JP6781973B2

JP6781973B2 - 腎臓病進行抑制細胞シート組成物、その製造方法、及び、それを用いた腎臓病進行抑制方法

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Publication number: JP6781973B2
Application number: JP2016016546A
Authority: JP
Inventors: 雅俊岡; 佐智子関谷; 清水　達也; 達也清水; 孝作新田; 岡野　光夫; 光夫岡野
Original assignee: Tokyo Womens Medical University
Current assignee: Tokyo Womens Medical University
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2020-11-11
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: US20170216362A1; JP2017132744A; US10688133B2

Description

本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞を含む、腎臓病進行抑制又は予防細胞シート組成物に関する。また、本発明は、腎臓病進行抑制又は予防細胞シート組成物を製造する方法に関する。また、本発明は、細胞シート組成物を用いた、腎臓病の進行抑制又は予防する方法に関する。

糖尿病や高血圧を含む疾患により引き起こされる慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅ：ＣＫＤ）は徐々に、かつ、不可逆的に腎線維化が進行し、腎機能が失われる。ＣＫＤ患者は、その病状が進行して腎機能が１５％以下になると末期腎不全となり、腎代替療法が必要となり、大多数が血液透析を行う。血液透析治療には、毎週３回程度、１回あたり数時間拘束されてしまうことから、ＱＯＬが著しく低下してしまうのみならず、治療の長期化に伴う合併症を引き起こすという課題を有している。さらに、血液透析は、生涯にわたって治療が必要であり、高額な医療費が必要となり社会問題と化している。末期腎不全を罹患した患者が血液透析治療および腹膜透析治療を回避するためには腎移植が必要となるが、日本を含む世界中でドナーが圧倒的に不足しており、従来治療に代わる新しい治療が求められている。ＣＫＤの病態進行を抑制して、透析治療を導入する数を減らすことは喫緊の課題といえる。

現在、原因疾患を治療することによって、ＣＫＤ進行を抑制する治療が試みられているが、腎臓に直接働きかけるような治療は未だ確立されていない。既往研究により、ＨＧＦなどのサイトカインを進行する腎線維化の抑制作用が研究されていたが（例えば、非特許文献１及び２）、全身的投与では肝臓への初回通過効果での喪失が著しく、有効濃度を腎臓に長期間作用させることが困難であった（非特許文献３）。

ＭｉｚｕｎｏＳ．，ＭａｔｕｍｏｔｏＫ．，ＮａｋａｍｕｒａＴ．，ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．１３０４−１３１４２００１ＧａｏＸ．，ＭａｅＨ．，ＡｙａｂｅＮ．，ｅｔａｌ．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．１２３８−１２４８２００２ＳｕｇｉｕｒａＴ．，ＴａｋａｈａｓｈｉＳ．，ＳａｎｏＫ．，ｅｔａｌ．ＪｏｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ２３７−２４９２０１３

上述のように、ＣＫＤ進行を抑制する治療剤又は方法の開発が試みられているが、未だ十分なものが提供されるに至っていない。そこで、本発明は、腎臓病進行抑制又は予防細胞シート組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、腎臓病進行抑制又は予防細胞シート組成物を製造する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、細胞シート組成物を用いた、腎臓病の進行抑制又は予防する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞を含む、細胞シート組成物を腎臓へ適用すると、腎臓病進行抑制又は予防することを見出した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。

［１］肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞を含む、腎臓病進行抑制又は予防細胞シート組成物。
［２］腎臓の線維被膜下に適用されるように用いられることを特徴とする、［１］に記載の細胞シート組成物。
［３］前記腎臓病が、糖尿病性腎症、腎硬化症、慢性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、閉塞性腎症、急速進行性糸球体腎炎、ループス腎炎、間質性腎炎からなる群から選択される１以上の腎疾患によって引き起こされる腎臓病である、［１］又は［２］に記載の細胞シート組成物。
［４］前記細胞が、ＨＧＦタンパク質を発現する核酸がコードされたベクターが導入された細胞を含む、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の細胞シート組成物。
［５］前記細胞が、間葉系幹細胞を含む、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の細胞シート組成物。
［６］前記間葉系幹細胞が、臍帯血、胎盤、骨髄、脂肪組織、滑膜、歯髄及び／又は、多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞である、［５］に記載の細胞シート組成物。
［７］前記間葉系幹細胞が、骨髄由来幹細胞である、［５］に記載の細胞シート組成物。

［８］（１）刺激応答性培養基材上に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞を含む細胞群を播種し、コンフルエントになるまで培養する工程、（２）前記刺激応答性培養基材から前記細胞が剥離する刺激を与える工程、を含む、［１］〜［７］に記載の細胞シート組成物を製造する方法。
［９］前記工程（１）において、培養に用いられる培地が、アスコルビン酸又はその塩を含有する、［８］に記載の方法。

［１０］［１］〜［７］のいずれか１項に記載の細胞シート組成物を、哺乳動物の腎臓の線維被膜下に適応する、腎臓病の進行抑制又は予防する方法。

本発明によって、種々の要因により起こる腎臓の線維化の進行を劇的に抑制して、腎機能を維持することが可能となる。さらに、本発明は、腎臓が障害を受けたことによって、腎髄質で生じる血行不全を改善し、腎臓で最も重要な機能の一つである尿濃縮能（水再吸収能）及び生体内の電解質濃度調整、ｐＨ調整、タンパク質やアミノ酸再吸収機能を司る腎髄質の尿細管構造を維持し、腎髄質構造の崩壊による腎髄質機能低下および腎実質菲薄化を著しく改善する。本発明によって、ＣＫＤ進行を抑制又は防止し、血液透析治療を導入する患者を減少し、ＱＯＬの低下の抑制及び医療費の大幅抑制に貢献する。

