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CN112795657A - miRNA在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用 - Google Patents

miRNA在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用 Download PDF

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CN112795657A
CN112795657A CN202110301029.3A CN202110301029A CN112795657A CN 112795657 A CN112795657 A CN 112795657A CN 202110301029 A CN202110301029 A CN 202110301029A CN 112795657 A CN112795657 A CN 112795657A
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CN
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sequence
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mir
prostate cancer
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CN202110301029.3A
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张昱
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Abstract

本发明提供了诊断或者辅助诊断哺乳动物前列腺癌症的miRNA生物标志物，其为hsa‑miR‑155‑5p，hsa‑miR‑24‑3p，hsa‑miR‑27a‑3p，hsa‑miR‑23b‑3p，hsa‑miR‑27b‑3p，hsa‑miR‑378a‑3p中的任一种或多种的组合，尤其是hsa‑miR‑155‑5p、hsa‑miR‑27a‑3p、hsa‑miR‑27b‑3p和hsa‑miR‑378a‑3p的联合诊断效能达到0.914，可以作为诊断前列腺癌症的有效联合标志物。本发明还据此提供了一种诊断模型，使用此模型可预测患者患前列腺癌症的概率。

Description

miRNA在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中miRNA在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用。
背景技术
前列腺癌致死率约占全世界癌症病例的12％，是男性第二常见癌症，因此迫切需要早期诊断和预后的生物标志物。液体活检可避免前列腺穿刺检测的不适性，并且可能更好的反映肿瘤的异质性。癌细胞释放到液体的外泌体含有反映疾病状态的分子，目前被认为是一种非常有前景的新型活检方式。外泌体是来源于内体的纳米级膜泡，内含DNA、RNA、蛋白和脂类等多种物质。随着外泌体作为生物学活性分子的载体和介导细胞间通讯的重要媒介的发现，其在临床疾病诊断和治疗上的巨大潜力也逐渐被揭示。尤其引人注意的是，外泌体由于其来源细胞的不同而具有特异性，这使得它们非常适合作为标志物进行疾病的诊断。转录组测序已经被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。目前，一些研究已经针对前列腺癌症患者的尿液外泌体进行转录组测序，发现了一些重要的RNA分子，可作为前列腺癌的生物标志分子。
猪与人的氨基酸同源性达84.1％，在形态结构和生理功能上与人十分相似，并且猪胚胎与人胚胎在发育上具有极高的相似性，是目前世界生物医学研究中非常有吸引力的生物模型。由于以猪为模型不但避免了人类疾病研究中的许多混杂因素(例如吸烟、饮酒、饮食习惯等)，而且为后续的功能验证和分子机理解析奠定了良好基础，因此已经用于许多人类疾病的研究中。研究显示前列腺癌症患者大多表现出精子发生的功能障碍。同时有研究表明，精子质量低与前列腺癌风险增加有关，并且男性不育患者被报道显著增加高级别前列腺癌发病率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症。
为解决上述技术问题，本发明提供了诊断或者辅助诊断哺乳动物前列腺癌症的miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物为如下A1-A6中的一种或多种的组合：
A1、序列如SEQ ID NO：1所示的单链RNA；
A2、序列如SEQ ID NO：2所示的单链RNA；
A3、序列如SEQ ID NO：3所示的单链RNA；
A4、序列如SEQ ID NO：4所示的单链RNA；
A5、序列如SEQ ID NO：5所示的单链RNA；
A6、序列如SEQ ID NO：6所示的单链RNA。
上述miRNA生物标志物具体可为A1、A2、A3、A4的组合。
本发明还提供检测样品中上述miRNA生物标志物含量的物质的下列任一应用：
U1、在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用；
U2、在制备预测哺乳动物前列腺癌症预后的产品中的应用；
U3、在鉴别预测哺乳动物精液品质中的应用；
U4、在制备筛查或辅助筛查哺乳动物前列腺癌症患者产品中的应用。
上述应用中，所述样品是精浆外泌体。
上述应用中，所述检测样品中上述miRNA生物标志物含量的物质可包括检测上述miRNA生物标志物含量的试剂和/或仪器，如通过荧光定量PCR检测上述miRNA生物标志物含量所需的试剂和仪器。
为解决上述技术问题，本发明还提供了产品，其为下列任一产品：
V1、诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品；
V2、预测哺乳动物前列腺癌症预后的产品；
V3、鉴别预测哺乳动物精液品质高低的产品；
