JP6526792B2 - プトレシンを生産する微生物及びそれらを用いてプトレシンを生産する方法 - Google Patents

Description

本発明は、プトレシンを生産するための組換え微生物及びそれを用いてプトレシンを生産する方法に関する。

バイオジェニックアミン（biogenic amines、BAs）は、アミノ酸の脱炭酸作用、アルデヒドとケトンのアミノ化とアミノ基転移反応により主に生成される窒素化合物である。このようなバイオジェニックアミンは低分子量であり、微生物、植物と動物の代謝過程で合成されるため、これら細胞でよく発見される構成要素として知られている。特に、スペルミジン（spermidine）、スペルミン（spermine）、プトレシン（putrescineまたは1,4-butanediamine）及びカダベリン（cadaverine）などのようなポリアミン（polyamine）は、大部分の生きている細胞内で存在する物質である。

このうち、プトレシンはアジピン酸（adipic acid）と反応してポリアミンナイロン-4,6を合成する重要な原料物質であり、主にプロピレン（propylene）からアクリロニトリル（acrylonitrile）及びスクシノニトリル（succinonitrile）を経る化学合成法で主に生産される。

また、大腸菌とコリネバクテリウム微生物を形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開された（国際特許公開WO06/005603;国際特許公開 WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4): 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88(4): 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178., 2012）。さらに、プトレシントランスポータ（transporter）に関する研究が大腸菌、酵母、植物及び動物細胞を対象に活発に行われている（K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48：506-512、2010）。

一方、本発明者らはプトレシン生産経路を含むコリネバクテリウム属微生物においてＮＣｇｌ２５２２をコードする膜タンパク質がプトレシンの排出タンパク質として機能することを明らかにし、ＮＣｇｌ２５２２の活性を内在的活性に比べて強化させると、プトレシンを高収率で生産することができることを確認した（大韓民国特許出願第10-2013-0030020号）

また、ＮＣｇｌ２５２３遺伝子は、ＴｅｔＲファミリーに属する多薬剤耐性に関連する転写因子（multidrug-resistance-related transcription factor）であり、ＮＣｇｌ２５２２の発現抑制因子として作用すると知られている（Hirochi et. al., J Biol. Chem. 280:46, 38711-38719. 2005）。

国際特許公開ＷＯ０６／００５６０３ 国際特許公開ＷＯ０９／１２５９２４ 大韓民国特許出願第１０−２０１３−００３００２０号公報 国際特許公開ＷＯ２００９／０９６６８９ 大韓民国登録特許第０６２００９２号公報 国際特許公開ＷＯ２００６／０６５０９５ 大韓民国特許公開第２０１２−００６４０４６号公報 大韓民国特許出願第２０１２−０００３６３４号公報 大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号公報 大韓民国登録特許第１０−１３４８４６１号公報

Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4) 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88(4) 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178., 2012 K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48:506-512、2010 Hirochi et. al., J Biol. Chem. 280:46, 38711-38719. 2005 J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York

本発明者らは、継続的に研究を行い、ＮＣｇｌ２５２２オペロンを構成しているＮＣｇｌ２５２３を欠損させると、ＮＣｇｌ２５２２の活性を強化させた効果のような、プトレシンの生産量が向上することを確認することにより本発明を完成した。

本発明の目的は、プトレシンを高収率で生産する組換え微生物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記微生物を用いてプトレシンを高収率で生産する方法を提供することである。

本発明のプトレシン生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化するように変形してプトレシン排出タンパク質であると推定されるタンパク質、具体的には、ＮＣｇｌ２５２２の活性強化を誘導し、これにより細胞外にプトレシンの排出を増加させることができるため、プトレシンの生産において効果的に活用することができる。

ＮＣｇｌ２５２３周辺の遺伝子の組み合わせの形態を示した模式図である。具体的には、ＮＣｇｌ２５２３を含む微生物の周辺遺伝子の組み合わせの形態であるＮＣｇｌ２５２２−ＮＣｇｌ２５２３−ＮＣｇｌ２５２４の組み合わせの形態（Ｔｙｐｅ１）； ＮＣｇｌ２５２２−ＮＣｇｌ２５２３の組み合わせ及びＮＣｇｌ２５２４単独の形態（Ｔｙｐｅ２）； またはＮＣｇｌ２５２２−ＮＣｇｌ２５２３の組み合わせの形態（Ｔｙｐｅ３）を示す模式図である。

