JP6396479B2 - キサントフモールの調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、抽出後のホップ粕、顆粒状ホップ植物またはホップから高純度キサントフモールを調製する方法を提供する。得られたキサントフモールは高純度であるため、その栄養補助食品や飲料への使用および治療薬成分としての使用に成功することができた。

キサントフモール（Ｘｎ）すなわち（（Ｅ）−１−［２，４−ジヒドロキシ−６−メトキシ−３−（３−メチルブタ−２−エニル）−フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン）はプレニル化カルコン群の天然に生じる化合物であり、その主要な供給源はホップ（学名：Ｈｕｍｕｌｕｓ Ｌｕｐｕｓ）の雌花序である。キサントフモールはビール中に微量にのみ存在する。この化合物はα，β−不飽和カルボニル部分によって結合された２つのベンゼン環からなる。

この分子中に遊離ヒドロキシ基が存在することで、フラボノイド生合成経路における中間体である適切なフラバノンに容易に異性化可能となる。ホップの他の成分とは対照的に、キサントフモールはより親油性であり、その特徴はその構造中のプレニル化置換基の存在と関連している。なお、生きている生物系では、プレニル化（ファルネシルまたはゲラニルゲラニル）部分により、数多くの細胞内分子のそれらの適切な活性を決定づける細胞膜への結合が容易になる。同様にキサントフモールの場合、そのような部分は化合物の生物活性を著しく調整することができ、さらにその物理化学的特性および細胞内分布に影響を与え得ることが示唆されている。

生体外および生体内研究により、キサントフモールが様々な機構により炎症および酸化過程を減少させることも示唆されている。その主要なものは、酸素フリーラジカルおよびその反応型（ＲＴＦ）の除去、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）活性阻害、プロスタグランジン、ＮＯ、ＴＮＦα、ＮＦκＢ生成の減少ならびに膜リン脂質の過酸化の中和である。

キサントフモールの抗酸化および抗炎症活性はその分子中のヒドロキシ基およびプレニル化置換基の存在と関連している。α，β−不飽和カルボニル部分も重要である。上記部分は、生物学的に重要な求核試薬、例えばタンパク質中のＬ−システインおよび他のスルフヒドリル基含有分子とのマイケル反応に関与している。そのようにして、キサントフモールにより結合された各種分子の生物活性の喪失を引き起こす共有結合付加物が得られる。

広範囲のキサントフモール活性は、その化合物の重要な生物学的分子に結合する能力から生じるものと思われる。最も良く知られている例の１つは、キサントフモールのポリメラーゼα合成酵素、トポイソメラーゼＩ、アルカリホスファターゼ、アロマターゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ＭＡＰＫシグナル伝達経路タンパク質、ＦＡＫキナーゼ、ＡｋｔおよびＳＴＡＴまたはＮＦ−κＢ転写因子への影響である。Ｘｎに誘発された前記タンパク質の活性低下は、腫瘍細胞における増殖、細胞周期、接着および遊走の妨害の結果としての多面的細胞効果をもたらす。

その神経保護特性に関する情報にも注目すべきである。生体内での局所脳虚血を反映したＭＣＡＯ誘発性局所虚血ラットモデルにおいて、キサントフモールは脳虚血性壊死領域を有意に減少させる。従って、キサントフモールはβ−アミロイドペプチド（Ａβ）によって誘発される神経毒性作用も低下させることが示唆されている。Ａβはフリーラジカル機構を媒介することが知られており、フリーラジカルの生成および神経細胞における脂質の過酸化を増加させ、その結果それらのアポトーシスを引き起こすアルツハイマー病の主な原因のうちの１つである。

