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JP6738841B2 - 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置 - Google Patents

脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置 Download PDF

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Description

＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１２年３月１５日に出願の、米国仮特許出願第６１／６１１，２２５号、および２０１２年３月２３日に出願の、米国仮特許出願第６１／６１４，６６４号の利益を主張し、その両方は、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、ＢＤＮＦの発現及び／又は機能を調節するオリゴヌクレオチドおよび関連する分子を含む。
ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡの複製、転写、および翻訳を含む核酸機能の多くの態様にとって重要である。ハイブリダイゼーションはまた、特定の核酸を検出するか、またはその発現を変化させる様々な技術の中心である。アンチセンスヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることによって、遺伝子発現を妨害し、それによって、ＲＮＡのスプライシング、転写、翻訳、および複製を干渉する。アンチセンスＤＮＡには、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが、リボヌクレアーゼＨによる消化のための基質として機能する、追加の特徴がある（ほとんどの細胞型中に存在する活動）。オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に対するケースのように、アンチセンス分子は、細胞へと送達され得るか、あるいはＲＮＡ分子として内因性遺伝子から発現され得る。ＦＤＡは、（サイトメガロウイルス性網膜炎の処置のための）アンチセンス薬物、ＶＩＴＲＡＶＥＮＥ（商標）を最近認可し、これは、アンチセンスが治療上の有用性を有していることを反映している。
ＷＯ ２０１０／０９３９０４およびその米国対応出願ＵＳ／２０１１／０３１９４７５は、それらの中で詳述されるオリゴヌクレオチドを使用する調節のための標的としてＢＤＮＦを開示する。ＢＤＮＦ関連の疾患および疾病を潜在的に処置するための、またはその処置に関係する研究に使用するための、天然アンチセンスの標的、およびそのような標的を補完する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）且つＢＤＮＦタンパク質発現を調節する新しく開発されたオリゴヌクレオチドに対する継続的な開発が必要とされている。
本概要は、本発明の性質および物質を簡潔に示す本発明の概要を示すために提供される。それは、請求項の範囲または意味を解釈または制限するためには使用されないという理解とともに提出されている。
１つの実施形態では、本発明は、天然アンチセンス転写物の任意の領域に対する標的とされるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって、天然アンチセンス転写物の作用を阻害する方法を提供し、結果として、哺乳動物の生物体における対応するＢＤＮＦセンス遺伝子のアップレギュレーションをもたらす。本明細書に詳述される天然アンチセンス転写物の阻害が、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび小分子によって達成され得ることも本明細書において熟慮され、これは本発明の範囲内にあると考えられる。
１つの実施形態は、限定されないが、インビボまたはインビトロでの患者の細胞または組織を含む生物系においてＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を調節する方法を提供し、該方法は、前記生物系あるいは前記細胞または組織を、長さが約５乃至約３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、ここで前記オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１乃至１２７９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１乃至１４７８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至１４３７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１乃至２３２２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１乃至２０３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１乃至２３６４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の１乃至３１３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１乃至９０６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の１乃至９９２：のヌクレオチド内で５乃至３０の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、それによって、インビボまたはインビトロでの患者の前記細胞または組織を含む前記生物系においてＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を調節するが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０−５５を有しているオリゴヌクレオチドが除外されることを条件とする。
１つの実施形態では、上述されるオリゴヌクレオチドは、標的上に生物系に存在するＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１で言及されるヌクレオチド、および任意の変異体、対立遺伝子、同族体、突然変異体、誘導体、フラグメントおよび相補的配列を標的とする。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１２乃至４９で言及される。
別の実施形態では、本発明は、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を調節する方法を提供し、該方法は、前記生物系を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１乃至１２７９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１乃至１４７８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至１４３７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１乃至２３２２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１乃至２０３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１乃至２３６４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の１乃至３１３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１乃至９０６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の１乃至９９２：のヌクレオチド内で５乃至３０の連続するヌクレオチドを含むＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンス転写物を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、それによって、前記生物系においてＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を調節する。
別の実施形態では、本発明は、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を調節する方法を提供し、該方法は、前記生物系を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１乃至１２７９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１乃至１４７８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至１４３７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１乃至２３２２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１乃至２０３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１乃至２３６４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の１乃至３１３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１乃至９０６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の１乃至９９２：のヌクレオチド内で５乃至３０の連続するヌクレオチドを含むＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンス転写物の領域を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、それによって、前記生物系においてＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を調節する。
１つの実施形態では、本発明は、生物系においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １および２を有するＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を増加させる方法を含み、該方法は、前記生物系を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１乃至１２７９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１乃至１４７８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至１４３７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１乃至２３２２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１乃至２０３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１乃至２３６４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の１乃至３１３６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１乃至９０６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の１乃至９９２：のヌクレオチド内で５乃至３０の連続するヌクレオチドを含む前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンス転写物を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、それによって、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドまたはその発現産物の機能及び／又は発現を増加させる。
別の実施形態では、本発明は、生物系においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を有するＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を増加させる方法を含み、該方法は、前記生物系を、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンス転写物を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、それによって、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドまたはその発現産物の機能及び／又は発現を増加させ、ここで、天然アンチセンス転写物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１から選択される。
別の実施形態では、本発明は、生物系においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を有するＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能及び／又は発現を増加させる方法を含み、該方法は、前記生物系を、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンス転写物を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、それによって、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドまたはその発現産物の機能及び／又は発現を増加させ、ここで、天然アンチセンス転写物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１から選択され、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９の少なくとも１つから選択される。
１つの実施形態では、組成物は、センス及び／又はアンチセンスのＢＤＮＦポリヌクレオチドに結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾または置換されたヌクレオチドを含む。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾された結合を含む。
別の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、フルオロ−または炭素、メチレンまたは他のロックド核酸（ＬＮＡ）の分子を含む、修飾塩基を含む。好ましくは、修飾されたヌクレオチドは、α−Ｌ−ＬＮＡを含む、ロックド核酸分子である。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、患者に、皮下に、筋肉内に、静脈内に又は腹腔内に投与される。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、医薬組成物中に投与される。処置レジメンは、アンチセンス化合物を少なくとも１回患者に投与することを含むが、この処置は、一定期間にわたる複数回投与を含めるように変更され得る。処置は、１つ以上の他のタイプの治療と組み合わせられ得る。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リポソーム中にカプセル化されるか、または担体分子（例えばコレステロール、ＴＡＴペプチド）に付けられる。
１つの実施形態では、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの発現を調節するために、天然アンチセンス転写物（ＮＡＴ）を標的とするオリゴヌクレオチドとしてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０乃至５５の使用を含み、ここで前記ＮＡＴは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１から成る群から選択される。別の実施形態では、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの発現を調節するために、天然アンチセンス転写物（ＮＡＴ）を標的とするオリゴヌクレオチドとしてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０乃至５５の使用を含み、ここで前記ＮＡＴは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、７、８、９、１０および１１から成る群から選択される。
他の態様は、以下に記載される。
図１ａは、センスｍＲＮＡおよびタンパク質のアンチセンス媒介性の調節を示す。図１ａは、ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物の重複しない領域に対する標的とされる、３つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによる幾つかのヒトおよびマウスの細胞株のトランスフェクション後に、ＢＤＮＦ転写物のノックダウンおよびアップレギュレーションが生じたことを示す。 図１ｂは、センスｍＲＮＡおよびタンパク質のアンチセンス媒介性の調節を示す。図１ｂは、ＢＤＮＦおよびＢＤＮＦ−ＡＳの転写物両方の内因性の発現におけるＢＤＮＦ−ＡＳ−標的ｓｉＲＮＡの投与後の、時間的経過の研究データを示す。データは、時間の経過にわたって、ＢＤＮＦ−ＡＳがダウンレギュレートされ、その後、ＢＤＮＦ発現がアップレギュレートされ、可逆的であることを示す。 図１ｃは、センスｍＲＮＡおよびタンパク質のアンチセンス媒介性の調節を示す。図１ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定されたＢＤＮＦタンパク質が、組み換えた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡまたは対照非標的ｓｉＲＮＡによってではなく、ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物を標的とする２つのｓｉＲＮＡによって著しく増加されたことを示す。 図１ｄは、センスｍＲＮＡおよびタンパク質のアンチセンス媒介性の調節を示す。図１ｄは、ＥＬＩＳＡ及び／又はウエスタンブロットを使用する、様々なｓｉＲＮＡの投与後のＢＤＮＦのタンパク質レベルを示す。 図１ｅは、センスｍＲＮＡおよびタンパク質のアンチセンス媒介性の調節を示す。図１ｅは、オリゴヌクレオチドの増加する濃度（１０−１２から１０−６Ｍ）に対する擬対照（ｍｏｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較したＢＤＮＦの倍率変化のパーセンテージを示す。 図２は、Ｂｄｎｆアップレギュレーションが、神経細胞の過成長を増加させることを示す。 図３は、Ｂｄｎｆ−ＡＳが、インビボでＢｄｎｆ ｍＲＮＡおよびタンパク質を調節することを示す。 図４は、Ｂｄｎｆ−ＡＳの遮断が、インビボで、神経細胞の生存および増殖の増加を引き起こすことを示す。 図５は、ＢＤＮＦ−ＡＳノックダウンが、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡアップレギュレーションにつながることを示す。 図６は、Ｂｄｎｆ発現の転写後調節を示す。 図７は、ｈＢＤＮＦＡｎｔａｇｏＮＡＴによるヒトＢＤＮＦ−ＡＳ転写物の阻害を示す。 図８は、ＡｎｔａｇｏＮＡＴによる、Ｎ２ａ細胞におけるマウスＢｄｎｆ−ＡＳ転写物の阻害を示す。 図９は、ＢＤＮＦ−ＡＳノックダウンが、両方向のＴｒｋＢおよびＢＤＮＦの隣接する遺伝子（Ｌｅｔ７ＣおよびＫＩＦ１８Ａ）のレベルをいずれも変化させないことを示し：ＬＩＮ７ＣおよびＫＩＦ１８Ａは、それぞれ、ＢＤＮＦの３’下流および５’上流に位置する遺伝子である。
配列表の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、転写変異体３、ｍＲＮＡ。（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿１７０７３５）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：マウス脳由来神経栄養因子（Ｂｄｎｆ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００７５４０）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（転写変異体ＢＴ１Ａ；ＮＲ＿０３３３１３．１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（転写変異体ＢＴ２Ａ；ＮＲ＿０３３３１４．１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（転写変異体ＢＴ１Ｂ；ＮＲ＿０３３３１５．１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（転写変異体ＢＴ２Ｂ；ＮＲ＿００２８３２．２）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（転写変異体ＢＴ１Ｃ；ＮＲ＿０３３３１２．１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（ＢＤＮＦ−ＡＳ変異体）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：天然ＢＤＮＦアンチセンス配列；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：マウス天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（マウスＢＤＮＦ−ＡＳ変異体１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：マウス天然ＢＤＮＦアンチセンス配列（マウスＢＤＮＦ−ＡＳ変異体２）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至５５：アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６乃至５９：それぞれ、アンチセンスオリゴヌクレオチド１２乃至１５の逆相補；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０乃至６４：それぞれ、アンチセンスオリゴヌクレオチド４２乃至４６の逆相補；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５および６６：アッセイ配列．ＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレンロックド核酸）：＋Ａ＊または＋Ｔ＊または＋Ｃ＊または＋Ｇ＊；２’ＯＭ（２’−Ｏ−メチル）：ｍＵ＊またはｍＡ＊またはｍＣ＊またはｍＧ＊；ＰＳ（ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ））：Ｔ＊またはＡ＊またはＧ＊またはｃ＊；ＲＮＡ：ｒＵまたはｒＡまたはｒＧまたはｒＣ。
本発明の幾つかの態様は、例証のための例の適用に関連して以下に記載される。多数の具体的な詳細、関連性、および方法が、本発明の十分な理解を提供するために言及されることが理解されるべきである。しかしながら、関連する技術分野における当業者は、１つ以上の具体的な詳細なしで、または他の方法とともに本発明が実施され得ることを容易に認識するであろう。本発明は、作用または事象の順序によって限定的されず、なぜなら、異なる順序で生じ得る及び／又は他の作用または事象と同時に生じ得る作用もあり得るからである。さらに、本発明に従って方法論を実施するために、すべての例証される作用または事象が必要とされるとは限らない。
本明細書に開示される、すべての遺伝子、遺伝子名および遺伝子産物は、任意の種からの同族体に対応するように意図され、そのために本明細書に開示される組成物および方法が適用可能である。したがって、それらの用語は、限定されないが、ヒトおよびマウスからの遺伝子および遺伝子産物を含む。特定の種からの遺伝子または遺伝子産物が開示されるときに、本開示が、例示目的のみに意図され、それが現われる文脈が明確に示さない限り、限定するものとして解釈されないことが理解される。したがって、例えば、幾つかの実施形態において哺乳動物の核酸およびアミノ酸の配列に関連する、本明細書に開示される遺伝子のために、限定されないが、他の哺乳動物、魚、両生動物、爬虫類動物、および鳥類を含む、他の動物からの、相同遺伝子及び／又はオルソロガス遺伝子、および遺伝子産物を包含するように意図される。１つの実施形態では、遺伝子または核酸配列は、ヒトである。
＜定義＞
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものあり、本発明を限定するようには意図されない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「とともに（ｗｉｔｈ）」、またはその変形が、詳細な記載及び／又は請求項のいずれかで使用される程度まで、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に類似した方法で含まれるように意図される。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者に決定されるような特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味し、それは、部分的に、その値がどのように測定されるか又は決定されるかに、すなわち、測定システムの限度に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の実施当たり、１以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、およびより好ましくはさらに１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系またはそのプロセスに関して、該用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が当該出願および請求項に記載される場合、他に明記のない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する用語「約」が仮定されるべきである。
本明細書で使用されるように、用語「ｍＲＮＡ」は、標的遺伝子の現在知られているｍＲＮＡ転写物、および解明され得る任意のさらなる転写物を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」は、別のＲＮＡまたはＤＮＡ（標的ＲＮＡ、ＤＮＡ）と結合するＲＮＡまたはＤＮＡの分子を意味する。例えば、それがＲＮＡオリゴヌクレオチドであると、それはＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって別のＲＮＡ標的に結合し、標的ＲＮＡの活性を変化させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドの発現及び／又は機能をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。定義として、治療上、診断上、または他の見解から有用な、任意の異種のＲＮＡまたはＤＮＡの分子を含むことが意図される。そのような分子は、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、デコイＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、治療上編集する（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）ＲＮＡ、およびアゴニストおよびアンタゴニストＲＮＡ、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｐｌｉｃｅｒｓ）、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を含む。そのため、これらの化合物は、一本鎖か、二本鎖、部分的に一本鎖、または円形のオリゴマー化合物の形態で導入され得る。
本発明に関連して、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの模倣物を指す。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらの置換された及びアルファ−アノマーの形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、メチルホスホナートなどを含む、天然の及び／又は修飾されたモノマーまたは連鎖の線形または円形のオリゴマーを含む。オリゴヌクレオチドは、ワトソンクリック型の塩基対合、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対合などの、標準パターンのモノマー間の相互作用によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。
オリゴヌクレオチドは、「キメラ型（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」であり得る、すなわち、異なる領域から構成され得る。本発明に関連して、「キメラ型」化合物は、２つ以上の化学的領域、例えば、ＤＮＡ領域、ＲＮＡ領域、ＰＮＡ領域などを含む、オリゴヌクレオチドである。各化学的領域は、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから作られる。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも１つの領域を含み、ここでオリゴヌクレオチドは、１つ以上の所望の特性を示すために修飾される。オリゴヌクレオチドの所望の特性は、限定されないが、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞取込、及び／又は標的核酸に対する増加した結合親和性を含む。それ故、オリゴヌクレオチドの異なる領域は、異なる特性を有し得る。本発明のキメラ型オリゴヌクレオチドは、上に記載されるような、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）及び／又はオリゴヌクレオチドのアナログの混合した構造として形成され得る。
オリゴヌクレオチドは、「レジスター（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）」において、すなわち、モノマーが天然ＤＮＡでのように連続的に連結されるか、またはスペーサーによって連結されるときに、連結され得る領域から構成され得る。スペーサーは、領域間の共有結合の「架橋（ｂｒｉｄｇｅ）」を構成し、好ましい場合には、約１００の炭素原子を超過しない長さを有するように意図される。スペーサーは、例えば、正または負の電荷を有する、異なる官能性を保持し、脂肪親和性である、特有の核酸結合性を保持し得（介入物、グルーブバインダー（ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒｓ）、毒素、蛍光体など）、例えば、アルファ−ヘリックスを誘発するアラニン含有ペプチドのような特有の二次構造を引き起こす。
本明細書で使用されるように、「ＢＤＮＦ」および「脳由来神経栄養因子」は、すべてのファミリーメンバー、突然変異体、対立遺伝子、フラグメント、種、コード化および非コード化の配列、センスまたアンチセンスのポリヌクレオチド鎖などを含む。
本明細書で使用されるように、用語「脳由来神経栄養因子」およびＢＤＮＦは、文献において同じであると考えられ、本出願で交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、用語「〜に特異的なオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ）」または「〜を標的とするオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｗｈｉｃｈ ｔａｒｇｅｔｓ）」は、（ｉ）標的遺伝子の一部分との安定した複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することができる、または（ｉｉ）標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部分との安定した二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。複合体および二重鎖の安定性は、理論計算及び／又はインビトロアッセイによって決定され得る。ハイブリダイゼーションの複合体および二重鎖の安定性を決定するための典型的なアッセイは、以下の実施例に記載される。
