JP6769979B2 - マイクロｒｎａに基づく前立腺がん患者の予後評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、前立腺組織に存在する数個の特徴的なマイクロＲＮＡバイオマーカーのレベルを測定することで処置（たとえば、積極的監視、手術、放射線照射）を決定するために前立腺がんの悪性度（予後）を診断時（または診断後）に予測することに関する。

前立腺がんは男性のがんでは最も多く診断されており、西洋諸国のがん関連死亡率の主な原因の第５位である（１）。前立腺がんは、一般に血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルの上昇に続いて針生検による組織病理学的検査に基づき、診断される。

しかし、前立腺がんの検出にＰＳＡを利用すると偽陽性率が高くなり、低悪性度の腫瘍と高悪性度の腫瘍を十分に区別できない。この数十年の間、ＰＳＡ試験やＰＳＡに基づく検診の利用が増えた結果、前立腺がんのダウンステージングだけでなく発生率も上昇させている。

しかし、ＰＳＡも現在利用できる他の予後指標（主に、陽性生検体の数、臨床上のＴＮＭ病期分類およびグリーソンスコア）も、緊急に処置が必要な悪性度の高い前立腺がん患者を正確に予測できない。このことは著しい過剰処置につながり、多くの患者は不必要な根治的前立腺切除（ＲＰ）や放射線治療を受けているが、それによる副作用は非致死性の前立腺がんを処置せずに生きるよりも苦しいものである。

したがって、前立腺がんの診断には、積極的監視によって安全に管理できる低悪性度のがんと、早期介入が有益になる高悪性度のがんを正確に区別することによって予後の評価を改善できる方法を開発するという未達成の深刻な需要がある。

新たに出てきた、前立腺がんに関する新種の有望なバイオマーカーはマイクロＲＮＡである。

マイクロＲＮＡは、哺乳類などの多様な生物で遺伝子発現を転写後レベルで制御するある種の内在性の小さな非コード調節ＲＮＡ（約２２ｎｔ）を含む（２）。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、不完全に対形成された長いステムループ状の一次マイクロＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ）として転写され、さらに核内のＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによるプロセシングを受けてヘアピン状の前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ）になる（３）。Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５−Ｒａｎ−ＧＴＰによって細胞質へと排出された後、ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは別のＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって切断され、成熟マイクロＲＮＡの二本鎖（約２２ｎｔ）になる（３）。成熟マイクロＲＮＡはマイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に取り込まれてその機能を媒介する。マイクロＲＮＡは、この複合体を完全またはほぼ完全に相補的な標的ｍＲＮＡへと誘導し、翻訳阻害またはｍＲＮＡ分解をもたらす（４）。

マイクロＲＮＡは遺伝子制御分子の中で最も豊富な種類の１つで、ｍｉＲＢａｓｅ（バージョン２１）の最新の公開内容には２５８８個の成熟ヒトマイクロＲＮＡ（１８８１個は前駆体）が含まれる（http://www.mirbase.org/）（５）。これらのマイクロＲＮＡは全体ですべてのヒトｍＲＮＡの最大３分の２を制御すると推定されている。その結果、マイクロＲＮＡは、細胞の分化、細胞周期の進行およびアポトーシスなど細胞内の多くの過程に影響し、マイクロＲＮＡの制御解除はがんなどのヒトの疾患に関与する場合が多い（６）。さらに、いくつかのマイクロＲＮＡは細胞型で疾患に特異的と考えられ、制御解除されたマイクロＲＮＡの発現はがんの発症と進行の両方に関与するとされている（７）。したがって、がんの早期診断のための新規なバイオマーカーを得る有望な情報源となる可能性があるとしてマイクロＲＮＡ発現の異常が研究されている（７）。さらに、マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡを利用したがん治療標的として使用できる可能性がある（８）。いくつかのマイクロＲＮＡプロファイリング研究では、前立腺がんの発症および／または進行でもマイクロＲＮＡの発現異常が報告されている（９）。しかし、これまでに発表されている前立腺がんでのマイクロＲＮＡバイオマーカー研究の大部分は、患者試料の数が比較的少なく、同定されたマイクロＲＮＡ候補のバイオマーカー能力を確認するには厳密な独立した臨床検証が不十分である。

重要なことに、発明者らの知る限り、前立腺がんの再発リスクを予測できるマイクロＲＮＡバイオマーカーに基づく予後予測方法は見出されていない。

ここで、発明者らは最も豊富なマイクロＲＮＡのうち７５０個を超えるマイクロＲＮＡのｍｉＲｎｏｍｅプロファイリングを行い、根治的前立腺切除（ＲＰ）後に生化学的再発（ＢＣＲ）があった患者となかった患者の前立腺腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料で、有意な制御異常が見られたマイクロＲＮＡを確認した。コホート１では５個の予後分類因子を同定し、再発（前立腺切除（根治的前立腺切除（ＲＰ））後の生化学的再発（ＰＳＡ）としてモニタリングした）までの時間の予測因子としてのそれらの予後予測精度を評価した（実施例１）。次に、根治的前立腺切除を受けた２つの独立したコホート（コホート２およびコホート３）でそれらの分類因子の予後予測精度を検証した（実施例２〜６）。コホート３の前立腺腫瘍試料は異なる国籍（米国）のもので、異なる方法（スナップ凍結）で採取され、異なるＲＮＡ抽出手順に供され、異なるマイクロＲＮＡ発現検出プラットフォームで分析され、コホートの特徴が異なっていた（コホート３はコホート１および２よりも全体的に悪性度が低く、再発の事象が少なかった）にもかかわらず、発明者らによるマイクロＲＮＡ予後分類因子のうち４個はこの外部コホートでも同等に良好に機能し、これらの分類因子が確実であることを強調している。

５個のマイクロＲＮＡ分類因子はいずれも、ＲＰ後のＢＣＲまでの時間の予測に関して、通常の臨床病理学的変数に比べて有意な独立した予後予測値を示した。

前立腺特異抗原（ＰＳＡ）法は、偽陰性率が高く、臨床的に低悪性度の腫瘍と高悪性度の腫瘍を十分に区別できないため、単独使用または既存のマーカーと併用できる新規な前立腺がんマーカーが必要である。本発明は一連のマーカーと、それらを予後（腫瘍の悪性度／再発リスク）の評価に使用する方法を提供する。

したがって、第一の側面では、本発明は前立腺がんの予後を生体外で予測する方法に関する。この方法は、前立腺がん患者の生検体から採取した細胞のＲＮＡ試料でｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐの１３個からなるｍｉＲ群から選択される少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルを測定することを含む。ここで、基準発現プロファイルと比較した前記少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルの変化は前記患者の予後を示す。

本発明の第二の側面は前立腺がんの予後を生体外で評価するためのキットに関する。

本発明の第三の側面は、前立腺がんの処置を必要とする患者を処置するための方法に関する。この方法は、第一の側面の生体外での方法を実施することと、予後について患者を特性評価することと、この情報に基づき患者に適切な治療を選択することを含む。当然ながら、予後は患者のさらなる処置を計画するときに考慮すべき重要な因子である。というのも、予後評価が非常に悪いのであればストレスと苦痛を伴う方法は避けられると思われるからである。

図１は、２つの独立したコホートから得た根治的前立腺切除（ＲＰ）試料で８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子（表４）に基づき無再発生存（ＲＦＳ）のカプラン・マイヤー生存分析を行った結果を示す。訓練コホート１（Ａ）の患者をＲＯＣ分析後に低リスク群と高リスク群に分けた。コホート１で定義されたカットオフ値（割合）に従い検証コホート３（Ｂ）の患者を低リスク群と高リスク群に分けた。両側ログランク検定では有意なｐ値が得られる。８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子によって定義される分子的リスクの高い状態はＲＰ後の早期の生化学的再発と有意に関連していた。

図２は、３つの独立したコホートから得た根治的前立腺切除（ＲＰ）試料で上記８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子（ｍｉＲ−１８５−５ｐ＋ｍｉＲ−２２１−３ｐ＋ｍｉＲ−１５２−３ｐ、表５）に基づき無再発生存（ＲＦＳ）のカプラン・マイヤー生存分析を行った結果を示す。訓練コホート１（Ａ）の患者をＲＯＣ分析後に低リスク群と高リスク群に分けた。コホート１で定義されたカットオフ値（割合）に従い検証コホート２（Ｂ）の患者を低リスク群と高リスク群に分けた。これを外部検証コホート３にも同様に行った（Taylor et al.；およびHieronymus et al.；Ｂ）。両側ログランク検定では有意なｐ値が得られる。８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子によって定義される分子的リスクの高い状態は、３つの独立したコホートのＲＰ後の早期の生化学的再発と有意に関連していた。

