JP6871129B2 - 分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、分析方法に関し、特にキャピラリー電気泳動法による試料の分析方法に関する。

生体の状態を示す指標として、各種タンパク質が分析されている。中でも、血球中のヘモグロビン（Ｈｂ）については、複数のヘモグロビン種があり、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ）の他、複数種の変異ヘモグロビン（ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＳ等）が存在する。

試料の成分分析（たとえば液体クロマトグラフィー等）において、たとえば予め組成の分かっているサンプルを測定して検出したい成分が検出される検出時間、ピーク形状を確認し、被検体の分析結果と比較することにより成分を特定することが行われる（たとえば、特許文献１参照）。

血液（試料）のヘモグロビン種（成分）の分析においては、成分に応じて検出時間が異なるので、それを利用した分離分析が行われる。分離分析において、測定ごとのバラつき（たとえば、カラム劣化・溶離液保存状態などによる検出時間の違い等）を考慮し、たとえば、ある成分の検出時間が所定の検出時間範囲に入っていれば当該成分であると同定される。

ヘモグロビン（Ｈｂ）の分析手法の一つとして、電気泳動法が用いられる（たとえば、特許文献２参照）。電気泳動法による試料の分析は、分析装置に分析チップを装填した状態で行われる。分析チップは、試料を保持して当該試料を対象とした分析の場を提供するものである。この分析チップとしては、１回のみの分析を終えた後に廃棄することが意図されたディスポーザブルタイプのものがある。このようなディスポーザブルタイプの分析チップを用いたヘモグロビンの分析方法が、たとえば、下記特許文献３に開示されている。

ディスポーザブルタイプ（１回使い捨て）の分析チップの場合、分析の対象となる試料が同一でも、分析チップ自体のロット間差や同一ロット間の個体差によって特定成分の検出時間が変動する。繰り返しでの使用を前提とする分析チップの場合、既知の分析結果に基づいて較正を行うことで分析結果の精度を高めることが可能であるが、ディスポーザブルタイプの分析チップの場合、当該分析チップの個体差による検出時間の変動による誤差が大きい場合、成分の同定を誤って正確な分析結果が得られない事態が起こり得た。

特開昭６０−７３４５８号公報 特開平１１−３３７５２１号公報 特開２０１６−５７２８９号公報

本発明は、上記した事情のもとで考え出されたものであって、ディスポーザブルタイプの分析チップを用いて行う試料の分析において、分析精度の向上に適した分析方法を提供することをその課題とする。

本発明によって提供される分析方法は、微細流路に導入される試料溶液に電圧を印加し、前記試料溶液に含まれる成分を分離分析し、前記微細流路の測定部における測定開始後の経過時間に対応した光学測定値を測定するキャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、前記測定開始後の経過時間に対応した前記光学測定値に関する波形を形成する波形形成工程と、前記試料溶液と泳動液との界面が前記微細流路における所定の測定位置へ到達した際の前記光学測定値に基づいて界面検出時間を決定する界面検出工程と、前記波形に表れた複数の特徴波形を特定する特徴波形特定工程と、前記特徴波形の各々に対応する経過時間及び前記界面検出時間に基づき前記試料溶液に含まれる成分を同定する成分同定工程と、を含む。

ここで、「前記微細流路における所定の測定位置」とは、光学測定値を測定するための測定光が通過する位置をいう。なお、この界面に係る光学測定値は、同定されるべき成分に係る光学測定値が測定される前記測定部と同じ位置で測定されることしてもよいし、別の位置で測定されることとしてもよい。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記光学測定値は吸光度であり、前記特徴波形は前記波形におけるピーク波形であり、前記特徴波形特定工程は、前記ピーク波形を特定するピーク波形特定工程である。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記界面検出工程においては、前記界面が前記所定の測定位置へ到達した際の前記光学測定値の変化に基づいて前記界面検出時間を決定する。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記成分同定工程は、前記ピーク波形特定工程で特定される前記ピーク波形のうち最大のピーク波形である最大ピーク波形に対応する前記経過時間である最大ピーク検出時間と、前記界面検出時間と、の対比に基づき、前記最大ピーク波形に係る成分を同定する。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記成分同定工程は、前記ピーク波形特定工程で特定される前記ピーク波形のうち最大のピーク波形である最大ピーク波形に対応する前記経過時間である最大ピーク検出時間と、前記ピーク波形特定工程で特定される前記ピーク波形のうち２番目に大きいピーク波形である第２ピーク波形に対応する前記経過時間である第２ピーク検出時間と、前記界面検出時間と、
の対比に基づき、前記最大ピーク波形及び前記第２ピーク波形に係る成分を同定する。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記成分同定工程は、前記最大ピーク検出時間と前記界面検出時間との差と、前記第２ピーク検出時間と前記界面検出時間との差との比に基づき、前記最大ピーク波形及び前記第２ピーク波形に係る成分を同定する。

なお、上記分析方法における試料溶液とは、分析の対象となる試料を含む溶液であって、試料そのものが１００％を占めるものであっても、又は、試料が適宜希釈されたものであっても、いずれをも概念として含むものである。この試料溶液については、前記界面の到達を特定することができ、かつ、液体の性状を有していれば特に限定はない。この液体としては、前記試料としての固体を、たとえば、液体の媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液であってもよい。前記試料が液体の場合、たとえば、前記試料の原液をそのまま試料溶液として使用してもよいし、濃度が高すぎるような場合には、前記原液を、たとえば、液体の媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液を試料溶液として使用してもよい。前記液体の媒体は、前記試料を懸濁、分散又は溶解可能なものであれば、特に制限されず、たとえば、水、緩衝液等が挙げられる。前記試料は、たとえば、生体由来の検体、環境由来の検体、金属、化学物質、医薬品等が挙げられる。前記生体由来の検体は、特に制限されず、たとえば、尿、血液、毛髪、唾液、汗、爪等が挙げられる。前記血液検体は、たとえば、赤血球、全血、血清、血漿等が挙げられる。前記生体は、たとえば、ヒト、非ヒト動物、植物等が挙げられ、前記非ヒト動物は、たとえば、ヒト以外の哺乳類、両生爬虫類、魚介類、昆虫類等が挙げられる。前記環境由来の検体は、特に制限されず、たとえば、食品、水、土壌、大気、空気等が挙げられる。前記食品は、たとえば、生鮮食品又は加工食品等が挙げられる。前記水は、たとえば、飲料水、地下水、河川水、海水、生活排水等が挙げられる。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記試料溶液は血液を試料として含む溶液であり、前記成分はヘモグロビンである。

