KR101153344B1

KR101153344B1 - 캠페리트린 분리 및 정제 방법

Info

Publication number: KR101153344B1
Application number: KR1020100055814A
Authority: KR
Inventors: 이근하; 주철규; 주일우; 정용철; 이범천
Original assignee: (주)모아캠
Priority date: 2010-06-14
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2012-06-05
Also published as: KR20110136052A

Abstract

본 발명은 양마 잎에 다량으로 존재하는 플라보노이드 화합물인 캠페리트린을 분리, 정제하는 방법에 관한 것으로 (a) 양마잎을 분말화하고 유기용매를 첨가하여 유효성분을 추출하는 단계 (b) 상기 (a) 단계에서 유효성분이 용출된 용액을 감압 농축하여 파우더를 수득하는 단계 (c) 상기 (b)단계에서 수득된 파우더를 물에 분산하여 잔존 오일을 유기용매를 이용하여 제거 후 초고압 처리 및 염석결정화하여 캠페리트린을 석출하는 단계 (d) 상기(c)단계에서 석출된 캠페리트린을 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 양마잎으로부터 고순도의 캠페리트린을 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

캠페리트린 분리 및 정제 방법{Kaempferitrin isolating and purifying method}

본 발명은 선택적인 추출?분리 공정을 통하여 식물로부터 플라보노이드 배당체인 캠페리트린(kaempferitrin)을 높은 수율과 높은 지표 성분함량으로 분리?정제하는 방법에 관한 것이다.

밧줄, 마대감으로 목질부가 많이 이용되어 온 양마는 아프리카, 인도에서 자생하는 쌍떡잎 식물로 아욱묵 아욱과의 한해살이풀이다. 잎에는 많은 양의 플라보노이드(Flavonoid)계 물질이 존재하며 그 중 캠페리트린이라고 명명되는 플라보노이드는 약 5~10%가 잎에 다량으로 존재하고 있다.

플라보노이드(Flavonoid)는 과일, 채소, 허브의 노란색(Flavus)을 구성하는 약 4,000여개의 화합물을 총칭하며 벤즈-감마-피론(benz-γ-pyrone)의 구조를 갖는 페놀성 화합물이다. 플라보노이드는 항바이러스작용, 항산화작용, 항염작용 외에도 암 발생을 낮추며 다양한 질병의 발생을 예방하는 것으로 알려져 있다. 플라보노이드는 수용성, 지용성 또는 그 중간극성 등 다양한 용해성을 나타내기 때문에 인체에 섭취될 경우 세포의 여러 부분에서 기능을 발휘한다는 것이 임상학적으로 많이 증명되고 있다. 캠페리트린은 항염효과[Food chemistry 117 (2009) 444-450], 항당뇨효과[Bioc. Biop. Res. Comm., 380 (2009) 39-43]등이 연구, 보고되어 있고 항산화 효능 및 항균 효능(한국공개특허 10-0815476)도 우수하다고 보고되어 있다.

이와 같이 인체 내에서 유용한 기능을 가지는 캠페리트린의 우수한 효과를 입증하는 연구를 위해서, 또한 이와 같이 유용한 캠페리트린을 이용하기 위해서는 많은 양의 캠페리트린의 분리가 요구되며, 경제적이며, 생산성이 뛰어난 캠페리트린의 고순도 분리정제 기술 개발이 요구된다.

현재까지 천연식물에서 활성성분을 지표성분수준으로 분리정제하는 기술은 실리카겔 매질 등 다공성 극성물질의 충진을 통한 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 기술과 Prep-HPLC (High Perpomance Liquid Chromatography)를 이용하여 분획을 통해 분리하는 방법 등에 국한되어 있다.

대한민국공개특허 특2002-0011553에서는 헥산-에틸아세테이트를 기울기 용출용매로 이용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피(Silicagel column chromatography)를 수행하여 플라보노이드 화합물을 분리, 제조하는 방법을 제시하였고, 대한민국공개특허 특2002-0090672에서는 실리카겔에 메칠렌클로라이드에 녹인 활성물질을 흡착시킨 후 용매 기울기 용리법을 이용하여 일차적으로 활성물질을 분리한 후 박막 크로마토그래피를 이용하여 몇 가지 분획으로 나누어 최종적으로 HPLC를 이용하여 순수한 화합물을 정제하는 방법을 제시하였다.

