JP6947909B2 - マルチアーム標的抗がんコンジュゲート - Google Patents

Description

本発明はマルチアームポリマーで修飾された標的抗がんコンジュゲートに関し、より詳細には、本発明は、マルチアームポリマーを介して、標的分子と抗がん薬物とを連結してなるコンジュゲートに関する。

近年、生理活性物質の安定性及び送達を改善するための様々な方法が提案されている。医薬品用試薬の製造及び送達に関連する課題として、該医薬品用試薬の悪い水溶性、毒性、低いバイオアベイラビリティ、不安定さ、及び薬剤の迅速な生体内分解性が挙げられる。医薬品用試薬の送達を改善するために多くの方法が設計されているが、欠点のない単一の方法はない。例えば、通常使用される薬物送達方法は、リポソーム、ポリマーマトリックス、又は単分子ミセル内での薬物カプセル化、ポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーへの共有結合、遺伝子標的化剤の使用、塩類の構造等のうちの少なくとも１つ又は複数の課題を解決することを目的とする。

ＷＯ２００５０２８５３９、ＷＯ２０１００１９２３３、ＷＯ２０１１０６３１５６、ＷＯ２０１１０６３１５８には、第ＩＩＩ相臨床試験段階の薬物であるｎｋｔｒ １０２が開示され、該薬物は主に転移性乳がんに用いられ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに研究開発されたものである。該薬物は、薬物の担持を高めるための水溶性多分岐ポリマー薬物前駆体であり、その構造は下記のとおりである。

該化合物は、水溶性を高め、薬物担持量を増加させるように、マルチアームＰＥＧを介してイリノテカンと連結してなるものであり、抗がん作用が変わらない前提では、副作用は低減される。しかし、該薬物は、例えば、標的指向性が悪く、特定のがん細胞に作用できず、がん細胞を殺すと同時に正常細胞の性能にも影響を与えることから、不良反応の発生率は依然として高いという欠点がある。

本発明は、標的指向性を有する新たな多分岐薬物コンジュゲートに関するものであり、該コンジュゲートは、３つ以上の分岐を有し、下記式で示される。

式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、ｑは３〜８の任意の整数である。また、Ｌは下記式で示されるものである。

記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示し、ｌは２〜２０の任意の整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ０〜１０の任意の整数である。

Ｄは式（II）で示されるカンプトテシン系薬物である。

式中、Ｒ₁〜Ｒ₅はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基からなる群より選択され、Ｒ₆は、Ｈ又はＯＲ₈であり、Ｒ₈は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、又はヒドロキシアルキル基であり、Ｒ₇は、ヒドロキシ基、アミノ基、又はチオール基である。

ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、四者は共に該多分岐薬物コンジュゲートの「分岐」を構成する。該多分岐薬物コンジュゲートの各分岐は、ほかの分岐とは相互に独立している。各分岐は、有機中心である「Ｒ」から伸びるものである。なお、通常、該コンジュゲートの各分岐はすべて同じである。

以下、構造式（Ｉ）中の各変数について詳しく説明する。

有機中心である「Ｒ」について、構造式（Ｉ）において、「Ｒ」は１〜１００個の原子を含む有機中心基である。好ましくは、Ｒは３〜５０個の原子を含み、より好ましくはＲは約３〜３０個の原子を含む。Ｒは、使用される特別な中心分子によって、炭素原子からなる中心基であってもよく、例えばＯ、Ｓ、Ｎ、Ｐ等のヘテロ原子を１個又は複数個を選択的に含んでもよい。Ｒは直鎖、分岐又は環状のいずれであってもよく、少なくとも３つの独立したポリマー支鎖に分岐する。構造式（Ｉ）において、「ｑ」は、「Ｒ」から枝分かれしたポリマー支鎖の数に対応する。

有機中心「Ｒ」は、１つの分子から誘導されるものであり、該分子は、複数のポリマー結合部位を提供し、その数が、ポリマー支鎖の数にほぼ等しい。より好ましくは、多分岐ポリマー構造の主な中心の分子式は、ポリマー分岐として好適な、ヒドロキシ基、チオ基、又はアミノ基を有するポリヒドロキシ化合物、ポリスルフィド化合物、又はポリアミン化合物の残基を少なくとも３つ以上有する。１つの「ポリヒドロキシ化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なヒドロキシ基を含有する分子である。１つの「ポリスルフィド化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なチオ基を含有する分子である。１つの「ポリアミン化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なアミン基を含有する分子である。ポリマー分岐数により、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミン化合物又はポリスルフィド化合物の母体（ＰＯＬＹと共有結合する前の状態）は、典型的には、ヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜２５個有し、より好ましくはヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜１０個有し、最も好ましくはＰＯＬＹとの共有結合に好適なヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３個〜約８個（例えば３、４、５、６、７又は８）有する。

ポリヒドロキシ化合物又はポリアミン化合物の場合、中心の母体は、ポリマーと作用する前に、典型的には、構造式Ｒ−（ＯＨ）ｐ又はＲ−（ＮＨ₂）ｐを１つ有する。構造式（Ｉ）において、ｐ値はｑ値に対応するものである。その理由は、母体の有機分子中の各機能性基、典型的には−ＯＨ及び−ＮＨ₂は、位置が影響されやすく、又は反応が発生しやすい場合、ポリマー分岐であるＰＯＬＹと共有結合することになるだと考えられる。構造式（Ｉ）中、ＰＯＬＹに連結した後、Ｒ母体のポリヒドロキシ化合物のヒドロキシ基はすべて１つのポリマー分岐に変化し、前記Ｒは連結後の残基である。例えば、有機中心分子がペンタエリスリトールから誘導された場合、ポリヒドロキシ化合物の母体は、構造式Ｃ（ＣＨ₂ＯＨ）₄を有し、有機中心基Ｒは下記式で示される。

ポリマー中心として好ましい例示的なポリヒドロキシ化合物は、例えば、エチレングリコール、アルカンジオール、ヒドロカルビルグリコール、アルキレンヒドロカルビルグリコール、ヒドロカルビルシクロアルキルグリコール、１，５−ナフチレングリコール、４，８−ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキレングリコール、ジヒドロキシアルカン、トリヒドロキシアルカン、テトラヒドロキシアルカン等の１〜１０個の炭素原子及び１〜１０個のヒドロキシ基を有する脂肪族ポリヒドロキシ化合物が挙げられる。脂環式ポリヒドロキシ化合物は、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ロイコシド、トレイトール、アラビトール、エリスリトール、ガラクチトール、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タガトース、ピラノシド、スクロース、ラクトース、マルトース等の直鎖状又は閉環式の糖類及び糖アルコールが挙げられる。また、カテコール、ヒドロカルビルカテコール、ピロガロール、フロログルシンフェノール、１，２，４−ベンゼントリオール、レゾルシン、ヒドロカルビルレゾルシン、ジヒドロカルビルレゾルシン、オルシノール一水和物、オリーブフェノール、ヒドロキノン、ヒドロカルビルヒドロキノン、フェニルヒドロキノン等の芳香族ポリヒドロキシ化合物を使用することもできる。ほかに使用可能なポリヒドロキシル化合物中心としては、クラウンエーテル、シクロデキストリン、デキストリン、又はほかの炭水化物を含み得る。

