CN117180446A

CN117180446A - 一种自组装多肽偶联药物及其应用

Info

Publication number: CN117180446A
Application number: CN202311163844.3A
Authority: CN
Inventors: 王浩; 易丽; 王曼迪
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2023-09-11
Filing date: 2023-09-11
Publication date: 2023-12-08

Abstract

本发明涉及一种自组装多肽偶联药物及其应用，所述自组装多肽偶联药物的组成包括肿瘤特异靶点识别肽、自组装多肽、细胞毒素分子和连接子；所述肿瘤特异靶点识别肽和所述细胞毒素分子通过所述连接子连接于所述自组装多肽的同端或异端，且所述肿瘤特异靶点识别肽的数量为1或2。该自组装多肽偶联药物相较于传统的多肽偶联药物，能够在肿瘤特异性靶点处组装、聚集，通过受体介导进入细胞，增强肿瘤细胞对药物的摄取，提高药物的释放效率，提升药物的选择性和特异性，降低毒副作用，对于肿瘤的临床治疗具有重大意义。

Description

一种自组装多肽偶联药物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种自组装多肽偶联药物及其应用，尤其涉及一种自组装多肽偶联药物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的常见病和多发病。肿瘤的常见治疗方式有化疗、放疗、基因疗法和免疫疗法等，传统的化疗手段是使用小分子抗癌药，但是由于大部分小分子化疗药物都存在水溶性差、半衰期短、毒副作用大的缺点，严重限制了其在临床上的使用。通过蛋白、抗体、多肽等与化疗药物连接形成的偶联药物不仅可以改善化疗药的药代动力学行为，同时提高肿瘤靶向性，降低毒副作用，具有广阔的市场价值。

CN111110858A公开了一种Her2靶向的多肽药物偶联物及其制备方法和应用，所述的Her2靶向多肽药物偶联物能够实现靶向给药，靶向多肽能够将细胞毒素分子运送到特定的肿瘤细胞，药物进入肿瘤细胞后发挥二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点，迅速释放细胞毒素分子，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物，增加了药物疗效，降低对正常细胞的毒副作用。

CN112386707A公开了一种具有肿瘤靶向性的多肽药物偶联物的制备方法及应用，所述的肿瘤靶向多肽药物偶联物结构包括：肿瘤靶向肽WA1，非裂解连接器和细胞毒性细胞毒素分子；其中肿瘤靶向多肽药物偶联物(PDC-WA1)的制备方法采用Fmoc固相合成法，得到具有抗肿瘤活性的肿瘤靶向性的多肽药物偶联物。

CN108578708A公开了一种双靶向多肽-药物偶联物及其制备方法与抗肿瘤应用。其中，所述肿瘤特异性靶向多肽与所述细胞毒素分子通过含有腙键的连接臂相连；所述细胞毒素分子与所述线粒体靶向功能团通过化学键相连；所述的多肽偶联药物将分子靶向和细胞器靶向相结合不但能够增加药物在肿瘤细胞中的选择性摄取，而且能够将DOX的药物作用位点由细胞核转移至线粒体，从而克服耐药性杀伤肿瘤细胞。

基于以上研究可知，传统的多肽偶联药物虽然可以通过肿瘤特异性靶点识别肽提高药物靶向性，但是肿瘤的脱靶毒性仍然存在。同时，传统的多肽偶联药物鲜有关注肿瘤细胞对药物的摄取和释放环节。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种自组装多肽偶联药物及其应用，尤其提供一种自组装多肽偶联药物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该自组装多肽偶联药物能够在靶向部位特异性聚集，增强肿瘤细胞对药物的摄取，通过偶联的细胞毒素分子在细胞内的释放，杀伤肿瘤细胞，实现高效低毒的癌症治疗。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种自组装多肽偶联药物，所述自组装多肽偶联药物的组成包括肿瘤特异靶点识别肽、自组装多肽、细胞毒素分子和连接子；

