JP6627871B2 - 構造化照明顕微鏡システム、方法及びプログラム - Google Patents

Description

本発明は、構造化照明顕微鏡システム、方法及びプログラムに関する。

生体細胞などの標本の観察に超解像顕微鏡が有効である。超解像顕微鏡の一種である構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）は、干渉縞で標本を照明することにより、空間周波数の高い微細構造の情報を対物レンズの像側へと伝達できる周波数に変調させる技術である（特許文献１などを参照）。

しかしながら、ＳＩＭで生成される標本深部の超解像画像は、標本表面の超解像画像よりも画質が悪い傾向にあることが判明した。

米国発行特許発明第６２３９９０９号明細書

本発明の目的は、構造化照明顕微鏡の深部観察を高性能化することにある。

本発明を例示する構造化照明顕微鏡システムは、試料に含まれる蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で前記試料に照射する照明光学系と、前記干渉縞の方向、位相および空間周波数を制御する制御部と、対物レンズを含み、前記干渉縞が照射されて変調された前記試料の像を形成する結像光学系と、前記結像光学系が形成した像を撮像する撮像素子と、前記撮像素子により撮像された画像を複数用いて復調処理を行う復調部と、を備える構造化照明顕微鏡システムであって、前記制御部は、前記干渉縞のコントラストが一定以上となる範囲で定めた、前記対物レンズから照射位置までの間に存在する媒質および前記試料の深さ方向における前記干渉縞の光軸方向の照射位置と前記干渉縞の空間周波数との関係に基づき、前記干渉縞の空間周波数を適正値に設定する。

本発明を例示する方法は、試料に含まれる蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で前記試料に照射し、前記干渉縞の方向、位相および空間周波数を制御し、前記干渉縞が照射されて変調された前記試料の像を撮像し、前記干渉縞のコントラストが一定以上となる範囲で定めた、対物レンズから照射位置までの間に存在する媒質および前記試料の深さ方向における干渉縞の光軸方向の照射位置と前記干渉縞の空間周波数との関係に基づき、前記干渉縞の空間周波数を適正値に設定する。

本発明を例示するプログラムは、干渉縞が照射されて変調された試料の像を撮像して復調処理を行う構造化照明顕微鏡システムにおいて、コンピュータに、前記干渉縞のコントラストが一定以上となる範囲で定めた、対物レンズから照射位置までの間に存在する媒質および前記試料の深さ方向における干渉縞の光軸方向の照射位置と前記干渉縞の空間周波数との関係に基づき、前記干渉縞の空間周波数を適正値に設定する処理を実行させる。

第１実施形態における２Ｄ−ＳＩＭ１の構成図である。 ＳＬＭ１３を説明する図である。 セルを説明する図である。 光束選択部１００の構成例を示す図である。 図４に示す要素での偏光の状態を示す図である。 マスク１８の例を示す図である。 対物レンズ６と標本５との関係を説明する図である。 結像光学系３０のＭＴＦを観察対象面の深さ毎に示す図である。 観察対象面Ｐの深さと干渉縞の空間周波数の適正値との関係を示す図である（水使用時）。 観察対象面Ｐの深さと干渉縞の空間周波数の適正値との関係を示す図である（封入剤使用時）。 ２Ｄ−ＳＩＭ１の動作フローチャートである。 比較例における２Ｄ−ＳＩＭの性能を示す図である。 本実施形態における２Ｄ−ＳＩＭ１の性能を示す図である。 観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンである。 観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンを滑らかな曲線状とした例である。 観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンを直線状とした例である 観察対象面の深さが所定値より小さいときに干渉縞の空間周波数を固定した例である。 観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンをユーザがリアルタイムで指定する例である。 間隔調整部を説明する図である。 変倍機能付きリレーレンズを説明する図である。 第２実施形態における２Ｄ−ＳＩＭ１’の構成図である。 第３実施形態における２Ｄ−ＳＩＭ１’’の構成図である。 ＳＬＭ１３のユニットセルを示す図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として２光束干渉を利用した構造化照明顕微鏡（２Ｄ−ＳＩＭ：Two-Dimensional Structured Illumination Microscopy）システムを説明する。なお、以下の説明では、構造化照明顕微鏡システムを単に２Ｄ−ＳＩＭと称することもある。

図１は２Ｄ−ＳＩＭ１（構造化照明顕微鏡システム１）の構成図である。図１に示すとおり２Ｄ−ＳＩＭ１には、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、撮像素子３５と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０と、画像表示装置４５と、ステージ５０と、標本５とが配置される。

光ファイバ１１は、不図示の可干渉光源と照明光学系１０との間でレーザ光を中継する例えば偏波面保存型のシングルモードファイバである。可干渉光源としては、波長の異なる複数種類のレーザ光を出射可能なレーザユニットなどを使用することが可能であるが、ここでは簡単のため、可干渉光源の出射するレーザ光の波長を１種類のみと仮定する。

照明光学系１０は、ステージ５０に載置された標本５をレーザ光で照明する例えば落射型照明光学系である。照明光学系１０には、コレクタレンズ１２と、偏光板２３と、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）１４と、回折格子１３と、集光レンズ１６と、光束選択部１００と、集光レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７と、励起フィルタ２８と、ダイクロイックミラー７と、対物レンズ６とが配置される。

照明光学系１０の回折格子１３は、例えば反射型の液晶ＳＬＭである。ここでは回折格子１３を反射型液晶ＳＬＭであると仮定して「ＳＬＭ１３」と称する。ＳＬＭ１３には液晶駆動回路であるドライバ１３Ａが接続される。

結像光学系３０は、撮像素子３５の撮像面３６に標本５の像を形成する結像光学系である。結像光学系３０には、対物レンズ６と、ダイクロイックミラー７と、バリアフィルタ３１と、第２対物レンズ３２とが配置されている。結像光学系３０の対物レンズ６及びダイクロイックミラー７は、照明光学系１０に兼用される。

なお、対物レンズ６は、例えば油浸型などの液浸型対物レンズであり、標本５は、例えば数μｍから数十μｍの厚さを有した培養細胞や組織切片などの生体標本である。

ここでは、後述する図７（Ａ）に示すとおり、平行平板状のカバーガラス５ｇと、カバーガラス５ｇの表面に滴下された培養液５ｃとによって標本５が構成されていると仮定する。培養液５ｃの内部では生体細胞が培養されており、生体細胞の内部には蛍光物質が発現している。前述した可干渉光源の波長は、蛍光物質の励起波長と同じ値に設定されている。なお、図７（Ａ）の符号６ｉは、浸液（油）である。

図１に戻り、撮像素子３５は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の二次元撮像素子であって、撮像面３６に形成された像を撮像して画像（後述する変調画像）を生成する。撮像素子３５が生成した画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へ取り込まれる。

ステージ５０は、標本５を支持し、対物レンズ６の光軸ＡＺに沿って標本５を移動させることにより、対物レンズ６と標本５との間隔を調節する。これによって、標本５における対物レンズ６の焦点面Ｐの深さが調節される（図７（Ａ）、（Ｂ）を参照。）。なお、焦点面Ｐは、２Ｄ−ＳＩＭ１の観察対象面である。以下、対物レンズ６の焦点面Ｐを「観察対象面Ｐ」と称す。

制御装置３９は、ドライバ１３Ａおよび光束選択部１００、撮像素子３５、ステージ５０、不図示の可干渉光源を制御し、超解像に必要な複数枚の変調画像を取得する。

画像記憶・演算装置４０は、制御装置３９が取得した複数枚の変調画像に基づき超解像画像を作成し、不図示の表示装置へ表示する。

次に、２Ｄ−ＳＩＭ１における光の振る舞いを説明する。

不図示の可干渉光源から射出したレーザ光は、光ファイバ１１の内部を伝播した後、光ファイバ１１の出射端に点光源を形成し、点光源から発散光束となって射出する。発散光束は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換された後、偏光板２３を通過することにより偏光方向を整える。偏光方向の整えられた平行光束は、ＰＢＳ１４へ入射すると、ＰＢＳ１４の偏光分離面で反射し、ＳＬＭ１３へ正面から入射する。

なお、偏光板２３の軸は、偏光板２３からＰＢＳ１４の偏光分離面へ向かう平行光束がＳ偏光となるように設定されている。よって、ＰＢＳ１４の偏光分離面へ向かった平行光束が高い効率でＳＬＭ１３へ導光される。

ＳＬＭ１３へ入射した平行光束は、ＳＬＭ１３にて回折反射し、角度の異なる複数の回折光束に分岐される。図１では、複数の回折光束のうち、０次回折光束、１次回折光束、−１次回折光束の３光束のみを描いた。

ＳＬＭ１３から射出した複数の回折光束は、ＰＢＳ１４へ入射した後、ＰＢＳ１４の偏光分離面を透過すると、互いに異なる角度で集光レンズ１６に入射する。

集光レンズ１６に入射した複数の回折光束は、集光レンズ１６の集光作用を受け、瞳共役面６Ａ’の互いに異なる位置に向かって集光する。

なお、瞳共役面６Ａ’は、フィールドレンズ２７及び集光レンズ２５に関して対物レンズ６の瞳面６Ａと共役な面である。ここでいう「共役な面」には、当業者が対物レンズ６、フィールドレンズ２７、集光レンズ２５などの収差、ビネッティング等の設計上必要な事項を考慮して決定した面も含まれる。

ここで、集光レンズ１６を介して瞳共役面６Ａ’に向かう複数の回折光束は、光束選択部１００に入射する。２Ｄ−ＳＩＭ１の場合、光束選択部１００は、受けた回折光束のうち±１次回折光束を通過させ、０次回折光束及び２次以上の高次回折光束を遮光する。なお、光束選択部１００の構成例については図４で説明する。

光束選択部１００を通過した±１次回折光束は、レンズ２５の集光作用を受けると、互いに異なる角度で像共役面へ入射し、像共役面にＳＬＭ１３の一次像を形成する。

なお、像共役面は、対物レンズ６及びフィールドレンズ２７に関して対物レンズ６の焦点面（＝観察対象面Ｐ）と共役な面である。因みに、この像共役面には、視野絞り２６が配置される。