図３は、３つの独立したコホートから得た根治的前立腺切除（ＲＰ）試料で３個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子（ｍｉＲ−１８５−５ｐ＋ｍｉＲ−２２１−３ｐ＋ｍｉＲ−３２６、表６）に基づき無再発生存（ＲＦＳ）のカプラン・マイヤー生存分析を行った結果を示す。訓練コホート１（Ａ）の患者をＲＯＣ分析の後に低リスク群と高リスク群に分けた。コホート１で定義されたカットオフ値（割合）に従い検証コホート２（Ｂ）の患者を低リスク群と高リスク群に分けた。これを外部検証コホート３にも同様に行った（Taylor et al.；およびHieronymus et al.；Ｃ）。両側ログランク検定では有意なｐ値が得られる。３個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子によって定義される分子的リスクの高い状態は、３つの独立したコホートのＲＰ後の早期の生化学的再発と有意に関連していた。

図４は、３つの独立したコホートから得た根治的前立腺切除（ＲＰ）試料で４個のｍｉＲＮＡの予後に関する比（ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ×ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ／ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ×ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの比、表７）のモデルに基づき無再発生存（ＲＦＳ）のカプラン・マイヤー生存分析を行った結果を示す。訓練コホート１（Ａ）の患者をＲＯＣ分析後に低リスク群と高リスク群に分けた。コホート１で定義された絶対的なカットオフ値に従い検証コホート２（Ｂ）の患者を低リスク群と高リスク群に分けた。これを外部検証コホート３にも同様に行った（Taylor et al.；およびHieronymus et al.；Ｃ）。両側ログランク検定のｐ値を求める。４個のｍｉＲＮＡの予後に関する比のモデルによって定義される分子的リスクの高い状態は、ＲＰ後の早期の生化学的再発と有意に関連していた。

図５は、３つの独立したコホートから得た根治的前立腺切除（ＲＰ）試料で２個のｍｉＲＮＡの予後に関する比（ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ／ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、表８）のモデルに基づき無再発生存（ＲＦＳ）のカプラン・マイヤー生存分析を行った結果を示す。訓練コホート１（Ａ）の患者をＲＯＣ分析後に低リスク群と高リスク群に分けた。コホート１で定義された絶対的なカットオフ値に従い検証コホート２（Ｂ）の患者を低リスク群と高リスク群に分けた。これを外部検証コホート３にも同様に行った（Taylor et al.；およびHieronymus et al；Ｃ）。両側ログランク検定のｐ値を求める。２個のｍｉＲＮＡの予後に関する比のモデルによって定義される分子的リスクの高い状態は、３つの独立したコホートのＲＰ後の早期の生化学的再発と有意に関連していた。

（定義）
ハレルの一致指数（Ｃ指数）は、打ち切り観察に関する一般化された受信者動作特性曲線下の面積（ＡＵＣ）を指し、再発の予測確率が再発という結果と一致する確率に相当する（Harrell (2001) Regression modelling strategies: with applications to linear models, logistic regression, and survival analysis. New York: Springer-Verlag）。

「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、および「ｍｉＲ」という表現は同義で用いられ、内在性遺伝子に由来する約１８〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長の非コードＲＮＡを指す。マイクロＲＮＡよりも長い（約７５ｎｔ）ｐｒｅ−ｍｉＲと呼ばれるヘアピン様の前駆体がプロセシングを受けてマイクロＲＮＡになる。マイクロＲＮＡは集合してｍｉＲＩＳＣと呼ばれる複合体となり、アンチセンスの相補性によって標的を認識する。マイクロＲＮＡが標的と１００％一致する場合、すなわち相補性が完全である場合、標的ｍＲＮＡは切断され、ｍｉＲはｓｉＲＮＡのように作用する。完全には一致しない場合、すなわち相補性が部分的である場合、標的ｍＲＮＡの翻訳は阻害される。

本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、細胞または組織試料でのＲＮＡ分子の転写および／または蓄積を指す。

本文脈では、「ｍｉＲの発現レベル」、「ｍｉＲ発現レベル」および「ｍｉＲのレベル」という用語は、試料中で検出される「特定のｍｉＲの量」の尺度として同義で用いられる。「特定のｍｉＲの量」は、絶対的尺度、相対的尺度、または正規化された尺度のいずれかで表すことができ、定量的方法と定性的方法のいずれによって得られた値も指す。「特定のｍｉＲの量」の特に好ましい１つの尺度は以下と実施例に記載のｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた交点（Ｃｐ）値であるが、「量」はデジタルＰＣＲまたは多様な次世代シーケンシング技術によっても定量できる。特定の状況、たとえばｍｉＲ発現レベルの比を用いて予後スコアを計算する場合、絶対的に決定されたｍｉＲ発現レベルで十分である。しかし、絶対的なｍｉＲ発現レベルの代わりに正規化されたｍｉＲ発現レベルに基づき決定を行ってもよい。

ｍｉＲの発現を構成的またはほぼ構成的に発現する遺伝子の発現と比較して絶対的なｍｉＲ発現レベルを補正することで、発現レベルを正規化する。正規化によく利用される好適な遺伝子としては、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が挙げられる。本研究では、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐを正規化に利用する。

本明細書で使用する場合、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、ｍｉＲ−６２５−３ｐ、およびｍｉＲ−１５１ａ−５ｐという用語は、ｍｉＲＮＡ登録データベースの公開内容１２．０以降に登録されており英国のSanger Instituteによって提供されているヒトのｍｉＲ配列と、動物の同等の配列を指す。表９も参照のこと。

「予後予測」という用語は、本明細書では、個々または累積的に臨床状況に応じて、疾患状態の蓋然的な転帰を予測する工程、あるいは症例の性質や症状によって示される、疾患から回復する見込みを決定する工程を包含すると定義される。

本文脈では、「基準発現プロファイル」は、試料採取後５年以内に著しいがんの進行がなかった前立腺がん患者の細胞試料における、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐからなる１３個のｍｉＲの群より選択される２個以上のｍｉＲの発現レベルを指す。

ｍｉＲ分類因子に関する「確実さ（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）」という用語は、本明細書では、試料の採取方法や定量方法が多少異なっていても前立腺がん患者の予後の評価に関して相対的に似た結果を出す分類因子を指すのに使用される。

「ＵｎｉＲＴ」は、Exiqon A/Sによって市販されているｑＲＴ−ＰＣＲ法である。この方法とその性能については実施例１および７、ならびにデンマーク国特許出願PA 2009 00156、欧州特許第２３９１７３６号、およびMestdagh et al. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):809-15に記載されている。

本発明の態様を以下に記載するが、これらは例示目的に過ぎない。
（本発明の詳細な開示）

本発明の根底にある技術的課題は、前立腺がん患者の予後を生体外で評価する代替的な方法を提供することである。特に、現在利用できる他の予後指標（主にＰＳＡ検査、陽性生検体の数、臨床上のＴＮＭ病期分類およびグリーソンスコア）の補足となるか、場合によってはそれらに代わる可能性もある方法を提供する。

実施例１では、２つの異なる統計的手法（１．一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）、２．単変量コックス回帰分析で有意なマイクロＲＮＡの組み合わせ）を応用して５個のｍｉＲ予後分類因子を得たことについて記載する（表１、表２、および表３を参照）。２つの手法を組み合わせることにより、合わせて１３個のｍｉＲからなる分類因子を得た。すなわち、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐである（表３）。

意外にも、発明者らは、この１３個からなるｍｉＲ群から導き出されたわずか２個のｍｉＲを用いて再発した症例と再発なしの症例を区別し、根治的前立腺切除後の生化学的再発（ＢＣＲ）までの時間を予測できることを見出した（実施例１と実施例６、図５、表８を参照）。したがって、本発明の一側面は、前立腺がん患者の予後を生体外で評価する方法であって、前記患者から採取した前立腺細胞の試料のＲＮＡでｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐからなるｍｉＲ群から選択される少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルを測定することを含み、ここで、基準発現プロファイルと比較して前記少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルの変化は前記患者の予後を示す、方法である。

一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）による最尤分類法（実施例１参照）を用いた探索・検証の研究で得た、予後予測精度に最も大きな影響を与える８個のｍｉＲＮＡが好適だと思われる。したがって、本発明の一態様では、前立腺がん患者の予後（すなわち、対象が高悪性度の前立腺がんを有しているリスク）を生体外で評価する方法であって、前記患者から採取した細胞試料でｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、およびｍｉＲ−６１５−３ｐからなるｍｉＲ群から選択される少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルを測定することを含む方法である。ここで、基準発現プロファイルと比較した前記少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルの変化は、予後があまりよくないことを示す。

一般の診療の要件を満たすため、予後予測方法は、試料採取や定量の方法が多少異なっても、患者の予後が良好か不良かの区別について比較的似た結果を提供しなければならない。この方法は確実であるべきである。有望なことに、コホート３の腫瘍試料は異なる国籍（米国）のもので、異なる方法（スナップ凍結）で採取され、異なるＲＮＡ抽出手順に供され、異なるマイクロＲＮＡ発現検出プラットフォーム（Agilent Human miRNA Microarray 2.0）で分析され、コホートの特徴が異なっていた（コホート３はコホート１よりも全体的に悪性度が低く、再発の事象が少なかった）にもかかわらず、発明者らによる８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子はこのコホートでも同等に良好に機能し、この８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子の確実さを強調している。実施例２と表４を参照のこと。