상기 방법들은 미량성분을 분리하는 공정에 있어 생산단가가 높아지고 수율이 낮으며, 생산시간이 오래 걸린다는 문제점이 있으며 다량의 유기용매를 사용하기 때문에 의약품, 식품 제조상 안전성의 문제를 발생시킬 수 있다. 따라서, 인체에 대한 안정성이 보장되고 경제적이며 생산성이 높은 천연물에서의 유효성분 분리, 정제 방법이 요구되고 있다.

현재까지 양마(Hibiscus cannabinus L.)에 대한 특허 및 연구논문으로는 대한민국공개특허 10-2009-0109025에서 천연섬유로 양마를 사용하되 전자빔을 사용하여 표면을 개질하여 표면 개질된 천연섬유와 폴리프로필렌 복합재료는 이증축 압축기를 사용하여 혼합하며 압축 성형 혹은 사출 성형에 의해 바이오복합재료로서 성형하는 제조방법을 제시하였고, 일본공개특허 10-2008-0107292에서는 양마를 사용하여 미립자 파우더를 제조하고 촉감을 향상시킬 수 있는 자동차 내장용 표피제를 제조하는 방법을 제시하였으며, 대한민국공개특허 10-2007-0111409 및 10-2010-0054450에서는 양마잎 부위를 메탄올로 추출하여 분리한 후 이에 대한 항균, 항산화, 미백실험을 통해 식품과 피부 미백용 외용제 조성물로 적용하기 위한 용도를 제시하였다.

상기와 같이 어떤 특허 및 연구논문에도 양마에 관해 유효한 활성물질인 캠페리트린을 분리 정제하는 방법을 목적으로 하는 특허 및 연구논문은 아직까지 개시된 바가 없었다.

본 발명은 천연물로부터 유효물질을 순수 분리 정제하는 방법에 관한 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 간편하고 선택적으로 순수한 캠페리트린을 고순도로 대량 분리 정제하는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 기존의 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리 정제 공정을 개선시키려 거듭 노력한 결과, 기존의 컬럼 크로마토그래피 및 Prep-HPLC 방법을 사용하지 않고도 선택도(selectivity) 및 기타 인자를 이용하여 천연물에 함유된 유용 활성물질인 캠페리트린을 대량 분리하고 고순도로 선별적으로 정제할 수 있음을 확인하였으며, 이에 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 양마 잎을 비롯하여 캠페리트린을 함유하는 천연물로부터 유효성분인 캠페리트린을 추출한 후, 캠페리트린이 물에 용해되지 않는 성질을 이용하여 저온에서 초고압 처리한 다음, 온도와 압력의 변화에 의해 평형상수가 변하고 용해도가 작아진 상태에서 염을 일정량 첨가하여 혼합액을 제조하면 염이 물에 이온포화 상태로 존재하게 되어 용해도 차이로 캠페리트린을 석출시킬 수 있음을 알게 되어 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 양마 등 캠페리트린을 함유하는 식물 추출물에서 초고압에 의한 압착 침출 및 염에 의한 염석결정법을 응용하여 다량의 캠페리트린을 얻는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 기존의 플라보노이드 화합물의 분리 및 정제 방법에 있어 기존의 컬럼 크로마토그래피 분리방법보다 더욱 높은 수율과 빠른 방법으로 단일물질을 수득하여 상업적으로 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 캠페리트린 함유 식물 추출물을 저온 초고압 처리를 할 경우 온도와 압력의 변화에 따라 캠페리트린의 용해도가 감소하며 이에 염을 첨가하여 이온 포화용액 상태를 만들어 용해도 차이에 따라 선택적으로 유효성분을 추출하는 방법으로 효율적으로 캠페리트린을 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 캠페리트린 성분을 함유하는 식물 시료로부터 캠페리트린을 분리하는 방법에 있어서,

(a) 건조, 세절된 시료에 유기 용매(물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매)를 첨가하여 시료를 추출하는 공정;

(b) 유효성분이 추출된 시료 용액을 감압 농축하여 파우더를 수득하는 공정;

(c) 파우더를 물에 분산하고 유기용매(헥산, 클로로포름, 에테르, 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매)를 가하여 파우더에 잔존하는 오일을 제거하는 공정;

(d) 초고압 챔버 내 용매에 50 ~ 300 MPa의 초고압을 가하여 오일이 제거된 시료를 압착, 침출하여 캠페리트린을 용출하는 공정;

(e) 염을 이용하여 염석결정화 방법으로 용출된 캠페리트린을 분리하는 공정; 및

(f) 분리된 캠페리트린에 1차 정제용매를 가하여 교반 혼합한 후 건조한 다음 2차 정제용매를 50 ~ 90℃에서 가하여 캠페리트린을 결정화하는 공정;을 포함하는 고순도, 고수율 캠페리트린 분리방법을 제공한다.