V4、筛查或辅助筛查哺乳动物前列腺癌症患者的产品；
所述产品包含检测上述miRNA生物标志物含量的试剂和/或仪器。
上述产品中，所述产品包括序列如SEQ ID NO：7所示的单链DNA、序列如SEQ IDNO：8所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：9所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：10所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：11所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：12所示的单链DNA、序列如SEQID NO：13所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：14所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：15所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：16所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：17所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：18所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：19所示的单链DNA、序列如SEQ IDNO：20所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：21所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：22所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：23所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：24所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：25所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：26所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：27所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：28所示的单链DNA。
上述产品中，所述产品优选包括序列如SEQ ID NO：7所示的单链DNA、序列如SEQID NO：8所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：9所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：10所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：15所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：16所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：17所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：22所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：23所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：24所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：25所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：26所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：27所示的单链DNA、序列如SEQID NO：28所示的单链DNA。
上述产品中，所述产品还包括数据转换装置，所述数据转换装置根据公式(1)将miRNA生物标志物含量转化为前列腺癌症诊断值；
logit(P＝PCa)＝-5.4152×EmiR-27b-3p-0.9097×EmiR-378a-3p+2.0536×EmiR-27a-3p-0.7837×EmiR-155-5p+43.9215 (1)
公式中EmiR-27b-3p为SEQ ID NO：3所示miRNA的相对表达量，EmiR-378a-3p为SEQID NO：4所示miRNA的相对表达量，EmiR-27a-3p为SEQ ID NO：2所示miRNA的相对表达量，EmiR-155-5p为SEQ ID NO：1所示miRNA的相对表达量；所述相对表达量以cel-miR-39为外参，采用2-△△Ct方法计算。
上述产品中，所述样品是精浆外泌体。
本发明还提供上述产品的下述任一应用：
V1、制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品；
V2、制备预测哺乳动物前列腺癌症预后的产品；
V3、制备鉴别预测哺乳动物精液品质高低的产品；
V4、制备筛查或辅助筛查哺乳动物前列腺癌症患者的产品。
本发明还提供一种诊断装置，包含如下公式1:
logit(P＝PCa)＝-5.4152×EmiR-27b-3p-0.9097×EmiR-378a-3p+2.0536×EmiR-27a-3p-0.7837×EmiR-155-5p+43.9215 (1)
公式中EmiR-27b-3p为SEQ ID NO：3所示miRNA的相对表达量，EmiR-378a-3p为SEQID NO：4所示miRNA的相对表达量，EmiR-27a-3p为SEQ ID NO：2所示miRNA的相对表达量，EmiR-155-5p为SEQ ID NO：1所示miRNA的相对表达量；所述相对表达量以cel-miR-39为外参，采用2-△△Ct方法计算。