本発明の好ましい実施の形態においては、前記分析方法は、前記微細流路を有するディスポーザブルタイプの分析チップを用いて行われる。

本発明に係る分析方法を実行するのに使用することができる分析システムを示すシステム概略図である。 図１の分析システムに用いられる分析チップを示す平面図である。 図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿う断面図である。 本発明に係る分析方法を示すフロー図である。 準備工程の手順を示すフロー図である。 図５の準備工程の一工程を示す断面図である。 図５の準備工程の一工程を示す断面図である。 図５の準備工程の一工程を示す断面図である。 図５の準備工程の一工程を示す断面図である。 分析工程の手順を示すフロー図である。 ＨｂＡＡ検体のエレクトロフェログラムの例を示す。 ＨｂＣＣ検体のエレクトロフェログラムの例を示す。 ＨｂＥＥ検体のエレクトロフェログラムの例を示す。 ＨｂＳＳ検体のエレクトロフェログラムの例を示す。 ＨｂＳＣ検体のエレクトロフェログラムの例を示す。 図１１〜図１５のエレクトロフェログラムを重ね合わせて示す。

以下、本発明の好ましい実施の形態につき、図面を参照して具体的に説明する。

図１は、本発明に係る分析方法を実行するのに使用することができる分析システムＡ１の概略構成を示している。分析システムＡ１は、分析装置１及び分析チップ２を備えて構成されている。分析システムＡ１は、試料Ｓａを対象として電気泳動法による分析方法を実行するシステムである。試料Ｓａは特に限定されないが、本実施形態においては、人体から採取された血液を例として説明する。試料Ｓａに含まれる成分のうち分析の対象となる成分を分析成分と定義する。

上記分析成分としては、ヘモグロビン（Ｈｂ）、アルブミン（Ａｌｂ）、グロブリン（α１、α２、β、γグロブリン）、フィブリノーゲン等が挙げられる。上記ヘモグロビンとしては、たとえば、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ）、変異ヘモグロビン（ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＳ等）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）等の複数のヘモグロビン種が挙げられる。変異ヘモグロビンについては、種々の疾病や病態の原因となることが知られており（たとえば、ＨｂＳは鎌状赤血球貧血症の原因となる）、ヘモグロビン種を同定することで、疾病・病態の診断や治療に役立てることが期待される。以降の説明においては、上記分析成分がヘモグロビン（特に変異ヘモグロビン種）である場合を例に説明する。健常な成人のヘモグロビンには、大多数のＨｂＡ並びに僅かなＨｂＦ及びＨｂＡ２が含まれる。ヘモグロビンは四量体であり、たとえばＨｂＡは二つのα鎖と二つのβ鎖から構成される。このα鎖又はβ鎖の産生を支配する遺伝子配列に何らかの変異が生じると、アミノ酸配列が通常とは異なる鎖が産生されたり、その鎖の産生が抑制されたりした結果、通常とは異なるヘモグロビン種が生じる。一般的に、このようなヘモグロビン種を変異ヘモグロビンと呼ぶ。健常人のヘモグロビンの遺伝子型はＨｂＡ／ＨｂＡのホモ接合体であるが、変異ヘモグロビン保有者の遺伝子型は、ＨｂＡ／ＨｂＶのヘテロ接合体（ＨｂＶはＨｂＡ以外の変異ヘモグロビン）、又は、ＨｂＶ／ＨｂＶのホモ接合体（ＨｂＶ同士が異なる場合は、ヘテロ接合体）である。臨床検査業界においては、健常人由来の血液検体をＨｂＡＡ検体、ＨｂＡ／ＨｂＶのヘテロ接合体を持つ人由来の血液検体をＨｂＡＶ検体（Ｖは任意の変異）、ＨｂＶ／ＨｂＶのホモ接合体（ＨｂＶ同士が異なる場合は、ヘテロ接合体）を持つ人由来の血液検体をＨｂＶＶ検体（Ｖは任意の変異）と呼ぶ。したがって、たとえばＨｂＡＳ検体には、大多数のＨｂＡ及びＨｂＳと、僅かなＨｂＦ及びＨｂＡ２が含まれる。たとえばＨｂＳＳ検体には、大多数のＨｂＳと、僅かなＨｂＦ及びＨｂＡ２が含まれる。ここで、以下の記述では、たとえば「ＨｂＸＹ」（ただし、「Ｘ」及び「Ｙ」はそれぞれ「Ａ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」及び「Ｓ」のうちのいずれかで、互いに異なるものとする。）と表記した場合、ＨｂＸ／ＨｂＹのヘテロ接合体であって、先に表記されている方（すなわち、ＨｂＸ）が後に表記されている方（すなわち、ＨｂＹ）よりも全ヘモグロビン中に占める割合が高いことを意味する。