상기에서, 단계 (a)의 유기용매는 바람직하게는 메탄올 및/또는 에탄올이 사용될 수 있으나 더욱 바람직하게는 에탄올을 사용한다. 에탄올을 사용할 경우 인체 내 독성에서 안전할 수 있으며, 헥산, 부탄올, 에틸 에테르, 메틸 에테르, 클로로포름, 증류수와 같이 일반적으로 식물의 유효성분 추출에 사용되는 용매를 사용한 경우에 비해 추출물의 생산 수율은 물론 추출물 중의 캠페리트린 함량에 있어서도 약 2 ~ 10 배 이상의 높은 효과를 나타낸다.

바람직하게는, 단계 (a)는 에탄올을 시료 중량의 약 5~20배, 더욱 바람직하게는 10배 첨가하고 12~50시간, 더욱 바람직하게는 24시간 침지하여 추출함으로써 높은 함량의 캠페리트린을 추출할 수 있다.

단계 (b)의 파우더 수득과정은 진공 감압, 바람직하게는 100hPa 이하, 더욱 바람직하게는 20hPa까지 감압하고 40 ~ 60℃ 조건에서 3~10시간, 바람직하게는 6시간 동안 감압 농축하여 파우더를 수득하였다.

한편, 단계 (c)의 유기용매로는 헥산이 바람직하며, 오일상의 선택적인 분리방법인 극성/비극성 분획법을 이용하여 감압 농축된 파우더로부터 오일성분을 제거한다.

단계 (c)에서 추출물 파우더에 바람직하게는 3~20배, 더욱 바람직하게는 10배의 증류수를 분산하고, 동량의 헥산을 첨가하여 수차례 혼합하고 비극성과 극성의 두 상이 서로 분리될 때까지 정치하여 헥산층(비극성)을 물층(극성)으로부터 분리하여 버린다.

단계 (d)의 초고압 처리과정은 바람직하게는 분리된 물층을 비닐팩에 넣어 밀봉한 후 50~300MPa, 더욱 바람직하게는 100MPa의 압력으로 30분 ~ 3시간, 더욱 바람직하게는 1시간 초고압 추출을 시행하여 압착 침출방식으로 캠페리트린을 용출시킨다.

그 후 단계 (e)에서 NaCl 또는 Na₂SO₄와 같은 염을 첨가함으로써 캠페리트린의 석출을 유도한다. 캠페리트린은 당이 붙어 있는 배당체 형태의 플라보노이드이기 때문에 친수성을 나타내지만, 물에서는 약한 용해성을 가지고 있어 분산된 형태를 지닌다.

"염석"이란 상기 단계가 염(예. 무기 염)의 존재 하에 바람직하게 수행되어 원하는 캠페리트린의 염을 수층으로부터 새로운 유기층으로 이동시킨다는 사실로부터 기원한다. 상기 염의 목적은 두 층 사이의 분배계수를 변화시키는 것이며 상기 전이를 향상시키기 위해 염 이외의 임의의 다른 "상-전이"제를 사용하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 측면에서 바람직한 염은 무기산의 금속염이고, 특히 그 수용액 형태이다. 많은 금속 염이 유용하나 알칼리 금속염(예. 나트륨으로부터의)이 바람직하다. 또한, 염의 포화 수용액을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

따라서 당업자에게 알려진 물에 용해성이 좋은 염이면 종류에 특별한 제한은 없으며, 바람직하게는 NaCl 및/또는 Na₂SO₄를 첨가하고 용액을 이온 포화상태로 만듦으로써 캠페리트린의 침전을 유도할 수 있다.

이 단계에서 얻어지는 결정을 HPLC 분석을 통해 측정하면 약 60% 이상의 순도를 나타낸다. 하지만 생리활성물질로서 사람에게 적용하기 위해서는 95% 이상의 순도를 가진 캠페리트린이 필요하고, 이를 위해서는 추가적으로 정제가 필요하다.

