢抵抗性前立腺がんを有し、アビラテロンおよび／またはエンザルタミドによる治療を受けている。他の実施形態では、被験体は、生化学的に再発性の前立腺がんを有し、以前に一次療法（例えば、根治的前立腺摘除（例えば、開腹、腹腔鏡、またはロボット支援）または放射線療法（例えば、線量漸増三次元原体ＲＴ、強度調節ＲＴ、密封小線源療法、またはそれらの組合せ）を受けたことがある。さらに他の実施形態では、被験体は、限局性ハイリスク前立腺がん（例えば、１ミリリットル当たり１０ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）を超える前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；１年当たり２ｎｇ／ｍｌを超えるＰＳＡ速度（それまでの１２か月間に２ｎｇ／ｍｌを超えるＰＳＡの上昇として定義される）；７（４＋３）以上のグリーソンスコア；または１０ｎｇ／ｍｌ以上のＰＳＡもしくは２ｎｇ／ｍｌ／年以上のＰＳＡ速度のいずれかである場合には、グリーソンスコア６）を有し、前立腺摘除術の候補である。
さらに、組成物（複数可）を含むキットを本明細書に提供する。一部の実施形態では、キットは、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物を含有する容器と、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲート（またはその成分）を含有する容器とを含む。キットは、本明細書に提供する少なくとも１つの追加の試薬をさらに含有することができる。一部の実施形態では、キットは、例えば試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、注射器等の１つもしくは複数の容器または一連の容器をその中に厳重に閉じ込めるために仕切られている運搬器を含むことができる。１つの容器または一連の容器は、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる１種または２種以上の化合物を含有することができる。別の容器または一連の容器は、一部の実施形態では、ＰＳＭＡリガンドコンジュゲート（またはその成分）を含有することができる。キットの成分は、水性媒体中にまたは凍結乾燥形態でパッケージすることができる。コンジュゲートの成分は、完全にコンジュゲートした形態で、中間体の形態で、またはキットの使用者によりコンジュゲートされる別々の部分として供給することができる。
キットはまた、一部の実施形態では、希釈剤、ならびに／または凍結乾燥形態のＰＳＭＡリガンドコンジュゲートおよび／もしくはＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させるための化合物を再構成するための説明書、またはキットの水性成分を希釈するための説明書を含むことができる。キットはまた、ＰＳＭＡの細胞表面発現を増大させる化合物および／またはＰＳＭＡリガンドコンジュゲートを併用するための説明書を含むことができる。
本発明を、以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これは、決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用された参考文献（参考論文、交付済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）のすべてについてその内容全体が、参照により本明細書に明確に組み込まれる。しかしながら、いかなる参考文献の引用も、前記参考文献が従来技術であると承認することを意図するものではない。
実施例１：ＰＳＭＡ ＡＤＣは、抗アンドロゲンおよびラパマイシンと相乗作用を示す
インヒビターについて、マトリックス形式で、一連の濃度にわたって、個々における、また併用における抗増殖活性を試験した。阻害データをＢｌｉｓｓ予測と比較し、実験結果と予測結果の差をマトリックス中の各点について計算した。正の差は相加効果を超える、すなわち相乗効果を示す。負の差は拮抗作用を示す。下記のように、結果について統計的有意性を評価した。
平均阻害データおよびＢｌｉｓｓ差を、エンザルタミド、アビラテロン、またはラパマイシンと併用したＰＳＭＡ抗体−薬物コンジュゲート（ＰＳＭＡ ＡＤＣ）について図２に示す。ヒートマップにより、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となるＢｌｉｓｓ差を示す。枠を使用して、統計的に有意なＢｌｉｓｓ差および対応するパーセント阻害を示す。ＰＳＭＡ ＡＤＣは、ＬＮＣａＰおよびＣ４−２細胞に対して同様の単剤活性を示し、それぞれの場合においてＩＣ５０値は約２００ｐＭであった。これらの結果は以前の報告（非特許文献５１，非特許文献５２）と一致する。エンザルタミド、アビラテロン、およびラパマイシンはそれぞれ、ＬＮＣａＰ細胞の増殖を阻害したが（図２Ａ）、単剤として使用した場合、Ｃ４−２細胞に対しては最小限の抗増殖効果しか示さなかった（図２Ｂ）。