さらに、その受容体に対する作用の他に、キサントフモールの活性機構はその脂質膜に対する選択的活性と関連しているものもある。キサントフモールのモデル脂質膜との相互作用機構に対する研究では、膜の動的および構造的特性の主要な修正が示されている。非常に小さい濃度のキサントフモールでさえ脂質膜の親水性断片と強く相互作用して二分子層の厚さの変化に影響を及ぼす。また、ネオニコチノイドはその高い疎水性により、非常に容易に脂質膜を透過することが知られている。キサントフモールの脂質膜との相互作用はネオニコチノイドによるその透過を有意に減少させることができ、これはニコチン受容体を遮断すること以外のその強い活性を説明することができる。

その化学構造については、キサントフモールはポリフェノールであるが、ポリフェノールとは対照的に熱水にほとんど溶けないがアルコールまたは水／アルコール混合物には容易に溶ける。

キサントフモールの良好な供給源は抽出後のホップ粕であり、ホップ粕はビール製造のための醸造産業によって使用されたホップの抽出物の製造から生じる廃棄物を含む。抽出後のホップ粕は、ホップ植物の種に応じて最大１％のキサントフモールを含有するものと推定されている。

キサントフモールの調製のための数多くの技術が当該技術分野で知られている。ドイツ特許出願公開第１９９３９３５０Ａ１号にはキサントフモール高含有ホップ抽出物の調製方法について記載されており、ここでは抽出のために水およびエタノールの混合物を使用した。得られた抽出物は５〜１５％のキサントフモールを含有していた。

欧州特許第１４２４３８５Ｂ１号は、５００バール超の圧力および６０℃超の温度下で溶媒として圧縮ＣＯ_２を使用してキサントフモール含有原料からキサントフモールを抽出する方法を開示している。

中国特許出願公開第１０１４４００２９号は、ホップ植物からキサントフモールを抽出する方法およびキサントフモール含有製品を開示しており、ここでは超音波によって支援される有機溶媒を用いた抽出を行った後、珪藻土と混合し、濾過し、水／メタノール混合物で洗浄し、濃縮、沈殿および乾燥して８６％の純度のキサントフモールを得る。

欧州特許第２１８７８９９Ｂ１号は、ホップ植物から高キサントフモール含有量の組成物を調製する方法を開示しており、ここでは０．０５〜５．０Ｍの範囲の濃度になるまで塩をキサントフモール含有溶液に添加した後、ｐＨを１０．５から１２．０に上昇させ、得られた沈殿物を濾過し、その濾液をｐＨ７〜８まで酸性化して４０〜９５％の純度のキサントフモール沈殿物を得る。

米国特許出願第１１／７９０，３６５号は、高（６０〜９０％）キサントフモール含有量の粉末の調製方法であって、キサントフモール高含有抽出物をアルカリ性溶液に懸濁させる工程と、不溶性生成物を分離する工程と、溶解したキサントフモールを酸で中和して沈殿させる工程と、その生成物を単離する工程とを含む方法を開示している。

中国特許第１０１４３３５９２号は、高純度キサントフモールを調製するための各種吸着樹脂の使用を開示している。

結論として、先行技術の分析は、高純度キサントフモールの単純かつ安価な調製方法を開発する必要性があることを明らかに示している。

この問題を、抽出後のホップ粕、顆粒状ホップ植物またはホップからキサントフモールを調製する新しく開発された方法によって解決する。

従って、本発明は、
ａ）キサントフモール含有抽出物を水と混合し、
ｂ）得られた混合物に遷移金属塩溶液を添加し、
ｃ）得られたキサントフモール沈殿物を回収および乾燥して９０％よりも高い純度のキサントフモールを得る
ことを特徴とする、キサントフモールの調製方法に関する。

好ましくは、工程ｂ）では混合物中の塩の濃度を０．００１Ｍ〜１０Ｍの範囲内に調整し、より好ましくは、工程ｂ）では混合物中の塩の濃度を０．００１Ｍ〜０．０５Ｍの範囲内または５Ｍ超に調整する。