像共役面から射出した±１次回折光束の各々は、フィールドレンズ２７によって収束光束へと変換され、励起フィルタ２８を経てからダイクロイックミラー７で反射し、対物レンズ６の瞳面６Ａの互いに異なる位置に向かって集光する。

瞳面６Ａから発散光束となって射出した±１次回折光束の各々は、対物レンズ６の先端から平行光束となって射出し、対物レンズ６の焦点面（＝観察対象面Ｐ）へ所定の角度関係で入射し、ストライプ状の干渉縞を形成する。

この干渉縞は、集光レンズ１６、集光レンズ２５、フィールドレンズ２７、対物レンズ６によるＳＬＭ１３の二次像に相当する。つまり、集光レンズ１６、集光レンズ２５、フィールドレンズ２７、対物レンズ６の全体には、ＳＬＭ１３の像を観察対象面Ｐへ投影する「投影光学系」の機能がある。

観察対象面Ｐに投影された干渉縞には、観察対象面Ｐにおける蛍光物質の密度分布が有する空間周波数を、干渉縞の空間周波数Ｋの大きさだけ低い周波数へとシフトさせ、蛍光物質の微細な構造情報を対物レンズ６の像側へ伝達させるという働きがある。

観察対象面Ｐの各位置で発生した蛍光は、対物レンズ６の先端へ入射すると、平行光束となって射出し、ダイクロイックミラー７、バリアフィルタ３１を介して第２対物レンズ３２へ入射する。

第２対物レンズ３２へ入射した平行光束は、第２対物レンズ３２の集光作用を受け、撮像素子３５の撮像面３６上に観察対象面Ｐの蛍光像を形成する。

この蛍光像は、干渉縞パターンにより変調された変調像である。

撮像面３６上の蛍光像は、撮像素子３５によって画像化される。但し、この画像化で得られる画像は、干渉縞パターンの重畳された「変調画像」である。よって、この変調画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれ、画像記憶・演算装置４０において復調演算が施される（例えば、米国特許８１１５８０６号明細書に記載の復調演算）。この復調演算の結果、観察対象面Ｐの蛍光超解像画像が生成される。この蛍光超解像画像は、画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、画像表示装置４５へ表示される。

なお、以上の２Ｄ−ＳＩＭ１において、励起フィルタ２８には、レーザ光と同じ波長の光を透過し、蛍光と同じ波長の光を遮光する機能がある。また、ダイクロイックミラー７には、レーザ光と同じ波長の光を反射し、蛍光と同じ波長の光を透過する機能がある。また、バリアフィルタ３１には、蛍光と同じ波長の光を透過し、他の波長の光（漏れ光）を遮光する機能がある。

次に、回折格子としてのＳＬＭ１３を説明する。

図２に示すとおりＳＬＭ１３は、多数の反射型液晶セルを二次元に配列している。但し、図２では、セルの配列数を実際より少なく描いている。各セルの液晶は、例えば強誘電体液晶であり、図２中の楕円は、ＳＬＭ１３の正面から見た液晶分子を模式的に表している。

ＳＬＭ１３のセルがオン／オフされると、セル内の液晶分子が基準軸の周りを回転する。基準軸は、オンされたセル（図３（Ａ））における液晶分子の方向とオフされたセル（図３（Ｂ））における液晶分子の方向との中間方向を示す軸のことである。

オンされたセルにおける液晶分子の方向（楕円の長手方向）は、図３（Ａ）に示すとおり基準軸から角度αだけ回転している。一方、オフされたセルにおける液晶分子の方向は、図３（Ｂ）に示すとおり基準軸から角度−αだけ回転している。この角度αは、液晶の種類によって一義的に決まる角度である。

これらのオンされたセルとオフされたセルとの各々には、セル内の液晶分子と同じ方向に進相軸を向けた１／２波長板と同じ機能がある。１／２波長板の進相軸とは、位相遅延量が最小となる入射光の偏光方向を示す軸のことである。

よって、図２に示すとおりオンされたセルとオフされたセルとが一方向に亘って周期配列されたパターン、つまり一次元の格子パターンをＳＬＭ１３へ表示すれば、ＳＬＭ１３を一次元回折格子として使用することが可能となる。

ここで、ＳＬＭ１３に対する入射光の偏光方向は、ＳＬＭ１３の基準軸に一致していると仮定する。この場合、ＳＬＭ１３は「位相差４αの位相回折格子」として機能する。

例えば、角度αが４５°であるならば、オンされたセルは、入射光の偏光方向を２×α＝＋９０°だけ回転させ、オフされたセルは、入射光の偏光方向を２×（−α）＝−９０°だけ回転させるので、オンされたセルが入射光に与える位相遅延量と、オフされたセルが入射光に与える位相遅延量との差は、４α＝１８０°＝πｒａｄとなる。よって、この場合、ＳＬＭ１３は「位相差πの位相回折格子」として機能する。

上記のように構成されたＳＬＭ１３は、０次回折光束の強度をゼロとするので、０次回折光束が不要な２Ｄ−ＳＩＭ１にとって好適である。

次に、ＳＬＭ１３のドライバ１３Ａを説明する。

ドライバ１３Ａは、ＳＬＭ１３に配列された個々のセルをオン／オフすることにより、ＳＬＭ１３に表示される格子パターンを次のとおり切り替える。

例えば、ドライバ１３Ａは、ＳＬＭ１３に表示される格子パターンの格子ピッチを切り替えることにより、干渉縞の空間周波数を切り替える。

また、ドライバ１３Ａは、ＳＬＭ１３に表示される格子パターンの方向を切り替えることにより、干渉縞の方向を切り替える。

また、ドライバ１３Ａは、ＳＬＭ１３に表示される格子パターンの位相をシフトさせることにより、干渉縞の位相をシフトさせる。

なお、以上の説明では、ＳＬＭ１３の液晶に固有の角度αを４５°としたが、液晶に固有の角度αは４５°未満であっても構わない。角度αが４５°未満である場合は、ＳＬＭ１３で発生する０次回折光束の強度がゼロにはならないものの、その他の点は、角度αが４５°の場合と同様である。

次に、図１に示す光束選択部１００について説明する。光束選択部１００には、観察対象面Ｐへ入射する光束を選択する機能と、観察対象面Ｐへ入射する±１次回折光束の偏光状態をＳ偏光に維持する機能がある。観察対象面Ｐへ入射する±１次回折光束をＳ偏光とするためには、観察対象面Ｐへ向かう±１次回折光束の偏光方向を、±１次回折光束の分岐方向に直交させればよい。

但し、本実施形態では、干渉縞の方向切り替えのためにＳＬＭ１３の格子パターンの方向が切り替わる。このとき、±１次回折光束の分岐方向も切り替わる。よって、光束選択部１００は、この切り替えに対応する必要がある。

図４は、光束選択部１００の構成例を示す図である。なお、図４では、ＳＬＭ１３およびＰＢＳ１４を光束選択部１００の入射側にそれぞれ示す一方で、光束選択部１００の入射側に配置される集光レンズ１６の図示は省略している。

光束選択部１００は、入射側から順に、１／２波長板１０１、セグメント波長板１７、固定偏光板１０２、液晶１／２波長板１０３，１０４を有している。

１／２波長板１０１は、光の進行方向から見て進相軸が水平から３７．５°回転した方向となるように配置される。

セグメント波長板１７は、例えば透過型の液晶ＳＬＭである。セグメント波長板１７を透過型液晶ＳＬＭであると仮定して「ＳＬＭ１７」と称す。ＳＬＭ１７には液晶駆動回路であるドライバ１７Ａが接続される。

ＳＬＭ１７は、透過型液晶ＳＬＭであり、ドライバ１７Ａによりそれぞれオン／オフの制御が可能な複数のセルを有している。例えば、ＳＬＭ１７は、中央部に配置される円形状のセルと、この円形状のセルの外周に配置され、リング状の領域を円周方向に分割して形成された６つのセルとを有している。ＳＬＭ１７のドライバ１７Ａは、ＳＬＭ１７の個々のセルがあらかじめ設定された進相軸の方向で１／２波長板として機能するか否かを、個々のセルに与えるべき駆動信号の値によって制御できる。

ＳＬＭ１７においてオンの状態のセルは、光の進行方向から見て進相軸が水平から３０°となる１／２波長板として機能する。また、ＳＬＭ１７においてオフの状態のセルは偏光制御機能がなく、入射したときの偏光状態が保存されたまま光が透過する。

固定偏光板１０２は、光の進行方向から見て偏光方向が水平から７５°となるように配置されている。

液晶１／２波長板１０３は、液晶駆動回路であるドライバ１０３Ａによりオン／オフが制御される。液晶１／２波長板１０３は、オンの状態のときに光の進行方向から見て進相軸が水平から１５°回転した方向に設定された１／２波長板として機能する。また、液晶１／２波長板１０３は、オフの状態のときには偏光制御機能がなく、入射したときの偏光状態が保存されたまま光が透過する。

液晶１／２波長板１０４は、液晶駆動回路であるドライバ１０４Ａによりオン／オフが制御される。液晶１／２波長板１０４は、オンの状態のときに光の進行方向から見て進相軸が水平から４５°回転した方向に設定された１／２波長板として機能する。また、液晶１／２波長板１０４は、オフの状態のときには偏光制御機能がなく、入射したときの偏光状態が保存されたまま光が透過する。

なお、ドライバ１７Ａ、１０３Ａ、１０４Ａは、それぞれ制御装置３９により制御される。

また、図５は、図４に示す要素での偏光の状態を示す図である。図４および図５では、一例として、構造化照明４５°であるときの偏光の状態を示している。

なお、図４、図５において各要素に付与した矢印のうち矢じりを黒く塗りつぶしたものは、各要素に入射及び射出する光の偏光方向を示している。図４、図５の矢印のうち矢じりを塗りつぶしていないものは素子の軸方向を示している。また、図４、図５では各要素を模式的に示しているので実際と同じとは限らない。

