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JP6397833B2 - 癌を診断および治療するためのａｌｋの融合に関する方法および組成物 - Google Patents

癌を診断および治療するためのａｌｋの融合に関する方法および組成物 Download PDF

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Description

本出願は、米国仮特許出願第６１／１７８，９３７号の利益を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の突然変異は、ｉ）非小細胞肺癌、ｉｉ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ｉｉｉ）食道扁平上皮癌、ｉｖ）未分化大細胞リンパ腫、ｖ）神経芽細胞腫（末梢神経系の発達により生じる小児癌）、およびｖｉ）炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）として知られる肉腫を含む多数の癌のサブセットの発生に関与していると考えられる。一部には、効率的な臨床診断法の欠如により癌の検出が遅れることもあって、これらの悪性腫瘍の多くに罹患する患者の予後は不良である。ＡＬＫが介在する癌の早期検出および診断は、患者集団における生存率を劇的に増加させる：一例として、ＡＬＫ陽性の未分化大細胞リンパ腫の早期検出は最大８３％の生存率をもたらし得るのに対し、検出の遅延により、患者集団の生存率は場合によってはわずか５０％となる。これらの癌のより早期の検出を可能にする技術は、これらに罹患する患者の医療管理を大幅に促進することが可能であり、最終的に彼らの治療成績を向上させるのに役立つ。前臨床データおよび早期臨床データの両方が、それらの発生および進行を誘発する活性化ＡＬＫ突然変異を発現する癌のみが、ＡＬＫ低分子阻害剤に対する強力な抗腫瘍応答を示すことを示唆している。
本明細書に開示される方法および組成物は、癌等の疾患または状態の存在の検出または診断の分野、癌等の疾患または状態に対する感受性またはリスクを評価すること、癌等の疾患の疾患進行を監視すること、および癌等の疾患の治療的処置に対する感受性または耐性の判定に関し、疾患または状態は、核酸変異、切断、またはＡＬＫ遺伝子の遺伝子融合に関連する。本明細書に開示される方法は、過剰な正常ＤＮＡの存在下におけるポリペプチド融合体を含む突然変異を含む稀な切断（すなわち、数の少ないヌクレオチド変異）の迅速かつ高感度な検出、ならびに野生型遺伝子の稀な切断および異常な過剰発現の検出を可能にすることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。
本発明の目的（複数可）によれば、本明細書において具現化および広く記載されるように、本発明は、一態様において、目的の核酸中のヌクレオチド変異を検出することにより癌の存在を検出する方法であって、癌に罹患する対象由来の組織サンプルから抽出したｍＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことを含み、増幅産物の存在または対照に対する増幅産物の増加は、融合、ヌクレオチド変異、切断、または過剰発現の存在を示唆し、それによって癌の存在を検出する、方法に関する。具体的には、本発明は、一態様において、特定の癌に起こり得る１つ以上のＡＬＫに関連する融合の存在および／または野生型ＡＬＫの上方制御された発現を検出することにより、癌の存在を検出する方法に関する。
開示される方法および組成物のさらなる利点は、一部には以下の説明に記載され、一部には該説明から理解され、または開示される方法および組成物の実践から学習され得る。開示される方法および組成物の利点は、特に添付の特許請求の範囲において指摘される要素および組み合わせによって認識および達成される。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明のどちらも単なる例示および説明であって、請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、かつ、その一部を成す添付の図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を示し、その記述と共に開示される方法および組成物の主旨を説明する役割を果たす。
代表的なＡＬＫ融合タンパク質、それらを産生する染色体再構成、ＡＬＫ陽性リンパ腫および炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）肉腫におけるそれらの出現、ならびにそれらの細胞内局在を示す。より一般的な発癌性ＡＬＫ融合の部分的なリストが示される（ＡＬＯ１７−ＡＬＫ、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ、ＭＹＨ９−ＡＬＫ、ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ、ＭＳＮ−ＡＬＫ、およびＴＦＧＸＬＡＬＫは表示せず）。Ｃ：細胞質、Ｎ：核、ＣＭ：細胞膜、ＮＭ：核膜。ＴＰＭ３：トロポミオシン−３、ＡＴＩＣ：５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ、ＣＬＴＣ：クラスリン重鎖、ＴＦＧ：ＴＲＫ融合遺伝子、ＴＰＭ４：トロポミオシン−４、ＭＳＮ：モエシン、ＲａｎＢＰ２：Ｒａｎ結合タンパク質２、ＥＭＬ４：棘皮動物微小管結合タンパク質様４。 ＡＬＫ融合を検出するＲＴ−ＰＣＲ反応のための順方向および逆方向プライマーを示す。 適切なプローブの位置、ならびに野生型ＡＬＫおよび７つの変異体ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＮＰＭ−ＡＬＫ、ＭＳＮ−ＡＬＫ、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ、ＴＰＭ−ＡＬＫ、およびＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫを含む種々の融合パートナーの切断領域を示す。 ＡＬＫ融合標的のＲＴ−ＰＣＲ増幅を示す。 図５は、ＲＴ−ＰＣＲによるＡＬＫ融合の検出およびアンプリコンの同定を示す。図５Ａは、対象由来のサンプルを得ることができ、ＡＬＫ融合（既知であるかまたはそれまで未同定であった）、野生型ＡＬＫ、ＡＬＫキナーゼドメイン、また、アッセイ間での正規化のための反応対照（ＣＯＸ５Ｂ）、ならびに陽性および陰性のアッセイ対照の存在について検査することができることを示す。 図５Ｂは、アンプリコンサイズによる融合または野生型の同定の例を示す。
本発明の化合物、組成物、物質、デバイス、および／または方法を開示および説明する前に、それらは、別途指定のない限り、特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジーの方法に限定されるものではなく、または別途指定のない限り、特定の試薬に限定されるものではないことを理解されたい：なぜならそのようなものは、当然異なり得るからである。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであって、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明示的にそうではないと指示しない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物等を含む。
範囲は、本明細書において、「おおよその」ある特定の値から、および／または「おおよその」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」の使用によって、特定の値が別の実施形態を形成することを理解されたい。さらに、各々の範囲の端点は、他の端点に関連して、および他の端点とは無関係に、そのどちらにおいても有意であることを理解されたい。また、本明細書において多くの値が開示され、各値は、その値自体に加えて、「おおよその」その特定の値としても本明細書に開示されることを理解されたい。例えば、「１０」という値が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、ある値が開示される場合、当業者には適切に理解されるように、「その値以下」「その値以上」、およびその値の間の可能な範囲もまた開示されることを理解されたい。例えば、「１０」という値が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」もまた開示される。また、本出願を通して、データは多くの異なる形式で提供され、このデータが終点および始点を表し、データポイントの任意の組み合わせにの範囲を表すことを理解されたい。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０および１５よりも大きい、それ以上、それ未満、それ以下、およびそれと等しいことが開示されると見なされ、また１０〜１５も同様であることを理解されたい。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲において、いくつかの用語が言及されるが、それらは以下の意味を有すると定義されるべきである。
「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないことを意味し、その記述は、上記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含む。
「増加」は、対照に対して大量の組成物または化合物（増幅産物等）をもたらす任意の変化を指すことができる。したがって、例えば、増幅産物の量の増加は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の増加を含むことができるが、これらに限定されない。本明細書において、対照に対するＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現または存在量の増加の検出は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質が対照中に存在しない状況においての、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の存在の検出を必ず含むことが、本明細書においてさらに企図される。
「組織サンプルを得ること」または「組織サンプルを得る」とは、対象から組織のサンプルを採取すること、または対象において組織を測定することを意味する。組織サンプルは、侵襲性および非侵襲性の技術を含む当該技術分野で既知の任意の手段によって得られてもよいことが、本明細書において企図されることを理解されたい。また、測定の方法は、直接的または間接的であってもよいことも理解されたい。組織サンプルを得るまたは測定する方法の例は、組織生検、組織洗浄、吸引、綿棒による組織採取、脊椎穿刺、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、陽電子断層撮影（ＰＥＴ）走査、ならびにＸ線（造影剤を用いるおよび用いない）を含むが、これらに限定されない。
ＤＮＡの既知の部位における突然変異の高感度検出は、既存の技術を用いて容易に行われる。対立遺伝子特異的プライマーは、そのシグナルが野生型ＤＮＡよりも優先的に増幅され得るように、既知の位置における突然変異を標的にするように設計することができる。残念ながら、これは、標的配列の任意の位置（塩基）で生じ得る未知の突然変異に関しては不可能である。
ＡＬＫに関連する癌を検出する方法
開示される方法は、一態様において、対象における癌等の疾患または状態の存在の検出または診断、癌等の疾患または状態に対する感受性またはリスクを評価すること、癌等の疾患または状態の進行を監視すること、および癌等の疾患または状態の治療的処置に対する感受性または耐性の判定の方法であって、対象由来の組織サンプルからｍＲＮＡの存在を検出すること、またはその発現レベルを測定することを含む、方法に関し、対照に対する増幅産物の量の増加は、癌の存在を示唆し、癌は、核酸変異、切断、またはＡＬＫの遺伝子融合と関連する。
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）
ＡＬＫ遺伝子は、ＡＬＫ（配列番号１）（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ６２５４０（ヒトコード配列））と呼ばれる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードし、通常、中枢神経系および末梢神経系で主として発現される。１６２０ａａのＡＬＫポリペプチドは、２６ａａアミノ末端シグナルペプチド配列を含む１０３０ａａ細胞外ドメインと、残基３９１と４０１との間に位置する結合部位とを含む。また、ＡＬＫポリペプチドは、残基１２７８、１２８２、および１２８３の活性化ループ内の自己リン酸化の原因となる３つのチロシンを含むキナーゼドメイン（残基１１１６〜１３８３）を含む。ＡＬＫの突然変異は、ＡＬＫタンパク質のキナーゼ触媒作用を構成的に活性化することが示されており、調節解除された変異ＡＬＫは、次いで、異常な細胞増殖を促進する経路において、下流の細胞シグナル伝達タンパク質を活性化させる。実際に、ＡＬＫキナーゼ活性の調節不全をもたらす突然変異は、いくつかの種類の癌と関連する。
ＡＬＫ融合は、このチロシンキナーゼの最も一般的な突然変異を表す。そのような融合は、ヌクレオフォスミン−ＡＬＫ（ＮＰＭ−ＡＬＫ）、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ−ＡＬＫ）、クラスリン重鎖−ＡＬＫ（ＣＬＴＣ−ＡＬＫ）、キネシン１重鎖遺伝子−ＡＬＫ（ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ）；Ｒａｎ結合タンパク質２−ＡＬＫ（ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ）、ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ、トロポミオシン−３−ＡＬＫ（ＴＰＭ３−ＡＬＫ）、トロポミオシン−４−ＡＬＫ（ＴＰＭ４−ＡＬＫ）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）−ＡＬＫ（ＴＦＧＬ−ＡＬＫ）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）−ＡＬＫ（ＴＦＧＳ−ＡＬＫ）、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ−ＡＬＫ（ＡＴＩＣ−ＡＬＫ）、ＡＬＯ１７−ＡＬＫ、モエシン−ＡＬＫ（ＭＳＮ−ＡＬＫ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子−ＡＬＫ（ＭＹＨ９−ＡＬＫ）、およびＴＲＫ融合遺伝子（特大）−ＡＬＫ（ＴＦＧＸＬＡＬＫ）を含むが、これらに限定されない。６つのＡＬＫ融合である、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ、ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ、ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ、ＴＰＭ３−ＡＬＫ、およびＴＰＭ４−ＡＬＫが、ＩＭＴにおいて同定されている。ＴＰＭ３−ＡＬＫ、ＴＰＭ４−ＡＬＫ、およびＣＬＴＣ−ＡＬＫの融合は、古典的Ｔ細胞またはヌル細胞リンパ腫およびＩＭＴ肉腫の両方に検出されている一方で、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ、ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ、およびＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫは、ＩＭＴにおいて生じる。ＣＬＴＣ−ＡＬＫおよびＮＰＭ−ＡＬＫはまた、Ｂ細胞の形質芽球性／免疫芽球性リンパ腫においても生じる。ＴＰＭ４−ＡＬＫの融合は、食道扁平上皮癌において生じ、ＡＬＫ融合ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＴＦＧ−ＡＬＫおよびＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫは、非小細胞肺癌に見られる。ＥＭＬ４−ＡＬＫはまた、最近、結腸直腸癌および乳癌においても同定されている。したがって、一態様において、ＡＬＫに関連する融合の存在を検出する方法であって、対象由来の組織サンプルからＡＬＫ融合と関連する核酸の存在を検出すること、またはその量を測定することを含み、核酸の存在または対照に対する核酸の増加はＡＬＫ融合の存在を示唆する、方法が、本明細書に開示される。
ＡＬＫ融合は、いくつかの既知の癌の種類と関連している。１つ以上のＡＬＫ融合が、特定の癌と関連し得ることを理解されたい。未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫を含むが、これらに限定されない、ＡＬＫ融合と関連する数種類の癌が存在することをさらに理解されたい。
ＡＬＣＬ。未分化大細胞リンパ腫は、全ＮＨＬの約２．５％を占めており、特に小児科年齢群では、全ＮＨＬの約１３％（全ての小児大細胞リンパ腫の３０〜４０％）がこの種類である。現在、ＡＬＣＬ患者の研究は、このＮＨＬをＡＬＫ陽性およびＡＬＫ陰性のサブセットに分割しており、全ＡＬＣＬの約６０％はＡＬＫ融合によって引き起こされる。理由は明確ではないが、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ患者は、ＡＬＫ陰性疾患に罹患する患者よりも、ＣＨＯＰベース、多剤併用型の従来の化学療法後の経過が有意に順調である（全体的な５年生存率は、それぞれ約７５％対約３５％）。しかしながら、１／３を超える患者が化学療法後に複数回の再発に苦しんでいるため、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬの５年間無病生存率はわずか約４０％である。
ＡＬＫ＋びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫。２００３年に、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＬＫ＋ＤＬＢＣＬ）におけるＣＬＴＣ−ＡＬＫまたはＮＰＭ−ＡＬＫにという記述で、ＮＨＬの非ＡＬＣＬ形態にＡＬＫ融合が生じることが示された。それらのＢ系列と一致して、これらのＮＨＬは、細胞質内ＩｇＡおよび形質細胞マーカーを発現し、免疫芽細胞の形態を保持する。トランスレーショナルリサーチの研究により、これらのリンパ腫の大部分にｔ（２；１７）およびＣＬＴＣ−ＡＬＫ ｍＲＮＡが認められ、免疫標識によって、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬに観察されたものと同一の顆粒状ＡＬＫ染色が確認された。全ての他のＡＬＫ融合パートナータンパク質については、ＣＬＴＣ−ＡＬＫのＣＬＴＣ部分の自己会合モチーフが、構成的自己会合および融合キナーゼの活性化を媒介してリンパ腫形成を誘発する。ＡＬＫ＋ＤＬＢＣＬは主に成人に生じるが、小児リンパ腫におけるｔ（２；５）およびＮＰＭ−ＡＬＫ ｍＲＮＡは、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ陽性の成人Ｂ−ＮＨＬと表現型的に同一である。全ＤＬＢＣＬの０．５〜１％は、ＡＬＫ陽性であると考えられている。これらのリンパ腫に罹患する患者は、ＣＨＯＰベースの治療後に、ＡＬＫ陰性ＤＬＢＣＬ患者と比較して極めて不良な予後を有するため、変異ＡＬＫによって引き起こされるＤＬＢＣＬの同定は重要である：したがって、ＡＬＫ＋ＤＬＢＣＬ患者は、ＡＬＫ標的キナーゼ阻害療法の候補として積極的に考慮されるべきである。
ＡＬＫ＋全身性組織球増殖症。ＡＬＫ融合は、２００８年に、別の造血器新生物である全身性組織球増殖症において記載された。早期乳児期に出現する、この以前は性質不明であった組織球増殖症の形態の３症例がＡＬＫ免疫反応性を呈し、分析した１症例がＴＰＭ３−ＡＬＫを分子的に発現した。
構成的に活性化されたＡＬＫの融合が多くの症例における原因機構であることが分かっている前述した血液系腫瘍に加えて、種々の固形腫瘍、いくつかの場合において、非小細胞肺癌、結腸直腸癌および乳癌等の、非常に一般的なヒト腫瘍のサブセットの発生が、異常に活性化されたＡＬＫに起因することが最近証明された。
炎症性筋線維芽細胞性腫瘍。ＡＬＫ融合を発現することが発見された最初の非造血器腫瘍は、小児および若年成人（平均診断年齢およそ１０歳）の軟組織および内臓における紡錘細胞の増殖である、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）として知られる肉腫である。多くのＩＭＴは緩徐進行型であり、切除により治癒可能である。しかしながら、局所再発性、浸潤性、および転移性のＩＭＴは珍しくなく、現在の化学療法および放射線療法は完全に無効である。ＩＭＴの染色体２ｐ２３（ＡＬＫ遺伝子の位置）およびＡＬＫ遺伝子再構成の関与が、本明細書に開示される。１１のＩＭＴのうち７つにＡＬＫ免疫反応性が示されており、いくつかの症例においてＴＰＭ３−ＡＬＫおよびＴＰＭ４−ＡＬＫが同定された。また、ＩＭＴにおけるさらに２つのＡＬＫ融合であるＣＬＴＣ−およびＲａｎＢＰ２−ＡＬＫが同定された。ＡＬＫ融合はまた、７３のＩＭＴにおいて免疫染色法により調べられ、６０％（７３症例のうち４４）がＡＬＫ陽性であることが明らかになった。したがって、ＡＬＫの調節解除は、大部分のＩＭＴにおいて病原的重要性がある。
非小細胞肺癌。日本人非小細胞肺癌患者７５人のうち５人（６．７％）における新規ＥＭＬ４−ＡＬＫキメラタンパク質の転写産物に関する記述により、癌におけるＡＬＫ融合の役割がさらに拡張された。そのすぐ後に、異なるグループが、中国人肺癌患者１３７人のうち６人（４．４％）がＡＬＫ融合（ＥＭＬ４−ＡＬＫ、３ｐｔｓ；ＴＦＧ−ＡＬＫ、１ｐｔ；Ｘ−ＡＬＫ）を発現することを発見したことにより、肺癌におけるＡＬＫ融合の存在が実証された。２つの一般的な主題が浮上した。すなわち１）ＡＬＫ融合は、主として、腺癌に罹患する患者に生じ（扁平上皮のまたは混在する組織像のＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣは散見されるが）、主に喫煙暦がほとんどないか全くない個体においてに生じること、および２）ＡＬＫの異常は、通常、他の一般的な遺伝的異常（例えば、ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳの突然変異）を伴わずに生じることである。ＡＬＫ融合によって引き起こされるＮＳＣＬＣの正確な割合は、未だに明確ではないが、生物医学文献における報告に基づく推定から約５〜１０％の範囲であることが示唆される。
食道扁平上皮癌。イラン人患者４５人において、プロテオミクスアプローチによって、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）において過少出現または過剰出現されたタンパク質が同定された：ＴＰＭ４−ＡＬＫは、それらの過剰出現タンパク質のうちの１つであった。プロテオミクスに基づく２回目のＥＳＣＣの試験により、この場合は中国人患者においてであるが、これらの腫瘍においてＴＰＭ４−ＡＬＫも同定された。
結腸直腸癌、乳癌。直腸結腸癌、乳癌、および非小細胞肺癌の３つのヒト腫瘍型を、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の存在について調査した（この試験では、他のＡＬＫ突然変異は評価しなかった）。ＮＳＣＬＣにおけるＥＭＬ４−ＡＬＫの発現を確認したことに加えて（調べた１０６検体のうち１２個、１１．３％）、乳癌（５／２０９症例、２．４％）および直腸結腸癌（２／８３症例、２．４％）のサブセットがＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性であった。結腸直腸癌において、既知のＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体１（Ｅ１３；Ａ２０）および２（Ｅ２０；Ａ２０）の他に、新規変異体（Ｅ２１；Ａ２０）が見つかった。
家族性および孤発性神経芽細胞腫におけるＡＬＫ。神経芽細胞腫は、最も一般的な小児の頭蓋外固形腫瘍であり、発達中の神経堤に由来する。神経芽細胞腫の小さなサブセット（約１〜２％）が、常染色体優性遺伝の家族性素因を示す。ほとんどの神経芽細胞腫患者は、集中的な化学療法および放射線療法にもかかわらず、４０％未満の生存確率を伴う侵襲性疾患を有し、この疾患は小児癌死亡率の約１５％を占める。ＡＬＫは、少数の神経芽細胞腫細胞株における遺伝子増幅の結果として、同様に高レベルの過剰発現に起因して構成的に活性化されることが以前に分かっており、実際に、ＡＬＫの増幅は、活性化点突然変異に加えて神経芽細胞腫の約１５％に生じる。ＡＬＫにおけるこれらのミスセンス変異は、神経芽細胞腫の成長を誘発する活性化突然変異として確認されており、さらに、ＡＬＫ低分子阻害剤を用いた神経芽細胞腫細胞株のインキュベーションにより、ＡＬＫ活性化を有するこれらの細胞（野生型ＡＬＫの正常レベルの発現を有する細胞株を除く）が強い細胞傷害反応を示すことが明らかになっている。
最近の研究は、低分子薬候補を用いたＡＬＫのこれらの変異形態の阻害が、この異常な細胞増殖を抑止し、神経芽細胞腫および他のＡＬＫ誘発性腫瘍の細胞株においてアポトーシスを促進することを実証している。これらの発見は、ＡＬＫの突然変異に特化した診断テストすなわち複数の臨床用途を有するであろうテスト―の必要性を浮き彫りにする。例えば、そのようなアッセイは、遺伝性神経芽細胞腫に罹患する家族の子供をスクリーニングするために使用することができ、彼らがもっと治療を受け入れやすいより早期の段階での腫瘍検出を容易にするのに役立つ。ＡＬＫによる癌の早期検出および診断は、患者集団における生存率を劇的に増加させる。したがって、一態様において、癌等（例えば、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌）の疾患または状態の存在を検出または診断する方法であって、対象由来の組織サンプルから、核酸変異、切断、もしくはＡＬＫ融合に関連するＤＮＡ、ｃＤＮＡのレベル、もしくはｍＲＮＡの発現の存在を検出すること、またはそのレベルを測定することを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法が、本明細書に開示される。また、疾患または状態に対する感受性またはリスクを評価する、疾患の進行を監視する、または対象における核酸変異、切断、もしくはＡＬＫ融合と関連する癌の治療的処置に対する感受性または耐性の判定の方法であって、対象の組織サンプルからＤＮＡ、ｃＤＮＡのレベル、もしくはｍＲＮＡの発現の存在を検出すること、またはそのレベルを測定することを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法も、本明細書に開示される。
よって、一態様において、ＡＬＫ融合配列の検出は癌の存在を示唆する。したがって、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからｍＲＮＡの存在を検出するか、またはその発現レベルを測定することを含み、ｍＲＮＡはＡＬＫ融合に特異的であり、対照に対するｍＲＮＡの量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法が、本明細書に開示される。
ＡＬＫ融合に関連する癌は、ＡＬＫキナーゼ阻害剤で治療することができる。しかしながら、ＡＬＫキナーゼ阻剤に耐性を示す癌も発見されている。これらの癌は、家族性および孤発性の癌（例えば、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫）においてＡＬＫの点突然変異をさらに含むＡＬＫ融合物である。ＡＬＫの突然変異は、ＡＬＫの構成的な活性化をもたらす。したがって、ＡＬＫと関連する癌は、これらの活性化点突然変異によって誘発される。チロシンキナーゼ触媒ドメインＭ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑ、ならびにＶ４７６Ａの細胞外ドメインにおける突然変異は、神経芽細胞腫と関連する。Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍにおける突然変異は、結腸直腸癌において同定された。また、Ｌ５６０Ｆにおける突然変異は乳癌において、および卵巣癌のＡ８７７Ｓにおいて同定された。したがって、一態様において、癌の存在を検出することは、ＡＬＫの配列における点突然変異の検出によって達成される（すなわち、点突然変異を検出することにより、ＡＬＫに関連する癌が同定される）。したがって、ＡＬＫに関連する癌の存在を検出する方法であって、癌はＡＬＫまたは野生型ＡＬＫの上方制御に１つ以上の点突然変異をさらに含む方法が、本明細書に開示される。