所述肿瘤特异靶点识别肽和所述细胞毒素分子通过所述连接子连接于所述自组装多肽的同端或异端，且所述肿瘤特异靶点识别肽的数量为1或2。

本发明创造性地设计了一种包括肿瘤特异靶点识别肽、自组装多肽、细胞毒素分子和连接子的多肽偶联药物，其可以通过识别肿瘤细胞表面的受体蛋白从而被诱导自组装，增加了毒素分子在肿瘤细胞处的富集，促进肿瘤细胞的摄取和释放，实现肿瘤细胞凋亡。且其具有生物相容性高、溶解性好、渗透性高、特异性强的优点，且作用迅速，所需时间短，在肿瘤靶向治疗领域具有广阔的应用前景。相较于传统的多肽偶联药物，自组装多肽偶联药物能够在肿瘤特异性靶点处组装、聚集，通过受体介导进入细胞，增强肿瘤细胞对药物的摄取，提高药物的释放效率，提升药物的选择性和特异性，降低毒副作用，对于肿瘤的临床治疗具有重大意义。本发明所涉及的自组装多肽偶联药物进入细胞发挥作用的示意图如图1所示。

优选地，所述自组装多肽偶联药物的分子结构包括直链型分子结构、T字支链型分子结构、双靶头型分子结构。

本发明所涉及的自组装多肽偶联药物的分子结构可以被设计成多种类型，其中效果较为优异的是直链型分子结构、T字支链型分子结构以及双靶头型分子结构。且三种结构的连接方式具体如下：

所述直链型分子结构的自组装多肽偶联药物包括依次相连的肿瘤特异靶点识别肽、第一连接子、自组装多肽、第二连接子、细胞毒素分子，且所述肿瘤特异靶点识别肽的数量为1，其结构示意图如图2所示。

所述T字支链型分子结构的自组装多肽偶联药物包括通过第一连接子或第二连接子分别连接于自组装多肽同端的肿瘤特异靶点识别肽和细胞毒素分子，其结构示意图如图3所示。

所述双靶头型分子结构的自组装多肽偶联药物包括依次相连的肿瘤特异靶点识别肽、第一连接子、自组装多肽、第二连接子、细胞毒素分子，且所述肿瘤特异靶点识别肽的数量为2，其结构示意图如图4所示。

优选地，所述肿瘤特异靶点识别肽的序列选自如下序列中的任意一种或任意两种：

(1)SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或，

(2)由(1)所述序列经取代、缺失或添加1-3个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列，或，

(3)与(1)或(2)所述序列具有至少95％序列同源性，且与(1)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1：CNGRGCG；

SEQ ID NO:2：YSAYPDSVPMMS；

SEQ ID NO:3：GGCGNKRTRGCG；

SEQ ID NO:4：YCDGFYACYMDV；

SEQ ID NO:5：HWSYGLKPG；

SEQ ID NO:6：TSFAEYWNLLSP；

SEQ ID NO:7：RRWCYRKCYKGYCYRKCR；

SEQ ID NO:8：DTCPPLMLYNPTTYQM；

SEQ ID NO:9：CPGPEGAGC；

SEQ ID NO:10：TSPLNIHNGQKL；

SEQ ID NO:11：CGKRK；

SEQ ID NO:12：SMSIARL。

优选地，所述自组装多肽的序列选自如下序列中的任意一种：

(1)SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或，

SEQ ID NO:13：FGFDP；

SEQ ID NO:14：INLYT；

SEQ ID NO:15：ISDNL；

SEQ ID NO:16：(AEAEAKAK)₂；

SEQ ID NO:17：FKFEFKFEFKFE；

SEQ ID NO:18：RADARADARADA；

SEQ ID NO:19：VQIVYK；

SEQ ID NO:20：GNNQQNY；

SEQ ID NO:21：GNNNQNY；

SEQ ID NO:22：ITSVV。

优选地，所述细胞毒素分子包括小分子化疗药物。

优选地，所述小分子化疗药物包括丝裂霉素、阿霉素、紫杉醇、环磷酰胺、姜黄素、5-氟尿嘧啶、喜树碱或上述在药学上可接受的盐、衍生物。

优选地，所述连接子独立地选自马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇对硝基苯基碳酸脂(Val-Cit)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(SULFO-SMCC)、3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯(DSP)、5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯(PEG₄)、芴甲氧羰基八聚乙二醇羧甲基(PEG₈)、芴甲氧羰基九聚乙二醇羧甲基(PEG₉)、芴甲氧羰基十六聚乙二醇羧甲基(PEG₁₆)、5-氨基戊酸(C₅)或2-氨基十六烷酸(C₁₆)。

