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JP6783886B2 - 抗ctla4モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用 - Google Patents

抗ctla4モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用 Download PDF

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Description

本発明は、腫瘍治療および分子免疫学の分野に属する。本発明は、抗CTLA4モノク
ローナル抗体またはその抗原結合断片、それらの医薬組成物、それらのコード配列および
前記のものを使用した、診断、予防、治療および/または補助療法の方法およびそれらに
おける使用に関する。
細胞傷害性Tリンパ球結合抗原4(CTLA4と略される。)は、遺伝子構造、染色体
位置、配列相同性および遺伝子発現においてCD28分子と非常に密接な関係を有する。
これらは両者とも、活性化T細胞の表面上で主に発現される同時刺激性分子B7に対する
受容体である。しかし、リンパ球活性化の同時刺激シグナルとして、CTLA4は、CD
28とは反対の機能を有する。B7への結合後、CTLA4は、マウスおよびヒトT細胞
の活性化を阻害し得、T細胞の活性化における負の制御の役割を果たす。
CTLA4 mAbまたはCTLA4リガンドは、CTLA4がそのネイティブリガン
ドに結合するのを防ぎ得、それによってCTLA4によるT細胞負制御シグナルの伝達を
阻止し、様々な抗原へのT細胞の応答性を促進する。この点において、インビボおよびイ
ンビトロ実験からの結果は、実質的に呼応している。現在のところ、いくつかのCTLA
4 mAb(10D1、11.2.2)が、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌、
肝臓癌、悪性メラノーマなどを処置することについて、臨床治験で試験されている(CT
LA−4 blockade in tumor models:an overvie
w of preclinical and translational resea
rch.Grosso JF.,Jure−Kunkel MN.,Cancer Im
mun.2013;13:5.Epub 2013 Jan 22;米国特許第6984
720号明細書;および米国特許第6682736号明細書)。とりわけ、10D1およ
び11.2.2は、最良の効果を有する抗CTLA4モノクローナル抗体とみなされる。
インターロイキン2(IL−2)はT細胞により産生される。これはT細胞のサブグル
ープを制御する増殖因子(factore)である。これは、免疫反応を調整する重要な
因子でもある。これは、B細胞の増殖を促進し、活性化し得、抗体反応、血球新生および
腫瘍監視に関連する。組み換えヒトIL−2は、悪性腫瘍(メラノーマ、腎臓腫瘍などを
含む。)の処置について米国FDAにより承認されている。これは、慢性ウイルス感染を
処置する臨床治験中でもある(Pharmacologic administrati
on of interleukin−2.Chavez,A.R.ら、Ann N Y
Acad Sci,2009.1182:14−27)。
T細胞の機能に影響を及ぼす重要な因子として、CTLA4およびCTLA4 mAb
は、身体中の免疫微小環境に干渉することによって疾患において特定の治療効果を生み出
し得る。これらは、高い効力を有し、従来の投薬の欠陥を修正し、遺伝子治療の新規経路
を開く。CTLA4およびCTLA4 mAbは、実験および臨床治験の様々なステージ
で試験されている。例えば、自己免疫疾患において、これらは、喘息の動物モデルにおい
て気道過敏症を効果的に抑制し、リウマチ疾患の発症を防ぎ、身体において同種移植片へ
の免疫寛容に介在するなどした。一方で、生物学的遺伝子治療は短期臨床治験で悪影響が
全く示されなかったものの、長期適用後の潜在的影響に注意を払うべきである。例えば、
CTLA4 mAbによるCTLA4−B7シグナル伝達の過剰な阻止の結果、自己免疫
疾患を発症し得る。抗体はそれらのリガンドに特異的に結合し、標的細胞の溶解を誘導す
るか、または病態の進行を阻止し得るので、抗体、特にヒト化抗体に基づく薬物の開発お
よび利用は、ヒトにおける悪性腫瘍および他の免疫疾患の臨床処置において重要な意義を
有する。
現在、B7へのCTLA4の結合を阻止する新規抗体およびそれらのヒト化抗体を開発
する必要がなお存在する。
米国特許第6984720号明細書 米国特許第6682736号明細書
Grosso JF.,Jure−Kunkel MN.,Cancer Immun.2013;13:5.Epub 2013 Jan 22 Chavez,A.R.ら、Ann N Y Acad Sci,2009.1182:14−27
発明者らによる集中的な研究および独創的な取り組みの後、哺乳動物細胞発現系を用い
て組み換えCTLA4を発現させ、免疫マウスへの抗原として使用した。マウス脾臓細胞
を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を得た。発明者らによる非常に
多くの試料のスクリーニング後、CTLA4に特異的に結合し、B7へのCTLA4の結
合を非常に効率的に阻止し得る特異的なモノクローナル抗体を分泌し、産生することが可
能なハイブリドーマ細胞株を得た。さらに、ヒト化抗体を作製した。したがって、次の発
明を提供する。
本発明のある態様は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関し、ここで、
本モノクローナル抗体は、
配列番号27のアミノ酸配列を含むHCDR1、
配列番号28のアミノ酸配列を含むHCDR2および
配列番号29のアミノ酸配列を含むHCDR3、
および/または
配列番号30のアミノ酸配列を含むLCDR1、
配列番号31のアミノ酸配列を含むLCDR2および
配列番号32、配列番号33および配列番号34から選択されるアミノ酸配列を含むL
CDR3
から選択される相補性決定領域(CDR)を含む。
本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で
あって、
本モノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号6、配列番
号10、配列番号14および配列番号18から選択され;
および/または
本モノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号8、配列番
号12、配列番号16、配列番号20、配列番号22および配列番号24から選択される
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で
あって、本モノクローナル抗体は、
(1)配列番号6で規定されるVHおよび配列番号8で規定されるVL;
(2)配列番号10で規定されるVHおよび配列番号12で規定されるVL;
(3)配列番号14で規定されるVHおよび配列番号16で規定されるVL;
(4)配列番号18で規定されるVHおよび配列番号20で規定されるVL;
(5)配列番号14で規定されるVHおよび配列番号22で規定されるVL;または
(6)配列番号14で規定されるVHおよび配列番号24で規定されるVL
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
本発明において、上記の群(1)から(6)は、それぞれ8D2/8D2(Re)、8
D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L
17の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
具体的に、配列番号6、配列番号10および配列番号14の位置18のメチオニン(M
et)は、独立に、ロイシン(Leu)、バリン(Val)、イソロイシン(Ile)ま
たはアラニン(Ala)から選択されるアミノ酸で置換される。
抗体、特にモノクローナル抗体(MAB)に基づく治療薬は、一部の疾患の処置におい
て優れた効能を達成した。このような治療用抗体を得るための従来法は、抗原で動物に免
疫付与し、免疫付与動物からの抗原に対する抗体を得ること、または親和性成熟によって
抗原に対する親和性が低い抗体を改善することである。しかし、このような方法は、時間
がかかり、労力を要し、抗原上の特異的なエピトープを標的とすることができないことが
多い。
抗原結合は、軽鎖および重鎖の可変領域に依存し;各鎖の可変領域は、相補性決定領域
(CDR)とも呼ばれる3個の超可変領域を含む(重鎖(H)はHCDR1、HCDR2
およびHCDR3、軽鎖(L)はLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み;定義
については、Kabatら、Sequences of Proteins of Im
munological Interest,Fifth Edition(1991)
,Vol.1−3,NIH Publication 91−3242,Bethesd
a Mdを参照のこと。)。
当業者にとって周知の技術的手段によって、例えばVBASE2データベース分析によ
って、上記実施形態(1)から(6)のモノクローナル抗体配列におけるCDRのアミノ
酸配列を分析した。結果を以下で提供する。
(1)重鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
HCDR1:GFTFSDNW (配列番号27)、
HCDR2:IRNKPYNYET (配列番号28)、
HCDR3:TAQFAY (配列番号29)。
軽鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
LCDR1:ENIYGG (配列番号30)、
LCDR2:GAT (配列番号31)、
LCDR3:QNVLRSPFT (配列番号32)。
(2)重鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
HCDR1:GFTFSDNW (配列番号27)、
HCDR2:IRNKPYNYET (配列番号28)、
HCDR3:TAQFAY (配列番号29)。
軽鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
LCDR1:ENIYGG (配列番号30)、
LCDR2:GAT (配列番号31)、
LCDR3:QNVLRSPFT (配列番号32)。
(3)重鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
HCDR1:GFTFSDNW (配列番号27)、
HCDR2:IRNKPYNYET (配列番号28)、
HCDR3:TAQFAY (配列番号29)。
軽鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
LCDR1:ENIYGG (配列番号30)、
LCDR2:GAT (配列番号31)、
LCDR3:QNVLRSPFT (配列番号32)。
(4)重鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
HCDR1:GFTFSDNW (配列番号27)、
HCDR2:IRNKPYNYET (配列番号28)、
HCDR3:TAQFAY (配列番号29)。
軽鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
LCDR1:ENIYGG (配列番号30)、
LCDR2:GAT (配列番号31)、
LCDR3:QNVLRSPFT (配列番号32)。
(5)重鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
HCDR1:GFTFSDNW (配列番号27)、
HCDR2:IRNKPYNYET (配列番号28)、
HCDR3:TAQFAY (配列番号29)。
軽鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
LCDR1:ENIYGG (配列番号30)、
LCDR2:GAT (配列番号31)、
LCDR3:QNVLSRHPG (配列番号33)。
(6)重鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