好ましくは、工程ｂ）での塩の添加後にさらに、
ｂ１）その溶液を７を超えるｐＨレベルまでアルカリ化し、
ｂ２）最初の沈殿物を濾別し、その濾液を７未満のｐＨレベルまで酸性化し、
ｂ３）酸性化した濾液を濃縮してキサントフモール沈殿物を得る。

好ましくは、工程ｂ１）では上記溶液を７．５〜１０．５の範囲または１２超のｐＨレベルまでアルカリ化する。

好ましくは、抽出後のホップ粕、ホップ、顆粒状ホップ植物またはそれらの混合物を有機の水混和性溶媒で抽出してキサントフモール含有抽出物を得、その際、この溶媒を原料１ｋｇ当たり０．１〜１０リットルの量で使用する。

好ましくは、有機の水混和性溶媒として、ケトンおよびアルコールまたはそれらの混合物を使用し、より好ましくは、有機の水混和性溶媒として、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールまたはそれらの混合物を使用する。

好ましくは、５〜６５℃の範囲の温度で上記抽出を行う。

好ましくは、１リットルの抽出物当たり０．１〜５リットルの範囲の水の比でキサントフモール含有抽出物を水と混合し、より好ましくは、１リットルの抽出物当たり１〜３リットルの範囲の水の比でキサントフモール含有抽出物を水と混合する。

好ましくは、工程ｂ）では遷移金属塩の濃度は０．０１Ｍ〜０．０５Ｍの範囲内で得られる。

好ましくは、遷移金属塩として銅（ＩＩ）塩または亜鉛（ＩＩ）塩を使用する。

好ましくは、遷移金属塩として塩化物塩、硝酸塩または硫酸塩を使用する。

好ましくは、遷移金属塩として塩化銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）または塩化亜鉛（ＩＩ）または硫酸亜鉛（ＩＩ）を使用する。

本発明に係る方法により、良好な収率で少なくとも９０％（通常は９５％超）の純度のキサントフモールを得ることができる。本発明に係る方法は、複雑なクロマトグラフィーシステムまたは担持樹脂の使用を必要としない。

得られたキサントフモールの純度は、SUPELCOSIL LC-PAHカラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ、粒径：５μｍ、カラム温度：２０℃、相Ａ：９５％アセトニトリル／０．３％ＨＣＯＯＨ、相Ｂ：２％アセトニトリル／０．３％ＨＣＯＯＨ、流速：２ｍＬ／分、注入量：２０μｌ、検出：３７０〜２９０ｎｍの波長）でＨＰＬＣ技術により測定した。

本発明を以下の実施例により例示する。

実施例１
２５０ｇの抽出後のホップ粕を秤量し、アセトン（０．７５Ｌ）と共に注ぎ入れた。１時間の機械的撹拌後に、生じた抽出物を濾紙で濾過した。得られた濾液（０．６５Ｌ）を水（１．３Ｌ）で洗い流した。次いで、この溶液を１リットルの濾液当たり３００ｍＬの体積でＣｕＣｌ_２水溶液（濃度：１０ｇ／Ｌ）と共に添加した（最終濃度：０．０２２Ｍ）。塩化銅を添加した後、この溶液のｐＨを約４．５に安定化させた。実際には、塩化銅を注ぎ入れた直後に、抽出物中の沈殿物は、キサントフモールが発見された黄色の溶液から分離している残留するフムロンおよびクロロフィルからなる緑色の物質の凝集体として生じた。１時間後、ＮａＯＨを添加し、ｐＨを約１０に上昇させることにより過剰な銅を沈殿させた。１時間後、容器の底に泥状の塊および水酸化銅沈殿物からなる沈殿物が観察された。沈殿物を濾紙で濾別した。得られた濾液をＨＣｌでｐＨ６まで酸性化し、ロータリーエバポレーターで濃縮して結晶性キサントフモール沈殿物を得、これを濾別して乾燥器（温度：５０〜６０℃）で乾燥して９７．８％のＨＰＬＣ純度の２０６ｍｇのキサントフモールを得た。キサントフモール抽出プロセスの収率は、ホップ粕中のキサントフモールの総含有量に基づき８２％であった。