１３個または８個のｍｉＲＮＡを測定するのは一般の診療に意図される予後予測試験には非実用的だと思われるかもしれない。実施例１および実施例３〜６、表５〜８では、この１３個のｍｉＲＮＡのリスト（表３）から絞り込んで導き出された、予後予測値のある複数のｍｉＲＮＡ分類因子を示す。
意外にも、これらの絞り込まれたｍｉＲＮＡ分類因子は、８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子よりもさらに確実だと思われる。したがって、本発明の他の側面は、前立腺がん患者の予後を生体外で評価するための方法であって、前記患者から採取した細胞の試料でｍｉＲ１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの発現レベル；またはｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、およびｍｉＲ−３２６のレベル；またはｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、およびｍｉＲ−２２１−３ｐのレベル；またはｍｉＲ−１０ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐのみのレベルを測定することを含み、ここで、基準発現プロファイルと比較して前記少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルの変化は前記患者の予後を示す、方法である。

「特定のｍｉＲの量」は、絶対的尺度、相対的尺度、または正規化された尺度のいずれかで表すことができ、定量的方法と定性的方法のいずれによって得られた値も指す。

絶対的なｍｉＲ発現レベルの代わりに正規化されたｍｉＲ発現レベルに基づき決定を行ってもよい。ｍｉＲの発現を構成的またはほぼ構成的に発現する遺伝子の発現と比較することで絶対的なｍｉＲ発現レベルを補正することにより、発現レベルを正規化する。アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が正規化によく利用される。しかし、ｍｉＲなどの短いＲＮＡの場合、特定の不変のｍｉＲＮＡが正規化群として好ましい。

したがって、本発明の一態様では、発現レベルは正規化された発現レベルである。本研究では、ｍｉＲを正規化に用いる。NormFinderアルゴリズム（１０）を用いて、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐを探索研究で最も安定に発現したｍｉＲＮＡと確認した。２つの正規化方法（全体平均とｍｉＲ−１５１−５ｐ）を比較したところ、最も特異的に発現されたｍｉＲＮＡに関してもｍｉＲＮＡ全体のランク付けに関しても非常によく似た結果が得られた。したがって、本発明の一態様では、発現レベルをｍｉＲ−１５１ａ−５ｐの発現レベルに対して正規化する。

予後予測試験を実用すると、試験値を用いて予後スコア（Ｐ）を計算することによってカットオフ値を定義し、その予後スコアに基づいて前立腺がん患者の予後を評価することができ、有利である。したがって、本発明の一態様は、がん患者の予後の評価は前記試料中の前記少なくとも２個のｍｉＲのレベルを検出し、少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルデータを含むデータセットに基づき予後スコア（Ｐ）を計算することを含む、方法である。

ｍｉＲのレベルは、逆転写酵素を用いた定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で有利に定量できる（１７）。したがって、本発明の一態様では、前記ｍｉＲの発現レベルをＲＴ−ＱＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、またはｑＲＴ−ＰＣＲ（これらは同義である）の方法で決定する。

「特定のｍｉＲの量」に関する特に好ましい１つの尺度は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた交点（Ｃｐ）値である。「特定のｍｉＲの量」に関する別の好ましい尺度は、実施例に記載の同じくｑＲＴ−ＰＣＲで得られる「サイクル閾値（Ｃｔ）」である。「特定のｍｉＲの量」の尺度ＣｐおよびＣｔではほぼ同様の測定値が得られる（（１２）を参照のこと）。ＣｐとＣｔのいずれを選択するかは、主に試験と関連し試験が実行される機械の選択の問題である。LightCycler^{(登録商標)}480 Real-Time PCR SystemでRoche LCのソフトウェアを使用して増幅を実行する場合、特定のｍｉＲの量はＣｐで表される。Applied BiosystemsのABI Prism 7900HTの３８４ウェルの機器で機器と共に提供されるソフトウェアを用いて増幅を実行する場合、特定のｍｉＲの量はＣｔで表される。以下ではＣｐ値を示すが、Ｃｔ値および「定量サイクル」（Ｃｑ）値にも当てはまる。

Ｃｐ値は、たとえば特定のｍｉＲのレベルと以下の関係式の関係にある：

（式中、Ｃｐ（ｍｉＲｘ）は、ある特定のｍｉＲ（ｍｉＲｘと呼ぶ）を特異的に検出するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ機器からのＣｐ読み取りを示す。実施例１はそのような試験について詳細に記載する。

比に基づくマーカーはデータの正規化から独立しているため、好適な分類因子モデルを提供する。発明者らは、１３個のｍｉＲ（または「コックス回帰」で得た１１個のｍｉＲ）から導き出した比による分類因子が、前立腺がんの再発までの時間を予測するための独立した予後バイオマーカーとして利用できることを見出した（実施例５を参照のこと）。

したがって、Ｃｐ値をｍｉＲのレベルの定量因子として使用する場合、たとえば、以下の式：

は、以下の式：

に等しい。

したがって、本発明の一態様では、４個のｍｉＲ（ｍｉＲ１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ）からなる分類因子に関する診断予後スコア（Ｐ）を以下のように計算する：

（式中、係数Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは、特定の設定に従って回帰分析によって決定され、Ｃはサイクル閾値（Ｃｔ）、または交点値（Ｃｐ）、または「定量サイクル」（Ｃｑ）値、あるいはそれらに似た任意の値である）。

意外にも、発明者らは、１３個のｍｉＲの群から導き出された４個のｍｉＲＮＡのうちの２個のみからなる比に基づく分類因子を、前立腺がんの再発の予測のための独立した予後バイオマーカーとして使用できることを見出した（実施例６参照）。

したがって、本発明のさらなる一態様は、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−１０ｂ−５ｐの２つのｍｉＲの発現レベルを測定することを含む、前立腺がん患者の予後を生体外で評価する方法である。

ｍｉＲがｑＲＴ−ＰＣＲによって定量され、ｍｉＲレベルの定量因子としてＣｐ値が使用される場合、以下の式：

は以下の式：

に等しい。

同様に、本発明の一態様では、２個のｍｉＲからなる分類因子に関する診断予後スコア（Ｐ）は以下のとおりである：

（式中、係数ＸおよびＹは回帰分析によって決定され、Ｃは、サイクル閾値（Ｃｔ）、または交点値（Ｃｐ）、または「定量サイクル」（Ｃｑ）値、あるいはそれらに似た任意の値である）。

直線回帰および他の種類の回帰が意図される。

「機械学習」は、経験を通じて自動的に改善するコンピュータアルゴリズムを利用した過程に関連し、当技術分野ではアルゴリズムを改善するこの過程を「訓練」ということが多い。機械学習は大きなデータセットにおける一般的な規則を発見するのに使用でき、たとえば、前立腺のがん試料とがんではない試料のｍｉＲ発現を含むデータセットから臨床情報データを抽出するのに使用できる。機械学習の概念に関する一般的な論文は、（Tom Mitchell, Machine Learning, McGraw Hill, 1997）で読むことができる。したがって、本発明の一態様では、機械学習を応用し、診断予後スコア（Ｐ）を計算するアルゴリズムを得た。

逆転写酵素を用いる定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は好ましい定量方法であるが、実施例２、３、４、および６は、本発明がマイクロアレイに基づく定量に適合していることを示しており、したがって本発明の一態様は、前記ｍｉＲの発現レベルをマイクロアレイによって測定する方法である。

ノーザンブロット、定量デジタルＰＣＲ、および様々な定量的次世代シーケンシング技術などのその他の定量方法も意図され、本発明の態様もそのように意図される。

本発明のさらなる側面は、前立腺がん患者の予後を生体外で評価するためのキットであって、評価は、前記患者から採取した前立腺細胞から得たＲＮＡ試料でｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐからなる１３個のｍｉＲの群から選択される少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルを測定することを含み、ここで、基準発現プロファイルと比較して前記少なくとも２個のｍｉＲの発現レベルの変化は前記患者の予後を示す、キットである。