Ｃ４−２細胞において直接的な抗増殖活性が欠如しているにもかかわらず、エンザルタミド、アビラテロン、およびラパマイシンはすべて、ＰＳＭＡ ＡＤＣの活性を有意に増強した。Ｂｌｉｓｓ差はほぼ４０％に及び、一連のインヒビター濃度および阻害レベルにわたって統計的に有意であった（図２Ｂ）。有意な拮抗作用は、これらの併用に対して、いずれの条件下でも観察されなかった。統計的に有意な相乗作用はまた、ＬＮＣａＰ細胞において、ＰＳＭＡ ＡＤＣ／エンザルタミドおよびＰＳＭＡ ＡＤＣ／アビラテロンの併用に対して観察された（図２Ａ）。しかしながら、Ｃ４−２細胞と比較して、その広がりおよび大きさはより限定的であった。同様に、ＬＮＣａＰ細胞において、Ｂｌｉｓｓ差も、ＰＳＭＡ ＡＤＣ／ラパマイシン併用に対して、濃度マトリックス全般にわたり正であった。しかしながら、どの値も統計的有意性には到達しなかった。
平均阻害データおよびＢｌｉｓｓ差を、抗アンドロゲンであるＡＲＮ−５０９またはＴＯＫ−００１と併用したＰＳＭＡ ＡＤＣについて図９に示す。ヒートマップにより、正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となるＢｌｉｓｓ差を示す。ＡＲＮ−５０９およびＴＯＫ−００１はそれぞれ、ＬＮＣａＰ細胞の増殖を阻害したが（図９Ａ）、単剤として使用した場合、Ｃ４−２細胞に対しては最小限の抗増殖効果しか示さなかった（図９Ｂ）。Ｃ４−２細胞において直接的な抗増殖活性が欠如しているにもかかわらず、ＡＲＮ−５０９およびＴＯＫ−００１は、ＰＳＭＡ ＡＤＣの活性を増強した。
観察された相乗作用がＰＳＭＡ ＡＤＣ／抗アンドロゲンの併用に特有のものであるか否かを判定するために、小分子リガンドを抗アンドロゲンと併用して試験した。平均阻害データおよびＢｌｉｓｓ差を、エンザルタミドと併用した小分子ＰＳＭＡリガンド−抗がん剤のコンジュゲート（ＥＣ１０６９）について図１１に示す。ヒートマップにより、相乗作用に対して正（緑色）、負（赤色）、またはほぼ０（黄色）となるＢｌｉｓｓ差を示す。
相乗作用の機序を分析する最初のステップとして、抗アンドロゲンおよびラパマイシンを、遊離ＭＭＡＥおよび非改変ＰＳＭＡ ｍＡｂと併用した。遊離ＭＭＡＥは、予想通りに（非特許文献５２）、ＬＮＣａＰおよびＣ４−２細胞の両方に対してナノモル以下の効力（ＩＣ５０、約０．５ｎＭ）を示した。エンザルタミドまたはアビラテロンと対にした場合には、遊離ＭＭＡＥは、ＬＮＣａＰ細胞では相加活性を示し、Ｃ４−２上では相加的から弱い相乗的な活性を示した（図３）。別の微小管インヒビターであるドセタキセルをエンザルタミドと併用した場合にも、同様の結果が得られた。ドセタキセル／エンザルタミド併用に対する統計的に有意な相乗作用の例は、散発的に過ぎなかった（図３）。
ラパマイシン／ＭＭＡＥ併用は、ＬＮＣａＰでは相加効果、Ｃ４−２細胞では中程度の相乗作用を示した（図４）。したがって、ラパマイシンは、両方の細胞株上で、ＰＳＭＡ ＡＤＣと比較して、ＭＭＡＥとの相乗作用はそれほど強力ではなかった。それにもかかわらず、ラパマイシン／ＭＭＡＥ併用は、Ｃ４−２細胞において、エンザルタミド／ＭＭＡＥ併用またはアビラテロン／ＭＭＡＥ併用と同様かまたはそれらより強力であるように見える。弱から中程度の相乗作用が、両方の細胞株において、ラパマイシンとエンザルタミドの間で観察された。Ｃ４−２細胞において、非阻害濃度のエンザルタミドが、ラパマイシンの弱い抗増殖活性を増強した（図４）。
非改変ＰＳＭＡ ｍＡｂは、単独、およびエンザルタミド、アビラテロン、またはラパマイシンとの併用の両方で不活性だった（図５）。個々の薬剤または併用の活性が極めて限定されているため、アッセイは、場合によっては２回のみ実施した。したがって、ＰＳＭＡ ＡＤＣと抗アンドロゲンとの併用で観察された頑強な相乗作用は、このコンジュゲートに特異的であり、その個々の成分のいずれにおいても再現されない。
対照として、模擬併用を準備し、２つの別々の添加によってＰＳＭＡ ＡＤＣをアッセイプレートに加えて、相乗作用について評価した。予想通りに、模擬併用は、いずれの細胞株でも、統計的に有意な相乗作用または拮抗作用を示さなかった。
実施例２：抗アンドロゲンは、時間依存的かつ用量依存的にＰＳＭＡ発現を可逆的に増大させる
さらなる研究では、相乗作用の有望な相関現象としてＰＳＭＡ発現の処理誘導変化を検討した。フローサイトメトリーおよびウエスタンブロッティングをそれぞれ使用して、細胞表面および全ＰＳＭＡを評価した。
エンザルタミドおよびアビラテロンは、両方の細胞株において、用量依存的にＰＳＭＡの細胞表面レベルを増大させた（図６Ａ〜Ｄ）。ＰＳＭＡ発現は、１ｍＭを超える抗アンドロゲン濃度で、処理７日後に約２倍になった。これに対して、ラパマイシンは、Ｃ４−２細胞においてのみ、ＰＳＭＡ発現を増大させた（図６Ｅ〜Ｆ）。低いナノモル濃度のラパマイシンで、Ｃ４−２細胞においてＰＳＭＡ発現の２倍超の増加を誘導するのに十分であった。
発現の動力学を究明するために、Ｃ４−２細胞をエンザルタミド（１ｍＭ）中で３週間培養した後、さらに８日間、薬物の非存在下で培養を継続した。細胞表面ＰＳＭＡをフローサイトメトリーにより測定した。ＰＳＭＡ発現は、エンザルタミドの存在下で時間経過と共に着実に増加した。２１日後、処理細胞上のＰＳＭＡ発現は、並行して継代した未処理細胞上の発現よりも４倍高かった。ＰＳＭＡ発現は、エンザルタミドの非存在下での培養で７日以内にベースラインレベルに戻った（図６Ｇ）。