本明細書で使用されるように、用語「標的核酸」は、ＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写された（ｐｒｅｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）ＲＮＡ、およびそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、コード化する配列、非コード化の配列、センスまたはアンチセンスのポリヌクレオチドを包含する。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、核酸の正常機能に干渉する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。干渉されるＤＮＡの機能は、例えば、複製および転写を含む。干渉されるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡの種をもたらすＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関係し得る又はそれによって促進され得る触媒活性などの、すべての生体機能を含む。標的核酸機能に対するそのような妨害の全体的な効果は、コード化された産物またはオリゴヌクレオチドの発現の調節である。
ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」は、それらの「標的」核酸配列に対して配列特異的な相同性を有している二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される。本発明の特定の実施形態では、媒介物質（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）は、５−２５のヌクレオチド「低分子干渉」ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡｓ）である。ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＲＮａｓｅ酵素によるｄｓＲＮＡの処理に由来する。ｓｉＲＮＡ二重鎖の産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と称された多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体へと動員される。その後、任意の特定の理論に縛られることなく、ＲＩＳＣは、標的核酸（適切にｍＲＮＡ）に誘導されると考えられ、ここで、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、触媒的方法で開裂を媒介するために配列特異的な方法で相互に作用する。本発明に従って使用され得る低分子干渉ＲＮＡは、当該技術分野に周知である、および当業者が精通する手順に従って、合成および使用され得る。本発明の方法に使用される低分子干渉ＲＮＡは、約１から約５０の間のヌクレオチド（ｎｔ）を適切に含む。限定しない実施形態の例では、ｓｉＲＮＡは、約５乃至約４０のｎｔ、約５乃至約３０のｎｔ、約１０乃至約３０のｎｔ、約１５乃至約２５のｎｔ、または約２０乃至２５のヌクレオチドを含むことができる。
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、核酸配列を自動的に配列し、同一性または相同性の領域を示す、コンピュータープログラムの使用により促進される。そのようなプログラムは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースの検索によって、またはＰＣＲ産物の配列によって得られた核酸配列を比較するために使用される。様々な種からの核酸配列の比較は、種間の適切な程度の同一性を示す核酸配列の選択を可能にする。配列されていない遺伝子の場合には、標的種および他の種における遺伝子間の同一性の程度の決定を可能にするために、サザンブロットが実施される。様々な程度のストリンジェンシーでサザンブロットを行うことによって、当該技術分野に周知のように、同一性のおよその測定を得ることが可能である。これらの手順によって、制御される被験体における標的核酸配列に対する高度の相補性および他の種おける対応する核酸配列に対するより低度の相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択が可能となる。当業者は、本発明での使用のために遺伝子の適切な領域を選択することにかなりの許容範囲があることを理解するであろう。
「酵素ＲＮＡ」は、酵素活性を有するＲＮＡ分子を意味する（Ｃｅｃｈ， （１９８８） Ｊ． Ａｍｅｒｉｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． ２６０， ３０３０−３０３）。酵素核酸（リボザイム）は、標的ＲＮＡに対する第１結合によって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを開裂するように作用する分子の酵素部分に近接して保持される酵素核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素核酸は、塩基対合を介して標的ＲＮＡを最初に認識して、その後結合し、一旦正確な部位に結合されると、酵素学的に標的ＲＮＡを切断するように作用する。
「デコイＲＮＡ」は、リガンドに対する天然結合領域を模倣するＲＮＡ分子を意味する。それ故、デコイＲＮＡは、特異的なリガンドの結合のために天然結合標的と競合する。例えば、ＨＩＶトランス活性化反応（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現が、「デコイ」として作用することができ、ＨＩＶｔａｔタンパク質を効率的に結合し、それによって、それがＨＩＶ ＲＮＡにおいてコード化されたＴＡＲ配列に結合することを防ぐことが示されてきた。これは、具体的な例であると意図される。当業者は、これが一例にすぎず、当該技術分野で一般に知られている技術を使用して、他の実施形態が容易に生み出され得ることを認識する。
本明細書で使用されるように、用語「モノマー」は、典型的に、少数のモノマー単位（例えば約３−４）からおよそ数百のモノマー単位までのサイズに及ぶオリゴヌクレオチドを形成するための、リン酸ジエステル結合またはそのアナログによって連結されたモノマーを示す。リン酸ジエステル結合のアナログは、以下により詳細に記載されるように、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホナート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｎａｔｅｓ）、ホスホロセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などを含む。
用語「ヌクレオチド」は、非自然発生のヌクレオチドと同様に自然発生のヌクレオチドも包含する。「非自然発生」と以前に考えられた様々なヌクレオチドが、その後自然に発見されたことは当業者に明らかであるはずである。したがって、「ヌクレオチド」は、既知のプリンおよびピリミジンの複素環含有分子だけでなく、その複素環式アナログおよび互変異性体も含む。他のタイプのヌクレオチドの例示的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、プソイドシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび米国特許出願第５，４３２，２７２号に記載される「非自然発生の」ヌクレオチド、を含む分子である。用語「ヌクレオチド」は、あらゆるすべてのこれらの例に加えて、それらのアナログおよび互変異性体を包含するように意図される。特に関心のあるヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシルを含むものであり、これらは、ヒトにおける治療上および診断上の適用に関連する自然発生のヌクレオチドと考えられている。ヌクレオチドは、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ２ｎｄ Ｅｄ． （Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９９２）に記載されるような、天然の２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシルの糖の他に、それらのアナログも含む。
ヌクレオチドに関連する「アナログ」は、修飾塩基部分及び／又は修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０； Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ， （１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２５（２２）， ４４２９− ４４４３， Ｔｏｕｌｍｅ， Ｊ．Ｊ．， （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：１７−１８； Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ｍ．， （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４８９：１１７−１３９； Ｆｒｅｉｅｒ Ｓ． Ｍ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２５：４４２９−４４４３， Ｕｈｌｍａｎ， Ｅ．， （２０００） Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ３： ２０３−２１３， Ｈｅｒｄｅｗｉｎ Ｐ．， （２０００） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １０：２９７−３１０を参照）；２’−Ｏ，３’−Ｃ−連結の［３．２．０］ビシクロアラビノヌクレオシド（ｂｉｃｙｃｌｏａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）を含む。
そのようなアナログは、結合性、例えば、二重または三重の安定性、特異性などを増強するように設計された合成ヌクレオチドを含む。
本明細書で使用されるように、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の実質的に相補鎖の対合を意味する。対合の１つの機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（ヌクレオチド）間の、ワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの水素結合であり得る、水素結合を含む。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対になる相補的なヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、様々な環境下に生じ得る。
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物を結合が、標的核酸の正常機能に干渉するときに、「特異的にハイブリダイズ可能」であり、これによって機能及び／又は活性の調節が引き起こされ、また、特異的結合が所望される条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下、およびアッセイがインビトロアッセイの場合に行われる条件下で、非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するための十分な程度の相補性が存在する。
本明細書で使用されるように、句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」または「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」は、本発明の化合物が、最小数の他の配列にではなく、その標的配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境下で異なり、本発明に関連して、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成、およびそれらが調査されているアッセイによって決定される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｎａ＋またはＫ＋（すなわち、低いイオン強度）などの無機カチオンを有する塩の低濃度（＜０．１５Ｍ）、オリゴマー化合物：標的配列複合体のＴｍより下の２０℃−２５℃より高い温度、およびホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または洗浄剤の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの、変性剤の存在を含む。例えば、ハイブリダイゼーション率は、各１％のホルムアミドに対して１．１％減少する。高度なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の一例は、３０分間６０℃での０．１Ｘ塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝剤（ＳＳＣ）／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳである。
「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）は、本明細書で使用されるように、１つまたは２つのオリゴマー鎖上の２つのヌクレオチド間の正確な対合のための能力を指す。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置での核酸塩基が、標的核酸の特定の位置で核酸塩基との水素結合が可能である場合（前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子である）、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的な位置であると考えられる。オリゴマー化合物、およびさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子は、各分子中の十分な数の相補的な位置が、互いに水素結合するヌクレオチドで占められるときに、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、安定した及び特異的な結合が、オリゴマー化合物と標的核酸との間で生じるような、十分な数のヌクレオチドに対する十分な程度の正確な対合または相補性を示すために使用される用語である。
オリゴマー化合物の配列が、特異的にハイブリダイズ可能となるその標的核酸の配列に対して１００％相補性である必要がないことは当該技術分野において理解される。その上、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のセグメント上でハイブリダイズし得、その結果、介在または隣接するセグメントは、ハイブリダイゼーションの事象（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピンの構造）に関係しない。本発明のオリゴマー化合物は、標的とされる標的核酸配列内の標的部位に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９９％の配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の２０のヌクレオチドのうち１８が標的部位に対して相補的であり、それ故、特異的にハイブリダイズする、アンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を示すであろう。本例では、残りの非相補的なヌクレオチドは、相補的なヌクレオチドで密集され得る又はそれらをちりばめられ得、互いにまたは相補的なヌクレオチドに対して隣接している必要はない。そのため、標的核酸との完全な相補性を備える２つの領域によって挟まれた４つの非相補的なヌクレオチドを有する、長さが１８ヌクレオチドであるアンチセンス化合物は、標的核酸との７７．８％の完全な相補性を有し、それ故、本発明の範囲内にあるであろう。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物のパーセント相補性は、当該技術分野で既知の、ＢＬＡＳＴプログラム（塩基局所配列検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを慣例的に使用して決定され得る。パーセントの相同性、配列同一性または相補性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， （１９８１） ２， ４８２−４８９）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用して、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）によって決定され得る。
本明細書で使用されるように、用語「熱融解（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ）」（Ｔｍ）は、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、定義された、イオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での温度を指す。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０乃至８．３で少なくとも約０．０１乃至１．０ＭのＮａイオン濃度（あるいは他の塩）であり、温度が、短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０乃至５０のヌクレオチドに対して少なくとも３０℃である、条件となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を加えることによって達成され得る。
本明細書で使用されるように、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、遺伝子の発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。
用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、ポリヌクレオチド配列に関連して使用されるときに、野生型遺伝子に関係するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ）」、「スプライス（ｓｐｌｉｃｅ）」、「種（ｓｐｅｃｉｅｓ）」、または「多型」の変異体を含み得る。スプライス変異体は、参照分子に対してかなりの同一性を有し得るが、一般に、ｍＲＮＡの処理中のエキソンの交互のスプライシングによって、より多くの又はより少ない数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、さらなる機能ドメインを有し得るか又は有さない。種変異体は、ある種から別の種までの様々なポリヌクレオチド配列である。本発明において特に有用なのは、野生型の遺伝子産物の変異体である。変異体は、核酸配列における少なくとも１つの変異から結果的に生じ得、且つ変更されたｍＲＮＡまたはポリペプチドをもたらし得、その構造または機能は、変更されるかもしれないし、されないかもしれない。任意の与えられた天然または組換えの遺伝子は、対立形質を有さないか、１つ、または多く対立形質を有し得る。変異体を生じさせる一般的な突然変異変化は、ヌクレオチドの自然な欠失、追加または置換に一般に起因する。これらのタイプの変化の各々は、与えられた配列において１回以上、単独で又は他の変化と組み合わさって生じ得る。
結果として生じるポリペプチドは、一般に、互いに対してかなりのアミノ酸同一性を有する。多型変異体は、与えられた種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変種である。多型変異体はまた、ポリヌクレオチド配列が１つの塩基によって変化する、「一塩基多型」（ＳＮＰ）または一塩基変異を包含し得る。ＳＮＰの存在は、例えば、疾患状態、すなわち、抵抗性に対する感受性の傾向のある、特定の個体群を暗示し得る。
誘導体ポリヌクレオチドは、アルキル、アシル、またはアミノの基によって化学修飾、例えば、水素の置換を受ける核酸を含む。誘導体、例えば、誘導体オリゴヌクレオチドは、変更された糖部分または糖間結合などの、非自然発生の部分を含み得る。これらの中で典型的なのは、当該技術分野で既知のホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種である。誘導体核酸はまた、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体剤、基質、補助因子、阻害剤、磁気微粒子などを含む、標識を含み得る。
「誘導体」ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸化、硫酸化、還元／アルキル化、アシル化、化学結合、または軽度のホルマリン処置によって修飾される、ポリペプチドまたはペプチドである。誘導体はまた、放射性同位体、蛍光、および酵素の標識を含む、検出可能な標識を、直接的または間接的にのいずれかで含むように修飾され得る。
本明細書で使用されるように、用語「動物」または「患者」は、例えば、ヒト、ヒツジ、オオシカ、シカ、ミュールジカ、ミンク、哺乳動物、猿、馬、牛、ブタ、ヤギ、イヌ、猫、ラット、マウス、鳥、ニワトリ、爬虫類、魚、昆虫およびクモ類を含むように意図される。
「哺乳動物」は、典型的に治療中の温血哺乳動物（例えば、ヒトおよび飼育動物）を包含する。例は、単にヒトの他に、ネコ科、イヌ科、ウマ科、ウシ科およびヒト科を含む。
「処置すること（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、哺乳動物中の疾病状態の処置を包含し、（ａ）特に、そのような哺乳動物が、疾病状態にかかりやすいが、それを患っているとまだ診断されていないときに、疾病状態が哺乳動物において生じるのを防ぐこと；（ｂ）疾病状態を阻害すること、例えば、それが発達するのを抑えること；及び／又は（ｃ）疾病状態を軽減する、例えば、所望のエンドポイントが達成されるまで、疾病状態の退行を引き起こすことを含む。処置はまた、疾患の症状の改善（例えば、疼痛または不快感を減少する）を含み、ここでそのような改善は、その疾患に直接影響を与えているかもしれないし、影響を与えていないかもしれない（例えば、原因、伝達、発現など）。
本明細書で使用されるように、「癌」は、限定されないが、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、哺乳動物において見られる、すべてのタイプの癌または腫瘍または悪性腫瘍を指す。癌は、癌の悪性細胞を含む「腫瘍」または組織として現われる。腫瘍の例は、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽細胞腫などの、肉腫および癌腫を含む。本発明による開示された組成物によって処置され得るさらなる癌は、限定されないが、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血、小細胞型肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵性インスリノーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、膀胱癌、胃癌、前悪性の皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頚癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌を含む。
本明細書で使用されるように、「神経系の疾患または障害（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、神経系及び／又は視覚系の任意の疾患または障害を指す。「神経系の疾患または障害」は、中枢神経系（脳、脳幹および小脳）、末梢神経系（脳神経を含む）、および自律神経系（その一部は中枢神経系および末梢神経系の両方に位置する）に関係する疾患または障害を含む。神経系の疾患または障害は、限定されないが、後天性てんかん型失語症；急性散在性脳脊髄膜炎；副腎脳白質ジストロフィー；加齢黄斑変性；脳梁欠損症；認知不能症；アイカルディ症候群；アレキサンダー病；アルパース病；交代性片麻痺；アルツハイマー病；血管性認知症；筋萎縮性側索硬化症；無脳症；アンゲルマン症候群；血管腫症；酸素欠乏症；失語症；失行症；クモ膜嚢胞；クモ膜炎；アーノルド・キアリ奇形；動静脈奇形；アスペルガー症候群；血管拡張性失調症（ａｔａｘｉａ ｔｅｌｅｇｉｅｃｔａｓｉａ）；注意欠陥多動性障害；自閉症；自律神経機能異常；背痛；バッテン病、ベーチェット病；ベル麻痺；良性特発性眼瞼痙攣；良性病巣（ｂｅｎｉｇｎ ｆｏｃａｌ）；筋萎縮症；良性脳圧亢進症；ビンスヴァンガー病；眼瞼痙攣；ブロッホ−サルズバーガー症候群；腕神経叢損傷；脳膿瘍；脳損傷；脳腫瘍（多形膠芽腫を含む）；脊髄腫瘍；ブラウン−セカール症候群；カナバン病；手根管症候群；灼熱痛；中枢痛症候群；橋中心髄鞘崩壊症；頭障害；脳動脈瘤；脳動脈硬化症；脳萎縮症；脳性巨人症；脳性麻痺；シャルコー−マリー−ツース病；化学療法誘発性の神経障害および神経障害性疼痛；キアリ奇形；コレア（ｃｈｏｒｅａ）；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；慢性疼痛；慢性局所疼痛症候群；コフィン−ローリー症候群；遷延性植物状態を含む、昏睡状態；先天性両側顔面神経麻痺；大脳皮質基底核変性症；頭部動脈炎；頭蓋骨癒合症；クロイツフェルト−ヤコブ病；蓄積外傷疾患；クッシング症候群；巨大細胞性封入体症；サイトメガロウイルス感染；ダンシングアイズ−ダンス足症候群（ｄａｎｃｉｎｇ ｅｙｅｓ−ｄａｎｃｉｎｇ ｆｅｅｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ダンディー−ウォーカー症候群；ドーソン病；ド・モルシア症候群；デジェリン−クルムプケ症候群（Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｋｌｕｍｋｅ ｐａｌｓｙ）；認知症；皮膚筋炎；糖尿病性神経障害；広汎性硬化症；自律神経異常症；書字障害；失読症；ジストニー；早期乳児てんかん性脳症；エンプティセラ症候群；脳炎；脳瘤；大脳三叉神経性血管腫症；癲癇；エルブ麻酔；本態性振戦；ファブリー病；ファール症候群；失神；家族性痙性麻痺；熱性発作；フィッシャー症候群；フリードライヒ失調症；前頭側頭型認知症および他の「タウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ）」；ゴーシェ病；ゲルストマン症候群；巨細胞性動脈炎；巨大細胞封入病；グロボイド細胞性ロイコジストロフィー；ギラン−バレー症候群；ヒトＴ細胞性脊髄麻痺；ハレルフォルデン−スパッツ病；頭部外傷；頭痛；片側顔面痙攣；遺伝性痙性対麻痺；遺伝性多発神経炎性失調；耳帯状疱疹；帯状疱疹；ヒラヤマ症候群；ＨＩＶ関連性の認知症および神経障害（エイズの神経症状も）；全前脳胞症；ハンチントン病および他のポリグルタミンリピート病；水頭性無脳症；水頭症；コルチゾン過剰症；低酸素症；免疫介在性脳脊髄炎；封入体筋炎；色素失調症；乳児型フィタン酸蓄積症；乳児レフスム病；点頭てんかん；炎症性ミオパチー；頭蓋内嚢胞；頭蓋内圧亢進症；ジュベール症候群；カーンズ−セイヤー症候群（Ｋｅａｍｓ−Ｓａｙｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ケネディ病；キンズボーン症候群；クリペル−フェーユ症候群；クラッベ病；クーゲルバーグ−ヴェランダー病；クールー病；ラフォラ病；ランバート−イートン筋無力症候群；ランドウ−クレフナー症候群；外側髄（バレンベリー）症候群；学習障害；リー病；レノックス−ガストー症候群（Ｌｅｎｎｏｘ−Ｇｕｓｔａｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；レッシュ−ナイハン症候群；白質ジストロフィー；レビー小体型認知症；脳回欠損；閉込め症候群；ルー・ゲーリッグ病（すなわち、運動ニューロン疾患または筋萎縮性側索硬化症）；腰部椎間板疾患；ライム病−−神経学的後遺症；マカド−ジョセフ病；大脳髄症；巨大脳髄症；メルカーソン−ローゼンタール症候群；メニエール病；髄膜炎；メンケス病；異染性ロイコジストロフィー；小頭症；偏頭痛；ミラー・フィッシャー症候群；小発作；ミトコンドリアミオパチー；メービウス症候群；若年性一側上肢筋萎縮症（ｍｏｎｏｍｅｌｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）；運動ニューロン疾患；モヤモヤ病；ムコ多糖症；多発脳梗塞性認知症；多巣性運動ニューロパチー；多発性硬化症および他の脱髄疾患；体位性低血圧を有する多系統萎縮症；筋ジストロフィー；重症筋無力症；全身性びまん性硬化症（ｍｙｅｌｉｎｏｃｌａｓｔｉｃ ｄｉｆｆｕｓｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）；乳児期ミオクロニー脳症；ミオクローヌス；ミオパチー；先天性筋緊張症；ナルコレプシー；神経線維腫症；神経遮断薬悪性症候群；エイズの神経症状；狼瘡の神経学的後遺症；神経ミオトニー；ニューロンセロイド脂褐素症；神経細胞遊走障害；ニーマン‐ピック病；オサリバン−マクレオド症候群；後頭神経痛；潜在性脊椎癒合不全の続発；大田原症候群；オリーブ橋小脳萎縮症；眼球クローヌスミオクローヌス；視神経炎；起立性低血圧症；濫用症候群；感覚異常；神経変性の疾患または障害（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、認知症、多発性硬化症、および神経細胞死に関係する他の疾患および障害）；先天性パラミオトニー（ｐａｒａｍｙｏｔｏｎｉａ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）；腫瘍随伴性疾患；発作（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ ａｔｔａｃｋｓ）；パリー−ロンベルグ症候群；ペリツェウス−メルツバッハー病；周期性麻痺；末梢性ニューロパシー；有痛性ニューロパシーおよび神経障害性疼痛；遷延性植物状態；広汎性発達障害；光くしゃみ反射；フィタン酸蓄積症；ピック病；はさまれた神経；下垂体腫瘍；多発性筋炎；孔脳症；ポリオ後症候群；帯状疱疹後神経痛；後感染性脳脊髄炎；体位性低血圧症；プラダー−ウィリー症候群；原発性側索硬化症；プリオン病；進行性顔面片側萎縮症；進行性多巣性白質脳症；進行性硬化性灰白質ジストロフィー；進行性核上性麻痺；偽脳腫瘍；ラムゼー−ハント症状群（Ｉ型およびＩＩ型）；ラスムッセン脳炎；反射性交感神経性ジストロフィー症候群；レフサム病、反復運動障害；反復運動過多損傷；不隠下肢症候群；レトロウイルス関連性の脊髄症；レット症候群；ライエ症候群；舞踏病（Ｓａｉｎｔ Ｖｉｔｕｓ ｄａｎｃｅ）；サンドホフ病；シルダー病；裂脳症；中隔視神経異形成症；揺さぶられっ子症候群；帯状疱疹；シャイ−ドレーガー症候群；シェーグレン症候群；睡眠時無呼吸；ソトス症候群；痙縮；二分脊椎症；脊髄損傷；脊髄腫瘍；脊髄性筋萎縮症；全身硬直症候群；脳卒中；スタージー−ウェーバー症候群；亜急性硬化性全脳炎；皮質下動脈硬化性脳症；シデナム舞踏病；失神；脊髄空洞症；遅発性ジスキネジー；テイ−ザックス病；側頭動脈炎；脊髄係留症候群；トムソン病、胸郭出口症候群；三叉神経痛；トッド麻痺；トゥーレット症候群；一過性脳乏血発作；伝達性海綿状脳症；横断性脊髄炎；外傷性脳損傷；振戦；三叉神経痛；熱帯性痙性脊髄麻痺；結節硬化症；血管性認知症（多発脳梗塞性認知症）；側頭動脈炎を含む血管炎；フォンヒッペル−リンダウ病；ワレンベルク症状群；ウェルトニッヒ−ホフマン病；ウェスト症候群；むち打ち；ウィリアムズ症候群；ウィルソン病（Ｗｉｌｄｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）；およびツェルウェガー症候群、を含む。
「増殖性の疾患または障害（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、限定されないが、脊髄、リンパまたは赤血球の系列、またはその前駆細胞から生じる造血由来の増生細胞／新生細胞に関係する造血新生障害を含む。これらは、限定されないが、赤芽球性白血病、急性前脊髄白血病（ＡＰＭＬ）、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、限定されないが、Ｂ系列のＡＬＬおよびＴ系列のＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含む、リンパ性腫瘍を含む。悪性リンパ腫のさらなる形態は、限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変異体、末梢Ｔ細胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード−ステルンベルグ病を含む。