上記目的を達成するための本発明の一様態は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物において配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化され、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明の一つの具体例は、前記微生物がさらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ＯＤＣ）の活性が導入されたものである、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明のもう一つの具体例は、上記ＯＤＣが配列番号：１０のアミノ酸配列を有するものである、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明のもう一つの具体例は、前記微生物がさらにアセチルトランスフェラーゼの活性が不活性化された、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明のもう一つの具体例は、上記アセチルトランスフェラーゼが配列番号：１５または１６で表されるアミノ酸配列を含む、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明のもう一つの具体例は、前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）である、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明の他の様態は、
ｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化され、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
ｉｉ）前記段階で得られる微生物または培地からプトレシンを分離する段階を含む、プトレシンの生産方法を提供する。

本発明の一つの具体例は、上記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムである、プトレシンの生産方法を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明の一様態は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物において配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＣｇｌ２５２３の活性が不活性化され、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物に関する。

本発明で使用される用語、「ＮＣｇｌ２５２３」とは、ＴｅｔＲファミリーに属する多薬剤耐性に関連する転写因子（multidrug-resistance-related transcription factor）であり、ＮＣｇｌ２５２２の発現抑制因子として作用することが知られている（Hirochi et. al., J Biol. Chem. 280(46): 38711-38719, 2005）。

本発明において、ＮＣｇｌ２５２３は配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質、または上記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であり、実質的にＮｃｇｌ２５２２の発現抑制因子としての活性を有するタンパク質であれば制限なく含まれることができる。

また、微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、これに限定されない。上記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号：２のタンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も本発明の範疇に含まれることは自明である。

上記において、用語「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示することができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が 「％相同性」と表される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ ２．０を利用したり、定義された厳しい条件の下でサザン混成化実験により配列を比較することにより確認することができ、定義される適切な混成化の条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York）で決定されることができる。

本発明のＮＣｇｌ２５２３をコードするポリヌクレオチドは、上記ＮＣｇｌ２５２３タンパク質と同様の活性を有する限り、配列番号：２のアミノ酸配列または上記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、特に、配列番号：１または３の塩基配列を含むことができる。

また、本発明のＮＣｇｌ２５２３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１または３の塩基配列又は前記塩基配列に由来したプローブ（probe）と厳しい条件（stringent conditions）で混成化されることができ、正常に機能するＮＣｇｌ２５２３をコードする変異型であり得る。上記において、用語「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。例えば、このような厳しい条件は文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。

本発明では、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物においてＮＣｇｌ２５２２オペロンを構成しているＮＣｇｌ２５２３を欠損させると、ＮＣｇｌ２５２２の活性を強化させた場合のようにプトレシンの生産量が向上することを確認した。これを根拠に、本発明は、ＮＣｇｌ２５２３の活性が不活性化され、ＮＣｇｌ２５２２の発現抑制が解除されることにより、高収率のプトレシン生産性を示す組換え微生物を提供することができる。したがって、本発明の実施例で開示しているように、前記ＮＣｇｌ２５２３とこれと類似の配列を有するアミノ酸を有し、該当アミノ酸がＮＣｇｌ２５２２とオペロンを構成する微生物またはＮＣｇｌ２５２３がＮＣｇｌ２５２２の発現調節因子として機能することと類似の機能をする微生物では、該当ＮＣｇｌ２５２３とこれと類似のアミノ酸配列をコードする遺伝子を不活性化させることによりプトレシン生産能が向上することができる。

本発明において、用語「不活性化」とは、該当ポリペプチドをコードする遺伝子が発現されないか、または遺伝子発現において特定の減少を示したり、発現されても機能性がある該当ポリペプチドを生産しないことを意味する。