開示されるＡＬＫ融合はまた、野生型ＡＬＫの調節解除を引き起こすことができる。調節不全の野生型ＡＬＫは、生成される野生型ＡＬＫの増加、およびキナーゼの触媒活性の調節不全をもたらす。代替として、癌は、ｃＭＥＴまたはＩＧＦＲ等の別の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）からの主要な分子病理学的特徴を有することができるが、ＡＬＫを介したシグナル伝達経路の平行経路活性化によって耐性を生じる。したがって、癌の存在を検出するための別の手段は、野生型ＡＬＫの発現の増加の検出によるものである。また、調節領域を欠失する切断された野生型ＡＬＫ遺伝子は、構成的なＡＬＫキナーゼの触媒機能をもたらし得る。したがって、癌の存在を診断する方法であって、切断されたＡＬＫ配列に関連するｍＲＮＡの発現の存在または相対的な増加を検出することを含む方法が、本明細書に開示される。
ＡＬＫに関連する癌の原因は、野生型ＡＬＫまたは既知のＡＬＫ融合の調節不全のみに起因するのではなく、１つ以上の未同定のＡＬＫ融合にも起因し得ることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。既知の融合を検出することのみが可能な方法は、ＡＬＫのそれまで未知であった融合または突然変異を検出することは不可能である。切断、ＡＬＫの核酸変異、またはＡＬＫ融合の存在だけではなく、野生型ＡＬＫおよびＡＬＫのキナーゼ活性も検出することによって、当業者は、癌が、野生型ＡＬＫの調節不全、既知のＡＬＫ融合、またはそれまで未同定であったＡＬＫ融合もしくはＡＬＫの突然変異に起因するものであるかどうかを判定することができる。したがって、癌を診断するため、癌に対する感受性もしくはリスクを評価するため、またはＡＬＫの調節不全の存在を検出するための方法であって、野生型ＡＬＫの存在を検出することをさらに含み、ＡＬＫキナーゼの活性の存在を検出することをなおもさらに含む方法が、本明細書に開示される。したがって、例えば、ＡＬＫに関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのＡＬＫ融合物、野生型ＡＬＫおよび／またはＡＬＫキナーゼドメインに関連する核酸の存在を検出することを含む方法が、本明細書に開示される。
ｍＲＮＡの検出および定量化
本明細書に開示される方法は、例えば、点突然変異もしくは切断の形態である核酸変異の検出、あるいはＡＬＫ融合の発現、異常な野生型ＡＬＫの発現、またはＡＬＫ切断変異の発現の検出に関する。これらの後者の発現レベルの検出のために、この方法は、ｍＲＮＡの存在量もしくは存在のいずれか、またはその両方を検出することを含む。したがって、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断するための方法および組成物であって、対象由来の組織サンプルからｍＲＮＡの存在またはレベルを測定することを含み、対照に対するｍＲＮＡの量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する、方法および組成物が、本明細書に開示される。
全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）ＲＮＡサンプル中の特定のｍＲＮＡの存在量を検出および判定するために広く使用される多くの手順が存在する。例えば、特定のｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）、インサイツハイブリダイゼーション、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびマイクロアッセイを使用して検出することができる。
理論上、これらの技術の各々は、特定のＲＮＡを検出し、それらの発現レベルを正確に判定するために使用することができる。一般に、ノーザン分析が、転写産物のサイズに関する情報を提供する唯一の方法であるのに対し、ＮＰＡは、複数のメッセージを同時に調査するための最も容易な方式である。インサイツハイブリダイゼーションは、組織型または細胞型における特定の遺伝子の発現を局在化するために使用され、ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現を検出および定量するための最も高感度な方法である。
ＲＴ−ＰＣＲは、出発物質の不足または特定のｍＲＮＡの相対的な存在量にかかわらず、いかなる遺伝子のＲＮＡ転写産物の検出も可能にする。ＲＴ−ＰＣＲでは、レトロウイルスの逆転写酵素を使用して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）内でＲＮＡ鋳型がコピーされる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲによって、ｃＤＮＡが指数関数的に増幅される。逆転写およびＰＣＲ反応は、同じかまたは異なる管内で起こり得る。ＲＴ−ＰＣＲは、分解ＲＮＡにいくらか耐性がある。プライマーによってスパニングされた領域内でＲＮＡが損なわれていない限り、その領域は増幅される。
相対定量ＲＴ−ＰＣＲは、目的の遺伝子と同時に内部標準を増幅させることが関与する。内部標準は、サンプルを正規化するために使用される。一旦正規化されると、サンプル全体にわたって、特定のｍＲＮＡの相対的な存在量の直接比較を行うことができる。全ての実験用サンプルにわたって一定の発現レベルを有する（すなわち、実験処置によって影響を受けない）内部標準を選択することが非常に重要である。一般的に使用される内部標準（例えばＧＡＰＤＨ、βアクチン、シクロフィリン）は発現量が変動することが多く、したがって、適切な内部標準とはなり得ない。また、最も一般的な内部標準は、調べたｍＲＮＡよりも遥かに高いレベルで発現される。相対ＲＴ−ＰＣＲの結果が有意であるためには、ＰＣＲ反応の全ての産物が増幅の線形範囲で分析されなければならない。広く異なる存在量レベルの転写産物にとって、これは困難である。
競合ＲＴ−ＰＣＲは、絶対定量のために使用される。この技術には、サイズまたは配列のわずかな相違によって内因性標的と区別することができる競合ＲＮＡを、設計、合成、および正確に定量することが関与する。既知の量の競合ＲＮＡが実験サンプルに加えられ、ＲＴ−ＰＣＲが実行される。内因性標的からのシグナルを競合者からのシグナルと比較して、サンプル中に存在する標的の量を判定する。
したがって、一態様において、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法が、本明細書に開示される。開示される方法は、野生型ＡＬＫ、ＡＬＫ融合、およびＡＬＫキナーゼドメインの活性を検出するために使用することができるため、または対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する、またはＡＬＫキナーゼの調節不全を検出する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対する第１のＲＴ−ＰＣＲ反応であって、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーであって、ＡＬＫ融合パートナーに特異的にハイブリダイズする、順方向プライマーと、を含む、第１のＲＴ−ＰＣＲ反応と、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対する第２のＲＴ−ＰＣＲ反応であって、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる順方向および逆方向プライマーを含む、第２のＲＴ−ＰＣＲ反応と、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対する第３のＲＴ−ＰＣＲ反応であって、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫキナーゼドメイン配列に特異的にハイブリダイズすることができる順方向および逆方向プライマーを含む、第３のＲＴ−ＰＣＲ反応と、を行うことを含み、アンプリコンの存在または対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在およびＡＬＫキナーゼの調節不全の存在を示唆する方法もまた、本明細書に開示される。具体的には、ＡＬＫ融合アンプリコンおよびキナーゼドメインアンプリコンの存在は、既知のＡＬＫ融合の存在を示唆し、野生型アンプリコンおよびキナーゼドメインアンプリコンの存在は、野生型ＡＬＫを示唆し、キナーゼドメインアンプリコンの存在は単独で、それまで未同定であったＡＬＫ融合または変異ＡＬＫの存在を示唆する。
ノーザン分析は、転写産物のサイズを判定するため、および選択的スプライシング転写産物および多重遺伝子族のメンバーを同定するための最も容易な方法である。これは、ブロット上の全てのサンプル間の所与のメッセージの相対的存在量を直接比較するためにも使用することができる。ノーザンブロット法の手順は単刀直入であり、種々の時点での進行（例えば、ＲＮＡサンプルが損なわれていないこと、およびそれがどれだけ効率的に膜に移動されたか）を評価する機会を提供する。ＲＮＡサンプルは、最初に、変性条件下で、アガロースゲル上の電気泳動によってサイズごとに分離される。次いで、ＲＮＡを膜に移動させ、架橋させ、標識プローブでハイブリダイズする。ランダムプライムドプローブ、ニック翻訳プローブ、またはＰＣＲで作製したＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、およびオリゴヌクレオチドを含む非同位体または抗特異性活性放射標識プローブを使用することができる。また、部分的相同性のみを有する配列（例えば、異なる種またはエクソンを含有する可能性のあるゲノムＤＮＡ断片由来のｃＤＮＡ）がプローブとして使用されてもよい。
ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）（リボヌクレアーゼプロテクションアッセイおよびＳ１ヌクレアーゼアッセイの両方を含む）は、特定のｍＲＮＡの検出および定量化のための高感度な方法である。ＮＰＡの基本となるのは、ＲＮＡサンプルに対するアンチセンスプローブ（放射標識または非同位体）の溶液ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーション後、一本鎖のハイブリダイズされていないプローブおよびＲＮＡが、ヌクレアーゼによって分解される。残りの保護された断片は、アクリルアミドゲル上で分離される。溶液ハイブリダイゼーションは、通常、膜ベースのハイブリダイゼーションよりも効率的であり、最大２０〜３０μｇのブロットハイブリダイゼーションと比較して、最大１００μｇのサンプルＲＮＡに対応することができる。ＮＰＡはまた、プローブと重複した領域においてのみ開裂が検出されるため、ノーザン分析よりもＲＮＡサンプルの分解に対する感度が低い（プローブは、通常約１００〜４００塩基長である）。
ＮＰＡは、いくつかのＲＮＡ種の同時検出に最適な方法である。溶液ハイブリダイゼーションおよびそれに続く分析の間、個々のプローブ／標的の相互作用は完全に互いに無関係である。よって、個々のプローブは異なる長さであることを条件として、いくつかのＲＮＡ標的および適切な対照を同時にアッセイすることができる（同じ反応において最大１２個が使用されている）。ＮＰＡはまた、ｍＲＮＡ末端およびイントロン／エクソン接合点を正確にマッピングするために一般的に使用される。
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞または組織における特定のｍＲＮＡの局在化のための強力かつ多用途のツールである。ノーザン分析およびヌクレアーゼプロテクションアッセイとは異なり、ＩＳＨはＲＮＡの単離または電気泳動による分離を必要としない。プローブのハイブリダイゼーションは、細胞または組織内で行われる。手順を通して細胞構造が維持されるため、ＩＳＨは、組織サンプル内におけるｍＲＮＡの位置に関する情報を提供する。
手順は、中性緩衝ホルマリン中でサンプルを固定させ、組織をパラフィンに包埋することにより開始される。次いで、サンプルを薄片にスライスし、顕微鏡スライド上に載せる（代替として、組織が凍った状態で薄片にし、パラホルムアルデヒド中で後固定することもできる）。薄片を脱脂および再水和するための一連の洗浄後、プローブの到達性を高めるためにプロテイナーゼＫによる消化を行い、次いで、標識されたプローブをサンプル薄片とハイブリダイズさせる。放射標識プローブは、スライド上で乾燥させた液膜で可視化される一方で、非同位体的に標識されたプローブは、比色分析または蛍光試薬で簡便に検出される。
配列決定技術の限界、特に感度のために、未知の突然変異のための数多くの走査技術が長年にわたって開発されてきている：変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）（ＸｉａｏおよびＯｅｆｎｅｒ，２００１）、塩基切断配列走査（ＢＥＳＳ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）（Ｎａｇａｍｉｎｅ ｅｔ．ａｌ．１９８９）、コンフォメーション高感度ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）（ＧａｎｇｕｌｙおよびＰｒｏｃｋｏｐ，１９９５；Ｇａｎｇｕｌｙ ｅｔ．ａｌ．１９９３）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（ＦｏｄｄｅおよびＬｏｓｅｋｏｏｔ，１９９４）、変性剤定濃度ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）（Ｈｏｖｉｇ ｅｔ ａｌ．１９９１）、経時的温度勾配ゲル電気泳動（ＴＴＧＥ）（Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ．１９９９）、ミスマッチの化学切断（Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｔａｂｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６）、ミスマッチの酵素切断（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．１９８５）およびミスマッチ修復酵素（ＯｌｄｅｎｂｕｒｇおよびＳｉｅｂｅｒｔ，２０００；Ｂａｂｏｎ ｅｔ．ａｌ．１９９９；Ｙｏｕｉｌ ｅｔ． ａｌ．１９９６；Ｂｒｏｗ ｅｔ．ａｌ．１９９６；Ｌｕ ａｎｄ Ｈｓｕ，１９９２）。これらの技術は、以下の限界のうちの１つ以上を有するため、広範囲には使用されていない：自動化するのが面倒、困難である（低スループット）、感度が低い、または再現するのが困難である。最新の点突然変異アッセイは、標的遺伝子の部位における既知の点突然変異の検出に重点を置いている。しかしながら、ＡＬＫのような遺伝子には、ＤＮＡの大きな領域全体に自発的点突然変異が生じるため、数百個の塩基対を走査できる技術が必要となる。いくつかの未知の点突然変異技術が開発されているが、そのほとんどまたは全てが、稀な遺伝子突然変異の検出に使用することを不可能にする限界を有する。
対照的に、鋳型交換および伸長反応（Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＴＥＥＲ（商標））は、その後半の工程において、選択的増幅を使用して稀なおよび未知の突然変異の検出感度を増加させる。この利点は、疾患を早期に検出する能力、ならびに、癌が進行および変異し続けるにつれて、さらなる突然変異による変化の蓄積を監視する能力を意味する。さらに、ＴＥＥＲ（商標）は、リアルタイムＰＣＲ、フラグメント分析、および電気泳動を含む複数のプラットフォームに適応可能である。例えば、ＴＥＥＲ（商標）は、混入する非腫瘍細胞由来の正常ＤＮＡの存在量を含有する混合臨床サンプル検体の稀なＡＬＫ活性化点突然変異の、サンプル収集から始まってエンドポイント検出まで適応可能である。全体のプロセスは、約５．５時間で完了することができる。
ＴＥＥＲ（商標）プラットフォームは、５つの基本工程からなる。１．固相捕捉精製のための配列決定蛍光フルオレセイン（ＦＡＭ）タグおよびビオチンタグを含有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、稀なまたは新規の突然変異を含有する最初のＡＬＫ２７０ｂｐ鋳型のＰＣＲ増幅に使用する。２．アンプリコンを熱変性させ、次いで、変性させた野生型ＡＬＫ鋳型とともにハイブリダイズさせて鋳型交換を起こす。３．次いで、単鎖ヌクレアーゼＣＥＬ１を用いて、存在するあらゆるミスマッチヌクレオチドを酵素的に切断する。４．切り出したミスマッチ塩基を含有するＤＮＡ鎖をＴａｑポリメラーゼで伸長させる。５．次いで、特異的ＲＴ−ＰＣＲプライマーを使用して、伸長させた鋳型の５’領域のみを検出する。ＴＥＥＲ（商標）増幅と定量化を組み合わせることにより、高スループットおよび高感度の検出が可能となる。伸長したＴＥＥＲ（商標）精製鋳型上にのみ存在する固有の逆方向プライマー部位を使用して、存在する（または存在しない）あらゆる潜在的な突然変異を増幅および定量する。初期順方向プライマー上のビオチン化オリゴ捕捉配列を使用して、混入する野生型鋳型に由来する背景を最小限に抑え、Ｅｘｏ ＩＩＩを使用して相補性３’または５’末端を含有するあらゆる二本鎖の二重鎖を消化する（米国特許第６，１５０，１０５号、鋳型交換および伸長反応の教示のために、その全体が本明細書に組み込まれる）。
ＴＥＥＲ（商標）プロセスは、本来、悪性細胞および組織由来の鋳型において未発見の遺伝子多型を検出するための高スループットツールとして、腫瘍学分野における必要性に対応するように開発された。ＴＥＥＲ（商標）は、最初にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて実証された。ＴＥＥＲ（商標）は、対照の未変異ＤＮＡ鋳型と比較して、稀な、既知の、または新規の突然変異を含有し得るＤＮＡ鋳型中の遺伝的変異を検出するように設計される。ＴＥＥＲ（商標）は、配列決定産物はそれらが産生される鋳型に固有であるという事実に基づいて、潜在的に突然変異を含有する「未知の」ＤＮＡ鋳型を、突然変異を持たないことが確認された鋳型と比較するために使用した。配列産物におけるいずれの変化も未知のＤＮＡ鋳型における遺伝的突然変異に反映され、ゲル電気泳動によって可視化することができた。最近になって、ＴＥＥＲ（商標）プロセスは、高スループット分析および使い易さの向上を可能にするために、固相マイクロタイター検出プラットフォームに適合された。ビオチン化ＰＣＲ産物を産生するように、対照および「未知の」ＤＮＡ鋳型が５’ビオチン化プライマーを用いて増幅された。その後、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ＤＮＡが、対照および「未知の」ＤＮＡ鋳型からのＰＣＲアンプリコンのハイブリダイゼーションによって形成された。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートウェルへのコンジュゲーションを介してホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ＤＮＡを固相に結合したため、ＴＥＥＲ（商標）プロセスの全工程を容易に行うことができるようになり、サンプルの取扱いおよび処理が大幅に簡素化された。ＴＥＥＲ（商標）プロセスは、修飾された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイであり、高スループットおよび高感度のためにリアルタイムＰＣＲプラットフォームと複合化することができる。
ＤＮＡの検出および定量化
本明細書に開示される方法は、例えば、点突然変異および切断の形態の核酸変異の検出、またはＡＬＫ融合の発現、異常な野生型ＡＬＫの発現、もしくはＡＬＫ切断変異の発現の検出に関する。これらの後者の発現レベル検出のために、方法は、ｍＲＮＡの存在量もしくは存在のいずれかまたは両方を検出することを含む。代替として、検出は、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡの存在量または存在を対象とすることもできる。したがって、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断するための方法および組成物であって、対象由来の組織サンプルからのＤＮＡの存在またはレベルを測定することを含み、対照に対するＤＮＡの量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法および組成物が、本明細書に開示される。
サンプル中の特定のＤＮＡの存在量を検出および判定するために広く使用される多くの手順が存在する。例えば、ＰＣＲの技術は、微量の標的核酸の増幅およびその後の検出を可能にする。ＰＣＲの詳細については、当該技術分野において十分に記載されており、例えば、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第４，６８３，１９５号、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．に対する第４，６８３，２０２号、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．に対する第４，９６５，１８８号を含む。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを標的核酸の変性鎖にアニーリングし、ポリメラーゼによるデオキシヌクレオシドトリホスフェートの重合によりプライマー伸長産物を形成する。典型的なＰＣＲ法は、鋳型核酸の変性、プライマーのアニーリング、および耐熱性ポリメラーゼの作用によるアニーリングされたプライマーの伸長、のサイクルを繰り返すことを含む。このプロセスにより、標的核酸の指数関数的な増幅がもたらされ、サンプル中に極微量で存在する標的の検出が可能になる。例えば、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＴ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、およびタッチダウンＰＣＲ等の、開示される方法において利用されてもよい、様々な当該技術分野で既知のＰＣＲ法が存在することを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。
マイクロアレイ
アレイは、整然と配置されたサンプルであり、塩基対形成の原則に基づいて既知および未知のＤＮＡサンプルを一致させるための媒体を提供し、未知のＤＮＡを同定するプロセスを自動化する。アレイ実験は、マイクロプレートまたは標準的なブロッティング膜等の一般的なアッセイ系を利用することができ、手で作製することができるか、またはサンプルを置くためにロボット工学を利用することができる。一般に、アレイは、マクロアレイまたはマイクロアレイと記載され、その違いはサンプルスポットのサイズである。マクロアレイは、約３００ミクロン以上のサンプルスポットサイズを含み、既存のゲルおよびブロットスキャナーにより容易に画像化することができる。マイクロアレイのサンプルスポットサイズは、３００ミクロン以下であってもよいが、典型的には２００ミクロン未満の直径であり、これらのアレイは、通常、数千のスポットを含む。マイクロアレイは、特別なロボット工学および／または画像化設備を必要とし、一般に、それは完全なシステムとしては市販されていない。この技術を説明するために文献で使用されてきた用語は、バイオチップ、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．の高密度オリゴヌクレオチドベースのＤＮＡアレイを指す）、および遺伝子アレイを含むが、これらに限定されない。
ＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップは、一般的にはガラスまたはナイロン基板上に、高速ロボットによって製造され、既知の同一性を有するプローブを使用して相補的な結合を測定し、それによって超並列型遺伝子発現および遺伝子発見の調査を可能にする。単一のＤＮＡチップを用いる実験が、何千という遺伝子に関する情報を同時に提供することができる。開示されるマイクロアレイは、遺伝子発現、疾患の診断、遺伝子の発見、創薬（薬理ゲノミクス）、および毒物学的研究または毒性ゲノミクスを監視するために使用できることが本明細書において企図される。
既知の同一性を有するアレイ化されたＤＮＡ配列の特性という観点から、ＤＮＡマクロアレイ技術には２つの変形がある。Ｉ型マイクロアレイは、プローブｃＤＮＡ（５００〜５，０００塩基長）を備え、それはロボットによるスポッティングを用いてガラス等の個体表面に固定され、別個にまたは混合物中においてのいずれかで、一連の標的に曝露される。この方法は、伝統的にＤＮＡマイクロアレイと称される。Ｉ型マイクロアレイを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列の局在的な複数のコピー、好ましくは単一のポリヌクレオチド配列のコピーが、基板表面の複数の所定領域上に固定される。ポリヌクレオチドとは、５〜１０，０００ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドの鎖を指す。これらの固定化されたポリヌクレオチド配列のコピーは、ハイブリダイゼーション実験においてプローブとして使用するのに好適である。
固定化されたプローブでコーティングされたビーズを調製するために、所望のプローブ配列を含む溶液にビーズを浸漬し、次いで、共有結合的または非共有結合的な手段によってビーズ上に固定する。代替として、プローブがロッド上に固定化される場合、所与のプローブは、ロッドの所定領域にスポットされてもよい。典型的なディスペンサーは、基板に対するマイクロピペットの位置を制御するためのロボットシステムを用いて基板に溶液を送達するマイクロピペットを含む。試薬が反応領域に同時に送達され得るように、多数のディスペンサーが存在してもよい。一実施形態において、マイクロアレイは、圧電作用に基づくインクジェット技術を用いることにより形成され、それによってオリゴヌクレオチド合成試薬等の目的の液体を収容する細い管が、アダプタによって取り囲まれる。アダプタを横切って送られる電荷は、管とは異なる比率でアダプタを拡張させ、基板上に液体の小滴が載るようにする。
サンプルは、目的のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド標的）を含有する任意のサンプルであり得、任意の体液（血液、尿、唾液、痰、胃液等）、培養細胞、生体組織、または他の組織調製物から得られる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当業者に周知の多くの方法のうちのいずれかに従ってサンプルから単離することができる。一実施形態において、全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ全ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）を用いて単離され、ＲＮＡは、オリゴｄ（Ｔ）カラムクロマトグラフィーまたはガラスビーズを用いて単離される。ハイブリダイゼーションおよびプロセッシングの後、得られたハイブリダイゼーションシグナルは、サンプルに加えられた対照標的ポリヌクレオチドの量を正確に反映するはずである。
基板上の複数の所定領域は、種々の形式で配置することができる。例えば、領域は、ケーシングの長さに垂直または平行に配置されてもよい。さらに、標的は、その基板に直接結合されなくてもよく、むしろリンカー基を介してその基板に結合することができる。リンカー基は、典型的には約６〜５０原子の長さまで変動し得る。リンカー基は、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二価酸等を含む。基板表面上の反応基は、リンカーの末端部分の一方と反応してリンカーを基板に結合させる。次いで、リンカーの他方の末端が官能化されてプローブを結合させる。