上述任一所述哺乳动物可为人或猪。
本研究以无精或低精子活力表型的公猪构建前列腺癌研究生物模型，拟利用生物医学模型猪挖掘人类前列腺癌的早期分子诊断标志物，通过转录组数据鉴定精浆外泌体中影响精子活力的重要miRNA分子。通过猪和人的基因组同源性序列的比对，选择高度同源的miRNA分子，利用人类前列腺癌公共数据库中的大规模数据构建前列腺癌诊断模型，确定精准诊断生物标志物，实现对前列腺癌患者的快速诊断，为将来开发外泌体靶向药物奠定坚实基础。本发明实施例的实验结果表明，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-24-3phsa-miR-27a-3phsa-miR-23b-3phsa-miR-27b-3phsa-miR-378a-3p对前列腺癌症具有良好的诊断效能，尤其hsa-miR-155-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-27b-3p和hsa-miR-378a-3p的联合诊断效能达到0.914，可以作为诊断前列腺癌症的有效联合标志物。
附图说明
图1为大白猪精液品质高组和精液品质低组精浆外泌体中ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378转录组测序的表达量结果。
图2为ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378与相应的人microRNAs同源性的比较。
图3为荧光定量PCR检测ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378在大白猪胞外囊泡(SPEVs)中的表达量。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，*代表显著性分析结果为P＜0.05，***代表显著性分析结果为P<0.001。
图4为hsa-miR-155-5p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-378a-3p以及hsa-miR-155-5p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-378a-3p联合诊断前列腺癌症的ROC曲线。图中实线代表测试集，虚线代表验证集。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、以大白猪为动物模型检测不同精液品质精浆SPEV中的显著差异表达microRNAs
一、试验动物与分组
本实施例所用的鲜精样品来自河南精旺种猪改良有限公司，公猪品种为大白猪，月龄在24-36个月，在相同的营养水平和饲养条件下饲养至性成熟。根据半年内公猪站的采精记录筛选精液品质高的公猪(精子总活力>96％且快速运动>70％)和精液品质低和精液品质低的公猪(精子总活力<75％且快速运动<45％)，选择无亲缘关系的11头公猪分为两组，精液品质高组(H)和精液品质低组(L)。两组个体的精子活力存在显著极差异(P<0.01，表1)。所有公猪由采精员在同一时间进行鲜精样品收集。
表1试验个体表型信息
个体号 编号 月龄 精子总活力(％) 快速运动(％)
H1 Y607647 30 97.7 78.3
H2 Y803771 15 98.7 71.1
H3 Y703589 27 99.6 76.9
H4 Y700486 29 99.6 78.3
H5 Y700600 14 98.5 76.7
H6 Y700601 35 96.8 74.5
L1 Y97910 36 73.2 32.9
L2 Y702447 17 65.8 42.1
L3 Y702624 29 55.3 24.8
L4 Y700606 28 31.3 14.3
L5 Y700609 14 63.2 26.3
Pvalue 0.9708 1.51E-04 1.56E-06
注：编号中含有H的属于精液品质高组；编号中含有L的属于精液品质低组。
二、分离猪精浆胞外囊泡(即猪SPEVs)
分别从11个鲜精样品中分离相应的猪SPEVs。每个鲜精样品分离猪SPEVs的步骤依次如下：
1、取鲜精样品，17℃平衡2h，之后17℃、800g离心15min，收集上清1。
2、完成步骤1后，取上清1，4℃、10000g离心30min，收集上清2。
3、完成步骤2后，取上清2，4℃、12000g离心60min，收集上清3。
4、完成步骤3后，取上清3，4℃、120000g离心1.5h，弃上清，用DPBS缓冲液(Gibco，美国)重悬沉淀，得到重悬液。
5、完成步骤4后，取重悬液，4℃、120000g离心1.5h，弃上清，用DPBS缓冲液重悬沉淀，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，得到猪SPEVs。
将猪SPEVs置于-80℃保存备用。
三、猪SPEVs中总RNA提取及浓度测定
分别从步骤二分离的11头猪SPEVs中提取总RNA，得到11头猪SPEVs的总RNA。采用Nanodrop核酸分析仪(Thermo Scientific，美国)检测11头猪SPEVs的总RNA的纯度和浓度。利用Agilent2100(Agilent，美国)检测11头猪SPEVs的总RNA的完整性。
结果表明，11头猪SPEVs的总RNA的浓度均大于8ng/μL，RIN值均为2.6。可以进行后续实验。
四、microRNAs文库构建及测序
1、分别取步骤三提取的11头猪SPEVs的总RNA，由北京恩泽康泰生物有限公司进行microRNAs建库，得到猪SPEVs的microRNAs文库。
每头猪SPEVs的microRNAs文库采用QIAseq miRNA Library Kit试剂盒(QIAGEN，德国)制备，简化的建库步骤如下：①3’和5’端adaptor连接；②Biotinylated RandomPrimers和mRNA混合逆转录；③通过磁珠捕获mRNA，洗脱后进行cDNA纯化；④PCR扩增。建库完成后，使用AgilentBioanalyzer 2100进行质检，质检合格后使用Illumina Hiseq2500进行双末端测序，测序读长为单端10×150bp，得到猪SPEVs的microRNAs文库。