分析チップ２は、試料Ｓａを保持し、かつ分析装置１に装填された状態で試料Ｓａを対象とした分析の場を提供するものである。本実施形態においては、分析チップ２は、１回の分析を終えた後に廃棄されることが意図された、いわゆるディスポーザブルタイプの分析チップとして構成されている。図２及び図３に示すように、分析チップ２は、本体２１、混合槽２２、導入槽２３、フィルタ２４、排出槽２５、電極槽２６、キャピラリー管２７及び連絡流路２８を備えている。図２は、分析チップ２の平面図であり、図３は、図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿う断面図である。なお、分析チップ２は、ディスポーザブルタイプのものに限定されず、複数回の分析に用いられるものであってもよい。また、本発明に係る分析システムは、分析装置１に装填される別体の分析チップ２を備える構成に限定されず、分析チップ２と同様の機能を果たす機能部位が分析装置１に組み込まれた構成であってもよい。

本体２１は、分析チップ２の土台となるものであり、その材質は特に限定されず、たとえば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等があげられる。本実施形態においては、本体２１は、図３における上側部分２Ａと下側部分２Ｂとが別体に形成されており、これらが互いに結合された構成である。なお、これに限らず、たとえば、本体２１を一体的に形成してもよい。

混合槽２２は、後述する試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する混合工程が行われる箇所の一例である。混合槽２２は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。導入槽２３は、混合槽２２における混合工程によって得られた試料溶液としての混合試料Ｓｍが導入される槽である。導入槽２３は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。

フィルタ２４は、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられている。フィルタ２４の具体的構成は限定されず、好適な例として、たとえばセルロースアセテート膜フィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．４５μｍ）が挙げられる。

排出槽２５は、電気泳動法における電気浸透流の下流側に位置する槽である。排出槽２５は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。電極槽２６は、電気泳動法による分析工程において、電極３１が挿入される槽である。電極槽２６は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。連絡流路２８は、導入槽２３と電極槽２６とを繋いでおり、導入槽２３と電極槽２６との導通経路を構成している。

キャピラリー管２７は、導入槽２３と排出槽２５とを繋ぐ微細流路であり、電気泳動法における電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）が生じる場である。キャピラリー管２７は、たとえば本体２１の上記下側部分２Ｂに形成された溝として構成されている。なお、本体２１には、キャピラリー管２７への光の照射及びキャピラリー管２７を透過した光の出射を促進するための凹部等が適宜形成されていてもよい。キャピラリー管２７のサイズは特に限定されないが、その一例を挙げると、その幅が２５μｍ〜１００μｍ、その深さが２５μｍ〜１００μｍ、その長さが５ｍｍ〜１５０ｍｍである。分析チップ２全体のサイズは、キャピラリー管２７のサイズ及び混合槽２２、導入槽２３、排出槽２５及び電極槽２６のサイズや配置等に応じて適宜設定される。

なお、上記構成の分析チップ２は一例であって、電気泳動法による分析が可能な構成の分析チップを適宜採用することができる。

分析装置１は、試料Ｓａが点着された分析チップ２が装填された状態で、試料Ｓａを対象とした分析処理を行う。分析装置１は、電極３１，３２、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３、スリット４４、検出器５、分注器６、ポンプ６１、希釈液槽７１、泳動液槽７２及び制御部８を備えている。なお、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３及び検出器５は、本発明でいう測定部の一例を構成する。

電極３１及び電極３２は、電気泳動法においてキャピラリー管２７に所定の電圧を印加するためのものである。電極３１は、分析チップ２の電極槽２６に挿入されるものであり、電極３２は、分析チップ２の排出槽２５に挿入されるものである。電極３１及び電極３２に印加される電圧は特に限定されないが、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。

光源４１は、電気泳動法において光学測定値としての吸光度を測定するための光を発する部位である。光源４１は、たとえば所定の波長域の光を出射するＬＥＤチップを具備する。光学フィルタ４２は、光源４１からの光のうち所定の波長の光を減衰させつつ、その余の波長の光を透過させるものである。レンズ４３は、光学フィルタ４２を透過した光を分析チップ２のキャピラリー管２７の分析箇所へと集光するためのものである。スリット４４は、レンズ４３によって集光された光のうち、散乱などを引き起こしうる余分な光を除去するためのものである。

検出器５は、分析チップ２のキャピラリー管２７を透過してきた光源４１からの光を受光するものであり、たとえばフォトダイオードやフォトＩＣなどを具備して構成されている。

このように、光源４１から発した光が検出器５へと至る経路が光路である。そして、当該光路がキャピラリー管２７と交わる位置でそのキャピラリー管２７を流れる溶液（すなわち、試料溶液及び泳動液のいずれか又はその混合溶液）について光学測定値が測定される。すなわち、キャピラリー管２７において光源４１から検出器５へ至る光路が交わる位置が、光学測定値の測定部である。この光学測定値としては、たとえば吸光度が挙げられる。吸光度は、該光路の光がキャピラリー管２７を流れる溶液によって吸収された度合いを表すものであり、入射光強度と透過光強度の比の常用対数の値の絶対値を表したものである。この場合、検出器５としては汎用的な分光光度計を利用することができる。なお、吸光度を使用せずとも、単純に透過光強度の値そのものなど、光学測定値であれば本発明に利用することができる。以下においては、光学測定値として吸光度を使用した場合を例に説明する。

分注器６は、所望の量の希釈液Ｌｄや泳動液Ｌｍ及び混合試料Ｓｍを分注するものであり、たとえばノズルを含む。分注器６は図示しない駆動機構によって分析装置１内の複数の所定位置を自在に移動可能である。ポンプ６１は、分注器６への吸引源及び吐出源である。また、ポンプ６１は、分析装置１に設けられた図示しないポートの吸引源及び吐出源として用いてもよい。これらのポートは、泳動液Ｌｍの充填などに用いられる。また、ポンプ６１とは別の専用のポンプを備えてもよい。

希釈液槽７１は、希釈液Ｌｄを貯蔵するための槽である。希釈液槽７１は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の希釈液Ｌｄが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。泳動液槽７２は、泳動液Ｌｍを貯蔵するための槽である。泳動液槽７２は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の泳動液Ｌｍが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。