サンプルのポリヌクレオチドは、１つ以上の標識部分で標識され、ハイブリダイズしたプローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の検出を可能にする。標識部分は、分光学的、光化学的、生化学的、生物電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出され得る組成物を含むことができる。標識部分は、放射性同位体（３２Ｐ、３３Ｐまたは３５Ｓ等）、化学発光化合物、標識された結合性タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー（蛍光マーカーおよび色素）、磁気標識、結合酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子輸送のドナーおよびアクセプター、ビオチン等を含む。
標識化は、増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応ならびにインビトロおよびインビボ転写反応等）の間に実行することができる。代替として、標識部分は、一旦、プローブ−標的複合体が形成されてから、ハイブリダイゼーション後に組み込まれてもよい。一実施形態において、ビオチンは、上記のように、増幅工程の間に最初に組み込まれる。ハイブリダイゼーション反応後、結合しなかった核酸が洗い流され、基板に結合した状態で残ったビオチンのみが、ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチドに結合したビオチンとなる。次いで、ビオチンに高い親和性で結合するアビジン結合体化フルオロフォア（アビジン‐フィコエリトリン等）が加えられる。
ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドプローブおよび相補的な標的が、塩基対形成を介して安定した二重鎖を形成させるようにする。ハイブリダイゼーションの方法は当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件は、塩濃度、温度、ならびに他の化学物質および条件によって定義することができる。ハイブリダイゼーションの時間、界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）または溶媒（ホルムアミド）の濃度、およびキャリアＤＮＡの組み込みまたは除外等の、様々な追加のパラメータは、当業者に周知である。これらの条件に対するさらなる変動は、当業者に容易に理解されるであろう。
複合体の形成を検出するための方法は、当業者に周知である。一実施形態において、ポリヌクレオチドプローブは蛍光標識を用いて標識され、複合体形成のレベルおよびパターンの測定は、蛍光顕微鏡、好ましくは、共焦点蛍光顕微鏡によって達成される。アルゴンイオンレーザーが蛍光標識を励起し、放射が光電子増倍管に方向付けられ、放射光の量が検出および定量される。検出されたシグナルは、マイクロアレイの各位置におけるプローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の量に比例するはずである。蛍光顕微鏡をコンピュータによるスキャナデバイスと合わせて、ハイブリダイゼーション強度の定量的二次元画像を作成することができる。走査された画像を調べて、それぞれのハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの存在量／発現レベルを決定する。
差次的なハイブリダイゼーション実験では、２つ以上の異なる生物学的サンプル由来のポリヌクレオチド標的が、異なる発光波長を有する２つ以上の異なる蛍光標識によって標識される。蛍光シグナルは、特定の波長を検出するように設定された異なる光電子増倍管を用いて別々に検出される。２つ以上のサンプル中の標的ポリヌクレオチドの相対的な存在量／発現レベルが得られる。典型的には、１つより多くのマイクロアレイが同様の試験条件下で使用される場合、ハイブリダイゼーション強度の変化を考慮に入れるようにマイクロアレイの蛍光強度を正規化することができる。一実施形態において、個々のポリヌクレオチドプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション強度は、各マイクロアレイ上に含まれる内部正規化対照の強度を用いて正規化される。
ＩＩ型マイクロアレイは、インサイチュ（チップ上）または従来の合成によって合成され、その後チップ上に固定される、オリゴヌクレオチド（２０〜８０ｍｅｒのオリゴ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブのアレイを備える。アレイは、標識されたサンプルＤＮＡに曝露され、ハイブリダイズされ、そして相補的配列の同一性／存在量が決定される。「歴史的に」ＤＮＡチップと称されるこの方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．で開発されたものであり、同社はＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）の商標でフォトリソグラフィを用いて製造された製品を販売している。
遺伝子発現のためのＩＩ型アレイの使用の基本概念は単純である：実験サンプルのｍＲＮＡ由来の標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡが、固体支持体に結合された核酸プローブにハイブリダイズする。各ＤＮＡの位置と関連する標識の量をモニタリングすることによって、示される各ｍＲＮＡ種の存在量を推測することが可能である。ハイブリダイゼーションは、核酸を検出および定量するために何十年間も使用されてきたが、技術の小型化と膨大かつ増え続ける配列情報の量とが相まって、遺伝子発現を調査できる規模が膨大に拡張された。
マイクロアレイの製造は、５インチ平方の石英ウエハから開始することができる。最初に、確実にその表面全体を均一にヒドロキシル化するために石英が洗浄される。石英は自然の状態でヒドロキシル化されているため、後にアレイ上にプローブを配置するために使用されるリンカー分子等の化学物質の結合のための優れた基板を提供する。
ウエハはシランの入った槽に入れられ、シランは石英のヒドロキシル基と反応して、共有結合分子のマトリクスを形成する。これらのシラン分子間の距離が、プローブの充填密度を決定し、アレイが、わずか１．２８平方センチメートル以内に５００，０００を超えるプローブの位置または特徴を保持することを可能にする。これらの特徴の各々は、数百万という同一のＤＮＡ分子を保有する。シランフィルムは、プローブの組立てを開始するための均一なヒドロキシル密度を提供する。シランマトリクスに結合したリンカー分子は、光によって空間的に活性化され得る表面を提供する。
プローブの合成は並行して行われ、結果として複数の成長する鎖にＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧのヌクレオチドを同時に付加する。各工程でどのオリゴヌクレオチド鎖がヌクレオチドを受け取るかを規定するために、個々の特徴の寸法に対応する１８〜２０平方ミクロンのウィンドウを有するフォトリソグラフィマスクが、コーティングされたウエハに乗せられる。ウィンドウは、各プローブの所望の配列に基づいてマスクの上に分布される。合成の最初の段階でマスクに紫外線が照射されると、曝露されたリンカーが脱保護され、ヌクレオチドのカップリングに使用可能となる。
一旦、所望の特徴が活性化されると、除去可能な保護基を有する１種類のデオキシヌクレオチドを含有する溶液が、ウエハ表面にフラッシングされる。ヌクレオチドは、活性化されたリンカーに結合し、合成プロセスを開始する。
オリゴヌクレオチドの配列におけるそれぞれの位置は、４つのうち１つのヌクレオチドに占められ得るため、ウエハあたり２５×４、つまりは１００の異なるマスクを必要とするように見えるが、合成プロセスは、この所要量を大幅に低減するように設計することができる。マスクの使用を最小減に抑えるのに役立つアルゴリズムは、同じマスクが複数回使用され得る場合、個々のプローブの合成速度を調節し、状況を確認することによって、プローブの成長を最適に調整する方法を計算する。
選択および設計の重要な要素のうちのいくつかは、それらが意図される用途とは関係なく、全てのマイクロアレイの製造に共通する。プローブのハイブリダイゼーションを最適化するためのストラテジーは、例えば、プローブ選択のプロセスに常に含まれる。特定のｐＨ条件、塩条件、および温度条件下でのハイブリダイゼーションは、融解温度を考慮し、所望のハイブリダイゼーション挙動と相関する経験則を用いることにより最適化することができる。
遺伝子活性の全体像を得るために、複数のスプライシング変異体またはポリアデニル化変異体によって共有される領域からいくつかのプローブが選択される。他の場合において、変異体を区別する固有のプローブが好ましい。プローブ間の距離もまた、選択プロセスに考慮される。
配列中の個々のヌクレオチドを調査するために、異なる一連のストラテジーを用いて、複数のプローブに依存するアレイを遺伝子型決定するためのプローブを選択する。標的塩基が何であるかは、標的位置においてのみ変化する４つの同一のプローブ（それぞれが、考えられる４つの塩基のうちの１つを含む）を用いて推定することができる。
代替として、特異的対立遺伝子を表す２つ以上のプローブを用いて、コンセンサス配列の存在を検査することができる。ヘテロ接合性にまたは遺伝的に混合されたサンプルを遺伝子型決定するために、多くのプローブを有するアレイを作製して冗長な情報を提供することができ、明確な遺伝子型決定がなされる。また、順応性を最大化するために、いくつかの用途では包括的なプローブを使用することができる。いくつかのプローブアレイは、例えば、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を同定するためにいくつかのプロトコルにおいて使用されるような複合混合物からの、個々の反応産物の分離および分析を可能する。
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲは、エンドポイント検出とは対照的に、各ＰＣＲサイクルの間に（すなわち、リアルタイムで）、アンプリコン生成の指標として反応中に発光される蛍光をモニタリングする。リアルタイムでの反応の進行は、いくつかのシステムで観察することができる。リアルタイムＰＣＲは、アンプリコンのサイズを検出しないため、ＤＮＡ増幅とｃＤＮＡ増幅の区別はできないが、ＳＹＢＲグリーンが使用されない限り、非特異的増幅による影響を受けない。リアルタイムＰＣＲ定量は、ＰＣＲ産物のＰＣＲ後のプロセッシングを排除する。これは、スループットを増加させ、キャリーオーバー汚染の可能性を減少させるのに役立つ。リアルタイムＰＣＲはまた、最大１０７倍の広いダイナミックレンジを提供する。いずれのアッセイのダイナミックレンジも、どれだけ標的濃度が異なり得るか、それでも定量され得るかを決定する。広いダイナミックレンジは、等しい感度および特異性で、幅広い範囲の比率の標的および正規化手段がアッセイ可能であることを意味する。当然、ダイナミックレンジが広い程、定量がより正確になる。ＲＴ−ＰＣＲと組み合わせると、リアルタイムＲＴ＿ＰＣＲ反応は、増幅プロセスが進行するにつれてアンプリコンの可視化を提供することにより、アンプリコンの量を測定するために必要な時間を短縮する。
リアルタイムＰＣＲシステムは、蛍光性レポーターの検出および定量化に基づいている。このシグナルは、反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増加する。各サイクルで蛍光発光の量を記録することにより、指数期の間にＰＣＲ反応を監視することが可能であり、ＰＣＲ産物の量の初期の有意な増加は、標的鋳型の初期量と相関する。核酸標的の開始時のコピー数が多い程、蛍光の有意な増加がより早く観察される。３〜１５サイクルの間に測定されたベースライン値を超える蛍光の有意な増加は、ＰＣＲ産物の蓄積の検出を示唆し得る。
固定蛍光閾値は、操作者が変更できるベースラインよりも有意に上に設定される。パラメータＣＴ（閾値サイクル）は、蛍光発光が固定閾値を越えるサイクル数として定義される。
ＤＮＡ増幅のための３つの主要な蛍光モニタリングシステムがある：（１）加水分解プローブ、（２）ハイブリダイズするプローブ、および（３）ＤＮＡ結合剤。加水分解プローブは、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコン、およびスコーピオンを含む。それらは、Ｔａｑポリメラーゼの蛍光発生５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、ｃＤＮＡサンプル中の標的配列の量を測定する。
ＴａｑＭａｎプローブは、通常、５’塩基上に蛍光色素、そして典型的には３’塩基上に消光色素（通常はＴＡＭＲＡ）を含有する、プライマーより長い（２０〜３０塩基長、１０℃高いＴｍ値）オリゴヌクレオチドである。照射されると、励起された蛍光色素は、蛍光を発するのではなく、近くの消光色素分子にエネルギーを伝達する（これは、ＦＲＥＴ＝フェルスターまたは蛍光共鳴エネルギー転移と呼ばれる）。したがって、プローブが損なわれない間は、レポーターと消光剤が近接することにより、あらゆる蛍光の発光を防ぐ。ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にアニーリングするように設計される。ポリメラーゼが、ＴａｑＭａｎプローブが結合された鋳型を複製する場合、その５’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。これにより、消光剤の活性が停止され（ＦＲＥＴなし）、レポーター色素が蛍光を発光し始め、各サイクルでプローブ切断の割合に比例して増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることによって検出される（プライマーは標識されないことに留意されたい）。ＴａｑＭａｎアッセイは、普遍的な熱サイクルパラメータおよびＰＣＲ反応条件を使用する。プローブが標的にハイブリダイズする場合にのみ切断が生じるため、検出された蛍光の由来は特異的増幅である。ハイブリダイゼーションおよび切断のプロセスは、産物の指数関数的な蓄積を妨害しない。蛍光発生プローブのための１つの特定の要件は、５’末端にＧがないということである。レポーター色素に隣接する「Ｇ」は、たとえ切断の後であってもレポーター蛍光を消光し得る。
分子ビーコンもまた、いずれかの末端に蛍光色素（ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＲＯＸ）および消光色素（典型的にはＤＡＢＣＹＬ）を含有するが、蛍光色素と消光剤を密接に近接させてＦＲＥＴを生じさせるように、溶液中に遊離している間はヘアピン構造を採るように設計される。それらは、非常に安定したハイブリッドまたはステムを形成する相補的な配列を有する２本のアームを有する。このヘアピン構成におけるレポーターと消光剤の近接は、レポーター蛍光を抑制する。アニーリング工程の間にビーコンが標的にハイブリダイズする場合、レポーター色素は消光剤から分離され、レポーターが蛍光を発する（ＦＲＥＴは生じない）。ＰＣＲの間、分子ビーコンは損なわれないままであり、蛍光発光のためのすべてのサイクルで標的に再結合しなければならない。これは、利用可能なＰＣＲ産物の量と相関する。ＳＹＢＲグリーンが使用される場合は、プラットフォームが融解曲線分析に好適である限り、スペクトル的に固有の蛍光／消光対を備えた各プローブ／ビーコンを設計することにより、全てのリアルタイムＰＣＲの化学的性質のために複数のＤＮＡ種の検出（多重化）が可能となる。多重化することによって、標的（複数可）および内因性対照を単一試験管内で増幅することができる。
スコーピオンプローブを用いると、配列特異的なプライミングおよびＰＣＲ産物の検出が、単一のオリゴヌクレオチドを使用して達成される。スコーピオンプローブは、ハイブリダイズしていない状態でステムループ構成を維持する。蛍光団は、５’末端に結合し、３’末端に連結された部分により消光される。ステムの３’部分は、プライマーの伸長産物に相補的な配列も含む。この配列は、増幅不可能なモノマーを介して特異的プライマーの５’末端に結合される。スコーピオンプライマーの伸長後、特異的プローブ配列は、伸長したアンプリコン内のその相補物に結合することが可能であり、そうすることでヘアピンループが開く。これにより蛍光の消光を防ぎ、シグナルが観察される。
他の代替例は、二本鎖ＤＮＡ結合色素化学であり、配列非特異的な蛍光挿入剤（ＳＹＢＲグリーンＩまたは臭化エチジウム）の使用によって、アンプリコンの生成（非特異的増幅およびプライマー二量体複合体を含む）を定量する。それはｓｓＤＮＡに結合しない。ＳＹＢＲグリーンは、溶液中ではほとんど蛍光を示さないが、二本鎖ＤＮＡに結合すると強い蛍光シグナルを発する、副溝に結合する蛍光発生色素である。ＳＹＢＲグリーンに基づくリアルタイムＰＣＲの欠点は、広範囲な最適化を必要とすることを含む。さらに、非特異的増幅は、アンプリコン同定のための追跡アッセイ（融点曲線または解離分析）を必要とする。この方法は、ＨＦＥ−Ｃ２８２Ｙ遺伝子型決定において使用されてきている。他の制御可能な問題は、アンプリコンが長いほど、より強いシグナを生成するということである（他の要因と組み合わされた場合に、これはＣＤＣカメラの飽和を引き起こす可能性がある。以下を参照のこと）。
通常、ＳＹＢＲグリーンは、シングルプレックス反応において使用されるが、融点分析と組み合わせると多重反応に使用することができる。
閾値サイクルまたはＣＴ値は、ΔＲｎの有意な増加が最初に検出されるサイクルである（ΔＲｎの定義については以下を参照のこと）。閾値サイクルとは、システムが対数線形位相（ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ ｐｈａｓｅ）の間にＰＣＲ産物の指数関数的な増加に関連したシグナルの増加を検出し始めるときである。この相は、反応に関する最も有用な情報を提供する（エンドポイントよりも確実に重要である）。対数線形位相の勾配は増幅効率を反映する。反応の効率（Ｅｆｆ）は、以下の式によって計算することができる：Ｅｆｆ＝１０（−１／勾配）１。ＰＣＲの効率は、９０〜１００％（３．６＞勾配＞３．１）であるべきである。多くの変数がＰＣＲの効率に影響を与え得る。これらの因子は、アンプリコンの長さ、二次構造、およびプライマーの品質を含む。効率範囲外に属する有効データを得ることができるが、ｑＲＴ−ＰＣＲがさらに最適化されるか、または代替のアンプリコンが設計されるべきである。勾配が実際の増幅（信号ドリフトではなく）の指標となるためには、変曲点がなければならない。これは対数線形位相が始まる時の増加曲線上の点である。変曲点はまた、増加曲線に沿った最も大きな変化率も表わす。（信号ドリフトは、産物の増幅のない蛍光の漸増または漸減によって特徴付けられる。）定量化のための重要なパラメータはＣＴである。ゲノムＤＮＡの初期量が高い程、蓄積された生成物がＰＣＲプロセスにおいてより早く検出され、ＣＴ値がより低くなる。閾値は、いかなるベースライン活性よりも上で、かつ指数関数的な増加位相内に置かれるべきである（対数変換において直線状に見える）。いくつかのソフトウェアは、増加曲線の数学的分析によってサイクル閾値（ＣＴ）の決定を可能にする。これは、より良好な実験ごとの再現性を提供する。ＣＴ値４０は、増幅がないことを意味し、この値を計算に含めることはできない。定量化に用いられることに加えて、ＣＴ値は、合格／不合格の尺度として定性分析に使用することができる。
別個の発光波長の複数の色素を使用して、多重ＴａｑＭａｎアッセイを行うことができる。この目的のために利用可能な色素は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＶＩＣ、およびＪＯＥ（最も高価）である。ＴＡＭＲＡはプローブ上で消光剤として、またＲＯＸはパッシブリファレンスとして確保される。最良の結果のために、ＦＡＭ（標的）およびＶＩＣ（内因性対象）の組み合わせが推奨される一方で（それらは最大発光に最も大きな差を有する）、ＪＯＥおよびＶＩＣは組み合わされるべきではない。色素層が正確に選択されていないと、機械が他の色素のスペクトルを読み取るので、これは重要である。例えば、ＶＩＣおよびＦＡＭの両方が互いに同様の範囲の蛍光を発するため、単一の色素を使用する場合は、ウェルに正確に印をつけるべきである。多重化の場合には、実験後の分析のためのスペクトル補償を行うべきである（ＡＢＩ７７００：インスツルメント／診断／アドバンスオプション／その他）。スペクトル補償の活性化は、色素スペクトルの分解能を向上する。
ネステッドＰＣＲ
開示される方法は、さらにネステッドＰＣＲを用いることができる。ネステッドＰＣＲは、ＤＮＡの非特異的増幅による背景を減少することによって、ＤＮＡ増幅の特異性を増加させる。２つの連続的なＰＣＲにおいて、２組のプライマーが使用される。第１の反応では、一対のプライマーを使用してＤＮＡ産物を産生するが、これは意図する標的の他に、非特異的に増幅させたＤＮＡ断片から依然としてなり得る。次いで、産物（複数可）は、第１の反応で使用したプライマーの各々とは結合部位が完全にまたは部分的に異なり、３’に位置する１組のプライマーとともに、第２のＰＣＲに使用される。ネステッドＰＣＲは、従来のＰＣＲよりも長いＤＮＡ断片を特異的に増幅する際により高い成果を上げることが多いが、標的配列についてのより詳細な知識を必要とする。
したがって、一態様において、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行うことを含み、ＰＣＲ反応は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する、方法が、本明細書に開示される。
プライマーおよびプローブ
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、特定の種類の酵素的操作を支持することが可能であり、酵素的操作が生じ得るように標的核酸にハイブリダイズすることができる、プローブのサブセットである。プライマーは、酵素的操作を妨害しない、当該技術分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドの誘導体もしくは類似体の任意の組み合わせから作製することができる。
本明細書で使用される場合、「プローブ」は、通常、例えば、ハイブリダイゼーションを通じて、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは当該技術分野で十分に理解されており、また本明細書において考察される。典型的には、プローブは、当該技術分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドの誘導体もしくは類似体の任意の組み合わせから作製することができる。
配列番号１またはその相補体等の開示される核酸と相互作用することができる、プライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の実施形態において、プライマーは、核酸伸長反応、核酸複製反応、および／または核酸増幅反応を支持するために使用される。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長され得る。配列特異的な様式におけるプライマーの伸長は任意の方法を含み、プライマーがハイブリダイズするか、またはそうでなければ会合する核酸分子の配列および／または組成が、プライマーの伸長によって生成される産物の組成または配列を決定するか、またはそれに影響を与える。したがって、配列特異的な様式におけるプライマーの伸長は、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写を含むが、これらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅させる技術および条件が開示される。特定の実施形態において、プライマーは、ＰＣＲまたは直接配列決定等のＤＮＡ増幅反応に用いられる。プライマーはまた、特定の実施形態において、非酵素的な技術を用いて伸長できることを理解されたく、例えば、プライマーを伸長するために用いられるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが修飾されている場合、それらは化学的に反応して配列特異的な様式でプライマーを伸長する。通常、開示されるプライマーは、開示される核酸もしくは核酸の領域にハイブリダイズするか、またはそれらは、核酸の相補体もしくは核酸の領域の相補体にハイブリダイズする。プライマーの使用の一例として、１つ以上のプライマーは、第一の核酸から伸長産物を作製するために使用されてもよく、また第一の核酸によって鋳型にされてもよい。
核酸との相互作用のためのプライマーまたはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅またはプローブもしくはプライマーの単純なハイブリダイゼーション等の、プライマーの所望の酵素的操作を支持する任意のサイズであり得る。典型的なプライマーまたはプローブは、少なくとも、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長であろう。
他の実施形態において、プライマーまたはプローブは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。
目的の核酸のためのプライマーは、典型的には、目的の核酸の領域を含有する伸長産物および／または他の複製もしくは増幅された産物を生成するために使用される。産物のサイズは、そのサイズが３、２、または１ヌクレオチド内まで正確に決定され得るようなサイズであり得る。
特定の実施形態において、産物は、例えば、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長であり得る。
他の実施形態において、産物は、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。
したがって、開示されるＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応は、プライマー対を形成するために順方向および逆方向プライマーを必要とすることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。順方向プライマーは、＊＊＊からなる群から選択されてもよいことが本明細書に開示される。例えば、順方向プライマーは、細胞内ＡＬＫプライマー、例えば（プライマー１００）５’ＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴ（配列番号６）；細胞外ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合プライマー、例えば（プライマー１０３）５’ＴＧＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号３）；細胞外ＮＰＭ−ＡＬＫ融合プライマー、例えば（プライマー１０２）；５’ＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴ（配列番号４）；細胞外ＣＴＬＣ−ＡＬＫ融合プライマー、例えば（プライマー１０５）５’ＧＡＧＡＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴ（配列番号５）；または非相同性領域からの細胞外野生型ＡＬＫプライマー、例えば（プライマー１０４）５’ＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴ（配列番号２）であってもよい。開示される方法において使用され得るさらなる順方向および逆方向プライマーは、表３に見出すことができる。