2、每头猪SPEVs的microRNAs文库的数据进行如下分析：
取测序后的原始序列(Raw reads)，用CutAdapt软件进行过滤，去除建库时加入的接头序列和低质量reads，形成Cleanreads；使用Bowtie软件将Clean reads与Silva数据库、GtRNAdb数据库、Rfam数据库和Repbase数据库进行序列比对，过滤掉核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核内小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)以及重复序列，过滤后得到unannotated reads用于后续分析，之后借助BWA软件将Clean reads比对到猪的参考基因组序列sscrofa11.1(网址为：http://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/sus_scrofa/)和相应的基因注释文件(http://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/sus_scrofa/)。
11头公猪精浆胞外囊泡的测序数据量和质控结果(即Q30)见表2。碱基质量值Q30为碱基匹配精度达到99.9％的水平，Q30＝质量值达到Q30及以上的碱基/总碱基。
表2测序数据统计表
Figure BDA0002986255790000061
Figure BDA0002986255790000071
五、差异microRNA的筛选
1、根据步骤四获得的测序数据，使用miRDeep2将比对到参考基因组上的reads与已知microRNAs数据库miRBase中的成熟microRNAs序列进行比对，获得已知microRNAs和预测新microRNAs。对各个样本中的microRNAs进行表达量统计，并用TPM(TranscriptsPerMillion，TPM)算法对表达量进行归一化处理。
归一化公式为：TPM＝(Read counts×1000000)/MappedReads
公式中，read counts表示比对到某一microRNA的reads数目，Mapped Reads表示比对到所有microRNAs上的reads数目。
另外，考虑到低表达的microRNAs生物学意义不大，假阳性高，同时也为了获得更有意义的功能注释分析结果，本研究中只选取符合reads count数>1条件的样本个数大于5的microRNAs进行差异表达分析。
2、使用DESeq2软件进行高低组间差异microRNAs分析。本研究设定差异显著阈值为|Fold Change|(FC)>1.5，P-value≤0.05。
分析结果见图1。结果表明，在猪精液的精浆胞外囊泡中，ssc-miR-155-5p、ssc-miR-24-3p、ssc-miR-27a、ssc-miR-23b、ssc-miR-27b-3p、ssc-miR-378这6个miRNAs在精液品质高组的表达量显著低于精液品质低组的表达量。
表3差异表达miRNAs
ID baseMean log<sub>2</sub>FoldChange Pvalue padj regulated
ssc-miR-155-5p 756.2089655 2.854687099 6.25E-05 0.009087588 up
ssc-miR-378 81.3833331 1.575673524 0.023494267 0.297253547 up
ssc-miR-24-3p 608.7680059 1.591267081 0.002360155 0.068680508 up
ssc-miR-23b 4850.255394 1.356061412 0.004805946 0.084431971 up
ssc-miR-27a 6646.19518 0.77841953 0.003858237 0.080196209 up
ssc-miR-27b-3p 7180.586316 0.745758313 0.004932452 0.084431971 up
实施例2、与人类microRNA的同源性比较和保守性分析
一、寻找同源miRNA
动物miRNA通过种子序列与基因结合发挥功能，不同物种间具有相同种子序列的miRNAs是物种间保守的miRNAs，可以视为同源miRNAs。对人(hsa)和猪(ssc)miRNAs种子序列进行统计比较。在实施例1中发现这6个miRNAs与人具有较高的同源性，结果见图2和表4(下划线指示的序列为同源miRNAs的种子序列)。
表4同源miRNA序列比较
miRNA名称 序列
ssc-miR-155-5p(SEQ ID NO：33) U<u>UAAUGCU</u>AAUUGUGAUAGGGG
hsa-miR-155-5p(SEQ ID NO：1) U<u>UAAUGCU</u>AAUCGUGAUAGGGGUU
ssc-miR-24-3p(SEQ ID NO：38) U<u>GGCUCAG</u>UUCAGCAGGAACAG
hsa-miR-24-3p(SEQ ID NO：6) U<u>GGCUCAG</u>UUCAGCAGGAACAG
ssc-miR-27a(SEQ ID NO：34) U<u>UCACAGU</u>GGCUAAGUUCCGC
hsa-miR-27a-3p(SEQ ID NO：2) U<u>UCACAGU</u>GGCUAAGUUCCGC
ssc-miR-23b(SEQ ID NO：37) A<u>UCACAUU</u>GCCAGGGAUUACCA
hsa-miR-23b-3p(SEQ ID NO：5) A<u>UCACAUU</u>GCCAGGGAUUACCAC
ssc-miR-27b-3p(SEQ ID NO：35) U<u>UCACAGU</u>GGCUAAGUUCUGC
hsa-miR-27b-3p(SEQ ID NO：3) U<u>UCACAGU</u>GGCUAAGUUCUGC
ssc-miR-378(SEQ ID NO：36) A<u>CUGGACU</u>UGGAGUCAGAAGGC
hsa-miR-378a-3p(SEQ ID NO：4) A<u>CUGGACU</u>UGGAGUCAGAAGGC