以下の非限定的な実施例、表、および図で本発明をさらに説明する。

（参照文献）
1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International journal of cancer Journal international du cancer. 2014.
2. Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and Mechanisms of microRNAs and siRNAs. Cell. 2009;136:642-55.
3. Zeng Y, Cullen BR. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA. 2003;9:112-23.
4. Gregory RI, Chendrimada TP, Cooch N, Shiekhattar R. Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell. 2005;123:631-40.
5. Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Res. 2014;42:D68-73.
6. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome research. 2009;19:92-105.
7. Di Leva G, Garofalo M, Croce CM. MicroRNAs in cancer. Annual review of pathology. 2014;9:287-314.
8. Bartels CL, Tsongalis GJ. MicroRNAs: novel biomarkers for human cancer. Clin Chem. 2009;55:623-31.
9. Tong AW, Fulgham P, Jay C, Chen P, Khalil I, Liu S, et al. MicroRNA profile analysis of human prostate cancers. Cancer Gene Ther. 2009;16:206-16
10. Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 2004;64:5245-50
11. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Wiley: Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), 1995.
12. Draminski M, Rada-Iglesias, Enroth S, Wadelius C, Koronacki, et al. Monte Carlo feature selection for supervised classification (2008) Bioinformatics (2008) 24 (1): 110-117.
13. Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M, Jensen JL, Marcussen N, Hamilton-Dutoit S, et al. Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays. Nature genetics. 2003;33:90-6.
14. Taylor BS, Schultz N, Hieronymus H, Gopalan A, Xiao Y, Carver BS, et al. Integrative genomic profiling of human prostate cancer. Cancer cell. 2010;18:11-22.
15. Mestdagh P, Van Vlierberghe P, De Weer A, Muth D, Westermann F, Speleman F, et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome biology. 2009;10:R64.
16. Mestdagh et al. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):809-15.
17. Bustin, S.A. (ed.) A-Z of quantitative PCR, IUL Biotechnology Series 5 (2004) 882 pages.
18. Harrell (2001) Regression modelling strategies: with applications to linear models, logistic regression, and survival analysis. New York: Springer-Verlag.
19. Tom Mitchell, Tom. Machine Learning, McGraw Hill, 1997.
20. Hieronymus H, Schultz N, Gopalan A, Carver BS, Chang MT, Xiao Y, et al. Copy number alteration burden predicts prostate cancer relapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:11139-44.
21. Haldrup C, Mundbjerg K, Vestergaard EM, Lamy P, Wild P, Schulz WA, et al. DNA methylation signatures for prediction of biochemical recurrence after radical prostatectomy of clinically localized prostate cancer. J Clin Oncol. 2013;31:3250-8.
22. Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8.

（実施例１）
ゲノム規模のマイクロＲＮＡプロファイリングによって確認された前立腺がん再発の予測のための新規な予後分類因子

研究の目的
前立腺がんの予後バイオマーカーとしてのマイクロＲＮＡ発現の能力を調査しリスク層別化のための分類因子を構築する

方法
検体
試料はすべてデンマークにあるAarhus University Hospitalの泌尿器科で採取され、同病院のInstitute of Pathologyから入手した（１９９７〜２００５年）。訓練コホート（コホート１）は、組織学的に確認され臨床的に位置特定された前立腺がんのＲＰ１２７例で構成されていた。熟練した病理学者がすべての組織検体を評価した。（Haldrup 2013）に記載の通り、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した切片で腫瘍の９０％より多くを含む代表的な領域を標識し、ＲＮＡ抽出のために対応するＦＦＰＥブロックからパンチ生検体を採取した。miRNeasy FFPE Kit（Qiagen）を用いて、製造者の取扱い説明に従い１．５ｍｍのパンチ生検体から全ＲＮＡを単離した。２６０／２８０ｎｍの吸光度比（最適比：２．０）をＲＮＡ試料の品質保証に用いた。比が１．７５未満のＲＮＡ試料はさらなる分析から除外した。精製したＲＮＡを−８０℃で保存した。

マイクロＲＮＡ発現プロファイリング
miRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCRプラットフォームを用いて、Exiqon A/S（デンマーク、ベドベーク）でマイクロＲＮＡ発現プロファイリング（試薬はすべてExiqon製）を実施した。簡潔に述べれば、miRCURY LNA（商標）micro RNA PCR, Polyadenylation and cDNA synthesis kit IIを用いて、４０ｎｇの全ＲＮＡを４０μｌの反応で逆転写した。ｃＤＮＡを１００倍に希釈し、１０μｌのＰＣＲ反応で分析した。コホート１（訓練）については、microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3Rを用いて３８４ウェルＰＣＲプレートで７５２個のｍｉＲＮＡの相対発現レベルを分析した。陰性対照（鋳型なしの逆転写反応）を並行して行った。LightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche）およびExiLENT SYBR（登録商標）Greenマスターミックスを用いて増幅を行った。Roche LCのソフトウェアを用いて増幅曲線を分析し、定量サイクル（Ｃｑ）値を決定し（二階微分法（Livak, 2001）による）、融解曲線分析を行った。陰性対照よりも小さいＣｑ値で検出されたのが３回未満のマイクロＲＮＡ、またはすべての試料ですべてのＣｑ値が３７を超えたマイクロＲＮＡ（コホート１では９７個、コホート２では０個のｍｉＲＮＡ）はさらなる分析から除外した。

コホート１（訓練）について、多数の試験を含むｑＲＴ−ＰＣＲデータを正規化する最良の方法として以前に報告されている、全体平均（すなわち、全試料で検出されたすべてのｍｉＲＮＡでの平均（ここで、ｎ＝６１）、表１０を参照のこと）に対してデータを正規化した（１５）。NormFinderアルゴリズム（１０）を用いて、発明者らは、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐがコホート１で最適で安定な単一の正規化遺伝子であることを見出した。２つの正規化方法（ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐおよび全体平均による正規化）では、コホート１で最も特異的に発現したマイクロＲＮＡに関してもマイクロＲＮＡ全体のランク付けに関しても非常によく似た結果が得られ、後に行われるより少ないｍｉＲＮＡを試験する検証研究でｍｉＲ−１５１ａ−５ｐを正規化遺伝子とすることの有効性が裏付けられた。正規化は式ΔＣｑ＝Ｃｑ_{正規化因子}−Ｃｑ_{ｍｉＲＮＡ}に従い行われた。発現レベルの差異をΔΔＣｑ＝ΔＣｑ_第１群−ΔＣｑ_第２群として計算し、これを倍数変化に換算するために式２^{−ΔΔＣｑ}を用いた。下方制御されたｍｉＲＮＡについては、逆数に係数−１を掛けたものを用いた。

統計分析
他に記載がない限り、統計分析はSTATAバージョン１１（StataCorp（米国テキサス州））で行った。すべての分析について、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。

発現分析
シャピロ・ウィルク検定を用いて、データが正常に分布しているか評価した。マイクロＲＮＡのうちいくつかは正常に分布していなかったため、ノンパラメトリック統計学のウィルコクソン符号順位検定を用いて異なる群でのマイクロＲＮＡ発現を対比較した。ベンジャミーニ・ホッホベルク法（１１）を用いて多重検定に対しＰ値を補正した。

分類因子の構築
過去に記述されている方法で、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）最尤分類法をソフトウェア「Ｒ」のバージョン３．０．０（Bell Laboratories, Lucent Technologies, http://www.cran.r-project.org/）とBioconductorで訓練し、試験した（１３）。１２７個のＲＰ試料（うち７０例は生化学的再発なし、５７例は生化学的再発あり）から得た正規化されたマイクロＲＮＡ発現レベルを用いて、前立腺がんの再発を分類するために構築された複数のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を得た。少なくとも７０％の試料で発現したマイクロＲＮＡのみを分析対象とした（ｎ＝２３６個のｍｉＲＮＡ）。分類因子の性能をχ^２検定と感度および特異度の計算によって試験した（表１）。８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子（後述）の８個のｍｉＲＮＡを含む統合モデルを作成してＲＦＳ分析を行うために、各ｍｉＲＮＡを多変量比例ハザードモデルの推定回帰係数で加重し、ｍｉＲＮＡ分類因子について、それらを結合した加重和を計算した。

さらに、２つの異なる手法を用いて、訓練コホート（ｎ＝１２６；ＲＰを受けた１２７人の患者のうち１人は術後の内分泌治療のため、ＲＦＳ分析から除外された；表２を参照のこと）の単変量コックス回帰分析で有意であった１１個のｍｉＲＮＡから得たｍｉＲＮＡ予後分類因子を訓練した。１つの手法では、前記分類因子に含まれる各ｍｉＲＮＡを多変量コックス比例ハザードモデルの推定回帰係数で加重し、ｍｉＲＮＡ分類因子について、それらを結合した加重和を計算した。第２の手法では、モデルに含まれる各ｍｉＲＮＡの生のＣｑ値に基づき、比に基づくｍｉＲＮＡ分類因子を作成した。