図１は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）タンパク質発現ベクターを構築する手順を示す図である。図２は、細胞シート組成物を移植する手順を示す図である。（ａ）遺伝子導入によるＨＧＦ産生機能をもつ細胞シートのＵＵＯモデルにおける腎機能維持効果を確認するプロトコール。（ｂ）：間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性シートのＵＵＯモデルにおける腎機能維持効果を確認するプロトコール。図３は、遺伝子導入よるＨＧＦ発現機能を有する細胞シートからのＨＧＦ発現と形状および移植後形態を示す図である。（ａ）回収後のＭＥＴ−ＨＧＦ細胞シートを示す図である。（ｂ）細胞シート培養上清中に２４時間で分泌されたＨＧＦ濃度を示す図である。（ｃ）ＨＥ染色による培養ＭＥＴ−ＨＧＦ細胞シートを示す図である。（ｄ）培養ＭＥＴ−ＨＧＦ細胞シートにおけるＳＶ４０蛋白を検出した図である。（ｅ）腎線維被膜下移植一週間後のＳＶ４０陽性ＭＥＴ−ＨＧＦ細胞シートを示す図である。（ｆ）移植４週後におけるＭＥＴ−ＨＧＦ細胞シート移植群の腎臓内ｈＨＧＦ分布状態を示す図である。図４は、ＨＧＦ発現機能を有する細胞シートを移植後１週間後の組織学的解析の結果を示す図である。（ａ）ＵＵＯ群、ＭＥＴ群、ＨＧＦ群における一週間後のシリウスレッド染色による線維化を検出した結果を示す。（ｂ）ＵＵＯ群、ＭＥＴ群、ＨＧＦ群における一週間後のαＳＭＡ免疫染色による筋線維芽細胞検出の結果を示す。（ｃ）（ａ）に代表される各実験によって取得された画像を数値化し、線維化を比較したグラフを示す。（ｄ）（ｂ）に代表される各実験によって取得された画像を数値化し、筋線維芽細胞の陽性領域を比較したグラフを示す。図５は、ＨＧＦ発現機能を有する細胞シート移植４週間後までの腎容積の変化と４週後の腎の比較を示す図である。（ａ）ＵＵＯ群、ＭＥＴ群、ＨＧＦ群における４週後の腎臓を示す図である。（ｂ）ＵＵＯ群、ＭＥＴ群、ＨＧＦ群における４週後の腎臓μＣＴ画像を示す図である。（ｃ）（ｂ）の解析によって得られた値から作製した経時的腎容積の推移グラフを示す。ＨＧＦ発現機能を有する細胞シートを腎線維被膜上に適用した例（「ＨＧＦ（被膜上）」）も含む。図６は、ＨＧＦ発現機能を有する細胞シート移植４週間後の腎における組織学的解析を示す図である。（ａ）ＵＵＯ、ＭＥＴ、ＨＧＦ群における４週間後のシリウスレッド染色による線維化を検出した図である。（ｂ）ＵＵＯ、ＭＥＴ、ＨＧＦ群における４週間後のαＳＭＡ免疫染色による筋線維芽細胞を検出した図である。（ｃ）（ａ）に代表される各実験によって取得された画像を数値化し、線維化を比較したグラフを示す。（ｄ）（ｂ）に代表される各実験によって取得された画像を数値化し、筋線維芽細胞の陽性領域を比較したグラフを示す。図７は、ＨＧＦ発現機能を有する細胞シート移植後のエコー解析による血流解析および血管構造解析を示す図である。（ａ）小動物用エコーを用いた腎血流量の測定値の推移グラフを示す。（ｂ）４週後のＭＥＴ群、ＨＧＦ群における血管内皮細胞染色像を示す。図８は、間葉系幹細胞シート移植４週後の腎組織解析の結果を示す図である。（ａ）腎表面への移植直後である骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シートを示す図である。（ｂ）骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シート移植４週後の腎臓を示す図である。（ｃ）骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シート移植４週後の腎臓のＨＥ染色組織像を示す。（ｄ）移植４週後の骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シートを示す図である。（ｅ）骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シート移植４週後の腎臓のＨＥ染色、シリウスレッド染色、およびαＳＭＡ免疫染色組織像を示す。

一般的に、腎臓とは泌尿器系の臓器であり、血液からの老廃物の除去及び水分のろ過と排出を行い、体液の恒常性の維持を行う重要な臓器である。腎臓は、中胚葉から発生し、ヒトの体内においては、腹の裏側、横隔膜の下に一対存在する。組織学的には、皮質と髄質から成る実質で構成され、皮質には、ネフロンと呼ばれる機能単位が多数存在し、ヒトの場合、左右の腎臓で約２００万個存在する。ネフロンは、腎小体及びそれに繋がっている尿細管から構成される。腎小体は、一本の輸入細動脈、その輸入細動脈の先が分枝して構成された毛細血管の塊（糸球体）及び、糸球体の毛細血管が再び一本に集まった輸出細動脈から構成されている。糸球体を取り囲むボーマン嚢は、毛細血管からろ過された毒素を含む水分を受け取る構造体であり、ボーマン嚢は尿細管へと繋がっている。個々のネフロンにおいて、ろ過、再吸収、分泌、濃縮を行い、尿を製造する。

慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅ：ＣＫＤ）は、日本人成人の約８人に一人が発症するといわれ、糖尿病、高血圧、慢性糸球体腎炎など多数の疾患が原因として発症する。慢性腎臓病とは、タンパク尿（微量アルブミン尿を含む）などの異常尿、画像診断や血液検査、病理所見で腎障害が明らかである場合、又は、糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）が６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２未満の状態が３ヶ月以上継続する場合をいう（日本腎学会編「ＣＤＫ診断ガイド」２００７）。その進行度によって、Ｇ１〜Ｇ５まで分類されており、数字が進むほど、重症度が増していることを示す。様々な研究によって、ＣＫＤが進行している患者には、糸球体濾過量が低下し腎間質線維化が共通することが明らかとなっている。線維化とは、臓器や組織において、障害に伴ってコラーゲンなどの細胞外基質が過剰に蓄積し、当該臓器や組織が硬化することを指す。線維化が進行すると、その臓器は機能不全となる。腎臓において、こうした線維化が進行してしまうと、尿を製造する機能が徐々に失われてしまい、重篤になると血液透析又は腹膜透析又は腎移植を行わなければ、死に至ってしまう。腎臓の線維化は不可逆的に進行するため、腎機能が失われると、現状では血液透析又は腹膜透析又は腎移植をするしか手段はない。そのため、いかに腎線維化の進行を抑制し、腎機能を維持するかが重要となる。