HCDR1:GFTFSDNW (配列番号27)、
HCDR2:IRNKPYNYET (配列番号28)、
HCDR3:TAQFAY (配列番号29)。
軽鎖可変領域の3個のCDRのアミノ酸配列を以下で示す:
LCDR1:ENIYGG (配列番号30)、
LCDR2:GAT (配列番号31)、
LCDR3:QNVLSSRPG (配列番号34)。
本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で
あって、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Fab、Fab’、F(ab
’)、Fd、Fv、dAb、相補性決定領域断片、1本鎖抗体(例えばscFv)、ヒ
ト化抗体、キメラ抗体またはダイアボディから選択されるモノクローナル抗体またはその
抗原結合断片。
本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で
あって、本モノクローナル抗体は、約10−5M未満、例えば約10−6M未満、10
M、10−8M、10−9Mまたは10−10M以下のKでCTLA4タンパク質と
結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で
あって、本モノクローナル抗体は、非CDR領域を含み、この非CDR領域は、マウス以
外の種、例えばヒトの抗体由来であるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、CTLA4に特異的に結合し
得る、抗CTLA4モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
腫瘍の、予防および/または治療および/または補助療法および/または診断での使用
のための、本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結
合断片;具体的には、この腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍/腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、
結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌/肝癌から選択される。
B7へのCTLA4の結合を阻止すること、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)すること、
CTLA4による身体における免疫抑制を緩和すること、または
Tリンパ球を活性化するかもしくはTリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる薬

における使用のための、本発明の実施形態の何れか1つによるモノクローナル抗体。
本発明の別の態様は、単離核酸分子に関し、この単離核酸分子は、抗体の重鎖可変領域
をコードすることが可能な核酸配列を含み、
抗体の重鎖可変領域は、配列番号27から29のアミノ酸配列を有するCDRを含み;
具体的に、本抗体の重鎖可変領域は、配列番号6、配列番号10、配列番号14または
配列番号18で規定されるようなアミノ酸配列を有し;
より具体的には、本核酸分子は、配列番号5、配列番号9、配列番号13または配列番
号17で規定されるようなヌクレオチド配列を有する。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸
分子をさらに提供する。このような核酸分子は、ハイブリドーマ細胞から単離され得るか
、または遺伝子操作の組み換え技術もしくは化学合成法の方法を通じて得ることができる
本発明のさらなる態様は、単離核酸分子に関し、この単離核酸分子は、抗体の軽鎖可変
領域をコードすることが可能な核酸配列を含み、
本抗体の軽鎖可変領域は、
1)配列番号30から32のアミノ酸配列を有するCDR;
2)配列番号30、配列番号31および配列番号33のアミノ酸配列を有するCDR;
または
3)配列番号30、配列番号31および配列番号34のアミノ酸配列を有するCDR;
を含み、
具体的に、本抗体の軽鎖可変領域は、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列
番号20、配列番号22または配列番号24で規定されるようなアミノ酸配列を有し;
より具体的には、本核酸分子は、配列番号配列番号7、配列番号11、配列番号15、
配列番号19、配列番号21または配列番号23で規定されるようなヌクレオチド配列を
有する。
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか1つによる単離核酸分子を含むベ
クターに関する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、
バクテリオファージ、コエミド(coemid)などである。
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか1つの単離核酸分子または本発明
によるベクターを含む宿主細胞に関する。このような宿主細胞としては、原核細胞、例え
ばE.コリ(E.coli)細胞など、および真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植
物細胞および動物細胞(例えば、マウス細胞、ヒト細胞などを含む哺乳動物細胞など)が
挙げられるが限定されない。本発明の細胞は、293T細胞などの細胞株でもあり得る。
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか1つによる、モノクローナル抗体
またはその抗原結合断片を調製する方法に関し、この方法は、本発明の宿主細胞を適切な
条件下で培養し、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を細胞培養物から回収する
段階を含む。
本発明のさらなる態様は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片および複合部分
を含む複合物に関し、ここで本モノクローナル抗体は、本発明の実施形態の何れか1つに
よるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、複合部分は検出可能な標識であ
る。具体的に、複合部分は、放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、発色物質または酵素
(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ)である。
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか1つによるモノクローナル抗体ま
たはその抗原結合断片または本発明による複合物を含むキットに関し;
具体的に、本キットは、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に
認識する二次抗体をさらに含み;この二次抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体
、蛍光物質、発光性物質、発色物質または酵素(例えばホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ)をさらに含んでいてもよい。
本発明のさらなる態様は、試料中のCTLA4の存在またはそのレベルを検出すること
における使用のためのキットの調製における、本発明の実施形態の何れか1つによるモノ
クローナル抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか1つによるモノクローナル抗体ま
たはその抗原結合断片または本発明による複合物を含む医薬組成物に関し、これは、医薬
的に許容可能な担体および/または賦形剤をさらに含んでいてもよい。
本発明のさらなる態様は、腫瘍の、予防および/または治療および/または補助療法お
よび/または診断における使用のための薬剤の調製における、本発明の実施形態の何れか
1つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物の使用
に関し;具体的に、この腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍/腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結
直腸癌、消化管の癌および肝臓癌/肝癌から選択される。
本発明のさらなる態様は、次の薬剤:
試料中でCTLA4の存在またはそのレベルを検出する薬剤、
B7へのCTLA4の結合を阻止する薬剤、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)する薬剤、
CTLA4による身体における免疫抑制を緩和する薬剤、
Tリンパ球を活性化する薬剤、または
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる薬剤
の調製における、本発明の実施形態の何れか1つによるモノクローナル抗体またはその
抗原結合断片または本発明による複合物の使用に関する。
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか1つによるモノクローナ
ル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物を細胞に投与する段階を含む、
インビボまたはインビトロ法に関し、この方法は:
試料中のCTLA4の存在またはそのレベルを検出する方法、
B7へのCTLA4の結合を阻止する方法、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)する方法、
CTLA4による身体における免疫抑制を緩和する方法、
Tリンパを活性化する方法、または
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる方法
から選択される。
この方法は、診断もしくは治療目的または非診断もしくは非治療目的(例えば試料が、
患者からの試料ではなく、細胞試料である場合)のために使用し得る。
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか1つによるモノクローナ
ル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物を対象に投与することを含む、
腫瘍の、予防および/または治療および/または補助療法および/または診断の方法に関
し;具体的に、この腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍/腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸
癌、消化管の癌および肝臓癌/肝癌から選択される。
本発明において、別段の指定のない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術
用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、本明細書中
で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学の手順は、関連技術分野で広く利
用される方法である。一方で、本発明をより理解する目的のために、関連用語の定義およ
び説明を以下で提供する。
本明細書中で使用される場合、CTLA4タンパク質(細胞傷害性T−リンパ球抗原4
)のアミノ酸配列について申し述べる場合、これは、CTLA4タンパク質の全長または
CTLA4の細胞外断片、CTLA4ECD(配列番号2)またはCTLA4ECDを含
む断片を含み;これはまた、CTLA4ECDの融合タンパク質、例えばマウスIgGの
Fcタンパク質断片(mFc)(配列番号3)と融合される断片も含む。しかし、当業者
により理解されるように、突然変異または変異(置換、欠失および/または付加を含むが
限定されない。)は、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、CTLA4タンパク質
のアミノ酸配列において天然に生じるかまたはCTLA4タンパク質のアミノ酸配列に人
工的に導入され得る。したがって、本発明において、「CTLA4タンパク質」という用
語は、配列番号2で規定されるような配列ならびにそのネイティブもしくは人工的変異体