第二方面，本发明提供第一方面所述的自组装多肽偶联药物的制备方法，所述制备方法包括固相合成法。

示例性地，所述固相合成法可以采用包括以下步骤的制备方法：

(1)树脂活化：称量树脂放入多肽合成管中，在N,N-二甲基甲酰胺的环境下溶胀4h以上，依次按照脱保护-检测-偶联-检测的方式循环加入氨基酸进行缩合反应，增长树脂上的多肽序列；

(2)当最后一个氨基酸脱除Fmoc保护后，加入提前活化好的细胞毒素分子，进行固相合成，后加入Kaiser检测液，检测呈阴性后，使用DCM和DMF交替洗涤，甲醇浓缩后，使用真空泵抽干液体得到自组装多肽偶联药物树脂。

(3)将步骤(2)所述的自组装多肽偶联药物树脂放入裂解液中裂解，经除杂、纯化，得到自组装多肽偶联药物纯品。

第三方面，本发明提供根据第一方面所述的自组装多肽偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

第四方面，本发明提供根据第一方面所述的自组装多肽偶联药物以非治疗目的地在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。

本发明所要求保护的抑制剂并不是用于消除病因或病灶，而是为了用于肿瘤细胞生理代谢行为的理论研究、用于筛选更多的治疗肿瘤的药物。

第五方面，本发明提供一种以非治疗为目的的抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括：将第一方面所述的自组装多肽偶联药物与肿瘤细胞共培养。

本发明所要求保护的方法并不是以有生命的人体或动物体为直接实施对象，而是以单纯的离体肿瘤细胞为直接实施对象，它仅保护的是针对肿瘤细胞(细胞水平)，对其进行生长抑制的方式；同时该方法也并不是进行消除病因或病灶的过程，不是直接用于改善人体或动物体健康状况的治疗方法，而是为了用于肿瘤细胞生理代谢行为的理论研究、用于筛选更多的治疗肿瘤的药物。

优选地，所述共培养时自组装多肽偶联药物的浓度为0.001-100μM，例如可以是0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.3μM、0.5μM、0.8μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、100μM等，但不仅限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用，优选为0.01-10μM。

优选地，所述共培养的时间为0.5-72h，例如可以是0.5h、12h、24h、30h、48h、54h、60h、66h、72h等，但不仅限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用，优选为48-72h。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地设计了一种包括肿瘤特异靶点识别肽、自组装多肽、细胞毒素分子和连接子的多肽偶联药物，其可以通过识别肿瘤细胞表面的受体蛋白从而被诱导自组装，增加了毒素分子在肿瘤细胞处的富集，促进肿瘤细胞的摄取和释放，实现肿瘤细胞凋亡。且其具有生物相容性高、溶解性好、渗透性高、特异性强的优点，且作用迅速，所需时间短，在肿瘤靶向治疗领域具有广阔的应用前景。相较于传统的多肽偶联药物，自组装多肽偶联药物能够在肿瘤特异性靶点处组装、聚集，通过受体介导进入细胞，增强肿瘤细胞对药物的摄取，提高药物的释放效率，提升药物的选择性和特异性，降低毒副作用，对于肿瘤的临床治疗具有重大意义。