また、ＣＤＫの進行に従い、腎髄質では不可逆的な構造の崩壊が起こり、腎髄質機能が低下し腎実質が菲薄化する現象が見られる。腎髄質は、尿濃縮能（水再吸収能）及び生体内の電解濃度調節、pH調整、タンパク質やアミノ酸再吸収機能も司る重要な組織であり、腎機能を維持するためには、腎皮質の線維化抑制同様、腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化を抑制することも重要である。

本発明において、「腎臓病」とは、上述のように腎皮質の線維化及び／又は腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化をいう。本発明において、「腎臓病進行」とは、上述のような腎皮質の線維化及び／又は腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化が進行することをいう。本発明によって、腎臓病進行が抑制又は防止することが可能となり、腎機能を維持することが可能となる。

本発明において、適用される腎臓病としては、例えば、糖尿病性腎症、腎硬化症、慢性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、閉塞性腎症、急速進行性糸球体腎炎、ループス腎炎、間質性腎炎等が挙げられる。これらの腎臓病は、病態の進行に伴い、腎皮質の線維化及び／又は腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化が引き起こされる。本発明を用いれば、上記疾患によって引き起こされる腎皮質の線維化及び／又は腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化を、抑制又は防止することが可能となる。

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とは、サイトカインの一種であって、一般的に線維芽細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、間葉系幹細胞などから産生され、主に上皮系細胞の増殖や機能を制御する因子として知られる。ＨＧＦは肝実質細胞ばかりでなく、血管内皮細胞では遊走能の促進、管腔形成などの形態形成誘導作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用および免疫応答調節作用なども有することが知られる。また、ＨＧＦの全身投与においては、腎線維化を抑制する作用があることが知られているが、投与されたＨＧＦは肝臓にて急速に分解されてしまうため、腎臓病の進行を抑制するのに十分な効果を与える有効濃度を作用させるのが困難であった。本発明であれば、腎臓に直接的かつ持続的に有効量のＨＧＦを作用させることが可能となり、腎臓病の進行を抑制又は防止することが可能となる。

本発明の、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞は、例えば、ＨＧＦタンパク質を持続的に発現する細胞であってもよく、ＨＧＦ遺伝子を有するベクターを遺伝子導入し、一過性又は持続的にＨＧＦタンパク質を発現する細胞であってもよく、任意の方法によって内在性のＨＧＦ遺伝子発現を活性化させた細胞であってもよい。安定的かつ継続的にＨＧＦ産生を行う細胞を用いた方がよく、好ましくは、ＨＧＦタンパク質を持続的に発現する細胞、又は、ＨＧＦ遺伝子を有するベクターを遺伝子導入して持続的にＨＧＦタンパク質を発現する細胞を用いることが好ましい。本発明に用いられる、ＨＧＦタンパク質を持続的に発現する細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、筋芽細胞等が挙げられ、これらを単独又は複数混合させて用いてもよい。

本発明において「肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞」とは、一般的な培養環境下又は生体内の環境において、細胞内に存在するＨＧＦ遺伝子を基に転写、翻訳等を行い、ＨＧＦタンパク質を産生する能力を有する細胞をいう。また、本発明において「肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞」とは、ＨＧＦ遺伝子を有しているが、一般的な培養環境下においてＨＧＦタンパク質を産生しない細胞と比較して、有意に高いＨＧＦタンパク質量を放出する細胞と定義することもできる。この場合、ＨＧＦタンパク質量を測定する方法は、市販のＨＧＦタンパク質用ＥＬＩＳＡキットや、その他の公知の方法を用いて測定可能である。

本発明において、使用される細胞に遺伝子導入されるＨＧＦ遺伝子は、適用する動物種のＨＧＦタンパク質を発現する遺伝子であることが好ましい。例えば、適用する動物種がヒトである場合、配列番号：１のアミノ酸配列を有したＨＧＦを発現する遺伝子をコードするベクターを導入すればよい。本発明において、発現するＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：１以外にもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において上記遺伝子産物を利用するためには、任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、サル、チンパンジーなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることも可能である。また、野生型の遺伝子産物のほか、数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失したＨＧＦタンパク質発現遺伝子であって、野生型のＨＧＦタンパク質と同様の機能を有するＨＧＦタンパク質を発現する遺伝子も利用可能である。

本明細書において使用される用語「サイトカイン」とは、細胞から産生される微量生理活性タンパク質の総称であって、当該分野において用いられる最も広義の意味と同等のものと定義される。サイトカインは、細胞同士のコミュニケーションを司り、細胞の増殖・分化・機能発現に関与する。細胞より産生されるサイトカインは産生細胞自身に作用するオートクライン効果、又は他の細胞へ作用するパラクライン効果によって働く。本発明において用いられる細胞は、ＨＧＦを産生する機能を有する細胞であるが、ＨＧＦ以外の複数のサイトカインを産生する細胞であってもよく、ＨＧＦ以外のサイトカイン遺伝子を導入した細胞であってもよい。例えば、ＨＧＦ以外のサイトカインとしては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ７）、若しくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のような細胞増殖因子、インターロイキン類、ケモカイン類、若しくはコロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、又は、インターフェロン類などが挙げられる。

本発明において、ＨＧＦタンパク質発現するために使用されるベクターは特に限定されず、適宜選択可能である。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。ＨＧＦ遺伝子をベクターに導入する方法は、任意の遺伝子組換え技術を用いて導入することが可能であり、特に限定されない。また、ＨＧＦ遺伝子が組み込まれたベクターを細胞へトランスフェクションする方法も公知の方法に従えばよく、特には限定されない。また、遺伝子導入されて、ＨＧＦタンパク質を持続的に発現する細胞を選択する方法も特には限定されず、例えば、使用したベクターに導入されている薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン等）を使用して選択すればよい。