を含め、全てのこのような配列を含むべきである。さらに、CTLA4タンパク質の配列
断片について申し述べる場合、これは配列番号2の配列断片を含むだけでなく、そのネイ
ティブまたは人工的変異体の対応する配列断片も含む。
本明細書中で使用される場合、具体的に指定されない限り、B7はB7−1および/ま
たはB7−2を指し;それらの具体的なタンパク質配列は、当技術分野で公知の配列を指
す。先行技術またはGenBankの文献、例えばB7−1(CD80、NCBI Ge
ne ID:941)、B7−2(CD86、NCBI Gene ID:942)で開
示される配列を参照し得る。
本明細書中で使用される場合、EC50という用語は、最大効果の50%に対する濃度
、すなわち最大効果の50%を引き起こす濃度を指す。
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に2対のポリペプチド鎖(
各対は「軽」(L)鎖および「重」(H)鎖を有する。)からなる免疫グロブリン分子を
指す。抗体軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類され得る。重鎖はμ、δ、γ、αまたはε
として分類され得、抗体のアイソタイプはそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよ
びIgEとして定められる。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約12個
以上のアミノ酸の「J」領域を介して連結され、重鎖は約3個以上のアミノ酸の「D」領
域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域(V)および重鎖定常領域(C)からなる
。重鎖定常領域は、3個のドメイン(C1、C2およびC3)からなる。各軽鎖は
、軽鎖可変領域(V)および軽鎖定常領域(C)からなる。軽鎖定常領域はCドメ
インからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)およ
び古典的な補体系(C1q)の第一の構成成分を含め、宿主組織また因子への免疫グロブ
リンの結合に介在し得る。VおよびV領域は、比較的保存されるフレームワーク領域
(FR)と呼ばれる領域に散在する高い可変性を有する領域(相補性決定領域(CDR)
と呼ばれる。)にさらに細かく分けられ得る。各VまたはVは、アミノ末端からカル
ボキシ末端へと次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、F
R4で並んでいる、3個のCDRおよび4個のFRからなる。重鎖/軽鎖の各対の可変領
域(VおよびV)は抗体結合部位をそれぞれ形成する。各領域またはドメインに対す
るアミノ酸の割り当ては、Kabat,Sequences of Proteins
of Immunological Interest(National Insti
tutes of Health,Bethesda,Md.(1987および1991
))またはChothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:
901−917;Chothiaら(1989)Nature 342:878−883
で提供される定義に従う。「抗体」という用語は、抗体を作製するための何らかの具体的
な方法に限定されない。例えば、これは、特に、組み換え抗体、モノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばIgG(例え
ばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、I
gD、IgEまたはIgM抗体であり得る。
本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体により
結合される抗原に特異的に結合し、および/または抗原への特異的な結合について全長抗
体と競合する能力を保持する全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。これは、「抗原
結合部分」とも呼ばれる。全般的には、全ての目的に対してその全体において参照により
本明細書中に組み込まれる、Fundamental Immunology,Ch.7
(Paul,W.ed.,Second Edition,Raven Press,N
.Y.(1989))を参照のこと。抗体の抗原結合断片は、組み換えDNA技術または
インタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。いくつかの場合にお
いて、抗原結合断片は、Fab、Fab’、F(ab’)、Fd、Fv、dAbおよび
相補性決定領域(CDR)断片、1本鎖抗体(例えばscFv)、キメラ抗体、ダイアボ
ディおよび、ポリペプチドに特異的抗原結合能を付与するのに十分な抗体の少なくとも一
部を含むこのようなポリペプチドを含む。
本明細書中で使用される場合、「Fd断片」という用語は、VおよびC1ドメイン
からなる抗体断片を指し;「Fv断片」という用語は、抗体のシングルアームのVおよ
びVドメインからなる抗体断片を指し;「dAb断片」という用語は、Vドメインか
らなる抗体断片を指し(Wardら、Nature 341:544−546(1989
));「Fab断片」という用語は、V、V、CおよびC1ドメインからなる抗
体断片を指し;「F(ab’)断片」という用語は、ヒンジ領域においてジスルフィド
架橋により連結される2つのFab断片を含む抗体断片を指す。
いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、1本鎖抗体(例えばscFv)であ
り、ここでVおよびVドメインは互いに対して、1価分子を形成させるために1本の
ポリペプチド鎖の生成を可能にするリンカーを介して対形成する(例えば、Birdら、
Science 242:423−426(1988)およびHustonら、Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883(1988)を参照
のこと。)。このようなscFv分子は、一般構造:NH−V−リンカー−V−C
OOHまたはNH−V−リンカー−V−COOHを有し得る。先行研究からの適切
なリンカーは、反復GGGGSアミノ酸配列またはその変異体からなる。例えば、アミノ
酸配列(GGGGS)を有するリンカーを使用し得るが、その変異体も使用し得る(H
olligerら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:
6444−6448)。本発明において有用な他のリンカーは、Alfthanら(19
95)Protein Eng.8:725−731;Choiら(2001)Eur.
J.Immunol.31:94−106;Huら(1996)Cancer Res.
56:3055−3061;Kipriyanovら(1999)J.Mol.Biol
.293:41−56およびRooversら(2001)Cancer Immuno
lに記載されている。
いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、ダイアボディ(2価抗体)であり、
ここでVおよびVドメインは、単一ポリペプチド鎖上で発現される。しかし、利用さ
れるリンカーは、短すぎて同じ鎖上の2個のドメインが互いに対形成できず、別の鎖上の
相補的なドメインと対形成せざるを得ない。このようにして、2個の抗原結合部位が形成
される(例えば、Holliger P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 90:6444−6448(1993)およびPoljak R.J.ら、St
ructure 2:1121−1123(1994)を参照のこと。)。
抗体の抗原結合断片(例えば上記の抗体断片)は、当業者にとって公知の従来技術(例
えば、組み換えDNA技術または酵素的もしくは化学的切断法)を用いて、ある種の抗体
(例えば本発明において提供されるモノクローナル抗体4B3、13A10、12B9ま
たは4H4)から得ることができ、インタクト抗体の場合と同じように特異性についてス
クリーニングし得る。
本明細書中で、文脈において明らかに指定されない限り、「抗体」という用語について
申し述べる場合、インタクトな抗体を含むだけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書中で使用される場合、「mAb」または「モノクローナル抗体」という用語は
、非常に均一な抗体分子の集団からの抗体または抗体断片を指し、すなわち、この集団を
含む個々の抗体は、可能性のある天然の突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗
体は、抗原上の単一のエピトープに非常に特異的である。モノクローナル抗体とは対照的
に、ポリクローナル抗体調製物は、一般的には、抗原上の異なるエピトープを認識する少
なくとも2つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般に、最初にKohl
erらにより記載されたハイブリドーマ技術(Nature,256:495,1975
)を用いて得ることができるか、または組み換えDNA技術(例えば米国特許第4,81
6,567号明細書を参照のこと。)を使用して得ることができる。
本明細書中で使用される場合、番号とともに述べられるモノクローナル抗体は、同じ番
号の付いたハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体と同一である。例えば、モノ
クローナル抗体4B3(または13A10、12B9または4H4)は、ハイブリドーマ
細胞株4B3(または13A10、12B9または4H4)またはそのサブクローンまた
は子孫細胞から得られる抗体と同一である。
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、標的抗原への結合のため
の活性を保持する限り、軽鎖および/または重鎖の部分が(特定の種由来であり得るかま
たは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る)抗体由来であり、一方で軽鎖およ
び/または重鎖の別の部分が、(同一であるまたは異なる種由来であり得るか、または同
一であるまたは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る)別の抗体由来であるよ
うな抗体を指す(Cabillyらに対する米国特許第4,816,567号明細書;M
orrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−
6855(1984))。
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン(レ
シピエント抗体)の全てのまたは一部のCDRを非ヒト抗体(ドナー抗体)のCDRで置
き換えた後に得られる抗体または抗体断片を指し、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性
または反応性を有する非ヒト(例えばマウス、ラットまたはウサギ)抗体であり得る。さ
らに、レシピエント抗体のフレームワーク領域(FR)の一部のアミノ酸残基は、抗体の
性能をさらに向上させるかまたは最適化するために非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基ま
たは他の抗体のアミノ酸残基で置き換えられ得る。ヒト化抗体に関するより詳細な説明に
ついては、例えばJonesら、Nature,321:522−525(1986);
Reichmannら、Nature,332:323−329(1988);Pres
ta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992);
およびClark,Immunol.Today 21:397−402(2000)を
参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「中和抗体」は、標的ウイルスの病原性(例えば細胞に
感染する能力)を取り除き得るかまたは顕著に低下させ得る、抗体または抗体断片を指す
本明細書中で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗
体により特異的に結合される抗原上の部分(prat)を指す。当技術分野において、「
エピトープ」は「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は一般に、分
子の化学的に活性のある表面基、例えばアミノ酸または炭水化物化合物または糖側鎖から
なり、一般に特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。例えば、エピト
ープは一般に、別個の(distince)空間的な高次構造において、少なくとも3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の連続または非連
続アミノ酸を含む。これは、「直鎖状」または「高次構造的」エピトープであり得る。例
えば、Epitope Mapping Protocols in Methods
in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,E
d.(1996)を参照のこと。直鎖状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子
(例えば抗体)との間の相互作用点は全て、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って一列
に存在する。高次構造的エピトープにおいて、相互作用点は、互いから離れているタンパ
ク質のアミノ酸残基にわたるように存在する。
本明細書中で使用される場合、「単離される」という用語は、人工的手段によってネイ
ティブ状態から得られていることを意味する。「単離される」物質または構成成分が天然
に生じる場合、その天然の環境が変化しているか、またはその物質が天然の環境から単離
されているか、またはその両方であると考えられる。例えば、単離されていないポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、インビボで生きている動物中に天然に存在し、このよう
な天然の状態から単離される高純度の同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
、「単離されている」ものとされる。「単離される」という用語は、人工的または合成物
質との混合物を排除せず、物質の活性に影響を与えない他の不純物の存在を排除しない。
本明細書中で使用される場合、「E.コリ(E.coli)発現系」という用語は、E
.コリ(E.coli)(ステイン(stain))およびベクターからなる発現系を意
味し、E.コリ(E.coli)(株)は、例えば市販の株由来であるが、GI698、
ER2566、BL21(DE3)、B834(DE3)およびBLR(DE3)に限定
されない。
本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入さ
れ得る核酸保有ツールを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードさ
れるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベ
クターは、ベクターにより保有される遺伝物質構成要素が宿主細胞で発現されるように、
形質転換、形質導入または遺伝子移入によって宿主細胞に導入することができる。ベクタ
ーは、当業者にとって周知であり、プラスミド;ファージミド;コスミド;人工染色体、
例えば酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)またはP1−由来人工染色
体(PAC);バクテリオファージ、例えばλファージまたはM13ファージならびに動
物ウイルスなどが含まれるが限定されない。ベクターとして使用し得る動物ウイルスとし
ては、レトロウイルス(レンチウイルスを含む。)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイル
ス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウ
イルス、パピローマウイルス、パポバウイルス(例えばSV40)が挙げられるが限定さ
れない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択構成要
素およびレポーター遺伝子を含むが限定されない、発現を調節するためのいくつかの構成
要素を含み得る。さらに、ベクターは、複製開始部位も含み得る。
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入のために使
用し得る細胞を指し、原核細胞、例えばE.コリ(E.coli)またはバチルス・サブ
チリス(Bacillus subtilis)など、真菌細胞、例えば酵母細胞または
アスペルギルス(Aspergillus)など、昆虫細胞、例えばS2ショウジョウバ
エ細胞もしくはSf9など、または動物細胞、例えば線維芽細胞、CHO細胞、COS細
胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK293細胞またはヒト細胞が含まれ
るが限定されない。
本明細書中で使用される場合、「同一性」という用語は、2つのポリペプチド間または
2つの核酸間で一致する配列を述べるために使用される。比較した2つの配列における対
応する位置に同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットが存在する場合(例えば、2
つのDNA分子における対応する位置に両方ともアデニンが存在するか、または2つのポ
リペプチドにおける対応する位置に両方ともリジンが存在する場合)、これらの分子はそ
の位置で同一である。2つの配列間の「パーセント同一性」は、これらの2つの配列が共
有する、一致する位置の数を比較した位置の数で除して100をかけた関数である。例え
ば、2つの配列の10カ所の位置のうち6カ所が一致する場合、これらの2つの配列は6
0%同一性を有する。例えば、DNA配列CTGACTおよびCAGGTTは、50%同
一性を共有する(全体で6カ所のうち3カ所が一致する。)。一般に、アライメント後に
2つの配列を比較して、同一性が最大になるようにする。例えば、このようなアライメン
トは、Needlemanら(1970)J.Mol.Biol.48:443−453
の方法により、コンピュータプログラム、例えばAlignプログラム(DNAstar
,Inc.)を用いて都合よく達成され得る。さらに、2つのアミノ酸配列間のパーセン
ト同一性を決定するために、PAM120ウエイトレジデューテーブル(weight
residue table)、12のギャップ長ペナルティーおよび4のギャップペナ
ルティーを用いて、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる、E.M
eyersおよびW.Millerのアルゴリズム(Comput.Appl.Bios
ci.,4:11−17(1988))を使用し得る。さらに、GCGパッケージ(ww
w.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムに組み込まれるNeedleman
およびWunschのアルゴリズム(J MoI Biol.48:444−453(1
970))は、Blossum62マトリクスまたはPAM250マトリクス、ギャップ
ウェイト(gap weight)16、14、12、10、8、6または4および長さ
ウェイト(length weight)1、2、3、4、5または6を用いて、2つの
アミノ酸配列間のパーセント同一性を決定するために使用し得る。
本明細書中で使用される場合、「保存的置換」という用語は、不都合な影響を及ぼさな
いかまたはそのアミノ酸配列を含むタンパク質/ポリペプチドの必須の特性を変更しない
アミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当技術分野で公知の標準的技術、例えば部
位特異的突然変異誘発およびPCR介在型突然変異誘発などにより導入し得る。保存的ア
ミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基、例えば、物理
または機能について対応するアミノ酸残基(例えば、同様のサイズ、形態、電荷、共有結
合または水素結合の形成能を含む化学的特性などを有する。)と同様の残基で置換される
ものが挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義
されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニンおよびヒ
スチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸)、非荷電極性側鎖(
例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイ
ンおよびトリプトファン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニンおよびメチオニン)、ベータ−分岐状側鎖(例えばス
レオニン、バリンおよびイソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルア
ラニン、トリプトファンおよびヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。したがって、対応
するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することが好まし
い。アミノ酸保存的置換を同定する方法は当技術分野で周知である(例えば、参照により
本明細書中に組み込まれる、Brummellら、Biochem.,32:1180−
1187(1993);Kobayashiら、Protein Eng.12(10)
:879−884(1999);およびBurksら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,94:412−417(1997)を参照のこと)。
本明細書中で使用される場合、「免疫原性」という用語は、特異的な抗体を産生させる
ために、またはリンパ球を感作するために身体を刺激する能力を指す。これは、免疫細胞
の、活性化、増殖および分化ならびに最終的には抗体などの免疫エフェクター物質の産生
を誘導するために特異的な免疫細胞を刺激し得、リンパ球を感作し得る抗原の特性を指す
だけでなく、抗原による身体の刺激後に、抗体を産生させるかまたはTリンパ球を感作す
るための、身体の免疫系による特異的な免疫反応も指す。免疫原性は、抗原の最も重要な
特性である。抗原が宿主における免疫反応の誘導に成功し得るか否かは、3つの要因:抗
原の性質、宿主の反応性および免疫付与方式に依存する。
本明細書中で使用される場合、「特異的な結合」という用語は、2つの分子間の非無作
為結合反応、例えば抗体とその標的抗原との間の反応などを指す。いくつかの実施形態に
おいて、抗原に特異的に結合する抗体(または抗原に特異的な抗体)は、抗体が約10
M未満、例えば約10−6M未満、10−7M、10−8M、10−9Mまたは10
10M以下の親和性(K)で抗原に結合することを意味する。
本明細書中で使用される場合、「K」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解
離平衡定数を指し、これは、抗体と抗原との間の結合親和性を述べるために使用される。
平衡解離定数が小さいほど、抗体−抗原結合が堅固であり、抗体と抗原との間の親和性が
高い。一般に、抗体(例えば、本発明のモノクローナル抗体4B3、13A10、12B
9または4H4)は、BIACORE機器上で表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して
決定した場合、約10−5M未満、例えば約10−6M未満、10−7M、10−8M、
10−9Mまたは10−10M以下の解離平衡定数(K)で抗原(例えばL1タンパク
質)と結合する。
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」および「mAb」という用語は
同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリクローナル抗体」および「pA
b」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリペプチド」お