構造式（Ｉ）中、ｑは、対応する「Ｒ」に連結しているポリマー分岐の数を示し、具体的に３〜２０であってもよい。典型的には、「ｑ」の具体的な数字が３、４、５、６、７、８であってもよい。具体的には、「Ｒ」を中心として３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つのポリマー支鎖に分岐してもよい。

一部の実施の形態において、「Ｒ」は３つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は、好ましくは、

である。

一部の実施の形態において、「Ｒ」は４つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は、好ましくは、

である。

一部の実施の形態において、「Ｒ」は６つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は、好ましくは、

である。

一部の実施の形態において、「Ｒ」は８つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は、好ましくは、

である。

ポリマー、「ＰＯＬＹ」について、構造式（Ｉ）中、「ＰＯＬＹ」はポリマーであり、各ポリマー分岐におけるＰＯＬＹは独立して選択されるものであり、好ましくは各ポリマーは同じポリマーであり、より好ましくは各構造式（Ｉ）中のポリマー分岐は同じである。好ましいポリマーは水溶性であり、任意の水溶性ポリマーを本発明のコンジュゲートの形成に使用できる。本発明でいうポリマーは、任意の幾何学的形態又は形状であってもよい。代表的なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸アミン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアクリル酸、ポリ酢酸ビニル、ポリフォスファジン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）等を含むが、これらに限定されない。

典型的な化合物としては、「ＰＯＬＹ」はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、直鎖、分岐、フォーク型等の任意の幾何学的形態又は形状であってもよい。ここで使用される「ポリエチレングリコール」は、任意の水溶性ポリエチレンオキシドを含むことを意味する。典型的には、本発明で使用されるＰＥＧは、「（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_k−」又は「（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_k−ＣＨ₂ＣＨ₂−」という２つの構造から選択される１つを含み、１個又は複数個の末端酸素が例えば１つの合成変換中に置換されたかにより決められる。変数ｋの数値範囲は５〜約５００であり、且つこれらの末端基及び全体的なＰＥＧの構造は変更されてもよい。前記ポリエチレングリコール構造は通常、さらに一部の末端残基を含有し、ＰＯＬＹの末端基に類似するように、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基）、Ｃ_1-6アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基）、アシル基、又はアリール基を末端とすることができる。

本発明では、好ましい「ＰＯＬＹ」は線状ポリエチレングリコールである。典型的な構造は、

（式中、「

」は、原子の結合点を示し、「＆」付きの酸素原子は、有機中心「Ｒ」と結合する原子である。ただし、ｋの数値範囲は約５〜５００であり、最も好ましくは５０〜２００であり、ｒは１〜１０の任意の整数である。）であり、より好ましくは、本発明の「ＰＯＬＹ」は、

或いは

である。

本発明の「ＰＯＬＹ」はさらに、

などであってもよい。

本明細書で記載する活性剤「Ｄ」は、カンプトテシン系抗がん剤であり、カンプトテシン系薬物は、臨床で用いられるトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、高活性でありながら、水溶性が悪く、正常な生体組織への毒性副作用が大きい等の欠点を有するため、カンプトテシン系抗がん剤の臨床応用が大いに制限されている。

Ｄの構造中のＲ₇は、例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、又はチオール基等の多価リンカーＬと共有結合する基であり、好ましくはヒドロキシ基である。活性剤Ｄが多価リンカーＬに連結する際に、生物学的活性は大幅に損失しないことが要求される。

本発明では、活性剤は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンであることが好ましい。その詳細は下記表に示す。

本発明では、「Ｔ」は標的分子であり、医薬用途を有しても有しなくてもよい。該標的分子の作用は、該コンジュゲートの目標組織における濃度をさらに高め、生理活性又は医薬用途を向上させるように、標的指向性を向上させることである。「Ｔ」は、単機能標的分子であってもよく、多機能標的分子であってもよい。一部の具体的な実施の形態において、「Ｔ」は、２個以上の標的分子からなる標的部分であってもよい。一部の具体的な実施の形態において、「Ｔ」は、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」の配列を含むＲＧＤペプチドであってもよい。ＲＧＤペプチドは、インテグリンとその受容体タンパク質とが相互作用する認識部位である。好ましいＲＧＤペプチドとしては、ｉＲＧＤ及びｃＲＧＤ等が挙げられる。Ｔは、Ｌｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２又はＧＥ１１であってもよい。

ｉＲＧＤの構造は以下のとおりである。

ｃＲＧＤは一連の化合物であり、典型的な化合物は下記のものを含む。

好ましいｃＲＧＤは、

である。

ｔＬｙｐ−１の構造は以下のとおりである。

Ｌｙｐ−１の構造は以下のとおりである。

ＲＰＡＲＰＡＲのポリペプチド配列は、アルギニン−プロリン−アラニン−アルギニン−プロリン−アラニン−アルギニンであり、その構造は以下のとおりである。

Ａｎｇｉｏｐｅｐ２のポリペプチド配列は、ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹであり、その構造は以下のとおりである。

ＧＥ１１のポリペプチド配列は、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩであり、その構造は以下のとおりである。

本明細書で記載する活性剤「Ｄ」は、非変性母体活性剤の一部、又は、薬物と本発明の多価リンカーとが共有結合して生成する共有結合鎖（或いはその活性化又は化学変性の形態）の前の未変性母体活性剤の残基である。活性剤部分と多価リンカーとの間の連結基が加水分解又は酵素分解された時、活性剤自体は放出される。

本発明の目的によれば、技術用語「残基」は、化合物の一部であって、もう１つの化合物と置換反応した後の残留物であると理解されるべきである。

本発明のコンジュゲートが生体内に入り、標的細胞又は標的組織に到達した時、活性剤Ｄと多価リンカーＬとが切断され、活性剤Ｄは、改良されていない形態、つまり、共有結合が形成されていない形態で放出され、母体から分離し、生理活性を発揮する。

本発明の好ましい実施の形態では、「ＰＯＬＹ」は、線状ポリエチレングリコール結合アームであり、つまり、本発明のコンジュゲートは、下記したいくつかの種類の化合物を含む。

４アームタイプ：

３アームタイプ：

８アームタイプ：

上記の式において、ｋの数値範囲は約５〜５００であり、最も好ましくは５０〜２００であり、ｒは１〜１０の任意の整数である。

本発明では、式（III）の化合物が好ましい。式（III）において、ｋは、１１３であることが好ましい。この分野の技術者であれば、高分子分野では、ｋが前記ポリマーの重合度を表し、前記ポリマーの分子量により決められ、絶対的な数値ではないこと、例えば、ｋが１１３であるとき、平均値が１１３を意味することと理解されるべきである。

より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２又はＧＥ１１からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。