附图说明

图1是本发明涉及的自组装多肽偶联药物进入细胞发挥作用的示意图；

图2是直链型自组装多肽偶联药物结构示意图；

图3是T字支链型自组装多肽偶联物结构示意图；

图4是双靶头型自组装多肽偶联药物结构示意图；

图5是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-1的化学结构式；

图6是小分子药物CPT对HepG2细胞的杀伤数据统计结果图；

图7是小分子药物CPT对L929细胞的杀伤数据统计结果图；

图8是SAP-CPT-1对HepG2细胞的杀伤数据统计结果图；

图9是SAP-CPT-1对L929细胞的杀伤数据统计结果图；

图10是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-2的化学结构式；

图11是SAP-CPT-2对HepG2细胞的杀伤数据统计结果图；

图12是SAP-CPT-2对L929细胞的杀伤数据统计结果图；

图13是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-3的化学结构式；

图14是自组装多肽片段GNNQQNY与GNNNQNY在不同浓度下的ThT荧光响应数据统计结果图；

图15是SAP-CPT-3对HepG2细胞的杀伤数据统计结果图；

图16是SAP-CPT-3对L929细胞的杀伤数据统计结果图；

图17是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-4的化学结构式；

图18是SAP-CPT-4对HepG2细胞的杀伤数据统计结果图；

图19是SAP-CPT-4对L929细胞的杀伤数据统计结果图；

图20是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-5的化学结构式；

图21是SAP-CPT-5对HepG2细胞的杀伤数据统计结果图；

图22是SAP-CPT-5对L929细胞的杀伤数据统计结果图；

图23是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-5经尾静脉注射后小鼠体重变化数据统计结果图；

图24是自组装多肽偶联药物SAP-CPT-5经尾静脉注射后抑瘤效果统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中，涉及的脱保护剂的配方为A液：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯:N,N-二甲基甲酰胺(DMF)＝1:48(v/v)，B液:每100mL A液中加入5g无水哌嗪，完全溶解后得到脱保护试剂；涉及的偶联剂的配方为N-甲基吗啉:N,N-二甲基甲酰胺(DMF)＝1:19(v/v)；涉及的裂解液的配方为92.5vol％三氟乙酸+2.5vol％三异丙基硅烷+2.5vol％水+2.5vol％1,2-乙二硫醇；涉及的Kaiser检测液的配方为茚三酮:维C:苯酚＝1:1:1(v/v/v)。涉及的(PEG)₄为5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯。其余原料和试剂，无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例提供一种直链型靶向CD13的自组装多肽偶联药物(命名为SAP-CPT-1)，其分子结构示意图如图2所示，其序列为CPT-PEG₄-GNNNQNY-PEG₄-GCNGRCG(二硫键)，其化学式如图5所示。其合成步骤如下：

(1)树脂活化：称量300mg Fmoc-Gly-Wang resin树脂(载量0.415mmol/g)于10mL多肽合成管中，加入8mL DMF溶胀5h，溶胀结束后使用DMF和DCM交替冲洗三次后由真空泵抽干管中液体，再在多肽合成管中加入10mL的脱保护试剂，脱保护15min后，使用DMF和DCM交替冲洗三次，取约10颗树脂于1.5mL离心管中，加入3滴Kaiser检测液，将离心管放置在沸水浴中加热2min，观察树脂颜色，Kaiser检测阳性后，进行氨基酸的循环偶联。

(2)氨基酸循环偶联：取500mg的Fmoc-Gly-Wang resin和350mg的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)于15mL离心管中，加入10mL的偶联剂充分溶解后倒入多肽合成管，反应偶联60min后，使用DCM和DMF交替冲洗三遍后，取10颗树脂于1.5mL离心管中，加入3滴Kaiser检测液，将离心管放置在沸水浴中加热2min，观察树脂颜色，Kaiser检测阴性后，加入脱保护试剂，脱除氨基酸上的Fmoc保护基团，重复上述步骤中的检测-偶联-脱保护-检测的过程，并按照C(Fmoc-Cys(Trt)-OH)、R(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、G(Fmoc-Gly-OH)、N(Fmoc-Asn(Trt)-OH)、C(Fmoc-Cys(Trt)-OH)、G(Fmoc-Gly-OH)、5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯(PEG₄)、Y(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、N(Fmoc-Asn(Trt)-OH)、Q(Fmoc-Gln(Trt)-OH)、N(Fmoc-Asn(Trt)-OH)、N(Fmoc-Asn(Trt)-OH)、N(Fmoc-Asn(Trt)-OH)、G(Fmoc-Gly-OH)、5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯(PEG₄)，按顺序依次连接，反应中所用保护氨基酸10倍过量。