「炎症」は、全身炎症性の疾病、および単球、白血球及び／又は好中球）の遊走および誘引に局所的に関係する疾病を指す。炎症の例は、限定されないが、病原性生物（グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス、真菌類、および原虫および蠕虫などの寄生生物を含む）による感染、移植拒絶反応（腎臓、肝臓、心臓、肺または角膜などの実質器官の拒絶反応の他に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む、骨髄移植拒絶反応を含む）、または局所的な慣性または急性の自己免疫性またはアレルギー性の反応、から結果として生じる炎症を含む。自己免疫性疾患は、急性糸球体腎炎；リューマチまたは反応性関節炎；慢性糸球体腎炎；クローン病、潰瘍性大腸炎および壊死性全腸炎などの、炎症性腸疾患；肝炎；敗血症；アルコール性肝疾患；非アルコール性脂肪症；顆粒球輸血関連の症候群；接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬などの、炎症性の皮膚病；全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、および糖尿病の幾つかの形態、または被験体自身の免疫系による発作が病理組織の破壊を結果的にもたらす、任意の他の自己免疫性の状態、を含む。アレルギー性反応は、アレルギー性喘息、慢性気管支炎、急性および遅延型過敏症を含む。全身性炎症性疾患の状態は、精神的外傷、熱傷、虚血性事象（例えば、心筋梗塞と脳卒中を含む、心臓、脳、腸または末梢血管中の血栓性事象）後の再潅流、敗血症、ＡＲＤＳまたは多臓器機能障害症候群に関係する炎症を含む。炎症細胞の動員は、アテローム斑にも生じる。炎症は、限定されないが、非ホジキンリンパ腫、ヴェーゲナー肉芽腫症、橋本甲状腺炎、肝細胞癌、胸腺萎縮症、慢性膵炎、関節リウマチ、反応性リンパ組織増殖症、変形性関節症、潰瘍性大腸炎、乳頭状癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、肝硬変、慢性唾液腺炎、腹膜炎、急性膵炎、慢性膵炎、慢性胃炎、腺筋症、子宮内膜症、急性子宮頚管炎、慢性子宮頸管炎、リンパ組織増殖症、多発性硬化症、特発性血小板減少性紫斑病続発性の肥大症、原発性ＩｇＡ腎症、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、肺気腫、慢性腎盂腎炎、および慢性膀胱炎、を含む。
＜ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの組成物および分子＞
標的：１つの実施形態では、標的は、限定することなく、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）により関係する、センス及び／又はアンチセンスの非コード化の及び／又はコード化する配列を含む、ＢＤＮＦの核酸配列を含む。共に「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ （ＢＤＮＦ） Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｔｏ ＢＤＮＦ」という発明の名称である、およびそれら全体が引用によって本明細書に組み込まれた、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０９３９０４および米国特許出願公開番号２０１１／０３１９４７５は、それらの中で詳述されるようなオリゴヌクレオチドを使用する調節のための標的としてＢＤＮＦを開示している。
ニューロトロフィンは、神経の生存および分化を促進する構造的に関連する成長因子の種類である。それらは、神経突起伸長を刺激し、これは、それらが、損傷した神経細胞の再生を促進することができる且つニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉ）を生成する標的組織での側枝発芽（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）を刺激するために標的由来の神経栄養因子として作用することができることを示唆している。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、脳抽出物中にあり、後根神経節の生存を増加させることができる、塩基性タンパク質として最初に特徴づけられた。細胞体との軸索伝達（ａｘｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）が損傷によって妨げられるときに、シュワン細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）およびＢＤＮＦなどの、神経栄養因子を生成する。ニューロトロフィンは、シュワン細胞から放出され、再生する軸索のまわりで勾配方法（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ）で拡散性に分散される。その後、それはニューロトロフィンの密度勾配に沿って遠位に伸びる。新生児のラットにおける切断された神経に対するＢＤＮＦの局所適用は、軸索切断後の運動性神経細胞の大量死を防ぐことが示された。ＢＤＮＦのｍＲＮＡ力価は、軸索切断の４日後に標準レベルの数倍に増加し、４週間でその最大値に達する。その上、ＢＤＮＦは、培養中のコリン作動性神経細胞の生存を増強すると報告された。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦのファミリーメンバーに関係する疾患または障害を予防または処置するために使用される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって及び／又はアンチセンス化合物を使用して及び／又は有して得られる幹細胞から再生成された細胞／組織によって処置され得る、典型的な脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）媒介性の疾患および障害は：ＢＤＮＦの異常な機能及び／又は発現に関係する疾患または障害、神経系の疾患または障害、不完全な神経新生に関係する疾患または障害；神経変性の疾患または障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症など）；神経精神障害（鬱病、統合失調症、統合失調症様障害、統合失調感情障害、および妄想性障害；パニック障害、恐怖症（広場恐怖症を含む）、強迫性障害、外傷性ストレス障害、双極性障害、神経性食欲不振、神経性過食症などの不安障害）、中枢神経系の自己免疫疾患（例えば多発性硬化症）、記憶喪失、長期間または短期間の記憶障害、良性健忘症、小児期学習障害、閉鎖性頭部外傷、注意欠陥障害、ウイルス感染に対する神経細胞反応、脳損傷、ナルコレプシー、睡眠障害（例えば、概日リズム障害、不眠症およびナルコレプシー）；神経の切断または神経損傷、脳脊髄神経索（ＣＮＳ）の切断、および脳または神経細胞に対する損傷、エイズに関係する神経異常、運動性チック及び／又は音声チックによって特徴付けられる、運動性障害およびチック障害（例えば、トゥーレット病、慢性運動性または音声チック障害、一過性チック障害、および常同性運動障害）、物質乱用障害（例えば、物質誘発性の精神障害、物質離脱および物質誘発性の認知症または健忘障害などの、物質依存、物質乱用および物質乱用／依存の後遺症）、外傷性脳損傷、耳鳴、神経痛（例えば、三叉神経痛）、疼痛（例えば、慢性疼痛、慣性炎症性疼痛、関節炎に関係する疼痛、線維筋痛、背痛、癌に関連する疼痛、消化器病に関係する疼痛、クローン病に関係する疼痛、自己免疫性疾患に関係する疼痛、内分泌疾患に関係する疼痛、糖尿病性神経障害に関係する疼痛、幻肢痛、自発痛、慣性術後疼痛、慣性側頭下顎骨疼痛、灼熱痛、帯状疱疹後神経痛、エイズ関連の疼痛、複合性局所疼痛症候群Ｉ型およびＩＩ型、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関係する疼痛、薬物摂取に関係する疼痛および再発性急性疼痛、神経障害性疼痛）、糖尿病などの疾患における神経感覚異常（ｎｅｕｒｏｄｙｓｔｈｅｓｉａｓ）を結果としてもたらす不適当な神経活動、ＭＳおよび運動ニューロン疾患、運動失調症、筋固縮（痙直）、顎関節機能不全、報酬欠陥症候群（ＲＤＳ）、アルコールまたは物質の乱用（例えば、エクスタシー、メタンフェタミンなど）によって引き起こされる神経毒症、精神遅滞または認知障害（例えば、無症候性Ｘ連鎖精神遅滞、脆弱Ｘ症候群、ダウン症候群、自閉症）、失語症、ベル麻痺、クロイツフェルト−ヤコブ病、脳炎、加齢黄斑変性、オンディーヌ症候群、ＷＡＧＲ症候群、難聴、レット症候群、癲癇、脊髄損傷、脳卒中、低酸素症、虚血、脳損傷、糖尿病性神経障害、末梢神経障害、神経移植合併症、運動ニューロン疾患、末梢神経損傷、肥満、メタボリック症候群、癌、喘息、アトピー性疾患、炎症、アレルギー症、湿疹、神経腫瘍性の疾患または障害、神経免疫性の疾患または障害、および神経耳科学的な疾患または障害；および加齢および老化に関係する疾患または障害、を含む。
本発明は、内因性のＮＡＴがそのセンス遺伝子の対応物の転写を抑える機構を提供する。本発明は、内因性遺伝子の発現が、ほとんどの転写単位から転写される、ＮＡＴの除去または阻害による遺伝子座特異的な方法で、アップレギュレートされ得ることを定めている。
本発明の１つの実施形態は、タンパク質出力を調節する機能的なｎｃＲＮＡの例を提供し、その現象は、多くの他のゲノム遺伝子座に適用可能である。
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、神経細胞の成長、成熟、分化および維持にとって不可欠な、成長因子の「ニューロトロフィン」ファミリーのメンバーである。ＢＤＮＦはまた、神経可塑性にとって不可欠であり、学習および記憶力のプロセスに関係することが示されている。ＢＤＮＦの遺伝子座は、染色体１１上にあり、両方の鎖からの活性転写を示し、非コード化ＮＡＴの転写につながる。
本発明は、インビトロおよびインビボの両方で、センスＢＤＮＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現以上に、強力な相互および動的な調節を発揮するＢＤＮＦ−ＡＳである、このアンチセンスＲＮＡ分子の調節的な役割を特徴づけている。
本発明の１つの実施形態は、ＡｎｔａｇｏＮＡＴと呼ばれる、アンチセンスＲＮＡ転写阻害分子を使用する、ｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションのための方策を提供する。ＡｎｔａｇｏＮＡＴは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０６８３４０に記載され、その全体が、引用によって本明細書に組み込まれる。
真核生物ゲノム中のｎｃＲＮＡの数は、発達上の複雑性に応じて増加することが示され、例えば、神経系で発現されたｎｃＲＮＡにかなりの数の多様性がある。過去数年にわたって、機能的なＮＡＴに関する報告があり、アルツハイマー病、パーキンソン病、および脆弱Ｘ症候群を含む、ヒト障害へのそれらの起こり得る関与が示されている。その上、ＣＤ９７センス遺伝子のアップレギュレーションが、そのアンチセンスＲＮＡ転写物のノックダウンによって達成され得ることが報告されている。プロゲステロン受容体（ＰＲ）、および他の内因性の転写物のアップレギュレーションは、プロモーター由来の非コード化ＲＮＡを標的とすることによって報告された。ｐ２１遺伝子の転写活性およびＯｃｔ４プロモーターが、ＮＡＴ欠乏によって報告された。アンチセンスＲＮＡ誘発性のクロマチンのリモデリングは、多くの低コピー数のＮＡＴに対して実現可能且つ動的な様式であるように見える。その場合、アンチセンスＲＮＡは、クロマチン構造を維持または修飾する局所効果を優性に発揮し、結果的にセンス遺伝子発現を活性化または抑制するかもしれない。
ＰＣＲ２は、４つのコアサブユニット：Ｅｅｄ、Ｓｕｚ１２、ＲｂＡｐ４８および触媒性のＥｚｈ２、から成るタンパク質複合体であり、ヒストンＨ３−リジンのトリメチル化を触媒する。（Ｈ３Ｋ２７ｍｅｔ３）。最近の研究は、Ｅｚｈ２と多くのｎｃＲＮＡ転写物との間の直接的なＲＮＡ−タンパク質の相互作用の証拠を提供する。Ｘ不活性化およびＨＯＸ遺伝子集団に関する他の研究は、抑圧的な染色質マーク（ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍａｒｋｓ）である、Ｈ３Ｋ２７ｍｅｔ３のＰＲＣ２媒介性の誘発に関係することになる、ＲＮＡ転写物を示している。ＰＲＣ２のトランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）のプロファイリングは、胚性幹細胞中に９，０００以上のＰＲＣ２相互作用のＲＮＡを特定し、それらの多くは、アンチセンスＲＮＡ転写物として分類された。ｐ１５およびＤＭ１の遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングが、そのアンチセンスＲＮＡによる異質染色質形成を含むことが報告された。異質染色質または真性染色質のカテゴリーへの染色質の従来の二分割は、完全ではないかもしれず、なぜなら、最近の研究は、元来信じられたものよりも動的且つ可撓性な５つの主要な染色質タイプがあることを示しているからである。多くの遺伝子座に恐らく適用可能であるため、ＮＡＴは、染色質修飾の遺伝子座に特異的な変化を得るために操作され得る。例として、ＢＤＮＦ遺伝子のアンチセンス転写物の（ｓｉＲＮＡによる）開裂または（ＡｎｔａｇｏＮＡＴによる）阻害が、対応するｍＲＮＡのアップレギュレーションにつながることが示されている。
ニューロトロフィンは、神経細胞の生存、発達、分化および機能を増強する、分泌された成長因子の種類に属し、ＢＤＮＦは、シナプス可塑性の重要な分子媒介物質である。ＢＤＮＦは、神経細胞および神経膠の成熟を同調させ、軸索および樹状の分化に関与し、神経細胞の細胞生存を保護および増強すると示唆される。ニューロトロフィンの発現レベルは、神経変性障害において、および精神障害と神経発達障害において弱くなる。ニューロトロフィンのアップレギュレーションは、幾つかの神経学的障害に有益な効果があると考えられている。ＡｎｔａｇｏＮＡＴは、ＢＤＮＦ−ＡＳを阻害し、結果的に様々な疾病状態の神経細胞の増殖および生存を増強するための治療上の方策として使用され得る。自然な修飾を含む且つすべての既知のスプライス形態を表わすと推定される、内因性のＢＤＮＦ分子の合成をアップレギュレートする、本明細書に記載される手法が、合成のＢＤＮＦ分子を施すこととは異なる、およびもしかしかしたらそれよりも優れていることを証明するであろうことを除外することはできない。
１つの実施形態では、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢＤＮＦの調節は、正常対照と比較して、ＢＤＮＦの異常な表現、機能、活性に関連する、任意の疾患または障害を予防または処置するために、それを必要とする患者に施される。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定することなく、非コード化領域を含む、本明細書に詳述される、ＢＤＮＦの天然アンチセンス転写物に特異的である。ＢＤＮＦ標的は、ＢＤＮＦの変異体；ＳＮＰを含む、ＢＤＮＦの突然変異体；ＢＤＮＦの非コード化配列；対立遺伝子、フラグメントなどを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子である。
本発明の実施形態に従って、標的核酸分子は、ＢＤＮＦポリヌクレオチドだけに限定されず、ＢＤＮＦのアイソフォーム、受容体、同族体、非コード化領域のいずれかなどにも及ぶ。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定することなく、変異体、対立遺伝子、同族体、突然変異体、誘導体、フラグメントおよびそれらの相補的配列を含む、ＢＤＮＦ標的の天然アンチセンス配列（コード化および非コード化の領域に対する天然アンチセンス）を標的とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスのＲＮＡまたはＤＮＡの分子である。
１つの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物はまた、異なる塩基が化合物中のヌクレオチド位置の１つ以上に存在する、変異体を含む。例えば、第１ヌクレオチドがアデニンである場合、この位置で、チミジン、グアノシン、シチジンまたは他の天然または非天然のヌクレオチドを含む変異体が生成され得る。これは、アンチセンス化合物の位置のいずれかで行われ得る。その後、これらの化合物は、標的核酸の発現を阻害するそれらの能力を決定するために、本明細書に記載される方法を使用して試験される。
幾つかの実施形態では、アンチセンスの化合物と標的との間の、相同性、配列同一性または相補性は、約５０％乃至約６０％である。幾つかの実施形態では、相同性、配列同一性または相補性は、約６０％乃至約７０％である。幾つかの実施形態では、相同性、配列同一性または相補性は、約７０％乃至約８０％である。幾つかの実施形態では、相同性、配列同一性または相補性は、約８０％乃至約９０％である。幾つかの実施形態では、相同性、配列同一性または相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％である。
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が、標的核酸の正常機能に干渉し、活性の損失をもたらすときに特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が所望される条件下で非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避することに対して十分な程度の相補性がある。そのような条件は、すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件、およびアッセイがインビトロアッセイの場合に行われる条件を含む。
アンチセンス化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ、置換された化合物であろうと、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの分子に対する化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能に干渉し、有用性の損失をもたらすときに特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が所望される条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の、およびアッセイが行われるインビトロアッセイの場合の生理学的条件下で、非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避することに対して十分な程度の相補性がある。
１つの実施形態では、限定することなく、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを使用して、特定且つ拡大されるアンチセンス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１として明記される配列の１つ以上などを含む、ＢＤＮＦを標的とすることで、ＢＤＮＦの発現または機能が調節される。１つの実施形態では、発現または機能は、対照と比較してアップレギュレートされる。１つの実施形態では、発現または機能は、対照と比較してダウンレギュレートされる。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを使用して、特定且つ拡大されるアンチセンス配列を含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９として明記される核酸配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド、より短い又は長いフラグメント、修飾された結合などを含むことができる。修飾された結合またはヌクレオチド間結合の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを含む。１つ実施形態では、ヌクレオチドは、リン誘導体を含む。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチド中の糖または糖アナログの部分に付けられ得るリン誘導体（または修飾されたリン酸基）は、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオエートなどであり得る。上述されるリン酸塩アナログの調製、およびヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドへのそれらの取り込みも、それら自体が、知られており、本明細書で記載される必要はない。
アンチセンスの特異性および感受性も、治療上の使用に対する当業者によって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾病状態の処置における治療上の部分として利用されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全且つ効果的に施されており、多数の臨床試験が現在進行中である。それ故、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの処置のための処置レジメンに有用であるように構成され得る有用な治療手段であることが確立されている。
本発明の実施形態では、オリゴマーのアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合し、標的遺伝子によってコード化された分子の発現及び／又は機能を調節する。干渉されるＤＮＡの機能は、例えば、複製および転写を含む。干渉されるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位に対するＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡの種をもたらすＲＮＡのスプライシング、およびにＲＮＡに関係し得る又はそれによって促進され得る触媒活性などのすべての生体機能を含む。機能は、所望される機能に依存して、アップレギュレートまたは阻害され得る。
アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を含む。そのため、これらの化合物は、一本鎖か、二本鎖、部分的に一本鎖、または円形のオリゴマー化合物の形態で導入され得る。
特定の核酸分子に対してアンチセンス化合物を標的とすることには、本発明に関連して、多段階プロセスが存在し得る。そのプロセスは、標的核酸の特定で通常始まり、その機能は調節される。この標的核酸は、例えば、細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）であり得、その発現は、特定の障害または疾患の状態、または感染因子からの核酸分子に関係する。本発明では、標的核酸は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコード化する。
標的プロセスは、所望される効果、例えば、発現の調節が結果的にもたらされるように生じるアンチセンスの相互作用に対する、標的核酸内の少なくとも１つの標的の領域、部分、または部位の決定も通常は含む。本発明の文脈内では、用語「領域」は、少なくとも１つの特定可能な構造、機能、または特性を有する標的核酸の一部分として定義される。標的核酸の領域内には、セグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内のより小さい領域またはその領域のサブ部分として定義される。「部位」は、本発明で使用されるように、標的核酸内の位置として定義される。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の天然アンチセンス配列に結合し、ＢＤＮＦの発現及び／又は機能を調節する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）。アンチセンス配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至５５を含む。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの１つ以上のセグメントに結合し、ＢＤＮＦの発現及び／又は機能を調節する。セグメントは、ＢＤＮＦのセンスまたはアンチセンスのポリヌクレオチドの少なくとも５つの連続するヌクレオチドを含む。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦの天然アンチセンス配列に特異的であり、ここで、ＢＤＮＦの天然アンチセンス配列に対するオリゴヌクレオチドの結合は、ＢＤＮＦの発現及び／又は機能を調節する。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９として明記される配列、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを使用して、特定且つ拡大されるアンチセンス配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド、より短い又は長いフラグメント、修飾された結合などを含むことができる。修飾された結合またはヌクレオチド間結合の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを含む。１つの実施形態では、ヌクレオチドは、リン誘導体を含む。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチド中の糖または糖アナログの部分に付けられ得るリン誘導体（または修飾されたリン酸基）は、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオエートなどであり得る。上述されるリン酸塩アナログの調製、およびヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドへのそれらの取り込みも、それら自体が、知られており、本明細書で記載される必要はない。
当該技術分野で知られるように、翻訳開始コドンは、典型的に、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡの分子において；対応するＤＮＡ分子内で５’−ＡＴＧ）であるため、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。遺伝子の少数は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し；５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧは、インビボで機能すると示されている。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、たとえ各例における開始因子のアミノ酸が、典型的に、（真核生物中の）メチオニンまたは（原核生物中の）フォルミルメチオニンであっても、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物および原核生物の遺伝子は、２つ以上の選択的開始コドンを有し得、それらのいずれか１つは、特定の細胞型または組織において、または特定の一連の条件下で、翻訳開始のために優先的に利用され得る。本発明に関連して、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、コドン、またはそのようなコドンの配列にかかわらず、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコード化する遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するために、インビボで使用されるコドンを指す。遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、３つの配列、すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ、および５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ、および５’−ＴＧＡである）の１つを有し得る。
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからのいずれかの方向（すなわち、５’または３’）で、約２５乃至約５０の隣接するヌクレオチドを包含する、そのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンからのいずれかの方向（すなわち、５’または３’）で、約２５乃至約５０の隣接するヌクレオチドを包含する、そのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。結果的に、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「停止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物によって効果的に標的とされ得るすべての領域である。
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すと当該技術分野で知られている、読取枠（ＯＲＦ）または「コード領域」はまた、効果的に標的とされ得る領域である。本発明の文脈内で、標的領域は、遺伝子の読取枠（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止のコドンを包含する遺伝子内領域である。
別の標的領域は、翻訳開始コドンからの５’方向でｍＲＮＡの部分を指すと当該技術分野で知られており、それ故、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、５’の翻訳されていない領域（５’ＵＴＲ）を含む。また別の標的領域は、翻訳終止コドンからの３’方向でｍＲＮＡの部分を指すと当該技術分野では知られており、それ故、ｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端との間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、３’の翻訳されていない領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸塩結合を介してｍＲＮＡの５’−末端（ｍｏｓｔ）残留物に連結された、Ｎ７−メチル化されたグアノシン残留物を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、キャップ部位に隣接している最初の５０のヌクレオチドの外に、５’キャップ構造自体も含むと考えられる。本発明のための別の標的領域は、５’キャップ領域である。
幾つかの真核生物ｍＲＮＡの転写物は、直接的に翻訳されるが、その多くは、翻訳される前に転写物から切除される、「イントロン」として知られる、１つ以上の領域を含んでいる。残りの（それ故、翻訳された）領域は、「エキソン」として知られ、連続的なｍＲＮＡ配列を形成するために一緒にスプライシングされる。１つの実施形態では、スプライス部位、すなわち、イントロン−エキソン接合またはエキソン−イントロン接合を標的とすることは、異常なスプライシングが疾患に関係する場合、または特定のスプライス産物の過剰生産が疾患に関係する場合の状況において特に有用である。再配列または欠失による異常な融合の接合（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）は、標的部位の別の実施形態である。異なる遺伝子源からの２つ（またはそれ以上の）ｍＲＮＡのスプライシングのプロセスによって生成されたｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られている。イントロンは、例えば、ＤＮＡまたはプレｍＲＮＡに標的とされるアンチセンス化合物を使用して、効果的に標的とされ得る。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコード化及び／又は非コード化の領域に結合し、標的分子の発現及び／又は機能を調節する。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然アンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現及び／又は機能を調節する。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現及び／又は機能を調節する。
代替的なＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から生成され得る。これらの代替的な転写物は、「変異体」として一般に知られている。より具体的には、「プレｍＲＮＡ変異体」は、それらの開始位置または停止位置のいずれかで同じゲノムＤＮＡから生成された他の転写物と異なり、イントロンおよびエキソン両方の配列を含んでいる、同じゲノムＤＮＡから生成された転写物である。
スプライシング中の１つ以上のエキソンまたはイントロンの領域、またはその部分の切除後に、プレｍＲＮＡ変異体は、より小さな「ｍＲＮＡ変異体」を生成する。結果的に、ｍＲＮＡ変異体は、処理されたプレｍＲＮＡ変異体であり、各々の特有のプレｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として特有のｍＲＮＡ変異体を常に生成しなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、「選択的スプライス変異体」としても知られている。
プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが生じない場合、プレｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同一である。