より好ましい実施の形態において、Ｌは、

からなる群より選択される１種である。

式（III）に基づき、一部の実施の形態において、本発明の化合物は下記のようになる。

化合物ａ：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｃＲＧＤである。

より具体的には、化合物ａは下記形態のように表すこともできる。

化合物Ａは、化合物ａの塩酸塩である。

化合物ｂ：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｉＲＧＤである。

化合物Ｂは、化合物ｂの塩酸塩である。

化合物ｃ：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｔＬｙＰ−１である。

化合物Ｃは、化合物ｃの塩酸塩である。

化合物ｄ：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。

化合物Ｄは、化合物ｄの塩酸塩である。

化合物ｅ：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＡｎｇｉｏｐｅｐ−２である。

化合物Ｅは、化合物ｅの塩酸塩である。

より具体的には、化合物ｅは下記形態のように表すことができる。

化合物ｆ：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＧＥ１１である。

化合物Ｆは、化合物ｆの塩酸塩である。

より具体的には、化合物ｆは下記形態のように表すこともできる。

なお、塩を形成する際に、本発明のコンジュゲートの分岐とＨＣｌとがそれぞれ塩を形成する。例えば、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄでは、各分岐に２分子のＨＣｌを有するため、分子全体としては、８つのＨＣｌを有することになる。化合物Ｅでは、各分岐に６分子のＨＣｌを有するため、分子全体としては、２４分子のＨＣｌを有することになる。化合物Ｆでは、各分岐に３分子のＨＣｌを有するため、分子全体としては、１２個のＨＣｌを有することになる。

本発明の主旨によれば、上記開示されている具体的な化合物のほか、この分野の技術者は、さらに本発明に記載の実施の形態及び製造方法に従い、より多くのコンジュゲートを製造することができる。例えば、
１．ＤがＳＮ−３８であり、ＴがそれぞれｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２又はＧＥ１１であるコンジュゲート、２．Ｄが１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴがそれぞれｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２又はＧＥ１１であるコンジュゲート、３．Ｄがルビテカンであり、ＴがそれぞれｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２又はＧＥ１１であるコンジュゲートが挙げられる。

本発明のコンジュゲートは典型的な薬物前駆体であり、加水分解作用又は酵素分解作用により、活性剤Ｄが放出され、母体から分離し、生理活性を発揮する。本発明のコンジュゲートは高担持能力を示すため、総投与量を低減して、例えばがん等の特殊な疾患を治療することができる。つまり、本発明のコンジュゲート活性剤担体は、共有結合で複数種の活性剤分子と効果的に連結できるため、一定量のコンジュゲートあたりに、より多くの量の治療剤形（つまり、活性剤部分）を投与することが許容される。本発明のコンジュゲートは、水溶性ポリマーの修飾により、実質的に親水性となり、特に活性剤が水難溶性薬物である場合、コンジュゲートのバイオアベイラビリティを向上できる。本発明のコンジュゲートは、カップリングされていない薬物に比べ、より強い作用を示し、ヒト又はほかの動物の体内組織に豊富に存在することができる。

本発明におけるコンジュゲート薬物前駆体は、特に活性剤が１つの抗がん化合物である場合、様々な独特な性質を有する。このような薬物前駆体は、腫瘍の増殖をより高効率的に抑制することができる。使用するこのような小分子は、抗がん特性を有するものとして知られている小分子である。しかし、上記のように多分岐ポリマーと結合することで、その治療効果及び薬物代謝動態学は該小分子（例えば抗がん化合物自体）に比べ、大いに改良された。対象とされうる固形腫瘍の種類としては、結腸癌、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ、及び、乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫が挙げられる。

上記のように、本発明は、マルチアームポリマーで修飾された標的抗がんコンジュゲートに関するものである。そのうち、水溶性ポリマーによる修飾は、該コンジュゲートの水溶性を高め、薬物担持量を高めることができる。標的分子は、標的指向性を高め、該コンジュゲートの目標組織における濃度をさらに高められる。Ｌは、任意の連結リンカーであり、その作用は、標的分子と抗がん薬物とを連結してから、さらに標的分子、抗がん薬物及びポリマーアームを連結し、コンジュゲートを１つのものとすることである。

本発明のコンジュゲートの薬学的に許容される塩は、塩酸塩であることが好ましく、薬化学分野の一般の手段により塩を形成することができ、また、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩等であってもよい。

また、本発明は前記コンジュゲートの製造方法を提供する。本発明のコンジュゲートの製造過程では、ＰＯＬＹ及び有機中心Ｒは実質上マルチアームポリマーを形成している。本発明の好ましい実施例では、該マルチアームポリマーはマルチアームポリエチレングリコールであり、市販の原料から得ることができ、例えば北京鍵凱科技有限会社から各種類の４アーム、３アーム、８アームポリエチレングリコール誘導体を購入することができる。市販のこれらマルチアームＰＥＧは、反応に直接的に参与することができる。

式（III）のコンジュゲートを製造する際に、好ましく使用される４アームポリエチレングリコールは下記式に示す。

この好ましい４アームポリエチレングリコールは４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれており、その分子量が約２０ｋＤａである。同様に、式（IV）及び式（V）のコンジュゲートを製造する際に、使用される３アーム及び８アームポリエチレングリコールの分子量も約２０ｋＤａであることが好ましい。

以下、本発明について詳細に説明する。なお、本発明は様々な異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載された実施例に限定されるべきではない。これらの実施例を記載する目的は、開示内容をより完全且つ全面的にするためである。使用した試薬及び原料について、製造方法を開示したもの以外はすべて市販から入手したものであり、例えば４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭは北京鍵凱科技有限会社から購入したものである。

技術用語説明

実施例１

化合物２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、３．５０ｇの化合物１（１．０ｅｑ）、５２．５ｍｌのＤＭＦを加え、６０℃に加熱して溶解し、５〜１０ｍｉｎ後にＤＭＦを減圧留去し、３００ｍｌのｎ−ヘプタンを加えて減圧蒸留し、３回繰り返し、遠心脱水後、１０５ｍｌのＤＣＭ、１．０８ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、６３ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、１．５９ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮して１２０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１５０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥し、淡黄色の固体として、４．０２ｇの化合物２を得た。

化合物３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．０２ｇの化合物２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌して溶解させた後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄し、淡黄色の固体として、４．００ｇの化合物３を得た。

実施例２

化合物５の作製
２５０ｍＬの三ツ口フラスコに、６．９ｇの化合物４、３０ｍｌのＥＡを加え、攪拌して溶解させた後に０℃まで降温させ、４０ｍｌの０．３ＭのＨＣｌ／ＥＡを加え、保温して２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、濃縮乾固させ、化合物５を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物６の作製
化合物５（１．０ｅｑ）を５０ｍｌの精製水で溶解し、３．９６ｇの炭酸水素ナトリウム（２．０ｅｑ）を加え、５０ｍｌのＤＭＥで５．３０ｇのＦｍｏｃ−ＯＳＵ（１．０ｅｑ）を溶解し、化合物５のバイアル瓶に加え、２５ｍｌのＴＨＦを追加し、室温で２時間撹拌し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、有機溶媒を留去し、ＥＡで不純物を抽出し、希塩酸で水相をｐＨ３〜４に調整し、ＥＡで２回抽出し、有機層を合併し、１回水洗し、飽和食塩水で洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、淡黄色の油状物として、８．４ｇの化合物６を得た。