予後予測値：無再発生存（ＲＦＳ）を分析するため、生化学的再発（ＢＣＲ；現地の臨床実務に基づきＰＳＡカットオフ値は０．２ｎｇ／ｍｌ以上であった）をエンドポイントとした。ＢＣＲを経験していない患者については最後の正常なＰＳＡ測定時で打ち切りとした。マイクロＲＮＡ発現の予後予測値およびマイクロＲＮＡに基づく分類因子の加重和を、カプラン・マイヤー分析および両側ログランク検定、さらには単変量および多変量コックス回帰分析によって、連続変数および二分変数として評価した。マイクロＲＮＡ発現およびマイクロＲＮＡに基づく分類因子を二分変数として分析するため、コホート１の患者を、無再発か再発の状態をＲＯＣ分析した後に決定したカットオフ値によって高発現群と低発現群に分けた。単変量解析で有意なすべての臨床病理学的パラメータを多変量解析の対象とした。多変量解析で基準を満たさなかった変数を段階的な後退的選択法により最終多変量モデルから除外した。すべての変数についてｌｏｇ（−ｌｏｇ）生存分布関数によって比例ハザード仮定を検証した。マイクロＲＮＡおよび分類因子の予後予測の精度を、単変量および多変量コックス回帰分析によって確立したハレルの一致指数（Ｃ指数；予測と結果が一致したすべての患者ペアの比率と定義される）で評価する。

結果
前立腺がんでのマイクロＲＮＡ発現の予後予測能力を調べるため、発明者らはまず、コホート１のｐＴ２対ｐＴ３−４、グリーソンスコアの高低、および／または再発腫瘍対非再発腫瘍の対比較（データの提示なし）で有意に制御解除されていると判明した４５個の候補ｍｉＲＮＡについて生化学的無再発生存（ＲＦＳ）を分析した。単変量コックス回帰分析により、これらのｍｉＲＮＡのうち１１個はコホート１（ｎ＝１２６）のＲＦＳ期間と有意に関連づけられた（表２）。より具体的には、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐの高発現とｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、およびｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの低発現は、このコホートの早期の生化学的再発（ＢＣＲ）と関連していた。しかし、これらの１１個のｍｉＲＮＡのいずれも、通常の臨床病理学的因子（ＰＳＡ、ｐＴ病期、グリーソンスコア、および周縁の状態；データの提示なし）を含む多変量モデルでは有意でなく、コホート１の単変量解析で見られたそれらの予後予測値は、別個のコホート２およびコホート３（ｎ＝９９）（表２；これらのコホートについては実施例２および３に記載する）では全体的に確認できなかった。

代わりに、数個のマイクロＲＮＡを組み合わせて予後分類因子とすることによって単一のマイクロＲＮＡに比べてＲＦＳ期間の予測が改善するかどうかを調べた。２つの統計的手法、すなわち１）一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ；表１）および２）コホート１の単変量コックス回帰分析で有意であった１１個のマイクロＲＮＡの組合せ（加重モデルおよび比に基づくモデル）で並行してデータを分析した（表２）（いずれの方法についても方法の項で説明する）。この２つの方法を用いて、予後予測能力を有する１３個のマイクロＲＮＡ候補のリストを見出した（表３）。

ＬＯＯＣＶによる分類因子の構築
方法１）：数個のマイクロＲＮＡを組み合わせることによってＲＰ後のＢＣＲリスクの予測精度が上がるかどうかを調べた。したがって、発明者らは、コホート１で７０％を超える試料で検出された２３６個のマイクロＲＮＡに関する正規化された発現データを使用した。再発のない患者７０人と再発のあった患者５７人を区別するため、最尤法によるマイクロＲＮＡ予後分類因子を構築する。８個のマイクロＲＮＡを含む分類因子が最も正確にＲＰ試料を無再発群と再発群に分類した（表１）。そこで、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−１５２−３ｐを交差検証ループの少なくとも７０％で用いて最終的な８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を構成した。

分類因子１：８個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（一個抜き交差検証に基づく）
方法１）で確認された８個のマイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−６１５−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−１５２−３ｐ（表１）からなる予後分類因子は、コホート１の再発のあった試料と無再発の試料の７４．６％を正しく分類した（Ｐ＜０．０００１、χ^２検定）。

８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子のＢＣＲまでの時間（ＢＣＲ状態ではない）の予測に関する性能を評価するため、発明者らは予後分類因子に含まれる８個すべてのマイクロＲＮＡの発現の加重和を計算した。次に、８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子の予後予測値を評価するため、発明者らはＰＳＡに基づくＲＦＳ分析を行った。コホート１では、予後分類因子（加重和の連続変数として分析された）は単変量コックス回帰分析で短いＲＦＳ期間と有意に関連していた（Ｐ＜０．００１；表４上段）。この８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子は、グリーソンスコア、切除縁の状態、および術前ＰＳＡ値と組み合わせた多変量モデルでも有意であった（Ｐ＜０．００１、表４上段）。注目すべきことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子を加えると、コホート１の予測精度は０．７３から０．７９に上昇し、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能をもつことを示唆している。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート１で８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子と短いＲＦＳが有意に関連していることが実証された（図１Ａ；Ｐ＜０．０００１、ログランク検定）。

結論として、発明者らは８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子を構築したが、これはコホート１のＲＰ後のＢＣＲの有意な独立した予後予測因子であった。

絞りこまれた分類因子の構築
分類因子２：３個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（上記８個のマイクロＲＮＡからなる分類因子から得られた、８個から絞り込んだｍｉＲＮＡ予後分類因子）
表１の８個のマイクロＲＮＡを段階的に除外し、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、およびｍｉＲ−２２１−３ｐという３個のマイクロＲＮＡの組み合わせを確認した。これらの３個のマイクロＲＮＡの結合された加重和は、単変量および多変量コックス回帰分析のいずれにおいても、８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子と同様に有意であった（表５上段）。８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子は、グリーソンスコアおよび切除縁の状態と組み合わせた多変量モデルでも有意であった（Ｐ＜０．０１３；表５上段）。さらに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子を加えると、コホート１の予測精度は０．６９から０．７２に上昇し、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能をもつことを示唆している。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート１で８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子と短いＲＦＳが有意に関連していることが実証された（図２Ａ；Ｐ＝０．０００１、ログランク検定）。結論として、発明者らは８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子を構築したが、これはコホート１のＲＰ後のＢＣＲの有意な独立した予後予測因子であった。

単変量コックス回帰分析による分類因子の構築
方法２）：コホート１（訓練コホート、ｎ＝１２６）のマイクロＲＮＡ発現（連続変数として分析）の単変量コックス回帰分析により、短いＲＦＳ期間は、試験した４５個のマイクロＲＮＡのうち１１個の発現と統計学的に有意に（Ｐ値がＰ＝０．０４９からＰ＜０．００１までの範囲）関連づけられた（表２）。したがって、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、およびｍｉＲ−６２５−３ｐの高発現とｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、およびｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの低発現は早期のＢＣＲと有意に関連していた。さらに、確立されている通常の臨床病理学的予後因子、すなわちＰＳＡ値が高いこと、グリーソンスコアが高いこと、Ｔ病期が進んでいること、および切除縁の状態が陽性であることはＲＦＳと有意に関連しており、発明者らのコホートが一般的であることを示す（表２）。次に、１１個のマイクロＲＮＡを組み合わせることによって単一のｍｉＲＮＡに比べてＲＦＳ期間予測が改善するかどうかを調べた。２つの異なる手法で、訓練コホートの単変量コックス回帰分析で有意であった１１個のｍｉＲＮＡから得たｍｉＲＮＡ予後分類因子を訓練した。１つの手法では、分類因子に含まれる各ｍｉＲＮＡを多変量コックス比例ハザードモデルの推定回帰係数で加重し、ｍｉＲＮＡ分類因子について、それらを結合した加重和を計算した。第２の方法では、モデルに含まれる各ｍｉＲＮＡの生のＣｑ値に基づき、比に基づくｍｉＲＮＡ分類因子を作成した。

分類因子３：３個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（単変量コックス回帰分析で有意なマイクロＲＮＡの加重和に基づく分類因子）
段階的除外により、発明者らはｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、およびｍｉＲ−３２６の３個のマイクロＲＮＡの組み合わせが（これらの３個のマイクロＲＮＡの結合した加重和として分析した）コホート１の単変量コックス回帰分析で短いＲＦＳ期間と有意に関連しており（Ｐ＜０．００１）、ｐＴ病期、グリーソンスコア、切除縁の状態、および術前ＰＳＡ値に関して調整された多変量モデルでも有意である（Ｐ＝０．０３１）と確認した（表６上段）。注目すべきことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルにこの３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を加えると、コホート１での予測精度（ハレルのＣ指数により推定）は０．７２から０．７４に上昇し（表３上段）、適度に改善された性能を示唆している。さらに、カプラン・マイヤー分析により、３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子とコホート１でのＲＦＳが有意に関連していることがわかった（Ｐ＝０．０００５、ログランク検定、図３Ａ）。要約すると、発明者らはコホート１のＲＰ後のＢＣＲまでの時間を通常の臨床病理学的パラメータとは独立に予測する、３個のマイクロＲＮＡからなる新規な予後分類因子（ｍｉＲ−１８５−５ｐ＋ｍｉＲ−２２１−３ｐ＋ｍｉＲ−３２６）の訓練と試験に成功している。
分類因子４：４個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（単変量コックス回帰分析で有意な１１個のマイクロＲＮＡのうち４個のマイクロＲＮＡの比に基づく）
マイクロＲＮＡの生のＣｑ値の比に基づくバイオマーカー候補は正規化因子に依存しないため、臨床試験に好都合だと考えられる。コホート１の単変量解析で有意な１１個のマイクロＲＮＡ（表２）を用いて、比に基づくマイクロＲＮＡバイオマーカー候補を構築した。コホート１の単変量ＲＦＳ分析で有意であった１１個の候補ｍｉＲＮＡ（表２）のサブセットから、単純な２：２のｍｉＲＮＡ比に基づくモデルを構築することを目的とした。この比モデルの確実さを保証するため、コホート１（訓練）の１２６個のＲＰ試料のうち少なくとも１２５個で発現され、最もＣｑ値の低いｍｉＲＮＡを優先した。さらに、ダイナミックレンジを拡大するため、上方に発現制御されたｍｉＲＮＡおよび下方に発現制御されたｍｉＲＮＡを分母と分子に分けた。