本発明における「細胞シート組成物」とは、複数の任意の細胞を含む細胞群を細胞培養基材上で培養し、細胞培養基材上から剥離することで得られる１層又は複数層のシート状の細胞群をいう。細胞シート組成物を得る方法としては、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材表面を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法や、任意の培養基材にて細胞を培養し、細胞培養基材の端部から物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。好ましい形態としては、刺激応答性培養基材として、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した温度応答性培養基材を用いる方法である。温度応答性培養基材上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで細胞を培養し、細胞をシート状に剥離して回収する方法である。その際、細胞は０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養基材上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養する。その温度域とは通常、細胞を培養する温度、例えば３３℃〜４０℃であることが好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。

刺激応答性高分子、特に温度応答性高分子としてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を用いた場合を例（温度応答性培養皿）に説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集して白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆されて固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に固定されているため、培養基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、培養基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に被覆されているため、培養基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着し、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できない表面となる。そのため、該基材を３１℃以下に冷却すると、細胞が基材表面から剥離する。細胞が培養面一面にコンフルエントになるまで培養されていれば、該基材を３１℃以下に冷却することによって細胞シート組成物が回収できる。温度応答性培養皿は、同一の効果を有するものであれば限定されるものではないが、例えば、セルシード社が市販するＵｐＣｅｌｌ（登録商標）などが挙げられる。

本発明に用いられる細胞の動物種の由来は、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本発明の細胞シート組成物をヒトの治療に用いる場合はヒト由来、ブタの治療に用いる場合はブタ由来、サルの治療に用いる場合はサル由来、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来、ネコの治療に用いる場合はネコ由来の細胞を用いる方が好ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家細胞）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（他家細胞）、市販の細胞株であってもよい。

本明細書中において、「間葉系幹細胞」とは、未分化な細胞で、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、及び／又は腱細胞等のさまざまな間葉系の細胞へ分化する能力を持ち、且つ自己複製の能力を持つ細胞をいう。ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）において、間葉系幹細胞を既定する以下の３つの最小限の基準；（１）標準的な培養条件でプラスチックに接着して培養できること、（２）免疫学的特徴として、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａ又はＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性であること、（３）ｉｎｖｉｔｒｏ分化系で骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞への分化能を示すこと、を提唱するが、本発明においては、これに限定されない。その他、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０６及びＳＴＲＯ−１も間葉系幹細胞を示す陽性マーカーとして挙げられる。本発明において、「間葉系幹細胞」は、可能な限り最も広く解釈される。

間葉系幹細胞は、生体内においては、骨髄、脂肪組織、臍帯血、歯髄、滑膜、胎盤等の組織から単離される細胞であって、公知の方法を用いて単離することができる。

例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、骨髄から採取した骨髄液を、密度勾配遠心法にて血球系細胞を分離し、プラスチック培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ₂環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。

脂肪組織由来間葉系幹細胞（脂肪組織由来幹細胞；Ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌ）は、採取した脂肪組織を細分化（ミンス（ｍｉｎｃｅ））し、コラゲナーゼタイプＩＩによって、３７℃１時間処理をして組織を消化し、培地を加えて遠心分離する。その後、沈殿した細胞を基礎培地で洗浄し、セルストレーナー等のメッシュにてろ過し、プラスチック培養皿に播種して、３７℃、５％ＣＯ₂環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。その他の組織由来の間葉系幹細胞を単離する方法については、公知の方法を用いればよく、限定されない。

間葉系幹細胞は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞であってもよい。本明細書において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本発明で用いられる多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒyｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒyｏｎａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エビブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒyｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｇｅｒｍｌｉｎｅｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（参照：国際公開ＷＯ２０１１／００７９００）などが含まれる。多能性幹細胞より、公知の方法（例えば、特開２０１２−１２０４８６、ＦｕｋｕｔａＭ．，ｅｔａｌ.，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈａｎｅｕｒａｌｃｒｅｓｔｌｉｎｅａｇｅｕｓｉｎｇｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｉｔｈｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉａ．ＰＬＯＳＯＮＥ，２０１４；９（１２）：ｅ１１２２９１．等）を用いて誘導された間葉系幹細胞を用いてもよい。

間葉系幹細胞の分化誘導される能力については、公知の方法によって確認すればよい。例えば、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化誘導の確認には、インスリン及びデキサメサゾンを加えた培地で培養して、ＯｉｌＲｅｄＯ染色によって確認すればよい。例えば、間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導では、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸、デキサメサゾンを培地に添加して培養し、アルカリフォスファターゼ染色で確認すればよい。例えば、間葉系幹細胞から筋分化誘導には、ウマ血清を加えた培地で培養すればよく、筋細胞に特異的な融合細胞が出現することを確認すればよい。その他、間葉系幹細胞からの分化誘導は、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。分化誘導の有無の確認も公知の方法を用いればよく、例えば、分化誘導後にのみ発現する遺伝子又はタンパク質を、リアルタイムＰＣＲ法、フローサイトメーター等によって検出すればよい。

本発明に使用される間葉系幹細胞の由来は限定されないが、骨髄又は脂肪組織であれば、採取方法、分離方法が広く確立されており、好ましい。

細胞の由来によっては、細胞培養基材上に接着しにくい細胞があり、そのような場合は、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の細胞接着性タンパク質を単独又は２種以上の混合物を予め被覆した細胞培養基材上で細胞を培養することができる。これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、例えば、細胞接着性タンパク質を含む水溶液を細胞培養基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去し、リンスする方法等が挙げられる。