实施例3、实时荧光定量PCR验证6个保守性较高的microRNAs在高、低精液品质的大白猪SPEVs中的相对表达量
一、引物对的制备
根据ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378，cel-miR-39的核苷酸序列设计并合成用于反转录引物1、反转录引物2、反转录引物3、反转录引物4、反转录引物5、反转录引物6、反转录引物7和用于实时荧光定量PCR检测的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7以及探针1、探针2、探针4、探针6、探针7。各个引物的核苷酸序列见表5。
表5 6个保守性较高的miRNAs以及外参cel-miR-39的探针和引物对
Figure BDA0002986255790000081
Figure BDA0002986255790000091
二、猪SPEVs的cDNA的获得
取实施例1中步骤三获得的猪SPEVs，每个样品200μL中加入5pmol cel-miR-39(miRB0000010，Riobio，中国)，并使用RNeasyMini Kit(QIAGEN，德国)提取总RNA，，分别采用反转录引物1、反转录引物2、反转录引物3、反转录引物4、反转录引物5、反转录引物6、反转录引物7进行反转录，具体：以反转录引物1反转录得到猪SPEVs的ssc-miR-155-5p的cDNA，以反转录引物2反转录得到猪SPEVs的ssc-miR-24-3p的cDNA，反转录引物3反转录得到猪SPEVs的ssc-miR-27a的cDNA，以反转录引物4反转录得到猪SPEVs的ssc-miR-23b的cDNA，反转录引物5反转录得到猪SPEVs的ssc-miR-27b-3p的cDNA，以反转录引物6反转录得到猪SPEVs的ssc-miR-378的cDNA，以反转录引物7反转录得到猪SPEVs的cel-miR-39的cDNA。
反应体系均为10μL，包括2μL猪SPEVs的总RNA、5.25μL RNase Free dH2O、0.5μLPrimeScript RT Enzyme Mix I、2μL 5X PrimeScript Buffer(for Real Time)、0.25μL反转录引物1/2/3/4/5/6/7。
反应程序为：37℃1h；85℃5s。
使用PrimeScript TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)(RR037)试剂盒(TAKARA公司)的试剂。
三、检测ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378的表达量
分别检测11头猪SPEVs的cDNA中ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378的表达量。
1、检测ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-23b，ssc-miR-378的表达量
实时荧光定量检测每个猪SPEVs的cDNA中ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-23b，ssc-miR-378的表达量的步骤依次如下：
取猪SPEVs的cDNA，用水稀释至500ng/μL作为模板，分别采用对应的引物对和探针进行实时荧光定量检测，之后按组取平均值，得到猪精液品质高组和猪精液品质低组中ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378的表达量。其中，ssc-miR-155-5p的表达量采用引物对1和探针1检测，ssc-miR-24-3p的表达量采用引物对2和探针2检测，ssc-miR-23b的表达量采用引物对4和探针4检测，ssc-miR-378的表达量采用引物对6和探针6检测，cel-miR-39的表达量采用引物对7和探针7检测。
反应体系均为20μL，包括5μL猪SPEVs cDNA的稀释液、0.4μL引物F1/F2/F3/F4/F5/F6/F7水溶液(浓度为10μM)、0.4μL引物R1/R2/R3/R4/R5/R6/R7水溶液(浓度为10μM)、10.0μL Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)、0.08μl Probe(探针1/探针2/探针4/探针6/探针7)(100μM)、0.2μL ROX Reference Dye II和3.92μL灭菌水。
使用Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)(RR390)试剂盒(TAKARA公司)中的试剂。
反应程序见表6。
表6PCR反应体系
Figure BDA0002986255790000101
Figure BDA0002986255790000111
2、检测ssc-miR-27a和ssc-miR-27b-3p的表达量
ssc-miR-27a的表达量采用引物对3检测，ssc-miR-27b-3p的表达量采用引物对5检测，cel-miR-39的表达量采用引物对7检测。ssc-miR-27a和ssc-miR-27b-3p的表达量采用常规荧光定量PCR实验方法进行检测反应体系均为20μL，包括5μL猪SPEVs cDNA的稀释液、0.8μL引物F3/F5/F7水溶液(浓度为10μM)、0.8μL引物R3/R5/R7水溶液(浓度为10μM)、10.0μL TB Green Fast qPCR Mix、0.4μL ROX Reference Dye II和3μL灭菌水。
使用TB Green Fast qPCR Mix(RR430)试剂盒(TAKARA公司)中的试剂。
反应程序见表7。
表7常规法qPCR反应程序
Figure BDA0002986255790000112
两种方法检测的6个miRNAs相对表达量均通过cel-miR-39作为外参计算结果。6个miRNAs在两组间相对表达量的检测结果见图3。结果表明，大白猪中，ssc-miR-155-5p，ssc-miR-24-3p，ssc-miR-27a，ssc-miR-23b，ssc-miR-27b-3p，ssc-miR-378在精液品质高组的表达量显著低于精液品质低组的表达量。