先ず、ＰＢＳ１４から射出した±１次回折光束の偏光方向は、ＰＢＳ１４の偏光分離面を透過できる光の偏光方向であるので、±１次回折光束の分岐方向の切り替えに拘わらず不変である。

±１次回折光束の分岐方向が４５°であるとき、光束選択部１００は、入射した±１次回折光束の偏光方向を、分岐方向の４５°と直交する方向（−４５°の直線偏光）へと変換する必要がある。そのために、まず固定の１／２波長板１０１で偏光方向を所定の方向に回転する。ここではＰＢＳ１４の透過後の偏光方向を水平０°とし、１／２波長板１０１の進相軸を光の進行方向から見て水平から３７．５°回転した方向に配置する。すると偏光方向を同７５°に回転することができる（図５（ｂ））。

続いて、制御装置３９は、ドライバ１７Ａを介して、ＳＬＭ１７のセルのうち分岐方向４５°の±１次回折光束が入射するセルをオフとし、それ以外のセルをオンとする制御を行う。ＳＬＭ１７のオンのセルは光の進行方向から見て進相軸が水平から３０°を回転した方向に設定された１／２波長板として機能し、ＳＬＭ１７のオフのセルは偏光制御機能がなく、入射したときの偏光状態が保存されたまま光が透過する。その結果、ＳＬＭ１７の後の偏光状態は、分岐方向４５°の±１次回折光束が入射する領域（ＳＬＭ１７のオフのセル）を通った光は、光の進行方向から見て水平から７５°の直線偏光のままであり、それ以外の領域（ＳＬＭ１７のオンのセル）を通過する光は光の進行方向から見て水平から−１５°の直線偏光に変換される（図５（ｃ））。

ＳＬＭ１７を透過した光は固定偏光板１０２に入射する。このとき、ＳＬＭ１７のオンのセルを通過する光は光の進行方向から見て水平から−１５°の直線偏光に変換されるため、偏光方向が７５°の固定偏光板１０２で遮断される（図５（ｄ）上段）。一方、ＳＬＭ１７のオフのセルを通った光は、光の進行方向から見て水平から７５°の直線偏光であるので、偏光方向が７５°の固定偏光板１０２をそのまま透過する（図５（ｄ）下段）。

そして、制御装置３９は、ドライバ１０３Ａを介して、液晶１／２波長板１０３をオンにする制御を行う。また、制御装置３９は、ドライバ１０４Ａを介して、液晶１／２波長板１０４をオフにする制御を行う。

液晶１／２波長板１０３は、オンにすることで光の進行方向から見て進相軸が水平から１５°回転した方向に設定された１／２波長板として機能する。ＳＬＭ１７のオフのセルを通過した分岐方向４５°の±１次回折光は、光の進行方向から見て水平から７５°の直線偏光であったが、１５°に進相軸をもつ液晶１／２波長板１０３によって光の進行方向から見て水平から−４５°の直線偏光に変換される（図５（ｅ））。また、液晶１／２波長板１０４はオフであるので、偏光状態が保存されたまま液晶１／２波長板１０４を光が透過する。このように、ＰＢＳ１４から射出した±１次回折光束は、光束選択部１００を通過した後は、分岐方向４５°に直交した−４５°の偏光状態に変換される。

なお、光束選択部１００において、±１次回折光束の分岐方向を変化させる場合には、制御装置３９により、ＳＬＭ１７のセルのオン／オフと、液晶１／２波長板１０３のオン／オフおよび液晶１／２波長板１０４のオン／オフを適宜切り替えればよい。

なお、図４に示す光束選択部１００において、ＳＬＭ１３のピクセル構造などに起因して発生したノイズ回折光の通過を抑制するために、ＳＬＭ１７の各セルに対応する開口を備えたマスク１８を光束選択部１００の光路に挿入してもよい。マスク１８は、例えば、必要な回折光の入射領域にのみ開口部（孔）を形成した黒色の薄いマスク基板である。或いは、マスク１８は、例えば、必要な回折光の入射領域に透過セルを配置し、かつ不要な回折光の入射領域に不透明セルを配置した液晶素子であってもよい。図６は、光束選択部１００に挿入されるマスク１８の例を示す図である。例えば、図６（ａ）は、後述のように０次回折光と±１次回折光とを通過させる場合の３光束用マスク１８のパターン例を示し、図６（ｂ）は、±１次回折光を通過させる場合の２光束用のマスク１８のパターン例を示す。なお、図６において、マスク１８の黒い部分は遮光領域を示す。

次に、観察対象面Ｐの深さ調節について説明する。

通常、２Ｄ−ＳＩＭ１の超解像効果は、干渉縞の空間周波数が高いほど高まるので、従来の２Ｄ−ＳＩＭにおける干渉縞の空間周波数は、対物レンズ６が伝達可能な空間周波数の上限値（光学的なカットオフ周波数）の近くに設定されていた。しかしながら、観察対象面Ｐの深さを調節すると、主に以下の２つの問題が発生する。

第１の問題は、次のとおりである。すなわち、図７（Ａ）に示すとおり観察対象面Ｐがカバーガラス５ｇの直上に位置するとき（表面観察時）には対物レンズ６の収差は無視できるが、図７（Ｂ）に示すとおり観察対象面Ｐが培養液５ｃの深部に位置するとき（深部観察時）には対物レンズ６の収差が無視できなくなる。なぜなら、対物レンズ６の設計は、表面観察（図７（Ａ））を想定しているので、深部観察（図７（Ｂ））のように、対物レンズ６の先端から観察対象面Ｐまでの光路中に存在する媒質の厚さ及び屈折率の組み合わせが想定外（インデックスミスマッチ）になると、対物レンズ６の球面収差が抑えきれなくなるからである。

このため、深部観察（図７（Ｂ））の際には、対物レンズ６を含む結像光学系３０のＭＴＦ（ＭＴＦ：Modulation Transfer Function）が悪化して、結像光学系３０が撮像面３６に形成する像のコントラストが低下し、結果として、復元画像の画質が悪化する。

第２の問題は、次のとおりである。すなわち、深部観察（図７（Ｂ））の際には、非観察対象面に存在する細胞などの多種構造物で発生した散乱光が、ノイズ光となって対物レンズ６へ入射し、最終的には撮像素子３５にも到達し得る。

このため、深部観察（図７（Ｂ））の際には、撮像素子３５のＳＮ比が悪化する。

そして、以上の第１の問題（像のコントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）と第２の問題（ＳＮ比の悪化）とに起因して、深部観察（図７（Ｂ））の際には、撮像素子３５が画像化可能な空間周波数の上限値（実質的なカットオフ周波数）が低下する。

そこで、本実施形態では、主に第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）の解決を図る。因みに、後述する第２実施形態及び第３実施形態では、第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）と第２の問題（ＳＮ比の悪化）との双方の解決を図る。

以下、本実施形態における第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）と、その解決策を説明する。

図８は、結像光学系３０のＭＴＦ（ＭＴＦ：Modulation Transfer Function）を観察対象面Ｐの深さ毎に示す図である。図８の横軸は、結像光学系３０が撮像面３６に形成する像の空間周波数であり、図８の縦軸は、結像光学系３０が撮像面３６に形成する像のコントラストである。

ここでは、表面観察時における観察対象面Ｐの深さを０［μｍ］とおき、浸液６ｉを油とし、細胞を含む培養液５ｃを水とみなし、対物レンズ６の倍率を１００倍と仮定し、対物レンズ６の開口数ＮＡを１．４９とし仮定し、結像光学系３０の使用波長λを０．５８７［μｍ］と仮定し、結像光学系３０の結像倍率Ｍを１００倍と仮定した。

図８に示すとおり、観察対象面Ｐの深さ（細胞（水）の深さ）が０［μｍ］であるときには、結像光学系３０はカットオフ周波数まで伝達できるので、伝達可能な最大空間周波数は５０．７［ｃ／ｍｍ］である。因みに、このカットオフ周波数Ｒは、Ｒ＝１０００／（λ／（２（ＮＡ／Ｍ）））の式で表される。

しかし、観察対象面Ｐの深さがゼロより大きくなると、図８に示すとおり結像光学系３０のＭＴＦ曲線の形状が変化して、像のコントラストが低下することにより、結像光学系３０では伝達可能な最大空間周波数は低下する。例えば、観察対象面Ｐの深さが１０［μｍ］のときには、結像光学系３０の伝達可能な最大空間周波数は約３０［ｃ／ｍｍ］にまで低下する。

このため、仮に、干渉縞の空間周波数を、観察対象面Ｐの深さがゼロであるときのカットオフ周波数Ｒ＝５０．７［ｃ／ｍｍ］と同じ値に固定してしまうと、観察対象面Ｐの深さを大きくしたときには伝達可能な空間周波数が低下してしまうため、干渉縞のパターンを撮像面３６の側へ伝達できないという現象が発生する。画像の復元処理をする場合には、構造化照明の空間周波数の情報が必要であるため、取得画像から構造化照明の空間周波数の情報を読み出す必要がある。したがって、干渉縞のパターンを撮像面３６の側へ伝達できないという現象が発生すると、構造化照明の空間周波数の情報を取得画像から正しく読みだすことができず、ノイズを情報と見誤って復元処理演算をすることになり、超解像画像の画質が悪化する。

そこで、本実施形態では、第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）を解決すべく、干渉縞の空間周波数を制御する。

具体的には、本実施形態では、観察対象面Ｐの深さを所定範囲内で切り替えたとしても、撮像面３６に投影される干渉縞のコントラストが一定以上となるよう、干渉縞の空間周波数を制御する。このようにすれば、超解像画像の画質の悪化を防ぐことができる。

しかも、本実施形態では、観察対象面Ｐの深さを所定範囲内で切り替えたとしても、撮像面３６に投影される干渉縞のコントラストが適正範囲内に収まるよう、干渉縞の空間周波数を制御する。このようにすれば、超解像画像の画質を保つことができる。