本発明において、細胞シート組成物に含まれる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する能力を有する細胞の数は、貼付する部位の大きさ、度合いによって変化するため、限定されない。また、本発明の細胞シート組成物に含まれる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する能力を有する細胞の割合も限定されないが、例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい。細胞シート組成物に含まれる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する能力を有する細胞の割合が高ければ高いほど、腎皮質の線維化及び／又は腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化を抑制又は防止する効果が、より高くなる。

本発明の一態様において、間葉系幹細胞を含む細胞シート組成物を構成する細胞としては、間葉系幹細胞以外の細胞が含まれてもよく、例えば、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、上皮系細胞、間質細胞等、移植する部位、目的によって適宜選択すればよい。また、間葉系幹細胞を採取した組織由来の細胞（例えば、間葉系細胞）が含まれていても良い。

本発明において、細胞シート組成物を作製するために播種する細胞数は動物種や細胞種によって異なるが、例えば、０．３×１０⁴〜１０×１０⁶個／ｃｍ²であってもよく、０．５×１０⁴〜８×１０⁶個／ｃｍ²であってもよく、０．７×１０⁴〜５×１０⁶個／ｃｍ²であってもよい。本発明においては、細胞シート組成物を温度応答性培養基材から剥離して回収するためには、細胞が付着し、コンフルエント又はサブコンフルエント状態となった培養基材の温度を、被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることで得られる。その際、細胞シート組成物の作製は、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞シート組成物をより早く、高効率に剥離、回収するために、培養基材を軽くたたいたり揺らしたりする方法、ピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独又は併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は常法に従えばよい。例えば、使用する培地については公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、無血清培地を用いてもよい。

本発明に用いられる細胞シート組成物の作製用の細胞培養基材の形状は、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、又は平膜状などの形状のものを用いることができる。細胞培養基材の材料としては、通常、細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の化合物や、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。

本発明に用いられる細胞シート組成物の作製用の細胞培養基材は、細胞が接着する領域と細胞が接着しない領域の両方とを同一培養面上に備えた細胞培養基材を用いてもよく、例えば、複数の円形の細胞接着領域と、それ以外の細胞を接着しない領域とを同一培養面に備えた細胞培養基材を用いることで一度に複数の細胞シートを作製することが可能である。この場合、細胞接着領域の形状は円形、正方形、三角形、長方形等、目的に応じて所望の形状であってよく、その大きさも適宜変更することができる。細胞が接着しない領域を設ける方法としては特に限定されないが、例えば細胞と親和性の低い細胞非付着性高分子である、ポリ−Ｎ−アクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース等の親水性高分子、又はシリコーン高分子、フッ素高分子等の強疎水性高分子等を被覆する方法等が挙げられる。

本発明における細胞シート組成物は、従来、接着性細胞を回収する際に用いられるディスパーゼ、トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いないため、細胞表面に発現するタンパク質に損傷をほとんど受けていない。そのため、細胞培養基材から剥離された細胞シート組成物の下面（細胞培養基材と接触していた側の面）は、損傷を受けていない接着性タンパク質を豊富に有しており、また、細胞−細胞間のデスモゾーム構造が保持されている。このような構造を有していることにより、細胞シート組成物は生体患部に貼付することや、細胞シート組成物を積層することに適している。タンパク質分解酵素であるディスパーゼは、細胞−細胞間のデスモソーム構造を１０〜４０％保持した状態で細胞を剥離させることができることで知られているが、細胞−培養基材間に存在する基底膜様タンパク質等も同時に破壊してしまう。これに対して、本発明に用いられる細胞シート組成物は、デスモゾーム構造及び基底膜様タンパク質の両者を６０％以上残存された状態で剥離・回収可能であり、上述したような種々の効果を得ることができる。

本発明の細胞シート組成物は、複数の細胞シート組成物を積層した積層化細胞シート組成物を用いても良い。本発明において、積層化細胞シート組成物を用いた場合、貼付する細胞数が多くなり、腎皮質の線維化及び／又は腎髄質の構造の崩壊及び／又は腎髄質機能低下及び/又は腎実質の菲薄化を抑制又は防止効果がより高くなる。積層化細胞シート組成物を得る方法としてはピペット等によって培養液中に浮かんでいる細胞シート組成物を培養液ごと吸い取り、別の培養皿の細胞シート組成物上に放出し、液体培地の流れによって積層する方法、細胞移動治具を用いて積層する方法等が挙げられる。本発明の積層化細胞シート組成物を製造する方法では、細胞移動治具を用いる方法の方が、細胞シート組成物を損傷させることなく積層することが可能となるため、好ましい。細胞移動治具は、細胞シート組成物を捕捉できる機能を有するものであればよく、例えば、材料としては、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーン樹脂、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリンゲル等を用いることができる。細胞移動治具の形状としては、例えば、スタンプ型、膜状、多孔膜状、不織布状、織布状の形状で使用される。本発明の実施形態では、細胞移動治具は細胞シート組成物を破損することなく回収し、別の細胞シート組成物に積層する機能を有していればよく、細胞接着性タンパク質、細胞接着性ペプチド、又は親水性ポリマーの１種、若しくは２種以上からなる細胞付着部を有する培養細胞移動治具であることが好ましい。例えば、特開２００５−１７６８１２号公報には細胞付着部を有したスタンプ型の培養細胞移動治具を開示している。該スタンプ型の培養細胞移動治具は、その細胞付着部によって細胞シート組成物を破損することを防止し、細胞シート組成物が培養皿から剥離するときに起こる細胞シート組成物の縮みを防止しながら回収を可能とする。該細胞移動治具により、細胞シート組成物を別の細胞シート組成物上に容易に移動させつつ、細胞シート組成物を縮ませることなく積層することができる。細胞シート組成物を縮ませずに積層することにより、細胞シート組成物同士が隙間なく積層され、高密度な三次元構造を有する積層化細胞シート組成物を得ることができる。