ＰＳＭＡの処理誘導増大は、ウエスタンブロッティングによっても明らかになった（図７）。増大の大きさは、溶解物の段階希釈およびウエスタンブロットの半定量分析により判定すると、エンザルタミド処理ＬＮＣａＰ細胞について約５倍であった（図示せず）。エンザルタミド、アビラテロン、およびラパマイシンは、Ｃ４−２細胞において、ＰＳＭＡを同程度にアップレギュレートした。ＰＳＭＡ発現の大きさは、チャコール処理血清と共に培養した細胞で見られる発現に、抗アンドロゲンの存在下で近づいたが、それを超えることはほとんどなかった。全体として、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットのデータは、ＰＳＭＡ発現における処理誘導変化の一致したパターンを示した。
実施例３：ＡＲ、ＰＳＡ、およびＰＩ３Ｋ経路の成分における処理誘導変化
ＡＲ、ＰＳＡ、全Ａｋｔ、ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）、全Ｓ６、およびホスホＳ６のレベルを、ウエスタンブロッティングにより、処理前後で評価した。アクチンを全細胞負荷の尺度として調べた。予想通りに、ＰＳＭＡの抗アンドロゲン誘導アップレギュレーションには、ＰＳＡのダウンレギュレーションが伴った（図７）。これに対して、ラパマイシンはＰＳＡ発現を増大させた。この結果は、ラパマイシンまたはそのアナログについての以前の観察と一致している（非特許文献５３、非特許文献５４）。ラパマイシンによるＰＳＭＡおよびＰＳＡの同時アップレギュレーションは、抗アンドロゲンが及ぼす、ＰＳＭＡおよびＰＳＡに対して反対に働く効果と対照的である。ＡＲタンパク質レベルについては、処理による影響は軽度であった（図７）。
Ａｋｔ活性化は、ＬＮＣａＰ細胞の抗アンドロゲン処理またはラパマイシン処理に対する共通の反応であった。しかしながら、Ｃ４−２細胞のＡｋｔ活性化に対する処理の効果は限定されていた。同様に、抗アンドロゲンは、ＬＮＣａＰ細胞のホスホＳ６レベルを増大させたが、Ｃ４−２細胞では増大させなかった。これらの発見は、ＬＮＣａＰ細胞における、抗アンドロゲン処理に対するｍＴＯＲ媒介による適応と一致する。Ａｋｔのラパマイシン媒介活性化は、インシュリン受容体基質１を含むネガティブフィードバックループの破壊により起こることが知られている（非特許文献５５、非特許文献５６、非特許文献５７、非特許文献５８）。予想通りに、ラパマイシンは、ＬＮＣａＰおよびＣ４−２の両方におけるＳ６リン酸化を効果的に消失させ、ラパマイシンが両方の細胞株で薬理学的に活性であることが示された（図７）。
実施例５：他の薬物併用についての相加効果から弱い相乗効果
探索研究では、さらなる化合物群を、単独およびＰＳＭＡ ＡＤＣとの併用での活性についてスクリーニングした。これらの薬剤には、ＡｋｔインヒビターのＭＫ−２２０６（非特許文献５９）；ＰＩ３ＫインヒビターのＧＤＣ−０９４１（非特許文献６０）；プレドニゾン；およびキネシン紡錘体タンパク質（ｋｓｐ）Ｅｇ５のインヒビターであるＳＢ−７４３９２１（非特許文献６１）が含まれる。ＭＫ−２２０６およびＧＤＣ−０９４１は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の上流成分の選択的インヒビターである。プレドニゾンは、前立腺がんにおける、アビラテロンをベースとした治療レジメンおよびドセタキセルをベースとした治療レジメンの構成成分である。ＳＢ−７４３９３１は、ｃＢｉｏがんゲノミクスデータベース（非特許文献６２）内の遺伝子発現プロファイリングに基づいた本発明者らの研究に含まれており、原発性および転移性前立腺がん腫瘍内のＰＳＭＡおよびＥｇ５に対する、遺伝子の協調的発現（Ｐ＝０．０００００４）が示された。これらの化合物のそれぞれは、ＰＳＭＡ ＡＤＣ（図８）と併用すると、相加的から弱い相乗的な活性を示した。すなわち、Ｂｌｉｓｓ差は、ほとんどの条件に対して相乗作用の傾向を示し、少数の分離したケースで、統計的有意性に達した。どの併用に対しても、有意な拮抗作用は観察されなかった。プレドニゾンをその活性代謝物であるプレドニゾロンに置き換えた場合にも、同様の結果が得られた。
表２（図１９）に、この研究で観察された相乗作用の概要を示す。薬物：薬物併用のそれぞれについて、相乗作用の広がりを、薬物濃度のマトリックスにわたって統計的に有意な相乗作用をもたらした、評価可能な条件のパーセントとして表す。ＬＮＣａＰ細胞で観察された相乗作用の広がりに従って、最大から最小に併用を並べ替えた。ＰＳＭＡ ＡＤＣ／エンザルタミド併用およびＰＳＭＡ ＡＤＣ／アビラテロン併用が、ＬＮＣａＰ細胞において最も広がりのある相乗作用を示した。その次が、プレドニゾンまたはＳＢ−７４３９２１とＰＳＭＡ ＡＤＣの併用であった。ＰＳＭＡ ＡＤＣ／ＳＢ−７４３９２１併用については、いくつかの薬物−薬物併用が１００％超の阻害をもたらしたため、Ｂｌｉｓｓ差が評価できなかったので、データは注意して解釈すべきである。より焦点を絞った濃度範囲でこの併用をさらに試験することが当然必要である。ほとんどの併用が、ＬＮＣａＰ細胞において有意な相乗作用を示さなかった。