図９は、観察対象面Ｐの深さと干渉縞の空間周波数の適正値との関係を示す図である。ここでは、干渉縞の空間周波数を撮像面３６における値に換算した。また、ここでは、培養細胞の全体を過不足なくカバーできるよう観察対象面Ｐの深さ範囲を０〜１０［μｍ］と仮定した。

図９に示すとおり、観察対象面Ｐの深さが大きいときほど、干渉縞の空間周波数の適正値は低くなる。

具体的に、本実施形態では、観察対象面Ｐの深さが０［μｍ］以上かつ０．５［μｍ］未満であるときには、干渉縞の空間周波数の適正値を４０［ｃ／ｍｍ］とする。

また、観察対象面Ｐの深さが０．５［μｍ］以上かつ１［μｍ］未満であるときには、干渉縞の空間周波数の適正値を３５［ｃ／ｍｍ］とする。

また、観察対象面Ｐの深さが１［μｍ］以上かつ２［μｍ］未満であるときには、干渉縞の空間周波数の適正値を３０［ｃ／ｍｍ］とする。

また、観察対象面Ｐの深さが２［μｍ］以上かつ５［μｍ］未満であるときには、干渉縞の空間周波数の適正値を２５［ｃ／ｍｍ］とする。

また、観察対象面Ｐの深さが５［μｍ］以上かつ１０［μｍ］未満であるときには、干渉縞の空間周波数の適正値を２０［ｃ／ｍｍ］とする。

これらの適正値によると、観察対象面Ｐの深さを０［μｍ］〜１０［μｍ］の範囲内で切り替えたとしても、干渉縞のコントラストは、０．０３〜０．１の範囲内に収まる。

なお、本実施形態では、干渉縞パターンを結像光学系３０が正確に伝達できるよう干渉縞の空間周波数を意図的に低く設定するので、その分だけ超解像効果は下がる。図９の最下段に示す値は、超解像効果εである。超解像効果εは、干渉縞の空間周波数Ｋと、観察対象面Ｐの深さがゼロであるときにおける結像光学系３０のカットオフ周波数Ｒとによってε＝（Ｒ＋Ｋ）／Ｒで表される。

図９の最下段によると、本実施形態では、観察対象面Ｐの深さを０〜１０［μｍ］の範囲内で切り替えたとしても、超解像効果は１．４〜１．８の良好な範囲内に収まることがわかる。

また、上記の説明では、カバーガラス５ｇの上下に存在する媒質として浸液（油）６ｉと培養液（水）５ｃとの組み合わせを想定したが、他の組み合わせにすることもできる。例えば、水の代わりに封入剤を使用することも可能である。

例えば、汎用の封入剤であるＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄを使用した場合（Ｐｒｏｌｏｎｇは登録商標）、観察対象面Ｐの深さと干渉縞の空間周波数の適正値との関係は、図１０に示すとおりとなる。

図１０のデータは、図９のデータにおいて水の深さを封入剤の深さへ換算したものに相当する。この換算は、以下の関係式に基づく。

ｔｂ＝（ｎｏ−ｎｗ）／（ｎｏ−ｎｂ）×ｔｗ
但し、ｔｗは水の深さ、ｔｂは封入剤の深さ、ｎｗは水の屈折率、ｎｂは封入剤の屈折率、ｎｏは浸液（油）の屈折率である。

油の屈折率ｎｏは１．５１、水の屈折率ｎｗは１．３３、封入剤（ＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄ）の屈折率ｎｂは１．４６であるので、上記関係式によると、水の深さｔｗと封入剤の深さｔｂとの比は、１０：３６であることがわかる。この場合、水の最大深さ１０［μｍ］に対応する封入剤の最大深さは３６［μｍ］である。

よって、水を使用した場合には観察対象面Ｐの深さ範囲が０〜１０μｍであったのに対して、封入剤を使用した場合には観察対象面Ｐの深さ範囲を０〜３６μｍにすることができる。

このような広い深さ範囲０〜３６μｍは、比較的厚みの大きな組織切片細胞をもカバーすることができる。つまり、水の代わりに封入剤を使用すると、２Ｄ−ＳＩＭ１のアプリケーションが広がる。

次に、２Ｄ−ＳＩＭ１の動作フローを説明する。ここでは、図９に示すデータと図１０に示すデータとが例えばルックアップテーブルとして制御装置３９に格納されたと仮定する。

図１１は、２Ｄ−ＳＩＭ１の動作フローチャートである。以下、図１１の各ステップを順に説明する。

ステップＳ１：制御装置３９は、ドライバ１３Ａを介して干渉縞の方向、干渉縞の位相、干渉縞の空間周波数を初期値に設定する。また、制御装置３９は、ステージ５０を介して観察対象面の深さを初期値に設定する。因みに、干渉縞の空間周波数の初期値は４０［ｃ／ｍｍ］であり、深さの初期値は０［μｍ］である。

ステップＳ２：制御装置３９は、不図示の可干渉光源及び撮像素子３５を駆動することにより、干渉縞で変調された標本の画像である変調画像を取得し、変調画像を画像記憶・演算装置４０へ送出する。

ステップＳ３：制御装置３９は、干渉縞の位相数が必要数に達したか否かを判別し、達していない場合はステップＳ４へ移行し、達した場合はステップＳ５へ移行する。

ステップＳ４：制御装置３９は、ドライバ１３Ａを介してＳＬＭ１３に表示される格子パターンの位相を１ステップだけシフトさせてから、ステップＳ２に戻る。本ステップにより、干渉縞の位相は１ステップだけシフトする。

ステップＳ５：制御装置３９は、干渉縞の方向数が必要数に達したか否かを判別し、達していない場合はステップＳ６へ移行し、達した場合はステップＳ７へ移行する。

ステップＳ６：制御装置３９は、ドライバ１３Ａを介してＳＬＭ１３に表示される格子パターンの方向を１ステップだけ切り替えてから、ステップＳ２に戻る。本ステップにより、干渉縞の方向は１ステップだけ切り替わる。

ステップＳ７：制御装置３９は、観察対象面の深さ数が必要数に達したか否かを判別し、達していない場合はステップＳ８へ移行し、達した場合はステップＳ１１へ移行する。

ステップＳ８：制御装置３９は、ステージ５０を介して標本５を対物レンズ６の側へ１ステップだけ近接させてから、ステップＳ９へ移行する。本ステップにより、観察対象面の深さは１ステップだけ大きくなる。

ステップＳ９：制御装置３９は、ルックアップテーブルを参照し、干渉縞の現在の空間周波数が適正であるか否かを判別し、適正であればステップＳ２へ戻り、適正でなければステップＳ１０へ移行する。但し、本ステップにおける制御装置３９は、カバーガラス５ｇの上に存在する媒質として水が使用されている場合は図９のルックアップテーブルを参照し、封入剤が使用されている場合は図１０のルックアップテーブルを参照する。なお、カバーガラス５ｇの上に存在する媒質の種類は、ユーザから制御装置３９へと予め指定されたと仮定する。

ステップＳ１０：制御装置３９は、ドライバ１３Ａを介してＳＬＭ１３に表示される格子パターンの格子ピッチを切り替えてから、ステップＳ２へ戻る。本ステップにより、干渉縞の空間周波数は適正値に切り替わる。

ステップＳ１１：画像記憶・演算装置４０は、以上のステップＳ１〜Ｓ１０で取得された複数枚の変調画像を、干渉縞の空間周波数又は観察対象面の深さによってグループ化する。なお、これら複数枚の変調画像の間では「干渉縞の位相」、「干渉縞の方向」、「観察対象面の深さ」、「干渉縞の空間周波数」のうち少なくとも１つが異なる。そして、画像記憶・演算装置４０は、グループごとに公知の復調演算を施すことにより、標本５の超解像画像を求める。なお、この復調演算には、米国特許８１１５８０６号明細書に記載の復調演算や、ハインツマン等の論文（下記）に記載の復調演算（Slice3Dアルゴリズム）などを適用することができる。因みに、ハインツマン等のSlice3Dアルゴリズムは、干渉縞の空間周波数の異なる複数の変調画像を、個別に復調するのに適している。

ハインツマン等の論文："Phase optimisation for structured illumination microscopy", KaiWicker, Ondrej Mandula, Gerrit Best, Reto Fiolka, and Rainer Heintzmann Received 28 Sep 2012; revised 6 Jan 2013; accepted 7 Jan 2013; published 18 Jan 2013(C) 2013 OSA 28 January 2013 / Vol. 21, No. 2 / OPTICS EXPRESS 2033
次に、本実施形態における第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）と、その解決策について、別の観点で説明する。

図８では、取得画像から構造化照明の空間周波数の情報を読み出し、復調処理を行った場合において、第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）が生じることを説明し、その解決策を説明した。

しかしながら、取得画像から構造化照明の空間周波数の情報を読み出さずに、既知の値として復調処理を行うことも可能であるが、この場合においても、第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）が生じる。

以下、構造化照明の空間周波数を既知の値として復元処理を行った場合においても、本実施形態の方法が第１の問題（コントラストの低下により、超解像画像の画質が悪化する問題）を解決し得ることを、図１２、図１３を参照して説明する。

図１２の左側は、比較例の実効的なＭＴＦを観察対象面の深さごとに示したものであり、図１２の右側は、比較例の実効的なＰＳＦ（ＰＳＦ：Point Spread Function）を観察対象面の深さごとに示したものである。図１２の下側ほど観察対象面の深さが大きい。

ここで、実行的なＭＴＦとは、結像光学系３０が図８に示す伝達関数それぞれを持つ状態で、構造化照明を施し、構造化照明の空間周波数の情報を既知の値として復元処理した場合の伝達関数を意味する。また、実効的なＰＳＦとは、結像光学系３０が図８に示す伝達関数それぞれを持つ状態で、構造化照明を施し、構造化照明の空間周波数の情報を既知の値として復元処理された後の点像強度分布を意味している。

図１２のA1に示す実効的なＭＴＦは、波数空間のXY平面を示し、色の白さで周波数ごとの強度を示している。またA2は、対応する実効的なＭＴＦのプロファイル図を示し、上段がX方向のプロファイル、下段がY方向のプロファイルを示している。プロファイル図の横軸は空間周波数で、中央が0、周辺へ行くほど高周波を示す。縦軸は規格化強度を示す。