本発明の細胞シート組成物を製造する方法について、さらに、アスコルビン酸を添加した培地で培養してもよい（参照：ＫａｔｏＹ，ｅｔａｌ．ＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆａｎＡｄｉｐｏｓｅ−ＤｅｒｉｖｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌＳｈｅｅｔＣｏｍｂｉｎｅｄＷｉｔｈＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｋｉｎＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｓＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇｉｎａＲａｔＷｏｕｎｄＭｏｄｅｌｏｆＴｙｐｅ２ＤｉａｂｅｔｅｓａｎｄＯｂｅｓｉｔｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１５Ａｕｇ；６４（８）：２７２３−３４）。アスコルビン酸を添加した培地で培養することによって得られた間葉系幹細胞を含む細胞シート組成物は、アスコルビン酸を添加せずに培養して得られた細胞シート組成物よりも強度が高く、破れにくい細胞シート組成物が得られる。これは、アスコルビン酸が、細胞シート組成物に含まれる細胞から、細胞外マトリックスの分泌を促進され、その結果、細胞シート組成物の強度が増大するものと考えられる。アスコルビン酸を含む培地で培養することによって、移植に適した細胞シート組成物が得られ、好ましい。

本発明において、「アスコルビン酸」とは、アスコルビン酸又はその誘導体その誘導体（例えば、アスコルビン酸２リン酸、アスコルビン酸１リン酸、Ｌ一アスコルビン酸ナトリウムなど）をいい、さらに、その塩（ナトリウム塩、マグネシウム塩等）も含まれる。

多くの腹腔内の臓器は、被膜（漿膜）によって被われており、臓器が腹腔内の所定の位置に配置されるように腹壁に固定する役割を果たしている。線維被膜は、主に単層の扁平上皮（中皮細胞）から形成されている。本発明において、細胞シート組成物を適用する部位としては、臓器の表面が好ましいが、特に好ましいのは、線維被膜下であって、臓器表面であることが好ましい。線維被膜を剥がして臓器表面に細胞シート組成物を適用することにより、本発明の細胞シート組成物から放出されるＨＧＦを含む、様々なサイトカインが安定的かつ持続的に供給されることとなり、発明の効果を顕著に高めることが可能となる。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。なお、本実施例におけるラットを用いた実験プロトコールは、東京女子医科大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されたものであり、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって刊行された「実験動物の管理と使用に関する指針」（１９９６年改定版）に沿って実施された。

＜材料及び方法＞
１．細胞シートの作成方法
１−１．遺伝子導入よるＨＧＦ産生機能を有する細胞の作製
１−１−１．ｈＨＧＦタンパク質発現プラスミドベクターの構築
公知の遺伝子組換え方法により、図１に示す手順で遺伝子組換えを行った。以下、簡単に説明する。
（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヒトＨＧＦｃＤＮＡ及びその５’上流にＳＲαプロモーターを有するプラスミド（ｐＵＣ−ＳＲα／ＨＧＦ（６．２ｋｂ）、参考：ＳｅｋｉＴ．，ＨａｇｉｙａＭ．，ＳｉｍｏｎｉｓｈｉＭ．，ＮａｋａｍｕｒａＴ．，ＳｈｉｍｉｚｕＳ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｅｎｃｏｒｄｉｎｇｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ１９９１Ｖｏｌ．１０２２１３−２１９）より、制限酵素ＳａｌＩにて核酸配列を切り出した。
（２）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）から、制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩを用いてＰ_ＣＭＶを切り出した。
（３）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニングサイトを制限酵素ＸｈｏＩで処理して（１）で得られた核酸断片をライゲーションした。

１−１−２．ＨＧＦタンパク質発現細胞の取得
遺伝子導入よるＨＧＦ産生機能を有する細胞としてヒト中皮細胞株（Ｍｅｔ−５Ａ、ＳＶ４０不死化細胞）へ上述のｈＨＧＦ発現プラスミドベクターをリポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて遺伝子導入し、Ｇ４１８にてクローニングした細胞であるＭｅｔ−ＨＧＦ細胞を抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ社）および０．１５ｍｇ／ＬＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｈ６９０９）と５ｍｇ／ｍＬＩｎｓｕｌｉｎ（Ｗａｋｏ社）、５００ｎｇ／ｍＬＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０％牛胎児血清ＦＢＳ（ＪａｐａｎＢｉｏＳｅｒｕｍ社）を含むＭ１９９（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｍ４５３０）培養液（以下、「Ｍｅｔ用培地」という。）にて培養を行った。遺伝子導入をされていないＭｅｔ−５ＡはＧ４１８を除くＭｅｔ用培地にて必要細胞数を増殖、培養を行った。

１−２．遺伝子導入よる細胞シートの作製
細胞シートは、１．２ｘ１０⁶個の細胞数にて、Ｍｅｔ用培地を用いて３５ｍｍ温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社）へ播種を行った。４日間３７℃ ＣＯ₂ ５％インキュベーターにて培養後、２０℃ ＣＯ₂ ５％インキュベーターにて１時間培養することで培養皿から剥離、腎臓病進行抑制細胞シートの回収を行った。

１−３．骨髄間葉系幹細胞の採取と培養
４〜６週令の雄ＧＦＰ発現ラット（ＳＤ−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）Ｒａｔ）を犠牲死後、大腿骨骨髄液を２３Ｇの注射針を用いて、抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ社）を含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）（以下、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍ」という。）を５ｍＬシリンジに入れ、２回フラッシュすることで骨髄細胞を回収した。セルストレイナー（ＢＤＦａｌｃｏｎ社）を用いて夾雑物を除去し、回収された細胞を遠心分離後、Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍ１０ｍＬで懸濁、１００ｍｍ細胞培養皿（ＢＤＦａｌｃｏｎ社）にて３７℃ ＣＯ₂ ５％インキュベーター内に２４時間培養した。２４時間後に培養液を除き、ＰＢＳ５ｍＬで３回洗うことにより、夾雑する赤血球を除去した。その後、再び１０ｍＬのＣｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍにてコンフルエントまで４〜５日間培養し、継代を行った。３回のトリプシン・ＥＤＴＡによる継代培養後の細胞を骨髄由来の間葉系細胞として細胞シートを作成した。