化合物７の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、４．００ｇの化合物６（１．０ｅｑ）、２．９２ｇのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ、４０ｍｌのＤＣＭを加えて溶解し、２．７６ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、１．７４ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２時間撹拌し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、酢酸水溶液による洗浄、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄をし、１回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、７．０ｇの淡黄色の油状物である化合物７を得、これを精製せずに直接的に次の反応に供した（同じ方法により化合物１６を作製。）。

化合物８の作製
１４０ｍｌの２５％のＤＥＡ／ＤＣＭで７．０ｇの化合物７を溶解し、室温で６時間撹拌し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、濃縮乾固させ、１５０ｍｌのＥＡを加え、希塩酸でｐＨ３〜４に調整し、分液し、水相をＥＡで２回抽出した後に、濃縮乾固させ、淡黄色の固体として、３．５ｇの化合物８を得た（同じ方法により化合物１７を作製。）。

実施例３ 保護基を連結した標的分子ｃＲＧＤ（化合物１１）の作製

化合物９の作製
Ｆｍｏｃ保護法に基づく２Ｃｌ−Ｔｒｔ Ｒｅｓｉｎを用い、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨといった順に保護アミノ酸を樹脂に連結し、Ｆｍｏｃを除去し、ＤＭＦによる洗浄、ＤＣＭによる洗浄をし、メタノール洗浄後に乾燥させ、開裂剤として醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥し、オフホワイトの固体として、化合物９を得た。

化合物１０の作製
２Ｌの三ツ口フラスコに、１４．０ｇの化合物９（１．０ｅｑ）を加え、１ＬのＤＭＦを加え、０℃まで降温させ、９．２ｇの炭酸水素ナトリウム（８．０ｅｑ）を加え、溶解して透明になった後に１５．１ｇのＤＰＰＡ（４．０ｅｑ）を加え、一晩保温し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、５Ｌの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、水洗し、飽和塩化ナトリウムで洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、オフホワイトの固体として、１１．５ｇの化合物１０を得た。

化合物１１の作製
１Ｌの水素化反応釜に、１１．５ｇの化合物１０、１Ｌのメタノール、２．５ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過し、濃縮し、灰色の固体として、１１．０ｇの化合物１１を得た。

実施例４ 保護基を連結した標的分子ｉＲＧＤ（化合物２０）の作製

Ｆｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ Ｒｅｓｉｎを用い、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ａｌｌｏｃ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨといったを順に保護アミノ酸を樹脂に連結し、ＤＭＦで洗浄した後に、トリフルオロ酢酸タリウム（２．０ｅｑ）を加えて１８時間撹拌し、次いでＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合させ、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、酢酸ピリジンを加え２０ｍｉｎ反応させ、ＤＭＦで洗浄し、３ｅｑのＰｄ（ＰＰｈ₃）₄のＣＨＣｌ₃：ＡｃＯＨ：ＮＭＭ（１８：１：０．５）溶液を加え、２ｈ反応させ、Ａｌｌｏｃを除去し、次いでクロロホルム（６^*２０ｍｌ）で洗浄し、２０％ＨＯＡｃのＤＣＭ溶液、ＤＣＭ及びＤＭＦで洗浄し、さらにＤＭＦによる洗浄し、ＤＣＭによる洗浄し、メタノールによる洗浄をした後に乾燥させ、１％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥し、オフホワイトの固体として、化合物２０を得た。

実施例５ 保護基を連結した標的分子ｔＬｙＰ−１（化合物３０）の作製

２Ｃｌ−Ｔｒｔ Ｒｅｓｉｎを用い、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨといった順に保護アミノ酸を樹脂に連結し、開裂剤として醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥し、オフホワイトの固体として、化合物３０を得た。

実施例６ 保護基を連結した標的分子ＲＰＡＲＰＡＲ（化合物４０）の作製

２Ｃｌ−Ｔｒｔ Ｒｅｓｉｎを用い、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨといった順に保護アミノ酸を樹脂に連結し、開裂剤として醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥し、オフホワイトの固体として、化合物４０を得た。

実施例７ 保護基を連結した標的分子Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２（化合物５０）の作製

Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２の配列はＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹである。

２Ｃｌ−Ｔｒｔ Ｒｅｓｉｎを用い、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨといった順に保護アミノ酸を樹脂に連結し、開裂剤として醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥し、オフホワイトの固体として、化合物５０を得た。

実施例８ 保護基を連結した標的分子ＧＥ１１（化合物６０）の作製

ＧＥ１１の配列はＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩである。

２Ｃｌ−Ｔｒｔ Ｒｅｓｉｎを用い、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし法、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、開裂剤として醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥し、オフホワイトの固体６０を得た。

実施例９ 化合物ａと化合物Ａの作製

化合物１２の作製
５ｍｌのバイアル瓶に、４８０ｍｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、３８０ｍｇの化合物８（１．１ｅｑ）、１ｍｌのＤＭＦ、２０３ｍｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、１２８ｍｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、１０ｍＬの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、希塩酸による洗浄し、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄、飽和塩化ナトリウムによる洗浄をした後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、０．８ｇのゼリー状の固体である化合物１２を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物１３の作製
２００ｍｌの水素化反応釜に、０．８ｇの化合物１０、３０ｍＬのメタノール、０．２８ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過、濃縮し、灰色の固体として、０．６６ｇの化合物１３を得た。

化合物１４の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、６．６０ｇの化合物１３（１．０ｅｑ）、３．５９ｇの化合物３（１．０５ｅｑ）、６６ｍｌのＤＭＦ、１．１６ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、１．１０ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、７００ｍｌのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、固体を１５０ｍｌのＤＣＭで溶解した後に１．５ＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥して、灰色の粉末として、９．０ｇの化合物１４を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物１５の作製
２５０ｍｌのバイアル瓶に、９．０ｇの化合物１４を加え、開裂剤として９２．５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％ＴＩＳを加え、室温で２ｈ撹拌し、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離し、洗浄し、粗生成物に逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、淡黄色のフロックとして、５．０ｇの化合物１５を得た。

化合物ａの作製
バイアル瓶に２．３ｇの化合物１５（４．５ｅｑ）、６．０ｇの４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）、６０ｍｌのＤＭＦ、０．２７ｇのＴＥＡ（９．０ｅｑ）を加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣにて反応が著しく進展しなくなったことをモニタニングした後に、１０００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にし、減圧ろ過し、乾燥して７．６ｇの粉末状粗生成物ａを得、ＨＰＬＣによる精製後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末として、３．４ｇの化合物ａを得た。

化合物Ａの作製
化合物ａの粉末状粗生成物を得た後に、ＨＰＬＣで精製して脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、希塩酸でｐＨ＝５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、黄緑色の粉末として、３．４ｇの化合物Ａを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検出した結果、分子量は２５４８０．２７であった。