相乗作用はＣ４−２細胞ではより広範囲に及んだ。ＰＳＭＡ ＡＤＣ／エンザルタミド併用およびＰＳＭＡ ＡＤＣ／アビラテロン併用では、ＰＳＭＡ ＡＤＣまたはＭＭＡＥとラパマイシンとの併用がそうであるように、Ｃ４−２細胞において、相乗作用条件が高頻度に現れた。他の併用（例えば、ＭＫ−２２０６またはＧＤＣ０９４１とＰＳＭＡ ＡＤＣの併用）でも、Ｃ４−２細胞において有意な相乗作用が示されたが、ＬＮＣａＰ細胞では示されなかった（表２（図１９））。ＬＮＣａＰ細胞でもＣ４−２細胞でも有意な相乗作用を示さなかった併用は、ＰＳＭＡ ｍＡｂおよびＰＳＭＡ ＡＤＣ模擬併用を含むものであった。
材料および方法
材料
ＬＮＣａＰ細胞は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手した。Ｃ４−２は、ＬＮＣａＰのアンドロゲン非依存性サブクローンである（非特許文献６３）。ＬＮＣａＰおよびＣ４−２は、ＡＲのＴ８７７Ａ変異およびＰＴＥＮ発現の喪失を特徴とする（非特許文献６４、非特許文献６５）。これらの細胞株により、同質遺伝子的なバックグラウンドでのアンドロゲン依存の研究が可能になる。両細胞株を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルピン酸ナトリウム、１００μＭ非必須アミノ酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）中で継代した。細胞を共有バンクから引き出した後、１０継代以内に使用した。ＰＳＭＡ ＡＤＣは、記載のように（非特許文献５１）調製し、エンザルタミドおよびアビラテロン（親薬物）は、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（図１）から入手した。プレドニゾンおよびプレドニゾロンは、Ｓｉｇｍａから購入し；ラパマイシンは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。ＧＤＣ０９４１、ＭＫ−２２６、およびＳＢ−７４３９２１は、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製であった。以下の抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した：抗ＡＲ（ｓｃ−７３０５、４４１）および抗ＰＳＡ（ｓｃ−７６３８、Ｃ−１９）。２つのマウス抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを使用した。すなわち、ウェスタン用にＭＡＢ５４４（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびフローサイトメトリー用に３．９（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）。以下の抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した：全Ａｋｔ（＃２９２０Ｓ）、ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３、＃４０５１Ｌ）、全Ｓ６（＃２３１７Ｓ）、およびホスホＳ６（＃２２１１Ｌ）。抗アクチン抗体（ＭＡＢ１５０１）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。アイソタイプ特異的二次ＩＲＤｙｅ抗体は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。
細胞生存率アッセイ
細胞を、３８４ウェルの白色マイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に、２５μＬ中１×１０３細胞の密度で播種し、一晩培養した。翌日、細胞を、全量５０μＬ中で１つまたは２つの薬物で処理した。培養物を３７℃で７時間インキュベートした。生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および５６０ｎｍの発光に対するＡｎａｌｙｓｔ ＧＴルミネセンスリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、０日目および７日目に評価した。増殖のパーセント阻害は、（Ｖｕ−Ｖｔ）／（Ｖｕ−Ｖ０）×１００として計算した。ここで、Ｖｕ、Ｖｔ、およびＶ０はそれぞれ、７日目の未処理細胞の生存値、７日目の処理細胞の生存値、および０日目の処理前の細胞の生存値を表す。１００％の値は、増殖の完全な阻害（Ｖｔ＝Ｖ０）を反映する。１００％超の値は、細胞傷害性の化合物または併用を反映し、そこではＶｔ＜Ｖ０となる。
フローサイトメトリー