希釈液Ｌｄは、試料Ｓａと混合されることにより、試料溶液としての混合試料Ｓｍを生成するためのものである。希釈液Ｌｄの主剤は特に限定されず、水、生理食塩水が挙げられ、好ましい例として後述する泳動液Ｌｍと類似の成分の液体が挙げられる。また、希釈液Ｌｄは、上記主剤の他に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。

泳動液Ｌｍは、電気泳動法による分析工程において、排出槽２５及びキャピラリー管２７に充填され、電気泳動法における電気浸透流を生じさせる媒体である。泳動液Ｌｍは、特に制限されないが、酸を用いたものが望ましい。上記酸は、たとえば、クエン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸がある。また、泳動液Ｌｍは、弱塩基を含むことが好ましい。上記弱塩基としては、たとえば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。泳動液ＬｍのｐＨは、たとえば、ｐＨ４．５〜６の範囲である。泳動液Ｌｍのバッファーの種類は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等がある。また、泳動液Ｌｍにも、希釈液Ｌｄの説明で述べたのと同様に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。

泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ、及び混合試料Ｓｍは以下を例示するが、後述する界面検出時間において、試料溶液（混合試料Ｓｍ）と泳動液Ｌｍとの界面の到達に起因する光学測定値の変化が生じる組み合わせであれば任意に選択できる。

（泳動液Ｌｍ）
泳動液Ｌｍは、たとえば、以下の成分を含有する。
クエン酸：４０ｍＭ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム：１．２５％ｗ／ｖ
ピペラジン：２０ｍＭポリオキシアルキレンアルキルエーテル（商品名：エマルゲンＬＳ−１１０、花王社製）：０．１％ｗ／ｖ
アジ化ナトリウム：０．０２％ｗ／ｖ
プロクリン３００：０．０２５％ｗ／ｖ
以上の成分の他、ｐＨ調整用のジメチルアミノエタノールを滴下して、ｐＨ５．０に調整した。

（希釈液Ｌｄ）
希釈液Ｌｄは、たとえば、以下の成分を含有する。
クエン酸：３８ｍＭ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム：０．９５％ｗ／ｖ
１−（３−スルホプロピル）ピリジニウムヒドロキシド分子内塩（ＮＤＳＢ−２０１）：４７５ｍＭ
２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）：１９ｍＭ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（商品名：エマルゲンＬＳ−１１０、花王社製）：０．４％ｗ／ｖ
アジ化ナトリウム：０．０２％ｗ／ｖ
プロクリン３００ ０．０２５％ｗ／ｖ
以上の成分の他、ｐＨ調整用のジメチルアミノエタノールを滴下して、ｐＨ６．０に調整した。

（混合試料Ｓｍ）
１．５μＬの試料Ｓａを６０μＬの希釈液Ｌｄに添加して混合試料Ｓｍとした。

制御部８は、分析装置１における各部を制御するものである。制御部８は、たとえばＣＰＵ、メモリ及びインターフェースなどを具備する。前記メモリには、本発明に係る分析方法を行うためのプログラムや各種データが適宜記憶されている。

次に、分析システムＡ１を用いて行う本発明に係る分析方法の一例について、以下に説明する。図４は、本実施形態の分析方法を示すフロー図である。本分析方法は、準備工程Ｓ１、電気泳動工程Ｓ２、及び分析工程Ｓ３を有する。

＜準備工程Ｓ１＞
図５は、準備工程Ｓ１における具体的な手順を示すフロー図である。本実施形態において、準備工程Ｓ１は、同図に示すように、試料採取工程Ｓ１１、混合工程Ｓ１２、泳動液充填工程Ｓ１３、及び導入工程Ｓ１４を有する。

＜試料採取工程Ｓ１１＞
まず、試料Ｓａを用意する。本実施形態においては、試料Ｓａは、人体から採取された血液である。血液としては、全血、成分分離血液又は溶血処理が施されたもの等であってもよい。そして、試料Ｓａが分注された分析チップ２を分析装置１に装填する。

＜混合工程Ｓ１２＞
次いで、試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する。具体的には、図６に示すように、所定量の試料Ｓａが分析チップ２の混合槽２２に点着されている。次いで、分注器６によって希釈液槽７１の希釈液Ｌｄを所定量吸引し、図７に示すように、所定量の希釈液Ｌｄを分析チップ２の混合槽２２に分注する。そして、ポンプ６１を吸引源及び吐出源として、分注器６から希釈液Ｌｄの吸引及び吐出を繰り返す。これにより、混合槽２２において試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合され、試料溶液としての混合試料Ｓｍが得られる。試料Ｓａと希釈液Ｌｄとの混合は、分注器６の吸引及び吐出以外の方法によって行ってもよい。

＜泳動液充填工程Ｓ１３＞
次いで、分注器６によって泳動液槽７２の泳動液Ｌｍを所定量吸引し、図８に示すように、所定量の泳動液Ｌｍを分析チップ２の排出槽２５に分注する。そして、上述したポートからの吸引や吐出を適宜実施するなどの手法により、排出槽２５及びキャピラリー管２７に泳動液Ｌｍを充填する。

＜導入工程Ｓ１４＞
次いで、図９に示すように、混合槽２２から所定量の混合試料Ｓｍを分注器６によって採取する。そして、分注器６から導入槽２３に所定量の混合試料Ｓｍを導入する。この導入においては、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられたフィルタ２４を混合試料Ｓｍが通過する。また、本実施形態においては、混合試料Ｓｍが導入槽２３から連絡流路２８を通じて電極槽２６へと充填される。この際、導入槽２３から連絡流路２８を介した電極槽２６への混合試料Ｓｍの流動が起こることとなるが、導入槽２３から連絡流路２８へは、キャピラリー管２７の長手方向に対してほぼ直交する方向へ混合試料Ｓｍが流動する（図２参照）。一方、キャピラリー管２７の泳動液Ｌｍはこの段階ではほとんど移動していない。この結果、導入槽２３とキャピラリー管２７との接続部（図３参照）においてせん断流が生じることで、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの明瞭な界面が生じた状態となる。なお、混合溶液Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が生じる方法であれば、物理的に導入槽２３とキャピラリー管２７との境界に移動可能なフィルタを設けたり、制御的に流動方法を変更したりする等、あらゆる手段を採用することができる。