(3)细胞毒素分子偶联：上述最后一个反应物偶联在树脂上并脱保护完全后，在30mL偶联剂中加入250mg CPT-npc，充分溶解后，将多肽合成管中的树脂转移到50mL离心管中过夜偶联，反应结束后，树脂转移到多肽合成管中，使用DMF和DCM交替冲洗三次，再用甲醇冲洗三次，树脂用真空泵抽干后转移到10mL血清瓶中，往其中加入4mL裂解液，于4℃裂解2.5h，将SAP-CPT即组装多肽偶联物从树脂上裂解下来，真空干燥后得到的粗品。

上述CPT-npc的合成步骤为：称量349mg的喜树碱溶于30mL的二氯甲烷(用CaCl₂除水30min)和5mL的无水吡啶，超声溶解至药物分布均匀后，称量250mg 4-硝基苯基氯甲酸酯(npc)冰浴下加入二氯甲烷喜树碱溶液中，氮气保护下反应24h。旋蒸去掉DCM，过滤、晾干得到产物。使用硅胶色谱柱，取200mg CPT-npc粗品溶于DCM中，加入少量硅胶粉末，旋蒸后得到粉末，用DCM溶解后缓慢倒入色谱硅胶柱中，待分配完全后，配制200mL不同浓度的二氯甲烷/甲醇溶液，依次使用上述溶液冲洗硅胶柱，收集滤液，用高效薄层层析硅胶板取样分析，旋蒸得到较纯产品。

(4)制得的多肽粗品以C18制备柱进行纯化，检测波长：220nm，流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：水(含0.1％三氟乙酸)。岛津LC-MS-8050确定所得纯品分子量，HPLC确定样品纯度，经冷冻干燥得到自组装多肽偶联药物SAP-CPT-1纯品。

测试例1

本测试例对实施例1制得的SAP-CPT-1进行体外肿瘤细胞特异性杀伤功能鉴定：

采用CCK-8法检测SAP-CPT-1多肽药物偶联物对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤能力。将HepG2细胞和L929细胞以每孔5×10³的密度接种在96孔板中，在完全培养基中培养24h。之后将完全培养基更换为含有不同梯度浓度的SAP-CPT-1和CPT原药的培养基继续培养48h。然后除去含有药物的培养基，更换为含10％ CCK-8的新鲜培养基继续培养2h。最后使用酶标仪在450nm的测试波长和600nm的参考波长下测定样品孔吸收值(A_样品)，CCK-8溶液对照孔吸收值(A_空白)和细胞对照孔吸收值(A_对照)。细胞存活率的计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(A_样品-A_空白)/(A_对照-A_空白)×100％。

CPT原药对HepG2细胞的杀伤结果如图6所示，CPT原药对L929细胞的杀伤结果如图7所示，由图可知，CPT非特异性杀伤肿瘤细胞HepG2和正常细胞L929，两种细胞的IC₅₀都在50nM左右。

SAP-CPT-1对L929细胞的杀伤结果如图8所示，SAP-CPT-1对L929细胞的杀伤结果如图9所示，由图可知，SAP-CPT-1能够特异性的杀伤肿瘤细胞HepG2，IC₅₀值为8.23μM，对正常细胞L929的杀伤能力低，IC₅₀为125.13μM，这说明相比于原药CPT，自组装多肽偶联药物SAP-CPT-1能够高特异性有选择的杀伤肿瘤细胞，同时降低对正常细胞的毒性。

对比例1

为验证本发明所涉及的自组装多肽偶联药物的优效性，验证自组装模块的引入对多肽偶联药物的药效影响，本对比例合成传统多肽偶联药物作为对照分子(命名为SAP-CPT-2)，其序列为CPT-PEG₄-GCNGRCG(二硫键)，其化学式如图10所示。其合成步骤参照实施例1。