逆方向プライマーは、例えば、プライマー１０１：５’ＴＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＴＴＣＡ（配列番号７）であってもよい。代替として、逆方向プライマーは、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号５８であってもよい。方法は、少なくとも１つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むことを理解されたい。したがって、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、順方向プライマーは、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫプライマー、ＮＰＭ−ＡＬＫプライマー、ＡＴＩＣ−ＡＬＫプライマー、ＣＬＴＣ−ＡＬＫプライマー、ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫプライマー、ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫプライマー、ＴＰＭ３−ＡＬＫプライマー、ＴＰＭ４−ＡＬＫプライマー、ＴＦＧＬ−ＡＬＫプライマー、ＴＦＧＳ−ＡＬＫプライマー、ＣＡＲＳ−ＡＬＫプライマー、ＥＭＬ４−ＡＬＫプライマー、ＡＬＯ１７−ＡＬＫプライマー、ＭＹＨ９−ＡＬＫプライマー、ＭＳＮ−ＡＬＫプライマー、およびＴＦＧＸＬＡＬＫプライマーからなる群から選択され、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法が、本明細書に開示される。したがって、順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５９からなる群から選択される方法もまた開示される。例えば、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、順方向プライマーは、配列番号４を含むＮＰＭ−ＡＬＫ融合プライマーであり、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法が、本明細書に開示される。
プライマー対のさらなる例として、順方向プライマーは野生型ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＮＰＭ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＡＴＩＣ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＣＬＴＣ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＴＰＭ３−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＴＰＭ４−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＴＦＧＬ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＴＦＧＳ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＣＡＲＳ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７；順方向プライマーはＥＭＬ４−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＡＬＯ１７−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；順方向プライマーはＭＹＨ９−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である；または順方向プライマーはＴＦＧＸＬ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号７である方法である方法が、本明細書に具体的に開示される。また、プライマー対が、配列番号２および７、配列番号３および７、配列番号４および７、配列番号５および７、配列番号６および７を含む方法も開示される。
プライマー対のさらなる例、順方向プライマーは野生型ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＮＰＭ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＡＴＩＣ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＣＬＴＣ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＴＰＭ３−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＴＰＭ４−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＴＦＧＬ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＴＦＧＳ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＣＡＲＳ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＥＭＬ４−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＡＬＯ１７−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である；順方向プライマーはＭＹＨ９−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６；または順方向プライマーはＴＦＧＸＬ−ＡＬＫプライマーであり、逆方向プライマーは配列番号４６である方法が、本明細書に具体的に開示される。また、プライマー対が、配列番号２および４６、配列番号３および４６、配列番号４および４６、配列番号５および４６、配列番号６および４６、配列番号３３および４６、配列番号３４および４６、配列番号３５および４６、配列番号３６および４６、配列番号３７および４６、配列番号３８および４６、配列番号３９および４６、配列番号４０および４６、配列番号４１および４６、配列番号４２および４６、配列番号４３および４６、配列番号４４および４６、配列番号４５および４６、配列番号４８５および４６、配列番号４９および４６、配列番号５０および４６、配列番号５１および４６、配列番号５２および４６、配列番号５３および４６、配列番号５４および４６、配列番号５５および４６、または配列番号５８および４６を含む方法も開示される。
融合、切断、または過剰発現する突然変異を検出するために、１つより多くのプライマー対を利用することが有利であり得る場合があることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。そのようなＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応は、別個に、または単一の反応において行うことができる。複数のプライマー対が単一の反応に用いられる場合、これは「多重ＰＣＲ」と称される。例えば、反応は、逆方向プライマーと対になった野生型ＡＬＫプライマー、および同じ逆方向プライマーと対になったＡＬＫ融合プライマーを含むことができる。したがって、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも２つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する方法が、本明細書に開示される。同様に、少なくとも３つの順方向プライマーを含む方法も開示される。２つ以上または３つ以上の任意の組み合わせの本明細書に開示される順方向プライマーが、多重反応において使用されてもよいことを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、例えば、順方向プライマーがＮＰＭ−ＡＬＫプライマーおよび野生型ＡＬＫプライマーである診断の方法が本明細書に開示される。また、例えば、順方向プライマーがＥＬＭ４−ＡＬＫプライマーおよび野生型ＡＬＫプライマーである診断の方法も開示される。
多重ＰＣＲの順方向プライマーセットの他の例として、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＡＴＩＣ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＴＰＭ３−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＴＰＭ４−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＴＦＧＬ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＴＦＧＳ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＡＬＯ１７−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＭＹＨ９−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＭＳＮ−ＡＬＫ融合プライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、切断されたＡＬＫプライマーおよび野生型ＡＬＫプライマー、ＬＭ４−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＮＰＭ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＡＴＩＣ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＴＰＭ３−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＴＰＭ４−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＴＦＧＬ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＴＦＧＳ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＡＬＯ１７−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ＭＹＨ９−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマー、ならびにＭＳＮ−ＡＬＫ融合プライマーおよび切断されたＡＬＫプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる例として、ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＮＰＭ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＣＬＴＣ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＡＴＩＣ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＳＥＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＴＰＭ３−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＴＰＭ４−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＴＦＧＬ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＴＦＧＳ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＣＡＲＳ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＡＬＯ１７−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ＭＹＨ９−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマー；ならびにＭＳＮ−ＡＬＫ融合プライマー、野生型ＡＬＫプライマー、および切断されたＡＬＫプライマーＡＬＫプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、一態様において、単一の反応管が、１つ以上のＡＬＫ融合、野生型ＡＬＫ、またはＡＬＫキナーゼドメインにハイブリダイズする順方向プライマーと、野生型ＡＬＫにハイブリダイズする逆方向プライマーとを含むことができる。本明細書に開示される方法は、複数の反応管を含むことができることを理解されたい。例えば、方法は、１つ以上の順方向ＡＬＫ融合プライマーと、野生型ＡＬＫにハイブリダイズする逆方向ＡＬＫプライマー（例えば、順方向プライマー配列番号２、３、４、５、６、３４，３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４８、４９、５０、５１、５２、５３、および５９、逆方向プライマー配列番号７、３２、４６、４７、５６、５７、または５８）とを含む、既知のＡＬＫ融合の存在を検出するための第１の反応と；野生型ＡＬＫの検出のための順方向および逆方向プライマー（例えば、順方向プライマー配列番号３３、５４、または５５、逆方向プライマー配列番号７、３２、４６、４７、５６、５７、または５８）を含む、第２の反応管と；ＡＬＫのキナーゼドメインの存在を検出するための順方向および逆方向プライマー（例えば、順方向プライマー配列番号４５または４８、逆方向プライマー配列番号７、３２、４６、４７、５６、５７、または５８）と；対照を検出するための順方向および逆方向プライマーと；陽性ｃＤＮＡ対照のための順方向および逆方向プライマーと；陰性ｃＤＮＡ対照のための順方向および逆方向プライマーと、を含むことができる。複数の反応管を用いる方法において、ＲＮＡは対象から得た組織サンプルから抽出され、ＲＮＡはｃＤＮＡを生成するために逆転写され、ｃＤＮＡは１つ以上の反応管に分割され、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイアッセイが行われる。対照が設計した通りに機能すると仮定すると、当業者は、融合管、野生型管、およびキナーゼ管の中の増幅産物を検出することができる。融合管およびキナーゼ管にはアンプリコンが存在するが、野生型管には存在しない結果をもたらすアッセイは、既知のＡＬＫ融合の存在を示唆する。融合管は陰性であり、野生型管およびキナーゼ管が陽性である場合、野生型ＡＬＫのみが存在する。野生型および融合の両方の反応管が陰性であり、キナーゼ管が陽性である場合、それまで未知であった融合が存在する。キナーゼ管が陰性であり、融合または野生型のいずれかの管が陽性である場合、機能的ＡＬＫは存在せず、組織サンプルはＡＬＫに関連する癌（図５Ａを参照）を含有しない。アンプリコンのサイズを測定することによって、サンプル中の特定のＡＬＫ融合または野生型ＡＬＫが何であるかを決定することができることを理解されたい（図５Ｂを参照）。アンプリコンが特定のＡＬＫ融合または野生型ＡＬＫとは関係のないサイズを有する場合、アンプリコンはそれまで未知であったＡＬＫ融合を表す。
蛍光変化プローブおよびプライマー
蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーは、検出される、アッセイされる、または複製されるプローブまたはプライマーおよび核酸の形態または高次構造の変化に基づく蛍光強度または波長の変化を含む、全てのプローブおよびプライマーを指す。蛍光変化プローブおよびプライマーの例として、分子ビーコン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒｓ、ＦＲＥＴプローブ、切断可能なＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重オリゴ（三重分子ビーコンまたは三重ＦＲＥＴプローブを含むが、これらに限定されない）、蛍光水溶性コンジュゲートポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブが挙げられる。
蛍光変化プローブおよびプライマーは、それらの構造および／または機能にしたがって分類することができる。蛍光変化プローブは、ヘアピン消光プローブ、切断消光プローブ、切断活性化プローブ、および蛍光活性化プローブを含む。蛍光変化プライマーは、ステム消光プライマーおよびヘアピン消光プライマーを含む。
ヘアピン消光プローブは、標的配列に結合しないときに標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識と消光部分を近接させるヘアピン構造（および、通常はループ）を形成するプローブである。プローブが標的配列に結合するとステムが破壊され、消光部分はもはや蛍光標識と近接しておらず、蛍光が増加する。ヘアピン消光プローブの例は、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブ、およびＱＰＮＡプローブである。
切断活性化プローブは、蛍光がプローブの切断によって増加されるプローブである。切断活性化プローブは、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識と消光部分を近接して含むことができる。プローブが切り出されるかまたは消化されると（通常、増幅の間のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による）、消光部分はもはや蛍光標識と近接しておらず、蛍光が増加する。ＴａｑＭａｎプローブは、切断活性化プローブの例である。
切断消光プローブは、プローブの切断によって蛍光が減少されるかまたは変更されるプローブである。切断消光プローブは、アクセプターとドナーが近接しているときに、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー伝達がアクセプターに蛍光を発生させるように、アクセプター蛍光標識およびドナー部分を含むことができる。したがって、プローブは、例えば、標的配列にハイブリダイズするときに、蛍光性である。プローブが切り出されるかまたは消化されると（通常、増幅の間のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による）、ドナー部分はもはやアクセプター蛍光標識と近接しておらず、アクセプターからの蛍光が減少する。ドナー部分自体が蛍光標識である場合、アクセプターと近接していないときに、（典型的には、アクセプターの蛍光とは異なる波長で）エネルギーを蛍光として放出することができる。全体的な効果は、アクセプター蛍光の減少およびドナー蛍光の増加である。切断消光プローブの場合のドナー蛍光は、切断活性化プローブによって産生される蛍光と等しく、アクセプターは消光部分であり、ドナーは蛍光標識である。切断可能なＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）プローブは、切断消光プローブの例である。
蛍光活性化プローブは、標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションによって蛍光が増加されるかまたは変更されるプローブまたはプローブの対である。蛍光活性化プローブは、アクセプターとドナーが近接しているとき（プローブが標的配列にハイブリダイズするとき）、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー伝達がアクセプターに蛍光を発生させるように、アクセプター蛍光標識およびドナー部分を含むことができる。蛍光活性化プローブは、通常、アクセプターとドナーが近接するように、隣接する配列にハイブリダイズするように設計されるプローブの対である。蛍光活性化プローブはまた、ドナーおよびアクセプターの両方を含有する単一のプローブであってもよく、プローブが標的配列にハイブリダイズしないときはドナーとアクセプターは近接していないが、プローブが標的配列にハイブリダイズするとドナーとアクセプターが近接する。これは、例えば、プローブの反対の末端にドナーおよびアクセプターを配置すること、およびプローブの各末端に標的相補的配列を配置することによって達成されてもよく、標的相補的配列は、標的配列の隣接する配列に相補的である。蛍光活性化プローブのドナー部分自体が蛍光標識である場合、アクセプターと近接していないとき（すなわち、プローブが標的配列にハイブリダイズしないとき）に、（通常、アクセプターの蛍光とは異なる波長で）エネルギーを蛍光として放出することができる。プローブが標的配列にハイブリダイズする場合、全体的な効果は、ドナー蛍光の減少およびアクセプター蛍光の増加である。ＦＲＥＴプローブは、蛍光活性化プローブの例である。
ステム消光プライマーは、相補的な配列にハイブリダイズしないときに標識からの蛍光が消光されるように、蛍光標識と消光部分を近接させるステム構造（分子内ステム構造または分子間ステム構造のいずれか）を形成するプライマーである。プライマーが相補的な配列に結合すると、ステムが破壊され、消光部分はもはや蛍光標識と近接しておらず、蛍光が増加する。開示される方法において、ステム消光プライマーは、核酸合成のためのプライマーとして使用され、したがって合成または増幅された核酸に組み込まれる。ステム消光プライマーの例は、ペプチド核酸消光プライマーおよびヘアピン消光プライマーである。
ペプチド核酸消光プライマーは、ペプチド核酸消光剤またはペプチド核酸蛍光と会合してステム構造を形成するプライマーである。このプライマーは、蛍光標識または消光部分を含有し、それぞれ、ペプチド核酸消光剤またはペプチド核酸蛍光のいずれかと会合する。これにより蛍光標識が消光部分と近接する。プライマーが複製されると、ペプチド核酸が置換され、そのため蛍光標識が蛍光シグナルを生成することが可能となる。
ヘアピン消光プライマーは、相補的な配列にハイブリダイズしないときに標識からの蛍光が消光されるように、蛍光標識と消光部分を近接させるヘアピン構造（および、通常はループ）を形成するプライマーである。プライマーが相補的な配列に結合すると、ステムが破壊され、消光部分はもはや蛍光標識と近接しておらず、蛍光が増加する。ヘアピン消光プライマーは、通常、核酸合成のためのプライマーとして使用され、したがって合成または増幅された核酸に組み込まれる。ヘアピン消光プライマーの例は、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマーおよびスコーピオンプライマーである。
切断活性化プライマーは、それらが複製された鎖に組み込まれるプライマーであり、続いて切断されることを除いて、切断活性化プローブと同様である。
標識
開示される方法を使用して生成される核酸の検出および定量化を補助するために、標識は、ヌクレオチドもしくは核酸に直接組み込まれてもよいか、またはプローブおよびプライマー等の検出分子にカップリングされてもよい。本明細書で使用される場合、標識は、ヌクレオチドまたは核酸と、直接的または間接的に会合することができ、直接的または間接的のいずれかで測定可能、検出可能なシグナルを生じる任意の分子である。ヌクレオチドおよび核酸への組み込みのため、または核酸プローブへのカップリングのための、そのような多くの標識が当業者に既知である。開示される方法における使用に好適な標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。蛍光標識は、特に蛍光変化プローブおよびプライマーに関連して、増幅のリアルタイム検出に有用である。
好適な蛍光標識の例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｙｅ（商標）等）蛍光エネルギー伝達色素（チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体）、ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。他の特定の蛍光標識の例として、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、アントロイルステアリン酸、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコフォアＦＦＧ溶液、ブランコフォアＳＶ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコフォルホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォルホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、チナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１ ８、ＣＹ５．１ ８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、二フッ化ジピロメテンホウ素、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、グロキサン酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、Ｉｎｄｏ−１、イントラホワイトＣｆ液、ロイコフォアＰＡＦ、ロイコフォアＳＦ、ロイコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアファストレッド、ヌクレアイエロー、ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロサニリン（フォイルゲン）、ホルワイトＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、フィコエリトリンＢ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢカンＣ、スルホローダミンＧエクストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣ．が挙げられる。
これらの蛍光のうちのいくつかについての吸収および発光極大波長は、それぞれ、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ、５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ、５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ、５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ、６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ、７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ、７７８ｎｍ）であり、これによって、それらの同時検出が可能となる。フルオレセイン色素の他の例として、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられる。蛍光標識は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を含む、様々な商業的供給源から入手可能である。
さらなる目的の標識は、それらが会合するプローブが標的分子に特異的に結合されるときのみシグナルを提供する標識を含み、そのような標識は、Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３および欧州特許第００７０６８５Ｂ１号に記載されるような「分子ビーコン」を含む。他の目的の標識は、参照により、本明細書に組み込まれる米国特許第５，５６３，０３７号に記載されるものを含む。
標識されたヌクレオチドは、合成の間に増幅産物に直接組み込むことができる標識の形態である。増幅された核酸に組み込むことのできる標識の例として、ヌクレオチド類似体、例えば、ＢｒｄＵｒｄ、アミノアリルデオキシウリジン、５−メチルシトシン、ブロモウリジン、およびビオチン、またはジゴキシゲニン等の好適なハプテンで修飾されたヌクレオチドが挙げられる。好適な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアン酸塩−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである。ＤＮＡのためのヌクレオチド類似体標識の一例は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ）である。ＤＮＡに標識を組み込むためのヌクレオチド類似体の他の例は、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジン三リン酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。ＲＮＡに標識を組み込むためのヌクレオチド類似体の一例は、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸塩、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。直接標識のために、フルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５をｄＵＴＰに結合させてもよい。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチンまたはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用可能である。