実施例２
塩化銅を添加した後に沈殿した緑色の汚泥を濾別し、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して９０．８％のＨＰＬＣ純度の結晶性キサントフモール沈殿物を得たこと以外は、実施例１と同様の方法でキサントフモールを得た。

実施例３
塩化銅を１０ｇ／Ｌの濃度の硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４）溶液で置き換えたこと以外は、実施例１と同様の方法でキサントフモールを得た。亜鉛塩溶液の添加後に、この溶液のｐＨを約６に安定化させ、沈殿が観察された。約１時間後に、ＮａＯＨを添加してｐＨを約１０まで上昇させた。１時間後に容器の底にさらなる沈殿物が観察された。沈殿物を濾紙で濾別した。得られた濾液をＨＣｌでｐＨ６まで酸性化し、ロータリーエバポレーターで濃縮して結晶性キサントフモール沈殿物を得、これを濾別して乾燥器（温度：５０〜６０℃）で乾燥して、ホップ粕中のキサントフモールの総含有量に基づき７９％の収率で９７．８％のＨＰＬＣ純度のキサントフモールを得た。

実施例４
２５０ｇの抽出後のホップ粕を秤量し、０．７５リットルの純粋なメタノールと共に注ぎ入れた。１時間の機械的撹拌後に、生じた抽出物を濾紙で濾過した。得られた濾液を水と共に１：２の体積比（２部の水に対して１部の濾液）で注ぎ入れた。次いで、この溶液を１リットルの濾液当たり３００ｍＬの体積でＣｕＣｌ_２水溶液（濃度：１０ｇ／Ｌ）と共に添加した（塩の最終濃度：０．０２２Ｍ）。１時間後、抽出物中に黄色の溶液から分離している緑色の物質からなる凝集体の沈殿が観察された。次いでＮａＯＨを添加してｐＨを１０まで上昇させた。１時間後、容器の底に泥状の緑色の沈殿物が観察された。生じた抽出物を濾紙で濾過した。得られた抽出物をＨＣｌでｐＨ６まで酸性化した。残った量の溶媒をエバポレーターで除去し、キサントフモール結晶の懸濁液を得た。この懸濁液を濾紙で濾過してキサントフモールを得、これを５５℃の乾燥器で乾燥してホップ粕中のキサントフモールの総含有量に基づき約７８％の収率で９５．８％の純度の１９６ｍｇのキサントフモールを得た。

実施例５
塩化銅（ＩＩ）の代わりに１０ｇ／Ｌの濃度の硫酸銅（ＩＩ）（ＣｕＳＯ_４）を使用して９４．８％の純度のキサントフモールを得たこと以外は、実施例４と同様の方法でキサントフモールを得た。

実施例６
０．０２２Ｍ〜０．０４４Ｍの範囲のより高濃度の塩化銅（ＩＩ）を使用したこと以外は、実施例１と同様の方法でキサントフモールを得た。９６．３〜９７．８％の範囲の純度を有するキサントフモールを得た。

実施例７
第１の工程からの抽出物と添加した水の量との比が１：１であり、０．０２２ＭのＣｕＣｌ_２濃度を使用して９６．８％の純度のキサントフモールを得たこと以外は、実施例１と同様の方法でキサントフモールを得た。

実施例８
アセトンの代わりに２−プロパノールを使用し、かつ０．０２２ＭのＣｕＣｌ_２濃度を使用して９３．８％の純度を有するキサントフモールを得たこと以外は、実施例１と同様の方法でキサントフモールを得た。

比較例１
２５０ｇの抽出後のホップ粕を秤量してアセトン（０．７５Ｌ）と共に注ぎ入れた。１時間の機械的撹拌後に、生じた抽出物を濾紙で濾過した。得られた濾液を濃縮して３２．８％の純度のキサントフモールを得た。