短期間処理（≦７日）の場合には、５００μＬ当たり２００，０００細胞の密度で、一晩、２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）上に細胞を播種した。翌日、ウェルを、インヒビターを含む、５００μＬの新鮮培地に交換し、指定時点まで３７℃でインキュベートした。長期間処理（＞７日）の場合には、５ｍＬの培地中、フラスコ当たり５００，０００細胞の密度で、一晩、２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）上に細胞を播種した。５ｍＬの処理または未処理の新鮮培地に、翌日交換した。その後、毎週ごとに、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ溶液（Ｓｉｇｍａ）で細胞を剥離し、新鮮培地で洗浄し、Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントし、２つのＴ−２５フラスコ中に分割して入れ、インヒビターを含有または非含有の状態で培養を継続した。分析前に、細胞を剥離し、カウントし、０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）および０．１％アジ化ナトリウム（ＶＷＲ）を含有するＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇを含有しないＰＢＳ（−）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した。細胞（１００μＬ中に１００，０００）を丸底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に入れ、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬの抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ３．９と共に、室温で３０分間インキュベートした。次いで、２００μＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジド緩衝液で２回細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して読み取った。無関係の特異性のマウスＩｇＧ２ｂ−ＰＥコンジュゲート（Ａｂｃａｍ）をアイソタイプ対照として含めた。
ウエスタンブロッティング
細胞（３００，０００）を、１０％ＦＢＳのＲＰＭＩ１６４０培地４ｍＬ中にて、６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）で一晩インキュベートした後、インヒビターを加えた。プレートをさらに７日間、３７℃でインキュベートし、５ｍＬの冷ＰＢＳ（−）で１回洗浄し、氷上に置いた。細胞を１３０μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解し、次いで、４℃で１０分間、１４０００×ｇで遠心分離した。上清について、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してタンパク質濃度を定量し、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して還元条件下で分離し、ｉＢｌｏｔ ７−Ｍｉｎｕｔｅ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ニトロセルロースに転写した。メンブレンをＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロックし、一次抗体および二次抗体と共にインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージャー（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して視覚化した。
相乗作用計算および統計的方法
他に指示がない限り、薬物併用について、独立した細胞生存率アッセイを３〜７回繰り返して試験した。阻害データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、４パラメーターロジスティック式に適合させた。潜在的な非相加効果は、Ｂｌｉｓｓ独立法（Ｂｌｉｓｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）（非特許文献６６、非特許文献６７、非特許文献６８）により評価した。手短に言えば、併用（Ｆｃ）の予測Ｂｌｉｓｓ値を、Ｆｃ＝Ｆａ＋Ｆｂ−（Ｆａ×Ｆｂ）として計算した。ここで、ＦａおよびＦｂは、単独で使用した化合物ＡおよびＢに起因する増殖阻害率の観測値を表す。Ｂｌｉｓｓ差は、実験的に観察された阻害から予測値（Ｆｃ）を減じることにより計算した。平均Ｂｌｉｓｓ差を、薬物−薬物併用のマトリックスの各点について計算し、パーセントに変換し、０．０５の有意水準による両側ｔ検定を使用して、０のヌル値からの統計的有意性を評価した。増殖阻害率が１００％を超える場合、そのような値はＢｌｉｓｓの枠組みの外側になるので、統計的評価を実施しなかった。加えて、５％未満のＢｌｉｓｓ差は、生物学的関連性が限定されていると見なし、相乗作用の検討から除外した。
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Claims (21)

  1. アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、またはガレテロンである、抗アンドロゲンと、