増幅された核酸に組み込まれた標識、例えばビオチンは、当該技術分野で周知の高感度な方法を使用して、その後で検出することができる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を用いて検出することができ、これをビオチンに結合させて、後に好適な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム、３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光によって検出する。標識はまた、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびポリメラーゼであってもよく、これらは、例えば、化学的シグナル増幅を用いて、または光（例えば化学発光性１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを生成する酵素に対する基質を用いることによって検出することができる。
これらの標識のうち２つ以上を組み合わせた分子もまた標識と見なされる。いずれの既知の標識も、開示されるプローブ、タグ、ならびに、開示される方法を使用して増幅された核酸を標識および検出するための方法とともに用いることができる。標識によって発生されたシグナルを検出および測定するための方法もまた、当業者に既知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーション測定または直接的な可視化によって検出することができ、蛍光分子は、蛍光分光光度計を用いて検出することができ、リン光分子は、分光光度計またはカメラによる直接的な可視化を用いて検出することができ、酵素は、その酵素によって触媒される反応の産物の検出または可視化によって検出することができ、抗体は、その抗体に結合された二次標識を検出することによって検出できる。本明細書で使用される場合、検出分子は、増幅された核酸と相互作用し、そこに１つ以上の標識が結合される分子である。
特定のｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡの発現の増加が起こったかどうか、または特定のｍＲＮＡが存在するかどうかを評価する１つの方法は、対照サンプルとの比較によるものであることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、対象において癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応を行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆し、組織サンプルは非癌性組織から得られる方法が、本明細書に開示される。ＡＬＫに関連する癌に関して、非癌性組織対照の使用が用いられてもよいが、ＡＬＫに関連しない癌由来の癌性組織もまた使用され得ることから、それは必ずしも必要ではないことをさらに理解されたい。したがって、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断することであって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆し、対照組織はＡＬＫに関連しない癌性組織から得られることが、本明細書に開示される。
開示される方法は、本明細書において「癌」と称される、無制御な細胞増殖が起こる任意の疾患を診断するために使用することができる。異なる種類のＡＬＫに関連する癌の非制限的なリストは以下の通りである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌、固形組織癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高グレード神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性癌、または癌一般。
開示される方法を使用して診断することができる癌の代表的ではあるが、非限定的なリストは以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌等）、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口腔、咽喉、咽頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌、乳癌および上皮癌、腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血器癌、精巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。
したがって、癌は、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、全身性組織球増殖症、乳癌、結腸直腸癌、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、および炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）からなる群から選択される、癌を診断する方法が、本明細書に開示される。例えば、対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことを含み、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆し、癌は、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、全身性組織球増殖症、乳癌、結腸直腸癌、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、および炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）からなる群から選択される方法が、本明細書に開示される。
ＡＬＫを対象とする治療の適合性を評価する方法
現在の理論に束縛されるものではないが、低分子薬候補を用いたこれらの形態のＡＬＫ遺伝子の阻害は、関連する異常な細胞増殖を抑止し、神経芽細胞腫および他のＡＬＫ関連腫瘍の細胞株におけるアポトーシスを促進すると考えられており、さらには、前臨床動物モデルおよびこれらの阻害剤を用いた初期臨床実験の両方により、ＡＬＫ低分子阻害剤は、ＡＬＫに関連する癌に対する著しい抗腫瘍活性を保持するだけでなく、制限的な標的に関連する毒性がなく、非常に優れた耐容性を示すことも示されている。
これらの発見は、ＡＬＫの突然変異に特化した診断テストの必要性を浮き彫りにする。例えば、そのようなアッセイは、遺伝性神経芽細胞腫に罹患する家族の子供をスクリーニングするために使用することができ、彼らがもっと治療を受け入れやすいより早期の段階での腫瘍検出を促進するのに役立つ。したがって、対象における癌に対するＡＬＫ阻害剤による治療の適合性を評価する方法であって、対象由来の組織サンプルからのｍＲＮＡを測定することを含み、対照に対するＡＬＫ配列のｍＲＮＡの量の増加は、ＡＬＫ阻害剤を用いて癌を治療することができることを示唆する方法が、本明細書に開示される。
本明細書に開示される開示されるｍＲＮＡ測定技法のいずれも、これらの方法において使用され得ることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、例えば、対象における癌に対するＡＬＫ阻害剤による治療の適合性を評価する方法であって、ｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を、または対象由来の組織サンプルからのＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行うことを含み、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、対照に対する増幅産物の量の増加は、ＡＬＫ阻害剤を用いて治療することができる癌を示唆する方法が、本明細書に開示される。開示される方法は、本明細書に開示されるプライマーのいずれをもさらに含むことができ、開示される多重化ＰＣＲ技術を利用することができることをさらに理解されたい。
ＡＬＫの点突然変異から生じるＡＬＫに関連する癌を診断する方法およびＡＬＫ阻害剤に対する耐性を評価する方法
ＡＬＫに関連する癌の治療後の、微小残存病変（ＭＲＤ）の検出の後続治療の決定に影響を与えるための予後診断の重要性および適切性は、本明細書に提唱されるような高感度かつ容易に実行される診断アッセイによって強化され得る。前臨床試験により、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−２３４１０６６等の低分子阻害剤に対する耐性を付与する広範囲のＡＬＫキナーゼドメインの点突然変異が同定されている。そのようなアッセイは、何年もの間臨床的に使用されてきたＧｌｅｅｖｅｃ等の阻害剤に対する耐性を付与する突然変異の予測のためのそれらの使用に基づいて、臨床的に関連性のある阻害剤耐性突然変異を高度に予測することで知られる。
本開示は、患者への薬物治療を選択的に誘導し、かつ標的にするように使用することができる、高感度および特異的なＡＬＫ診断アッセイのための方法および組成物を含む。変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）、塩基切断配列走査（ＢＥＳＳ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）、コンフォメーション高感度ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、変性剤定濃度ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）、経時的温度勾配ゲル電気泳動（ＴＴＧＥ）、クリベースによる消化によって精製される断片長多型（ＣＦＬＰ）、ミスマッチの化学切断、ミスマッチの酵素切断、およびミスマッチ修復酵素等、数多くの未知の突然変異のための走査技術が、本明細書に開示される方法において使用され得る。一態様において、ＡＬＫ、またはＡＬＫに関連する癌に薬剤抵抗性を付与する突然変異内の癌遺伝子突然変異を検出するために、鋳型交換伸長反応（ＴＥＥＲ（商標））技術を用いて、単一ヌクレオチドまたはＡＬＫ遺伝子に関連する他の突然変異による変化を同定する方法が開示される。ＴＥＥＲ（商標）技術は、稀および新規の突然変異さえも含む、初期および薬剤抵抗性のＡＬＫ癌の両方に存在するそのようなＡＬＫ突然変異を同定することができる。ＴＥＥＲ技術は、米国特許第６，６１０，４８６号、米国特許第６，１５０，１０５号、および米国特許出願第１２／１５２，５１２号に記載されており、参照により、ヌクレオチド変異の検出に関するそれらの教示のために、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるＡＬＫに関連する核酸変異の検出のための方法は、癌等の疾患または状態の存在の検出または診断、核酸変異と関連する疾患または状態に対する感受性またはリスクを評価すること、疾患の進行を監視すること、および治療的処置に対する感受性または耐性の判定を含むが、これらに限定されない、多くの用途を有する。
同じ種類の変異（すなわち、２つの点突然変異間、または２つのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合間）を区別する場合があり得ることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、癌を診断するまたは治療の適合性を評価する開示される方法のいずれも、その方法から得られた任意のアンプリコンを配列決定することをさらに含み得ることを理解されたい。
スクリーニングの方法
本明細書に開示されるＡＬＫ融合および点突然変異は、癌治療薬の標的である。したがって、対象においてＡＬＫに関連する癌を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＡＬＫに関連する癌に罹患する対象から組織サンプルを得ることと、
ｂ）組織サンプルを薬剤に接触させることと、
ｃ）組織サンプルからｍＲＮＡを抽出することと、
ｄ）組織サンプルからのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことと、を含み、
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーとを含み、未処理の対照に対する増幅産物の量の減少は、薬剤がＡＬＫに関連する癌を阻害することができることを示唆する方法が、本明細書に開示される。
核酸
開示される方法および組成物は、種々の核酸を使用する。一般に、開示される方法において任意の核酸を使用することができる。例えば、開示される目的の核酸および開示される参照核酸は、獲得または評価される所望の分析および情報に基づいて選択され得る。開示される方法はまた、新規かつ改変された核酸を生成する。そのような核酸の性質および構造は、それらが本方法において生成および操作される様式によって確立される。したがって、例えば、伸長産物およびハイブリダイズ核酸が、開示される方法において生成される。本明細書で使用される場合、ハイブリダイズ核酸は、伸長産物および第二の核酸のハイブリッドである。
目的の核酸は、ヌクレオチド変異の有無の判定が所望される任意の核酸であり得ることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、例えば、目的の核酸は、参照核酸の野生型配列に相当する配列を含むことができる。開示される方法は、第１の核酸が参照核酸であり、第２の核酸が目的の核酸である場合、または第１の核酸が目的の核酸であり、第２の核酸が参照核酸である場合に実行することができることが、本明細書にさらに開示される。
参照核酸は、目的の核酸が比較される任意の核酸であり得ることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。典型的には、参照核酸は、既知の配列を有する（および／または、参照として目的の配列を有することが分かっている）。このことは、必要ではないが、参照配列が目的の核酸に近い関係であることが既知であるかまたは疑われる場合に有用である。例えば、単一のヌクレオチド変異が検出されることが望ましい場合、参照配列は、同じかまたは関連する生物もしくは個体からの同じ遺伝子または遺伝的要素に由来する核酸等の、目的の核酸の相同体であるかまたはそれに密接に一致する配列となるように、有用に選択することができる。したがって、例えば、参照核酸は、野生型配列を含むことができるか、または代替として、既知の突然変異、例えば、その有無が疾患または治療的処置に対する耐性に関連する変異を含む、既知の突然変異を含むことができることが本明細書において企図される。したがって、例えば、開示される方法は、目的の核酸を野生型配列（すなわち、突然変異を保有しないことが分かっている）を含む参照核酸と比較すること、および目的の核酸中の変異の有無を調べることによって、目的の核酸中の既知の突然変異の存在を検出または診断するために使用することができ、変動が存在しないことは突然変異が存在しないことを意味することが企図される。代替として、参照核酸は、既知の突然変異を有することができる。したがって、例えば、開示される方法は、目的の核酸を疾患に対する感受性を示す既知の突然変異を含む参照核酸と比較すること、および突然変異の有無を調べることによって、疾患または状態に対する感受性を検出するために使用することができ、突然変異の存在は、疾患を意味することが企図される。
本明細書において、「ヌクレオチド変異」という用語は、参照核酸のヌクレオチド配列に対する目的の核酸のヌクレオチド配列における任意の変化または相違を指す。したがって、ヌクレオチド変異は、参照核酸と目的の核酸（または、文脈において適当である場合、その相補体）との間の配列が異なる場合に起こると言える。したがって、例えば、核酸の特定の位置におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換は、参照核酸が対応する位置にＡを含むことを条件として、ヌクレオチド変異である。変異の判定は、参照核酸に基づくものであり、配列が野生型であるかどうかは示唆しないことを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、例えば、既知の突然変異を有する核酸が参照核酸として使用される場合、突然変異を保有しない核酸（野生型核酸を含む）は、（参照核酸に対して）ヌクレオチド変異を保有すると見なされるであろう。
ヌクレオチド
開示される方法および組成物は、種々のヌクレオチドを使用する。本出願および本明細書に開示される方法を通して、ヌクレオチドのための塩基の種類に言及がなされる。ある種の塩基について言及する場合、それは、核酸鎖中のヌクレオチドが基準塩基のうちの１つ以上の所定の組とハイブリダイズ（結合）可能である塩基を指すことを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。したがって、例えば、３種類のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドの存在下で伸長されるが、修飾ヌクレオチドと同じ種類の塩基を含むヌクレオチドの存在下では伸長されない伸長産物に言及がなされる場合、これは、例えば、修飾ヌクレオチドの塩基がアデニン（Ａ）である場合、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、例えば、グアニン（Ｇ），チミン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）であり得ることを意味する。これらの塩基の各々（４つの基準塩基を表す）は、４つの基準塩基のうちの異なる１つとハイブリダイズすることができ、したがって、各々が、本明細書に定義される異なる種類の塩基であると見なされる。別の例として、イノシン塩基は、主としてアデニンおよびシトシンと（ＤＮＡ中で）対になるため、それぞれがチミンおよびグアニンと対になるアデニンおよびシトシンとは異なる種類の塩基であると見なすことができるが、グアニンおよびチミンの塩基対形成は、イノシンのハイブリダイゼーションパターンと重複する（つまり、それと異ならない）ため、それぞれがシトシンおよびアデニンと対になるグアニンまたはチミンとは異なる種類の塩基ではない。
開示される方法および組成物において、任意の種類の修飾または代替の塩基を用いることができ、それは一般に、そのような塩基を用いるために使用される酵素の能力によってのみ制限される。多くの修飾されたならびに代替のヌクレオチドおよび塩基が既知であり、それらのいくつかは、以下におよび本明細書の他の箇所に記載される。そのような修飾されたおよび代替の塩基が表す塩基の種類は、本明細書に記載されるような塩基のための塩基形成のパターンによって決定することができる。したがって、例えば、修飾ヌクレオチドがアデニンである場合、主としてチミンと対になる任意の類似体、誘導体、修飾塩基、または変異型塩基は、アデニンと同じ種類の塩基であると見なされることとなる。換言すると、類似体、誘導体、修飾、または変異体が、別の塩基と同じ塩基形成のパターンを有する限り、同じ種類の塩基であると見なすことができる。修飾は、ヌクレオチドの糖基またはリン酸基に対して行うことができる。一般に、そのような修飾は、塩基の塩基形成パターンを変更しない。しかしながら、核酸鎖中のヌクレオチドの塩基形成パターンが、ヌクレオチド中の塩基の塩基型を決定する。
伸長産物中に組み込まれる修飾ヌクレオチド、および開示される方法において開示される物質によって選択的に除去される修飾ヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載されるように、開示される方法において必要な、機能する任意の修飾ヌクレオチドであり得る。修飾ヌクレオチドはまた、例えば、化学的修飾、酵素的修飾、またはその組み合わせによって、伸長産物等の既存の核酸鎖中で生成されてもよい。
多くの種類のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが既知であり、開示される方法において使用することができる。例えば、ヌクレオチドは修飾されたリン酸基を有し、および／または、修飾された糖基は１つ以上のヌクレアーゼに耐性であり得る。本明細書において、ヌクレアーゼ耐性は、任意の１つ以上のヌクレアーゼによる核酸からの除去に耐性であると定義される。一般的に、特定のヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性は、関連するヌクレアーゼの観点から定義することができる。したがって、例えば、開示される方法において特定のヌクレアーゼが用いられる場合、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドは、その特定のヌクレアーゼに対してのみ耐性である必要がある。有用なヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドの例として、チオ修飾ヌクレオチドおよびボラノ修飾ヌクレオチドが挙げられる。
核酸に基づく多様な分子が本明細書に開示される。本明細書では、これらおよび他の分子の非限定的な例について考察する。例えば、ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含有する分子であることを理解されたい。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を介して一緒に結合し、ヌクレオシド間結合を作製することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（アデニン、Ａ）、シトシン−１−イル（シトシン、Ｃ）、グアニン−９−イル（グアニン、Ｇ）、ウラシル−１−イル（ウラシル、Ｕ）、およびチミン−１−イル（チミン、Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸塩である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに対するいくつかの種類の修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕの天然および合成の修飾、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基、例えば、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒドロキサンチン−９−イル（イノシン、Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イルを含む。修飾された塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザアデニンおよび３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない。さらなる塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号（塩基修飾に関するその教示のために、その全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン等の特定のヌクレオチド類似体。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加することができる。しばしば、塩基修飾は、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル等の糖修飾と組み合わせて、二重鎖の安定性増加等の固有の特性を達成することができる。第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号等、塩基修飾の範囲について詳述および説明する多くの米国特許がある。これらの特許の各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチド類似体はまた、糖部分の修飾を含むことができる。糖部分に対する修飾は、リボースおよびデオキシリボースの天然の修飾ならびに合成の修飾を含む。糖修飾は、これらに限定されないが、２’位における以下の修飾を含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０、アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい）。２’糖修飾はまた、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ｎおよびｍは、１〜１０である）を含むが、これらに限定されない。
２’位における他の修飾は、これらに限定されないが、以下を含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾はまた、糖上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上のまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位で、および５’末端ヌクレオチドの５’位で作製されてもよい。修飾された糖はまた、ＣＨ２およびＳ等の架橋環酸素での修飾を含有するものを含む。ヌクレオチド糖類似体はまた、糖模倣物、例えばペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分を有してもよい。第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号等、そのような修飾された糖構造の調製を教示する多数の米国特許があり、これらの各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチド類似体はまた、リン酸部分において修飾することもできる。修飾されたリン酸部分は、２つのヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィン酸塩、ホスホラミデート、例えば、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含むように修飾され得るものを含むが、これらに限定されない。２つのヌクレオチドの間のこれらのリン酸結合または修飾されたリン酸結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を介してもよく、また３’−５’から５’−３’、もしくは２’−５’から５’−２’等の逆位の極性を含有してもよいことを理解されたい。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形態もまた含まれる。多くの米国特許が修飾されたリン酸塩を含有するヌクレオチドを作製および使用する方法を教授しており、それらには、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されず、これらのそれぞれが、参照することにより本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチド類似体は、単一の修飾を含有する必要があるだけであるが、部分のうちの１つに、または異なる部分間に、複数の修飾を含有してもよいことを理解されたい。
ヌクレオチド置換基は、ヌクレオチドと同様の機能特性を有する分子であるが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等のリン酸部分は含有しない。ヌクレオチド置換基は、ワトソン‐クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識する分子であるが、リン酸部分以外の部分によって一緒に結合される。ヌクレオチド置換基は、適切な標的核酸と相互作用するときに、二重らせん型の構造に一致することが可能である。