またB1の実効的なＰＳＦは、実空間のXY平面上の強度を示し、色の白さでその位置における強度を示している。またB2は、対応する実効的なＰＳＦのプロファイル図を示し、同様に上段がX方向、下段がY方向のプロファイル図である。ＰＳＦのプロファイル図の横軸は像面上の位置で、中央が像中心を示し、縦軸は規格化した像強度である。

図１２に示すとおり、比較例では、波数空間（ＭＴＦ）では干渉縞の空間周波数Ｋに相当する位置に不連続なピークが発生し、実空間（ＰＳＦ）では点像の周囲に輝点ノイズが発生してしまう。

このため、比較例で取得した超解像画像では、二重像のような縁取りや六対称なノイズパターンが細胞像の周囲に現れる。

つまり、構造化照明の空間周波数を既知の値として復元処理を行った場合においても、本実施形態の方法が第１の問題（コントラストの低下により、復元画像の画質が悪化する問題）が発生することが分かる。

図１２の計算では構造化照明の空間周波数の情報は既知として扱ったので、上記ノイズパターンは不連続なピークに起因するものだけだが、実際には図８で検討したごとく、構造化照明の情報を像面へ伝達できない問題も発生するため、復元処理がうまくいかず、より激しいノイズが発生することが考えられる。

図１３は、本実施形態の性能を示す図である。図１３の表記方法は、図１２の表記方法と同じである。

図１３に示すとおり、本実施形態では、干渉縞の空間周波数を制御するので、観察対象面の深さが大きくとも、前述した第１の問題（対物レンズ６の球面収差）は目立たず、波数空間（ＭＴＦ）では干渉縞の空間周波数Ｋに相当する位置に不連続なピークが殆ど発生せず、実空間（ＰＳＦ）では点像の周囲に輝点ノイズが殆ど発生しない。

このため、本実施形態で取得した超解像画像では、二重像のような縁取りや六対称なノイズパターンが細胞像の周囲に現れることは無い。

次に、撮像素子３５及びＳＬＭ１３の仕様を具体的に説明する。

ここでは、画素サイズが６．５μｍであり、画素数が１０２４×１０２４［ｐｉｘｅｌ］であるＣＭＯＳ撮像素子が撮像素子３５として使用されたと仮定する。

上述したとおり本実施形態では、撮像素子３５の撮像面３６に形成すべき干渉縞のうち、最も微細な干渉縞の空間周波数は、４０［ｃ／ｍｍ］であった。この干渉縞を撮像面３６に形成する場合、撮像面３６の全体における縞本数は、４０［ｃ／ｍｍ］×６．５［μｍ］／１０００×１０２４［ｐｉｘｅｌ］＝２６６［Ｈｚ］となる。

また、ここではＳＬＭ１３の全体へ表示すべき格子パターンの最小単位であるユニットセルの画素数（セル数）の横方向のメイン画素間隔を「９」と仮定する。このユニットセルは、位相変調で格子パターンを変位させる方向における１周期分の格子パターンをＳＬＭ１３へ表示するのに必要な画素の集まりのことである。このユニットセルをＳＬＭ１３へ隙間無く配列すれば、格子パターンの全体をＳＬＭ１３へ表示することができる。

ここで、ユニットセルについて図２３を用いて説明する。図２３（ａ）はＳＬＭ１３の一部を示す。本図に示すように格子パターンを形成したとき、破線で囲った領域をユニットセルとする。図２３（ｂ）はユニットセルだけ抜き出して示したものである。ＳＬＭ１３の全面に図２３（ｂ）に示すユニットセルを敷き詰める形で表現できる。ユニットセルの横方向のメイン画素間隔が「９」なので、横方向の格子周期が９［ｐｉｘｅｌ］ということである。こうしておけば、ＳＬＭ１３上の格子パターンを横方向に３［ｐｉｘｅｌ］ずつ変位させることで、構造化照明の位相を２π／３［ｒａｄ］ごとに３回行う位相変調が実現できる。

さて、この場合、ＳＬＭ１３の全体に必要な画素数（セル数）は、２６６［Ｈｚ］／２×９［ｐｉｘｅｌ］＝１１９８［ｐｉｘｅｌ］である。

なお、２６６［Ｈｚ］を「２」で除した理由は、±１次回折光束によるＳＬＭ１３の像（＝干渉縞）の縞本数は、ＳＬＭ１３に表示される格子パターンの格子本数の２倍だからである。

したがって、本実施形態では、ＳＬＭ１３の画素数（セル数）を、１１９８以上とすればよい。

因みに、汎用のＳＬＭの中には１２８０［ｐｉｘｅｌ］のＳＬＭが存在するので、そのＳＬＭをＳＬＭ１３として使用すれば、必要な干渉縞を確実に撮像面３６へ投影することが可能である。

なお、以上の説明では、空間周波数４０［ｃ／ｍｍ］の干渉縞を形成するために必要なＳＬＭ１３の横方向の格子周期を９［ｐｉｘｅｌ］とした。

その場合、空間周波数３５［ｃ／ｍｍ］の干渉縞を形成するために必要なＳＬＭ１３の横方向の格子周期は１０．３［ｐｉｘｅｌ］である。

また、空間周波数３０［ｃ／ｍｍ］の干渉縞を形成するために必要なＳＬＭ１３の単位ユニットの画素数は、１２［ｐｉｘｅｌ］である。

また、空間周波数２５［ｃ／ｍｍ］の干渉縞を形成するために必要なＳＬＭ１３の横方向の格子周期は、１４．４［ｐｉｘｅｌ］である。

また、空間周波数２０［ｃ／ｍｍ］の干渉縞を形成するために必要なＳＬＭ１３の横方向の格子周期は、１８［ｐｉｘｅｌ］である。

ここで、必要な空間周波数に対応する格子周期が３の倍数でない場合は、縦方向または横方向に３の倍数の整数でユニットセルが形成できるよう拡張すればよい。
［第１実施形態の補足］
なお、第１実施形態では、観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンを「ステップ状」としたが（図１４を参照）、更に細かいステップ状としてもよいし、更に粗いステップ状としてもよい。

また、第１実施形態では、観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンを「ステップ状」としたが（図１４を参照）、変化パターンの一部又は全部を「滑らかな曲線状」としてもよいし（図１５を参照）、変化パターンの一部又は全部を「直線状」としてもよい（図１６を参照）。

また、第１実施形態では、観察対象面の深さ変化量に対する干渉縞の空間周波数の変化量の割合を、観察対象面の深さが小さいときほど大きくしたが（図１４、図１５参照）、深さが大きいときほど大きくしてもよい。

例えば、観察対象面の深さが所定値以下のときには干渉縞の空間周波数を固定し、観察対象面の深さが所定値を超えるときにのみ干渉縞の空間周波数を変化させてもよい（図１７を参照）。

また、第１実施形態では、観察対象面の深さに対する干渉縞の空間周波数の変化パターンを制御装置３９が予め決めていたが、変化パターンをユーザが予め指定してもよいし、変化パターンをユーザがリアルタイムで指定してもよい。

なお、変化パターンをユーザがリアルタイムで指定するために、制御装置３９は、観察対象面の深さを大きくしながら超解像画像の生成・表示を繰り返し、ユーザが切り替え指示を入力したタイミングでのみ、干渉縞の空間周波数を低い値へと切り替えればよい。図１８は、ユーザが指示を入力したタイミングと変化パターンとの関係を示す図である。図１８における矢印は、ユーザが指示を入力したタイミングである。ユーザは、リアルタイムで表示される超解像画像を観察し、超解像画像の画質が悪化したタイミングで干渉縞の空間周波数の切り替え指示を制御装置３９へ入力するだけで、超解像画像の画質を保つことができる。

また、第１実施形態では、観察対象面へ縞を投影するために、ＳＬＭ１３を像共役面へ配置し、縞の空間周波数を切り替えるために、ＳＬＭ１３に表示する格子パターンの格子ピッチを切り替えたが、他の方法を採用してもよい。他の方法とは、例えば以下の方法（１）〜（４）の何れかである。

（１）観察対象面へ縞を投影するために、格子ピッチの異なる複数の回折格子を保持したターレットを像共役面へ挿入し、縞の空間周波数を切り替えるために、ターレットを回転させる方法。なお、ターレットには、光軸ＡＺから外れた回転軸の周りにターレットを回転させる回転機構が設けられる。この回転機構は、制御装置３９によって駆動される。また、ターレットが光路へ同時に挿入する回折格子は、複数の回折格子の何れか１つのみであり、複数の回折格子は同一部材で構成されてもよいし、互いに異なる部材で構成されてもよい。

（２）観察対象面へ縞を投影するために、瞳共役面上の光軸ＡＺに関して対称な位置へ光ファイバの１対の出射端を配置し、縞の空間周波数を切り替えるために、光軸ＡＺから１対の出射端からまでの高さを切り替える方法。なお、光軸ＡＺから１対の出射端までの高さは、ピエゾ素子などの機構によって調整される。この機構は制御装置３９によって駆動される。

（３）観察対象面へ縞を投影するために、格子パターンが不変の回折格子を像共役面に配置し、縞の空間周波数を切り替えるために、瞳面６Ａに向かう±１次回折光束の光路間隔を例えば図１９のような間隔調整部２００で調整する方法。なお、間隔調整部の機構は、制御装置３９によって駆動される。

（４）観察対象面へ縞を投影するために、格子パターンが不変の回折格子を像共役面に配置し、縞の空間周波数を切り替えるために、回折格子と標本との間に例えば図２０のような変倍機能付きリレーレンズを配置して変倍操作する方法。なお、変倍機能付きリレーレンズの変倍調整機構（いわゆるズーム調整機構）は、制御装置３９によって駆動される。
［間隔調整部の説明］
以下、図１９に示した間隔調整部２００を説明する。