変異体は、転写を開始または停止するための代替的なシグナルの使用によって生成され得る。プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは、１つを超える開始コドンまたは停止コドンを持つことができる。選択的開始コドンを使用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから生じる変異体は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的停止コドンを使用するこれらの転写物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られている。選択的停止変異体の１つの特定の種類は、「ポリＡ変異体」であり、この中で、生成される複数の転写物は、転写機構によって「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替的選択から結果として生じ、それによって、特有のポリＡ部位で終了する転写物を生成する。本発明の文脈内で、本明細書に記載される変異体のタイプはまた、標的核酸の実施形態である。
アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、活性アンチセンスの化合物が標的とされる、標的領域の少なくとも１つの５−ヌクレオチド長の部分として定義される。
特定の典型的な標的セグメントの特異的配列が本明細書で明記されているが、当業者は、これらが本発明の範囲内で特定の実施形態を例証する且つ記載するように機能することを認識するであろう。さらなる標的セグメントは、本開示を考慮する当業者によって容易に特定可能である。
例示的な好ましい標的セグメント内から選択される一続きの少なくとも５の連続するヌクレオチドを含む、長さが５−１００ヌクレオチドの標的セグメントは、標的とするためにも適切であると考えられる。
標的セグメントは、例示的な好ましい標的セグメントの１つの５’−末端からの少なくとも５の連続するヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡの配列を含むことができる（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの５’−末端の上流ですぐに始まり、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５乃至約１００のヌクレオチドを含むまで継続する、連続する一続きの同じＤＮＡまたはＲＮＡである）。同様に好ましい標的セグメントは、例示的な好ましい標的セグメントの１つの３’−末端からの少なくとも５の連続するヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡの配列によって表わされる（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの３’−末端の下流ですぐに始まり、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５乃至約１００のヌクレオチドを含むまで継続する、連続する一続きの同じＤＮＡまたはＲＮＡである）。本明細書に例証される標的セグメントを有する当該技術分野における当業者は、不要な実験なしで、さらに好ましい標的セグメントを特定することができるであろう。
一旦１つ以上の標的の領域、セグメントまたは部位が特定されると、所望の効果を得るために、標的に十分に相補的である、すなわち、十分好適に及び十分な特異性を有してハイブダイズする、アンチセンス化合物が選択される。
本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特定の標的のアンチセンス鎖に結合する。オリゴヌクレオチドは、少なくとも５ヌクレオチドの長さであり、各オリゴヌクレオチドが重複する配列を標的とするように合成され得、その結果、オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの全長を包含するように合成される。標的はまた、コード化領域の他に非コード化領域も含む。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって特異的な核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンスの化合物を標的とすることには、多段階プロセスがある。そのプロセスは、通常、核酸配列の特定で始まり、その機能は調節される。これは、例えば、例えば、細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）であり得、その発現は、特定の障害または疾患の状態、または例えば、非コード化ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）などの、非コード化ポリヌクレオチドに関係する。
ＲＮＡは、（１）タンパク質に翻訳される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、および（２）非タンパク質をコード化するＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に分類され得る。ｎｃＲＮＡは、高密度の停止コドンを含み、広範囲な「読取枠」を欠く、マイクロＲＮＡ、アンチセンス転写物および他の転写単位（ＴＵ）を含む。多くのｎｃＲＮＡは、タンパク質をコード化する遺伝子座の３’の翻訳されていない領域（３’ＵＴＲ）における開始部位から開始するように見える。ｎｃＲＮＡは、しばしば、希薄であり、ＦＡＮＴＯＭのコンソーシアムによって配列されたｎｃＲＮＡの少なくとも半分は、ポリアデニル化されていないようである。ほとんどの研究者は、細胞質へと処理および輸送されるポリアデニル化されたｍＲＮＡに焦点を置いた明白な理由を持つ。最近、一連のポリアデニル化されていない核ＲＮＡが、非常に大きく、多くのそのような転写物が、いわゆる遺伝子間領域から生じることが示された。ｎｃＲＮＡが遺伝子発現を調節し得る機構は、標的転写物との塩基対合によるものである。塩基対合によって機能するＲＮＡは、（１）同じ遺伝位置ではあるが、それらが作用するＲＮＡに対して反対の鎖上でコード化され、それ故、それらの標的に対する完全な相補性を示す、ｃｉｓコード化された（ｃｉｓ ｅｎｃｏｄｅｄ）ＲＮＡ、および（２）それらが作用するＲＮＡとは異なる染色体位置でコード化され、一般に、それらの標的との完全な塩基対合の可能性を示さない、トランスコード化された（ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ）ＲＮＡへとグループ化され得る。
理論に縛られることなく、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスポリヌクレオチドの摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は、対応するセンスメッセンジャーＲＮＡの発現を変更することができる。しかしながら、この調節は、不一致になる（アンチセンスノックダウンは、結果としてメッセンジャーＲＮＡの上昇をもたらす）か、または一致する（アンチセンスノックダウンは、結果として付随するメッセンジャーＲＮＡ還元をもたらす）のいずれかであり得る。これらの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのノックダウンまたは隔離を結果としてもたらすアンチセンス転写物の重複する又は重複しない部分に対して標的となり得る。コード化および非コード化のアンチセンスは、同一の方法で標的とされ得、そのいずれのカテゴリーも、一致したまたは不一致な方法のいずれかで、対応するセンス転写物を調節することができる。標的に対する使用のために新しいオリゴヌクレオチドを特定する際に利用される方策は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスＲＮＡ転写物のノックダウンまたは所望の標的を調節する任意の他の手段に基づき得る。
方策１：不一致な調節の場合には、アンチセンス転写物をノックダウンすることによって、従来の（センス）遺伝子の発現が上昇する。後者の遺伝子が既知の又は推定上の薬物標的に対してコード化する場合には、そのアンチセンス対照物のノックダウンは、受容体アゴニストまたは酵素刺激物（ｅｎｚｙｍｅ ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）の作用をおそらく模倣することができる。
方策２：一致した調節の場合には、当業者は、アンチセンス転写物およびセンス転写物両方を付随的にノックダウンし得、その結果、従来の（センス）遺伝子の発現の相乗的還元を達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドがノックダウンを達成するために使用される場合、この方策は、センス転写物に対して標的とされるアンチセンスオリゴヌクレオチド、および対応するアンチセンス転写物に対して標的とされる別のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または重複するセンスおよびアンチセンスの転写物を同時に標的とする、単一のエネルギー的に対称なアンチセンスのオリゴヌクレオチドを適用するために使用され得る。
本発明によると、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などの一本鎖または二本鎖のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズし、その機能を調節する他のオリゴマー化合物を含む。そのため、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、またはそれらの混合物、あるいはこれらの１つ以上の模倣物であり得る。これらの化合物は、一本鎖または二本鎖、円形またはヘアピン状のオリゴマー化合物であり得、内部または末端のバルジ、ミスマッチまたはループなどの、構造要素を含み得る。アンチセンス化合物は、慣例的に、線形に準備されるが、連結され得、さもなければ円形及び／又は分枝になるように準備される。アンチセンス化合物は、例えば、全体的にまたは部分的に二本鎖の化合物を形成するようにハイブリダイズされる二本鎖、または完全に又は部分的に二本鎖の化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするために、十分な自己相補性を有する一本鎖などの構成物を含むことができる。二本鎖は、遊離３’または５’末端を残して内部に連結され得るか、または連続的なヘアピンの構造またはループを形成するように連結され得る。ヘアピンの構造は、一本鎖の特徴の伸張をもたらす５’または３’末端のいずれかの上にオーバーハングを含み得る。二本鎖の化合物は、随意に、端部上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端、選択されたヌクレオチド位置、糖位置の１つに、またはヌクレオシド間連結のうちの１つに付けられた、コンジュゲート群（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ）を含むことができる。あるいは、二本鎖は、非核酸部分またはリンカー群によって連結され得る。一本鎖のみから形成されたときに、ｄｓＲＮＡは、二重鎖を形成するために二つ折りに畳まる（ｄｏｕｂｌｅｓ ｂａｃｋ ｏｎ ｉｔｓｅｌｆ）自己相補性のヘアピン型の分子の形態をとることができる。したがって、ｄｓＲＮＡは、完全に又は部分的に二本鎖であり得る。遺伝子発現の特異的な調節は、トランスジェニック細胞株におけるｄｓＲＮＡのヘアピンの安定した表現によって達成され得るが、幾つかの実施形態では、遺伝子の発現または機能はアップレギュレートされる。二重鎖を形成するために二つ折りに畳まれた、自己相補性のヘアピン型の分子の形態をとる、二本鎖、または一本鎖から形成されたときに、二本鎖（または一本鎖の二重鎖を形成する領域）は、ワトソンクリックの方法で塩基対合する相補的ＲＮＡ鎖である。
一旦系に導入されると、本発明の化合物は、標的核酸の開裂または他の修飾に効果のある１つ以上の酵素または構造タンパク質の作用を引き出し得るか、または占有ベースの機構（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ−ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）によって働き得る。一般に、（オリゴヌクレオチドを含む）核酸は、「ＤＮＡ様」（すなわち、一般に１つ以上の２’−デオキシ糖を有し、一般にＵ塩基よりもむしろＴ塩基）、または「ＲＮＡ様」（すなわち、一般に１以上の２’−ヒドロキシルまたは２’−修飾された糖を有し、一般にＴ塩基よりもむしろＵ塩基）と記載され得る。核酸ヘリックスは、１つを超えるタイプの構造、最も一般にＡ型およびＢ型を採用することができる。一般に、Ｂ型のような構造を有するオリゴヌクレオチドは、「ＤＮＡ様」であり、Ａ型のような構造を有するオリゴヌクレオチドは、「ＲＮＡ様」であると考えられている。幾つかの（キメラの）実施形態では、アンチセンス化合物は、ＡおよびＢ型の領域の両方を含み得る。
１つの実施形態では、所望のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスの化合物は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾された連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；小型ＲＮＡ誘発性の遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡｓ）、またはそれらの組み合わせ、の少なくとも１つを含む。
ｄｓＲＮＡはまた、「小型ＲＮＡ誘発性の遺伝子活性化」またはＲＮＡａと称されている機構である、遺伝子発現を活性化することができる。ｄｓＲＮＡ標的遺伝子プロモーターは、関係する遺伝子の強力な転写活性化を誘発する。ＲＮＡａは、「小活性化ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）と称されている、合成ｄｓＲＮＡを使用して、ヒト細胞で実証された。ＲＮＡａが、他の有機体に保護されるか否かは現在知られていない。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの、小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる、進化的に保存された機構の引き金になることが分かった。ＲＮＡｉは、リモデリングする染色質を介して遺伝子サイレンシングに例外なくつながることで、転写を抑制して、相補的ｍＲＮＡを分解するか、またはタンパク質翻訳を阻止する。しかしながら、続く実施例のセクションで詳しく記載される実例では、オリゴヌクレオチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドおよびそのコード化された産物の発現及び／又は機能を増加させると示されている。ｄｓＲＮＡはまた、小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）として作用し得る。理論に縛られることなく、遺伝子プロモーター中の配列を標的とすることによって、ｓａＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ誘発性の転写活性化（ＲＮＡａ）と呼ばれる現象において、標的遺伝子の発現を誘発するだろう。
さらなる実施形態では、本明細書で特定される「好ましい標的セグメント」は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現を調節する追加の化合物のためのスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎ）において利用され得る。「調節因子（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）」は、ＢＤＮＦをコード化する核酸分子の発現を減少または増加させる化合物であり、好ましい標的セグメントに相補的な少なくとも１つの５−ヌクレオチド部分を含む。スクリーニング方法は、ＢＤＮＦのセンスまたは天然のアンチセンスポリヌクレオチドをコード化する核酸分子の好ましい標的セグメントを、１つ以上の候補モジュレーターと接触させる工程、およびＢＤＮＦポリヌクレオチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９をコード化する核酸分子の発現を減少または増加させる１つ以上の候補調節因子のために選択する工程を含む。一旦、候補調節因子が、ＢＤＮＦポリヌクレオチドをコード化する核酸分子の発現を調節する（例えば、減少または増加させる）ことができると示されると、調節因子は、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの機能に関するさらなる調査研究において、または本発明に従う調査、診断、治療上の薬剤として使用するために利用され得る。
天然アンチセンス配列を標的とすることは、好ましくは、標的遺伝子の機能を調節する。例えば、ＢＤＮＦ遺伝子（例えば、受入番号 ＮＭ＿１７０７３５およびＮＭ＿００７５４０）。１つの実施形態では、標的は、ＢＤＮＦ遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドである。１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦポリヌクレオチド（例えば、受入番号 ＮＭ＿１７０７３５およびＮＭ＿００７５４０）のセンス及び／又は天然のアンチセンス配列、変異体、対立遺伝子、アイソフォーム、同族体、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびそれらの相補的配列を標的とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子であり、その標的は、アンチセンス及び／又はセンスのＢＤＮＦポリヌクレオチドのコード化領域および非コード化領域を含む。
本発明の好ましい標的セグメントはまた、安定化した二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドを形成するために、本発明のそれぞれの相補的アンチセンス化合物と組み合わされ得る。
そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、標的発現を調整する且つアンチセンス機構によってＲＮＡプロセシングと同様に翻訳も調節すると、当該技術分野で示されている。その上、二本鎖部分は、化学的修飾にさらされ得る。例えば、そのような二本鎖部分は、標的に対する二重鎖のアンチセンス鎖の古典的なハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、それによって、標的の酵素分解を引き起こすと示されている。
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチド（例えば、受入番号 ＮＭ＿１７０７３５およびＮＭ＿００７５４０）、変異体、対立遺伝子、同族体、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびそれらの相補的配列を標的とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子である。
本発明の実施形態に従って、標的核酸分子は、ＢＤＮＦだけに限定されず、その任意のポリヌクレオチド変異体、およびＢＤＮＦ発現産物及び／又はその任意のアイソフォームを生成する、それに影響を与える、衝撃を与える、またはそれを結果的にもたらす、あるいはそれに関連する、任意のポリヌクレオチドまで及ぶ。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦポリヌクレオチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１として明記されるポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、および、任意の変異体、対立遺伝子、同族体、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびそれらの相補的配列を標的とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９として明記される。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定することなく、ＢＤＮＦポリヌクレオチドに関係する非コード化のセンス及び／又はアンチセンスの配列を含む、ＢＤＮＦアンチセンスの核酸配列に相補的であるか又は結合し、ＢＤＮＦ分子の発現及び／又は機能を調節する。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至１１として明記された、ＢＤＮＦの天然アンチセンスの核酸配列に相補的であるか又は結合し、ＢＤＮＦ分子の発現及び／又は機能を調節する。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９の少なくとも５の連続するヌクレオチドの配列を含み、ＢＤＮＦ分子の発現及び／又は機能を調節する。
ポリヌクレオチド標的は、ＢＤＮＦを含み、そのファミリーメンバー、ＢＤＮＦの変異体；ＳＮＰを含む、ＢＤＮＦの突然変異体；ＢＤＮＦの非コード化配列；ＢＤＮＦの対立遺伝子；種変異体、フラグメントなどを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子である。
１つの実施形態では、ＢＤＮＦポリヌクレオチドを標的とするオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；小型ＲＮＡ誘発性の遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；あるいは小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、を含む。
１つの実施形態では、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３乃至５５を標的とすることで、これらの標的の発現または機能が調節される。１つの実施形態では、発現または機能は、対照と比較して、アップレギュレートされる。１つの実施形態では、発現または機能は、対照と比較して、ダウンレギュレートされる。
１つの実施形態では、アンチセンス化合物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９として明記される配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾されるヌクレオチド、より短い又は長いフラグメント、修飾された結合などを含むことができる。
１つの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２乃至４９は、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドを含む。
所望の標的核酸の調節は、当該技術分野で既知の様々な方法で実行され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなど。酵素の核酸分子（例えばリボザイム）は、様々な反応の１以上を触媒することができる核酸分子であり、ヌクレオチド塩基配列に特異的な方法で他の個別の核酸分子を繰り返し開裂する能力を含む。そのような酵素の核酸分子は、例えば、事実上任意のＲＮＡ転写物を標的とするために使用され得る。
それらの配列特異性のため、トランス開裂（ｔｒａｎｓ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）の酵素の核酸分子は、ヒト疾患用の治療薬としての有望性を示す。酵素の核酸分子は、細胞のＲＮＡのバックグラウンド内の特異的なＲＮＡ標的を開裂するように設計され得る。そのような開裂事象は、ｍＲＮＡが機能を持たないようにし、そのＲＮＡからタンパク質発現を抑止する。このように、疾患状態に関連するタンパク質の合成は選択的に阻害され得る。
一般に、ＲＮＡ開裂活性を伴う酵素の核酸は、標的ＲＮＡへの第１結合によって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを開裂するように作用する分子の酵素部分に近接して保持される酵素の核酸の標的結合部分によって、生じる。故に、酵素の核酸は、標的ＲＮＡを最初に認識し、次に相補的塩基対合によって標的ＲＮＡに結合し、一旦正確な部位に結合されると、標的ＲＮＡを切断するために酵素学的に作用する。そのような標的ＲＮＡの方策的な開裂は、コード化されたタンパク質の直接合成に導くその能力を破壊する。酵素の核酸が結合し、そのＲＮＡ標的を開裂した後、それは、別の標的を探索するためにＲＮＡから放され、新しい標的に繰り返し結合し、開裂することができる。
インビトロセレクション法（進化）方策（Ｏｒｇｅｌ， （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ， Ｂ ２０５， ４３５）などの様々な手法は、リン酸ジエステル連結とアミド連結の開裂及びライゲーションなどの様々な反応を触媒することができる新しい核酸触媒を進化させるために、使用されてきた。
触媒活性に最適なリボザイムの発達は、遺伝子発現を調節する目的でＲＮＡ開裂リボザイムを使用する、任意の方策に著しく寄与する。ハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、Ｍｇ２＋補助因子の飽和する（１０ｍＭ）濃度の存在下で、約１ｍｉｎ−１の触媒の速度（ｋｃａｔ）により機能する。人工の「ＲＮＡリガーゼ」リボザイムは、約１００ｍｉｎ−１の速度に対応する自己修飾反応を触媒すると示されてきた。加えて、ＤＮＡで作られる基質結合腕を有する、修飾したハンマーヘッド型リボザイムは、１００ｍｉｎ−１に近似する多数の回転率でＲＮＡ切断を触媒することが知られている。最終的に、ハンマーヘッド型の触媒コア内の特異的な残基の特定のヌクレオチドアナログとの置換は、触媒の速度の１０倍の改善と同じくらいのものを示す、修飾したリボザイムを与える。これらの結果は、リボザイムが、大半の天然の自己開裂リボザイムによってインビトロで表示されたものより著しく高い触媒速度により化学転換を促進することができることを、実証する。その後、最大の触媒活性を与えるために特定の自己開裂リボザイムの構造が最適化され得、又はＲＮＡリン酸ジエステル開裂のための著しく速い速度を表示する全く新しいＲＮＡモチーフが作られ得ることが、可能である。
「ハンマーヘッド型」モデルに適合するＲＮＡ触媒による、ＲＮＡ基質の分子内開裂は、１９８７年に最初に示された（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ， Ｏ． Ｃ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ， ３２８： ５９６−６００）。ＲＮＡ触媒は再生され、多数のＲＮＡ分子に反応し、それが本当に触媒であったことを実証した。
「ハンマーヘッド型」モチーフに基づいて設計される触媒のＲＮＡは、標的配列の必要な塩基対合を維持するためにＲＮＡ中で適切な塩基変化を行うことにより、特異的な標的配列を開裂するために使用されてきた。これは、触媒のＲＮＡの使用が特異的な標的配列を開裂することを可能にし、「ハンマーヘッド型」モデルに従って設計された触媒のＲＮＡが、恐らくインビボで特異的基質ＲＮＡを開裂し得ることを示す。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、哺乳動物と哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するための強力なツールとなった。この手法は、ｓｉＲＮＡに加工される小型ヘアピンＲＮＡのために発現プラスミド又はウイルス及びコード配列を使用する、ＲＮＡ自体、又はＤＮＡの何れかとして小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達を必要とする。このシステムは、プレｓｉＲＮＡの細胞質への効率的な運搬を可能にし、それらは活性であり、遺伝子発現のために調節された及び組織に特異的なプロモーターの使用を許容する。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド又はアンチセンス化合物は、リボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマー、又はそれらの模倣物、キメラ、アナログ、或いは同族体を含む。この用語は、自然発生のヌクレオチド、糖、及び共有結合のヌクレオシド間（骨格）連結、並びに、同様に機能する非自然発生部分を有するオリゴヌクレオチドで構成される。例えば、細胞の取り込みの増強、標的核酸の親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のため、そのような修飾した又は置換したオリゴヌクレオチドは大抵、天然の形態よりも所望される。
本発明に従って、オリゴヌクレオチド又は「アンチセンス化合物」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの模倣物、キメラ、アナログ、又は同族体）、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓａＲＮＡ、ａＲＮＡ、及び標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし且つその機能を調節する他のオリゴマー化合物などの一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物を含む。そのため、それらはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、又はそれらの混合物であり、又はこれらの１以上の模倣物であり得る。これら化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、又はヘアピン型オリゴマー化合物であり、内部又は末端のバルジ、ミスマッチ、或いはループなどの構造要素を含み得る。アンチセンス化合物は慣例通り、直線的に調製されるが繋げられ、又は他に環状及び／又は分枝であるように調製され得る。アンチセンス化合物は、例えば、完全に又は部分的に二本鎖化合物のハイブリダイゼーション及び形成を可能にするのに十分な自己相補性により、完全に又は部分的に二本鎖又は一本鎖の化合物を形成するようにハイブリダイズされた二本鎖などの構築物を含み得る。二本鎖は内部で連結して遊離の３’又は５’の末端を残し、あるいは連続的なヘアピン型の構造又はループを形成するように連結され得る。ヘアピン型構造は、一本鎖特徴の延長をもたらす、５’又は３’の何れかの末端上にオーバーハングを含み得る。二本鎖化合物は随意に、端部に突出部を含み得る。さらなる修飾物は、末端の１つ、選択されたヌクレオチド位置、糖の位置、又はヌクレオシド連結の１つに付けられる共役基を含み得る。代替的に、二本鎖は、非核酸部分又はリンカー基を介して連結され得る。ほんの一本鎖から形成されると、ｄｓＲＮＡは、二重鎖を形成するために二つ折りに重なる、自己相補性ヘアピン型分子の形態をとることができる。故に、ｄｓＲＮＡは、完全に又は部分的に二本鎖であり得る。遺伝子発現の特異的な調節は、トランスジェニック細胞株におけるｄｓＲＮＡのヘアピンの安定した発現によって達成され得る。二重鎖を形成するために二つ折りに重なる、自己相補性ヘアピン型分子の形態をとる二本鎖又は一本鎖から形成されると、二本鎖（又は一本鎖の二重鎖形成の領域）は、ワトソン−クリック様式における塩基対合する相補的ＲＮＡ鎖である。
一旦システムに導入されると、本発明の化合物は、標的核酸の開裂又は他の修飾を達成するために１以上の酵素又は構造タンパク質の作用を引き出し、又は占有ベースの機構によって作動し得る。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）は、「ＤＮＡ様」（即ち、１以上の２’−デオキシ糖、及び一般にＵよりもむしろＴの塩基を一般的に有する）、又は「ＲＮＡ様」（即ち、１以上の２’−ヒドロキシル又は２’−修飾した糖、及び一般にＴよりもむしろＵの塩基を一般的に有する）と記載され得る。核酸のヘリックス、１より多くの種類の構造、最も一般的にＡ型構造及びＢ型構造を採用し得る。一般に、Ｂ型構造様の構造があるオリゴヌクレオチドは「ＤＮＡ様」であり、Ａ型構造があるものは「ＲＮＡ様」であると、考えられている。幾つかの（キメラの）実施形態において、アンチセンス化合物は、Ａ及びＢ型構造領域の両方を含み得る。
本発明に従ったアンチセンス化合物は、長さが約５乃至約８０ヌクレオチドまで（即ち、約５から約８０の連結したヌクレオシドまで）、アンチセンス部分を含み得る。これは、アンチセンス化合物のアンチセンスの鎖又は部分の長さを指す。要するに、本発明の一本鎖アンチセンス化合物は、５乃至約８０ヌクレオチドを含み、本発明の二本鎖アンチセンス化合物（例えば、ｄｓＲＮＡなど）は、長さが５乃至約８０ヌクレオチドのセンス或いはアンチセンスの鎖又は部分を含む。当業者は、このことが、長さが５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０、或いはその中の任意の範囲のヌクレオチドのアンチセンス部分を包含することを認識する。
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、長さが１０乃至５０ヌクレオチドのアンチセンス部分を有する。当業者は、このことが、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０、或いはその中の任意の範囲のヌクレオチドのアンチセンス部分を有するオリゴヌクレオチドを例示することを理解する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１５ヌクレオチドである。