また、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が完全に不活性化されているだけでなく、その発現レベルが野生型に比べて弱化するか、または著しく低いため、実質的に発現しないことも含まれる意味である。したがって、遺伝子不活性化は、完全（ノックアウト）であるか、または部分的（例えば、遺伝子が正常の発現レベル未満を示す低次型遺伝子（hypomorph）またはこれが影響を及ぼす活性において部分的な減少を示す突然変異体遺伝子の生成物）であり得る。

具体的には、本発明においてＮＣｇｌ２５２３の不活性化は、
１）上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）上記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）上記タンパク質の活性が弱化するように染色体上の上記ポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせなどを使用して行うことができるが、特にこれに限定されない。

１）上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交換することにより行うことができる。上記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類に応じて異なるが、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、より具体的には１〜５０個である。

本発明で使用される用語「ベクター」とは、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させるように適合した調節配列に作動可能に連結された上記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。上記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適合した宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。

本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクター、またはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知となった発現ベクターを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用することができる。

このように、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドで交換することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えにより行うことができるが、これに限定されない。

本発明において、用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なくこれらすべてを含む。また、上記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形で導入されても関係ない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形で宿主細胞に導入することができる。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。上記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形であり得る。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに限定されない。

また、上記において用語「作動可能に連結された」とは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。

次に、２）上記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を変形する方法は、特にこれに限定されないが、上記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに弱い活性を有する核酸配列に交換することにより行うことができる。上記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むことができ、これに限定されない。

併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、上記タンパク質の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに弱い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することにより行うことができ、これに限定されない。

本発明で使用される用語「プトレシン生産能を有する微生物」または「プトレシンを生産する微生物」とは、自然にプトレシン生産能を有している微生物またはプトレシンの生産能がない親菌株にプトレシンの生産能が付与された微生物を意味する。

上記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに限定されないが、グルタミン酸からオルニチンまでの生合成経路を強化するためにグルタミン酸をアセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）に転換するアセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンをオルニチンに転換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に転換するアセチルグルタミン酸キナーゼ（ArgB）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタミン酸セミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde ）に変換するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ArgC）、アセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ArgD）の活性を内在的活性に比べて増加させるように変形されてプトレシンの生合成原料として使用されるオルニチンの生産性が向上したものであり得る。

また、前記微生物は、オルニチンにおいてアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransfrase、 ArgF）、グルタミン酸のエクスポータ（glutamate exporter）（ＮＣｇｌ１２２１）、及び／またはプトレシンをアセチル化させるアセチルトランスフェラーゼの活性を内在的活性が不活性化するように変異され／されたり、オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ＯＤＣ）の活性を導入するように変形されたものであり得る。

ここで、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、グルタミン酸エクスポータ（ＮＣｇｌ１２２１）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）は、特にこれに限定されないが、具体的には、それぞれ配列番号：８、９、１０、１１ 、１２、１３、及び１４で表されるアミノ酸配列またはそれと７０％以上、より具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

また、プトレシンをアセチル化させるアセチルトランスフェラーゼは、特にこれに限定されないが、具体的には、配列番号：１５または１６で表されるアミノ酸配列またはそれと７０％以上、より具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

具体的には、本発明において活性の増加は、
１）上記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）上記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）上記酵素の活性が強化されるように、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせにより強化されるように変形する方法などにより行うことができるが、これに限定されない。

上記１）のポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形で行うか、または宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行うことができる。具体的には、本発明の酵素を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製され、機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるか、または上記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより、上記宿主細胞の染色体内、上記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法で行うことができる。

次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに限定されないが、上記発現調節配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列で交換することにより行うことができる。上記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。

上記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されることができるが、上記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあり、さらに具体的には、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（ＷＯ２００９／０９６６８９）、あるいはＣＪ７プロモーター（大韓民国登録特許第０６２００９２号及びＷＯ２００６／０６５０９５）と作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。

併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、上記ポリヌクレオチド配列の活性を強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することにより行うことができる。

また、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、グルタミン酸エクスポータ、及びアセチルトランスフェラーゼの不活性化は、先にＮＣｇｌ２５２３の不活性化と関連して前述したような方法、例えば、

１）上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）上記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）上記タンパク質の活性が弱化するように、染色体上の上記ポリヌクレオチド配列の変形、及び
４）これらの組み合わせから選択された方法により達成することができ、これに限定されない。