先ず、間隔調整部２００の配置先は、格子パターンが不変の回折格子１３’から観察対象面までの間において±１次回折光束の光路が互いに分離された箇所である。ここでは図１９に示すとおり間隔調整部２００の配置先を瞳共役面６Ａ’の近傍とする。瞳共役面６Ａ’の近傍では、±１次回折光束の光路の分離量が最も大きくなる。なお、図１９の例では、光束選択部１００の要素のうち、１／２波長板１０１、液晶１／２波長板１０３，１０４の図示は省略している。

間隔調整部２００には、集光レンズ１６の側から入射する＋１次回折光束を光軸ＡＺから離れた方向へと偏向するプリズムミラー２０２と、プリズムミラー２０２にて偏向した＋１次回折光束を反射し、その＋１次回折光束の光路の方向を、元の方向に戻すプリズムミラー２０１とが備えられる。

また、間隔調整部２００には、集光レンズ１６の側から入射する−１次回折光束を光軸ＡＺから離れた方向へと偏向するプリズムミラー２０２’と、プリズムミラー２０２’にて偏向した−１次回折光束を反射し、その−１次回折光束の光路の方向を、元の方向に戻すプリズムミラー２０１’とが備えられる。

ここで、干渉縞に寄与する±１次回折光束の光路は、光軸ＡＺに関して対称な関係に保たれる必要がある。

よって、間隔調整部２００の上流側のプリズムミラー２０２、２０２’の反射面の配置関係は、光軸ＡＺに関して対称な関係に保たれ、間隔調整部２００の下流側のプリズムミラー２０１、２０１’の反射面の配置関係は、光軸ＡＺに関して対称な関係に保たれる。

そして、間隔調整部２００の下流側のプリズムミラー２０１、２０１’は、図１９Ａ）→図１９（Ｂ）に示すとおり、互いの位置関係を光軸ＡＺに関して対称な関係に保ちつつ、互いの間隔を変化させることが可能である。

このように、プリズムミラー２０１、２０１’の間隔を調整すれば、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点の間隔を調節することができる。これによって、干渉縞の空間周波数が調節される。ここでいう「集光点」は、集光する光の入射領域のうち最大強度の８割以上の強度を有する領域の重心位置のことを指す。

なお、間隔調整機構２００には、プリズムミラー２０１、２０１’の間隔を調整する不図示の機構が備えられ、不図示の機構は制御装置３９によって駆動される。

また、間隔調整部２００は、上流側に配置された１対のプリズムミラー２０２、２０２’によって±１次回折光束を光軸ＡＺから離れる方向へ偏向したので、±１次回折光束の分岐量は、間隔調整部２００の経由により拡大する。仮に間隔調整量がゼロであってもプリズムの大きさの分だけ分岐量は拡大してしまう。よって、回折格子１３’の格子ピッチは、間隔調整部２００がないときに必要な格子ピッチに比べて、この拡大分を考慮して予め粗く設定される必要がある。

また、上記の説明では、間隔調整部２００は、上流側に配置された１対のプリズムミラー２０２、２０２’によって±１次回折光束を光軸ＡＺから離れる方向へ偏向したが、光軸ＡＺに近づく方向へ偏向してもよい。その場合、±１次回折光束の分岐量は、間隔調整部２００の経由により縮小するので、回折格子１３’の格子ピッチは、この縮小分を考慮して予め細かく設定される必要がある。
［変倍機能付きリレーレンズの説明］
以下、図２０に示した変倍機能付きリレーレンズを説明する。ここでは、集光レンズ１６、２５からなるリレーレンズに変倍機能が付与されたと仮定する。図２０の上段、中段、下段は、変倍操作によるレンズ群の変位パターンの例を表している。なお、変倍に必要なレンズ群の変位方向は、光軸ＡＺの方向である。

図２０に示すとおり、集光レンズ１６は、第１レンズ群Ｇ１〜第４レンズ群Ｇ４によって構成され、集光レンズ２５は、第５レンズ群Ｇ５によって構成される。このうち、第１レンズ群Ｇ１〜第４レンズ群Ｇ４は、変倍機能を有した変倍光学系であって、第５レンズ群Ｇ５は、結像機能を有した結像光学系である。

これらの第１レンズ群Ｇ１〜第４レンズ群Ｇ４の配置先を矢印のとおり変化させると、変倍機能付きリレーレンズ（集光レンズ１６、２５）の結像倍率が切り替わるので、干渉縞のピッチが切り替わる。これによって、干渉縞の空間周波数が切り替わったとみなせる。

なお、変倍機能付きリレーレンズには、第１レンズ群Ｇ１〜第４レンズ群Ｇ４を連動させる不図示の変倍調整機構が備えられ、不図示の変倍調整機構は制御装置３９によって駆動される。
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図２１は、本実施形態における２Ｄ−ＳＩＭ１’（構造化照明顕微鏡システム１’）の構成図である。図２１において図１に示す要素と同じものには同じ符号を付した。

本実施形態の２Ｄ−ＳＩＭ１’では、ダイクロイックミラー７と対物レンズ６との間に、リレーレンズを構成する２つの集光レンズ６１、６２が順に配置されており、２つの集光レンズ６１、６２の間の像共役面には、回転ニポウディスク７０が挿入されている。回転ニポウディスク７０には、回転機構７０Ａが設けられている。回転機構７０Ａは、光軸ＡＺと平行であり、かつ、光軸ＡＺから外れた回転軸の周りに回転ニポウディスク７０を回転させる。この回転機構７０Ａは、制御装置３９によって駆動される。

回転ニポウディスク７０には、公知のニポウディスクと同様、多数のピンホールが形成されており、多数のピンホールの配列パターンは、像共役面上で互いに近接する２つの点が互いに異なるタイミングで開放され、かつ、像共役面の各点のトータルの開口量が均一になるように設定されている。ピンホールの数が多いほど短時間で画像取得が可能だが、ピンホールの間隔が近接しすぎて光学系の空間分解能に近くなると、隣接するピンホールに光量が漏れてしまい、セクショニング性能が低下するからである。

この回転ニポウディスク７０は、撮像素子３５が１フレームの変調画像を撮像する期間（露光期間）内に整数回転する。このような回転ニポウディスク７０には、非観察対象面で発生したノイズ光（＝アウトフォーカスのノイズ光）を除去する機能がある。

したがって、本実施形態の２Ｄ−ＳＩＭ１’には、前述した第２の問題（非観察対象面で発生したノイズ光）を軽減し、撮像素子３５のＳＮ比を改善できるという利点がある。

因みに、第１実施形態では、撮像素子３５のＳＮ比の悪化を考慮し、撮像面３６に形成される干渉縞のコントラストを一定以上に設定した（０．０３以上に設定した）。

しかし、本実施形態では、撮像素子３５のＳＮ比が改善されるため、干渉縞のコントラストを第１実施形態における干渉縞のコントラスト（０．０３以上）よりも更に低くしたとしても、干渉縞の画像化が可能である。

したがって、本実施形態では、第１実施形態と比較して干渉縞の空間周波数を高めにしたり、空間周波数の切り替えピッチを粗くしたり、観察対象面の深さの最大値を拡大したりすることができる。
［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態として第２実施形態の変形例を説明する。ここでは、第２実施形態との相違点のみを説明する。

図２２は、本実施形態の２Ｄ−ＳＩＭ１’’（構造化照明顕微鏡システム１’’）の構成図である。図２２において、図２１に示す要素と同じものには同じ符号を付した。

本実施形態では、格子パターンが可変の反射型回折格子であるＳＬＭ１３の代わりに、格子パターンが不変の透過型回折格子１３’が使用され、蛍光像の変調機能と復調機能との双方が回折格子１３’に付与される。つまり、本実施形態では、変調された像の復調が、画像記憶・演算装置４０によって演算で行われるのではなく、回折格子１３’によって光学的に行われる。

先ず、本実施形態では、回折格子１３’に対して光源からのレーザ光と標本５からの蛍光との双方を入射させる。そのために、レーザ光と蛍光とを分離するダイクロイックミラー７の配置先は、光ファイバ１１と回折格子１３’との間に設定される。このダイクロイックミラー７から対物レンズ６までの各要素が照明光学系１０と結像光学系３０とに兼用される。

また、本実施形態では、光束選択部１００を省略し、その代わりに回折格子１３’に対するレーザ光の入射角度を大きくする（斜入射とする）ことで、不要回折光束を有効な光路から外す。

具体的に、本実施形態では、回折格子１３’にて発生した０次回折光束と１次回折光との２光束を、干渉縞に寄与する回折光束（必要回折光束）として使用し、回折格子１３’にて発生した−１次回折光束を、干渉縞に寄与しない不要回折光束として光路から外す。

また、本実施形態では、干渉縞の空間周波数を調節するために、回折格子１３’の格子ピッチを調節する代わりに、回折格子１３’の像を像共役面に投影するリレーレンズ８０に対して変倍機能を付与する。なお、符号８０Ａは、変倍機能付きリレーレンズ８０を変倍操作する変倍調整機構であり、変倍調整機構８０Ａは、制御装置３９によって駆動される。

また、本実施形態では、干渉縞の位相及び方向を切り替えるために、回折格子１３’を格子ピッチ方向にかけて並進移動させる並進機構１３Ａ’と、回折格子１３’及び並進機構１３Ａ’を光軸ＡＺの周りに回転させる回転機構１３Ｂ’とが備えられる。並進機構１３Ａ’及び回転機構１３Ｂ’は、制御装置３９によって駆動される。

以下、本実施形態における光の振る舞いを説明する。

光ファイバ１１の出射端から発散したレーザ光は、コレクタレンズ９１に対して偏心した位置から入射すると、平行光束となって集光レンズ９２へ入射し、収束光束となる。収束光束は、励起フィルタ２８を介してダイクロイックミラー７へ入射すると、ダイクロイックミラー７にて反射し、集光レンズ９３に向かう。なお、ダイクロイックミラー７は、集光レンズ９２の後側焦平面近傍に配置されているため、収束光束は、ダイクロイックミラー７の近傍で集光点を形成し、集光点から発散光束となって射出し集光レンズ９３へ入射する。