比較例２
２５０ｇの抽出後のホップ粕を秤量してアセトン（０．７５Ｌ）と共に注ぎ入れた。１時間の機械的撹拌後に、生じた抽出物を濾紙で濾過した。得られた濾液（０．６５Ｌ）を水（１．３Ｌ）と共に注ぎ入れた。次いで、この溶液を１リットルの濾液当たり３００ｍＬの体積でＮａＣｌ水溶液（濃度：３０ｇ／Ｌ）と共に添加した。次いで、ＮａＯＨを添加してｐＨを約１２まで上昇させた。形成された沈殿物を濾紙で濾別した。得られた濾液をＨＣｌでｐＨ５まで酸性化し、ロータリーエバポレーターで濃縮してキサントフモール沈殿物を得、これを濾別して乾燥器（温度：５０〜６０℃）で乾燥して８４．８％のＨＰＬＣ純度のキサントフモールを得た。

比較例３
ＮａＣｌを使用しなかったこと以外は比較例２と同じ方法でキサントフモールを得た。ｐＨ１２までアルカリ化しただけで５８％のＨＰＬＣ純度のキサントフモールを得た。

上記実施例に基づき、本発明に係る方法により非常に単純かつ安価な方法で高純度のキサントフモールを得ることができることを確認することができた。当業者には、本発明の方法によって得られたキサントフモールを公知の方法に従ってさらに精製できることは明らかである。

Claims (15)

1. ａ）キサントフモール含有抽出物を水と混合し、
   ｂ）前記得られた混合物に遷移金属塩溶液を添加し、
   ｃ）前記得られたキサントフモール沈殿物を回収および乾燥して９０％よりも高い純度のキサントフモールを得る
   ことを特徴とする、キサントフモールの調製方法。
2. 工程ｂ）では前記混合物中の前記塩の濃度を０．００１Ｍ〜１０Ｍの範囲内に調整することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｂ）では前記混合物中の前記塩の濃度を０．００１Ｍ〜０．０５Ｍの範囲内に調整することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 工程ｂ）での前記塩の添加後にさらに、
   ｂ１）工程ｂ）において混合物に遷移金属塩溶液を添加して得られた溶液を７超のｐＨレベルまでアルカリ化し、
   ｂ２）最初の沈殿物を濾別し、かつ前記濾液を７未満のｐＨレベルまで酸性化し、
   ｂ３）前記酸性化した濾液を濃縮して前記キサントフモール沈殿物を得る
   ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 工程ｂ１）では前記溶液を７．５〜１０．５の範囲のｐＨレベルまでアルカリ化することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 抽出後のホップ粕、ホップ、顆粒状ホップ植物またはそれらの混合物を有機の水混和性溶媒で抽出して前記キサントフモール含有抽出物を得、その際、前記溶媒を１ｋｇの原料当たり０．１〜１０リットルの量で使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 有機の水混和性溶媒として、ケトンおよびアルコールまたはそれらの混合物を使用することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 有機の水混和性溶媒として、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールまたはそれらの混合物を使用することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. ５〜６５℃の範囲の温度で前記抽出を行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. １リットルの前記抽出物当たり０．１〜５リットルの範囲の水の比で前記キサントフモール含有抽出物を水と混合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. １リットルの前記抽出物当たり１〜３リットルの範囲の水の比で前記キサントフモール含有抽出物を水と混合することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 工程ｂ）では遷移金属塩の濃度は０．０１Ｍ〜０．０５Ｍの範囲内で得られることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 遷移金属塩として、銅（ＩＩ）塩または亜鉛（ＩＩ）塩を使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 遷移金属塩として、塩化物塩、硝酸塩または硫酸塩を使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
15. 遷移金属塩として、塩化銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、塩化亜鉛（ＩＩ）または硫酸亜鉛（ＩＩ）を使用することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。