一方、本発明の微生物は、プトレシン生産能を有する微生物であり、上記配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質が発現される原核微生物を含み、この例としては、エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウイニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、セレノモナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp）などに属する微生物であり得る。具体的には、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する微生物であることができ、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）であることができるが、これに限定されない。

本発明の具体的な一実施様態では、グルタミン酸においてプトレシン生成経路が強化され、高濃度プトレシン生産能を有する菌株として寄託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐのコリネバクテリウム属微生物（大韓民国特許公開第２０１２−００６４０４６号）と寄託番号ＫＣＣＭ１１２４０Ｐのコリネバクテリウム属微生物（大韓民国特許出願第２０１２−０００３６３４号）を利用した。

本発明のまた他の実施様態では、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐとそれぞれ同一な遺伝子型（genotype）を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａ（大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号）及びＤＡＢ１２−ｂ（大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号； ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ１４６９）を用いた。ＡＴＣＣ１３８６９菌株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection; ATCC）から入手することができる。

具体的には、本発明者は、プトレシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２４０ＰにおいてＮＣｇｌ２５２３の活性が不活性化するように変形してプトレシン生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０８４４と命名し、ブダペスト条約下で２０１４年２月２５日付で韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１１５２０Ｐを与えられた。

本発明の他の様態は、
ｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化され、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；
及び
ｉｉ）前記段階で得られる微生物または培地からプトレシンを分離する段階を含む、プトレシンの生産方法を提供する。

上記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行うことができる。この時、培養条件は、特に限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素−含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することができる。上記培養により生産されたプトレシンは培地中に分泌されたり、細胞内に残留することができる。

併せて、使用される培養用培地は、炭素源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラッセ、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素−含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、コーン浸漬液、大豆粕粉及び尿素）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されず、その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須の成長−促進物質を含むことができる。

本発明の上記培養段階で生産されたプトレシンを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより、当該分野において公知となった適合した方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集することができる。

以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＮＣｇｌ２５２３欠損菌株の製作及びそのプトレシン生産能の確認
＜１−１＞ ＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株からＮＣｇｌ２５２３欠損菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２３の欠損がプトレシン生産能に関与するかどうかを確認するために、上記ＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子を欠損するためのベクターを作製した。

具体的には、配列番号：１で表されるＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子の塩基配列をベースにＮＣｇｌ２５２３のＮ−末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号：４及び５のプライマー対と、ＮＣｇｌ２５２３のＣ−末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号：６及び７のプライマー対を下記表１の通り作製した。

上記コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にし、２対のプライマーのそれぞれを用いてＰＣＲを行い、ＮＣｇｌ２５２３遺伝子のＮ−末端部位とＣ−末端部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。これから得られたＮ−末端部位の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで、Ｃ−末端部位の断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理し、処理された断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングしてプラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２３（Ｋ／Ｏ）を作製した。

上記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２３（Ｋ／Ｏ）をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ（大韓民国登録特許第１０−１３４８４６１号）及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号）にそれぞれ電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を得て、上記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。これから形成されたコロニーのうち、青色のコロニーを選択することにより、上記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２３（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選抜した。

上記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース 10 g/L、ポリペプトン 10 g/L、酵母エキス 5 g/ L、牛肉エキス 5 g/L、塩化ナトリウム 2.5 g/L、尿素 2 g/L、pH6.8）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０^−４から１０^−１０まで順次希釈した後、Ｘ−ｇａｌ含有固体培地に塗抹し、培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーのうち、比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によりＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子が欠損した菌株を最終選抜した。

最終選抜された菌株を対象に配列番号：４及び７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子が欠損されたことを確認し、上記コリネバクテリウム・グルタミクム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３と命名した。