また、ダイクロイックミラー７は、集光レンズ９３の前側焦平面近傍に配置されているため、発散光束は、集光レンズ９３の集光作用を受けて平行光束となり、回折格子１３’に対して所定角度で入射（斜入射）する。

回折格子１３’では、０次回折光束と、＋１次回折光束を含む高次の回折光束とが発生する。これらの回折光束のうち、０次回折光束と＋１次回折光束とは、変倍機能付きリレーレンズ８０へ入射すると、像共役面に配置された回転ニポウディスク７０の上に回折格子１３’の像を形成する。

なお、変倍機能付きリレーレンズ８０は、変倍操作に依らず瞳共役面６Ａ’の位置と像共役面の位置とを維持できるように設計されている。

回転ニポウディスク７０を通過した０次回折光束及び＋１次回折光束は、フィールドレンズである集光レンズ６２の集光作用を受けて収束光束となり、全反射ミラーＭで反射した後、対物レンズ６の瞳面６Ａの互いに異なる位置に向かって集光する。なお、瞳面６Ａにおける０次回折光束の集光点と＋１次回折光束の集光点とは、光軸ＡＺに関して対称である。

瞳面６Ａから射出した０次回折光束及び＋１次回折光束は、対物レンズ６の先端から平行光束となって射出し、対物レンズ６の焦点面（＝観察対象面Ｐ）へ所定の角度関係で入射し、ストライプ状の干渉縞を形成する。

この干渉縞は、変倍機能付きリレーレンズ８０、フィールドレンズ６２、対物レンズ６による回折格子１３’の二次像である。つまり、変倍機能付きリレーレンズ８０、フィールドレンズ６２、対物レンズ６の全体には、回折格子１３’の像を観察対象面Ｐへ投影する「投影光学系」の機能がある。

観察対象面Ｐの各位置で発生した蛍光は、対物レンズ６の先端へ入射すると、対物レンズ６の瞳面６Ａから平行光束となって射出し、全反射ミラーＭ、フィールドレンズ６２、回転ニポウディスク７０を介して変倍機能付きリレーレンズ８０へ入射する。変倍機能付きリレーレンズ８０から射出した蛍光は、回折格子１３’、集光レンズ９３、ダイクロイックミラー７、バリアフィルタ３１、第２対物レンズ３２を介して、撮像面３６上に観察対象面Ｐの蛍光像を形成する。本実施形態の制御装置３９は、撮像素子３５の露光期間内に並進機構１３Ａ’を駆動し、回折格子１３’を周期の整数倍シフトさせる。

蛍光像に寄与する蛍光は回折格子１３’を通過しているので、この蛍光像では、干渉縞によって変調されていた空間周波数が元の空間周波数に戻されている。つまり、この蛍光像は、復調像である。

よって、本実施形態の制御装置３９は、復調像の形成中に撮像素子３５を駆動することにより、復調像の画像（超解像画像）を取得することができる。

これによって、単一方向に亘って超解像効果の得られた超解像画像を取得することができる。

また、本実施形態の制御装置３９は、回転機構１３Ｂ’を駆動して回折格子１３’の方向を切り替えると共に、各方向で撮像素子３５の露光期間内に並進機構１３Ａ’を駆動し、回折格子１３’を周期の整数倍シフトさせる。

これによって、各方向毎に超解像効果の得られた超解像画像を取得することができる。例えば米国特許８０８１３７８号明細書に記載の手法を用いて、各方向毎の超解像画像から２次元の超解像画像に拡張することができる。

また、本実施形態の制御装置３９は、観察対象面Ｐの深さ方向の位置に応じて、機構８０Ａを駆動することにより、干渉縞の空間周波数を適正値に制御する。干渉縞の空間周波数の制御方法については、前述したとおりである。

したがって、本実施形態においても第２実施形態と同様の効果を得ることができる。
［その他の実施形態］
なお、上述した何れかの実施形態では、第１の問題（球面収差）の一部又は全部を、アダプティブオプティクスなどの収差補正素子で補正してもよい。アダプティブオプティクスは、瞳共役面又はその近傍に配置され、入射光束の波面形状を補正する素子である。上述した何れかの実施形態では、アダプティブオプティクスの補正量分布を、観察対象面の深さに応じて変更すればよい。

また、上述した何れかの実施形態では、本発明を２Ｄ−ＳＩＭに適用したが、本発明は３Ｄ−ＳＩＭにも適用が可能である。２Ｄ−ＳＩＭは、干渉縞に寄与する光束が２光束であるのに対して、３Ｄ−ＳＩＭは、干渉縞に寄与する光束が３光束である。

第１実施形態の２Ｄ−ＳＩＭ１（図１）又は第２実施形態の２Ｄ−ＳＩＭ１’（図２１）を３Ｄ−ＳＩＭに変形する場合は、光束選択部１００において、ＳＬＭ１７の光軸ＡＺ近傍のセルをオフの状態とし、０次回折光束が固定偏光板１０２で遮断されないようにすればよい。

また、上述した２Ｄ−ＳＩＭにおいて、２光束干渉縞を形成するための２つの回折光束の組み合わせは、上述したものに限定されることは無い。

同様に、上述した３Ｄ−ＳＩＭにおいて、３光束干渉縞を形成するための３つの回折光束の組み合わせは、上述したものに限定されることは無い。

また、上述した実施形態の照明光学系１０は、結像光学系３０の対物レンズ６を介して標本５を照明する落射型照明光学系であったが、対物レンズ６を介さずに（コンデンサレンズによって）標本５を照明する透過型又は反射型照明光学系であってもよい。

また、上述した実施形態では、標本５に含まれる蛍光物質の種類数を「１」と仮定したが、「２以上」としてもよい。特性の異なる第１蛍光物質と第２蛍光物質とが標本５に含まれる場合、上述した実施形態のＳＩＭは、例えば次の（１）〜（４）のとおり変形される。

（１）可干渉光源として、第１レーザ光源及び第２レーザ光源を搭載したレーザユニットが使用される。第１レーザ光源から射出するレーザ光の波長は、第１蛍光物質の励起波長と同じであり、第２レーザ光源から射出するレーザ光の波長は、第２蛍光物質の励起波長と同じである。

（２）第２対物レンズ３２の後段に、第２のダイクロイックミラーが配置される。第２のダイクロイックミラーの特性は、第１蛍光物質の蛍光波長と同じ波長の光を反射し、かつ、第２蛍光物質の蛍光波長と同じ波長の光を透過する特性である。

（３）撮像素子３５として第１撮像素子及び第２撮像素子が使用される。第１撮像素子の配置先は、第２のダイクロイックミラーで反射した蛍光の光路であり、第２撮像素子の配置先は、第２のダイクロイックミラーを透過した蛍光の光路である。

（４）バリアフィルタ３１として第１バリアフィルタ及び第２バリアフィルタが使用される。第１バリアフィルタの配置先は、第２のダイクロイックミラーと第１撮像素子との間であり、第２バリアフィルタの配置先は、第２のダイクロイックミラーと第２撮像素子との間である。第１バリアフィルタの特性は、第１蛍光物質の蛍光波長と同じ波長の光を透過し、かつ他の波長の光を遮光する特性に設定される。第２バリアフィルタの特性は、第２蛍光物質の蛍光波長と同じ波長の光を透過し、かつ他の波長の光を遮光する特性に設定される。

また、上述した実施形態では、本発明をＳＩＭに適用したが、本発明は、縞を標本へ投影する他の観察装置にも適用可能である。

例えば、トニーウィルソンが提案した観察装置（米国特許６３７６８１８号明細書）にも本発明は適用可能である。この観察装置は、標本に縞を投影することにより光学セクショニング効果を得るものである。この観察装置でも上述した第１の問題及び第２の問題が発生しうるので、本発明は有効である。

また、上述した実施形態では、観察対象面の深さに応じて、空間周波数を変化させたが、対物レンズ６の視野（観察領域）に応じて、空間周波数を変化させてもよい。

例えば、所定の深さの観察対象面において、対物レンズ６の視野（観察領域）を切り替える場合がある。その場合、観察領域に応じて、インデックスミスマッチが発生し、超解像画像の画質が悪化する場合がある。このような場合、観察領域（対物レンズ６の視野）に応じて、空間周波数を変化させることにより、上述したように、超解像画像の画質を向上させることができる。なお、対物レンズ６の視野（観察領域）で、部分的に空間周波数を変化させてもよい。
［復調演算の説明］
以下、復調演算の一例を説明する。簡単のため、先ずは２Ｄ−ＳＩＭの復調演算を説明する。

２Ｄ−ＳＩＭにおける構造化照明（縞）の強度分布を、空間周波数Ｋの単一成分のみからなる正弦波と仮定し、標本の変調方向（縞ピッチ方向）における座標をｘとおき、標本の蛍光密度分布をＯ_ｒ（ｘ）とおき、標本像を形成する光学系の点像強度分布をＰ_ｒ（ｘ）とおくと、光学系による標本像は下記の式（１）で表される。

但し、記号＊は畳み込み積分を表し、φは構造化照明の位相であり、ｌは構造化照明による変調次数（ｌ＝−１，０，１）であり、ｍ_ｌは構造化照明による変調振幅である。

式（１）において変調次数ｌ＝０に対応する成分は、構造化照明によって変調を受けない０次変調成分であり、変調次数ｌ＝＋１に対応する成分は、構造化照明によって変調を受けた＋１次変調成分（モアレ）であり、変調次数ｌ＝−１に対応する成分は、構造化照明によって変調を受けた＋１次変調成分（モアレ）である。

以下、実空間における量と波数空間における量とを区別するため、実空間における量には添え字ｒを付与し、波数空間における量には添え字ｋを付与する。

ここで、式（１）をフーリエ変換して波数空間で表記すると、下記の式（２）が得られる。この式（２）において、点像強度分布Ｐ_ｒ（ｘ）のフーリエ変換Ｐ_ｋ（ｋ）は、光学系のＭＴＦである。

式（２）において変調次数ｌ＝−１に対応する−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ）と、変調次数ｌ＝＋１に対応する＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）とは、標本の実際の空間周波数を構造化照明の空間周波数Ｋの分だけずらしたものに相当する。