＜電気泳動工程Ｓ２＞
次いで、図１に示すように、電極槽２６に電極３１を挿入し、排出槽２５に電極３２を挿入する。続いて、制御部８からの指示により電極３１及び電極３２に電圧を印加する。この電圧は、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。これにより電気浸透流を生じさせ、導入槽２３から排出槽２５へとキャピラリー管２７中において混合試料Ｓｍを徐々に移動させる。この際、導入槽２３に混合試料Ｓｍが充填されているため、キャピラリー管２７において混合試料Ｓｍが連続的に供給されている状態で、上記分析成分であるヘモグロビン（Ｈｂ）を電気泳動させることとなる。このとき、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの上記した界面が維持された状態のまま、混合試料Ｓｍは泳動液Ｌｍを下流方向へ押しやりつつキャピラリー管２７を泳動していくことになる。また、光源４１からの発光を開始し、検出器５による吸光度の測定を行う。そして、電極３１及び電極３２からの電圧印加開始時から経過時間と吸光度との関係を測定する。

＜分析工程Ｓ３＞
ここで、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的速い成分に対応した吸光度ピークは、上記電圧印加開始時からの経過時間が比較的短い時点で現れる。一方、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的遅い成分に対応した吸光度ピークは、上記電圧印加開始時からの経過時間が比較的長い時点で現れる。このことを利用して、混合試料Ｓｍ中の成分の分析（分離測定）が行われる。本実施形態においては、血液に含まれるヘモグロビン（特に変異ヘモグロビン）の分析を行い、混合試料Ｓｍ（血液）に含まれ得るヘモグロビン（変異ヘモグロビン）が分析成分である。測定された吸光度を基に、制御部８の制御によって分析工程Ｓ３が実行される。本実施形態の分析工程Ｓ３は、図１０に示すように、波形形成工程Ｓ３１、界面検出工程Ｓ３２、ピーク波形特定工程Ｓ３３及び成分同定工程Ｓ３４を有する。

＜波形形成工程Ｓ３１＞
測定された上記吸光度は、たとえば、測定開始時点からの経時的な累積値として表されるため、経時的に単調増加の曲線となる。本工程においては、測定された上記吸光度の経時的な累積値に対し演算処理（たとえば、制御部８による微分処理、差分処理等）することにより、エレクトロフェログラムを作成する。ここで、電圧印加開始時を測定開始時（０ｓｅｃ）として、当該測定開始後の経過時間（検出時間）に対応した吸光度に関する測定波形が形成される。

たとえば、変異ヘモグロビンが含有されないＨｂＡＡ検体のエレクトロフェログラムは、図１１のようになる。ここで、縦軸が「吸光度変化率（ｍＡｂｓ／ｓｅｃ）」となっているのは、測定された吸光度が前記演算処理により微分処理されて得られた値（微分値）を縦軸に取っていることを示している（以下同様）。本検体では、ＨｂＡに由来する最大のピーク波形（以下、「最大ピーク波形」とする。）がほぼ単一のピーク波形として明瞭に認められ、このピーク波形が得られる検出時間が最大ピーク検出時間である。

また、変異ヘモグロビンのホモ接合体の例として、ＨｂＣＣ検体のエレクトロフェログラムは図１２のようになる。本検体では、ＨｂＣに由来する最大ピーク波形が明瞭に認められるが、このピーク波形は図１１のＨｂＡのピーク波形の検出時間よりも長い検出時間（最大ピーク検出時間）で検出される。

変異ヘモグロビンのホモ接合体の別の例として、ＨｂＥＥ検体のエレクトロフェログラムは図１３のようになる。本検体では、ＨｂＥに由来する最大ピーク波形が明瞭に認められるが、このピーク波形は図１１のＨｂＡのピーク波形の検出時間よりもやや長いが、図１２のＨｂＣのピーク波形の検出時間よりは短い検出時間（最大ピーク検出時間）で検出される。

変異ヘモグロビンのホモ接合体のさらに別の例として、ＨｂＳＳ検体のエレクトロフェログラムは図１４のようになる。本検体では、ＨｂＳに由来する最大ピーク波形が明瞭に認められるが、このピーク波形は図１３のＨｂＥのピーク波形の検出時間よりもやや長いが、図１２のＨｂＣのピーク波形の検出時間よりは短い検出時間（最大ピーク検出時間）で検出される。

なお、図示はしないが、変異ヘモグロビンのホモ接合体であるＨｂＤＤ検体においては、ＨｂＤに由来する最大ピーク波形は、図１３に示すＨｂＥのピーク波形の検出時間と図１４に示すＨｂＳのピーク波形の検出との間の検出時間（最大ピーク検出時間）で検出される。

そして、変異ヘモグロビンのヘテロ接合体の例として、ＨｂＳＣ検体のエレクトロフェログラムは図１５のようになる。本検体では、ＨｂＳに由来する最大ピーク波形が、図１４に示すピーク波形の検出時間とほぼ同一の検出時間で検出され、この検出時間が最大ピーク検出時間となっている。また、ＨｂＣに由来する２番目に大きいピーク波形（以下、「第２ピーク波形」とする。）が、図１２に示すピーク波形の検出時間とほぼ同一の検出時間で検出され、この検出時間が第２ピーク検出時間となっている。