ヌクレオチド置換基は、リン酸部分および／もしくは糖部分が置換されているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド置換基は、標準的なリン原子を含有しない。リン酸の置換基は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合であり得る。これらは、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のものを含む。多数の米国特許が、これらの種類のリン酸置換を作製および使用する方法を開示しており、それには、限定されないが、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号を含み、これらのそれぞれが、参照することにより本明細書に組み込まれる。
また、ヌクレオチド置換において、ヌクレオチドの糖およびリン酸部分の両方が、例えば、アミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換されてもよいことを理解されたい。米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子を作製および使用する方法を教示しており、これらのそれぞれが、参照することにより本明細書に組み込まれる。
また、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に、他の種類の分子（コンジュゲート）を結合させることも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合させることができる。そのようなコンジュゲートは、コレステロール部分等の脂肪部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。多くの米国特許が、このようなコンジュゲートの調製について教示しており、それには、限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号を含み、これらのそれぞれが、参照することにより本明細書に組み込まれる。
ワトソン‐クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換基のワトソン‐クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換基のワトソン‐クリック面は、Ｃ２、Ｎ１およびＣ６位のプリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換基、ならびにＣ２、Ｎ３、Ｃ４位のピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換基を含む。
フーグスティーン相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の二重鎖ＤＮＡの主溝に露出されたフーグスティーン面で起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位、およびＣ６位の反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、通常、プライマーまたはプローブおよび遺伝子等の少なくとも２つの核酸分子間の配列誘導性の相互作用を意味する。配列誘導性の相互作用とは、ヌクレオチド特異的な様式で２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体の間で起こる相互作用を意味する。例えば、ＧがＣと相互作用すること、またはＡがＴと相互作用することは、配列誘導性の相互作用である。典型的には、配列誘導性の相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知の多くの条件およびパラメータによって影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、そのハイブリダイゼーションおよび洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって支配される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションのパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中のハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低くなるように選択された温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄とを含むことができる。温度および塩条件は、フィルターに固定された参照ＤＮＡのサンプルを標識された目的の核酸にハイブリダイズし、次いで、異なるストリンジェンシー条件下で洗浄する予備実験において、経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、通常、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションではより高い。その条件は、ストリンジェンシーを達成するために、上記のように、または当該分野で既知であるように用いられてもよい。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）、およびそれに続く６８℃での洗浄であり得る。所望の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が低下するにつれて、またさらには、変動性が探索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて、低下させることができる。同様に、所望の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相同性が増加するにつれて、またさらには、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて、増加させることができ、これらは全て当該技術分野で既知である。
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、他の核酸に結合した核酸のうち１つの量（パーセント）を考慮することによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、限定的な核酸のうちの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、非限定的な核酸に結合している場合である。通常、非限定的なプライマーは、例えば１０または１００または１０００倍過剰である。この種類のアッセイは、限定的および非限定的なプライマーの両者が、例えばそれらのｋｄの１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍低いか、または核酸分子のうちの１つのみが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍であるか、または１つもしくは両方の核酸分子が、それらのｋｄを超えるという条件下で行うことができる。
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、所望の酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素的操作を受けるプライマーのパーセントを考慮することによる。例えばいくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマーのうちの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的操作を受ける場合であり、例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸張であるならば、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子のうちの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長される場合である。条件はまた、製造者によって推奨される条件、または当該技術分野において、酵素による操作を行うのに適切であると示された条件を含む。
相同性と同様に、２つの核酸分子の間のハイブリダイゼーションのレベルを判定するための様々な方法が、本明細書に開示されることを理解されたい。これらの方法および条件は、２つの核酸分子の間に異なるハイブリダイゼーションの割合を提供する可能性があるが、別途記載のない限り、方法のうちのいずれかのパラメータを満たすことが十分であることを理解されたい。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが求められる場合、これらの方法のうちのいずれか一つにおいて必要とされるパラメータの範囲内でハイブリダイゼーションが起こる限り、それは本明細書に開示されると見なされる。
当業者は、ある組成物または方法が、集合的にまたは単独で、ハイブリダイゼーションを判定するためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合、それは本明細書に開示される組成物または方法であることを理解するということを理解されたい。
キット
本明細書に開示される方法を実践する際に使用することができる試薬を含むキットが、本明細書に開示される。具体的には、キットは、本明細書で考察される、または開示される方法の実践において有用であると理解される、任意の試薬または試薬の組み合わせを含むことができる。例えば、キットは、方法の特定の実施形態において考察される伸長、複製および増幅反応を行うための本明細書に開示される１つ以上プライマー、ならびに目的通りにプライマーを使用するために必要な緩衝液および酵素を含むことができる。
ＡＬＫに関連する融合を検出するためには、野生型ＡＬＫにハイブリダイズする逆方向プライマーを使用することができることを理解されたい。したがって、少なくとも１つの逆方向プライマーを含むキットであって、逆方向プライマーが、野生型ＡＬＫのキナーゼドメイン等の野生型ＡＬＫの一部にハイブリダイズする、キットが、本明細書に開示される。開示されるキットにおいて使用することができる逆方向プライマーの例として、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７が挙げられるが、これらに限定されない。また、本明細書に開示されるキットは、ＡＬＫまたは野生型ＡＬＫの融合パートナーに特異的にハイブリダイズする１つ以上の順方向プライマーを含むことができることを理解されたい。したがって、例えば、順方向プライマーは、野生型ＡＬＫ、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、クラスリン重鎖（ＣＬＴＣ）、Ｒａｎ結合タンパク質２（ＲＡＮＢＰ２）、ＳＥＣ３１Ｌ１、トロポミオシン−３（ＴＰＭ３）、トロポミオシン−４（ＴＰＭ４）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）（ＴＦＧＬ）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）（ＴＦＧＳ）、ＣＡＲＳ、ＡＬＯ１７、モエシン（ＭＳＮ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ９）、またはＴＲＫ融合遺伝子（特大）（ＴＦＧＸＬ）にハイブリダイズすることができる。本明細書に開示されるキットにおいて使用することができる順方向プライマーの非制限的なリストは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５９を含むが、これらに限定されない。当業者は、１つより多くのプライマー対を含み、例えば、配列番号７等の１つの逆方向プライマーおよび複数の逆方向プライマーを含み得るキットを有することが適切であることを理解することができる。したがって、野生型ＡＬＫ、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、クラスリン重鎖（ＣＬＴＣ）、Ｒａｎ結合タンパク質２（ＲＡＮＢＰ２）、ＳＥＣ３１Ｌ１、トロポミオシン−３（ＴＰＭ３）、トロポミオシン−４（ＴＰＭ４）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）（ＴＦＧＬ）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）（ＴＦＧＳ）、ＣＡＲＳ、ＡＬＯ１７、モエシン（ＭＳＮ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ９）、またはＴＲＫ融合遺伝子（特大）（ＴＦＧＸＬ）に特異的にハイブリダイズする１つ以上の順方向プライマーと、少なくとも１つの逆方向プライマーとを含むキットであって、逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、および配列番号５８等の野生型ＡＬＫ逆方向プライマーである、キットが、本明細書において具体的に企図される。
開示されるキットはまた、本明細書に開示される方法が適切に機能していることを確実にするため、およびアッセイ間の結果を正規化するための対照も含むことができることを理解されたい。したがって、例えば、陽性ｃＤＮＡ対照、陰性ｃＤＮＡ対象、および対照プライマー対が、本明細書に開示される。例えば、開示されるキットは、ヒトＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、Ｏサブユニット（ＡＴＰ５Ｏ）、ミトコンドリアタンパク質ｍＲＮＡをコードする核遺伝子；ヒトＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１α部分複合体、２，８ｋＤａ（ＮＤＵＦＡ２）、ｍＲＮＡ；ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ｍＲＮＡ；ヒトＨ３ヒストン、ファミリー３Ａ（Ｈ３Ｆ３Ａ）、ｍＲＮＡ；ヒトプロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、β型、４（ＰＳＭＢ４）、ｍＲＮＡ；ヒトリボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、転写物変異体１、ｍＲＮＡ；ヒト真核細胞翻訳開始因子４Ａ、アイソフォーム２（ＥＩＦ４Ａ２）、ｍＲＮＡ；ヒトリボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、ｍＲＮＡ；ヒトアデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡ特異的（ＡＤＡＲ）、転写物変異体１、ｍＲＮＡ；またはヒトチトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶｂ（ＣＯＸ５Ｂ）、ｍＲＮＡの検出のための対照プライマー対を含むことができる。プライマー対の例として、表１に見出されるプライマー対が挙げられるが、これらに限定されない。
表１
また、開示されるキットは、そのような他の試薬、および酵素（例えば、ポリメラーゼ）、緩衝液、滅菌水、反応管等の開示される方法を行うための材料を含んでもよいことを理解されたい。さらに、キットは、修飾ヌクレオチド、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド、および標識されたヌクレオチドを含むこともできる。また、開示されるキットは、本明細書に開示される方法を行うための説明書、およびＡＬＫ突然変異の存在を計算することを可能にするためのソフトウェアを含むことができる。
一態様において、開示されるキットは、サンプルが、野生型ＡＬＫ、既知のＡＬＫ融合、またはそれまで未同定であったＡＬＫ融合を含むかどうかを判定するために、１回のアッセイ実行において方法を同時にまたは別々に行うのに十分な材料を含むことができる。キットはまた、対照反応を実行するのに十分な材料も含む。したがって、一態様において、陽性Ｃｄｎａ対照反応管、陰性ｃＤＮＡ対照反応管、対照プライマー反応管、既知のＡＬＫ融合を検出するための反応管、野生型ＡＬＫを検出するための反応管、およびキナーゼ活性を検出するための反応管を備えるキットが、本明細書に開示される。
別の構成において、開示されるキットは、内部標準遺伝子に対してなされる測定に基づいて、ＡＬＫの状態、すなわち野生型の発現、キナーゼドメインの過剰発現、または融合突然変異の過剰発現を判定するために使用することができる。本開示の他の箇所に記載した内部標準遺伝子は、細胞周期、発達または環境因子とは関係なく、安定にかつ構成的に発現されると理解されたい。したがって、一態様において、ＡＬＫの状態は、ＡＬＫ（分子）／内部標準（分母）の方程式によって判定することができ、得られた商は、検査した組織、細胞株、または他のサンプルがＡＬＫ陽性またはＡＬＫ陰性のいずれかであることを示唆する結果の範囲である。特定の組織は異なるレベルの内部標準転写物を発現することを理解すると、ＡＬＫ陽性または陰性の状態を示唆するために決定される比率および商は、各組織および検体の種類ごとに別個に確立される。
本明細書に開示される組成物および開示される方法を実行するために必要な組成物は、別途特記のない限り、その特定の試薬または化合物のための当該技術分野において既知の任意の方法を使用して作製することができる。
核酸の合成
開示される核酸、例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、標準的な化学合成法を用いて作製することができるか、または酵素的方法もしくは任意の他の既知の方法を使用して生成することができる。そのような方法は、標準的な酵素消化およびその後のヌクレオチド断片の単離から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ １Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の８７００型自動合成機またはＡＢＩ３８０Ｂ型）を使用するシアノエチルホスホラミダイト法による純粋合成法にまでおよび得る。
以下の実施例は、本明細書で請求される化合物、組成物、物質、デバイスおよび／または方法が、どのように作製および評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されるが、それらは純粋に例示的なものであり、本開示を制限することは意図されない。数字（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保するべく努力がなされたが、ある程度の誤差および変動は考慮されるべきである。別途指示のない限り、割合は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近の圧力である。
Ａ．実施例１：血液系腫瘍および固形腫瘍（未分化大細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋全身性組織球増殖症、ＩＭＴ肉腫、非小細胞肺癌、食道扁平上皮癌、乳癌、結腸直腸癌）におけるＡＬＫ融合遺伝子
ＡＬＫの点突然変異は神経芽細胞腫において生じるが、いわゆる「ＡＬＫ融合」は、このチロシンキナーゼの最も一般的な突然変異を表す（図１）。上の標題に列挙した血液学的（血液系由来の）腫瘍および固形腫瘍の各々のサブセットは、ＡＬＫ融合によって引き起こされる。一例として、新規ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質は、日本人の非小細胞肺癌患者のほぼ７％に見られる。ＡＬＫ融合配列のＲＴ−ＰＣＲ検出を行うために、癌に罹患する対象から組織サンプルを得る。組織サンプルからｍＲＮＡを抽出する。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、少なくとも１つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いる。図２は、種々のプライマー対形成の例を示す。例えば、順方向プライマーは、細胞内ＡＬＫプライマー（プライマー１００）５’ＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴ（配列番号６）、細胞外ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合プライマー（プライマー１０３）５’ＴＧＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号３）、細胞外ＮＰＭ−ＡＬＫ融合プライマー（プライマー１０２）５’ＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴ（配列番号４）、細胞外ＣＴＬＣ−ＡＬＫ融合プライマー（プライマー１０５）５’ＧＡＧＡＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴ（配列番号５）、または非相同性領域からの細胞外野生型ＡＬＫプライマー（プライマー１０４）５’ＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴ（配列番号２）であってもよい。逆方向プライマーは、プライマー１０１：５’ＴＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＴＴＣＡ（配列番号７）であってもよい。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、表２に示すサイズの増幅産物（すなわち、アンプリコン）をもたらす。
表２
Ｂ．実施例２：鋳型交換伸長反応（ＴＥＥＲ）
鋳型交換伸長反応（ＴＥＥＲ）は、未知のまたは配列決定されていない核酸の鋳型を配列決定された鋳型と比較して、それらが同一であるかどうかを判定することができる方法の一種を指す。これは、配列決定産物はそれらが産生される鋳型に固有であるという事実に基づいている。開示される方法および組成物は、特定の形態のＴＥＥＲを含む。
もともと、鋳型交換伸長反応（ＴＥＥＲ）は、ホモ接合またはヘテロ接合の状態に存在する未知の生殖系列および体細胞突然変異を検出するために開発された。これは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて化学発光検出によって実証された。このプロセスは、マイクロタイターに基づく検出フォーマットに変換された。マイクロタイタープレートフォーマットにおいて、それはより高いスループットを有し、ＤＮＡの配列決定の前に、突然変異についてＤＮＡを迅速にスクリーニングするために使用することができる。配列走査法として、それは所与のサンプルについて特定の遺伝子における突然変異の可能性が極めて低い大きなサンプル集団をスクリーニングする際に有用である。ＴＥＥＲは、サンプルを迅速にスクリーニングし、突然変異を含有するものにフラグを立て、そうすることで、それらが配列決定されて突然変異が同定され得る。
ＴＥＥＲは、マイクロプレートフォーマットで突然変異を検出することが示された。ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートウェルを使用してビオチン化ＰＣＲ産物を固相に結合させる。固相におけるハイブリダイゼーションの間に、ホモ二重鎖分子およびヘテロ二重鎖分子が形成される。このプロセスの各工程は、マイクロタイタープレート中で容易に達成され、それによって、サンプルの取扱いおよび処理が大幅に簡素化される。
Ｃ．実施例３：挿入および欠失の検出
ＴＥＥＲは、挿入および欠失を容易に検出することができる。これらの突然変異は、挿入／欠失のポイントで、または単に変異３’（野生型伸長鎖上）でミスマッチを作製し、そこで配列フレームがシフトされる。これらの突然変異の検出は、長く伸びた同じヌクレオチドまたは反復配列が存在する領域において妨げられ得る。例えば、ストレッチが十分に長い場合、ヘアピンループが形成し始め、そのために挿入または欠失が締め出されて検出されない可能性があり得る。これらのストレッチの中央付近にある挿入または欠失は、末端にあるものよりも検出するのが困難である。
Ｄ．実施例４：ＴＥＥＲで選択された突然変異のリアルタイムＰＣＲ検出
マイクロプレートに化学物質を移す間、ＴＥＥＲが正常または野生型シグナルを上回る変異シグナルを選択していることが明白であった。それは、６０個の「正常な」単一塩基伸長のうち１つの「変異」からのシグナルを発生していた。ホモ二重鎖に対するヘテロ二重鎖シグナルの増加は劇的なものではなく、約４倍であったが、プロセスが作用しているという証拠を提供した。これは、マイクロプレート検出のノイズ比に対してシグナルを増加させる必要性と共に、ＤＮＡ配列決定によってそれをさらに特徴づけることができるように、ＰＣＲを用いて突然変異を増幅することができるかどうかを決定する。最初にＰＣＲを利用して突然変異を増幅することによって、稀な突然変異の迅速かつ高感度の検出が可能になる。陽性のサンプルを配列決定して、突然変異を局在化および特定することができる。配列の各塩基が分析されるように、４塩基の各々が別個の反応で標的化される。一旦、ＴＥＥＲ選択が行われると、１つのサンプルからの４つの反応産物を一緒に合わせて、１つのリアルタイムＰＣＲ検出反応で分析することができる。
ＴＥＥＲにおける最初の工程は、鋳型交換である。特定の塩基でランダムに修飾されたＰＣＲ増幅した野生型ＤＮＡを、潜在的な突然変異を有するサンプルから増幅したＤＮＡにハイブリダイズする。二重鎖ＤＮＡは、ＥｘｏＩＩＩによる分解を防ぐために一方の端にミスマッチを有し、反対の端には、固相結合のためのリンカープローブの連結を可能にするために３’凹部末端を有する。リンカーは、全ての標的がその相補体にハイブリダイズすること、およびそれが全長の伸長産物であることを確実にする。任意の不完全な伸長産物は連結されず、ストリンジェントな洗浄を用いることによってプレートから容易に除去される。ヘテロ二重鎖ＤＮＡを、野生型鎖の修飾されたヌクレオチドのみで特異的に切断する酵素または化学物質で処理する。潜在的に突然変異を含有する相補的な鎖は影響を受けない。これにより、配列における塩基の各々の出現を代表する無塩基部位のサブセットが作製される。これは、本質的に、インタクトな全長鋳型上の、標的塩基を差し引いた配列決定ラダーである。
ＴＥＥＲにおける次の工程は、エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いた伸長反応である。ここでは、αチオヌクレオチドが使用されている。ホウ素ヌクレオチドもまた使用できることを理解されたく、またそれが本明細書において企図される。３つの考えられるヌクレオチド突然変異を表す３つのαチオデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の混合物を、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅを用いた伸長反応に使用する。標的塩基にマッチするｄＮＴＰは存在しない。例えば、（ウラシルを介して）チミンが標的塩基である場合、伸長ヌクレオチドはαチオｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰとなる。
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、突然変異を選択するために使用することができる。チオヌクレオチドで終止する伸張産物は突然変異を表し、エキソヌクレアーゼＩＩＩに耐性を示す。非保護の野生型鋳型は分解される。
編集された野生型鎖は、今では突然変異のコピーを含有する。ポリメラーゼは、ＤＮＡを伸長するにつれて、ポリメラーゼに依存して、鎖置換または５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて、変異鋳型の末端へと進む。このプロセスは、固相から変異二重鎖を遊離させる。遊離されたＤＮＡは、マイクロプレートからリアルタイムＰＣＲ反応に直接移動することができる。
選択された変異鋳型は、リアルタイム蛍光順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用して特異的に増幅される。例えば、ＳＹＢＲ緑色色素、または伸長された後にのみ蛍光を発する蛍光発生ヘアピンプライマー、例えば、ＬＵＸプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が使用されてもよい。突然変異の部位が未知であるため、Ｔａｑｍａｎまたは二重標識ＦＲＥＴプローブ等のリアルタイムＰＣＲ用内部ハイブリダイゼーションプローブの使用は推奨されない。
Ｅ．実施例５：マイクロアレイの設計および製作
