JP6262196B2 - 標的配列の多様化のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年3月15日に出願された現在係属中の米国特許仮出願第61/611,446号における米国特許法§119(e)の下で利益を請求し、本出願は、その全体が参照によって本開示に援用される。
本願と関連する配列表は、紙での写しの代わりに、テキスト形式で提供され、それによって、本明細書に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、980087_402WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。上記テキストファイルは、約17KBであり、2013年3月13日に作製された。そして、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金R01 GM41712およびU54 AI081680の国庫補助によってなされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
本開示は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座に遺伝子を標的化すること、およびその中に上記遺伝子を組みこむことに関する。本明細書で開示されるベクター、組成物、および方法は、エキソビボ加速抗体進化のために特に有用である。
モノクローナル抗体(mAbs)は、治療学、診断学、および研究用試薬として十分に確立されているが、それらの使用は、所望の標的に対して必要とされる親和性および特異性を有するmAbを同定することに関連する困難およびコストによって、現在制限されている。多くの目的の標的は、非常に保存されたタンパク質であり、免疫調節の機構が生理学的免疫応答から得られ得る抗体の多様性を制限している。さらに、多くの重要な治療標的は、細胞表面タンパク質であり、このことは、それらの生理学的に活性なコンホメーションが特定の抗体を誘発するための免疫化に使用される精製タンパク質もしくは膜調製物によっては容易に再現されないので、mAbの開発に対する特別な挑戦を示す。これらの細胞表面成分は、特定の臨床上有用な状況に対するいくつかの特に価値の高い標的(例えば、サイトカインレセプターおよびGタンパク質共役レセプター)を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座へ組みこむための組換えポリヌクレオチドベクターであって、該ベクターは、
(a)ニワトリ免疫グロブリンV H 遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H −D−J H 遺伝子を含む標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJ H 遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、
ここで該標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンV H 領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H コード核酸配列と、DT40 V H 偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得る、ベクター。
(項目2)
前記標的遺伝子は、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載のベクター。
(項目3)
前記マーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)から選択される、項目2に記載のベクター。
(項目4)
前記体細胞超変異は、免疫グロブリンV H 相補性決定領域コード配列および免疫グロブリンV H フレームワーク領域コード配列のうちのいずれかもしくはその両方で起こる、項目1に記載のベクター。
(項目5)
複数の標的遺伝子を複数のニワトリ免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座に組みこむための複数の組換えポリヌクレオチドベクターを含む組成物であって、該ベクターの各々は、
(a)ニワトリ免疫グロブリンV H 遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H −D−J H 遺伝子を含む標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJ H 遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、
ここで該標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンV H 領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)該再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H コード核酸配列と、DT40 V H 偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得、
ここで該再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H −D−J H 遺伝子は、ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された、複数の再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H −D−J H 遺伝子から得られる、
組成物。
(項目6)
前記標的遺伝子は、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目5に記載の組成物。
(項目7)
前記マーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)から選択される、項目6に記載の組成物。
(項目8)
前記体細胞超変異は、免疫グロブリンV H 相補性決定領域コード配列および免疫グロブリンV H フレームワーク領域コード配列のうちのいずれかもしくはその両方で起こる、項目5に記載の組成物。
(項目9)
組成物であって、
(a)項目1〜4のいずれか1項に記載のベクター;ならびに
(b)第2の標的遺伝子を免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座に組みこむための第2のベクターであって、
(1)ニワトリ免疫グロブリンV L 遺伝子上流核酸配列領域;
(2)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L −J L 遺伝子を含む第2の標的遺伝子;および
(3)ニワトリ免疫グロブリンJ L 遺伝子下流核酸配列領域、
を含む、第2のベクター;
を含み、ここで該第2の標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンV L 領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L コード核酸配列と、DT40 V L 偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得る、組成物。
(項目10)
組成物であって、
(1)項目5〜8のいずれか1項に記載の組成物;ならびに
(2)複数の標的遺伝子を、複数のニワトリ免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座へ組みこむための1つまたは複数の組換えポリヌクレオチドベクターであって、該ベクターの各々は、
(a)ニワトリ免疫グロブリンV L 遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された、再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L −J L 遺伝子を含む第2の標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJ L 遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、ここで該第2の標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座へ組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンV L 領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L コード核酸配列と、DT40 V L 偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得、そして
ここで該再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L −J L 遺伝子は、ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団由来の複数の単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L −J L 遺伝子から得られる、