これらの基準を用いて、カプラン・マイヤー分析と単変量および多変量コックス回帰分析によってコホート１での早期のＢＣＲと有意に関連づけられた（それぞれ、Ｐ＜０．０００１、図４Ａ；Ｐ＜０．００１；Ｐ＝０．００１）４個のｍｉＲＮＡからなる予後に関する比モデル（ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ×ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ）／（ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ×ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ）を開発した（表７上段）。さらに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルにこの４個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルを加えると、コホート１の予測精度は０．７３から０．７６に上昇し、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能を有することを示唆している。

結論として、発明者らは４個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルを構築したが、これはコホート１でのＲＰ後のＢＣＲの有意な独立した予後予測因子であった。

絞り込んだ比モデルの構築
分類因子５：２個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（４個のマイクロＲＮＡからなる上記分類因子から絞り込んだ２個のマイクロＲＮＡのみの比に基づく）

このモデルを将来考えられる臨床使用のため単純化すべく、上記の４個のマイクロＲＮＡの比に基づく分類因子をさらに絞り込んで２個のｍｉＲＮＡの比モデル（ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ／ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ）を得た。コホート１では、この２個のｍｉＲＮＡの予後に関する比モデルは、単変量コックス回帰分析でも通常の臨床病理学的変数を含む多変量解析でも、ＢＣＲまでの時間の有意な予測因子であった（それぞれ、Ｐ＝０．００１；Ｐ＜０．００１）（表８上段）。注目すべきことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルにこの２個のｍｉＲＮＡの予後に関する比モデルを加えると、コホート１の予測精度（ハレルのＣ指数で推定）は０．７３から０．７７に上昇し、改善された性能を示唆している。最後に、カプラン・マイヤー分析によっても、コホート１での２個のｍｉＲＮＡの予後に関する比モデルとＲＦＳ期間との有意な関連性が実証された（Ｐ＝０．０２５９；ログランク検定；図５Ａ）。
結論として、発明者らは２個のｍｉＲＮＡの予後に関する比モデルを構築したが、これはコホート１でＲＰ後のＢＣＲまでの時間の有意な独立した予測因子であった。

結論
発明者らは、大きな前立腺がんコホートでＲＰ後のＢＣＲまでの時間を通常の臨床病理学的変数とは独立に予測する、２〜８個のマイクロＲＮＡを含む予後分類因子を構築している。

（実施例２）
外部検証コホートでの再発リスク予測に関する、８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子の検証

研究の目的
実施例１に記載の８個のマイクロＲＮＡからなる分類因子を独立したＲＰ患者コホートで検証する

方法
検体およびｍｉＲＮＡ発現データ
発明者らは、上記８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子の予後予測能力の性能を、ＧＥＯウェブサイトで利用できるTaylorらの外部ＧＳＥ２１０３６マイクロＲＮＡ発現データセットで調査した（14 および Hieronymus H, Schultz N, Gopalan A, Carver BS, Chang MT, Xiao Y, et al. Copy number alteration burden predicts prostate cancer relapse. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111:11139-44）。このデータセットはスナップ凍結された９９個のＲＰ組織試料を含んでいた（コホート３）。３６８個のマイクロＲＮＡの発現をAgilent Human microRNA Microarray 2.0で測定した（14 および Hieronymus H, Schultz N, Gopalan A, Carver BS, Chang MT, Xiao Y, et al. Copy number alteration burden predicts prostate cancer relapse. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111:11139-44）。

統計分析
統計分析は、STATAバージョン１１（StataCorp（米国、テキサス州））で実施した。すべての分析について、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。

予後予測精度
生化学的再発（ＢＣＲ；現地の臨床実務に基づきＰＳＡカットオフ値は０．２ｎｇ／ｍｌ以上であった）をエンドポイントとした。ＢＣＲを経験していない患者については最後の正常なＰＳＡ測定時で打ち切りとした。８個のマイクロＲＮＡからなる分類因子のマイクロＲＮＡ発現の予後予測値を、カプラン・マイヤー分析および両側ログランク検定、さらには単変量および多変量コックス回帰分析によって連続変数および二分変数として評価した。８個のマイクロＲＮＡからなる分類因子を検証するため、コホート３の患者を、コホート１で定義したカットオフ値（割合）を用いて２つの群に分けた（無再発または再発の状態に関するＲＯＣ分析の後に決定されたカットオフ値）。すべての変数についてｌｏｇ（−ｌｏｇ）生存分布関数によって比例ハザード仮定を検証した。多変量試験については単変量解析で有意な臨床病理学的パラメータをすべて対象とした。多変量解析で基準を満たさなかった変数を段階的な後退的選択法により最終多変量モデルから除外した。病理学的なＴ病期は、局在性（Ｔ２）と局所的進行性疾患（Ｔ３〜４）に二分化した。グリーソンスコアは、それぞれ５〜６点（低）および７〜１０（高）を含む２つのカテゴリに分類した。切除縁の状態は、陰性の周縁と陽性の周縁に二分化した。術前のＰＳＡレベルは連続変数として分析した。ハレルの一致指数を用いて予後予測の精度を推定した。

結果
コホート３の腫瘍試料は異なる国籍（米国）のもので、異なる方法（スナップ凍結）で採取され、異なるＲＮＡ抽出手順に供され、異なるマイクロＲＮＡ発現検出プラットフォームで分析され、コホートの特徴が異なっていた（コホート３はコホート１よりも全体的に悪性度が低く、再発の事象が少なかった）にもかかわらず、発明者らによる８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子はこの外部コホートでも同等に良好に機能し、この８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子の確実さを強調している。

コホート３では、８個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子によって定義される分子的リスクの高い状態は、単変量および多変量コックス回帰分析のいずれにおいてもＲＰ後の早期のＢＣＲと有意に関連していた（それぞれ、Ｐ＝０．００３、Ｐ＝０．００６）（表４下段）。このコホートでは、病理学的なＴ病期は有意な独立した予後予測値を有さず、グリーソンスコアは一方の群では事象がないため分析から除外された。

さらに、多変量モデルの予測精度をハレルのＣ指数によって推定した。注目すべきことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を加えると、コホート３の予測精度は０．７３から０．８０に上昇し（表４下段）、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能をもつことが裏付けられている。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート３で８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子と短いＲＦＳが有意に関連していることが実証された（図１下段；Ｐ＜０．０１９、ログランク検定）。

結論
結論として、発明者らは８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を構築したが、これは２つの独立した患者コホートでＲＰ後のＢＣＲの有意な独立した予後予測因子であった（実施例１および２）。この８個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子（コホート１でのＲＰ後のＢＣＲの有意な独立した予後予測因子）の性能は、まったく異なる患者コホート３で検証され、前立腺がんに関する予後予測手段としての分類因子の強さが証明された。

（実施例３）
２つの独立した検証コホートでの再発リスクの予測に関する、８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子の検証

研究の目的
実施例１および２に記載の８個のマイクロＲＮＡからなる分類因子を絞り込んで得た３個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（ｍｉＲ−１５２−３ｐ×ｍｉＲ−１８５−５ｐ×ｍｉＲ−２２１−３ｐ）を２つの独立したＲＰ患者コホート（コホート２およびコホート３）で検証する