つまり、空間周波数Ｋの構造化照明によると、光学系のカットオフ周波数を超えた高い空間周波数の構造が像空間へ伝達される。そして、構造化照明の空間周波数Ｋが高いほど、超解像効果は高まる。よって、超解像効果を最大にするためには、構造化照明の空間周波数Ｋは、光学系のカットオフ周波数以下のなるべく大きな値に設定すればよい。

ここで、式（２）によると、２Ｄ−ＳＩＭの標本像では、０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ）、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ）、＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）が互いに重畳しているので、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、これらの成分を互いに分離する必要がある。

そこで、２Ｄ−ＳＩＭの制御装置は、構造化照明の空間周波数Ｋを固定し、構造化照明の方向を固定し、構造化照明の位相φをシフトさせながら、撮像をＮ回行う。これによって、空間周波数成分が共通、変調振幅が共通、構造化照明の位相φのみが異なるＮ枚の変調画像が取得される。

これらＮ枚の変調画像のうちｊ番目の変調画像の信号強度Ｉ_ｋｊ（ｋ）は、下記の式（３）で表される。

但し、式（３）におけるφ_ｊは、ｊ番目の変調画像における構造化照明の位相である。

そして、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、Ｎ枚の変調画像の各々の信号強度を式（３）へ当てはめることで、Ｎ個の方程式を取得する。これらＮ個の方程式においては、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ），０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ），＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）の３つが未知数である。

よって、２Ｄ−ＳＩＭの制御装置は、変調画像の枚数ＮをＮ≧３とする。また、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、Ｎ枚の変調画像を式（３）へ当てはめることによりＮ個（Ｎ≧３）の方程式を取得し、それらＮ個の方程式を連立させることにより、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ），０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ），＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）の各々を既知とする。

なお、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ），０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ），＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）を互いに分離する際に、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ），０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ），＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）の各々を既知としてから、それらの成分をＰ_ｋ（ｋ）の値で除算してもよいが、単なる除算を行う代わりに、ウィナーフィルタなどノイズの影響を受けにくい公知の手法を利用してもよい。

ここで、構造化照明の代わりに非構造化照明（一様照明）を採用した場合、光学系のＭＴＦ（＝Ｐ_ｋ（ｋ））が伝達可能な空間周波数ｋの範囲は、ｋ＝−２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λである。但し、λは波長λ、ＮＡは対物レンズの開口数である。

一方、２Ｄ−ＳＩＭの構造化照明を採用した場合、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ）は、空間周波数範囲（−２ＮＡ／λ−Ｋ）〜（２ＮＡ／λ−Ｋ）の構造情報を含み、０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ）は、空間周波数範囲（２ＮＡ／λ）〜（２ＮＡ／λ）の構造情報を含み、＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）は、空間周波数範囲（−２ＮＡ／λ＋Ｋ）〜（２ＮＡ／λ＋Ｋ）の構造情報を含む。

よって、−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ）、０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ）、＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ）の全体は、空間周波数範囲（−２ＮＡ／λ−Ｋ）〜（２ＮＡ／λ＋Ｋ）の構造情報を含む。

そこで、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ），−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ）を、空間周波数Ｋの分だけｘ方向にかけて再配置してから、＋１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ＋Ｋ），０次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ），−１次変調成分Ｏ_ｋ（ｋ−Ｋ）を同一の周波数空間上で重み付け合成することで、空間周波数範囲の広がった復調画像Ｏ_ｋ（ｘ）を生成する。

そして、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、空間周波数範囲の広がった復調画像Ｏ_ｋ（ｘ）を逆フーリエ変換することによって、標本の超解像画像Ｏ_ｒ（ｘ）を求める。この超解像画像Ｏ_ｒ（ｘ）は、変調方向（ｘ方向）にかけてのみ高い解像度を有している。

そこで、２Ｄ−ＳＩＭの制御装置は、複数方向にかけて高い解像度を得るために、方向の異なる複数の構造化照明の各々で前述したＮ枚の変調画像を取得する。そして、２Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、方向ごとに前述した処理を施す。但し、その際には、方向ごとに再配置した各成分を同一の周波数空間上で重み付け合成すればよい。

また、ここでは２Ｄ−ＳＩＭの復調演算を説明したが、３Ｄ−ＳＩＭの復調演算は、以下のとおりである。

３Ｄ−ＳＩＭの構造化照明は、２光束干渉縞の代わりに３光束干渉縞を用いるため、変調画像に重畳する変調成分は、変調を受けていない０次変調成分と、標本面内の１次元方向における超解像成分となる±２次変調成分と、光軸方向の超解像成分となる±１次変調成分との５成分である。よって、３Ｄ−ＳＩＭの復調演算の未知数は、５である。

このため、３Ｄ−ＳＩＭの制御装置は、Ｎ≧５とし、３Ｄ−ＳＩＭの復調演算では、Ｎ個（Ｎ≧５）の方程式を連立させることにより、上記の５成分の各々を既知とすればよい。

したがって、３Ｄ−ＳＩＭによると、標本面内方向だけでなく光軸方向にかけても超解像効果を得ることができる。

なお、ここでは複数の変調成分の分離を、連立方程式を解くことによって行ったが、Ｎが大きい場合には、米国特許８１１５８０６号明細書に開示された方法（最小自乗法）で行ってもよい。

また、ここでは復調演算における再配置及び合成の処理を順次に行ったが、一括の演算式で行うことも可能である。その演算式としては、グスタフソン等の論文（下記）のOnline Methodsにおける数式（１）などが適用可能である。

グスタフソン等の論文："Super-Resolution Video Microscopy of Live Cells by Structured Illumination", Peter Kner, Bryant B. Chhun, Eric R. Griffis, Lukman Winoto, and Mats G. L. Gustafsson, NATURE METHODS Vol.6 NO.5, pp.339-342, (2009)
［その他］
なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１，１’，１’’：構造化照明顕微鏡システム、１１：光ファイバ、１０：照明光学系、３０：結像光学系、３５：撮像素子、３９：制御装置、４０：画像記憶・演算装置、４５：画像表示装置、５０：ステージ、５：標本、１３：ＳＬＭ、１３Ａ：ドライバ、６：対物レンズ

Claims (12)

1. 試料に含まれる蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で前記試料に照射する照明光学系と、
   前記干渉縞の方向、位相および空間周波数を制御する制御部と、
   対物レンズを含み、前記干渉縞が照射されて変調された前記試料の像を形成する結像光学系と、
   前記結像光学系が形成した像を撮像する撮像素子と、
   前記撮像素子により撮像された画像を複数用いて復調処理を行う復調部と、
   を備える構造化照明顕微鏡システムであって、
   前記制御部は、前記干渉縞のコントラストが一定以上となる範囲で定めた、前記対物レンズから照射位置までの間に存在する媒質および前記試料の深さ方向における前記干渉縞の光軸方向の照射位置と前記干渉縞の空間周波数との関係に基づき、前記干渉縞の空間周波数を適正値に設定する構造化照明顕微鏡システム。
2. 前記深さ方向は、前記照明光学系の光軸方向である
   請求項１に記載の構造化照明顕微鏡システム。
3. 前記照明光学系は、対物レンズを含み、
   前記制御部は、前記対物レンズの前記試料に対する焦点位置を制御することにより、干渉縞の照射位置を制御する
   請求項１または請求項２に記載の構造化照明顕微鏡システム。
4. 前記制御部は、前記対物レンズの焦点位置を、光軸方向に沿って変更し、
   少なくとも異なる２つの焦点位置において、前記干渉縞の空間周波数が互いに異なるように制御する
   請求項３に記載の構造化照明顕微鏡システム。
5. 前記制御部は、
   第１の焦点位置における干渉縞の空間周波数が、第１の焦点位置より前記対物レンズ側に位置する第２の焦点位置における干渉縞の空間周波数よりも小さくなるように制御する
   請求項３または請求項４に記載の構造化照明顕微鏡システム。
6. 前記制御部は、
   前記照明光学系の光軸方向に対応する前記試料の深さ方向において、前記焦点位置を変更し、
   第１の焦点位置における干渉縞の空間周波数が、前記第１の焦点位置と比べて前記試料の深い位置に対応する第２の焦点位置における干渉縞の空間周波数よりも小さくなるように制御する
   請求項３〜５のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡システム。
7. 前記制御部は、前記照明光学系の光軸方向に対応する前記試料の深さ方向において、前記焦点位置を所定方向に所定量ずつ移動させ、
   前記撮像素子は、各々の前記焦点位置で前記結像光学系が形成した像を撮像する
   請求項３〜６のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡システム。
8. 前記復調部は、前記撮像素子により撮像された前記画像を、前記干渉縞の空間周波数または前記試料の深さ方向における前記干渉縞の照射位置に基づき分類し、分類したグループに属する複数の画像を用いて復調処理を行う
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡システム。
9. 前記媒質は、前記対物レンズの浸液および前記試料の培養液の少なくとも一方を含む
   請求項１〜８のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡システム。
10. 前記媒質は、前記対物レンズの浸液および前記試料の培養液の組み合わせである
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡システム。
11. 試料に含まれる蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で前記試料に照射し、
    前記干渉縞の方向、位相および空間周波数を制御し、
    前記干渉縞が照射されて変調された前記試料の像を撮像し、
    前記干渉縞のコントラストが一定以上となる範囲で定めた、対物レンズから照射位置までの間に存在する媒質および前記試料の深さ方向における干渉縞の光軸方向の照射位置と前記干渉縞の空間周波数との関係に基づき、前記干渉縞の空間周波数を適正値に設定する方法。
12. 干渉縞が照射されて変調された試料の像を撮像して復調処理を行う構造化照明顕微鏡システムにおいて、
    コンピュータに、
    前記干渉縞のコントラストが一定以上となる範囲で定めた、対物レンズから照射位置までの間に存在する媒質および前記試料の深さ方向における干渉縞の光軸方向の照射位置と前記干渉縞の空間周波数との関係に基づき、前記干渉縞の空間周波数を適正値に設定する処理
    を実行させるプログラム。

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