实施例4、6个microRNAs诊断前列腺癌的诊断效能
一、收集数据
所有个体的数据均从TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)中获得。从TCGA数据库下载哺乳动物前列腺癌症患者前列腺的肿瘤组织样本和癌旁健康组织样本miRNA的表达数据，共有551个样本，其中有499个为肿瘤样本，52个为癌旁健康样本。
从上述551个样本中随机选择82例样本的miRNA表达文件作为测试集，包括52个肿瘤样本和30个癌旁健康样本；从上述551个样本中随机选择132例样本的miRNA表达文件作为验证集，包括了80个肿瘤样本和52个癌旁健康样本。
二、建立6个miRNAs的前列腺癌症诊断模型
为了检测这6个miRNAs(hsa-miR-155-5p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-378a-3p)对前列腺癌症的诊断能力，发明人通过受试者工作曲线，计算各分子的ROC-AUC。在包含52个样本的测试集中，通过logistic多元回归方程建立基于hsa-miR-155-5p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-378a-3p的诊断模型。对建立的模型，通过受试者工作曲线分析其对前列腺癌症诊断的敏感性和特异性，通过曲线下面积评估诊断模型的诊断效能ROC-AUC，发现这6个miRNAs的诊断效能分别达到0.737，0.754，0.703，0.760，0.862，0.762，均大于0.7，具体可见图4。基于这6个miRNAs可以有效地将前列腺癌症和健康对照分开，因此发明人将这6个miRNAs纳入诊断模型。
为了评估基于这6个miRNAs建立起来的诊断模型的可重复性，在包含132个样本的验证集中，通过logistic多元回归方程建立基于hsa-miR-155-5p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-378a-3p的诊断模型。对建立的模型，通过受试者工作曲线分析其对前列腺癌症诊断的敏感性和特异性，通过曲线下面积评估诊断模型的诊断效能，发现这6个miRNAs依旧具有良好的诊断效能，诊断效能分别达到0.691，0.762，0.682，0.770，0.840和0.759，具体可见图4，ROC曲线参照图4。
三、联合hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-155-5p和hsa-miR-378a-3p建立前列腺癌症诊断模型
在验证集中，发明人对这6个重要的miRNAs，再次进行logistic多元回归分析，通过显著性检验，保留了其中4个相对重要的miRNAs，具体为hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-155-5p和hsa-miR-378a-3p。用这4个miRNAs建立诊断模型，通过受试者工作曲线分析其对前列腺癌症诊断的敏感性和特异性，通过曲线下面积评估诊断模型的诊断效能，发现这4个miRNAs(hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-155-5p和hsa-miR-378a-3p)的联合诊断效能达到0.914(具体可见图4)，比单个分子的诊断效能高，是这4个miRNAs两两以及两两以上任意组合中最高的AUC值，ROC曲线参照图4，此时的敏感性和特异性分别为0.8077和0.8750。通过对TCGA数据库前列腺患者miRNA表达量的分析，建立的4个miRNAs作为联合标志物的诊断模型如下：
logit(P＝PCa)＝-5.4152×EmiR-27b-3p-0.9097×EmiR-378a-3p+2.0536×EmiR-27a-3p-0.7837×EmiR-155-5p+43.9215 (1)
其中，EmiR为miRNA对应的相对表达量，以cel-miR-39为外参，采用2-△△Ct方法计算miRNA的相对表达量；
具体公式中EmiR-27b-3p为hsa-miR-27b-3p的相对表达量，EmiR-378a-3p为hsa-miR-378a-3p的相对表达量，EmiR-27a-3p为hsa-miR-27a-3p的相对表达量，EmiR-155-5p为hsa-miR-155-5p的相对表达量。再用R语言中的predict()函数，输入公式(1)，待测对象的4个miRNAs标志物的相对表达量，函数中type选择response，得到预测待测对象前列腺癌症的患病概率，患病概率数值范围为0-1，患病概率越接近1，待测对象患前列腺癌症的风险越高，患病概率越接近0，待测对象患前列腺癌症的风险越低。
综上，hsa-miR-155-5p(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-27a-3p(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-27b-3p(SEQ ID NO：3)和hsa-miR-378a-3p(SEQ ID NO：4)可以作为诊断前列腺癌症的有效联合标志物。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> miRNA在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用
<130> GNCSY211005
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
uuaaugcuaa ucgugauagg gguu 24
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
uucacagugg cuaaguucug c 21
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
acuggacuug gagucagaag gc 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