実施例１０ 化合物ｂと化合物Ｂの作製

化合物２１の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、５．００ｇの化合物２０（１．０ｅｑ）、２．３６ｇの化合物１７（１．１ｅｑ）、５０ｍｌのＤＭＦ、１．１１ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．７１ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、３００ｍＬの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、酢酸水溶液による洗浄、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄、飽和塩化ナトリウムによる洗浄をした後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、７．１８ｇの淡黄色の固体である２１を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物２２の作製
２００ｍｌの水素化反応釜に、７．００ｇの化合物２１、１２０ｍＬのメタノール、０．３５ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過、濃縮し、灰色の固体として、７．０５ｇの化合物２２を得た。

化合物２３の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、７．００ｇの化合物２２（１．０ｅｑ）、２．２２ｇの化合物３（１．０５ｅｑ）、７０ｍｌのＤＭＦ、１．１０ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．７０ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、７００ｍｌのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にした後、減圧ろ過し、１００ｍｌのＤＣＭで固体を溶解させた後に、１．０ＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥させて、灰色の粉末として、８．６０ｇの化合物２３を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物２４の作製
８．６０ｇの化合物２３に、開裂剤としての醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を２００ｍｌ加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥、及びＨＰＬＣ精製を経て、２．１０ｇのオフホワイトの固体２４を得た。

化合物２５の作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、１．２３ｇの化合物２４（４．５ｅｑ）、２．００ｇの４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのＤＭＦ、０．０９ｇのＴＥＡ（９．０ｅｑ）を加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣによるモニタリングで反応が著しく反応しなくなったことを確認した後に、４００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にし、減圧ろ過し、乾燥して３．０５ｇの化合物２５を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物ｂの作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、３．０ｇの化合物２５、３０ｍｌの開裂剤としての９２．５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％ＴＩＳを加え、室温で２ｈ撹拌し、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末として、１．０２ｇの化合物ｂを得た。

化合物Ｂの作製
化合物ｂ粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、希塩酸でｐＨ＝５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、黄緑色の粉末として、１．０２ｇの化合物Ｂを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検出した結果、分子量は２９０１３．１９であった。

実施例１１ 化合物ｃと化合物Ｃの作製

化合物３１の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、５．６０ｇの化合物３０（１．０ｅｑ）、２．３９ｇの化合物１７（１．１ｅｑ）、６０ｍｌのＤＭＦ、１．０３ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．６５ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、３００ｍＬの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、酢酸水溶液による洗浄、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄し、飽和塩化ナトリウムによる洗浄をした後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、淡黄色の固体として、７．０８ｇの化合物３１を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物３２の作製
２００ｍｌの水素化反応釜に、７．０５ｇの化合物３１、１５０ｍＬのメタノール、０．３５ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過、濃縮し、灰色の固体として、６．９５ｇの化合物３２を得た。

化合物３３の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、６．８０ｇの化合物３２（１．０ｅｑ）、１．８９ｇの化合物３（１．０５ｅｑ）、７０ｍｌのＤＭＦ、０．９４ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．５９ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、７００ｍｌのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にした後、減圧ろ過し、１００ｍｌのＤＣＭで固体を溶解した後に、１．０ＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥させて、灰色の粉末として、８．２０ｇの化合物３３を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物３４の作製
８．２０ｇの化合物３３に、開裂剤としての醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を１６０ｍｌ加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥、及びＨＰＬＣ精製を経て、オフホワイトの固体として、５．６ｇの化合物３４を得た。

化合物３５の作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、０．７５ｇの化合物３４（４．５ｅｑ）、１．００ｇの４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのＤＭＦ、０．０５ｇのＴＥＡ（９．０ｅｑ）を加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣによるモニタリングで反応が著しく反応しなくなったことを確認した後に、２００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥して、１．６９ｇの化合物３５を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物ｃの作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、１．６５ｇの化合物２５、２０ｍｌの開裂剤としての９２．５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％ＴＩＳを加え、室温で２ｈ撹拌し、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末として、０．８４ｇの化合物ｃを得た。

化合物Ｃの作製
化合物ｃの粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、希塩酸でｐＨ＝５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、黄緑色の粉末として、０．８４ｇの化合物Ｃを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検出した結果、分子量は２８０７６．２１であった。

実施例１２ 化合物ｄと化合物Ｄの作製

化合物４１の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、６．２０ｇの化合物４０（１．０ｅｑ）、３．３０ｇの化合物１７（１．１ｅｑ）、６２ｍｌのＤＭＦ、１．４３ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．９０ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、３１０ｍＬの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、酢酸水溶液による洗浄、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄し、飽和塩化ナトリウムによる洗浄をした後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、淡黄色の固体である化合物４１を８．８４ｇ得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物４２の作製
２００ｍｌの水素化反応釜に、８．８０ｇの化合物４１、１５０ｍＬのメタノール、０．４４ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過、濃縮し、灰色の固体として、８．８４ｇの化合物４２を得た。

化合物４３の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、８．５０ｇの化合物４２（１．０ｅｑ）、２．７７ｇの化合物３（１．０５ｅｑ）、８５ｍｌのＤＭＦ、１．３８ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．８７ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、８５０ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、１１０ｍｌのＤＣＭで固体を溶解した後に１．１ＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥させて、灰色の粉末として、９．８６ｇの化合物４３を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物４４の作製
９．８０ｇの化合物４３に、開裂剤としての醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を２００ｍｌ加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥、ＨＰＬＣ精製を経て、オフホワイトの固体として、５．９２ｇの化合物４４を得た。

化合物４５の作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、０．６０ｇの化合物３４（４．５ｅｑ）、１．００ｇの４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのＤＭＦ、０．０５ｇのＴＥＡ（９．０ｅｑ）を加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣによるモニタリングで反応が著しく反応しなくなったことを確認した後に、２００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にし、減圧ろ過、乾燥して、１．４５ｇの化合物４５を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物ｄの作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、１．４５ｇの化合物４５、１５ｍｌの開裂剤としての９２．５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％ＴＩＳを加え、室温で２ｈ撹拌し、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末として、０．５７ｇの化合物ｄを得た。

化合物Ｄの作製
化合物ｄの粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、希塩酸でｐＨ＝５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、黄緑色の粉末として、０．５７ｇの化合物Ｄを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検出した結果、分子量は２７９６３．５４であった。

実施例１３ 化合物ｅと化合物Ｅの作製

化合物５１の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、６．２０ｇの化合物５０（１．０ｅｑ）、１．３９ｇの化合物１７（１．１ｅｑ）、６２ｍｌのＤＭＦ、０．６０ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．３８ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、１０ｍＬの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、酢酸水溶液による洗浄、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄、飽和塩化ナトリウムによる洗浄をした後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、ゼリー状の固体として、６．５ｇの化合物５１を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物５２の作製
２００ｍｌの水素化反応釜に、６．５３ｇの化合物５１、１５０ｍＬのメタノール、０．３３ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過、濃縮し、灰色の固体として、６．５０ｇの化合物５２を得た。

化合物５３の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、６．５０ｇの化合物５２（１．０ｅｑ）、１．０８ｇの化合物３（１．０５ｅｑ）、６５ｍｌのＤＭＦ、０．５４ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．３４ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、６５０ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、１００ｍｌのＤＣＭで固体を溶解した後に１．０ＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥して、６．７１ｇの灰色の粉末５３を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物５４の作製
２．５ｇの化合物５３に、開裂剤としての醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を５０ｍｌ加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥、及びＨＰＬＣ精製を経て、オフホワイトの固体として、０．９７ｇの化合物５４を得た。