特定のＡＬＫ突然変異の同定のためのマイクロアレイ診断法の開発をここに記載する。１２個の考えられる突然変異および内部標準としての野生型ＡＬＫを検出することができる、４７個の固有の要素からなるＤＮＡマイクロアレイの製造が本明細書に開示される。インプット核酸プローブを最適化するために経験的な２つのシナリオを追及することができ、それは逆転写、または逆転写およびＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が関与する。サブクローニングしたＡＬＫ融合物および変異体の正確な検出に基づくインビトロ実行可能性は、プラスミドコンストラクトから、また、野生型ＡＬＫを含有する細胞株と様々な比率で混合したヒト癌細胞株を含有する種々の変異ＡＬＫの融合を使用して、実証することができる。ＡＬＫ突然変異は、肺癌生検標本から同定することができる。この研究は、利用可能な診断標準との基準となる比較試験、ＡＬＫ ＦＩＳＨアッセイ、および抗ＡＬＫ免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を含むことができる。
１．オリゴヌクレオチドの設計
ＡＬＫ融合パートナーの固有の５’領域を検出することにより、ＡＬＫの突然変異およびそれらの部分変異体を同定するためのストラテジーを設計した。一般に、このストラテジーは、接合部位全体にわたるＡＬＫのＭｒｎａの３’細胞内領域内の領域から融合パートナーの５’部分への逆転写ならびに伸長および／または増幅に基礎を置く。産生されたｃＤＮＡまたは増幅されたＤＮＡは、共有結合されたフルオロプローブで後標識され、マイクロアレイへのインプットとしての役割を果たす。３通りに印刷された、融合パートナーまたはＡＬＫのｃＤＮＡの５’領域内の異なる領域に相補的な２つのプローブは、マイクロアレイ捕捉ＤＮＡとしての役割を果たす。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出の位置により、一連の１０個のハウスキーピング内部標準転写物に対するＡＬＫおよび／またはＡＬＫ突然変異ならびにそれらの発現の存在を同定する（図３および表３）。
表３





ＯＬＩＧＯＡＮＬＹＺＥＲ ３．１（登録商標）プログラムを用いて、それぞれの合成したプローブを融解温度６５℃および５’融合パートナーまたはＡＬＫの固有のハイブリダイゼーション領域に最適化した。融解温度および約３０ヌクレオチドの長さは、最適化されたマイクロアレイ条件に関する報告に基づいて選択した。それらの精製および調製したガラススライドへのコンジュゲーションを可能にするように、プローブに５’モノメトキシトリチルＣ−６アミノリンカーを加えた。このリンカーは、化学的性質の最適化に基づいて選択した。最後に、理想的には融合パートナーの異なる領域にある各ＡＬＫ融合パートナーのための２つのプローブを合成し、ＤＮＡの三次構造の立体構造上の制限によってプローブの領域に対する結合が防止される場合の代替の同定方法を提供する。これらの基準は、内部標準の設計にも適用された。
ＰＣＲプライマー
それぞれの合成されたプライマーは、プログラムＯＬＩＧＯＡＮＬＹＺＥＲ ３．１（登録商標）を用いて、理論上の融解温度である６０℃、ならびに５’融合パートナーおよび３’ＡＬＫ細胞内ドメインの両方の固有の領域に再び最適化された。「普遍的なＡＬＫ逆方向プライマー」として定義されるプライマーは、逆転写工程に共通するプライマーとしての役割を果たす。他の列挙されるプライマーは、その後の推定上の標的のＰＣＲ工程および増幅を可能にする。これらの基準は、内部標準の設計にも適用された。
ＲＴ−ＰＣＲプライマーの最適化
ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは、推定上の標的ＤＮＡの産生のために、結合Ｔｍ６０℃に最適化した。これらのプライマーは、単一アンプリコン反応として最適化されているが、推定上の標的ＤＮＡの多重化を可能にするために、いくつかまたは全てがバッチ化されてもよい。図４は、各ＡＬＫ変異体から増幅された標的ＤＮＡおよび目的の融合物のゲル電気泳動を示す。利用したＰＣＲ増幅プロトコルは、９５℃で１５分を３５サイクル、９４℃で３０秒、５２℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１５分、および４℃であった。
当業者には、本発明の範囲または主旨から逸脱することなく、本発明において種々の修正および変形が行われ得ることが理解されよう。本発明の他の実施形態は、本明細書および本明細書に開示される本発明の実践を考慮すると、当業者には明白であろう。本明細書および実施例は単なる例示であり、本発明の真の範囲および主旨は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
開示される方法および組成物は、記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されることを意図するものではないことを理解されたい。それは異なり得るからである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
本明細書の記載および特許請求の範囲と通して、「含む」という用語、および「含むこと」および「含む」等の該用語の変形は、「〜を含むが、それらに限定されない」ことを意味し、例えば、他の添加物、組成物、完全体または工程を除外することを意図するものではない。
当業者は、単なるルーチン実験を用いて、本明細書に記載される方法および組成物の特定の実施形態の多くの均等物を認識または確認するであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本発明の別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、対象由来の組織サンプルから、核酸変異、切断、またはＡＬＫ融合に関連する核酸の存在を検出すること、またはその量を測定することを含み、対照に対する増幅産物または標識プローブの量の増加は、ＡＬＫに関連する癌の存在を示唆する、方法。
〔２〕前記核酸は、前記サンプルに対して第１の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことによりｍＲＮＡレベルを測定することによって測定される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記核酸は、マイクロアレイによって測定される、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはマイクロアレイは、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーおよび少なくとも１つ以上の順方向プライマーの使用を含む、前記〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記逆方向プライマーは、ＡＬＫに結合する、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号５８である、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーは、野生型ＡＬＫ、キネシン１重鎖遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ）、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、クラスリン重鎖（ＣＬＴＣ）、Ｒａｎ結合タンパク質２（ＲＡＮＢＰ２）、ＳＥＣ３１Ｌ１、トロポミオシン−３（ＴＰＭ３）、トロポミオシン−４（ＴＰＭ４）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）（ＴＦＧL）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）（ＴＦＧS）、ＣＡＲＳ、ＡＬＯ１７、モエシン（ＭＳＮ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ９）、またはＴＲＫ融合遺伝子（特大）（ＴＦＧXL）にハイブリダイズする、前記〔４〕に記載の方法。
〔８〕前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５９からなる群から選択される、少なくとも１つの順方向プライマーを含む、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、または１５個以上の順方向プライマーを含む、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記マイクロアレイは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１からなる群から選択される、１つ以上のプローブの使用をさらに含む、前記〔４〕に記載の方法。
〔１１〕前記癌は、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔１２〕前記癌は、Ｖ４７６Ａ、Ｍ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する神経芽細胞腫である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記癌は、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する結腸直腸癌である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＬ５６０Ｆである、乳癌である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１５〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＡ８７７Ｓである、卵巣癌である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１６〕鋳型交換および伸長反応（ＴＥＥＲ）を使用して、前記組織サンプルから、核酸変異、切断、またはＡＬＫ融合の存在を検出することをさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１７〕第２のＲＴ−ＰＣＲ反応をさらに含み、前記第２のＲＴ−ＰＣＲ反応は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマー、および野生型ＡＬＫに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つ以上の順方向プライマーの使用を含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔１８〕第３のＲＴ−ＰＣＲ反応をさらに含み、前記第３のＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＡＬＫのキナーゼドメインのＡＬＫ配列５’および３’に特異的にハイブリダイズする順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記順方向プライマーのうちの少なくとも１つは、棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）またはヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）に特異的にハイブリダイズする、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕ＡＬＫキナーゼの調節不全の存在を検出する方法であって、対象から組織サンプルを得ることと、１つ以上のＡＬＫ融合の有無を検出することと、野生型ＡＬＫの有無を検出することと、ＡＬＫのキナーゼドメインの有無を検出することと、を含む、方法。
〔２１〕前記癌は、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫からなる群から選択される、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕前記癌は、Ｖ４７６Ａ、Ｍ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する神経芽細胞腫である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２３〕前記癌は、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する結腸直腸癌である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２４〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＬ５６０Ｆである、乳癌である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２５〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＡ８７７Ｓである、卵巣癌である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２６〕前記ＡＬＫポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイによって検出される、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２７〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはマイクロアレイは、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマー、および既知のＡＬＫ融合パートナーに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つ以上の順方向プライマーの使用を含む、前記〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号５８である、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕前記ＡＬＫ融合パートナーは、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、キネシン１重鎖遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ）、クラスリン重鎖（ＣＬＴＣ）、Ｒａｎ結合タンパク質２（ＲＡＮＢＰ２）、ＳＥＣ３１Ｌ１、トロポミオシン−３（ＴＰＭ３）、トロポミオシン−４（ＴＰＭ４）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）（ＴＦＧL）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）（ＴＦＧS）、ＣＡＲＳ、ＡＬＯ１７、モエシン（ＭＳＮ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ９）、またはＴＲＫ融合遺伝子（特大）（ＴＦＧXL）からなる群から選択される、前記〔２７〕に記載の方法。
〔３０〕前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５９からなる群から選択される、少なくとも１つの順方向プライマーを含む、前記〔２７〕に記載の方法。
〔３１〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはマイクロアレイは、野生型ＡＬＫに特異的にハイブリダイズすることができる順方向および逆方向プライマーの使用を含む、前記〔２６〕に記載の方法。
〔３２〕前記順方向プライマーは、配列番号３３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択される、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号５８からなる群から選択される、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３４〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはマイクロアレイは、ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズすることができる順方向および逆方向プライマーの使用を含む、前記〔２６〕に記載の方法。
〔３５〕前記順方向プライマーは、配列番号４５および配列番号４８からなる群から選択される、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３６〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号５８からなる群から選択される、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３７〕対象においてＡＬＫに関連する癌を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＡＬＫに関連する癌に罹患している対象から組織サンプルを得ることと、
ｂ）前記組織サンプルを薬剤に接触させることと、
ｃ）前記組織サンプルからｍＲＮＡを抽出することと、
ｄ）前記組織サンプルからの前記ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことと、を含み、
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーと、を含み、未処理の対照に対する増幅産物の量の減少は、薬剤がＡＬＫに関連する癌を阻害することができることを示唆する、方法。
〔３８〕ＡＬＫに関連する癌を診断するためのキットであって、（ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆方向プライマーであり、前記逆方向プライマーは、配列番号１またはその補体のアミノ酸配列をコードする第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、（ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、順方向プライマーであり、前記順方向プライマーは、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、キネシン１重鎖遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ）、クラスリン重鎖（ＣＬＴＣ）、Ｒａｎ結合タンパク質２（ＲＡＮＢＰ２）、ＳＥＣ３１Ｌ１、トロポミオシン−３（ＴＰＭ３）、トロポミオシン−４（ＴＰＭ４）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）（ＴＦＧL）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）（ＴＦＧS）、ＣＡＲＳ、ＡＬＯ１７、モエシン（ＭＳＮ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ９）、ＴＲＫ融合遺伝子（特大）（ＴＦＧXL）、棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）、またはヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）をコードする第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第２のプライマーと、を含む、キット。
〔３９〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号５８である、前記〔３８〕に記載のキット。
〔４０〕前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５５、および配列番号５９からなる群から選択される、少なくとも１つの順方向プライマーを含む、前記〔３８〕に記載のキット。
〔４１〕５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、キネシン１重鎖遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ）、クラスリン重鎖（ＣＬＴＣ）、Ｒａｎ結合タンパク質２（ＲＡＮＢＰ２）、ＳＥＣ３１Ｌ１、トロポミオシン−３（ＴＰＭ３）、トロポミオシン−４（ＴＰＭ４）、ＴＲＫ融合遺伝子（大）（ＴＦＧL）、ＴＲＫ融合遺伝子（小）（ＴＦＧS）、ＣＡＲＳ、ＡＬＯ１７、モエシン（ＭＳＮ）、非筋肉ミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ９）、ＴＲＫ融合遺伝子（特大）（ＴＦＧXL）、棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）、またはヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）のうちの１つ以上に特異的にハイブリダイズする、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、またはそれら以上の順方向プライマーを含む、前記〔３８〕に記載のキット。
〔４２〕野生型ＡＬＫに特異的にハイブリダイズする順方向プライマーをさらに含む、前記〔３８〕に記載のキット。
〔４３〕前記順方向プライマーは、配列番号３３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択される、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４４〕前記ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズする順方向プライマーをさらに含む、前記〔３８〕に記載のキット。
〔４５〕前記順方向プライマーは、配列番号４５および配列番号４８からなる群から選択される、前記〔４４〕に記載のキット。
〔４６〕対照プライマー対をさらに含む、前記〔３８〕に記載のキット。
〔４７〕前記対照プライマー対は、ＣＯＸ５Ｂに特異的にハイブリダイズする、前記〔４６〕に記載のキット。
〔４８〕前記第１および第２のプライマーは、それぞれ、第１および第２の検出試薬で標識される、前記〔３８〕に記載のキット。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１'〕対象において未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に関連する癌を診断する方法であって、前記対象由来の組織サンプルにおいて、核酸増幅プロセスを行うこと、並びに前記組織サンプル中の野生型ＡＬＫ及びＡＬＫキナーゼドメインに関連する核酸の存在を検出するかまたはその量を測定することを含む、前記方法。
〔２'〕前記核酸核酸増幅プロセスが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）又はリアルタイムＰＣＲである、前記〔１'〕に記載の方法。
〔３'〕前記ＲＴ−ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ反応が、野生型ＡＬＫに特異的にハイブリダイズする順方向及び逆方向プライマー対、並びに野生型ＡＬＫキナーゼドメイン配列に特異的にハイブリダイズする順方向及び逆方向プライマー対を含む、前記〔２'〕に記載の方法。
〔４'〕少なくとも１つの逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号６６である、前記〔３'〕に記載の方法。
〔５'〕少なくとも１つの順方向プライマーは、配列番号２、配列番号６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６５又は配列番号６７を含む、前記〔３'〕に記載の方法。
〔６'〕少なくとも１つの順方向プライマーは、野生型ＡＬＫの細胞外領域にハイブリダイズする、前記〔３'〕に記載の方法。
〔７'〕前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号６５である、前記〔６'〕に記載の方法。
〔８'〕前記ＲＴ−ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ反応が、ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズすることができる順方向プライマーを含む、前記〔２'〕に記載の方法。
〔９'〕前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７である、前記〔８'〕に記載の方法。
〔１０'〕前記癌は、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫からなる群から選択される、前記〔１'〕に記載の方法。
〔１１'〕前記癌は、Ｖ４７６Ａ、Ｍ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する神経芽細胞腫である、前記〔１０'〕に記載の方法。
〔１２'〕前記癌は、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する結腸直腸癌である、前記〔１０'〕に記載の方法。
〔１３'〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＬ５６０Ｆである、乳癌である、前記〔１０'〕に記載の方法。
〔１４'〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＡ８７７Ｓである、卵巣癌である、前記〔１０'〕に記載の方法。
〔１５'〕対象由来の組織サンプル中のＡＬＫキナーゼの調節不全の存在を検出する方法であって、野生型ＡＬＫの有無を検出することと、ＡＬＫのキナーゼドメインの有無を検出することとを含む、前記方法。
〔１６'〕前記癌は、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫からなる群から選択される、前記〔１５'〕に記載の方法。
〔１７'〕前記癌は、Ｖ４７６Ａ、Ｍ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する神経芽細胞腫である、前記〔１５'〕に記載の方法。
〔１８'〕前記癌は、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する結腸直腸癌である、前記〔１５'〕に記載の方法。
〔１９'〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＬ５６０Ｆである、乳癌である、前記〔１５'〕に記載の方法。
〔２０'〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＡ８７７Ｓである、卵巣癌である、前記〔１５'〕に記載の方法。
〔２１'〕前記ＡＬＫポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲによって検出される、前記〔１５'〕に記載の方法。
〔２２'〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲは、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマー、および野生型ＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つ以上の順方向プライマーを含む、前記〔２１'〕に記載の方法。
〔２３'〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号６６である、前記〔２２'〕に記載の方法。
〔２４'〕前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーは、配列番号２、配列番号６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６５又は配列番号６７を含む、前記〔２２'〕に記載の方法。
〔２５'〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲは、野生型ＡＬＫの細胞外領域に特異的にハイブリダイズすることができる順方向および逆方向プライマーを含む、前記〔２２'〕に記載の方法。
〔２６'〕前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号６５である、前記〔２５'〕に記載の方法。