よび「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。さらに、本
発明において、アミノ酸は一般に、当技術分野で周知の、1文字または3文字略号により
表される。例えば、アラニンはAまたはAlaで表し得る。
本明細書中で使用される場合、「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞株」と
いう用語は、交換可能に使用され得る。さらに、「ハイブリドーマ」または「ハイブリド
ーマ細胞株」という用語について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマのサブクロー
ンおよび子孫細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞株4B3について申し述べる場合
、これは、ハイブリドーマ細胞株4B3のサブクローンおよび子孫細胞も含む。
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能なベクターおよび/または賦形剤」
という用語は、薬理学および/または生理学において対象および活性のある構成要素に適
合するベクターおよび/または賦形剤を指し、これらは当技術分野で周知であり(例えば
、Remington’s Pharmaceutical Sciences.Gen
naro AR編,19th ed.Pennsylvania:Mack Publi
shing Company,1995を参照のこと。)、これらには、pH調整剤、界
面活性剤、アジュバント、イオン強度促進剤が含まれるが限定されない。例えば、pH調
整剤としてはリン酸緩衝液が挙げられるが限定されず;界面活性剤としては陽イオン性、
陰イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばTween−80が挙げられるが限定さ
れず;イオン強度促進剤としては塩化ナトリウムが挙げられるが限定されない。
本明細書中で使用される場合、「アジュバント」という用語は、非特異的な免疫促進剤
を指し、これは、抗原に対する身体の免疫反応を促進し得るかまたは抗原と一緒にもしく
は身体に予め送達される場合、免疫反応のタイプを変化させ得る。アルミニウムアジュバ
ント(例えば水酸化アルミニウム)、フロイントアジュバント(例えば完全フロイントア
ジュバントおよび不完全フロイントアジュバント)、コリネバクテリウム・パルブム(C
orynebacterium parvum)、リポ多糖類、サイトカインなどを含む
が限定されない多くのアジュバントがある。フロイントアジュバントは、現在のところ動
物試験において最も一般的に使用されるものであり、水酸化アルミニウムは臨床実験で広
く使用されるものである。
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するかまた
は少なくとも一部達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患(例えば、B7へのCTL
A4の過剰な結合またはCTLA4活性が関連する疾患、例えば腫瘍など)に対する予防
的有効量は、疾患(例えば、B7へのCTLA4の過剰な結合またはCTLA4活性が関
連する疾患、例えば腫瘍など)の発症を防ぐか、抑止するかまたは遅延させるのに十分で
ある量を指し;疾患に対する治療的有効量は、疾患に罹患している患者において疾患およ
びその合併症を治癒させるか少なくとも部分的に抑止するのに十分な量を指す。このよう
な有効量を決定することは十分に当業者の技術の範囲内である。例えば、治療的有効量は
、処置しようとする疾患の重症度、患者の免疫系の全般的状況、患者の全般的状況、例え
ば年齢、体重および性別、薬剤の投与形式、同時に行われる他の治療などに依存する。
本発明のモノクローナル抗体8D2およびそのヒト化抗体は、CTLA4と非常によく
特異的に結合し得る。中でも、抗体8D2および8D2(Re)は、対照抗体10D1(
Alan J.Korman,Edward L.Halkら、HUMAN CTLA−
4 ANTIBODIES、米国特許第6984720号明細書)および11.2.1(
Douglas Charles Hanson,Mark Joseph Neveu
ら、Human monoclonal antibodies to CTLA−4、
米国特許第682736号明細書)よりも良好な結合効率でマウスCTLA4抗原に結合
する。ヒト化抗体8D2H1L1は、対照抗体10D1よりも良好で、11.2.1に匹
敵する結合効率でマウスCTLA4抗原に結合する。ヒト化抗体8D2H2L2は、10
D1に匹敵する結合効率でヒトCTLA4抗原に結合する。ヒト化抗体8D2H2L2お
よび8D2H3L3は、10D1に匹敵する結合効率でサルCTLA4抗原に結合する。
抗体8D2H2L15および8D2H2L17は、対照抗体10D1および11.2.1
よりも良好な結合効率でヒトCTLA4抗原に結合する。
抗体8D2、8D2(Re)および8D2ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2
、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L17は、抗原CTLA4への結
合についてB7と競合し得る。中でも、8D2、8D2(Re)、8D2H1L1および
8D2H2L2は、CTLA4への結合についてのB7−2との競合において10D1よ
りも強力であり;8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15
および8D2H2L17は、全て、CTLA4への結合についてのB7−1およびB7−
2との競合において抗体10D1および11.2.1よりも強力である。
本発明のモノクローナル抗体8D2およびそのヒト化抗体は、B7へのCLTA4の結
合を阻止し得、具体的には、CTLA4による身体上の免疫抑制を緩和し、非常に効率的
にTリンパ球を活性化する。中でも、8D2H2L2および8D2H2L15は、Tリン
パ球を活性化することにおいて、対照抗体10D1および11.2.1よりも強力である
CTLA4ECD−mFc融合タンパク質のSDS−PAGEの結果。4つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;CTLA4ECD−mFc融合タンパク質、1μg;CTLA4ECD−mFc融合タンパク質、2μg;CTLA4ECD−mFc融合タンパク質、3μg。 8D2抗体のSDS−PAGEの結果。4つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、0.3μg;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、2μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、0.3μg。 8D2組み換え抗体(8D2(Re))のSDS−PAGEの結果。4つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、2μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg。 8D2、8D2H1L1のヒト化抗体のSDS−PAGEの結果。4つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、2μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg。 8D2、8D2H2L2のヒト化抗体のSDS−PAGEの結果。4つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、2μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg。 8D2、8D2H3L3のヒト化抗体のSDS−PAGEの結果。4つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、2μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg。 8D2、8D2H2L15のヒト化抗体のSDS−PAGEの結果。試料およびそれらのローディング量は、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg。 8D2、8D2H2L17のヒト化抗体のSDS−PAGEの結果。試料およびそれらのローディング量は、次のとおりであった:M、マーカー、10μL;タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg;タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、1μg。 mAb8D2の動的特性パラメーター決定の結果。 8D2H1L1の動的特性パラメーター決定の結果。 8D2H2L2の動的特性パラメーター決定の結果。 8D2H3L3の動的特性パラメーター決定の結果。 8D2H2L15の動的特性パラメーター決定の結果。 8D2H2L17の動的特性パラメーター決定の結果。 フローサイトメトリーを使用して検出した場合の、非標識293F細胞、アイソタイプ対照および293F−CTLA4細胞における、CTLA4の発現を示すヒストグラム(細胞数−蛍光(FITC))。 フローサイトメトリーを使用して検出した場合の、非標識293F細胞、アイソタイプ対照および293F−CTLA4細胞における、CTLA4の発現の平均蛍光強度(MFI)。 標識293F−CTLA4細胞に対するmAb8D2の結合のEC50の結果。 標識293F−CTLA4細胞に対する8D2(Re)抗体の結合のEC50の結果。 標識293F−CTLA4細胞に対する8D2H1L1の結合のEC50の結果。 標識293F−CTLA4細胞に対する8D2H2L2の結合のEC50の結果。 標識293F−CTLA4細胞に対する8D2H3L3の結合のEC50の結果。 ELISA法を用いたCTLA4への抗体8D2、8D2H1L1および8D2(Re)の結合の判定。 ELISA法を用いたヒトCTLA4への組み換え抗体8D2H2L2および8D2H3L3の結合の判定。 ELISA法を用いたサルCTLA4への組み換え抗体8D2H2L2および8D2H3L3の結合の判定。 ELISA法を用いたサルCTLA4への組み換え抗体8D2H2L15および8D2H2L17の結合の判定。 B7−1との抗体8D2、8D2H1L1および8D2(Re)の競合に対するELISAの結果。 B7−2との抗体8D2、8D2H1L1および8D2(Re)の競合に対するELISAの結果。 B7−1との8D2H2L2および8D2H3L3抗体の競合に対するELISAの結果。 B7−2との8D2H2L2および8D2H3L3抗体の競合に対するELISAの結果。 B7−1との8D2H2L15および8D2H2L17抗体の競合に対するELISAの結果。 B7−2との8D2H2L15および8D2H2L17抗体の競合に対するELISAの結果。 末梢血単核細胞(PBMC)、Raji細胞およびそれぞれヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2または8D2H3L3との72時間の同時培養後の、ELISA法により検出した場合のTリンパ球によるIL−2分泌レベルに対する効果。結果から、mAb8D2のヒト化抗体が、CTLA4の受容体を妨害することによって、Tリンパ球によるIL−2分泌を増加させたことが示される。 末梢血単核細胞(PBMC)、Raji細胞およびそれぞれヒト化抗体8D2H2L15または8D2H2L17との72時間の同時培養後の、ELISA法により検出した場合のTリンパ球によるIL−2分泌レベルに対する効果。結果から、mAb8D2のヒト化抗体が、CTLA4の受容体を妨害することによって、Tリンパ球によるIL−2分泌を増加させたことが示される。 8D2H2L2で処置したhu−SCID−rajiモデルにおける皮下移植腫瘍の増殖曲線。
以下で実施例を参照して本発明の実施形態を詳述する。当業者は、次の実施例が単に本
発明を例示するために提供されることを理解しよう。これらは、何であれ、本発明の範囲
を制限するものとして解釈されるべきものではない。具体的な技術または条件が記載され
ない実施例は、当技術分野の文献で開示される技術または条件を使用して(例えば、J.