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス又はオリゴヌクレオチドの化合物は、長さが１２又は１３乃至３０ヌクレオチドのアンチセンス部分を有する。当業者は、このことが、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０、或いはその中の任意の範囲のヌクレオチドのアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を例示することを認識する。
一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物はまた、異なる塩基が化合物中のヌクレオチド位置の１以上に存在する変異体を含む。例えば、第１のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置でチミジン、グアノシン、又はシチジンを含む変異体がもたらされ得る。これは、アンチセンス化合物又はｄｓＲＮＡ化合物の位置の何れかにて行われ得る。その後、これら化合物は、標的核酸の発現を阻害するそれらの能力を決定するために、本明細書に記載される方法を使用して試験される。
幾つかの実施形態において、同族性、配列同一性、又は相補性は、アンチセンス化合物と標的の間で、約４０％から約６０％まである。幾つかの実施形態において、同族性、配列同一性、又は相補性は、約６０％から約７０％まである。幾つかの実施形態において、同族性、配列同一性、又は相補性は、約７０％から約８０％まである。幾つかの実施形態において、同族性、配列同一性、又は相補性は、約８０％から約９０％まである。幾つかの実施形態において、同族性、配列同一性、又は相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％である。
一実施形態において、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１２乃至４９にて明記される核酸分子などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１以上の置換物又は修飾物を含む。１つの実施形態において、ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）により置換される。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦに関連するコード化及び／又は非コード化配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１乃至１１として明記される配列のセンス及び／又はアンチセンスの核酸分子の１以上の領域を、標的とする。オリゴヌクレオチドも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１乃至１１の重複領域に標的化される。
本発明の特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、キメラのオリゴヌクレオチドである。「キメラのオリゴヌクレオチド」又は「キメラ」は、この本発明の文脈において、２以上の化学的に異なる領域（各々、少なくとも１つのヌクレオチドから作られる）を含むオリゴヌクレオチドである。これらオリゴヌクレオチドは典型的に、１以上の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、細胞への取り込みの増加、標的に対する結合親和性の増加など）を与える修飾したヌクレオチドの少なくとも１つの領域、及び、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドを開裂することができる酵素のための基質である領域を含む。一例として、ＲＮＡａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞のエンドヌクレアーゼである。ＲＮＡａｓｅ Ｈの活性化はそれ故、ＲＮＡ標的の開裂を結果としてもたらし、それにより、遺伝子発現のアンチセンスの調節の効率をかなり増強する。結果的に、比較可能な結果は大抵、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラのオリゴヌクレオチドが使用されると、より短いオリゴヌクレオチドにより得られ得る。ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動、及び必要ならば、当該技術分野で既知の関連する核酸ハイブリッド形成技術によって慣例的に検知され得る。１つの実施形態において、キメラのオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾される少なくとも１つの領域、及び通常、ＲＮＡｓｅ Ｈの基質として作用する領域を含む。その標的（この場合、核酸コード化ｒａｓ）のためのオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチド／標的の対のＴｍの測定により慣例的に決定され、Ｔｍは、オリゴヌクレオチドと標的が分離する温度であり；分離は分光測光法で検知される。Ｔｍが高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が大きくなる。
本発明のキメラのアンチセンス化合物は、２以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又は上記のようなオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成され得る。そのような化合物はまた、当該技術分野において雑種又はｇａｐｍｅｒと称されてきた。そのような混成構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第５，０１３，８３０；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；及び第５，７００，９２２号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、修飾されるオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位置で修飾される少なくとも１つのヌクレオチドを、最も好ましくは、２’−Ｏアルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ＲＮＡ修飾物は、ピリミジン、脱塩基残基、又はＲＮＡの３’末端にて反転した塩基のリボース上に、２’−フルオロ、２’−アミノ、及び２’−メチルの修飾物を含む。そのような修飾物は、オリゴヌクレオチドに慣例的に組み込まれ、これらオリゴヌクレオチドは、与えられた標的に対する２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（即ち、より高い標的結合親和性）を有することが示される。そのような親和性増加の効力は、遺伝子発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害を大いに増強することである。ＲＮＡａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞のエンドヌクレアーゼであり；この酵素の活性化はそれ故、ＲＮＡ標的の開裂を結果としてもたらし、故に、ＲＮＡｉ阻害の効率を大いに増強することができる。ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動によって慣例的に実証され得る。一実施形態において、キメラのオリゴヌクレオチドも、ヌクレアーゼ抵抗性を増強するために修飾される。細胞は、核酸を分解することができる様々なエキソ−ヌクレアーゼ及びエンド−ヌクレアーゼを含む。多くのヌクレオチドとヌクレオシドの修飾物は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、本来のオリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼ分解に対して耐性があるようにすると示された。ヌクレアーゼ抵抗性は、通常はゲル電気泳動によって、細胞抽出物又は分離されたヌクレアーゼ溶液によりオリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって、及び経時的に残る無傷のオリゴヌクレオチドの範囲を測定することによって、慣例的に測定される。それらのヌクレアーゼ抵抗性を増強するために修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドより長期間、無傷で生存する。様々なオリゴヌクレオチド修飾物が、ヌクレアーゼ抵抗性を増強又は与えるために実証された。少なくとも１つのホスホロチオエート修飾物を含むオリゴヌクレオチドが、現在好ましい。幾つかの場合において、標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾物も、独立して、ヌクレアーゼ抵抗性を増強することができる。
この本発明のために予見された幾つかの好ましいオリゴヌクレオチドの特異的な例は、修飾した骨格を含むもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキル、シクロアルキル糖間連結、短鎖ヘテロ原子、又はヘテロ環式糖間連結を含む。最も好ましいものは、ホスホロチオエート骨格を備えるオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格を備えるもの、特に、ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２、ＣＨ、−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩの骨格として知られる］、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２、及びＯ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２の骨格であり、ここで、本来のリン酸ジエステル骨格はＯ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨとして表わされる。Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２８：３６６−３７４に開示されるアミド骨格も、好ましい。また、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号）。他の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格など、オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ・チッ素原子に直接又は間接的に結合される。オリゴヌクレオチドはまた、１以上の置換された糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位置にて、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＮＨ２、又はＯ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、ここで、ｎは１乃至約１０であり；Ｃ１乃至Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリル、又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−−、Ｓ−−、又はＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−、又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；又は、オリゴヌクレオチド及び類似の特性がある他の置換基の薬理学的特性を改善するための基、の１つを含む。好ましい修飾物は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる］を含む。他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ ＣＨ２ＣＨ３）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。類似の修飾も、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置にて行われ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の適所にシクロブチル基などの糖模倣物を有し得る。
オリゴヌクレオチドはまた、付加的に又は代替的に、核酸塩基（大抵、当該技術において単に「塩基」と呼ばれる）の修飾物又は置換物を含み得る。本明細書で使用されるように、「未修飾の」、「天然の」ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾したヌクレオチドは、天然の核酸においてのみ頻繁に又は一時的に見出されるヌクレオチド（例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、且つ頻繁に当該技術分野で５−Ｍｅ−Ｃと称される））、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、及びゲントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣ）、並びに、合成のヌクレオチド（例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換したアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリン）を含む。当該技術分野で既知の「普遍的な」塩基（例えばイノシン）が含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換物は、核酸二重鎖安定性を０．６−１．２℃、増加させると示され、現在好ましくは塩基置換である。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性又は細胞の取り込みを増強する１以上の部分又は接合体をオリゴヌクレオチドに化学的に連結する工程を含む。そのような部分は、限定されないが、コレステロール部分、コレステリル部分、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール又はウンデシルの残基）、ポリアミン又はポリエチレングリコールの鎖、或いはアダマンタン酢酸などの脂質部分を含む。例えば、親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、及びそのようなオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当該技術分野、例えば米国特許第５，１３８，０４５号、第５，２１８，１０５号、及び第５，４５９，２５５号にて既知である。
与えられたオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されることは必要とされず、実際、前述の修飾物の１より多くは、単一のオリゴヌクレオチドにおいて、又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内にまでも組み込まれ得る。本発明はまた、本明細書の前述にて定義されるようなキメラのオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、又はポリヒドロカーボンの化合物を含むがこれらに限定されない、別の部分と結合する。当業者は、これら分子が、糖、塩基、又はリン酸基上の様々な位置にて核酸分子を含む任意のヌクレオチドの１以上に連結され得ることを認識する。
この発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって都合よく且つ慣例的に作られ得る。そのような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む様々な売手によって販売される。そのような合成のための他の手段も利用され得る；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、当業者の手腕内で十分である。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体など他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも、周知である。蛍光性に標識化してビオチン化したもの、又はコレステロールで修飾したオリゴヌクレオチドなどの他の修飾したオリゴヌクレオチドを合成するために、同様の技術、並びに、商業上利用可能な修飾したアミダイト及び気孔が制御されたガラス（ＣＰＧ）生成物（ビオチン、フルオレセイン、アクリジン、又はソラレンで修飾したアミダイト及び／又はＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから利用可能）など）を使用することも周知である。
本発明に従って、作用の効力、特異性、及び作用持続時間を増強し、且つ、ＭＯＥ、ＡＮＡ、ＦＡＮＡ、ＰＳなどの現在の化学から構成されたオリゴヌクレオチドの投与経路を広げるために、ＬＮＡモノマーなどの修飾物を使用する。これは、ＬＮＡモノマーによる現在のオリゴヌクレオチドにおけるモノマーの幾つかを置換することによって達成され得る。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、親化合物に類似する大きさを有し得、又はそれよりも大きい、或いは好ましくは小さくてもよい。そのようなＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、約７０％未満、より好ましくは約６０％未満、最も好ましくは約５０％未満のＬＮＡモノマーを含み、且つ、それらの大きさが約５と２５の間のヌクレオチド、より好ましくは約１２と２０の間のヌクレオチドであることが、好ましい。
好ましい修飾したオリゴヌクレオチド骨格は、限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、フォスフィン酸塩、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び標準の３’−５’連結、これらの２’−５’の連結したアナログ、及び逆転した極性を有するものを有するボラノホスフェートを含み、ここで、隣接したヌクレオシドユニットの対は、３’−５’乃至５’−３’、又は２’−５’乃至５’−２’に連結される。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。
連結を含む上記リンの調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第３，９７４，２７２号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；及び第５，６２５，０５０号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
中にリン原子を含まない、好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキル・ヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間連結、又は１以上の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらは、モルノリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホンの骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）及びチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）の骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルの骨格を含むアルケン；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノの骨格；スルフォナートとスルホンアミドの骨格；アミド骨格；及び、混合したＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２の構成部分を有する他のもの、を含む。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７７，４３９号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチドユニットの糖及びヌクレオシド間連結（即ち、骨格）の両方は、新しい基と取り替えられる。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、即ち優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と取り替えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ・チッ素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， １４９７−１５００に見出され得る。
本発明の実施形態において、ホスホロチオエート骨格を備えるオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格を備えるオリゴヌクレオチド、及び特にメチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−及び−ＯＮ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−が記載され、ここで、天然のリン酸ジエステル骨格は、上記米国特許第５，４８９，６７７号の−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として、及び上記米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格として表わされる。上記米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１以上の置換された糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位置にて、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキニル；又はＯアルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣからＣＯのアルキル、又はＣ２乃至Ｃ１０のアルケニル及びアルキニルでもよい。Ｏ（ＣＨ２）ｎ、ＯｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（ＣＨ３）２が特に好ましく、ここで、ｎとｍは１〜約１０までであり得る。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位置にて、ＣからＣＯ（低級アルキル、置換した低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、又はＯ−アラルキル）、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換したシリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を向上させるための基、或いは、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性を向上させるための基、及び類似の特性を有する他の置換基、の１つを含む。好ましい修飾物は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる）、即ち、アルコキシアルコキシ基を含む。更に好ましい修飾物は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、以下の本明細書の実施例に記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２を含む。
他の好ましい修飾物は、２’−メトキシ（２’−Ｏ ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−Ｏ ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。類似の修飾も、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’の連結したオリゴヌクレオチド中の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置にて行われ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシルの糖の適所にシクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。そのような修飾した糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（大抵、当該技術分野で単に「塩基」と称される）の修飾物又は置換物を含み得る。本明細書で使用されるように、「未修飾の」、「天然の」ヌクレオチドは、プリン塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾したヌクレオチドは、他の合成及び天然のヌクレオチド（５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル及びアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル及びアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾ・ウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなど）を含む。
更に、ヌクレオチドは、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、‘Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ．Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ‘Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ’， １９９１， ３０， ｐａｇｅ ６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， ‘Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ． ｅａ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に開示されるものを含む。特定のこれらヌクレオチドは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に役立つ。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６の置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６−１．２℃により核酸の二重安定性を増加させると示され（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄｓ， ‘Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６−２７８）、且つ、より具体的には２’−Ｏメトキシエチル糖修飾物と結合した時に、現在好ましい塩基置換である。
上述の修飾ヌクレオチド、同様に他の修飾したヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、同様に第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，７５０，６９２号、及び第５，６８１，９４１号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞の取り込みを増強する１以上の部分又は接合体をオリゴヌクレオチドに化学的に連結する工程を含む。
そのような部分は、限定されないが、脂質部分（コレステロール部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール又はウンデシルの残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖など）、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン或いはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔ オキシコレステリン部分を含む。
そのようなオリゴヌクレオチド接合体の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；
第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号、及び第５，６８８，９４１号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
創薬：本発明の化合物はまた、創薬及び標的確認の領域に適用され得る。本発明は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドと、疾患状態、表現型、又は疾病との間に存在する関係を解明するための創薬の試みにおける、化合物、及び本明細書で識別される好ましい標的セグメントの使用を包含する。これらの方法は、サンプル、組織、細胞、又は本発明の化合物と生物体を接触させる工程を含む、ＢＤＮＦポリヌクレオチドを検知又は調節する工程、処置後の幾つかの時点でＢＤＮＦポリヌクレオチド及び／又は関連する表現型又は化学的なエンドポイントの核酸又はタンパク質のレベルを測定する工程、及び、測定した値を未処置のサンプル又は本発明の更なる化合物により処置されるサンプルと随意に比較する工程を含む。これらの方法はまた、標的確認のプロセスのために未知の遺伝子の機能を決定するための、又は特定の疾患、疾病、又は表現型の処置又は予防の標的として特定の遺伝子産物の有効性を決定するための他の実験と並行して、又は組み合わせて、行われ得る。
＜遺伝子発現のアップレギュレーション又は阻害の評価＞
外因性の核酸の宿主細胞又は生物体への移動は、細胞又は生物体における核酸の存在を直接検知することにより、評価され得る。そのような検知は、当該技術分野で周知の様々な方法によって達成され得る。例えば、外因性の核酸の存在は、サザンブロット、又は、核酸に関連したヌクレオチド配列を明確に増幅するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって検知され得る。外因性の核酸の発現も、遺伝子発現解析を含む従来の方法を使用して測定され得る。例えば、外因性の核酸からもたらされたｍＲＮＡは、ノーザンブロット及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、検知され且つ定量化され得る。
外因性の核酸からのＲＮＡの発現も、酵素活性又はリポータータンパク質活性の測定により検知され得る。例えば、アンチセンスの調節作用は、外因性の核酸がエフェクターＲＮＡをもたらしているという指標としての標的核酸発現における減少又は増加として、間接的に測定され得る。配列保存に基づき、プライマーは、標的遺伝子のコード領域を増幅するために設計され且つ使用され得る。初めに、任意のコード領域又は非コード領域が使用され得るが、各遺伝子から最も高度に発現されたコード領域が、モデル制御遺伝子を構築するために使用され得る。各制御遺伝子は、レポーターコード領域とそのポリ（Ａ）信号の間に各コード領域を挿入することにより、組み立てられる。これらプラスミドは、遺伝子の上流部分においてレポーター遺伝子を持つｍＲＮＡを、及び、３’非コード領域において可能なＲＮＡｉ標的をもたらす。個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、レポーター遺伝子の調節によって分析される。本発明の方法に役立つレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｓ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、及びテトラサイクリンに対する抵抗性を与える、多数の選択可能なマーカーが利用可能である。レポーター遺伝子の調節を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、限定されないが、蛍光測定器方法（例えば、蛍光分光学法、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡法）、抗生物質耐性測定を含む。
ＢＤＮＦタンパク質及びｍＲＮＡの発現は、当業者に既知の、及び本明細書の各部に記載される方法を使用してアッセイされ得る。例えば、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイはタンパク質レベルを測定するために使用され得る。ＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡアッセイのキットは、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）から、商業上利用可能である。