aucacauugc cagggauuac cac 23
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgcactgga tacgaccccc ta 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcccgttaa tgctaattgt ga 22
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccccta 50
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcgcactgg atacgacctg ttc 23
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggtggctca gttcagcag 19
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctgttc 50
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccgagttca cagtggctaa g 21
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcggaa 50
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcgcactgg atacgactgg taatc 25
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgcatcaca ttgccagg 18
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 21
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactggtaa tc 52
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccgagttca cagtggctaa g 21
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcagaa 50
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcgcactgga tacgacgcct tc 22
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgactggac ttggagtca 19
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgcactgga tacgacgcct tc 22
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgccttc 50
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
attcgcactg gatacgacca agct 24
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgctcaccgg gtgtaaatc 19
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagct 50
<210> 33
<211> 22
<212> RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 33
uuaaugcuaa uugugauagg gg 22
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 34
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 35
uucacagugg cuaaguucug c 21
<210> 36
<211> 22
<212> RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 36
acuggacuug gagucagaag gc 22
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 37
aucacauugc cagggauuac ca 22
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 38
uggcucaguu cagcaggaac ag 22

Claims (9)

1.诊断或者辅助诊断哺乳动物前列腺癌症的miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物为如下A1-A6中的一种或多种的组合：
A1、序列如SEQ ID NO：1所示的单链RNA；
A2、序列如SEQ ID NO：2所示的单链RNA；
A3、序列如SEQ ID NO：3所示的单链RNA；
A4、序列如SEQ ID NO：4所示的单链RNA；
A5、序列如SEQ ID NO：5所示的单链RNA；
A6、序列如SEQ ID NO：6所示的单链RNA；
所述哺乳动物为人或猪。
2.根据权利要求1所述miRNA生物标志物，其特征在于，其为A1、A2、A3、A4的组合。
3.检测样品中权利要求1或2所述miRNA生物标志物含量的物质的下列任一应用：
U1、在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用；
U2、在制备预测哺乳动物前列腺癌症预后的产品中的应用；
U3、在鉴别预测哺乳动物精液品质中的应用；
U4、在制备筛查或辅助筛查哺乳动物前列腺癌症患者产品中的应用；
所述哺乳动物为人或猪。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样品是精浆外泌体。