    前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートと
    を含む、抗アンドロゲン療法単独に非感受性の細胞を含むＰＳＭＡ発現がん細胞の増殖を阻害するための組成物であって、
    コンジュゲートのＰＳＭＡリガンドが、ＰＳＭＡ上の酵素部位に特異的に結合し、グルタメート−尿素−アミノ酸部分を含む小分子リガンドを含む、前記組成物。
  2. グルタメート−尿素−アミノ酸部分のアミノ酸が、リジンまたはグルタメートである、請求項１に記載の組成物。
  3. アミノ酸がリジンである、請求項２に記載の組成物。
  4. アミノ酸がグルタメートである、請求項２に記載の組成物。
  5. 小分子リガンドが、ＭＩＰ−１０９５、ＭＩＰ−１０７２、またはＤＵＰＡを含む、請求項１に記載の組成物。
  6. ＰＳＭＡリガンドコンジュゲートが、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉ１２４、Ｂｒ７５、Ｂｒ７７、およびＦ１８からなる群から選択される細胞傷害性放射性核種にコンジュゲートしたＭＩＰ−１０９５またはＭＩＰ−１０７２を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 細胞傷害性薬剤が、細胞傷害性放射性核種を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現がん細胞の増殖を阻害する方法であって、前記方法が、
    ＰＳＭＡ発現がん細胞を、抗アンドロゲンに接触させることと、
    前記ＰＳＭＡ発現がん細胞を、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートに接触させることと
    を含む前記方法における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 抗アンドロゲンが、ＰＳＭＡ発現をアップレギュレートするのに有効な量である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 抗アンドロゲンをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを前記ＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとが、同時である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 抗アンドロゲンをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップと、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを前記ＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップとが、逐次的である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 抗アンドロゲンをＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップが、ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを前記ＰＳＭＡ発現がん細胞に接触させるステップの前である、請求項１２に記載の組成物。
  14. ＰＳＭＡ発現がん細胞が、ＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. ＰＳＭＡ発現がん細胞が、被験体由来である、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 被験体が、進行性の転移性去勢抵抗性前立腺がんを有する、請求項１５に記載の組成物。
  17. 被験体が、少なくとも１種のタキサンによる前化学療法を受けたことがある、請求項１５または１６に記載の組成物。
  18. 被験体が、１種または２種以上の抗アンドロゲンによる前処置を受けたことがある、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 被験体が、前処置にもかかわらず進行した前立腺がんを有する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 被験体が、以前に細胞傷害性化学療法を受けたことがない、請求項１５または１６に記載の組成物。
  21. アビラテロン、エンザルタミド、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、ＡＲＮ ５０９、またはガレテロンである、抗アンドロゲンを含有する容器と、
    ＰＳＭＡリガンド−細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを含有する容器と
    を含み、前記コンジュゲートが、請求項１〜７のいずれか一項に定義される、キット。
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