実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して処置されるサンプル（例えば、インビボ又はインビトロの細胞或いは組織）におけるＢＤＮＦ発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質）は、対照サンプルにおけるＢＤＮＦ発現と比較して評価される。例えば、タンパク質又は核酸の発現は、当業者に既知の方法を使用して、偽処置された（ｍｏｃｋ−ｔｒｅａｔｅｄ）又は未処置のサンプルにおけるものと比較され得る。代替的に、対照のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、変更した又は異なる配列を有するもの）で処置されるサンプルとの比較は、所望される情報に依存して行われ得る。別の実施形態において、処置したサンプルｖｓ未処置のサンプルにおけるＢＤＮＦタンパク質又は核酸の発現の差は、処置したサンプルｖｓ未処置のサンプルにおける異なる核酸（研究者によって任意の標準の認められた適切なもの、例えばハウスキーピング遺伝子を含む）の発現の差と比較され得る。
観察した差は、例えば、対照との比較に使用するための比率又は画分の形態で、所望されるように発現される。実施形態において、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したサンプルにおいて、未処置のサンプル又は対照の核酸で処置したサンプルに対して、約１．２５倍乃至約１０倍以上増加或いは減少され得る。実施形態において、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルは、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、又は少なくとも約１０倍以上、増加又は減少される。
＜キット、研究試薬、診断、及び治療学＞
本発明の化合物は、診断、治療学、及び予防法のために、及びキットの研究試薬及び構成要素として利用され得る。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチド（精巧な特異性により遺伝子発現を阻害することができる）は、特定の遺伝子の機能を解明するために、又は生物学的経路の様々な部材の機能間を区別するために、当業者によって大抵は使用される。
キット及び診断、並びに様々な生物系における使用のために、本発明の化合物は、単独で又は他の化合物或いは治療薬と組み合わせて、細胞及び組織内で発現される遺伝子の一部又は全体の補体の発現パターンを解明するための差別的な及び／又は組み合わせの分析におけるツールとして有用である。
本明細書に使用されるように、用語「生物系」又は「システム」は、発現する任意の生物体、細胞、細胞培養物、又は組織として定義される、又は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子の生成物を発現するために適格にされ得る。これらは、限定されないが、ヒト、形質転換動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植片、移植片、及びそれらの組み合わせを含む。
１つの制限しない例として、１以上のアンチセンス化合物で処置した細胞又は組織内の発現パターンは、アンチセンス化合物で処置していない対照の細胞又は組織と比較され、もたらされるパターンは、例えば、疾病関連性、シグナル経路、細胞局在、発現レベル、大きさ、試験した遺伝子の構造又は機能にそれらが属するため、遺伝子発現の差別的なレベルの遺伝子発現について分析される。これら分析は、刺激した細胞又は刺激していない細胞上で、及び発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在下又は不在下で行われ得る。
当該技術分野で既知の遺伝子発現解析の方法の例は、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイ、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）、ＲＥＡＤＳ（消化されたｃＤＮＡの制限酵素増幅）、ＴＯＧＡ（合計の遺伝子発現解析）、タンパク質アレイ及びプロテオミクス、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）シーケンス解析、負のＲＮＡフィンガープリント法（ＳｕＲＦ）、負のクローニング、示差表示（ＤＤ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）技術、及び質量分析法方法を含む。
本発明の化合物が脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコード化する核酸にハイブリダイズするため、これら化合物は研究と診断に役立つ。例えば、効果的なＢＤＮＦモジュレーターとなるように、本明細書に開示されるような効率により及び条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、遺伝子増幅又は検知にそれぞれ促進する条件下で効果的なプライマー又はプローブである。これらプライマーとプローブは、ＢＤＮＦをコード化する核酸分子の特異的検出を必要とする方法、及び、ＢＤＮＦの更なる研究における検知又は使用のための前記核酸分子の増幅において、役立つ。核酸コード化ＢＤＮＦによる本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（特にプライマー及びプローブ）のハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知の手段によって検知され得る。そのような手段は、酵素のオリゴヌクレオチドへの共役、オリゴヌクレオチドの放射性標識法、又は任意の他の適切な検出手段を含み得る。サンプルにおけるＢＤＮＦのレベルを検知するためのそのような検出手段を使用するキットも、調製され得る。
アンチセンスの特異性及び感受性も、治療用途のため当業者によって利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物の病状の処置において、治療部分として利用された。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬物は、ヒトに安全且つ効果的に投与され、多数の臨床試験が現在進行中である。故に、アンチセンス化合物が、細胞、組織、及び動物（特にヒト）の処置のための処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅｓ）に役立つように構成され得る、有用な治療手段となり得ることが確証される。
治療のため、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの発現の調節により処置され得る疾患又は障害を患う疑いのある動物（好ましくはヒト）は、本発明に従ってアンチセンス化合物を投与することにより処置される。例えば、１つの制限しない実施形態において、方法は、治療上効果的な量のＢＤＮＦモジュレーターを、処置を必要とする動物に投与する工程を含む。本発明のＢＤＮＦモジュレーターは、ＢＤＮＦの活性を効果的に調節する、又はＢＤＮＦタンパク質の発現を調節する。１つの実施形態において、動物のＢＤＮＦの活性又は発現は、対照と比較して、約１０％阻害される。好ましくは、動物のＢＤＮＦの活性又は発現は、約３０％阻害される。より好ましくは、動物のＢＤＮＦの活性又は発現は、５０％以上阻害される。故に、オリゴマー化合物は、対照と比較して、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ｍＲＮＡの発現を、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％調節する。
１つの実施形態において、動物の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の活性又は発現は、対照と比較して、約１０％増加される。好ましくは、動物のＢＤＮＦの活性又は発現は、約３０％増加される。より好ましくは、動物のＢＤＮＦの活性又は発現は、５０％以上増加される。故に、オリゴマー化合物は、対照と比較して、ＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現を、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％調節する。
例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現の増加又は減少は、血清、血液、脂肪組織、肝臓又は任意の他の体液、動物の組織又は臓器において測定され得る。好ましくは、分析されている前記流体、組織、又は臓器内に含まれる細胞は、核酸分子コード化ＢＤＮＦペプチド及び／又はＢＤＮＦタンパク質自体を含む。
本発明の化合物は、適切な薬学的に許容可能な希釈剤又は担体に効果的な量の化合物を加えることにより、医薬組成物中で利用され得る。化合物の使用及び本発明の方法はまた、予防的に有用であり得る。
＜接合体＞
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞の取り込みを増強する１以上の部分又は接合体をオリゴヌクレオチドに化学的に連結する工程を含む。これらの部分又は接合体は、一級又は二級のヒドロキシル基などの官能基に共有結合される共役基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｇｒｏｕｐ）を含み得る。本発明の共役基は、インターカレータ、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物速度論的特性を増強する基を含む。典型的な共役基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素を含む。薬物動態学的特性を増強する基は、本発明の文脈において、取り込みを向上させ、劣化に対する抵抗性を増強し、及び／又は標的核酸による配列特異性のハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物速度論的特性を増強する基は、本発明の文脈において、本発明の化合物の取り込み、分配、代謝、又は排出を向上させる基を含む。代表的な共役基は、引用により本明細書に組み込まれる、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６、及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示される。共役基は、限定されないが、脂質部分（コレステロール部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール又はウンデシルの残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖など）、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン或いはヘキシルアミノ−カルボニル− オキシコレステリン部分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドも、活性薬物物質（例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロサイアザイド、ジアゼピン、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈｉｃｉｎ）、バルビツール酸塩、セファロスポリン、サルファ薬、糖尿病用薬、抗菌薬、又は抗生物質に共役され得る。
そのようなオリゴヌクレオチド接合体の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号、及び第５，６８８，９４１号を含む。
＜製剤＞
本発明の化合物はまた、取り込み、分配、及び／又は吸収を助けるために、他の分子、分子構造、又は化合物の混合物（例えば、リポソーム、受容体に標的とされた分子、経口、直腸、局所、又は他の製剤）と混合され、閉じ込められ、共役され、又は他に関連付けられ得る。そのような取り込み、分配、及び／又は吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１６５号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；及び第５，５９５，７５６号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
アンチセンスヌクレオチドは、標的の発現及び／又は機能を調節するためにベクターに関連して投与する必要はないが、本発明の実施形態は、プロモーター、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための発現ベクター構築物に関係し、且つ、強力な構成的のプロモーター作用、又は所望の場合において誘発され得るプロモーター作用を持つ。
実施形態において、本発明の実施は、適切な核酸送達システムにより前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを投与する工程を含む。１つの実施形態において、そのシステムは、ポリヌクレオチドに操作可能に連結した非ウイルスのベクターを含む。そのような非ウイルスのベクターの例は、オリゴヌクレオチド単独（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１２〜４９の何れか１以上）、又は適切なタンパク質、多糖類、或いは脂質製剤と組み合わせたものを含む。
更に適切な核酸送達システムは、ウイルスベクター、典型的に、アデノウイルス、アデノウイルス関連性ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、又は日本リポソーム（ＨＶＪ）複合体のヘマグルチナチンの配列を含む。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに操作可能に連結される強力な真核生物のプロモーター（例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）を含む。
更に好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、及び化学接合体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶベースのウイルスを含む。１つの好ましいＨＩＶベースのウイルスベクターは、ｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルス由来である、少なくとも２つのベクターを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらベクターは、オルソポックス又はアビポックスなどのｐｏｘベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連性ウイルスベクターを含む。
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、或いは任意の他の化合物の塩を包含し、それらは、ヒトを含む動物への投与後、生物学的に活性な代謝物又はその残基を提供することができる（直接又は間接的に）。
用語「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の化合物の生理学的且つ薬学的に許容可能な塩を指す：即ち、親化合物の所望の生物活性を保持し、且つ望まれない毒物学効果を与えない塩である。オリゴヌクレオチドのため、薬学的に許容可能な塩の好ましい例及びそれらの使用が、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号にて更に記載される。
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物及び製剤を含む。本発明の医薬組成物は、局所又は全身の処置が所望されるかどうか、及び処置される領域に依存する多くの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、並びに、膣及び直腸の送達を含む粘膜を含む）、肺（例えば、噴霧器によるものを含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は吸い込みによる）；気管内、鼻腔内か、表皮、及び経皮的、経口又は非経口でもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射、或いは注入；又は頭蓋内（例えば、脊髄腔内又は脳室内）の投与を含む。
中枢神経系中の組織の処置のため、投与は、例えば脳脊髄液への注射又は注入によって行われ得る。脳脊髄液へのアンチセンスＲＮＡの投与は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１７７７２号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｌｏｗｉｎｇ ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」に記載され、それはその全体において引用により本明細書に組み込まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが中枢神経系における細胞へ投与されることが意図されると、投与は、血液脳障壁を横切って被験体のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる１以上の薬剤によって行われ得る。注射は、例えば、嗅内皮質又は海馬において行われ得る。アデノウイルスベクターの筋組織内での運動性ニューロンへの投与による、神経栄養因子の送達は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３２，４２７号「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載される。ベクターの脳（例えば、線条体、視床、海馬、又は黒質）への直接送達は、当該技術分野で既知であり、例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７５６，５２３号「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ」に記載される。投与は注射などにより急速となり得、又は、除放性製剤の遅い注入又は投与などにより期間にわたって行われ得る。
被験体のアンチセンスオリゴヌクレオチドも、望ましい薬学的又は薬理学的な特性を提供する薬剤に連結又は共役され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェリンレセプターに対する抗体など血液脳障壁をわたる浸透又は運搬を促進するために、当該技術分野で既知の任意の物質に結合され、静脈注射によって投与され得る。アンチセンス化合物はウイルスベクターと連結され得、例えばそれは、アンチセンス化合物をより効果的なものにし、及び／又は、血液脳障壁をわたるアンチセンス化合物の運搬を増加する。浸透圧の血液脳障壁の破壊はまた、例えば、糖（限定されないが、メソ・エリトリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（−）フルクトース、Ｄ（−）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（−）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（−）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（−）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（−）フコース、Ｄ（−）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、及びＬ（−）リキソースを含む）、又はアミノ酸（限定されないが、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、及びタウリンを含む）の注入によって、達成され得る。血液脳障壁浸透を増強する方法及び材料は、例えば、米国特許第４，８６６，０４２号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、第６，２９４，５２０号「Ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、及び第６，９３６，５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載され、それら全ては、それらの全体における引用によって本明細書に組み込まれる。
被験体のアンチセンス化合物は、取り込み、分配、及び／又は吸収を助けるために、他の分子、分子構造、又は化合物の混合物（例えば、リポソーム、受容体に標的とされた分子、経口、直腸、局所、又は他の製剤）と混合され、閉じ込められ、共役され、又は他に関連付けられ得る。例えば、カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの取り込みを促進するための製剤に含まれ得る。取り込みを促進すると示された１つのそのような組成物は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから利用可能）である。
少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾物を備えたオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に役立つと考えられる。局所投与のための医薬組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液体、及び粉末剤を含み得る。従来の製薬の担体、水性基剤、粉末基剤、又は油基剤、増粘剤などは、必要なもの又は望ましいものであり得る。コーティングしたコンドーム、グローブなども役立ち得る。
本発明の医薬製剤（単位投与形態に都合良く存在し得る）は、医薬品工業にて周知の従来技術に従って調製され得る。そのような技術は、活性成分の、製薬の担体又は賦形剤との関連をもたらす工程を含む。一般に、製剤は、活性成分の、液体担体又は細かく分割された固形担体との関連を均一且つ密接にもたらすことにより調製され、その後、必要な場合、生成物を形成する。
本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ剤、柔らかいゲル剤、坐剤、及び浣腸剤などの多くの可能な投与形態の何れかへと処方され得る。本発明の組成物も、水性、非水性、又は混合の培地中で懸濁液として処方され得る。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘性を増加させる物質をさらに含み得る。懸濁液はまた、安定剤を含み得る。
本発明の医薬組成物は、限定されないが、溶液、乳剤、フォーム、及びリポソーム含有製剤を含む。本発明の医薬組成物及び製剤は、１以上の浸透促進剤、担体、賦形剤、又は他の活性或いは不活性な成分を含み得る。
乳剤は典型的に、直径の点で通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態で分散された１つの液体の不均質系である。乳剤は、分散相、及び、分離した相として水相、油相、又はそれ自体の何れかにおいて溶液として存在し得る活性薬物に加えて、追加成分を含み得る。マイクロエマルジョンは本発明の実施形態として含まれる。乳剤とその使用は当該技術分野で周知であり、米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載される。
本発明の製剤はリポソーム製剤を含む。本発明にて使用されるように、用語「リポソーム」は、球状の二重層又は複数の二重層にて整えられた両親媒性脂質で構成されるベシクルを意味する。リポソームは、親油性材料から、及び送達される組成物を含む水性の内部から形成された細胞膜を有する、単層又は多重層のベシクルである。カチオン性リポソームは、安定した複合体を形成するための負に荷電されたＤＮＡ分子と相互作用すると考えられる、正に荷電したリポソームである。ｐＨ感受性の又は負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合するよりも、ＤＮＡを捕捉すると考えられる。カチオン性及び非カチオン性のリポソームの両方は、細胞にＤＮＡを送達するために使用されてきた。
リポソームはまた、「立体的に安定した」リポソームを含み、該用語は、本明細書に使用されるように、１以上の特異的な脂質を含むリポソームを指す。リポソームに組み込まれると、これらの特異的な脂質は、そのような特異的な脂質を欠くリポソーム対する循環寿命を増強するリポソームを結果としてもたらす。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞形成性脂質部分の一部が１以上の糖脂質を含む、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１以上の親水性ポリマーにより誘導されるものである。リポソーム及びその使用は当該技術分野で周知であり、米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載される。
本発明の医薬製剤及び組成物はまた、界面活性剤を含み得る。薬物製品、製剤、及び乳剤における界面活性剤の使用は、当該技術分野で周知である。界面活性剤及びその使用は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号にて更に記載される。
１つの実施形態において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達を達成するために様々な浸透促進剤を使用する。細胞膜にわたる非親油性薬物の拡散を支援することに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬物の透過性を増強する。浸透促進剤は、５つの広いカテゴリ（即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、非キレート化の非界面活性剤）の１つに属するものとして分類され得る。浸透促進剤及びその使用は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号にて更に記載される。
当業者は、それらの使用目的（即ち、投与経路）に従って製剤が慣例的に設計されることを認識する。
局所投与のための好ましい製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合剤にあるものを含む。好ましい脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイル−ホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、及び陽性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイル−ホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。
局所又は他の投与のため、本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に閉じ込められ、又は、それに対する、特にカチオン性リポソームに対する複合体を形成し得る。代替的に、オリゴヌクレオチドは、脂質、特にカチオン性脂質に複合され得る。好ましい脂肪酸及びそのエステル、薬学的に許容可能な塩、並びにその使用は、米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載される。
経口投与用の組成物及び製剤は、水又は非水性の培地、カプセル剤、ゲルカプセル剤、小袋、錠剤、又はミニ錠剤中に、粉末剤又は果粒剤、微小粒子、ナノ粒子、懸濁液又は溶液を含む。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ ａｉｄｓ）又は結合剤が、望ましい場合もある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１以上の浸透促進剤界面活性剤及びキレート化剤と併用して投与されるものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸及び／又はそのエステル又は塩、胆汁酸及び／又はその塩を含む。好ましい胆汁酸／塩及び脂肪酸並びにそれらの使用は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載される。浸透促進剤の組み合わせ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩も好ましい。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧されて乾燥した粒子を含む粒状の形態で経口送達され、又は微小粒子或いはナノ粒子を形成するために複合され得る。オリゴヌクレオチド錯化剤及びその使用は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載される。
非経口、脊髄腔内、又は脳室内の投与用の組成物及び製剤は、緩衝剤、賦形剤、及び他の適切な添加剤（限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤など）も含み得る無菌の水性溶液を含み得る。
本発明の特定の実施形態は、非アンチセンス機構によって機能する１以上のオリゴマー化合物及び１以上の他の化学療法剤を含む、医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例は、限定されないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、サイトシンアラビノサイド、ビスクロロエチル−ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロ−ホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの、癌の化学療法薬を含む。本発明の化合物と共に使用されると、そのような化学療法剤は、個々に（例えば、５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチドが後続する期間で５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、又は１以上の他のそのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、及びオリゴヌクレオチド、又は、５−ＦＵ、放射線治療、及びオリゴヌクレオチド）使用され得る。抗炎症薬（限定されないが、非ステロイド系抗炎症薬及びコルチコステロイドを含む）、並びに抗ウイルス薬（限定されないが、リバビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン、アシクロビル、及びガンシクロビル）も、本発明の組成物中で組み合わせられ得る。アンチセンス化合物及び他の非アンチセンス薬物の組み合わせも、本発明の範囲内にある。組み合わせた２以上の化合物は、共に又は連続して使用され得る。
別の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第１核酸に標的化される１以上のアンチセンス化合物（特にオリゴヌクレオチド）、及び第２核酸標的に標的化される１以上の追加のアンチセンス化合物を含み得る。例えば、第１標的は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の特定のアンチセンス配列であり、第２標的は別のヌクレオチド配列からの領域であり得る。代替的に、本発明の組成物は、同じ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）核酸標的の異なる領域に標的化される２以上のアンチセンス化合物であり得る。アンチセンス化合物の多数の例が本明細書に例証され、他のものは、当該技術分野で既知の適切な化合物の中から選択され得る。組み合わせた２以上の化合物は、共に又は連続して使用され得る。
＜投薬＞
治療用組成物の製剤及びそれらの後の投与（投薬）は、当業者の能力内にあると考えられる。投薬は、処置される病状の重症度及び反応性に依存し、処置の経過は、数日から数か月まで、又は、治癒される或いは病状の減少が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定から計算され得る。当業者は、最適な投与量、投薬方法、及び反復率を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に依存して異なり、インビトロ及びインビボで動物モデルに効果的であると見出されるＥＣ５０に基づいて、一般的に評価され得る。一般に、投与量は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１０ｍｇまであり、毎日、毎週、毎月、又は毎年に１回以上を、或いは２乃至２０年ごとに一度与えられ得る。当業者は、体液又は組織中の薬物の測定された滞留時間及び濃度に基づく投薬に関する反復率を容易に推定することができる。処置が成功した後、病状の再発を予防するために維持療法を患者に受けさせることが望ましい場合があり、ここで、オリゴヌクレオチドは。体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ乃至１０ｍｇの維持量で、毎日１回以上乃至２−２０年ごとに１回投与され得る。