方法
検体
２つのコホートを検証に用いた。コホート２：ＲＴ−ｑＰＣＲによるｍｉＲＮＡプロファイリングのため、発明者らはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺組織試料を使用した。試料はすべてデンマークのAarhus University Hospitalの泌尿器科で採取され、同病院のInstitute of Pathologyから入手した（１９９７〜２００５年）。がん試料について、（Haldrup 2013）に記載の通り、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した切片で腫瘍の９０％より多くを含む代表的な領域を標識し、ＲＮＡ抽出のために対応するＦＦＰＥブロックからパンチ生検体を採取した。miRNeasy FFPEキット（Qiagen）を用いて、製造者の取扱い説明に従い１．５ｍｍのパンチ生検体から全ＲＮＡを単離した。２６０／２８０ｎｍの吸光度比（最適比：２．０）をＲＮＡ試料の品質保証に用いた。比が１．７５未満のＲＮＡ試料はさらなる分析から除外した。精製したＲＮＡを−８０℃で保存した。この検証コホート（コホート２）は、組織学的に確認され臨床的に位置特定された前立腺がんのＲＰ１１２例で構成されていた（ＲＦＳ分析についてはｎ＝１１０；ＲＰを受けた１１２人の患者のうち２人は術後の内分泌治療のため、ＲＦＳ分析から除外された）。コホート３：ＧＥＯウェブサイトで利用できるTaylorらの外部ＧＳＥ２１０３６マイクロＲＮＡ発現データセットで構成されている（１４、およびHieronymus H, Schultz N, Gopalan A, Carver BS, Chang MT, Xiao Y, et al. Copy number alternation burden predicts prostate cancer relapse. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:11139-44.）。このデータセットはスナップ凍結された９９個のＲＰ組織試料を含んでいた。Agilent Human microRNA Microarray 2.0で３６８個のマイクロＲＮＡの発現を測定した。

マイクロＲＮＡ発現プロファイリング
miRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCRプラットフォームを用いて、Exiqon A/S（デンマーク、ベドベーク）でマイクロＲＮＡ発現プロファイリング（試薬はすべてExiqon製）を実施した。簡潔に述べれば、miRCURY LNA（商標）micro RNA PCR, Polyadenylation and cDNA synthesis kit IIを用いて、４０ｎｇの全ＲＮＡを４０μｌの反応で逆転写した。ｃＤＮＡを１００倍に希釈し、１０μｌのＰＣＲ反応で分析した。コホート２（検証）については、miRCURY LNA（商標）Universal RT Pick-&-Mix microRNA PCR panel（４×９６＝３８４ウェル、使用準備済み）を用いて、選択した９４個のｍｉＲＮＡ（正規化遺伝子ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐを含む）を分析した。陰性対照（鋳型なしの逆転写反応）を並行して行った。LightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche）およびExiLENT SYBR（登録商標）Greenマスターミックスを用いて増幅を行った。Roche LCのソフトウェアを用いて増幅曲線を分析し、定量サイクル（Ｃｑ）値を決定し（二階微分法（Livak, 2001）による）融解曲線分析を行った。陰性対照よりも小さいＣｑ値で検出されたのが３回未満のマイクロＲＮＡ、またはすべての試料ですべてのＣｑ値が３７を超えるマイクロＲＮＡ（コホート２では０個のｍｉＲＮＡ）はさらなる分析から除外した。

実施例１で最適で安定な単一の正規化遺伝子として確立され、NormFinderアルゴリズム（１０）によってコホート１とコホート２の両方において最適で安定な単一の正規化遺伝子と確認された正規化遺伝子ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐを用いて、正規化を行った。正規化は式ΔＣｑ＝Ｃｑ_{正規化因子}−Ｃｑ_{ｍｉＲＮＡ}に従い行われた。発現レベルの差異をΔΔＣｑ＝ΔＣｑ_第１群−ΔＣｑ_第２群として計算し、これを倍数変化に換算するために式２^{−ΔΔＣｑ}を用いる。発現が下方制御されたｍｉＲＮＡについては、逆数に係数−１を掛けたものを用いた。

統計分析
統計分析はSTATAバージョン１１（StataCorp（米国テキサス州））で行った。すべての分析について、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。

予後予測精度
生化学的再発（ＢＣＲ；現地の臨床実務に基づきＰＳＡカットオフ値は０．２ｎｇ／ｍｌ以上であった）をエンドポイントとした。ＢＣＲを経験していない患者については最後の正常なＰＳＡ測定時で打ち切りとした。分類因子の予後予測値を、カプラン・マイヤー分析および両側ログランク検定、さらには単変量および多変量コックス回帰分析によって連続変数および二分変数として評価した。分類因子を検証するため、コホート２および３の患者を、コホート１で定義したカットオフ値（割合）（無再発または再発の状態に関するＲＯＣ分析の後に決定されたカットオフ値）を用いて２つの群に分けた。すべての変数についてｌｏｇ（−ｌｏｇ）生存分布関数によって比例ハザード仮定を検証した。多変量試験については単変量解析で有意な臨床病理学的パラメータをすべて対象とした。多変量解析で基準を満たさなかった変数を段階的な後退的選択法により最終多変量モデルから除外した。病理学的なＴ病期は、局在性（Ｔ２）と局所的進行性疾患（Ｔ３〜４）に二分化した。グリーソンスコアは、それぞれ５〜６点（低）および７〜１０（高）を含む２つのカテゴリに分類した。切除縁の状態は、陰性の周縁と陽性の周縁に二分化した。術前のＰＳＡレベルは連続変数として分析した。ハレルの一致指数を用いて予後予測の精度を推定した。

結果
表５からわかるように、コホート３では、８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子によって定義される分子的リスクの高い状態は、単変量および多変量コックス回帰分析のいずれにおいてもＲＰ後の早期のＢＣＲと有意に関連していた（それぞれ、Ｐ＝０．００１、Ｐ＝０．００３）（表５下段）。このコホートでは、術前のＰＳＡレベルは有意な独立した予後予測値を有さず、グリーソンスコアは一方の群では事象がないため分析から除外した。さらに、コホート２では、８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子は、ＲＰ後の早期のＢＣＲと単変量コックス回帰分析では有意に関連しており（Ｐ＝０．０４７）、多変量コックス回帰分析では有意傾向（borderline significant）（Ｐ＝０．０９１）であった（表５中段）。このコホートでは、病理学的なＴ病期およびグリーソンスコアはいずれも有意な独立した予後予測値を有さなかった。

さらに、多変量モデルのそれぞれの予測精度をハレルのＣ指数によって推定した。興味深いことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子を加えると、予測精度はコホート３では０．７４から０．７８（表５下段）、コホート２では０．７１から０．７３（表５中段）に上昇し、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能をもつことが裏付けられている。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート２では８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子と短いＲＦＳが有意に関連している（図２Ｂ；Ｐ＝０．０１４、ログランク検定）ことが実証され、この関連性をコホート３でも検証できた（図２Ｃ；Ｐ＝０．０１９、ログランク検定）。

コホート３の腫瘍試料は異なる国籍（米国）のもので、異なる方法（スナップ凍結）で採取され、異なるＲＮＡ抽出手順に供され、異なるマイクロＲＮＡ発現検出プラットフォームで分析され、コホートの特徴が異なっていた（コホート３はコホート１および２よりも全体的に悪性度が低く、再発の事象が少なかった）にもかかわらず、８個から絞り込んｍｉＲＮＡからなる予後分類因子はこの外部コホートでも同等に良好に機能し、この８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる分類因子の確実さを強調している。

結論
発明者らは８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子を構築したが、これは３つの独立した患者コホートでＲＰ後のＢＣＲまでの時間の有意な予後予測因子であった（実施例１および３）。この８個から絞り込んだｍｉＲＮＡからなる予後分類因子（すなわちコホート１でのＲＰ後のＢＣＲまでの時間の有意な独立の予後予測因子）の性能は、まったく異なる患者コホート３で検証され、前立腺がんに関する予後予測手段としてのこの分類因子の強さが証明された。

（実施例４）
２つの独立な検証コホートでの再発リスクの予測に関する、３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子の検証

研究の目的
３個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（実施例１に記載の、単変量コックス回帰分析で有意なｍｉＲＮＡの加重和に基づくｍｉＲ−１８５−５ｐ＋ｍｉＲ−２２１−３ｐ＋ｍｉＲ−３２６）を２つの独立した患者コホート（コホート２およびコホート３）で検証する

方法
実施例３に記載

結果
表６からわかるように、コホート２およびコホート３では、単変量および多変量コックス回帰分析で３個のマイクロＲＮＡからなる分類因子の予後予測値の検証に成功した。コホート２およびコホート３では、３個のｍｉＲＮＡからなる予後分類因子によって定義される分子的リスクの高い状態は、単変量および多変量コックス回帰分析のいずれにおいてもＲＰ後の早期のＢＣＲと有意に関連していた（単変量解析ではそれぞれＰ＝０．００６およびＰ＜０．００１；多変量解析ではそれぞれＰ＝０．０４８およびＰ＝０．０１２）（表６中段および下段）。コホート２では、切除縁の状態とグリーソンスコアは有意な独立した予後予測値を有さず、コホート３では、病理学的なＴ病期は多変量モデルで有意ではなく、グリーソンスコアは一方の群では事象がないため分析から除外した。