化合物５５の作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、２．９１ｇの化合物５４（４．５ｅｑ）、３．００ｇの４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）、３０ｍｌのＤＭＦ、０．１３ｇのＴＥＡ（９．０ｅｑ）を加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣによるモニタリングで反応が著しく反応しなくなったことを確認した後に、３００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にし、減圧ろ過、乾燥して、５．８３ｇの５５を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物ｅの作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、２．０４ｇの化合物５５、３０ｍｌの開裂剤としての９２．５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％ＴＩＳを加え、室温で２ｈ撹拌し、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、凍結乾燥を経て、０．４２ｇのオフホワイトの粉末Ｅを得た。

化合物Ｅの作製
化合物ｅの粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、希塩酸でｐＨ＝５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、０．４２ｇの黄緑色の粉末Ｅを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検出した結果、分子量は３３８１２．６５であった。

実施例１４ 化合物ｆと化合物Ｆの作製

化合物６１の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、５．００ｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．６６ｇの化合物１７（１．１ｅｑ）、５０ｍｌのＤＭＦ、０．７２ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．４５ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、１０ｍＬの水に投入し、ＥＡで２回抽出し、酢酸水溶液による洗浄、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄し、飽和塩化ナトリウムによる洗浄をした後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、６．１４ｇのゼリー状の固体６１を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物６２の作製
２００ｍｌの水素化反応釜に、６．１０ｇの化合物６１、１５０ｍＬのメタノール、０．３１ｇのＰｄ／Ｃを加え、一晩水素添加し、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、ろ過、濃縮し、灰色の固体として、５．９８ｇの化合物６２を得た。

化合物６３の作製
１００ｍｌのバイアル瓶に、５．９５ｇの化合物６２（１．０ｅｑ）、１．３６ｇの化合物３（１．０５ｅｑ）、６０ｍｌのＤＭＦ、０．６８ｇのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．４３ｇのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣによるモニタリングで反応が終了したことを確認した後、６００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、１００ｍｌのＤＣＭで固体を溶解した後に１．０ＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥して灰色の粉末として、６．５３ｇの化合物６３を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物６４の作製
６．５０ｇの化合物６３に、開裂剤としての醋酸／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１／２／７を１３０ｍｌ加え、２時間反応させ、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、洗浄、乾燥、及びＨＰＬＣ精製を経て、オフホワイトの固体として、３．６３ｇの化合物６４を得た。

化合物６５の作製
５０ｍｌのバイアル瓶に、２．０６ｇの化合物６４（４．５ｅｑ）、３．００ｇの４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）、３０ｍｌのＤＭＦ、０．１３ｇのＴＥＡ（９．０ｅｑ）を加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣによるモニタニングで反応が著しく反応しなくなったことを確認した後に、３００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、スラリー状にして減圧ろ過し、乾燥して、４．６７ｇの化合物６５を得、これを直接的に次の反応に供した。

化合物ｆの合成
２００ｍｌのバイアル瓶に、４．６０ｇの化合物６５、１００ｍｌの開裂剤としての９２．５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％ＴＩＳを加え、室温で２ｈ撹拌し、氷冷したＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末として、１．３４ｇの化合物ｆを得た。

化合物Ｆの合成
化合物ｆの粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した後に脱塩し、濃縮して有機溶媒を除去し、希塩酸でｐＨ＝５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、黄緑色の粉末として、１．３４ｇの化合物Ｆを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検出した結果、分子量は３０９０７．８２であった。

本発明の実施例１５〜１９で用いられる試料、試薬、設備等は下記のとおりである。

イリノテカン（原薬）は購入品である。

ｎｋｔｒ−１０２の作製方法について、ＣＮ１０２７１１８３７Ａに開示されている方法を参照されたい。具体的には下記のとおりである。

実施例１における化合物３（８２９ｍｇ、４．５ｅｑ）を２５０ｍＬのバイアル瓶に添加し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）、トリエチルアミン（２２１ｍｇ、９．０ｅｑ）を加え、溶解後に４ＡＲＭ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（５．００ｇ、１．０ｅｑ）をこのバイアル瓶にを加えた。ＨＰＬＣによるモニタニングで反応が著しく反応しなくなったこと確認した後に、減圧蒸留して約２０ｍＬのＤＣＭを除去し、溶液を３００ｍＬのＴＢＭＥに投入し、撹拌して沈殿させ、ろ過し、５．４ｇの粗生成物を得、粗生成物をＨＰＬＣにより精製、脱塩し、希塩酸でｐＨ５〜６に調整し、凍結乾燥を経て、２．７１ｇの淡緑色の粉末ｎｋｔｒ−１０２を得た。

生理食塩水は、上海華源長富薬業（集団）有限公司から購入したものである。１ｍｌの無菌シリンジは、上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司（上海、中国）から購入したものである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養し、５％ＣＯ₂を含む３７℃のインキュベーターで培養した。マトリゲル（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ）Ｍａｔｒｉｇｅｌは、米国のＢＤ社から購入したものである。

生物学的安全キャビネット（型番：ＡＣ２−６Ｅ１）は、ＥＳＣＯから購入し、ＣＯ₂水密性インキュベーター（型番：３１１１）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｏｒｍａから購入し、倒立顕微鏡（型番：ＣＫＸ４１ＳＦ）は、Ｏｌｙｍｐｕｓから購入し、電気吸引装置（型番：ＹＸ９３０Ｄ）は、上海医療器械工業（集団）有限公司から購入し、天びん（ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ ＡＢ１３５−Ｓ）は、ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯから購入し、低速遠心機（型番：ＬＤ５−２Ａ）は、北京雷勃爾遠心機有限公司から購入し、電子デジタルノギス（型番：ＳＦ２０００）は、桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入したものである。

本発明の実施例１５〜１９では、すべての実験動物の操作は、動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照し、中国ＳＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりｐ＜０．０５のものが有効である。

腫瘍体積（ＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＶ（ｍｍ³）＝ｌ×ｗ²／２
（式中、ｌは腫瘍長径（ｍｍ）を表し、ｗは腫瘍短径（ｍｍ）を表す。）

相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算公式は、ＲＴＶ＝ＴＶ_t／ＴＶ_initialである。
（式中、ＴＶ_initialは、群分けして投与した時に測定した腫瘍体積を示し、ＴＶ_tは、投与期間中、各測定時の腫瘍体積を示す。）

相対腫瘍増殖率（％Ｔ／Ｃ）の計算公式は、％Ｔ／Ｃ＝１００％×（ＲＴＶ_T／ＲＴＶ_C）である。
（式中、ＲＴＶ_Tは治療群のＲＴＶを示し、ＲＴＶ_Cは溶媒対照群のＲＴＶを示す。）

腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）の計算公式は、ＴＧＩ＝１００％×［１−（ＴＶ_t(T)−ＴＶ_initial(T)）／（ＴＶ_t(C)−ＴＶ_initial(C)）］である。
（式中、ＴＶ_t(T)は、治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶ_initial(T)は、群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、ＴＶ_t(C)は、溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶ_initial(C)は、群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。）