組成物。
(項目11)
前記第2の標的遺伝子は、第2のマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目9または10に記載の組成物。
(項目12)
前記第2のマーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)から選択される、項目11に記載の組成物。
(項目13)
前記体細胞超変異は、免疫グロブリンV L 相補性決定領域コード配列および免疫グロブリンV L フレームワーク領域コード配列のうちのいずれかもしくはその両方で起こる、項目9または10のいずれかに記載の組成物。
(項目14)
項目1〜4のいずれか1項に記載のベクター、または項目5〜8および9〜13のいずれか1項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
(項目15)
前記細胞は、細菌細胞である、項目14に記載の宿主細胞。
(項目16)
前記細胞は、ニワトリ細胞に由来する、項目14に記載の宿主細胞。
(項目17)
前記細胞は、ニワトリ嚢リンパ腫細胞である、項目14に記載の宿主細胞。
(項目18)
前記細胞は、DT40細胞である、項目14に記載の宿主細胞。
(項目19)
前記宿主細胞における免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座は、重合ラクトースオペレーターを含む、項目16〜18のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目20)
前記宿主細胞における免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座は、重合ラクトースオペレーターを含む、項目16〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目21)
項目14〜20のいずれか1項に記載の宿主細胞のライブラリー。
(項目22)
標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこむための方法であって、該方法は、
(a)ニワトリB細胞を項目1〜3のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトするか、またはニワトリB細胞を項目5〜8のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトする工程;および
(b)該標的遺伝子が該免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれたニワトリB細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
(項目23)
第1の標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組み込み、第2の標的遺伝子を免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に組みこむための方法であって、該方法は、
(a)1または複数のニワトリB細胞を、項目9〜13のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトして、1または複数のトランスフェクトしたB細胞を得る工程;ならびに
(b)再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H −D−J H 遺伝子を含む該標的遺伝子が該免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座に組みこまれ、該第2の標的遺伝子が該免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座に組みこまれた、トランスフェクトされたニワトリB細胞を(a)から同定する工程、
を包含する、方法。
(項目24)
再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H −D−J H 遺伝子を含む標的遺伝子によってコードされる標的ポリペプチドの、ニワトリ免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列改変体のレパートリーを生成するための方法であって、該方法は、
項目1〜3のいずれか1項に記載のベクターを含むニワトリB細胞を、複数のB細胞が得られるまで、該B細胞の増殖を可能にする条件下で培養する工程であって、ここで該B細胞は、(i)免疫グロブリンV H 相補性決定領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンV H コード核酸配列と、V H 偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方が可能であり、そしてそれによって、該標的ポリペプチドのニワトリ免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列改変体のレパートリーを生成し得る、工程、
を包含する、方法。
(項目25)
項目24に記載の方法であって、前記ニワトリB細胞は、第2の標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座に組みこむための第2のベクターをさらに含み、該第2のベクターは、
(a)ニワトリ免疫グロブリンV L 遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L −J L 遺伝子を含む第2の標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJ L 遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、ここで該第2の標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座へと組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンV L 相補性決定領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンV L コード核酸配列と、DT40 V L 偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得る、
方法。
(項目26)
前記ニワトリ免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座は、重合ラクトースオペレーターを含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記ニワトリ細胞は、DT40およびDTLacOから選択される、項目22〜26のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
抗原への結合について前記複数のニワトリB細胞をスクリーニングする工程をさらに包含する、項目25または26に記載の方法。
特定の実施形態において、本開示は、標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座に組みこむための組換えポリヌクレオチドベクターを提供する。上記組換えポリヌクレオチドベクターは、(a)ニワトリ免疫グロブリンVH遺伝子上流核酸配列領域;(b)標的遺伝子;および(c)ニワトリ免疫グロブリンJH遺伝子下流核酸配列領域を含む。好ましい実施形態において、上記標的遺伝子は、再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子であり、これは、DT40細胞のニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンVH領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)上記再構成されたニワトリ免疫グロブリンVHコード核酸配列とDT40 VH偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくは両方を受け得る。特定の実施形態において、上記体細胞超変異は、免疫グロブリンVH相補性決定領域(CDR)コード配列で起こり得、特定の実施形態においては、上記体細胞超変異は、免疫グロブリンVHフレームワーク領域(FW)コード配列で起こり得、特定の実施形態においては、上記体細胞超変異は、免疫グロブリンVH相補性決定領域(CDR)コード配列および免疫グロブリンVHフレームワーク領域(FW)コード配列の両方で起こり得る。
本開示はまた、特定の実施形態に従って、本明細書で開示される組換えポリヌクレオチドベクターを含む組成物を提供する。