さらに、多変量モデルのそれぞれの予測精度をハレルのＣ指数によって推定した。注目すべきことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を加えると、予測精度はコホート３では０．７３から０．７５（表６中段）、コホート３では０．７４から０．８０（表５下段）に上昇し、この複合予後予測モデルが改善された性能をもつことが裏付けられている。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート２では３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子と短いＲＦＳが有意に関連している（図３Ｂ；Ｐ＝０．０３５、ログランク検定）ことが実証され、この関連性はコホート３でも検証できた（図３Ｃ；Ｐ＝０．００８、ログランク検定）。

コホート３の腫瘍試料は異なる国籍（米国）のもので、異なる方法（スナップ凍結）で採取され、異なるＲＮＡ抽出手順に供され、異なるマイクロＲＮＡ発現検出プラットフォームで分析され、コホートの特徴が異なっていた（コホート３はコホート１および２よりも全体的に悪性度が低く、再発の事象が少なかった）にもかかわらず、発明者らの３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子はこの外部コホートでも同等に良好に機能し、この３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子の確実さを強調している。

結論
発明者らは、３つの独立した患者コホートでＲＰ後のＢＣＲまでの時間の予測に関して有意な独立した予後予測値を有する、３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を構築した（実施例１および４）。この３個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子（すなわちコホート１でのＲＰ後のＢＣＲまでの時間の有意な独立した予後予測因子）の性能は、まったく異なる患者コホート３で検証され、前立腺がんに関する予後予測手段としてのこの分類因子の強さが証明された。

（実施例５）
独立した検証コホートでの再発リスクの予測に関する、４個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子（比に基づく）の検証

研究の目的
比に基づく４個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（実施例１に記載のｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ×ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ／ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ×ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ）を２つの独立した患者コホート（コホート２およびコホート３）で検証する

方法
実施例３に記載

結果
表７からわかるように、コホート２では、４個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルによって定義される分子的リスクの高い状態は、単変量および多変量コックス回帰分析のいずれにおいてもＲＰ後の早期のＢＣＲと有意に関連していた（それぞれ、Ｐ＝０．０２１、Ｐ＝０．０２４）（表７中段）。このコホートでは、病理学的なＴ病期およびグリーソンスコアは有意な独立した予後予測値を有さなかった。さらに、コホート３では、４個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルは、ＲＰ後の早期のＢＣＲと単変量コックス回帰分析では有意に関連しており（Ｐ＝０．０１４）、多変量コックス回帰分析では有意傾向（Ｐ＝０．１１５）であった（表７下段）。コホート３でも、病理学的Ｔな病期は有意な独立した予後予測値を有さず、グリーソンスコアは一方の群では事象がないため分析から除外した。

さらに、多変量モデルのそれぞれの予測精度をハレルのＣ指数によって推定した。臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに４個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルを加えると、予測精度はコホート２では０．７３から０．７５（表７中段）、コホート２では０．７３から０．７８（表７下段）に上昇し、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能をもつことが裏付けられている。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート２では４個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルと短いＲＦＳが有意に関連している（図４Ｂ；Ｐ＝０．０３５５、ログランク検定）ことが実証され、この関連性はコホート３では有意傾向であった（図４Ｃ；Ｐ＝０．１０９７、ログランク検定）。

結論
結論として、発明者らは４個のマイクロＲＮＡの予後に関する比モデルを構築したが、これは３つの独立した患者コホートでＲＰ後のＢＣＲの有意な予後予測因子であり、かつ２つの独立した前立腺がん患者コホートで通常の臨床病理学的パラメータとは独立した予後予測値を有していた。（実施例１および５）。

（実施例６）
２つの独立した検証コホートでの再発リスクの予測に関する、２個のマイクロＲＮＡ（比に基づく）からなる予後分類因子の検証

研究の目的
比に基づく２個のマイクロＲＮＡからなる分類因子（実施例１に記載のｍｉＲ１０ｂ−５ｐ／ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ）を２つの独立した患者コホート（コホート２およびコホート３）で検証する

方法
実施例３に記載

結果
表８からわかるように、コホート２および３では、単変量および多変量コックス回帰分析により、２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルの予後予測値を検証できた。コホート２およびコホート３では、２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルによって定義される分子的リスクの高い状態は、単変量および多変量コックス回帰分析のいずれにおいてもＲＰ後の早期のＢＣＲと有意に関連していた（単変量解析ではそれぞれＰ＝０．０４７、Ｐ＝０．０２３；多変量解析ではそれぞれＰ＝０．０４７、Ｐ＝０．０１５）（表８中段および下段）。コホート２では、切除部の病理学的なＴ病期およびグリーソンスコアは有意な独立した予後予測値を有さず、コホート３では、病理学的なＴ病期は多変量モデルでは有意でなく、グリーソンスコアは一方の群では事象がないため分析から除外した。

さらに、多変量モデルのそれぞれの予測精度をハレルのＣ指数によって推定した。注目すべきことに、臨床病理学的因子のみを含む多変量モデルに２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルを加えると、予測精度はコホート２では０．７３から０．７４（表８中段）、コホート３では０．７３から０．７９（表８下段）に上昇し、この複合予後予測モデルが適度に改善された性能をもつことが裏付けられている。最後に、カプラン・マイヤー分析により、コホート２では２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルと短いＲＦＳが有意に関連している（図５Ｂ；Ｐ＝０．０４８７、ログランク検定）ことが実証され、この関連性はコホート３でも検証できた（図５Ｃ；Ｐ＝０．０００５、ログランク検定）。

コホート３の腫瘍試料は異なる国籍（米国）のもので、異なる方法（スナップ凍結）で採取され、異なるＲＮＡ抽出手順に供され、異なるマイクロＲＮＡ発現検出プラットフォームで分析され、コホートの特徴が異なっていた（コホート３はコホート１および２よりも全体的に悪性度が低く、再発の事象が少なかった）にもかかわらず、発明者らの２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルはこの外部コホートでも同等に良好に機能し、この２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデルの確実さを強調している。

結論
発明者らは、３つの独立した患者コホートでＲＰ後のＢＣＲまでの時間の予測に関して有意な独立した値を有する、比に基づく２個のマイクロＲＮＡからなる予後分類因子を構築した（実施例１および６）。この２個のマイクロＲＮＡからなる予後に関する比モデル（すなわちコホート１でのＲＰ後のＢＣＲまでの時間の有意な独立した予後予測因子）の性能は、まったく異なる患者コホート３で検証され、前立腺がんに関する予後予測手段としてのこの分類因子の強さと確実さが証明された。

（表）

Claims (13)

1. 前立腺がん患者の予後を生体外で評価する方法であって、前記患者から採取した前立腺細胞を含む試料において、ｍｉＲとして少なくともｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの発現レベルを測定するとともに、任意によりｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、及びｍｉＲ−６２５−３ｐからなる群より選択される少なくとも１個の追加のｍｉＲの発現レベルを測定することを含み、ここで、基準発現プロファイルと比較して前記ｍｉＲの発現レベルの変化は前記患者の予後を示す、方法。
2. 前記追加のｍｉＲは、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−２３ａ−３ｐからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 発現レベルは正規化された発現レベルである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 発現レベルはｍｉＲ−１５１ａ−５ｐの発現レベルに対して正規化されている、請求項３に記載の方法。
5. 前立腺がんが進行する確率の増加の評価は、前記試料で前記ｍｉＲのレベルを検出することと、前記ｍｉＲの発現レベルデータを含むデータセットに基づき予後スコア（Ｐ）を計算することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記予後スコア（Ｐ）は以下の発現レベルの比：
   

   

   として計算される、請求項５に記載の方法。
7. 前記予後スコア（Ｐ）は以下の発現レベルの比：
   

   

   として計算される、請求項５に記載の方法。
8. 前記ｍｉＲの発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲの方法により決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ｍｉＲの発現レベルはマイクロアレイによって測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ｍｉＲの発現レベルの測定に用いられるＲＮＡは、ＦＦＰＥブロックまたはスナップ凍結組織の切片の９０％超の腫瘍を含むと評価された領域から得たパンチ生検体から抽出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ｍｉＲの発現レベルの測定に用いられるＲＮＡの２６０／２８０ｎｍの吸光度比は１．７５より大きい、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前立腺がん患者の予後を生体外で評価するためのキットであって、前記患者から採取した前立腺細胞を含む試料において、ｍｉＲとして少なくともｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの発現レベルを測定するための手段を含むとともに、任意により、ｍｉＲとして更にｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、及びｍｉＲ−６２５−３ｐからなる群より選択される少なくとも１個の追加のｍｉＲの発現レベルを測定するための手段を含み、ここで、基準発現プロファイルと比較して前記ｍｉＲの発現レベルの変化は前記患者の予後を示す、キット。
13. 前記追加のｍｉＲは、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−２３ａ−３ｐからなる群より選択される、請求項１２に記載のキット。

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