단계 (f)의 1차 정제용매로는 유기용매 : 정제수 = 1~2 : 1~2 혼합용매를 사용하며, 헥산:정제수 또는 클로로폼:정제수의 비율이 1:1 인것이 바람직하며, 시료 중량의 약 20배를 첨가하여 약 10~30분간, 더욱 바람직하게는 20분간 교반 혼합하는 것이 바람직하다. (f) 단계에서 2차 정제용매로는 물을 사용하며 50 ~ 90℃에서 정제가 잘되며, 원래 시료 속에 있던 불순물을 가열함으로써 용매 속으로 녹아들어가도록 하면 용액을 완전히 식힌 다음에도 계속 용해된 상태로 존재하여 이것을 여과지, 바람직하게는 공극이 1.2㎛인 여과지로 여과하면 순도가 높은 캠페리트린을 수득할 수 있다.

본 발명은 캠페리트린의 분리 정제방법으로 양마잎으로부터 고순도의 캠페리트린을 대량으로 생산하는 방법을 개발하였고, 그 제조방법으로 얻은 캠페리트린은 항염, 항당뇨에 효과가 있는 의약품 소재개발 및 천연 아토피 치료용 화장료 조성물에 경쟁력이 있을 것으로 기대하며 본 발명을 천연물 분리 정제에 응용함으로써 기존의 컬럼 크로마토그래피 분리 정제방법에서 나타나는 생산단가 및 수율, 시간의 문제점을 개선하여 기술적, 생산 원가적 경쟁력을 크게 발전시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 양마로부터 분리정제된 캠페리트린의 HPLC 성분분석 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 분리 정제 후 화합물의 적외선(Infrared) 스펙트럼을 나타낸다.
도 3는 분리 정제 후 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 분리 정제 후 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재 범위로 제한되는 것이 아님은 자명하다.

[실시예 1] 양마 추출물 제조

건조된 양마 잎 500g에 70% 에탄올을 10중량배 사용하여 1일간 침적시키고 혼합하여 이를 감압, 농축하여 건조된 에탄올 추출물을 얻었다. 이 건조된 에탄올 추출물을 캠페리트린 포화용액으로 만들기 위해 증류수로 10배 희석시켜 분산한 후 헥산(hexane) 분획여두를 이용하여 비극성 성분을 제거하고 양마 추출물을 얻었다.

[실시예 2] 양마 추출물의 초고압 처리

비극성 성분이 제거된 양마 추출물을 진공백에 담아 진공기(IS-100, Namwoong, Korea)를 이용하여 진공처리를 했다. 그 후 초고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 하기 표의 실시예의 조건인 50 ~ 100MPa(500 ~ 1,000bar), 2 ~ 25℃, 0.5 ~ 2h 조건으로 초고압 처리하여 석출되어 나오는 캠페리트린을 공극이 1.2㎛인 거름종이를 이용하여 거른 후 거름종이 위의 캠페리트린을 수득함으로써 여액과 분리하였다. 수득 후 105℃에서 완전히 건조시킨 후 정제하여 양마잎에서 캠페리트린 함량 대비 수득량을 산출하여 수득율(%)을 나타내었으며 압력과 온도, 초고압 처리시간을 변화시켜가며 여러 가지 조건의 실시예에서 캠페리트린을 제조하였고 일반 침적방법으로 양마 잎을 추출한 것을 대조예로 하였다.

	조건	캠페리트린 수득율 (%)	최종 생성시간 (h)
대조예	1atm (25℃, 1h)	0	-
대조예	1atm (2℃, 1h)	0	-
실시예	50MPa (25℃, 1h)	36.2	4
	50MPa (2℃, 1h)	40.3	3
	100MPa (25℃, 1h)	43.5	3
	100MPa (2℃, 1h)	46.2	2

상기 표에 나타난 바와 같이 압력이 높아질수록 물질의 용해도 및 융점의 변화에 따라 수득율이 늘었으며 또한 낮은 온도에서 수득율이 늘어남을 알 수 있었고 본 실험의 수득율은 캠페리트린이 더 이상 생성되지 않는 시간을 최종 생성시간으로 하여 실험한 것으로 대조예에 비하여 짧은 시간에 캠페리트린이 생성된 것을 알 수 있다.