5.产品，其特征在于，其为下列任一产品：
V1、诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品；
V2、预测哺乳动物前列腺癌症预后的产品；
V3、鉴别预测哺乳动物精液品质高低的产品；
V4、筛查或辅助筛查哺乳动物前列腺癌症患者的产品；
所述哺乳动物为人或猪；
所述产品包含检测权利要求1或2所述miRNA生物标志物含量的试剂和/或仪器。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括序列如SEQ ID NO：7所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：8所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：9所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：10所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：11所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：12所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：13所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：14所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：15所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：16所示的单链DNA、序列如SEQID NO：17所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：18所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：19所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：20所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：21所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：22所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：23所示的单链DNA、序列如SEQ IDNO：24所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：25所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：26所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：27所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：28所示的单链DNA。
7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括序列如SEQ ID NO：7所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：8所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：9所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：10所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：15所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：16所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：17所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：22所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：23所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：24所示的单链DNA、序列如SEQID NO：25所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：26所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：27所示的单链DNA、序列如SEQ ID NO：28所示的单链DNA。
8.根据权利要求5-7任一所述的产品，其特征在于，所述产品还包括数据转换装置，所述数据转换装置根据公式1将miRNA生物标志物含量转化为前列腺癌症的患病风险值；
logit(P＝PCa)＝-5.4152×EmiR-27b-3p-0.9097×EmiR-378a-3p+2.0536×EmiR-27a-3p-0.7837×EmiR-155-5p+43.9215 (1)
公式中EmiR-27b-3p为SEQ ID NO：3所示miRNA的相对表达量，EmiR-378a-3p为SEQ IDNO：4所示miRNA的相对表达量，EmiR-27a-3p为SEQ ID NO：2所示miRNA的相对表达量，EmiR-155-5p为SEQ ID NO：1所示miRNA的相对表达量。
9.权利要求5-8任一所述的产品的下述任一应用：
V1、制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品；
V2、制备预测哺乳动物前列腺癌症预后的产品；
V3、制备鉴别预测哺乳动物精液品质高低的产品；
V4、制备筛查或辅助筛查哺乳动物前列腺癌症患者的产品；
所述哺乳动物为人或猪。
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