実施形態において、患者は、体重ｋｇ当たり、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１０ｍｇである、薬物の投与量で処置される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の注入された投与量は、例えば、全体において引用により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６３，８８４号「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＴＰ１Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」に記載される。
本発明の様々な実施形態が上述されてきた一方で、それらは制限無しに、ほんの一例として提示されたことを理解されたい。開示された実施形態への多数の変更は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、本明細書の開示に従って行なわれ得る。故に、本発明の幅及び範囲は、上記の記載された実施形態の何れかによっても制限されるべきでない。
本明細書に言及される全ての文献は、引用により本明細書に組み込まれる。あたかも個々の刊行物又は特許文書が非常に個々に示されるかのごとく、本出願に引用された刊行物及び特許文書は全て、同じ程度まで、全ての目的のために引用により組み込まれる。この文書における様々な引用文献の引用によって、出願人は、任意の特定の引用文献が本発明に対する「先行技術」であることを了承しない。進歩性のある組成物及び方法の実施形態は、以下の実施例にて示される。
以下の制限のない実施例は、本発明の選択された実施形態を示す役目を果たす。示される構成要素の要素における比率及び代案の変更は、当業者に明白であり、本発明の実施形態の範囲内にあることが認識される。
＜実施例１：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び／又はＢＤＮＦポリヌクレオチドのセンス鎖に対する、アンチセンス核酸分子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計＞
上記に示すように、用語「〜に特異的なオリゴヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド標的」は、（ｉ）標的とされた遺伝子の一部を備えた安定した複合体を形成することが可能な、又は（ｉｉ）標的とされた遺伝子のｍＲＮＡの転写の一部を備えた安定した二重鎖を形成することが可能な配列を有する、オリゴヌクレオチドを指す。
適切なオリゴヌクレオチドの選択を、所望の融解温度（通常５０−６０℃）を備えた標的ポリヌクレオチド配列により混成物を形成し、且つセルフダイマー又は他の複合二次構造を形成しない、１９−２５のヌクレオチドの与えられた配列の各々において自動的に識別するコンピュータプログラム（例えば、ＩＤＴ ＡｎｔｉＳｅｎｓｅ Ｄｅｓｉｇｎ， ＩＤＴ ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ）の使用により、促進する。
適切なオリゴヌクレオチドの選択を、核酸配列を自動的に整列し、且つ同一性又は同族性の領域を示すコンピュータプログラムの使用により、更に促進する。そのようなプログラムを使用して、例えばＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースの検索により、又はＰＣＲ生成物をシーケンス解析することにより得られた核酸配列を比較する。遺伝子の範囲からの核酸配列と、与えられたゲノムの遺伝子間領域との比較により、対象の遺伝子への特異性の適切な程度を表示する核酸配列の選択が可能となる。これら手順により、標的核酸配列への高度の相補性、及び与えられたゲノムにおける他の核酸配列への低度の相補性を示す、オリゴヌクレオチドの選択が可能となる。当業者は、本発明における使用に適切な遺伝子の領域の選択において相当な許容範囲が存在することを理解する。
化合物の標的核酸への結合が、機能及び／又は活性の調節を引き起こすために標的核酸の正常機能に干渉すると、アンチセンス化合物は「特異的にハイブリダイズ可能」であり、及び、特異的な結合が所望される条件下（即ち、インビボアッセイ又は治療上の処置の場合における生理学的条件下）、及び、インビトロアッセイの場合にアッセイが実行される条件下で、アンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、当該技術分野で既知の１以上のインビトロアッセイによって決定することができる。例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの特性を、融解曲線アッセイを使用する、標的の天然のアンチセンスと可能な薬物分子との間の結合強度の決定によって得ることができる。
標的の天然のアンチセンスと可能な薬物分子（分子）との間の結合強度を、分子間相互作用の強度を測定する確立された方法の何れか（例えば、融解曲線アッセイ）を使用して推測することができる。
融解曲線アッセイは、二本鎖から単鎖までの構造の急速な推移が、天然のアンチセンス／分子複合体のために生じる温度を決定する。この温度は、２つの分子間の相互作用強度の確実な手段として広く認められている。
実際の天然のアンチセンスＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピー、又は分子の結合部位に対応する合成ＤＮＡ或いはＲＮＡのヌクレオチドを使用して、融解曲線アッセイを行なうことができる。このアッセイを行なうのに必要な試薬を全て含む多数のキットが利用可能である（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ ｋｉｔ）。これらのキットは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合色素（ＡＢＩ ＨＲＭ色素、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯなど）の１つを含む、適切なバッファー溶液を含む。ｄｓＤＮＡ色素の特性は、それらが遊離形態で蛍光をほとんど放射しないが、ｄｓＤＮＡに結合されると高度に蛍光性である、ということである。
アッセイを行うために、ｃＤＮＡ又は対応するオリゴヌクレオチドを、特定の製造業者のプロトコルによって定義される濃度で分子と混合する。混合物を９５℃に加熱し、予め形成したｄｓＤＮＡを全て分離し、その後、室温、或いはキットの製造業者により定義される他の低い温度にまでゆっくりと冷却して、ＤＮＡ分子をアニールする。その後、新しく形成した複合体を９５℃にゆっくり加熱し、同時に連続的に、反応物によってもたらされる蛍光の量に関するデータを収集する。蛍光強度は、反応物に存在するｄｓＤＮＡの量に反比例する。キットに適合するリアルタイムＰＣＲ器具（例えば、ＡＢＩ’ｓ ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｒ ｌｉｇｈｔＴｙｐｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｅｗｅｓ， ＵＫ）を使用して、データを集めることができる。
適切なソフトウェア（例えば、ｌｉｇｈｔＴｙｐｅｒ （Ｒｏｃｈｅ）又はＳＤＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ， ＡＢＩ）を使用して、温度（ｘ軸）に対する温度（ｙ軸上の−ｄ（蛍光）／ｄＴ）に関する蛍光の負の誘導体化をプロットすることにより、融解ピークを構築する。データを分析し、ｄｓＤＮＡ複合体から一本鎖分子までの急速な推移の温度を識別する。この体温をＴｍと呼び、２つの分子間の相互作用の強度に直接比例する。典型的に、Ｔｍは４０℃を超える。
＜修飾したＡｎｔａｇｏＮＡＴ分子の設計：＞
多くのＤＮＡベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計して試験し、ＡｎｔａｇｏＮＡＴと名付け、非コーディングＢｄｎｆ−ＡＳ及び他のアンチセンス転写物を標的とする。２−Ｏ’−メチルＲＮＡ又はＬＮＡで修飾したヌクレオチドを加えた／差し引いた、十分なホスホロチオエート修飾を伴う、又はそれが無い、長さ１２乃至２０ヌクレオチドに及ぶ、様々なＡｎｔａｇｏＮＡＴが設計した。最高の効果を、各々の末端（ＸＸＸｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎＸＸＸ）で３つのＬＮＡで修飾したヌクレオチドを伴う１６−ヌクレオチドホスホロチオエートｇａｐｍｅｒにより、Ｂｄｎｆ ｍＲＮＡのレベルについて観察した。ヒトＢＤＮＦセンス−アンチセンス転写物間の相互作用の遮断のために、ＬＮＡ及び２−Ｏ’−メチルＲＮＡ分子の両方を含む１４−ヌクレオチドのｍｉｘｍｅｒを使用した。これら２−Ｏ’−メチルＲＮＡで修飾したオリゴヌクレオチドは単にＲＮＡを遮断すると示唆されるが、標的とされたＲＮＡの辺縁のダウンレギュレーションを、この実験で観察した（図１１）。これらの研究に使用される他のすべてのｓｉＲＮＡ、プライマー、及びプローブと同様に、様々なＡｎｔａｇｏＮＡＴの配列を、表１に記載する。
＜実施例２：ＢＤＮＦポリヌクレオチドの調節＞
実施例２で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを全て、実施例１に記載されるように設計した。製造業者（ＩＤＴ Ｉｎｃ． ｏｆ Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）に、設計したホスホチオエート結合オリゴヌクレオチドを製造するよう指示し、表１に示される設計したホスホチオエートアナログを提供した。ヌクレオチド間のアスタリスクの指標は、ホスホチオエート結合の存在を示す。ホスホラミダイトモノマー（保護基で保護された全ての活性基（例えば、糖上のトリチル基、Ａ及びＣ上のベンゾイル、並びにＧ上のＮ−２−イソブチリルを備えた、標準のヌクレオチド）を使用して、５ミクロンの制御した細孔ガラスビーズ（ＣＰＧ）などの固形支持体上で、任意の適切な最先端技術の方法（例えばＩＤＴによって使用される方法）を使用して、実施例２における実験に必要なオリゴヌクレオチドを合成することができる。保護基は、オリゴヌクレオチド合成中に不要な反応を予防する。保護基を、合成プロセスの終わりに除去する。初期のヌクレオチドは３’炭素を介して固形支持体に連結し、合成は３’乃至５’の方向に進行する。成長しているオリゴヌクレオチド連結に対する新しい塩基の付加は、４つの工程で行われる：１）トリクロロ酢酸を使用して、固定されたヌクレオチドの５’酸素から保護基を除去する；２）テトラゾールを使用して、固定され且つ次の配列の（ｎｅｘｔ−ｉｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ヌクレオチドを共に結合する；反応は、テトラゾリルホスホラミダイト中間体を介して進行する；３）未反応の遊離ヌクレオチド及び反応副産物を洗い流し、未反応の固定されたオリゴヌクレオチドをキャッピングし（ｃａｐｐｅｄ）、次回の合成におけるそれらの関与を防ぐ；無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールを使用して、遊離５’ヒドロキシルをアセチル化することにより、キャッピングを達成する；４）ヌクレオチド間の結合を安定させるために、リン酸ジエステル結合がもたらされる場合、ヨウ素と水を使用してリンを酸化し、又はホスホチオエート結合が所望される場合、或いはＢｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）を使用してリンを酸化する。２つの酸化剤を交替することによって、キメラの骨格を構築することができる。上述の４工程のサイクルを、配列中の全てのヌクレオチドのために繰り返す。完全な配列を合成する場合、オリゴヌクレオチドを固形支持体から開裂し、高温で水酸化アンモニウムを使用して脱保護する。保護基を脱塩により押し流し、残りのオリゴヌクレオチドを凍結乾燥する。
＜ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの量を定量化するための異なるｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置＞
１．ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃ ＣＲＬ−１５７３）からのＨｅｋ２９３細胞は、３７℃及び５％のＣＯ２で、ＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ｃａｔ ＃ＳＨ３００２４）＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン中で成長した。実験の１日前に、５×１０５／ウェルの密度で細胞を６ウェルのプレートに再度蒔き、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。
２．実験当日、６ウェルのプレートにおける培地を、新鮮なＭＥＭ／ＥＢＳＳ＋１０％ ＦＢＳに変更した。
３．ＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ（ＢＤＮＦ−ＡＳのオリゴヌクレオチドアンチセンス）を全て、２０ｕＭの濃度およびＢＤＮＦ−ＡＳ ｓｉＲＮＡに希釈した（１０ｕＭでのＢＤＮＦ−ＡＳの相補的なｓｉＲＮＡ；両方のオリゴヌクレオチド化合物をＩＤＴによって製造する。１つのウェルに投薬するために、この溶液の２μｌを、２０分間室温で、４００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ＃３１９８５−０７０）及び４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ＃ １１６６８０１９）でインキュベートし、ＨｅｐＧ２細胞を伴う６ウェルのプレートに滴下で加えた。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに２μｌの水を含む同様の混合物を、偽のトランスフェクトした対照に使用した。
４．３７℃及び５％のＣＯ２でのインキュベーションの３−１８時間後、培地を、新鮮なＭＥＭ／ＥＢＳＳ＋１０％のＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシンに変更した。
５．４８時間後、アンチセンスオリゴヌクレオチドの追加を行った。その後、培地を除去し、製造業者の指示に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ＃ Ｚ３１０５）のＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ又はＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃ ７４１８１）のＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。
６．２００−４００ｎｇの抽出されたＲＮＡを、ランダム六量体、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、及び適切なバッファーの２．５ｍＭの混合物を使用して行なわれた逆転写反応物に加えた。この逆転写反応物からのｃＤＮＡ（２０−４０ｎｇ）を使用し、ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）及び３００ｎＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに１５μｌの最終的な反応体積における２００ｎＭのプローブを使用する、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現を監視した。ＦｉｌｅＢｕｉｌｄｅｒのソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、プライマー／プローブを設計した。プライマーは、センス−アンチセンスの対に特異的な鎖であり、プローブは、ゲノムＤＮＡ増幅の可能性をなくすためにエキソン境界を包含した。ヒトＢＤＮＦのためのＡＢＩアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡによる、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ： Ｈｓ００５４２４２５＿ｓ１ （ＢＤＮＦ）であった。以下のＰＣＲサイクルを使用した：２分間５０℃、１０分間９５℃、ＧｅｎｅＡｍｐ ７９００ Ｍａｃｈｉｎｅ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する４０のサイクル（１５秒間９５℃及び１分間６０℃）。処置したサンプルと偽のトランスフェクトしたサンプルとの間の１８Ｓ−標準化ｄＣｔ値における差に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置後の遺伝子発現における倍率変化を計算した。
７．ＢＤＮＦ−ＡＳのためのオリゴの検知：
ＡＢＩアッセイ ＩＤ Ｈｓ００４１７３４５＿ｍｌ
コンテキスト配列ＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＴＡＴＴＡＴＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６５）
８．ＢＤＮＦのためのオリゴの検知：
ＡＢＩアッセイＩＤ Ｈｓ００５４２４２５＿ｓｌ
ＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６６）
ＢＤＮＦ−ＡＳのためのオリゴの検知：
ＡＢＩアッセイＩＤ Ｈｓ００４１７３４５＿ｍｌ
コンテキスト配列ＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＴＡＴＴＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６５）
ＢＤＮＦのためのオリゴの検知：
ＡＢＩアッセイＩＤ Ｈｓ００５４２４２５＿ｓｌ
ＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６６）
９．結果は、サイクル閾（Ｃｔ）値に基づく。ｄｄＣｔとして実験遺伝子と参照遺伝子（１８Ｓ ＲＮＡ）に関するＣｔ値の間の計算された差を、キャリブレータサンプルに対する各ＲＮＡの割合として図示した。
結果：ＢＤＮＦ−ＡＳ転写の重複しない領域を標的とする異なるｓｉＲＮＡを備えたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む、様々なヒト及びマウスの細胞株の形質移入は、４８時間で、ＢＤＮＦ転写（図１ａ及び図６）の２−６倍のアップレギュレーションを示す。ＢＤＮＦのアップレギュレーションは、内在性の対照の選択と関係しなかった（図５ａ−ｂ）。アップレギュレーションは、他のＢＤＮＦの近隣の遺伝子の調整に影響しなかった（図９）。
図５は、ＢＤＮＦ−ＡＳのノックダウンがＢＤＮＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを引き起こすことを示す。ＢＤＮＦ−ＡＳのノックダウンは、ＢＤＮＦ−ＡＳの転写の重複しない領域を標的とするｓｉＲＮＡｓ−１（１０ｎＭ）を使用して、ＢＤＮＦ（センス）ｍＲＮＡ（＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１）の６倍のアップレギュレーションを引き起こした。ここで示される結果を、内在性の対照としてベータアクチン（左のパネル）又は１８Ｓ ｒＲＮＡ（右のパネル）及び参照サンプルとして偽の形質移入を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における実験から得た。この実験は、内在性の対照又は参照のキャリブレータサンプルの選択が、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの観察されたアップレギュレーションを変化させないことを示すように意図される。
図６は、Ｂｄｎｆ発現の転写後調節を示す。ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９標的マウスＢｄｎｆ−ＡＳ転写と、（ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）処理に関係する）ドローシャｓｉＲＮＡ標的ドローシャタンパク質の組み合わせにより、Ｎ２ａ細胞をトランスフェクトした。Ｂｄｎｆ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを、ｍＢｄｎｆ−ＡＮｔａｇｏＮＡＴ９（＊＊＊＝ｐ値＜０．０００１）による細胞の処置後に観察した。ドローシャｓｉＲＮＡの追加は、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９処置（＊＝ｐ値＜０．０５）にわたるＢｄｎｆ転写をわずかに増加させた。この実験は、Ｂｄｎｆ転写の調整においてｍｉＲＮＡなどの、他の転写後の機構の関与を示唆し得る。
図９は、ＢＤＮＦ−ＡＳノックダウンが、ＴｒｋＢ、又は両方向においてＢＤＮＦに隣接する遺伝子（Ｌｅｔ７ＣとＫＩＦ１８Ａ）のレベルを変化させないことを示す：ＬＩＮ７ＣとＫＩＦ１８Ａは、ＢＤＮＦの３’下流及び５’上流のそれぞれに位置する遺伝子である。神経栄養のチロシンキナーゼ、受容体、２型（ＴｒｋＢ）は、ＢＤＮＦのために膜結合型受容体をコード化し、ＢＤＮＦとして異なる染色体（Ｃｈｒ−９）上に位置付けられる。これら遺伝子がＢＤＮＦ−ＡＳ転写の消耗後に変更されたかどうかを決定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、対照のｓｉＲＮＡ又はＢＤＮＦ−ＡＳ ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトし、様々な転写レベルを測定した。ＢＤＮＦ−ＡＳ転写をダウンレギュレートしたこと、及びこの原稿の他の場所で示されるようにＢＤＮＦ ｍＲＮＡをアップレギュレートしたことを、観察した。ＢＤＮＦＡＳのノックダウンは、ＴｒｋＢ発現、又は隣接する遺伝子Ｌｅｔ７Ｃ及びＫＩＦ１８Ａに効果がないことが、分かった。これらデータは、ＢＤＮＦ−ＡＳの消耗後、ＢＤＮＦ発現の位置に特異的な変化があることを示唆する。
＜ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ−ＡＳの量を定量化するための、０−９６時間の時間的経過における１つのｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置＞
伴う方法は、ｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置と同じであるが、今回、オリゴの追加０〜９６時間後に細胞を採取する。結果：ＢＤＮＦ−ＡＳの最適なダウンレギュレーションに対して同時に４８時間でのｓｉＲＮＡによる、ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ−ＡＳ発現の時間的経過は、ＢＤＮＦの最適なアップレギュレーションを示す（図１ｂ）。
＜ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ−ＡＳの量を定量化するための、異なるｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴによるＨｅｋ２９３細胞の処置＞
伴う方法は、ｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置と同じであるが、今回、細胞をＡｎｔａｇｏＮＡＴで処置する。
結果：ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡに対して十分な相補性を有する、２２５のヌクレオチドが重複する領域を含む。ＲＮＡ−ＲＮＡの相互作用は、そのアンチセンス転写物によるＢＤＮＦの不一致な調整の原因であり得る。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡに対するＢＤＮＦ−ＡＳの調節性の役割を決定するために、ＬＮＡ及び２’ＯＭｅ ＲＮＡの修飾物の両方を含むｇａｐｍｅｒ（ＡｎｔａｇｏＮＡＴ）を利用し、センス及びアンチセンスの転写物の間の相互作用を遮断した。ｈＢＤＮＦ−ＡａｔａｇｏＮＡＴをタイリングする（ｔｉｌｉｎｇ）ことにより、重複領域をカバーした。ｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴの使用がＢＤＮＦ ｍＲＮＡをアップレギュレートすることが分かった。ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物の僅かなダウンレギュレーションを観察し、それは、遮断オリゴ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏ）を含む２’ＯＭｅ−ＲＮＡに対して予期されなかった。１６のｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴを試験して、ＢＤＮＦ−ＡＳの重複領域の前半の遮断が、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションにより大きな効果があることが分かった。特に、ｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ１及びｈＢＤＮＦＡｎｔａｇｏＮＡＴ４は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの有意なアップレギュレーションを引き起こした。合成のｓｉＲＮＡと異なり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖であり、長さがより短くなる場合がある；それ故、非特異性の（オフターゲット）結合効果を弱める。単鎖のロックド核酸（ＬＮＡ）修飾オリゴヌクレオチドは一般に、未修飾のｓｉＲＮＡと比較して、インビボでより効果的である（図７）。
＜ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ−ＡＳの量を定量化するための、異なるｍＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴによるマウスＮ２ａ細胞の処置＞
伴う方法は、ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ−ＡＳの量を定量化するための、異なるｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴによるＨｅｋ２９３細胞の処置と同じであるが、今回、細胞はＮ２ａ細胞である。更に、以下のＰＣＲサイクルを使用した：２分間５０℃、１０分間９５℃、ＧｅｎｅＡｍｐ ７９００ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する５０のサイクル（１５秒間９５℃及び１分間６０℃）。
結果として図８は、ＡｎｔａｇｏＮＡＴによる、Ｎ２ａ細胞中のマウスＢｄｎｆ−ＡＳ転写の阻害を示す：ヒトＢＤＮＦのセンス及びアンチセンス転写物の間の重複領域の遮断は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡのレベルをアップレギュレートする。その後、同様の調節機構がマウス細胞株に存在し、マウスＢｄｎｆ−ＡＳ転写物を標的とする１１ ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴを試験したかどうかを決定した。ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴは、３’及び５’の末端の両方にて、ホスホロチオエート骨格及び３つのＬＮＡで修飾したヌクレオチドを含む。対照のオリゴヌクレオチドは、同様の骨格及び修飾物を有するが、哺乳動物ゲノムにおける任意の配列を標的としない。２つのｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ（ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡ３及びｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ−９）は、Ｎ２ａ細胞におけるＢｄｎｆ ｍＲＮＡのレベルを増加させることができた。要するに、単鎖のＡｎｔａｇｏＮＡＴ（１６量体）によるマウスＢｄｎｆ−ＡＳ転写物の遮断が、マウスＮ２ａ細胞におけるＢｄｎｆ ｍＲＮＡのレベルのアップレギュレーションを引き起こした。これらデータは、Ｂｄｎｆのアンチセンス転写物がＢｄｎｆ ｍＲＮＡに対して鎮静効力のある効果を発揮することを示唆する。
＜ＢＤＮＦタンパク質を定量化するための、異なるｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置＞
伴う方法は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの量を定量化するための、異なるｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置と同じであるが、ｓｉＲＮＡの追加の４８時間後に行なわれる工程５を除く。その後、培地を除去し、細胞を分裂させ、ＢＤＮＦタンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡ（図１ｃ）及びウェスタンブロット（図１ｄ）によって定量化した。
ウェスタンブロット：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｎＭのＢＤＮＦ−ＡＳ、又は対照のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。３５０ｍＭのＤＴＴを含む２００μｌのＬａｅｍｍｌｉのサンプルバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）による形質移入の４８時間後、細胞を分裂した。２０μｌの溶解産物を１０％のＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、一晩、それをニトロセルロース膜に移送した。その後、ＨＲＰに共役する、ＭｅｃＰ２（Ａｂｃａｍ）、ＢＤＮＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ（カタログ番号Ｇ１６４Ｂ））、及び二次抗体のための主要な抗体により、細胞膜をインキュベートした。ＨＲＰ基質の追加後、化学発光の信号をＸ線フィルムで検知した。同じ細胞膜を取り除き、負荷対照（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてβ−アクチンの検知のために再使用した。
ＥＬＩＳＡ：対照を、２０ｎＭのｓｉＲＮＡ又は対照のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞上清を、ＥＬＩＳＡ実験のために集めた。代替的に、プロテアーゼ阻害剤（ＢＣＡ ｋｉｔ， Ｆｉｓｈｅｒ）を加えたタンパク質抽出バッファーに埋め込まれるマウスの脳組織から、総タンパク量を抽出し、ｂｉｏｒｕｐｔｏｒと金属ビーズにより均質化した。ＢＣＡタンパク質測定キット（Ｐｉｅｒｃｅのカタログ番号２３２２７）を使用して、総タンパク量を測定し、サンプル負荷を総タンパク量濃度に標準化した。ＥＬＩＳＡキットを、ＰｒｏｍｅｇａのヒトＢＤＮＦ（カタログ番号Ｇ７６１１）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅのマウスＢｄｎｆ（カタログ番号ＣＹＴ３０６）から購入し、ＥＬＩＳＡを供給者のプロトコルに従って行なった。バックグラウンドから４５０ｎｍで３回繰り返して平均吸収を差し引き、対照サンプルに標準化した。
＜ＢＤＮＦ ｍＲＮＡを定量化するための、異なる濃度のｍＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９によるＨｅｋ２９３細胞（確かでない）の処置＞
伴う方法は、工程３を除く、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの量を定量化するための、異なるｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置と同じであり、ここで、同じ量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ＃３１９８５−０７０）を使用して、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの量を定量化するための異なるｓｉＲＮＡによるＨｅｋ２９３細胞の処置と同じ相対的な量のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ＃ １１６６８０１９）を使用して最終の１１の異なる濃度が細胞（３００ｎＭから５ｐＭまで及ぶ１：３の連続希釈）に適用されるように、全てのｍＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９は異なる濃度に希釈された。これを室温で２０分間行い、ＨｅｐＧ２細胞を伴う６ウェルのプレートの１つのウェルに滴下で加えた。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水を含む同様の混合物を、偽のトランスフェクトした対照に使用した。結果：図１ｅにおいて示されるように、ＢＤＮＦ−ＡＳがｍＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９によって標的とされる場合、ＢＤＮＦの用量依存性のアップレギュレーションが存在する。