	조건	수득율 (%)	최종 생성시간 (h)
대조예	1atm (25℃, 1h)	0	-
실시예	100MPa (25℃, 0.5h)	36.1	4
	100MPa (25℃, 1h)	42.9	3
	100MPa (25℃, 2h)	44.5	2

상기 표에서 나타난 바와 같이 초고압 처리 시간이 길어짐에 따라 수득율이 늘었으나 1시간 이후부터는 크게 증가하는 경향을 보이지 않으므로 초고압 처리는 1시간이 가장 적당함을 알 수 있다.

[실시예 3] 양마 추출물의 염석결정화

400rpm의 회전속도로 교반되는 믹서에 초고압 처리된 양마 추출물과 NaCl 또는 Na₂SO₄1 ~ 5중량%를 투입한 다음 5분간 교반하였다. 이를 2℃의 저온상태로 유지하여 재결정이 시작되었다. 3시간 후 생성된 결정을 여과한 다음 정제하였다.

상기 초고압 처리와 염석결정화의 추가공정을 통해 수득한 캠페리트린의 회수율을 비교한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	염 종류	투입량(%)	조건	수득율(%)
대조예	무첨가	-	2℃, 3시간	45.4
실시예	Na₂SO₄	1		49.2
		2		63.6
		5		74.5
	NaCl	1		48.5
		2		52.7
		5		54.8

상기 표 3과 같이 염의 투입 농도가 증가함에 따라 캠페리트린 수득율이 증가하는 것을 알 수 있다. 또한 NaCl에 비하여 Na₂SO₄에서 수득량이 크게 증가한 것을 알 수 있다. 이것은 NaCl이 Na₂SO₄와 비교해서 화학량론적 반응에 있어서 필요한 양(당량)의 차이 때문에 용액의 이온포화도에 영향을 적게 준 것이라고 유추할 수 있다.

[실시예 4] 결정물 정제

증류수와 헥산을 1:1 비율로 혼합하여 용매를 만든 후 수득한 캠페리트린을 첨가하여 비극성 성분과 기타 수용성성분을 제거하였다. 여기에 증류수를 첨가하여 50 ~ 90℃에서 비극성 성분 및 색소가 제거된 캠페리트린을 용해시킨 후 저온 상태(2℃)에서 냉각시켜 재결정화된 화합물을 얻었다. 이를 공극이 1㎛ 이상인 필터로 진공여과하여 필터 위에 걸러진 부분을 얻고 105℃에서 30분 가량 건조시켜 최종적으로 정제된 결정물을 얻었다.

[시험예 1] HPLC 분석을 통한 캠페리트린 정량분석

상기 실시예를 통해 분리 정제한 캠페리트린을 정량분석하기 위하여 HPLC(High pressure liquid chromatography)를 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2㎛ 여과지에 여과, 전처리한 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series, Agilent, USA)를 사용하여 UV 254 ~ 340㎚ 영역에서 분석하였으며, C₁₈컬럼(Zorbax XDB-C₁₈4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 초산 용매와 아세토나이트릴(Acetonitrile; ACN) 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 캠페리트린(kouting Chemical, China)을 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 표 4 및 도 1과 같다.

플라보노이드	캠페리트린 순도(%)	수득율(%)
캠페리트린	97.6(±1.6)	68.3(±5.1)

[시험예 2] 적외선 분광법을 통한 정성분석

적외선 분광기(Bio-Rad FTS)를 이용하여 상기 실시예를 통해 분리 정제한 화합물의 정성분석을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

IR _max: KBr ㎝^-13369(OH), 2984(CH₃), 1657(C=O), 1603,1493(C=C), 1449(cycloalkane), 1179(phenol)

상기 양마잎의 에탄올 추출물로부터 분리 정제한 화합물의 적외선 스펙트럼을 확인한 결과 OH, CH₃, C=O, C=C에서 흡수대가 나타나며 1449㎝^-1 부근에서 사이클로알케인(cycloalkane)에 의한 흡수가 나타났고, 1179㎝^-1에서 페놀의 흡수대가 나타나는 것으로 보아 이 화합물은 플라보노이드 배당체인 캠페리트린으로 추정되었다.

[시험예 3] NMR 분석을 통한 정성분석

NMR(Varian, Mercury 400MHz, CP-MAS)을 이용하여 상기 실시예를 통해 분리 정제한 화합물의 정성분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3, 도 4에 나타내었다.