＜１−２＞ ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株からＮＣｇｌ２５２３欠損菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２−ａ（大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号）及びＤＡＢ１２−ｂ（大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号； ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ１４６９）を対象にＮＣｇｌ２５２３欠損菌株を製作した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子及びそれから発現されるタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号：４及び７のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。これから得られたＰＣＲ産物を電気泳動で分離した後、配列分析を行った結果、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子は、配列番号：３で表される塩基配列を含めた。また、上記遺伝子からコードされるタンパク質のアミノ酸配列をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２３のアミノ酸配列（配列番号：２）と比較した結果、互いに１００％一致することを確認した。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子を欠損するために、前記実施例＜１−１＞のようにコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、表１に示した２対のプライマーのそれぞれを用いてＰＣＲを行い、ＮＣｇｌ２５２３遺伝子のＮ−末端部位とＣ−末端部位のＰＣＲ断片を、それぞれ増幅した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。これから得られたＮ−末端部位の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで、得られたＣ−末端部位の断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理し、処理された断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングしてプラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２５２３（Ｋ／Ｏ）を作製した。

上記プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２５２３（Ｋ／Ｏ）を実施例＜１−１＞と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミクムＤＡＢ１２−ａ及びＤＡＢ１２−ｂにそれぞれ形質転換してＮＣｇｌ２５２３をコードする遺伝子が欠損された菌株を選抜した。これから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株をＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ２５２３及びＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２３と命名した。

＜１−３＞ ＮＣｇｌ２５２３欠損菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてＮＣｇｌ２５２３欠損がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜１−１＞及び＜１−２＞で製作したコリネバクテリウム・グルタミクム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。

具体的には、４種のコリネバクテリウム・グルタミクム変異株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３、ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ２５２３及びＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２３）と４種の親菌株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ、ＤＡＢ１２−ａ及びＤＡＢ１２−ｂ）をそれぞれ１ ｍＭのアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース１％、ポリペプトン １％、 酵母エキス ０．５％、 牛肉エキス ０．５％、 塩化ナトリウム ０．２５％、 尿素 ０．２％、５０％ 水酸化ナトリウム １００μｌ、寒天 ２％、 ｐＨ ６．８、１ Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２ Ｏ ０．０５％、 尿素 ０．１５％、ビオチン１００ ｇ、チアミン塩酸塩３ ｍｇ、カルシウム−パントテン酸３ ｍｇ、ニコチン酸アミド３ ｍｇ、ＣａＣＯ_３ ５％、１ Ｌ基準）に一白金耳程度接種した後、これを３０℃、２００ ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養の時、培地に１ ｍＭのアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表２に示した。

上記表２で示されるように、ＮＣｇｌ２５２３が欠損した４種のコリネバクテリウム・グルタミクム変異株のプトレシン生産量が増加したことを確認した。

実施例２：ＮＣｇｌ２５２３欠損菌株の細胞内プトレシン濃度の測定
ＮＣｇｌ２５２３活性が不活性化されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株において細胞内プトレシンの濃度変化を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミクム変異株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３及び親菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐを対象に、有機溶媒を用いた抽出方法で細胞内プトレシン濃度を測定した。細胞内の代謝物質（intracellular metabolite）の分析は、文献（Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol., 73(14): 4491-4498, 2007）で記載された方法により行った。

まず、コリネバクテリウム・グルタミクム変異株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３及び親菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐをそれぞれ１ ｍＭのアルギニン含有ＣＭ液状培地（グルコース １％、 ポリペプトン １％、 酵母エキス ０．５％、 牛肉エキス ０．５％、 塩化ナトリウム ０．２５％、 尿素 ０．２％、５０％ 水酸化ナトリウム １００μｌ、ｐＨ６．８、１ Ｌ基準）２５ｍｌに接種した後、３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。培養の間、細胞の成長が対数増殖期（exponential phase）に達すると、急速真空ろ過（rapid vacuum filtration、Durapore HV、0.45 m; Millipore、Billerica、 MA）を通じて培養液から細胞を分離した。細胞が吸着されたフィルタを１０ ｍｌの冷却水で２回洗浄した後、５ Ｍのモルホリンエタンスルホン酸（morpholine ethanesulfonic acid）及び５ Ｍのメチオニンスルホン（methionine sulfone）を含有したメタノールに１０分間浸しておいた。これから得られた抽出液に同量のクロロホルムと０．４倍体積の水をよく混合した後、水層（aqueous phase）だけをスピンカラム（spin column）に適用してタンパク質汚染物を除去した。濾過された抽出液を毛細管電気泳動質量分析計（capillary electrophoresis mass spectrometry）を使用して分析し、その結果を下記表３に示した。