Sambrookら著、Peitang HUANGら訳、Molecular Clo
ning:A Laboratory Manual,Third Edition,S
cience Press)、または製品とともに提供される説明書に従い、行った。供
給者が示されていない試薬および機器は、市販の従来製品である。
本発明の次の実施例において、BALB/Cマウスは、Guangdong Medi
cal Laboratory Animal Centerから購入した。
本発明の次の実施例において、使用したT細胞は、Akeso Biopharma
Inc.,Zhongshanから入手した。
対照抗体、10D1は米国特許第6984720号明細書に従い調製し;11.2.1
は米国特許第6682736号明細書に従い調製した。
[実施例1]CTLA4−8D2ハイブリドーマ細胞株LT001の作製およびモノク
ローナル抗体8D2の調製
抗原としてマウスに免疫付与するために、哺乳動物細胞発現系において、組み換えCT
LA4を発現させ、マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドー
マ細胞を得た。多数の試料をスクリーニングした後、ハイブリドーマ細胞株(CTLA4
−8D2ハイブリドーマ細胞株LT001)を得た。前記の細胞株は、CTLA4に特異
的に結合するモノクローナル抗体8D2を分泌し得た。具体的な方法を以下に記載する。
1.CTLA4ECD−mFc遺伝子の合成
設計(配列番号3)に従い、CTLA4遺伝子(細胞傷害性T−リンパ球抗原4、NC
BI遺伝子ID:1493、配列番号1)の細胞外断片(CTLA4ECD)に対応する
アミノ酸配列(配列番号2)をマウスIgGのFcタンパク質断片(mFc)に融合させ
たが、mFcは、配列番号3の下線部により示されるようなアミノ酸配列を有するマウス
IgGのFcタンパク質断片を指す。
293f細胞発現系における関心のある遺伝子の発現効率を上昇させるために、コドン
選択性、GC含量、mRNAの二次構造および反復配列などを主に考慮して、配列番号3
タンパク質配列をコードする核酸配列をGenscript Co.で最適化した。CT
LA4ECD−mFc融合タンパク質をコードする最終的な最適化遺伝子は次の配列(配
列番号4)を有し、Genscript Co.で合成された。
CTLA4ECD遺伝子の配列(375bp):
Figure 0006783886
Figure 0006783886
CTLA4ECDによりコードされるタンパク質の配列(125aa):
Figure 0006783886
CTLA4ECD−mFc融合タンパク質の配列(364aa):
ここで、CTLA4ECD部分に波線を付し、mFc部分に実線を付す。
Figure 0006783886
CTLA4ECD−mFc融合タンパク質に対応する遺伝子のコード配列(1092b
p):
ここで、CTLA4ECD部分に波線を付し、mFc部分に実線を付す。
Figure 0006783886
2.pUC57simple−CTLA4ECD−mFcプラスミドの作製
Genscript Co.でpUC57 simple発現ベクター(Genscr
ipt Co.より提供)への合成CTLA4ECD−mFc融合遺伝子(配列番号4)
のクローニングが行われ、その結果、pUC57simple−CTLA4ECD−mF
cプラスミドが得られた。
3.pcDNA3.1−CTLA4ECD−mFc組み換えプラスミドの構築
エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIを用いてpUC57simple−CT
LA4ECD−mFcプラスミドを消化した。電気泳動を介してCTLA4ECD−mF
c融合遺伝子断片を回収し、pcDNA3.1発現ベクター(Invitrogen C
o.より購入)に連結させた。得られたpcDNA3.1−CTLA4ECD−mFcプ
ラスミドを使用して、E.コリ(E.coli)のDH5a株のコンピーテント細胞(T
IANGEN Co.より購入)に遺伝子移入した。説明書に従って、遺伝子移入および
培養を行った。pcDNA3.1−CTLA4ECD−mFcについて陽性のE.コリ(
E.coli)コロニーをスクリーニングして選び出し、従来法に従い増殖させた。次い
で、キット(Tiangen Biotech(Beijing)Co.LTD,DP1
03−03より購入)を使用して、キットとともに提供される説明書に従い、pcDNA
3.1−CTLA4ECD−mFc組み換えプラスミドを抽出した。
4.リポフェクタミン遺伝子移入キット(Invitrogen Co.より購入)を
使用して、pcDNA3.1−CTLA4ECD−mFc組み換えプラスミドを用いて2
93Fの細胞(Invitrogen Co.より購入)に遺伝子移入した。
5.293F細胞にpcDNA3.1−CTLA4ECD−mFc組み換えプラスミド
を用いて遺伝子移入してから7日後、高速遠心、細孔フィルター膜を通じた真空ろ過およ
びHiTrapプロテインA HPカラムクロマトグラフィーによって、CTLA4EC
D−mFc融合タンパク質を培養液から精製した。精製後、試料を採取し、タンパク質電
気泳動用の還元性ローディング緩衝液に添加し、SDS−PAGE電気泳動によって試験
した。図1で示されるように、関心のあるタンパク質は、約45kDのバンドとして示さ
れる。
6.CTLA4−8D2ハイブリドーマ細胞株LT001の作製
確立された方法(例えば、Basic Methods in antibody P
roduction and Characterization中の、Stewart
,S.J.,「Monoclonal Antibody Production」、E
ds.G.C.HowardおよびD.R.Bethell,Boca Raton:C
RC Press,2000)に従い、抗原としてCTLA4ECD−mFc融合タンパ
ク質を用いて、免疫付与BALB/Cマウス(Guangdong Medical L
aboratory Animal Centerより購入)からの脾臓細胞をマウス骨
髄腫細胞と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。
ELISAプレートを被覆するために抗原としてCTLA4を使用し、間接的ELIS
Aスクリーニングによって、CTLA4に特異的に結合する新規抗体を分泌するハイブリ
ドーマ細胞を得た。競合ELISAスクリーニングによって、間接的ELISAスクリー
ニングで得られたハイブリドーマ細胞から、CTLA4への結合についてリガンドB7−
1(CD80、NCBI遺伝子ID:941)またはB7−2(CD86、NCBI遺伝
子ID:942)と競合したモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を得た
。限界希釈を介して、安定したハイブリドーマ細胞株を得た。このハイブリドーマ細胞株
はCTLA4−8D2ハイブリドーマ細胞株と名付け、限界希釈を介してCTLA4−8
D2安定細胞株を得た(本発明においてLT001とも呼ぶ;これにより分泌されるモノ
クローナル抗体を8D2と名付けた。)。
7.抗体8G2の調製
10%低IgGのウシ胎仔血清を補給した培地中で本発明のCTLA4−8D2(LT
001)細胞株を培養した。7日後、抗体8D2を精製するために、細胞培養の上清を回
収した。
8.SDS−PAGEによる8D2抗体の検出
精製試料をタンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液およびタンパク質電気泳
動用の非還元性ローディング緩衝液に添加した。沸騰後、検出を行った。この結果から、
関心のあるタンパク質が、還元性タンパク質試料の場合は約50kDおよび25kDの2
本のバンドとして、または、非還元性タンパク質試料の場合は約150kDのバンドとし
て示されることが分かる(図2)。
[実施例2]モノクローナル抗体8D2の軽鎖および重鎖配列の決定
培養細胞/細菌Total RNA Extraction Kit(Tiangen
,Cat.No.DP430)の説明書に従い、実施例1で作製したCTLA4−8D2
ハイブリドーマ細胞株(LT001細胞)からmRNAを抽出した。
RT−PCRキット用のInvitrogen SuperScript(登録商標)
III First−Strand Synthesis Systemの説明書に従い
、cDNAを合成し、PCRにより増幅させた。pEASY−T1 Cloning K
it(TransGen,Cat.No.CT101)の説明書に従い、PCR増幅産物
をすぐにTAクローニングに供した。TAクローニングの産物をすぐに配列決定に供し、
配列決定の結果を以下で提供する。
重鎖可変領域のDNA配列決定の結果(345bp):
Figure 0006783886
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(115aa):
Figure 0006783886
軽鎖可変領域のDNA配列決定の結果(318bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(106aa):
Figure 0006783886
[実施例3]ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H
2L15および8D2H2L17の軽鎖および重鎖配列の設計
CTLA4タンパク質の三次元結晶構造(Nat.Struct.Biol.(199
7)4,p.527)および実施例2で得られた8D2抗体の配列に基づき、コンピュー
タ上で抗体の構造をモデル化した。抗体配列および構造モデル(抗体の定常領域配列はN
CBIデータベース由来)に基づいて、抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H
3L3、8D2H2L15および8D2H2L17の可変領域配列を設計した。可変領域
配列を以下で提供する。
1.モノクローナル抗体8D2H1L1の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のDNA配列(345bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(115aa):
Figure 0006783886
軽鎖可変領域のDNA配列(321bp):
Figure 0006783886
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(107aa):
Figure 0006783886
2.8D2ヒト化モノクローナル抗体8D2H2L2の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のDNA配列(345bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(115aa):
Figure 0006783886
軽鎖可変領域のDNA配列(321bp):
Figure 0006783886
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(107aa):
Figure 0006783886
3.8D2ヒト化モノクローナル抗体8D2H3L3の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のDNA配列(345bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(115aa):
Figure 0006783886
軽鎖可変領域のDNA配列(321bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(107aa):
Figure 0006783886
4.8D2ヒト化モノクローナル抗体8D2H2L15の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のDNA配列(345bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(115aa):
Figure 0006783886
軽鎖可変領域のDNA配列(321bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(107aa):
Figure 0006783886