测试例2

本测试例对对比例1制得的SAP-CPT-2进行体外肿瘤细胞特异性杀伤功能鉴定：

采用CCK-8法检测SAP-CPT-1多肽药物偶联物对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤能力，具体操作参照测试例1。SAP-CPT-2对HepG2细胞的杀伤结果如图11所示，SAP-CPT-2对L929细胞的杀伤结果如图12所示，由图可知，SAP-CPT-2对HepG2细胞的杀伤效果明显弱于SAP-CPT-1分子，其IC₅₀为12.66μM，对正常细胞L929的杀伤能力为65.12μM，高于SAP-CPT-1分子，说明自组装序列肽的引入可以明显提升多肽药物偶联物的肿瘤细胞杀伤效果。

实施例2

为对比不同自组装序列对自组装多肽偶联药物药效的影响，本实施例提供另一种自组装多肽偶联药物(命名为SAP-CPT-3)，其序列为CPT-PEG₄-GNNQQNY-PEG₄-GCNGRCG(二硫键)，其化学结构式如图13所示。不同浓度的GNNQQNY序列和GNNNQNY序列的ThT荧光强度结果如图14所示，ThT荧光强度越强，证明多肽的自组装能力越强，因此GNNQQNY自组装序列比GNNNQNY的组装能力要强。其合成步骤参照实施例1。

测试例3

本测试例对实施例2制得的SAP-CPT-3进行体外肿瘤细胞特异性杀伤功能鉴定：

采用CCK-8法检测SAP-CPT-3多肽药物偶联物对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤能力，具体操作参照测试例1。SAP-CPT-3对HepG2细胞的杀伤结果如图15所示，SAP-CPT-3对L929细胞的杀伤结果如图16所示，由图可知，SAP-CPT-3对HepG2细胞的IC₅₀值为125.13μM，对L929细胞的IC₅₀值为145.67μM。SAP-CPT-3与SAP-CPT-1相比，药效降低10倍左右。这说明在多肽偶联药物的设计中，选择性的引入自组装能力较弱的序列才能对药效进行提升。

实施例3

本实施例提供一种T字支链型自组装多肽偶联药物(命名为SAP-CPT-4)，其分子结构示意图如图3所示，其序列为CPT-(Peg)₄-[CNGRC-(Peg)₄]K-GNNNQNY(二硫键)，其化学式如图17所示。其合成采用固相合成法进行，参照实施例1。

测试例4

本测试例对实施例3制得的SAP-CPT-4进行体外肿瘤细胞特异性杀伤功能鉴定：

采用CCK-8法检测SAP-CPT-4多肽药物偶联物对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤能力，具体操作参照测试例1。SAP-CPT-4对HepG2细胞的杀伤结果如图18所示，SAP-CPT-4对L929细胞的杀伤结果如图19所示，由图可知，SAP-CPT-4对HepG2细胞的IC₅₀值为2.12μM，对L929细胞的IC₅₀值为167μM。说明自组装序列的引入位置与药效相关，相较于直链型结构，T字支链型的自组装多肽偶联药物能够将组装序列暴露出来，进一步促进肿瘤特异性靶点肽在受体蛋白处的组装和聚集，进而增加内吞率，提高药效。

实施例4

本实施例提供一种双靶头型自组装多肽偶联药物(命名为SAP-CPT-5)，其分子结构示意图如图4所示，其序列为CNGRC-(Peg)₄-[CPT-GNNNQNY]K-(Peg)₄-YSAYPDSVPMMS(二硫键)，其化学式如图20所示。其合成采用固相合成法进行，参照实施例1。

测试例5

本测试例对实施例4制得的SAP-CPT-5进行体外肿瘤细胞特异性杀伤功能鉴定：

采用CCK-8法检测SAP-CPT-5多肽药物偶联物对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤能力，具体操作参照测试例1。SAP-CPT-5对HepG2细胞的杀伤结果如图21所示，SAP-CPT-5对L929细胞的杀伤结果如图22所示，由图可知，SAP-CPT-5对HepG2细胞的IC₅₀值为125nM，而对正常细胞L929无显著杀伤能力，对L929细胞的IC₅₀值为172μM。进一步的，对比直链型和T字支链型的分子，双靶头型的结构设计增强肿瘤特异性靶点肽对受体的识别能力，同时通过其受体介导入胞和组装聚集入胞两种途径提升入胞效率，使得药效进一步提升。