図１は、センスｍＲＮＡ及びタンパク質の、アンチセンスを媒介とした調整を示す。（Ａ）ＢＤＮＦ−ＡＳ転写の重複しない領域を標的とする３つの独特なｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）の各々を備えるＨＥＫ２９３Ｔ細胞（処置につきｎ＝１２）における、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）天然アンチセンス転写物（ＢＤＮＦ−ＡＳ）のノックダウンは、ＢＤＮＦ（センス）ｍＲＮＡの２−６倍のアップレギュレーションを引き起こした（各々のデータポイント／処置に関してｎ＝６ ＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＝Ｐ＜０．０１）。同様の結果を、ヒト皮質ニューロン（ＨＣＮ）、グリア芽腫（ＭＫ０５９）細胞、マウスＮ２ａ細胞、及びニューロスフェアを使用する実験から得た（データは示さず）。組み換えた配列、偽の形質移入、及び対照のｓｉＲＮＡを、対照として使用した。この及び他の実験のための対照のｓｉＲＮＡは、哺乳動物ゲノムにおける任意の既知の配列を標的としない、不活性なｓｉＲＮＡ（ＣＣＵＣＵＣＣＡＣＧＣＧＣＡＧＵＡＣＡＴＴ）である。全ての測定を、１８Ｓ ｒＲＮＡに標準化し、負のｓｉＲＮＡの対照サンプルに対する各ｍＲＮＡの割合として図示した。
（Ｂ）ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ−ＡＳの転写物における変化を、ＢＤＮＦ−ＡＳのノックアウト（各データポイント／処置に関してｎ＝６）の後、一定期間評価した。ヒトＢＤＮＦ−ＡＳのｓｉＲＮＡのノックダウンは、６時間で始まり７２時間まで続く、ＢＤＮＦ−ＡＳの効率的で一貫したダウンレギュレーションを結果としてもたらした。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡのレベルは１８時間で上昇し、７２時間より多くの間は高いままであり、９６時間で処置前のレベルに戻った。４８時間でのピークが一貫しており、複製可能であることに注意する。ＢＤＮＦ−ＡＳのノックダウンは６時間後に始まるが、ＢＤＮＦのアップレギュレーションは処置の１８時間後に始まった。ＢＤＮＦ−ＡＳの消耗と、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの増加との間のこのタイムラグは、ＢＤＮＦをアップレギュレートする前にアンチセンス転写物の除去に適合する時間を細胞が必要とすることを示す事象の順序を示す。
（Ｃ）ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物の、ｓｉＲＮＡを媒介とするノックダウンは、ＥＬＩＳＡによって測定されたＢＤＮＦタンパク質レベルの増加を引き起こした。４８時間、ＢＤＮＦ−ＡＳ、組み換えたｓｉＲＮＡ、又は対照のｓｉＲＮＡのために、１０ｎＭの２つの活性なｓｉＲＮＡで、細胞をトランスフェクトした。これら細胞の上清を濃縮し、市販で入手可能なキットを使用して、ＥＬＩＳＡによってＢＤＮＦタンパク質について分析した。ＢＤＮＦタンパク質を、ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物を標的とするｓｉＲＮＡにより有意に増加した（処置につきｎ＝６、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１、＊＊＝Ｐ＜０．００１）。
（Ｄ）ウェスタンブロットは、ＢＤＮＦ−ＡＳ ｓｉＲＮＡ１による、非タンパク質コード化ＢＤＮＦ−ＡＳのノックダウンだけでなく、対照の非標的ｓｉＲＮＡ転写物が、ベータアクチンのレベルを変化させることなくＢＤＮＦタンパク質レベルを増加させたことを確認した。総じて、これらデータは、ＢＤＮＦ−ＡＳがＢＤＮＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を抑止する、センス及びアンチセンスのＢＤＮＦ転写物の間に不調和な関係が存在することを示唆する。この負の調節作用の除去は、ＢＤＮＦ−ＡＳノックダウンにより、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルのアップレギュレーションを引き起こす。
（Ｅ）Ｂｄｎｆ−ＡＳの消耗後のＢｄｎｆにおける用量依存性の増加：ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９（データポイント／処置につきｎ＝６）の１１の異なる濃度（３００ｎＭから５ｐＭまで及ぶ１：３の連続希釈）を使用して用量応答実験を行い、用量依存性の増加を、６．６ｎＭのＥＣ５０を伴う１−３００ｎＭの濃度でのＢｄｎｆ ｍＲＮＡのレベルで観察した。
＜ｓｉＲＮＡによる海馬のニューロスフェアの処置＞
ニューロスフェアにおけるマウスの海馬の神経幹細胞の解剖：神経細胞の幹細胞を、マウスの子の海馬、Ｐ０−Ｐ１から分離した。海馬を、単離細胞へ機械的に分離し、短い回転によって収集し、グルタミン、抗生物質、Ｂ２７溶液、及び０．００１ｍＭの濃度のＥＧＦとＦＧＦの両方を含む、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物において成長させた。３−４日後、流動するニューロスフェアが生じた。１００，０００の細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）でコーティングされた２４ウェルのプレートに蒔いた。ニューロスフェア細胞のＰＬＬ上への平板培養によって分化プロセスを始める。平板培養後３日目に、成長因子を培地から除去し、細胞を更に４日間（平板培養後７日）、成長させた。この時点まで、細胞培養は、星状細胞、ニューロン、乏突起膠細胞、及び成熟した脳組織に更に類似させるそれらの前駆細胞から成る神経系細胞系統の混合物を有していた。Ｂｄｎｆ及びＢｄｎｆ−ＡＳの発現を、培養物を蒔いて３及び７日後と同様に、流動するニューロスフェア中で測定した。平板培養の３又は７日後に、Ｂｄｎｆ−ＡＳ転写を標的とする５０ｎＭのｓｉＲＮＡ又は２０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの何れかを使用して、ノックダウン実験を行なった。神経幹細胞も、８０μｌの全容積で免疫細胞化学チャンバ（１つのウェル当たり１８，０００の細胞）に蒔かれる。その後、マウスの主要細胞に対するＢｄｎｆ−ＡＳノックダウンの機能効果を評価するために、同じプロトコルを使用して、ニューロスフェアをトランスフェクトした。４８−７２時間後、細胞を２０分間パラホルムアルデヒド（４％）で固定し、１Ｘ ＰＢＳで数回洗浄した。ＦＢＳによる遮断後、ニューロスフェアを一晩、１：２０００の濃度で、主要な抗体（モノクローナルのウサギβチューブリンＩＩＩ、ＴＵＪ１）によりインキュベートした。固定した細胞を、二次抗体でインキュベートし、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ５６８（１：５０００の濃度で、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌ）で標識化した。核をヘキスト染色により染色した。免疫蛍光抗原検出顕微鏡検査によって画像を得た。
＜ＡｎｔａｇｏＮＡＴによるＢＤＮＦ−ＡＳの標的化：＞
用語「ＡｎｔａｇｏＮＡＴ」は、センス−アンチセンスの相互作用を阻害する単鎖オリゴヌクレオチド分子を説明するために、本明細書で使用される（異なる修飾物と共に、補足の方法を参照）。単鎖ｇａｐｍｅｒを設計し、オリゴヌクレオチド、長さが１４ヌクレオチド、２’Ｏ−メチルＲＮＡ及び／又はロックド核酸（ＬＮＡ）修飾を伴う。この方策を使用し、我々は、ヒトＢＤＮＦ−ＡＳとＢＤＮＦ転写物の間の重複領域全体にタイリングし（ｔｉｌｅｄ）、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡをアップレギュレートすることができる様々な効果的なＡｎｔａｇｏＮＡＴを識別した。重複領域の第１部分を標的とするｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ１及びｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ４は、最大の反応をもたらした。データは、ＢＤＮＦアンチセンスＲＮＡの遮断が、単鎖のＡｎｔａｇｏＮＡＴによって、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの増加を引き起こすのに十分であることを示唆する。
その後、単鎖ｇａｐｍｅｒが設計され、ＬＮＡ修飾した、長さが１５ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＡｎｔａｇｏＮＡＴ）１６−ヌクレオチドは、マウスＢｄｎｆ−ＡＳに相補的なホスホロチオエート骨格を伴う。２つのＡｎｔａｇｏＮＡＴ（ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ３及びｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９）は一貫して、マウスＮ２ａ細胞におけるＢｄｎｆ ｍＲＮＡのレベルの統計的に有意な増加を示した（図７）。
図７は、ｈＢＤＮＦＡｎｔａｇｏＮＡＴによるヒトＢＤＮＦ−ＡＳ転写の阻害を示す：ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡに対して十分な相補性を有する、２２５のヌクレオチドが重複する領域を含む。ＲＮＡ−ＲＮＡの相互作用は、そのアンチセンス転写物によるＢＤＮＦの不一致な調整の原因であり得る。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡに対するＢＤＮＦ−ＡＳの調節性の役割を決定するために、ＬＮＡ及び２’ＯＭｅ ＲＮＡの修飾物の両方を含むｇａｐｍｅｒ（ＡｎｔａｇｏＮＡＴ）を利用し、センス及びアンチセンスの転写物の間の相互作用を遮断した。ｈＢＤＮＦ−ＡａｔａｇｏＮＡＴにタイリングすることにより重複領域をカバーした。ｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴの使用がＢＤＮＦ ｍＲＮＡをアップレギュレートすることが分かった。ＢＤＮＦ−ＡＳ転写物の僅かなダウンレギュレーションを観察し、それは、遮断オリゴを含む２’ＯＭｅ−ＲＮＡに対して予期されなかった。１６のｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ（以下に提供される配列を各々伴う１４量体）を試験して、ＢＤＮＦ−ＡＳの重複領域の前半の遮断が、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションにより大きな効果があることを見出した。特に、ｈＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ１及びｈＢＤＮＦＡｎｔａｇｏＮＡＴ４は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの有意なアップレギュレーションを引き起こした。合成のｓｉＲＮＡと異なり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖であり、長さがより短くなる場合がある；それ故、非特異性の（オフターゲット）結合効果を弱める。単鎖のロックド核酸（ＬＮＡ）で修飾したオリゴヌクレオチドは一般に、未修飾のｓｉＲＮＡと比較して、インビボでより効果的である。Ｂｄｎｆアップレギュレーションは神経細胞の成長を増加させる。
＜Ｂｄｎｆアップレギュレーションは神経細胞の成長を増加させる：＞
神経細胞の成長及び成体の神経新生１６−１７に対するＢｄｎｆの促進作用を示す、多くの以前の報告と一致して、Ｂｄｎｆ−ＡＳ転写のノックダウンによる内在性のＢｄｎｆレベルにおける増加は、神経細胞数の増加、及び、ニューロスフェア中に蒔いて３及び７日後に神経突起伸長及び成熟を、結果としてもたらしたことが分かった（図５ａ−ｄ）。これらデータは、アンチセンスＲＮＡの阻害のために、内在性のＢｄｎｆのアップレギュレーションが、神経細胞の前駆細胞において神経分化を誘発し、初期の神経細胞において成熟した表現型を引き起こし得ることを示唆する。
結果：図２は、Ｂｄｎｆアップレギュレーションが、神経細胞の成長を増加させ（Ａ−Ｂ）、平板培養の３日後に、対照のｓｉＲＮＡ（Ａ）又はＢｄｎｆ−ＡＳ ｓｉＲＮＡ（Ｂ）の何れかで処置した海馬のニューロスフェアの免疫細胞化学の画像を増加させることを示す。（Ｃ−Ｄ）平板培養の７日後の、対照のｓｉＲＮＡ（Ｃ）又はＢｄｎｆ−ＡＳ ｓｉＲＮＡ（Ｄ）の何れかで処置した海馬のニューロスフェアにおける、神経細胞の成熟及び神経突起伸長の免疫細胞化学の画像。Ｂｄｎｆ−ＡＳ転写物を標的とするｓｉＲＮＡによる細胞の処置は、ニューロスフェアの平板培養の３又は７日後、神経突起伸長と成熟の増加と同様、神経細胞数の増加を結果としてもたらした。Ｂ−チューブリンＩＩＩを赤に染色し、ＧＦＡＰを緑に染色し、ＤＡＰＩを青に染色した。
＜浸透圧によるミニポンプのノックダウンＢＤＮＦ−ＡＳ及びアップレギュレートＢＤＮＦを使用する、ｍＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９の脳室内（ＩＣＶ）の送達＞
マウス研究：１０匹の８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスをインビボ実験に使用した。４週間、１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄの投与量でＢｄｎｆ−ＡＳ（ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９）又は対照のオリゴヌクレオチド（ヒト又はマウスに存在しない不活性配列）に対して配向される合成のアンチセンスオリゴヌクレオチドの持続注入（０．１１マイクロリットル／ｈ）を送達した、浸透圧ミニポンプが皮下に注入された背側の第三脳室において、マウスを慢性の留置用カニューレで調製した。細管を浸透圧ミニポンプの出口ポートに接続し、留置用カニューレを皮下に通して、結果、処置を脳に直接送達した。注入の５日後、動物はすべて、連続して５日間、ＢｒｄＵ（８０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ＩＰ）注入を毎日受けた。手術の２８日後に、動物を屠殺し、３つの組織を、定量的ＲＮＡ測定用の各マウスの脳から切除した（海馬、前頭皮質、及び小脳）。
＜Ｂｄｎｆ−ＡＳのノックダウンはインビボでＢｄｎｆを増加させる：＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９の脳室内（ＩＣＶ）送達用の浸透圧ミニポンプを利用した。その後、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９を選択し、それは、インビトロでＢｄｎｆ ｍＲＮＡを増加する、その高度な効果に基づき、他の活性なＡｎｔａｇｏＮＡＴ上で、マウスＢｄｎｆ−ＡＳの非重複領域を標的としている。連続的なＡｎｔａｇｏＮＡＴ注入の２８日後、Ｂｄｎｆ ｍＲＮＡのレベルは、不活性の対照オリゴヌクレオチドによって変更しないレベルと比較して、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスの第三脳室に隣接している前脳領域にわたって、増加された（図３ａ、ｂ）。Ｂｄｎｆ及びＢｄｎｆ−ＡＳの転写物は、視床下部（第三脳室に直に隣接していない構造）において不変であった（図３ｃ）。更に、Ｂｄｎｆ−ＡＳのＡｎｔａｇｏＮＡＴを媒介とした遮断が、Ｂｄｎｆタンパク質レベルを結果として増加させたことが分かった（図３ｄ、ｅ）。これらの結果は、上記のインビトロのデータに相当し、Ｂｄｎｆ−ＡＳの遮断がインビボでのＢｄｎｆ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の増加を結果としてもたらすことを示す。
ＲＮＡ抽出及びマウス脳サンプルのＲＴ−ＰＣＲ：２８日後にマウスを屠殺し、脳を切除した。各マウスからの１つの半脳（ｈｅｍｉｂｒａｉｎ）を、組織学的研究のために４％のホルムアルデヒド中で一晩固定した。別の半脳を、ＲＮＡ定量的測度のために、海馬、前頭皮質、及び小脳から切除した。製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌの試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， １５５９６−０２６）における均質化後に、ＲＮＡを抽出した。水相を分離し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカラム（ＱＩＡＧＥＮ、７４１０６）にサンプルを通す前に７０％のエタノールの等量を加え、それらＲＮＡサンプルを、ＤＮＡ汚染物の除去のために、オンカラムＤＮＡｓｅ処置に曝した。４００ｎｇの各サンプルを、第１鎖のｃＤＮＡ合成に使用し、ＲＴ−ＰＣＲ測定を行った。パーセンタイル変化を、各グラフにおいて、対照マウスと比較した個々の組織についてＲＮＡレベルでプロットした。
結果：図３は、Ｂｄｎｆ−ＡＳがインビボでＢｄｎｆ ｍＲＮＡ及びタンパク質を調節することを示す；（Ａ−Ｃ）浸透圧のミニポンプを使用し、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９（ＣＡＡＣＡＴＡＴＣＡＧＧＡＧＣＣ）又は対照オリゴヌクレオチド（ＣＣＡＣＧＣＧＣＡＧＴＡＣＡＴＧ）を、マウスの脳の第三脳室に、２８日の期間にわたり絶えず注入した（処置群につきｎ＝５ ＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１）。対照オリゴヌクレオチドではなく、Ｂｄｎｆ−ＡＳに向けられるｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９が、海馬（Ａ）及び前頭皮質（Ｂ）のＢｄｎｆレベルの増加を結果としてもたらした。視床下部（Ｃ）において、脳の第三脳室に直接接続されない組織が予測されたため、両方の転写は不変であった。（Ｄ−Ｅ）ＢＤＮＦタンパク質レベルをＥＬＩＳＡによって評価し、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９の処置が、対照オリゴヌクレオチドで処置したマウスと比較して、海馬（Ｄ）及び前頭皮質（Ｅ）の両方においてＢＤＮＦタンパク質の増加を結果としてもたらしたことが分かった。
＜浸透圧によるミニポンプのノックダウンＢＤＮＦ−ＡＳ及びアップレギュレートＢＤＮＦを使用する、ｍＢＤＮＦ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９の脳室内（ＩＣＶ）の送達＞
５日間、研究の第１週に、ＢｒｄＵをｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスに注入した。連続的なＡｎｔａｇｏＮＡＴ注入の２８日後、脳組織の組織学的検査を行い、ニューロンの増殖を定量化し、Ｋｉ６７及びＢｒｄＵマーカーをそれぞれ使用して生存させた。ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスにおいて、対照の処置したマウスと比較して、増加をＫｉ６７陽性（増殖）細胞において観察した（図４ａ、ｂ）。Ｋｉ６７陽性細胞の数を定量化し、細胞増殖の有意な増加を、対照のオリゴヌクレオチドと比較したｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスにおいて見出した（図４ｃ）。ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスにおいて、対照オリゴヌクレオチドで処置したマウスと比較して、ＢｒｄＵ取り込み（生存細胞）において有意な増加が存在した（図４ｄ）。対照とｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスとの間の海馬体積における差は存在しなかった（図４ｅ）。これら結果は、Ｂｄｎｆ−ＡＳがインビボでＢｄｎｆレベルを調整することを実証する。
結果：図４は、Ｂｄｎｆ−ＡＳの遮断が、インビボで、神経細胞の生存及び増殖の増加を引き起こすことを示す；（Ａ−Ｂ）マウスを、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９又は対照のオリゴで処置した。連続的なｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９注入の２８日後、Ｋｉ６７を使用して脳組織の組織学的検査を行なった。Ｋｉ６７は海馬における増殖細胞のマーカーであり、増殖細胞の数の増加を、対照のオリゴを受けたマウスと比較して、Ｂｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ処置を受けたマウスにおいて観察した。ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９（Ｂ）で処置したマウスにおいて、対照の処置したマウス（Ａ）と比較して、Ｋｉ６７陽性細胞（増殖細胞）の増加が存在した。（Ｃ）対照で処置したマウスと比較して、ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスには、Ｋｉ６７陽性細胞の数の有意な増加があった。（Ｄ）ｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスにおいて、対照オリゴヌクレオチドで処置したマウスと比較して、生存細胞（ＢｒｄＵ陽性）の数の有意な増加があった。（Ｅ）対照とｍＢｄｎｆ−ＡｎｔａｇｏＮＡＴ９で処置したマウスとの間の海馬体積における差は存在しなかった。共に、これらデータ（処置群につきｎ＝５ ＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１）は、Ｂｄｎｆ−ＡＳがインビボでＢｄｎｆのレベルを調節すること、及び、Ｂｄｎｆセンス−アンチセンスの相互作用の遮断が、神経細胞系、増殖、及び生存の増加を結果としてもたらすことを、実証する。
本発明は、１以上の実施に関して例示され且つ記載されてきたが、本明細書及び添付図面の読み取り及び理解により、他の当業者は同等の変更及び修正を相当するであろう。加えて、本発明の詳細な特徴が様々な実施のほんの１つに関して開示されてきた一方で、そのような特徴は、任意の与えられた又は特定の用途のために所望され且つ都合がよいため、他の実施の１以上の他の特徴と組み合わせられ得る。
本開示の要約は、読者が技術的な開示の性質を素早く確認することを可能にする。それは、以下の請求項の範囲又は意味を解釈する或いは制限するためには使用されないという理解と共に提出される。

Claims (18)

  1. 生物系において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートするための医薬製剤の製造における少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、前記使用は、
    前記生物系を前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１０乃至３０ヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドの２２５ヌクレオチドの重複領域において、前記天然アンチセンスポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の相補性があり、特異的にハイブリダイズし、および、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１９、２０、２３、２４、２７、２９および３０のいずれか１つの配列を有する、使用。
  2. インビトロまたはインビボでの患者の細胞または組織において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートするための医薬製剤の製造における少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、前記使用は、
    前記患者の細胞または組織を前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１０乃至３０ヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドの２２５ヌクレオチドの重複領域において、前記天然アンチセンスポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の相補性があり、特異的にハイブリダイズし、および、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１９、２０、２３、２４、２７、２９および３０のいずれか１つの配列を有する、使用。
  3. 患者において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートするための医薬製剤の製造における少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、前記使用は、
    前記患者に前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を含み、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１０乃至３０ヌクレオチドであり、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドの２２５ヌクレオチドの重複領域において、前記天然アンチセンスポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の相補性があり、特異的にハイブリダイズし、および、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１９、２０、２３、２４、２７、２９および３０のいずれか１つの配列を有する、使用。
  4. 前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された糖部分、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組み合わせから選択される１つ以上の修飾を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の使用。
  5. 前記１つ以上の修飾は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾された糖部分、２’−メトキシ修飾された糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾された糖部分、二環式糖部分、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項４に記載の使用。
  6. 前記１つ以上の修飾は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、炭酸塩、ホスホトリエステル、アセタミダート、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結を含む、請求項４に記載の使用。
  7. 前記１つ以上の修飾は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アラビノ‐核酸（ＦＡＮＡ）、アナログ、誘導体、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項４に記載の使用。
  8. 前記天然アンチセンスポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１乃至１２７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１乃至１４７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至１４３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１乃至２３２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１乃至２０３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１乃至２３６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１乃至９０６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の１乃至９９２のヌクレオチドからなる群から選択される配列から本質的になる配列を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の使用。
  9. 前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１９、および２３の１つの配列を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の使用。
  10. 神経細胞の生存、神経細胞の増殖、またはその両方はアップレギュレートされる、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の使用。
  11. ＢＤＮＦポリヌクレオチドの発現は、海馬、前頭皮質、またはその両方においてアップレギュレートされる、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の使用。
  12. 少なくとも１つの修飾を含む、長さが１２乃至３０ヌクレオチドの合成の修飾オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの修飾は、少なくとも１つの修飾された糖部分、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組み合わせから選択され、前記オリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンス化合物であり、正常対照と比較して、インビボまたはインビトロでの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子の発現をアップレギュレートし、前記オリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドの２２５ヌクレオチドの重複領域において、前記天然アンチセンスポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の相補性があり、特異的にハイブリダイズし、および、前記オリゴヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１９、２０、２３、２４、２７、２９および３０のいずれか１つの配列を有する、オリゴヌクレオチド。
  13. 前記天然アンチセンスポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１乃至１２７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１乃至１４７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至１４３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１乃至２３２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１乃至２０３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１乃至２３６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１乃至９０６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の１乃至９９２のヌクレオチドからなる群から選択される配列から本質的になる配列を有する、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 請求項１２または１３に記載の少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドを含む、インビボまたはインビトロでの患者の細胞または組織において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートするための組成物。
  15. 請求項１３または１４に記載の少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドを含む、生物系において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートするための組成物。
  16. 請求項１３または１４に記載の少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドを含む、患者において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ポリヌクレオチドの発現に関係する疾患を処置するための組成物。
  17. 神経細胞の生存、神経細胞の増殖、またはその両方はアップレギュレートされる、請求項１２または１３に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載の組成物。
  18. ＢＤＮＦポリヌクレオチドの発現は、海馬、前頭皮質、またはその両方においてアップレギュレートされる、請求項１２または１３に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載の組成物。
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