¹H-NMR(400MHz, MeOH-d ₄) d 7.77(2H, d, J=8.8Hz, H-2'& 6'), 6.93(2H, d, J=8.8Hz, H-3' & 5'), 6.69(1H, d, J=2Hz, H-8), 6.43 (1H, d, J=2Hz, H-6), 5.84(1H, d, H-1"), 5.39 (1H, d, H-1"'), 1.27(3H, d, H-6"), 0.94(3H, d, H-6"')

¹³C-NMR(400MHz, MeOH-d ₄) d 179.7(C-4), 163.5(C-7), 162.9(C-5), 161.7(C-4'), 159.7(C-2), 158.0(C-9), 136.4(C-3), 132.0(C-2'), 132.0(C-6'), 122.3(C-1'), 116.5(C-3'), 116.5(C-5'), 107.5(C-10), 103.5(C-1"'), 101.4(C-1"), 99.8(C-6), 95.6(C-8), 73.6(C-4"), 73.1(C-4"'), 72.1(C-2"), 72.0(C-2"'), 71.9(C-3"), 71.9(C-3"'), 71.7(C-5"), 71.3(C-5"'), 18.1(C-6"), 17.7(C-6"')

상기 양마잎 추출물로부터 분리 정제한 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼에서 메타-커플링(meta coupling)하고 있는 두 방향족 양자(aromatic proton)의 신호[6.69(1H,d, J=2Hz, H-8), 6.43(1H, d, J=2Hz, H-6), 또 다른 2개의 메타-커플링 신호[7.77(2H, d, J=8.8Hz, H-2'& 6'), 6.93(2H, d, J=8.8Hz, H-3' & 5')] 및 아노머 양자 신호(anomeric proton signal)[5.84(1H, d, H-1"), 5.39 (1H, d, H-1"')]가 보이며, 2개의 람노스 메틸(rhamnose methyl)기로 추정되는 1.27(3H, d, H-6"), 0.94(3H, d, H-6"') 신호가 관측되었다. ¹³C-NMR 스펙트럼의 d 179.7, 163.5에서 4번과 7번의 탄소 신호가 관측되었고 162.9, 159.7에서 5번과 2번의 탄소 신호를 확인하였으며, 103.5(C-1"'), 101.4(C-1"), 73.6(C-4"), 73.1(C-4"'), 72.1(C-2"), 72.0(C-2"'), 71.9(C-3"), 71.9(C-3"'), 71.7(C-5"), 71.3(C-5"'), 18.1(C-6"), 17.7(C-6"')]은 L-람노스 유래 신호로서, 람노스가 2몰 존재함을 확인하여 이 화합물이 캠페리트린(kaempferitrin; kaempferol-3,7-α-L-rhamnoside)임을 확인하였다.

Claims

(a) 건조, 세절된 시료에 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 첨가하여 시료를 추출하는 공정;
(b) 상기 추출 시료 용액을 감압 농축하여 파우더를 수득하는 공정;
(c) 상기 파우더를 물에 분산하고 헥산, 클로로포름, 에테르, 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 가하여 파우더 내에 잔존하는 오일을 제거하는 공정;
(d) 초고압 챔버 내 용매에 초고압을 가하여 상기 오일이 제거된 시료를 압착 침출하여 캠페리트린을 용출하는 공정;
(e) 염을 이용하여 염석결정화 방법으로 캠페리트린을 분리하는 공정; 및
(f) 분리된 캠페리트린을 용매를 이용하여 정제한 후 건조하여 캠페리트린을 생산하는 공정을 포함하는 캠페리트린 분리 및 정제 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (d) 공정의 초고압은 압력 50 ~ 300MPa인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (e) 공정의 염은 NaCl 및 Na₂SO₄ 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (f) 공정의 용매를 이용한 정제 및 건조는
(가) 분리된 캠페리트린에 1차 정제용매를 가하여 교반, 혼합한 후 건조하는 공정; 및
(나) 상기 (가) 공정으로 건조된 캠페리트린에 2차 정제용매를 가하여 캠페리트린을 결정화하는 공정;을 포함함을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 (f) 공정의 1차 정제용매는 헥산:정제수 1:1 혼합용매 또는 클로로폼:정제수 1:1 혼합용매임을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 (f) 공정의 2차 정제용매는 물임을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 (f) 공정의 2차 정제용매의 온도는 50 ~ 90℃임을 특징으로 하는 방법.