测试例6

本测试例对实施例4制得的SAP-CPT-5进行肿瘤抑制效果和安全性验证：

选择雌性，周龄8周，体重在20-22g的Balb/c裸鼠共30只。体外培养肿瘤细胞并扩增，肿瘤细胞系选择HT1080人纤维肉瘤细胞系。待细胞扩增到一定数量后，将细胞消化后使用PBS重悬，每只小鼠按照100μL细胞悬液进行腋下皮下肿瘤。

观察3-5天，待小鼠肿瘤长到长、宽约5.5mm时，对小鼠进行分组并开始给药实验，记录为第0天。给药方案按照如下表格进行：

实验分组	药物编号	平行数量(只)	给药剂量	给药频次
					实验组—低剂量	SAP-CPT-5-低	6	2.5mg/kg	两天1次，3次
实验组—中剂量	SAP-CPT-5-中	6	5mg/kg	两天1次，3次
					实验组—高剂量	SAP-CPT-5-高	6	10mg/kg	两天1次，3次
阳性对照组	CPT	6	2.5mg/kg	两天1次，3次
					阳性对照组	伊立替康	6	30mg/kg	两天1次，3次
阴性对照组	PBS	6	/	两天1次，3次

从第0天开始，每两天一次记录不同分组的小鼠体重和瘤块体积，共观察22天。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积＝(长×宽²)/2，单位为mm³。

小鼠体重统计结果如图23所示，与PBS组相比，实验组分子的低、中、高三个剂量下的小鼠体重均维持较好，且略有增加，但小分子原药CPT组和阳性对照组伊立替康组的小鼠体重在给药后就出现不同程度的下降，侧面说明自组装多肽偶联药物的策略可以提高小鼠对于小分子药物的耐受性，扩大给药窗口。

小鼠瘤块体积统计结果如图24所示，与PBS组相比，实验组分子在低、中、高三个剂量下能不同程度的抑制肿瘤的生长，并且具有剂量依赖性，这说明自组装多肽偶联药物可以显著提高肿瘤的治疗效果，延长小鼠生存期。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种自组装多肽偶联药物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述自组装多肽偶联药物的组成包括肿瘤特异靶点识别肽、自组装多肽、细胞毒素分子和连接子；

2.根据权利要求1所述的自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述自组装多肽偶联药物的分子结构包括直链型分子结构、T字支链型分子结构、双靶头型分子结构。

3.根据权利要求2所述的自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述直链型分子结构的自组装多肽偶联药物包括依次相连的肿瘤特异靶点识别肽、第一连接子、自组装多肽、第二连接子、细胞毒素分子，且所述肿瘤特异靶点识别肽的数量为1；

所述T字支链型分子结构的自组装多肽偶联药物包括通过第一连接子或第二连接子分别连接于自组装多肽同端的肿瘤特异靶点识别肽和细胞毒素分子；

所述双靶头型分子结构的自组装多肽偶联药物包括依次相连的肿瘤特异靶点识别肽、第一连接子、自组装多肽、第二连接子、细胞毒素分子，且所述肿瘤特异靶点识别肽的数量为2。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述肿瘤特异靶点识别肽的序列选自如下序列中的任意一种或任意两种：

(1)SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或，

5.根据权利要求1-4中任一项所述的自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述自组装多肽的序列选自如下序列中的任意一种：

(1)SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或，

6.根据权利要求1-5中任一项所述的自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述细胞毒素分子包括小分子化疗药物；

7.根据权利要求1-6中任一项所述的自组装多肽偶联药物，其特征在于，所述连接子独立地选自马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇对硝基苯基碳酸脂、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯、3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯、5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯、芴甲氧羰基八聚乙二醇羧甲基、芴甲氧羰基九聚乙二醇羧甲基、芴甲氧羰基十六聚乙二醇羧甲基、5-氨基戊酸或2-氨基十六烷酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的自组装多肽偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的自组装多肽偶联药物以非治疗目的地在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。

10.一种以非治疗为目的的抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-7中任一项所述的自组装多肽偶联药物与肿瘤细胞共培养；

优选地，所述共培养时自组装多肽偶联药物的浓度为0.001-100μM；

优选地，所述共培养的时间为0.5-72h。