１−４．間葉系幹細胞を含む細胞シートの作製法
上述の方法で得た間葉系幹細胞を、３〜４×１０⁵個の細胞数にて、Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍを用いて３５ｍｍ温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社）へ播種を行った。３日後に２５０μg／Ｌアスコルビン酸（ＷＡＫＯ社、＃０１３−１９６４１）含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍに培地交換を行った。再び３日後にアスコルビン酸含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍに培地交換を行い、翌日（播種後７日目）２０℃ ＣＯ₂ ５％インキュベーターにて１０分程度培養することで培養皿から剥離し、細胞シートの回収を行った。

２．間葉系幹細胞を含む細胞シートの効果の解析方法
２−１．一側尿管結紮術モデル（Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｕｒｅｔｅｒａｌｏｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ（以下、「ＵＵＯ」という。）の作製

５週令の雄Ｎｕｄｅｒａｔ（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ，日本クレア株式会社）をイソフルランの麻酔下、背部から腎臓直上を切開し、腎臓を露出した。腎門部の脂肪を穏やかに剥離し、尿管を露出した。尿管は腎から５ｍｍ以内の距離で３箇所３回６−０のｓｉｌｋ縫合糸を用いることで結紮し、ＵＵＯモデルを作成した。その後、腎臓を後腹膜内へ戻し、皮膚縫合を経て飼育を継続した。

２−２．細胞シート移植
細胞シート移植はＵＵＯ作製
直後に行った。腎線維被膜をマイクロピンセットにて縦・約１．５ｃｍ、横・約０．８ｃｍ剥離し、腎機能維持細胞シートを用いて５週令ｒａｔ腎に対し、２枚移植した。細胞シートはＨＧＦ産生機能を持たないＭｅｔ−５Ａ細胞シート、およびＨＧＦ産生機能を持つＨＧＦ−Ｍｅｔ細胞シートを各々移植することでＨＧＦ有無による細胞シート移植効果の比較を行った。また、比較例として、腎線維被膜を剥離しないまま、腎皮膜上にＨＧＦ−Ｍｅｔ細胞シートを移植した。

２−３．μＣＴ（ＣｏｓｍｏｓｃａｎＧＸ，Ｒｉｇａｋｕ）による解析
１週、２週、３週、４週間飼育後、麻酔下で尾静脈より３００〜４００μＬ造影剤（オムニパーク３５０、第一三共社）を投与し、小動物用μＣＴを用いて腎臓の容積（ｖ）を解析した。容積は得られた画像より短軸（ｘ）、長軸（ｙ）および厚み（ｚ）を測定し、得られた値から以下の式により算出した。

２−４．腎動脈血流量の解析
一定期間飼育後、各々の個体を麻酔下、腎門部血流量を小動物用エコー（Ｖｅｖｏ（登録商標）２１００）を用いて腎動脈半径と心拍数とＰＷモードのＶＴＩ（速度時間積分）を測定し、解析を行った。以下の式にパラメータを入れることで、算出した。

血管断面積：エコーで腎動脈分岐部の直径（２ｒ）を測定し算出する。（π＊ｒ＊ｒ）
１分間の拍動数：同時に心電図で測定した心拍数
一回拍動時の血液の移動量：ＰＷで腎動脈流速波形を描出し、一回拍動時の拡張末期から次の拡張末期までの流速波形と基線に囲まれた面積（＝血液が動いた距離になる）を算出
ＶＴＩ：Ｖｅｒｏｃｉｔｙ−ｔｉｍｅｉｎｔｅｇｒａｌ；エコー画面上で計測。

２−５．腎臓の回収
ＵＵＯ後、一定期間飼育後、腎臓は４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定（武藤化学社、＃３３２５１）を用いて灌流固定し、採取した。採取した腎臓は４％ＰＦＡ固定を行い、その後アルコール、キシレン、パラフィンと液体を置換することでパラフィン包埋を行った。パラフィン包埋し、作製したブロックは約３μｍ厚にて薄切切片とした。凍結切片作成時は４％ＰＦＡ固定後、３０％スクロース・ＰＢＳ溶液に置換した腎を、ＯＴＣコンパウンドを用いて凍結ブロックとし、クライオスタッドによって５μｍ厚の切片にすることによって凍結切片とした。

２−６．組織学的解析
パラフィン切片を脱パラフィン処理後、ＰＡＳ染色、ＨＥ染色を行い、腎形態の観察を行った。線維化の評価はシリウスレッド染色にてコラーゲン繊維を赤色に染色することで解析した。筋線維芽細胞の検出はパーオキシデースブロッキング、およびブロッキングを行ったのち、αＳＭＡ抗体（ｃｌｏｎｅ１Ａ４、＃Ｍ０８５１、ＤＡＫＯ社）を用いて行い、ＤＡＫＯｅｎｖｉｓｉｏｎを用いてＤＡＢ発色を行うことで茶褐色に呈色させることで解析した。得られた画像は画像解析ソフト（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）、アドビ社）を用いて、色調にて陽性領域を選択し、選択領域の数値化をＮＩＨＩｍａｇｅＪを用いることで行い、対照群との比較を行った。移植後の細胞シートの確認は抗ＳＶ４０抗体（Ｐａｂ４１６、ａｂ１６８７９）を用いた染色によって検出した。

２−７．産生ＨＧＦの確認
細胞シートより培養中に産生しているＨＧＦはＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ社）を用いることで定量解析を行った。移植中のラット内でのＨＧＦ産生はパラフィン切片でのＨＧＦ免疫染色（抗体は金沢大学より分与、参考：ＹａｍａｄａＡ，ＭｉｚｕｎｏＳ，ＩｗａｎａｒｉＨｅｔａｌ．ＲａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＨＧＦｉｎｒａｔａｎｄｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．１９９５；１６：１０５-１４．）にて検出を行うことで確認した。