5.8D2ヒト化モノクローナル抗体8D2H2L17の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のDNA配列(345bp):
Figure 0006783886
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(115aa):
Figure 0006783886
軽鎖可変領域のDNA配列(321bp):
Figure 0006783886
それによりコードされるタンパク質配列(107aa):
Figure 0006783886
[実施例4]8D2組み換え抗体、8D2(Re)および8D2ヒト化抗体、8D2H
1L1、8D2H2L3、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L17の
調製およびSDS−PAGEによる検出
1.8D2組み換え抗体、8D2(Re)の調製およびSDS−PAGEによる検出
8D2の、重鎖のcDNA配列(その可変領域配列は配列番号5で示す。)および軽鎖
のcDNA配列(その可変領域配列は配列番号7で示す。)をpUC57simpleベ
クター(Genscript Co.により提供)にそれぞれクローニングし、その結果
、プラスミドpUC57simple−8D2HおよびpUC57simple−8D2
Lを得た。
プラスミドpUC57simple−8D2HおよびpUC57simple−8D2
Lをエンドヌクレアーゼ(HindIIIおよびEcoRI)でそれぞれ消化した。電気
泳動を介して回収した重鎖および軽鎖をコードする断片を個別にpcDNA3.1ベクタ
ーにサブクローニングした。組み換えプラスミドを抽出し、293Fの細胞に同時遺伝子
移入した。細胞培養7日後、培養液を高速遠心、細孔フィルター膜を通じた真空ろ過およ
びHiTrapプロテインA HPカラム上での精製に供した。精製試料をタンパク質電
気泳動用の還元性ローディング緩衝液およびタンパク質電気泳動用の非還元性ローディン
グ緩衝液に添加した。沸騰後、SDS−PAGEにより検出を行った。図3で示されるよ
うに、関心のあるタンパク質が、還元性タンパク質試料の場合は約50kDおよび25k
Dの2本のバンドとして、または、非還元性タンパク質試料の場合は約150kDのバン
ドとして示されることが分かる。
2.8D2ヒト化抗体、8D2H1L1、8D2H2L2および8D2H3L3の調製
およびSDS−PAGEによる検出
8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H
2L17の、重鎖のcDNA配列(それらの可変領域配列は、それぞれ配列番号9、配列
番号13、配列番号17、配列番号13、配列番号13で示される。)および軽鎖のcD
NA配列(それらの可変領域配列は、それぞれ配列番号11、配列番号15、配列番号1
9、配列番号21、配列番号23で示される。)をpUC57simpleベクター(G
enscript Co.により提供)にそれぞれクローニングし、その結果、プラスミ
ドpUC57simple−8D2H1L1、pUC57simple−8D2H2L2
、pUC57simple−8D2H3L3、pUC57simple−8D2H2L1
5およびpUC57simple−8D2H2L17を得た。8D2(Re)に対する上
記の手順に従い、これらを個別にpcDNA3.1ベクターにサブクローニングした。
組み換えプラスミドを293Fの細胞に遺伝子移入した。8D2(Re)に対する上記
の手順に従い精製した後、293F細胞の培養液を検出に供した。結果は、図4、図5、
図6、図7および図8で示す。還元性タンパク質試料は、約50kDおよび25kDの2
本のバンドとして関心のあるタンパク質を示し、非還元性タンパク質試料は、約150k
Dのバンドとして関心のあるタンパク質を示した。
この実施例に記載の手順に従い、次の実施例で使用する8D2組み換え抗体、8D2(
Re)および8D2ヒト化抗体、8D2H1L1、8D2H2L3、8D2H3L3、8
D2H2L15および8D2H2L17を調製した。
[実施例5]抗体の動的パラメーターの決定
Fortebio分子相互作用分析装置を使用して、抗原CTLA4(配列番号25で
示されるようなコード核酸配列および配列番号26で示されるようなコードされるアミノ
酸配列を有する、NCBI遺伝子ID:1493)に対する抗体8D2およびヒト化8D
2H1L1、8D2H2L2および8D2H3L3の結合の動的パラメーターを決定した
1.CTLA4−mFcタンパク質(CTLA4ECD−mFcの合成について実施例
1に記載のものと同じ方法に従い、CTLA4−mFcを作製した。)をTEVプロテア
ーゼで切断し、カラム上での精製によってCTLA4抗原を得た。
CTLA4遺伝子の配列(636bp):
Figure 0006783886
Figure 0006783886
コードされる対応するアミノ酸配列(212aa):
Figure 0006783886
2.アミノカップリングにより、AR2Gセンサーの表面上に、抗体8D2およびその
ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および
8D2H2L17を固定し、エタノールアミンでブロッキングした。PBST中での平衡
化後、結合のためにCTLA4抗原を添加した。CTLA4をPBST中で連続2x希釈
し、次の濃度:300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、0
nMを得た。PBST中で解離が起こった。8D2と同じ方法によって、ヒト化抗体8D
2H1L1、H2L2、H3L3、H2L15およびH2L17を検出し、抗原濃度は、
180、90、45、22.5、11.25、5.625、2.813、0nMであった
抗体8D2およびそのヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、
8D2H2L15および8D2H2L17の動的パラメーターを表1で提供し、動的特性
パラメーターを決定した結果は、それぞれ図9から14で示す。
Figure 0006783886
Figure 0006783886
結果から、6種類の抗体の全てが抗原に対して良好な親和性を有し、対照抗体10D1
および11.2.1に匹敵するかまたはこれよりさらに優れていることが明らかになる。
[実施例6]フローサイトメトリーによる、ハイブリドーマ細胞株の表面上の抗原CT
LA4に結合するための抗体の活性の判定
最初に、CTLA4抗原を発現する293F宿主細胞を作製し、それぞれ本発明におい
て調製した、モノクローナル抗体8D2(実施例1)および8D2(Re)および8D2
ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2および8D2H3L3(実施例4)で標識し
た。次いで、フローサイトメトリーにより、細胞表面上のネイティブ高次構造を有する抗
原への抗体の特異的結合能を確認した。
具体的な段階を以下で提供する。
1.CTLA4抗原を発現する293F宿主細胞の作製
リポフェクタミン遺伝子移入キット(Invitrogen Co.より購入)を使用
して、CTLA4に対するプラスミドpLenti6.3−CTLA4(ベクターpLe
nti6.3はInvitrogen Co.より購入)を用いて293Fの細胞に遺伝
子移入した。スクリーニング後、CTLA4(293F−CTLA4)を安定に発現する
細胞のクローン集団(293F−CTLA4)を得た。
2.抗体での標識およびフローサイトメーターを用いた検出
従来法に従い、上記段階により得られたCTLA4抗原を発現する293F宿主細胞を
トリプシンで消化し、2×10個の細胞を各回収チューブに添加した。1%BSAを含
有するPBS中の8D2抗体の希釈溶液を調製して、それぞれ20nM、10nM、5n
M、1nM、0.1nM、0.01nMおよび0nMの濃度を得た。CTLA4を発現す
る293F細胞との氷上での2時間の温置後、100μLのFITC−ヤギ−抗マウスI
gG(1:500)を各チューブに添加し、このチューブを氷上で1時間温置した。30
0μL PBSの添加後、フローサイトメーター上でFITCチャネルを用いて蛍光シグ
ナルを検出した。他の抗体を8D2抗体に対するものと同様の方法で検出した。
3.結果
293F−CTLA4細胞上でのCTLA4の発現を確認した結果を図15および図1
6でそれぞれ示す。293F細胞に対する抗体8D2、8D2(Re)および3種類のヒ
ト化抗体の結合の結果を図17から21でそれぞれ示す。これらの図で示されるように、
8D2抗体およびそのヒト化抗体は、293F宿主細胞の表面上でCTLA4標的タンパ
ク質に効率的に結合し得、それらの結合効率は用量依存性である。各用量での蛍光強度を
表2で提供する。
結合した抗体8D2およびそのヒト化抗体の蛍光定量分析での曲線シミュレーションに
よって8D2およびそのヒト化抗体の、結合効率、EC50を得たが、それを表3で示す

Figure 0006783886
Figure 0006783886
結果から、抗体8D2、8D2(Re)および8D2ヒト化抗体8D2H1L1、8D
2H2L2および8D2H3L3が全て、293F−CTLA4宿主細胞の表面上のCT
LA4抗原に結合する、非常に強い能力があることが明らかになる。
[実施例7]ELISAによる、CTLA4抗原に結合するための抗体の活性の判定
4℃で一晩、ELISAプレートをCTLA4で被覆した。37℃で2時間、1%BS
Aでブロッキングした後、CTLA4抗体8D2、8D2(Re)および8D2ヒト化抗
体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H
2L17および対照抗体10D1(Alan J.Korman,Edward L.H
alkら、HUMAN CTLA−4 ANTIBODIES,米国特許第698472
0号明細書)および11.2.1(Douglas Charles Hanson,M
ark Joseph Neveuら、Human monoclonal antib
odies to CTLA−4,米国特許第682736号明細書)を30分にわたる
反応のために添加した。酵素複合二次抗体を30分にわたる温置のために添加した。次い
で、ELISAプレートリーダー上で450nmでの吸収を決定した。
CTLA4抗原に対する8D2抗体およびそのヒト化抗体の結合を検出した結果は図2
2から25でそれぞれ示す。これらの図で示されるように、抗体8D2、8D2(Re)
および8D2ヒト化抗体は全て、CTLA4タンパク質に効率的に結合し得、それらの結
合効率は用量依存性である。各用量での蛍光強度を表4から8で提供する。結合した8D
2、8D2(Re)およびヒト化抗体の蛍光定量分析での曲線シミュレーションによって
、8D2、8D2(Re)およびヒト化抗体の、結合効率、EC50を得た(表9)。
Figure 0006783886
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Figure 0006783886
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上記の結果から、抗体8D2および8D2(Re)が対照抗体10D1および11.2
.1よりも良好な効率でマウスCTLA4抗原に結合することが明らかになる。ヒト化抗
体8D2H1L1は、対照抗体10D1よりも強く、11.2.1と匹敵する効率でマウ
スCTLA4抗原と結合する。
ヒト化抗体8D2H2L2は、10D1に匹敵する効率でヒトCTLA4抗原に結合す
る。ヒト化抗体8D2H2L2および8D2H3L3は、10D1に匹敵する効率でサル
CTLA4抗原に結合する。ヒト化抗体8D2H2L15および8D2H2L17は、対
照抗体10D1および11.2.1よりも顕著に強い効率でヒトCTLA4抗原と結合す
る。
[実施例8]競合的ELISAによる、CTLA4抗原に対する結合についてB7−1
/2と競合するための抗体の活性の検出
1.ELISAによる、CTLA4抗原に対する結合についてB7−1と競合するため
の抗体の活性の検出
4℃で一晩、B7−1でELISAプレートを被覆した。1%BSAで37℃にて2時
間ブロッキングした後、抗CTLA4抗体、すなわちモノクローナル抗体8D2および8
D2(Re)および8D2ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3
、8D2H2L15および8D2H2L17ならびに対照抗体10D1および11.2.