上記表３で示されるように、親菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐに比べてＮＣｇｌ２５２３活性が不活性化されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２３において細胞内プトレシン濃度が著しく減少したことを確認した。

これは、上記コリネバクテリウム・グルタミクム変異株ＫＣＣＭ１１２４０ＰにおいてＮＣｇｌ２５２３を欠損させると、ＮＣｇｌ２５２２の発現抑制が解除され、この活性が強化されて、それによりプトレシン排出能が向上するにつれて細胞内で生成されたプトレシンが細胞外に円滑に排出されると予測される。

実施例３：ＮＣｇｌ２５２３遺伝子の相同性検索及び遺伝子コンテキスト分析
ＫＥＧＧ、ＭｅｔａＣｙｃ ＤａｔａｂａｓｅとＮＣＢＩ ｂｌａｓｔＰを通じてコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２３の相同性遺伝子の探索（Ortholog Search）を行い、遺伝子クラスターを通じて各微生物のゲノム上にＮＣｇｌ２５２３とオペロンを構成するＮＣｇｌ２５２２、 ＮＣｇｌ２５２４との組み合わせの形態を確認した。

ＮＣｇｌ２５２の遺伝子名はｃｇｍＡで、ＤＨＡ２ファミリーに属する主要なファシリテーター スーパーファミリーパ-ミア-ゼであり、ＮＣｇｌ２５２３の遺伝子名はｃｇｍＲで、ＴｅｔＲ−ファミリー転写制御因子であり、ＮＣｇｌ２５２４はまだ機能が付与されていないが、ＵＭＦ１ファミリーに属する主要なファシリテーター スーパーファミリーパ-ミア-ゼである。

上記を分析した結果、ＮＣｇｌ２５２２とＮＣｇｌ２５２３の場合、大部分同様なオペロンを構成しており、微生物に応じてＮＣｇｌ２５２４は、同様なオペロンにもあり（Ｔｙｐｅ１）、ゲノム上他の位置にも存在し（Ｔｙｐｅ２）、ゲノム上にいないこともある（Ｔｙｐｅ３）。

これに対し、分析した各微生物をＮＣｇｌ２５２３周辺の遺伝子の組み合わせの形態を、３つのタイプに分類した。具体的には、ＮＣｇｌ２５２３を有していると予想される微生物中、ＮＣｇｌ２５２２−ＮＣｇｌ２５２３−ＮＣｇｌ２５２４の組み合わせの形態（Ｔｙｐｅ１）； ＮＣｇｌ２５２２−ＮＣｇｌ２５２３の組み合わせ及びＮＣｇｌ２５２４単独の形態（Ｔｙｐｅ２）；またはＮＣｇｌ２５２２−ＮＣｇｌ２５２３の組み合わせの形態（Ｔｙｐｅ３）に微生物を分けて分類した（図１）。上記分類結果は、下記表４の通りである。

このような結果から、上記ＮＣｇｌ２５２３とこれと類似した配列を有するアミノ酸を有し、上記分類のように、ＮＣｇｌ２５２２のようにプトレシン排出タンパク質と推定されるタンパク質とオペロンを構成する微生物の場合、該当ＮＣｇｌ２５２３とこれと類似したアミノ酸配列をコードする遺伝子を不活性化させると、本発明のようにプトレシン生産能が向上することを予想することができる。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (8)

1. プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物において配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化された、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
2. さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性が導入された、請求項１に記載のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
3. 前記ＯＤＣが配列番号：１０のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
4. 前記微生物がさらにアセチルトランスフェラーゼの活性が不活性化された、請求項１に記載のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
5. 前記アセチルトランスフェラーゼが配列番号：１５または１６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
6. 前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
7. 配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化され、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階； 及び
   前記段階で得られる微生物または培地からプトレシンを分離する段階を含む、プトレシン生産方法。
8. 前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項７に記載のプトレシン生産方法。