動物の体重低減率の計算公式は、動物の体重低減率＝１００％×（ＢＷ_initial−ＢＷ_t）／ＢＷ_initialである。
（式中、ＢＷ_tは、投与期間中、各測定時の動物体重を示し、ＢＷ_initialは、群分けして投与した時の動物体重を示す。）

腫瘍重量抑制率ＩＲ（％）の計算公式は、ＩＲ（％）＝１００％×（Ｗ_C−Ｗ_T）／Ｗ_Cである。
（式中、Ｗ_Cは対照群の腫瘍重量を示し、Ｗ_Tは治療群の腫瘍重量を示す。）

Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、群同士の比較はｔ−検定で行い、Ｐ＜０．０５の場合に有意差ありと認められる。

実施例１５ ヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける一連の化合物の生体内薬効評価

試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、本発明の１２種の化合物。

試薬：ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培養液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、注射用水、生理食塩水、乳酸、ソルビトール。

実験動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：１５０匹；週齢：６〜７週）をＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。

可移植性腫瘍株：中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９。

ＨＴ−２９細胞培養：５％ＣＯ₂、３７℃の培養条件下で、ＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に２〜３回行い、継代比率を１：４〜１：６とした。

動物モデルの構築：対数増殖期のＨＴ−２９細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地に再懸濁し、細胞濃度を４×１０⁷細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に１００μＬ（４×１０⁶細胞／匹）接種し、ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にＥｘｃｅｌ表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ³になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を９０匹選択し、乱塊法により１５組に分けた（ｎ＝６）。実験開始後に腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。

溶媒の調製：０．５ｇのソルビトールを秤量して５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管に５０ｍＬの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度１％のソルビトール水溶液（ｗ／ｖ）を調製し、４℃の冷蔵庫に保存しておいた。

イリノテカン投与製剤の調製：１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液をそれぞれ加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの有効濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ^-1とした。

ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製：毎回の投与に先立って、１０１．５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．５ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のｎｋｔｒ−１０２の有効濃度を４．０ｍｇ？ｍＬ^-1とした。

本発明の化合物投与製剤の調製：毎回の投与に先立って、それぞれ１２０．３ｍｇの化合物ａと化合物Ａ、１３７．０ｍｇの化合物ｂと化合物Ｂ、１３２．６ｍｇの化合物ｃと化合物Ｃ、１３２．０ｍｇの化合物ｄと化合物Ｄ、１５９．６ｍｇの化合物ｅと化合物Ｅ、１４５．９ｍｇの化合物ｆと化合物Ｆを正確に秤量し、２．５ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、（必要に応じて）超音波振動し薬物を完全に溶解させ、溶液中の本発明の化合物の有効濃度を４．０ｍｇ？ｍＬ^-1とした。

動物の群分け及び投与態様：群分けの日に初回の投与を開始し、約２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ^-1とした。イリノテカン含有量基準での有効量をすべで４０ｍｇ・ｋｇ^-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射により生理食塩水を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜１５群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物ａ、化合物Ａ、化合物ｂ、化合物Ｂ、化合物ｃ、化合物Ｃ、化合物ｄ、化合物Ｄ、化合物ｅ、化合物Ｅ、化合物ｆ及び化合物Ｆを、４日に１回、Ｑ４Ｄ×３で投与した。

実験の最終日に、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた（ＣＯ₂）。腫瘍組織を取り出し、秤量した。ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率（％Ｔ／Ｃ）を推奨する。相対腫瘍増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことを意味し、結果は表１に示す。

実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対して、良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かった。

実施例１６ ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス異種移植モデルにおける抑制作用

試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、本発明の１２種の化合物。

実験動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスであり、１５０匹接種し、実験で９０匹を使用した。年齢は６〜８週であり、体重は、２０〜２２ｇ±２０％の体重平均値である。動物リソースは、上海西普−必凱実験動物有限公司（ＢＫ）であり、許可証番号はＳＣＸＫ（滬）２００８−００１６である。すべての実験動物をＳＰＦレベルの実験室で飼育した。実験者は日常のケア及び実験研究を担当した。各ケージに実験番号、実験群別、実験者の名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングによりマーキングした。

ランダムな群分け：腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ³になった後に、各群にマウス６匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により１５群に群分けした。各群の腫瘍体積の平均値と、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±１０％以下であった。

飼育条件：
居住条件：ＩＶＣシステム、各ケージに６匹
温度：２０℃〜２６℃
湿度：４０％±７０％
光照射：１２時間ごとに昼夜を交替
照射ラット・マウス飼料は、北京科澳協力飼料有限公司から購入し、自由に摂食させた。飲水は、都市水道水であり、ろ過、高圧滅菌して飲水させた。敷料は、上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブであり、高圧滅菌して使用した。週に２回敷料を交換した。実験前にマウスに少なくとも１週間の環境適応期間を与えた。

ほかの化学試薬及び材料：上海中国科学院細胞生物研究所から購入したヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１。

ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して１×１０⁶個の細胞を接種した。投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ^-1とした。イリノテカン含有量基準での有効量をすべで４０ｍｇ・ｋｇ^-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射により生理食塩水を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜１５群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物ａ、化合物Ａ、化合物ｂ、化合物Ｂ、化合物ｃ、化合物Ｃ、化合物ｄ、化合物Ｄ、化合物ｅ、化合物Ｅ、化合物ｆ及び化合物Ｆを、４日に１回、Ｑ４Ｄ×３で投与した。

試料の調製は実施例１５を参照。単回投与に必要な容量は３ｍＬである。

実験方法：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％ＣＯ₂を含む３７℃のインキュベーターで培養した。細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築は、対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞懸濁液濃度を１×１０⁷／ｍｌに調整した。１ｍＬのシリンジ（針Ｎｏ．４）でヌードマウスの右背部皮下に腫瘍細胞を、１×１０⁶／０．１ｍｌ／マウスで接種した。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ³になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の１０％未満となるように、各群にマウス６匹で乱塊法により動物をランダムに１５群に群分けした。群分けの日をＤａｙ１とし、群分けの日に投与した。実験期間を３週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に２回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量、撮影して記録した。結果を表２に示す。

実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス移植腫瘍に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かった。

実施例１７ ヒト膵臓がんＭＩＡ Ｐａｃａ−２のヌードマウス異種移植モデルにおける抑制作用

試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、本発明の１２種の化合物。

実験動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスであり、１５０匹接種し、実験で９０匹を使用した。年齢は６〜８週であり、体重は２０〜２２ｇ±２０％の体重平均値である。動物リソースは上海西普−必凱実験動物有限公司（ＢＫ）であり、許可証番号はＳＣＸＫ（滬）２００８−００１６である。すべての実験動物をＳＰＦレベルの実験室で飼育した。実験者は日常のケア及び実験研究を担当した。各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングによりマーキングした。腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ³になった後に、各群にマウス６匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により１５群に群分けした。各群の腫瘍体積の平均値と、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±１０％以下であった。