以上のように、測定波形は、混合試料Ｓｍ（試料Ｓａ）に含まれる成分に応じたピーク波形部分を有する。そして、上記ピーク波形部分に関する情報が取得される。上記ピーク波形部分に関する情報は、前記最大ピーク波形及び第２ピーク波形のそれぞれについて、ピークトップ部分のピーク時間（ピーク波形部分における最も高い位置の検出時間、図１２参照）、ボトム時間（ピーク波形部分における最も低い位置での検出時間、図１２参照）、ピーク波形部分の面積比率（測定波形に表れた吸光度変化率が正の領域の全面積に対して、ピークトップを挟む２つのボトム間でピーク波形部分によって囲まれた面積の割合）等を含み、たとえば、制御部８による演算処理等によって得られる。なお、ボトムは様々な方法で決定することが可能である。たとえば、ピークトップの前後において直近に現れる極小値の位置をボトムとしてもよい。また、このような極小値がない場合（すなわち、ピークトップから単調に減少していくような場合）には、たとえば、面積算定の基準となるベースラインに達した位置をボトムとみなすこととしてもよい。

＜界面検出工程Ｓ３２＞
ここで、図１１〜１５において、測定開始後１０秒前後に見られる小さな波形、すなわち、一旦減少した後上昇に転ずる波形が、キャピラリー電気泳動において、電圧印加に伴って生ずるキャピラリー中の液全体の流れである「ＥＯＦ」（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ（電気浸透流）の略）が測定部（具体的には、前記光路）において最初に検出されたことを示す。ここで、このＥＯＦが最初に検出された時点は、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が測定部に到達したことを示す時点としての意義を有する。本発明では、測定開始時からこの時点までの時間を「界面検出時間」と称する。本工程では、このＥＯＦを、光学測定値としての吸光度の変化から検出し、測定開始後からその検出されるまでの経過時間である「界面検出時間」を決定する。なお、前記測定部や前記光路とは別に界面測定用の測定部（光路）を設けた場合は、その位置で決定すればよい。

＜ピーク波形特定工程Ｓ３３＞
特徴波形特定工程としてのピーク波形特定工程Ｓ３３においては、上記の波形形成工程Ｓ３１で得られた測定波形において表れたピーク波形に係る成分から、特徴波形としての最大ピーク波形が特定される。

ここで、前述の図１１〜図１５のエレクトロフェログラムを重ね合わせたものが図１６である。本図から明らかなように、ＨｂＣ由来のピーク波形は、ＨｂＡ、ＨｂＥ、ＨｂＤ（図示せず）及びＨｂＳの各ピーク波形の検出時間より明らかに長い検出時間で得られていることが分かる。また、ＨｂＡ、ＨｂＥ、ＨｂＤ（図示せず）及びＨｂＳの各ピーク波形は近接してはいるものの、この順に検出時間が長くなっていることが分かる。すなわち、ＨｂＡ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ及びＨｂＣの各ピーク波形の検出時間をそれぞれａ、ｅ、ｄ、ｓ及びｃとし、界面検出時間をｔとすると、図１６に示すように、ａ、ｅ、ｄ及びｓは当然ｔよりも大きく、ｃはａ、ｅ、ｄ及びｓよりも大きいことが明らかである。

具体的には、まず、前記波形形成工程で得られた測定波形から、最大の面積を有するピーク波形である最大ピーク波形が特定される。ここで、ピーク波形の面積については、前記の通り、ピークトップの前後に現れるボトム間（図１２参照）でピーク波形によって囲まれた面積とすることができる。

次に、同測定波形から、２番目に大きな面積を有するピーク波形である第２ピーク波形を特定する。ここで、図１１〜図１４に示すように、ホモ接合体の場合は最大ピーク波形は明瞭であるが、その他にも微小なピーク波形がいくつか認められる。そこで、測定波形全体の面積に対し、所定の割合以上を占める場合に限り、第２ピーク波形と認めることができる。そして、そうでない場合には、第２ピーク波形は存在しないものとして、最大ピーク波形のみで、ホモ接合体としてのヘモグロビン成分が同定されることとなる。

＜成分同定工程Ｓ３４＞
本工程においては、上記のピーク波形特定工程Ｓ３３で特定された最大ピーク波形が検出された最大ピーク検出時間（及び第２ピーク波形がある場合には、当該第２ピーク波形が検出された第２ピーク検出時間）と、界面検出時間との対比に基づいて同定する。以下では、図１６に示すように他のヘモグロビン成分とは明らかに区別可能なＨｂＣ成分、及び、実際に出現頻度が最も高いＨｂＡ成分の少なくとも一方を有する検体におけるヘモグロビン成分の同定について説明する。

ここで、ディスポーザブルタイプの分析チップ２を用いた測定・分析では、分析チップ２の個体差等によって同一成分の検出時間が変動しても、複数回の測定では可能であった較正等を行うことなく、１回のみの分析で正確な分析結果を得ることが求められる。１回のみの分析で最大のピーク波形部分のピーク時間（検出時間）を基準にヘモグロビン種の同定を行う場合、分析成分の検出時間の変動が大きいと、成分の同定が正確に行えずに分析結果に誤りが生じる場合がある。

上記のような事情に鑑み、ピーク波形の検出時間を、界面検出時間で相対化することによって、分析チップの個体差等に起因する検出時間の変動に影響されずにピーク波形に係るヘモグロビン成分を同定することが可能となる。