〔２７'〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲ反応は、ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズすることができる順方向プライマーの使用を含む、前記〔２２'〕に記載の方法。
〔２８'〕前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７である、前記〔２７'〕に記載の方法。
〔２９'〕対象においてＡＬＫに関連する癌を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、 ａ）ＡＬＫに関連する癌に罹患している対象から組織サンプルを得ることと、 ｂ）前記組織サンプルを薬剤に接触させることと、
ｃ）前記組織サンプルからｍＲＮＡを抽出することと、
ｄ）前記組織サンプルからの前記ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことと、を含み、
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマーと、少なくとも１つの順方向プライマーと、を含み、未処理の対照に対する増幅産物の量の減少は、薬剤がＡＬＫに関連する癌を阻害することができることを示唆する、方法。
〔３０'〕ＡＬＫに関連する癌を診断するためのキットであって、（ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆方向プライマーであり、前記逆方向プライマーは、配列番号１またはその補体のアミノ酸配列をコードする第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、（ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、順方向プライマーであり、前記順方向プライマーは、野生型ＡＬＫをコードする第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第２のプライマーと、を含む、キット。
〔３１'〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号６６である、前記〔３０'〕に記載のキット。
〔３２'〕前記順方向プライマーは、配列番号２、配列番号６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６５又は配列番号６７を含む、前記〔３０'〕に記載のキット。
〔３３'〕前記順方向プライマーは、野生型ＡＬＫの細胞外領域に特異的にハイブリダイズする、前記〔３２'〕に記載のキット。
〔３４'〕前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号６５である、前記〔３３'〕に記載のキット。
〔３５'〕前記順方向プライマーは、前記ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズする、前記〔３２'〕に記載のキット。
〔３６'〕前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７である、前記〔３５'〕に記載のキット。
〔３７'〕第二番目の順方向及び逆方向プライマーを更に含む、前記〔３０'〕に記載のキット。
〔３８'〕第一番目の順方向及び逆方向プライマーは、野生型ＡＬＫのキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズし、前記第二番目の順方向及び逆方向プライマーは、野生型ＡＬＫに特異的にハイブリダイズする、前記〔３７'〕に記載のキット。
〔３９'〕対照プライマー対をさらに含む、前記〔３０'〕に記載のキット。
〔４０'〕前記対照プライマー対は、ＣＯＸ５Ｂに特異的にハイブリダイズする、前記〔３９'〕に記載のキット。
〔４１'〕前記第１および第２のプライマーは、それぞれ、第１および第２の検出試薬で標識される、前記〔３０'〕に記載のキット。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１''〕組織サンプルにおいて未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）キナーゼドメインの存在を検出するかまたはその量を測定する方法であって、対象由来の組織サンプルにおいて、核酸増幅プロセスを行うこと、並びに前記組織サンプル中のＡＬＫキナーゼドメインの存在を検出するかまたはその量を測定することを含み、前記増幅プロセスにおいて使用されるプライマーが、ＡＬＫのキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズするプライマー対を含み、ＡＬＫキナーゼドメインの存在がＡＬＫ融合に関連する癌の存在を示唆するものである、前記方法。
〔２''〕前記核酸増幅プロセスが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）又はリアルタイムＰＣＲである、前記〔１''〕に記載の方法。
〔３''〕前記ＲＴ−ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ反応が、野生型ＡＬＫキナーゼドメイン配列に特異的にハイブリダイズする順方向及び逆方向プライマー対を含む、前記〔２''〕に記載の方法。
〔４''〕少なくとも１つの逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７又は配列番号５８である、前記〔３''〕に記載の方法。
〔５''〕少なくとも１つの順方向プライマーは、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７を含む、前記〔３''〕に記載の方法。
〔６''〕前記癌は、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫からなる群から選択される、前記〔１''〕に記載の方法。
〔７''〕前記癌は、Ｖ４７６Ａ、Ｍ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する神経芽細胞腫である、前記〔６''〕に記載の方法。
〔８''〕前記癌は、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する結腸直腸癌である、前記〔６''〕に記載の方法。
〔９''〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＬ５６０Ｆである、乳癌である、前記〔６''〕に記載の方法。
〔１０''〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＡ８７７Ｓである、卵巣癌である、前記〔６''〕に記載の方法。
〔１１''〕対象由来の組織サンプル中のＡＬＫポリヌクレオチドのキナーゼドメインの有無を検出する方法であって、野生型ＡＬＫポリヌクレオチドの有無を検出することと、ＡＬＫポリヌクレオチドのキナーゼドメインの有無を検出することとを含み、ＡＬＫポリヌクレオチドのキナーゼドメインの存在がＡＬＫキナーゼドメイン融合に関連する癌の存在を示唆するものである、前記方法。
〔１２''〕前記癌は、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、悪性組織球増殖症、および神経膠芽腫からなる群から選択される、前記〔１１''〕に記載の方法。
〔１３''〕前記癌は、Ｖ４７６Ａ、Ｍ１１６６Ｒ、Ａ１１６８Ｐ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｆ１１７４Ｉ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｒ１１９２Ｐ、Ｆ１２４５Ｃ、Ｆ１２４５Ｖ、Ｆ１２４５Ｌ、Ｆ１２４５Ｉ、Ｉ１２５０Ｔ、およびＲ１２７５Ｑからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する神経芽細胞腫である、前記〔１１''〕に記載の方法。
〔１４''〕前記癌は、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、およびＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点突然変異を有する結腸直腸癌である、前記〔１１''〕に記載の方法。
〔１５''〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＬ５６０Ｆである、乳癌である、前記〔１１''〕に記載の方法。
〔１６''〕前記癌は、ＡＬＫに関連する点突然変異を有し、前記点突然変異はＡ８７７Ｓである、卵巣癌である、前記〔１１''〕に記載の方法。
〔１７''〕前記ＡＬＫポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲによって検出される、前記〔１１''〕に記載の方法。
〔１８''〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲは、１つ以上のＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマー、および野生型ＡＬＫ配列に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つ以上の順方向プライマーを含む、前記〔１７''〕に記載の方法。
〔１９''〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号６６である、前記〔１８''〕に記載の方法。
〔２０''〕前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーは、配列番号２、配列番号６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６５又は配列番号６７を含む、前記〔１８''〕に記載の方法。
〔２１''〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲは、野生型ＡＬＫの細胞外領域に特異的にハイブリダイズすることができる順方向および逆方向プライマーを含む、前記〔１８''〕に記載の方法。
〔２２''〕前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号６５である、前記〔２１''〕に記載の方法。
〔２３''〕前記ＲＴ−ＰＣＲ反応またはリアルタイムＰＣＲ反応は、ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズすることができる順方向プライマーの使用を含む、前記〔１８''〕に記載の方法。
〔２４''〕前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７である、前記〔２３''〕に記載の方法。
〔２５''〕ＡＬＫ融合に関連する癌を診断するためのキットであって、（ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆方向プライマーであり、前記逆方向プライマーは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする第１のポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、（ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、順方向プライマーであり、前記順方向プライマーは、野生型ＡＬＫをコードする第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第２のプライマーと、を含む、キット。
〔２６''〕前記逆方向プライマーは、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号６６である、前記〔２５''〕に記載のキット。
〔２７''〕前記順方向プライマーは、配列番号２、配列番号６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６５又は配列番号６７を含む、前記〔２５''〕に記載のキット。
〔２８''〕前記順方向プライマーは、野生型ＡＬＫの細胞外領域に特異的にハイブリダイズする、前記〔２７''〕に記載のキット。
〔２９''〕前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号６５である、前記〔２８''〕に記載のキット。
〔３０''〕前記順方向プライマーは、前記ＡＬＫキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズする、前記〔２７''〕に記載のキット。
〔３１''〕前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７である、前記〔３０''〕に記載のキット。
〔３２''〕第二番目の順方向及び逆方向プライマーを更に含む、前記〔２５''〕に記載のキット。
〔３３''〕第一番目の順方向及び逆方向プライマーは、野生型ＡＬＫのキナーゼドメインに特異的にハイブリダイズし、前記第二番目の順方向及び逆方向プライマーは、野生型ＡＬＫに特異的にハイブリダイズする、前記〔３２''〕に記載のキット。
〔３４''〕配列番号１で示される野生型ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの順方向プライマーを更に含む、前記〔３''〕に記載の方法。
〔３５''〕野生型ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号６５からなるプライマーの群から選択される、前記〔３４''〕に記載の方法。
〔３６''〕配列番号１で示される野生型ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの逆方向プライマーを更に含む、前記〔３４''〕に記載の方法。
〔３７''〕野生型ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする前記逆方向プライマーが、配列番号６６である、前記〔３６''〕に記載の方法。
〔３８''〕少なくとも１つのプライマーがスコーピオンプライマーである、前記〔３''〕に記載の方法。
〔３９''〕前記〔１''〕に記載の方法に従ってＡＬＫキナーゼドメインの存在を検出するかまたはその量を測定するためのキットであって、（ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆方向プライマーであり、前記逆方向プライマーは、配列番号１のキナーゼドメインのアミノ酸配列をコードする第１のポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、（ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、順方向プライマーであり、前記順方向プライマーは、野生型ＡＬＫをコードする第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第２のプライマーと、を含む、キット。
〔４０''〕少なくとも１つのプライマーがスコーピオンプライマーである、前記〔２５''〕又は〔３９''〕に記載のキット。
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Claims (29)

  1. 癌組織サンプルにおいて未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）融合の存在を検出するか又はその量を測定する方法であって、対象由来の前記癌組織サンプルにおいて、核酸増幅プロセスを行うこと、及び前記癌組織サンプル中のＡＬＫキナーゼドメインの存在を検出するか又はその量を測定することを含み、
    前記核酸増幅プロセスにおいて使用されるプライマーが、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー対を含み、
    前記核酸増幅プロセスが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われ、
    ＡＬＫキナーゼドメインの存在がＡＬＫ融合に関連する癌の存在を示すものであり、
    前記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、未分化大細胞リンパ腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、及び悪性組織球増殖症からなる群から選択される、
    前記方法。
  2. 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、ＡＬＫキナーゼドメインをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする順方向及び逆方向プライマー対の使用を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 少なくとも１つの逆方向プライマーが、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７又は配列番号５８である、請求項２に記載の方法。
  4. 少なくとも１つの順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５又は配列番号４８を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記癌が、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、及びＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点変異を有する結腸直腸癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記癌が、ＡＬＫに関連する点変異を有する乳癌であり、前記点変異がＬ５６０Ｆである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記癌が、ＡＬＫに関連する点変異を有する卵巣癌であり、前記点変異がＡ８７７Ｓである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  8. 対象由来の癌組織サンプル中のＡＬＫポリヌクレオチドのキナーゼドメインの融合の有無を検出する方法であって、前記対象由来の癌組織サンプルにおいて、核酸増幅プロセスを行うことと、野生型ＡＬＫポリヌクレオチドの有無を検出することと、ＡＬＫポリヌクレオチドのキナーゼドメインの有無を検出することとを含み、
    前記核酸増幅プロセスが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われ、
    ＡＬＫポリヌクレオチドのキナーゼドメインの存在がＡＬＫ融合に関連する癌の存在を示すものであり、
    前記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、未分化大細胞リンパ腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、及び悪性組織球増殖症からなる群から選択される、
    前記方法。
  9. 前記癌が、Ｒ４０１Ｑ、Ａ１１６８Ｐ、及びＶ７５７Ｍからなる群から選択される、１つ以上のＡＬＫに関連する点変異を有する結腸直腸癌である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記癌が、ＡＬＫに関連する点変異を有する乳癌であり、前記点変異がＬ５６０Ｆである、請求項８に記載の方法。
  11. 前記癌が、ＡＬＫに関連する点変異を有する卵巣癌であり、前記点変異がＡ８７７Ｓである、請求項８に記載の方法。
  12. 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、１つ以上のＡＬＫ配列をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる逆方向プライマー、及びＡＬＫ配列をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つ以上の順方向プライマーの使用を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記逆方向プライマーが、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７又は配列番号５８である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つ以上の順方向プライマーが、配列番号２、配列番号６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６５又は配列番号６７を含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる順方向及び逆方向プライマーの使用を含む、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号６５である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、ＡＬＫキナーゼドメインをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる順方向プライマーの使用を含む、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７である、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１に記載の方法に従ってＡＬＫ融合に関連する癌を診断するためのキットであって、
    （ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる核酸増幅プロセスにおいて用いられる第一番目の逆方向プライマーであり、前記第一番目の逆方向プライマーは、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸の第１のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、
    （ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる核酸増幅プロセスにおいて用いられる第一番目の順方向プライマーであり、前記第一番目の順方向プライマーは、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸の第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドであり、前記第２のポリヌクレオチドは前記第１のポリヌクレオチドの相補体である、第２のプライマーと
    を含み、
    前記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、未分化大細胞リンパ腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、及び悪性組織球増殖症からなる群から選択される、
    前記キット。
  20. 前記逆方向プライマーが、配列番号７、配列番号３２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７又は配列番号５８である、請求項１９に記載のキット。
  21. 前記順方向プライマーが、配列番号６、配列番号４５、配列番号４８又は配列番号６７を含む、請求項１９に記載のキット。
  22. 請求項８に記載の方法に従ってＡＬＫ融合に関連する癌を診断するためのキットであって、
    （ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる核酸増幅プロセスにおいて用いられる第一番目の逆方向プライマーであり、前記第一番目の逆方向プライマーは、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸の第１のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、
    （ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる核酸増幅プロセスにおいて用いられる第一番目の順方向プライマーであり、前記第一番目の順方向プライマーは、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸の第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドであり、前記第２のポリヌクレオチドは前記第１のポリヌクレオチドの相補体である、第２のプライマーと
    を含み、
    前記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、未分化大細胞リンパ腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、及び悪性組織球増殖症からなる群から選択され、
    前記キットが更に、野生型ＡＬＫをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする第二番目の順方向及び逆方向プライマーを含む、キット。
  23. 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、配列番号１で示されるＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの順方向プライマーの使用を更に含む、請求項２に記載の方法。
  24. ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする前記順方向プライマーが、配列番号２、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号６５からなるプライマーの群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、配列番号１で示されるＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの逆方向プライマーを更に含む、請求項２３に記載の方法。
  26. ＡＬＫの細胞外領域をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする前記逆方向プライマーが、配列番号６６である、請求項２５に記載の方法。
  27. 少なくとも１つのプライマーがスコーピオンプライマーである、請求項２に記載の方法。
  28. 請求項１に記載の方法に従ってＡＬＫキナーゼドメインの存在を診断若しくは検出するか又はその量を測定するためのキットであって、
    （ａ）第１の検出試薬で標識された第１のプライマーであって、前記第１のプライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる核酸増幅プロセスにおいて用いられる逆方向プライマーであり、前記逆方向プライマーは、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸の第１のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドである、第１のプライマーと、
    （ｂ）少なくとも１つの第２のプライマーであって、前記第２のプライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる核酸増幅プロセスにおいて用いられる順方向プライマーであり、前記順方向プライマーは、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする核酸の第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドであり、前記第２のポリヌクレオチドは前記第１のポリヌクレオチドの相補体である、第２のプライマーと、
    を含む、前記キット。
  29. 少なくとも１つのプライマーがスコーピオンプライマーである、請求項１９又は２８に記載のキット。
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