飼育条件：
居住条件：ＩＶＣシステム、各ケージに６匹
温度：２０℃〜２６℃
湿度：４０％±７０％
光照射：１２時間ごとに昼夜を交替する
照射ラット・マウス飼料は、北京科澳協力飼料有限公司から購入し、自由に摂食させた。飲水は、都市水道水であり、ろ過、高圧滅菌して飲水させた。敷料は、上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブであり、高圧滅菌して使用した。週に２回敷料を交換した。実験前にマウスに少なくとも１週間の環境適応期間を与えた。

ほかの化学試薬及び材料：上海中国科学院細胞生物研究所から購入したヒト膵臓がんＭＩＡ Ｐａｃａ−２。

ヒト膵臓がんＭＩＡ Ｐａｃａ−２のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して３×１０⁶個の細胞を接種した。投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ^-1とした。イリノテカン含有量基準での有効量をすべで４０ｍｇ・ｋｇ^-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射により生理食塩水を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜１５群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物ａ、化合物Ａ、化合物ｂ、化合物Ｂ、化合物ｃ、化合物Ｃ、化合物ｄ、化合物Ｄ、化合物ｅ、化合物Ｅ、化合物ｆ及び化合物Ｆを、すべて４日に１回、Ｑ４Ｄ×３で投与した。

試料の調製は実施例１５を参照。単回投与に必要な容量は３ｍＬである。

実験方法：ＭＩＡ Ｐａｃａ−２細胞を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）及び２．５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％ＣＯ₂を含む３７℃のインキュベーターで培養した。

細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築：対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞懸濁液濃度を３×１０⁷／ｍｌに調整した。１ｍＬのシリンジ（針Ｎｏ．４）でヌードマウスの右背部皮下に腫瘍細胞を、３×１０⁶／０．１ｍｌ／マウスで接種した。

腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ³になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の１０％未満となるように、各群にマウス６匹で乱塊法により動物をランダムに１５群に群分けした。群分けの日をＤａｙ１とし、群分けの日に投与した。

実験期間を３週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に２回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量、撮影して記録した。結果を表３に示す。

実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト膵臓がんＭＩＡ Ｐａｃａ−２のヌードマウス移植腫瘍に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かった。

実施例１８ ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用

試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、本発明の１２種の化合物。

試薬：ＲＰＭＩ−１６４０培養液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、生理食塩水。

実験動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：１５０匹；週齢：６〜８週）をＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取する蘇州聖蘇新薬開発有限公司のＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。

可移植性腫瘍株：中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したヒト胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７。

実験方法

ＮＣＩ−Ｎ８７細胞培養：５％ＣＯ₂、３７℃の培養条件下で、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液中で通常細胞培養し、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に１〜２回行い、継代比率を１：２〜１：６とした。

動物モデルの構築：対数増殖期のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を５×１０⁷細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に１００μＬ（５×１０⁶細胞／匹）接種し、ＮＣＩ−Ｎ８７のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にＥｘｃｅｌ表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ³になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を９０匹選択し、乱塊法により１５組に分けた（ｎ＝６）。実験開始後に腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。

試料の調製は実施例１５を参照。単回投与に必要な容量は３ｍＬである。

動物群分け及び投与：群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ^-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜１５群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物ａ、化合物Ａ、化合物ｂ、化合物Ｂ、化合物ｃ、化合物Ｃ、化合物ｄ、化合物Ｄ、化合物ｅ、化合物Ｅ、化合物ｆ及び化合物Ｆを、（イリノテカン含有量基準で）４０ｍｇ・ｋｇ^-1の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。

実験終了後、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた（ＣＯ₂）。腫瘍組織を取り出して秤量し、結果を表４に示す。

実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の増殖に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かった。

実施例１９ 同所性ヌードマウスＵ８７ＭＧ脳ヒトグリオーマモデルの生存率への影響

試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、本発明の１２種の化合物。

試薬：ＲＰＭＩ−１６４０培養液、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、生理食塩水。

実験動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：１５０匹；週齢：６〜８週）をＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。

可移植性腫瘍株：中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したグリオーマ細胞Ｕ８７ＭＧ。

実験方法：

Ｕ８７ＭＧ細胞培養：５％ＣＯ₂、３７℃の培養条件下で、Ｕ８７ＭＧ細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に１〜２回行い、継代比率を１：２〜１：６とした。

動物モデルの構築：対数増殖期のＵ８７ＭＧ細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０⁸細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、動物定位固定装置の補助により、マイクロインジェクション法でヒトグリオーマ細胞Ｕ８７ＭＧ細胞１μＬ（１×１０⁵細胞／匹）を生体外で培養し、同所性Ｕ８７ＭＧ脳グリオーマモデルを構築し、接種後に定期的に動物の状態観察した。接種後１２日目に、動物を９０匹選択し、乱塊法により１５組に分けた（ｎ＝６）。

投与製剤の調製：試料の調製は実施例１５を参照。単回投与に必要な容量は３ｍＬである。

動物群分け及び投与：群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ^-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜１５群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、供試化合物を、４０ｍｇ・ｋｇ^-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。

データ記録、計算公式：動物の生存時間を記録した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、且つ関連統計処理を行った。２群の比較はｔ検定で行った。結果を表５に示す。

実験結果によれば、本発明の化合物は、グリオーマに対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かった。

Claims (13)

1. 下記の構造式を有する、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
   

   

   （式中、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、ｋの数値範囲は５〜５００である。ただし、Ｌは
   

   

   （式中、記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬと上記構造式との結合点を示し、ｌは２〜２０の任意の整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ０〜１０の任意の整数である。）であり、
   Ｔは、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」の配列を含むＲＧＤペプチド、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、又はＧＥ１１であり、
   Ｄは下記式（II）で示されるカンプトテシン系薬物である。
   

   

   （式中、Ｒ₁〜Ｒ₅はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基からなる群より選択され、Ｒ₆は、Ｈ又はＯＲ₈であり、Ｒ₈は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、又はヒドロキシアルキル基であり、Ｒ₇は、ヒドロキシ基である。））
2. ＴはｃＲＧＤ又はｉＲＧＤである、請求項１に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
3. ｋは５０〜２００の範囲内のいずれかの整数である、請求項１又は２に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
4. ｋの平均値が１１３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
5. Ｌは、
   

   

   

   又は、
   

   

   である、請求項１から４のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
6. Ｄはイリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン又はルビテカンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
7. 下記式で示されるものである、請求項１から６のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
   化合物ａ
   

   

   化合物ｂ
   

   

   化合物ｃ
   

   

   化合物ｄ
   

   

   化合物ｅ
   

   

   化合物ｆ
   

   
8. 下記式で示されるものである、請求項１から７のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
   化合物Ａ
   

   

   化合物Ｂ
   

   

   化合物Ｃ
   

   

   化合物Ｄ
   

   

   化合物Ｅ
   

   

   化合物Ｆ
   

   
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート、及び薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的に許容される組成物。
10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲートの、がんを治療するための薬物の製造のための使用。
11. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲートの、結腸癌、肺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ、及び、乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫を治療するための薬物の製造のための使用。
12. 請求項９に記載の組成物の、がんを治療するための薬物の製造のための使用。
13. 請求項９に記載の組成物の、結腸癌、肺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ、及び、乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫を治療するための薬物の製造のための使用。