具体的には、まず、前記ピーク波形特定工程Ｓ３３で特定された最大ピーク波形のピークトップに当たる検出時間を最大ピーク検出時間（ｐ１）とする。

次に、前記ピーク波形特定工程Ｓ３３で第２ピーク波形が特定されている場合には、当該第２ピーク波形のピークトップに当たる検出時間を第２ピーク検出時間（ｐ２）とする。

このとき、たとえば、図１６に示すように、ＨｂＣ成分由来のピーク波形の検出時間（ｃ）は他のピーク波形の検出時間（ａ、ｅ、ｄ又はｓ）よりも長いことに基づいて、最大ピーク検出時間（ｐ１）又は第２ピーク検出時間（ｐ２）と、界面検出時間（ｔ）との比（換言すると、最大ピーク検出時間又は第２ピーク検出時間を界面検出時間で除した値）が、所定の値よりも大きければ、その最大ピーク波形はＨｂＣ成分由来のものである、と判定することができる。

この所定の値としては、たとえば、ＨｂＣ成分以外で最も大きな検出時間（図中ではＨｂＳ成分のピーク波形の検出時間ｓ）とＨｂＣのピーク波形の検出時間ｃとに基づき、
（ｓ／ｔ）＜ｘ＜（ｃ／ｔ）
の関係を満たすような値ｘをもって充てることが望ましい。

（１）ＨｂＣ成分がある場合
ここで、最大ピーク検出時間（ｐ１）又は第２ピーク検出時間（ｐ２）について、
ｘ＜（ｐ１／ｔ） 又は ｘ＜（ｐ２／ｔ）
であれば、当該最大ピーク波形又は第２ピーク波形はＨｂＣ成分由来のものであると同定することができる。

（１−１）第２ピーク波形がない場合
この場合、最大ピーク波形のみが特定され、第２ピーク波形が特定されない場合は、当該検体種はＨｂＣＣ検体であると同定される。

（１−２）第２ピーク波形がある場合
一方、最大ピーク波形及び第２ピーク波形の両方が存在する場合には、当該検体種はＨｂＣ成分を有するヘテロ接合体、すなわち、ＨｂＣＡ検体、ＨｂＣＥ検体、ＨｂＣＤ検体、ＨｂＣＳ検体、ＨｂＳＣ検体、ＨｂＤＣ検体、ＨｂＥＣ検体又はＨｂＡＣ検体のいずれかであると考えられる。

そこで、最大ピーク検出時間（ｐ１）と、第２ピーク検出時間（ｐ２）と、界面検出時間（ｔ）との対比、つまり
ｙ＝（ｐ１−ｔ）／（ｐ２−ｔ）
で定義される値ｙに基づき、前記最大ピーク波形及び前記第２ピーク波形に係る成分が同定され、検体種を同定することができる。

たとえば、
０．６４≦ｙ＜０．６７
であれば、当該検体はＨｂＣＡ検体であると同定される。他のヘテロ接合体についてもこの数値を適宜設定することによって同定が可能である。

（２）ＨｂＣ成分がない場合
一方、
（ｐ１／ｔ）≦ｘ かつ （ｐ２／ｔ）≦ｘ
であれば、当該最大ピーク波形及び第２ピーク波形はいずれもＨｂＣ成分検体由来のものではない。そこで、当該最大ピーク波形及び第２ピーク波形はＨｂＡ、ＨｂＥ、ＨｂＤ及びＨｂＳのうちのいずれかの成分に由来すると考えられる。ただし、前述の通り、ＨｂＡ成分以外のヘモグロビン成分の出現頻度は稀であるため、最大ピーク波形がＨｂＣ成分由来のものと判定されなかった場合は、その最大ピーク波形はＨｂＡ成分由来のものと判定する。

（２−１）第２ピーク波形がない場合
そして、第２ピーク波形がない場合は、上述の通り最大ピーク波形はＨｂＡ成分由来のものと判定されているので、当該検体はＨｂＡＡ検体と判定される。

なお、最大ピーク波形のみの場合、当該最大ピーク波形は、上記で判定されたホモ接合体であるＨｂＡＡ検体ではなく、稀な頻度ながらも、ＨｂＥＥ検体、ＨｂＤＤ検体又はＨｂＳＳ検体のいずれかである可能性がある。その場合、最大ピーク検出時間（ｐ１）と界面検出時間（ｔ）とを利用して、当該検体がいずれのホモ接合体であるかを同定することは可能である。

たとえば、
下限値：（ｐ１−ｔ）×０．９４＋ｔ
と、
上限値：（ｐ１−ｔ）×０．９７＋ｔ
との間の範囲内に、ＨｂＡ２成分由来と考えられるピーク波形があった場合には、当該検体はＨｂＥＥ検体の疑いがあると判断する。

なお、ＨｂＡＡ検体の場合、ＨｂＡ１ｃ成分由来のピーク波形及び検出時間を利用して同定することが可能である。

（２−２）第２ピーク波形がある場合
一方、たとえば、最大ピーク波形に加え第２ピーク波形も特定された場合には、当該検体はＨｂＣ成分を有さず、ＨｂＡ成分を有するヘテロ接合体、すなわち、ＨｂＳＡ検体、ＨｂＤＡ検体、ＨｂＥＡ検体、ＨｂＡＥ検体、ＨｂＡＤ検体又はＨｂＡＳ検体のいずれかであると考えられる。

この場合も、前記した値ｙを用いて、前記最大ピーク波形及び前記第２ピーク波形に係る成分が同定され、検体種を同定することができる。

たとえば、０．８１≦ｙ＜０．８７
であれば、当該検体はＨｂＳＡ検体であると同定される。他のヘテロ接合体についてもこの数値を適宜設定することによって同定が可能である。ただし、異なる検体種であっても、値ｙが同じ範囲となったり、一部が重複したりすることもある。その場合は、それぞれの検体の疑いがあることを通知することが好ましい。

なお、上記ではＨｂＣ検体由来のピーク波形がなく、かつ、第２ピーク波形がある場合には、当該検体はＨｂＡ成分を有するヘテロ接合体であるとの前提にて検体種の同定を行うこととしているが、実際には、最大ピーク波形及び第２ピーク波形のいずれもＨｂＡ検体及びＨｂＣ検体由来のものではないヘテロ接合体の可能性もある。このような、ＨｂＡ検体及びＨｂＣ検体以外の組み合わせによるヘテロ接合体についても、前記値ｙを利用して、同定することは可能である