1を添加した。10分間温置した後、CTLA4−mFcを添加した。37℃で40分間
温置した後、酵素複合二次抗体を添加した。37℃で30分間温置した後、ELISAプ
レートリーダー上で450nmでの吸収を検出した。
2.ELISAによる、CTLA4抗原に対する結合についてB7−2と競合するため
の抗体の活性の検出
4℃で一晩、CTLA4−mFcでELISAプレートを被覆した。1%BSAで37
℃にて2時間ブロッキングした後、抗CTLA4抗体、すなわちモノクローナル抗体8D
2および8D2(Re)および8D2ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D
2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L17ならびに対照抗体10D1および
11.2.1を添加した。10分間温置した後、B7−2−hisを添加した。37℃で
40分間温置した後、酵素複合二次抗体を添加した。37℃で30分間温置した後、EL
ISAプレートリーダー上で450nmでの吸収を検出した。CTLA4抗原に対する8
D2、8D2(Re)およびヒト化抗体の結合を検出した結果は図26から31でそれぞ
れ示す。これらの図で示されるように、8D2、8D2(Re)抗体および8D2ヒト化
抗体は、CTLAプレオテイン(preotein)に効率的に結合し得、それらの結合
効率は用量依存性である。各用量での蛍光強度を表10から16で提供する。結合した抗
体8D2、8D2(Re)およびヒト化抗体の蛍光定量分析での曲線シミュレーションに
よって、8D2、8D2(Re)およびヒト化抗体の、結合効率、EC50を得た(表1
7)。
Figure 0006783886
Figure 0006783886
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上記の結果から、抗体8D2、8D2(Re)および8D2ヒト化抗体8D2H1L1
、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L17の全てが
、CTLA4抗原への結合についてB7と競合し得ることが明らかになった。特に、8D
2、8D2(Re)、8D2H1L1および8D2H2L2は、CTLA4への結合につ
いてのB7−2との競合において10D1よりも強力であり;一方で、8D2H2L17
は、CTLA4への結合についてのB7−1およびB7−2の両方との競合において抗体
10D1および11.2.1よりも強力である。
[実施例9]細胞におけるモノクローナル抗体8D2およびヒト化抗体8D2H1L1
、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L17の生物学
的活性の分析
末梢血単核細胞(PBMC)のIL−2発現におけるモノクローナル抗体8D2および
ヒト化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および
8D2H2L17および対照抗体10D1および11.2.1の効果を検出するために、
ヘパリンナトリウムを含有する回収チューブに健康なドナーからの末梢血を回収した。P
BS中での希釈および分離液上での遠心(2550rpmで20分間)後、細胞懸濁液と
してPBMCを得た。SEB(1μg/mL)/PHA(30μl/ml)とともに細胞
懸濁液を添加し、さらなる培養のために5%COを含有する飽和湿度の37℃のインキ
ュベーターに置いた。Rajiリンパ球および抗体を添加した。48時間(hous)の
同時温置後、PBMCをPBSで2回洗浄し、細胞10,000個/ウェルで96ウェル
プレートに添加した。次いで、対応する濃度勾配の抗体を添加した。20分間の温置後、
72時間の同時温置のために、細胞10,000個/ウェルで、MMCで1時間処理した
Raji細胞を添加した。72時間の同時温置後、細胞培養物を上清のために回収し、キ
ット(Dakewe Co.,DKW12−1020−096)ともに提供される説明書
に従い、ELISAキットを使用して細胞同時培養物の上清中のIL−2発現プロファイ
ルを検出した。
統計学的分析後、実験の結果を図32および33で示す。モノクローナル抗体8D2に
ついて、T細胞群およびRaji細胞群と比較した場合、そのヒト化抗体8D2H1L1
、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15および8D2H2L17は全て、
B7へのCTLA4の結合を効果的に阻止し、Tリンパ球中でIL−2発現を改善し得る
(図32および33)。特に、驚くことに、発明者らは、8D2H2L2、8D2H2L
15および8D2H2L17が対照抗体10D1および11.2.1よりも顕著に優れて
いることを発見した。10nMの濃度で、これらは、100nMの濃度で10D1または
11.2.1により達成されるものに匹敵するかまたはこれらよりさらに良好であるIL
−2レベルに到達した。したがって、本発明の抗体は、より低い濃度、例えば約10nM
でIL−2のレベルを上昇させ得る。
[実施例10]モノクローナル抗体8D2H2L2のインビボ抗腫瘍活性
hu−SCID−raji動物モデルを使用して、8D2H2L2のインビボ抗腫瘍活
性を評価した。Ficoll試薬を用いてヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離し、1
μg/mlのSEBを用いて3日間活性化した。次いで、1.25×10個の活性化P
BMCを5×10個のrajiバーキットリンパ腫細胞および8D2H2L2(20m
g/kg)と混合し、SCID−ベージュマウスの背部に皮下注射した。同時に、1群あ
たり5匹の動物でアイソタイプ対照群を設定した。次に、週に1回、3週間連続で静脈内
注射によって20mg/kgの用量を投与した。実験終了時まで、または腫瘍体積が10
00mmに到達するまで、腫瘍体積を週に2回測定した。
図34で示されるように、8D2H2L2は、hu−SCID−rajiモデルにおい
て腫瘍成長を著しく抑制し得た。この結果から、リンパ腫を処置するために臨床的にこの
抗体を使用し得ることが示された。
本発明の具体的な実施形態を詳細に記載してきたが、当業者は、本明細書で開示される
教示に照らして、様々な改変および変更が詳細に対してなされ得、これらが全て本発明の
保護範囲に包含されることを理解しよう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およ
びその何らかの同等物において定められる。

Claims (17)

  1. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むヒト細胞傷害性Tリンパ球結合抗原4(CTLA4)に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    (a)前記重鎖可変領域が、
    配列番号27のアミノ酸配列を含むHCDR1、
    配列番号28のアミノ酸配列を含むHCDR2、および
    配列番号29のアミノ酸配列を含むHCDR3;
    を含み、
    (b)前記軽鎖可変領域が、
    配列番号30のアミノ酸配列を含むLCDR1、
    配列番号31のアミノ酸配列を含むLCDR2、および
    配列番号32、配列番号33および配列番号34から選択されるアミノ酸配列を含むLCDR3
    を含む、
    抗体またはその抗原結合断片であって、
    ここで、重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号18であり;そして
    軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号16、配列番号22、配列番号24、配列番号8および配列番号12から選択される、
    抗体またはその抗原結合断片。
  2. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、
    (a)配列番号27のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むHCDR2および配列番号29のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号30のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むLCDR2および配列番号32のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む軽鎖可変領域;
    (b)配列番号27のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むHCDR2および配列番号29のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号30のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むLCDR2および配列番号33のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む軽鎖可変領域;
    (c)配列番号27のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むHCDR2および配列番号29のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号30のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むLCDR2および配列番号34のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む軽鎖可変領域;
    からなる群から選択される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 重鎖可変領域が、
    配列番号27のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むHCDR2および配列番号29のアミノ酸配列を含むHCDR3を含み、
    軽鎖可変領域が、
    配列番号30のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むLCDR2および配列番号32のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む、請求項2に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. ヒト化抗体またはその抗原結合断片である、請求項1から3の何れかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 表面プラズモン共鳴により決定した場合に、10−5M未満のKDでヒトCTLA4に結合する、請求項1から4の何れかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 抗体またはその抗原結合断片が、
    (a)B7へのCTLA4の結合を阻止し;
    (b)CTLA4の活性を制御し;
    (c)CTLA4による身体における免疫抑制を緩和し;
    (d)Tリンパ球を活性化し、および
    (e)Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる、
    からなる群から選択される少なくとも一つの活性を提供可能である、請求項1から5の何れかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 以下をコードする単離核酸分子:
    (i)ヒトCTLA4に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域であって、ここで、該重鎖可変領域が、配列番号18であるアミノ酸配列を含及び
    (ii)ヒトCTLA4に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域であって、ここで、
    (a)該軽鎖可変領域が、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号22および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含;または
    (b)該軽鎖可変領域をコードする単離核酸分子が、配列番号7、配列番号11、配列番号15、配列番号21および配列番号23からなる群から選択され
  8. 請求項7に記載の単離核酸分子を含む、ベクター。
  9. 請求項8に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  10. 請求項1から6の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、請求項9に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記抗体またはその抗原結合断片を細胞培養物から回収する段階を含む、方法。
  11. 請求項1から6の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、医薬的に許容可能な担体および/または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  12. ヒト対象において腫瘍を処置するための医薬組成物であって、請求項1から6の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
  13. 有効量の、請求項1から6の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を細胞に投与する段階を含む、インビトロの方法であって、該方法が、
    (a)試料中のCTLA4のレベルを検出する、
    (b)B7へのCTLA4の結合を阻止する、
    (c)CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御する、
    (d)CTLA4による身体における免疫抑制を緩和する、
    (e)Tリンパ球を活性化する、または
    (f)Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる、
    から選択される、インビトロの方法。
  14. 腫瘍の処置のための薬剤の製造のための、請求項1から6の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
  15. 有効量の、請求項1から6の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、該医薬組成物が、
    (a)B7へのCTLA4の結合を阻止する、
    (b)CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御する、
    (c)CTLA4による身体における免疫抑制を緩和する、
    (d)Tリンパ球を活性化する、または
    (e)Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる、
    から選択される目的に使用される、医薬組成物。
  16. 腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍/腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌/肝癌から選択される、請求項12に記載のヒト対象において腫瘍を処置するための医薬組成物。
  17. 腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍/腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌/肝癌から選択される、請求項14に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
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