２−８．血管構造の確認
凍結切片をブロッキング後、抗ＲＥＣＡ１抗体（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて血管内皮細胞を検出した。２次抗体はＦＩＴＣｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｃｈ社）を用いた。

＜実施例１＞
（１）ＨＧＦ遺伝子導入細胞シートによる腎機能維持の効果
実験方法の概要を図２（ａ）に示す。作製された遺伝子導入よるＨＧＦ産生機能を有する細胞シートは、２４時間以内に２００ｐｇ／ｍＬ／ｓｈｅｅｔの発現能を有していた（図３（ｂ））。細胞シートは収縮した状態で回収されるため、２〜３層の重層化により厚さは３０μｍ前後であった。本実施例で使用したＭｅｔ−５Ａ細胞及びＭｅｔ−ＨＧＦ細胞はＳＶ４０陽性であったため、移植後の検出にＳＶ４０免疫染色を用いた（図３（ｃ）〜（ｅ））。ｒａｔＨＧＦに交差反応しない抗ｈＨＧＦ抗体を用いた組織染色により、確実に４週後の腎臓にＨＧＦ産生機能を有する細胞シート移植群ではｈＨＧＦ分布が確認された（図３（ｆ））。

細胞シート移植一週間後の組織学的解析を行った。その結果、ＨＧＦを産生する細胞シートを移植した群（ＨＧＦ群）は、ＨＧＦを産生しない細胞シートを移植した群（ＭＥＴ群）及び細胞シートを移植しなかった群（ＵＵＯ群）と比較して、有意にシリウスレッド陽性領域（図４（ｃ）並びに抗ＳＭＡ陽性領域（図４（ｄ））が減少しており、線維化が抑制されていることが明らかになった。

さらに、ＵＵＯモデル作製後４週間の腎臓の容積の変化と外観を比較した。その結果、ＵＵＯ群及びＭＥＴ群の腎臓は、ＵＵＯ作製後４週間でその容積は増加した（図５（ｃ））。また、ＵＵＯ群及びＭＥＴ群の腎臓は、断面図（図５（a）右）からも明らかであるように、腎髄質が崩壊するとともに腎皮質が菲薄化しており、腎膨満化も顕著であった（図５(a)〜（ｃ））。一方、ＨＧＦ群においては、ＵＵＯ作製後４週間経過しても腎臓の容積はほとんど変化せず（図５）、腎髄質の崩壊及び腎皮質の菲薄化が抑えられた。この効果は、ＨＧＦ産生細胞シートを腎線維被膜下に移植した場合に見られ、腎線維被膜を剥がずに腎線維被膜上に移植した群では見られなかった（図５（ｃ）：ＨＧＦ（腎線維被膜上移植））。この結果より、ＵＵＯによって生じる腎髄質の崩壊とその結果による腎皮質の菲薄化、および腎容積の尿圧迫による膨張が、ＨＧＦ産生細胞シートを腎線維被膜下に移植した場合に著しく抑制され、腎髄質維持効果が確認された。

細胞シートを移植して4週間後の組織学的解析を行った結果を図６に示す。図６からも明らかであるようにＨＧＦ群において線維化が抑制されていた。

さらに、エコー解析による血流解析および血管構造解析も行った。その結果、エコーによる血流量の解析も、コントロール群（ＵＵＯ群及びＭＥＴ群）に比べて、ＨＧＦ群では４週後まで血流量が高く（図７（ａ））、また、血管構造も保持されていること（図７（ｂ））が明らかとなった。

＜実施例２＞
（２）間葉系幹細胞シートによる腎機能維持の効果
上述の方法に従い、骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シートをＵＵＯモデルへ移植した。図８から明らかであるように、骨髄由来間葉系幹細胞を含むＧＦＰ陽性細胞シートを移植することで、ＵＵＯによって生じる腎髄質の崩壊とその結果による腎皮質の菲薄化、および腎容積の尿圧迫による膨張が実施例１と同様に、著しく抑制され、腎髄質維持効果が確認された。

従来からＨＧＦはＴＧＦ−βによる腎線維化機構を阻害する作用をもつということで、血中投与や遺伝子導入が試みられているが、静脈投与のような全身性の投与を行った場合、肝臓における初回通過効果のため、ほとんどの投与量を奪われ、腎臓へのほとんど作用できないことが報告されている（非特許文献３）。従って、本発明内容ではＨＧＦ産生機能をもつ間葉系幹細胞含む細胞シートを作製、腎表層面からの直接移植を行うことで、腎臓へ局所および持続的ＨＧＦの長期間投与を行った。一側尿管結紮術による腎障害モデル作製後、４週間の観察にて、障害を受けた腎髄質で生じる血行不全がＨＧＦ産生機能を有する細胞シート移植にて改善され、腎臓で最も重要な機能の一つである尿濃縮能（水再吸収能）及び生体内の電解質濃度調整、pH調整、タンパク質やアミノ酸再吸収機能を司る腎髄質の尿細管の維持を可能とし、これまでにない腎機能維持効果をもたらした。

Claims

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を産生する機能を有する細胞を含む、腎臓病進行抑制又は予防用細胞シート組成物であって、前記細胞は、ＨＧＦタンパク質を発現する核酸がコードされたベクターが導入された細胞であり、
腎臓の線維被膜を除去した後の前記腎臓の表面へ直接適用するための、細胞シート組成物。
前記腎臓病が、糖尿病性腎症、腎硬化症、慢性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、閉塞性腎症、急速進行性糸球体腎炎、ループス腎炎、間質性腎炎からなる群から選択される１以上の腎疾患によって引き起こされる腎臓病である、請求項１に記載の細胞シート組成物。
間葉系幹細胞をさらに含む、請求項１又は２に記載の細胞シート組成物。
前記間葉系幹細胞が、臍帯血、胎盤、骨髄、脂肪組織、滑膜、歯髄及び／又は、多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞である、請求項３に記載の細胞シート組成物。
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来幹細胞である、請求項３に記載の細胞シート組成物。