このとき、前記値ｙのみでは判別が困難な場合も考えられるが、その場合は、測定波形を参照して第３のピーク波形の位置や面積を参照して同定の補助情報とすることもできる。この第３のピーク波形としては、たとえば、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＦ等が考えられる。また、可能性のある検体種についてその疑いがあることを通知することが望ましい。

ここで、上記までの説明で使用した数値範囲を表す不等式における不等号のうち、下限値及び上限値のどちらに等号付き不等号（≦）を使用するかについては、測定条件に鑑み適宜定めることができる。

なお、本分析方法に用いられるディスポーザブルタイプの分析チップ２については、製造時のロット間でのバラつきも生じ得る。同一ロットの分析チップ２は、各部の寸法が実質的に同一となるので、分析時のピーク波形の検出時間の変動についても同一の変動傾向が見られる。このため、たとえば製造ロットごとにあらかじめキャピラリー電気泳動法による分離測定を行い、ピーク波形の検出時間の変動傾向等のロット間差情報を収集しておくことが望ましい。そして、試料の分析の際には、成分同定工程（Ｓ３４）の前に、分析チップ２のロット間差情報に基づき、検出時間を補正する工程を行ってもよい。このような分析方法によれば、分析チップ２についてロット間でのバラつきが生じても分析精度の低下を抑制することができる。

以上、本発明の具体的な実施形態を説明したが、本発明に係る分析方法は、上述した実施形態に限定されるものではない。本発明に係る分析方法の各部の具体的な構成は、種々に設計変更自在である。

Ａ１ 分析システム
Ｓａ 試料
Ｓｍ 混合試料
Ｌｄ 希釈液
Ｌｍ 泳動液
１ 分析装置
２ 分析チップ
２Ａ 上側部分
２Ｂ 下側部分
２１ 本体
２２ 混合槽
２３ 導入槽
２４ フィルタ
２５ 排出槽
２６ 電極槽
２７ キャピラリー管
２８ 連絡流路
３１，３２ 電極
４１ 光源
４２ 光学フィルタ
４３ レンズ
４４ スリット
５ 検出器
６ 分注器
６１ ポンプ
７１ 希釈液槽
７２ 泳動液槽
８ 制御部
Ｓ１ 準備工程
Ｓ１１ 試料採取工程
Ｓ１２ 混合工程
Ｓ１３ 泳動液充填工程
Ｓ１４ 導入工程
Ｓ２ 電気泳動工程
Ｓ３ 分析工程
Ｓ３１ 波形形成工程
Ｓ３２ 界面検出工程
Ｓ３３ ピーク波形特定工程
Ｓ３４ 成分同定工程

Claims (9)

1. 微細流路に導入される試料溶液に電圧を印加し、前記試料溶液に含まれる成分を分離分析し、前記微細流路の所定の測定位置における光学測定値を測定するキャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、
   測定開始時点からの経過時間に対応した前記光学測定値に関する波形を形成する波形形成工程と、
   前記試料溶液と泳動液との界面が前記微細流路における前記所定の測定位置へ到達した際の前記光学測定値に基づいて前記測定開始時点から前記界面が前記所定の測定位置に到達する時点までの経過時間である界面検出時間を決定する界面検出工程と、
   前記波形に表れた複数の特徴波形の各々に対応する前記測定開始時点からの経過時間である波形検出時間を特定する特徴波形特定工程と、
   前記波形検出時間及び前記界面検出時間に基づき前記試料溶液に含まれる成分を同定する成分同定工程と、
   を含む、分析方法。
2. 前記測定開始時点は前記試料溶液への電圧印加開始時点である、請求項１に記載の分析方法。
3. 前記界面検出工程においては、前記界面が前記所定の測定位置へ到達した際の前記光学測定値の変化に基づいて前記界面検出時間を決定する、請求項１又は請求項２に記載の分析方法。
4. 前記光学測定値は吸光度であり、
   前記特徴波形は前記波形におけるピーク波形であり、
   前記特徴波形特定工程は、前記ピーク波形を特定するピーク波形特定工程である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の分析方法。
5. 前記成分同定工程は、
   前記ピーク波形特定工程で特定される前記ピーク波形のうち最大のピーク波形である最大ピーク波形に対応する前記測定開始時点からの経過時間である最大ピーク検出時間と、
   前記界面検出時間と、
   の対比に基づき、前記最大ピーク波形に係る成分を同定する、請求項４に記載の分析方法。
6. 前記成分同定工程は、
   前記ピーク波形特定工程で特定される前記ピーク波形のうち最大のピーク波形である最大ピーク波形に対応する前記測定開始時点からの経過時間である最大ピーク検出時間と、
   前記ピーク波形特定工程で特定される前記ピーク波形のうち２番目に大きいピーク波形である第２ピーク波形に対応する前記測定開始時点からの経過時間である第２ピーク検出時間と、
   前記界面検出時間と、
   の対比に基づき、前記最大ピーク波形及び前記第２ピーク波形に係る成分を同定する、請求項４に記載の分析方法。
7. 前記成分同定工程は、前記最大ピーク検出時間と前記界面検出時間との差と、前記第２ピーク検出時間と前記界面検出時間との差との比に基づき、前記最大ピーク波形及び前記第２ピーク波形に係る成分を同定する、請求項６記載の分析方法。
8. 前記試料溶液は血液を試料として含む溶液であり、前記成分はヘモグロビンである、請求項１から７までのいずれかに記載の分析方法。
9. 前記微細流路を有するディスポーザブルタイプの分析チップを用いて行う、請求項１から８までのいずれかに記載の分析方法。

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