「抗体」とは、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域(本明細書では可変ドメインともいわれる)に位置する少なくとも1つのエピトープ認識部位を介して、標的(例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど)に特異的に結合し得るものである。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のみならず、それらのフラグメント(例えば、単一可変領域抗体(single variable region antibody)(dAb)、または他の公知の抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvなど)、一本鎖(ScFv)、その合成改変体、天然改変体、必要とされる特異性の抗原結合フラグメントを有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原結合部位もしくはフラグメント(エピトープ認識部位)を含む、任意の他の操作されるかもしくは改変された立体配置の免疫グロブリン分子)もまた包含する。「二重特異性抗体」(遺伝子融合によって構築された多価もしくは多重特異性フラグメント(国際公開第94/13804号; Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444−6448, 1993))はまた、本明細書で企図される抗体の特定の形態である。CH3ドメインに結合されたscFvを含む低分子抗体(minibody)はまた、本明細書において含まれる(Hu et al, Cancer Res., 56, 3055−3061, 1996;例えば、Ward et al., Nature 341, 544−546 (1989); Bird et al, Science 242, 423−426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879−5883, 1988; PCT/US92/09965; 国際公開第94/13804号; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444−6448, 1993; Reiter et al., Nature Biotech 14, 1239−1245, 1996; Hu et al, Cancer Res. 56, 3055−3061, 1996もまた参照のこと)。ナノ抗体およびマキシ抗体(maxibodies)もまた、企図される(例えば、米国特許第6,765,087号;米国特許第6,838,254号;国際公開第06/079372号;国際公開第2010/037402号を参照のこと)。
用語「抗原」とは、選択的結合剤(例えば、抗体)によって結合され得、さらにその抗原のエピトープに結合し得る抗体を生成するために動物で使用され得る分子もしくは分子の一部をいう。抗原は、1以上のエピトープを有し得る。
抗体が、種々の条件下で(例えば、エピトープが還元条件および変性条件に供された後に)エピトープに結合する能力に言及する。
他の実施形態において、本開示は、組換えポリヌクレオチドベクターまたは本明細書で開示されるようなベクターを含む組成物を含む宿主細胞を提供する。
特定の関連実施形態において、上記宿主細胞は、本明細書で記載される組換えポリヌクレオチドベクターを増殖させ得る。このような目的での例示的な宿主細胞としては、細菌細胞(例えば、E.coli)が挙げられる。
本開示の特定の実施形態によれば、標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座へと組みこむための方法が提供される。このような方法は、(a)標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座へと組みこむための組換えポリヌクレオチドベクターまたは本明細書で提供されるような複数のこのような組換えポリヌクレオチドベクターを含む組成物で、ニワトリB細胞をトランスフェクトする工程;および(b)上記標的遺伝子が上記免疫グロブリン重鎖遺伝子座へと組みこまれたニワトリB細胞を同定する工程を包含する。
以下の結果を得た:
抗FZD10 mAb(FZ2)(米国特許出願第61/523,102号)を、本明細書で記載されるDTLacO−2集団から選択し、多様化は、テザリングされた因子HIRA−LacIによって加速した(Cummings et al., 2008)。8週間にわたるわずか4回の選択の後に集団はサブナノモルの親和性に達した(図5A)。このmAbは、みかけの親和性kD=0.16nMでその標的を認識した。クローニングされたVHおよびVλ領域の配列分析から、高い親和性および特異性を付与する変異は、CDRに主に位置することが示された(図5B)。
Claims (28)
- 標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座へ組みこむための組換えポリヌクレオチドベクターであって、該ベクターは、
(a)ニワトリ免疫グロブリンVH遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子を含む標的遺伝子であって、該V H −D−J H 遺伝子は、V H 、DおよびJ H 遺伝子が一緒に結合するように再構成されている標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJH遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、
ここで該標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンVH領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンVHコード核酸配列と、DT40 VH偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得る、ベクター。 - 前記標的遺伝子は、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載のベクター。
- 前記マーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)から選択される、請求項2に記載のベクター。
- 前記体細胞超変異は、免疫グロブリンVH相補性決定領域コード配列および免疫グロブリンVHフレームワーク領域コード配列のうちのいずれかもしくはその両方で起こる、請求項1に記載のベクター。
- 複数の標的遺伝子を複数のニワトリ免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座に組みこむための複数の組換えポリヌクレオチドベクターを含む組成物であって、該ベクターの各々は、
(a)ニワトリ免疫グロブリンVH遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子を含む標的遺伝子であって、該V H −D−J H 遺伝子は、V H 、DおよびJ H 遺伝子が一緒に結合するように再構成されている標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJH遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、
ここで該標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンVH領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)該再構成されたニワトリ免疫グロブリンVHコード核酸配列と、DT40 VH偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得、
ここで該再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子は、ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された、複数の再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子から得られる、
組成物。 - 前記標的遺伝子は、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記マーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)から選択される、請求項6に記載の組成物。
- 前記体細胞超変異は、免疫グロブリンVH相補性決定領域コード配列および免疫グロブリンVHフレームワーク領域コード配列のうちのいずれかもしくはその両方で起こる、請求項5に記載の組成物。
- 組成物であって、
(a)請求項1〜4のいずれか1項に記載のベクター;ならびに
(b)第2の標的遺伝子を免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座に組みこむための第2のベクターであって、
(1)ニワトリ免疫グロブリンVL遺伝子上流核酸配列領域;
(2)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンVL−JL遺伝子を含む第2の標的遺伝子;および
(3)ニワトリ免疫グロブリンJL遺伝子下流核酸配列領域、
を含む、第2のベクター;
を含み、ここで該第2の標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンVL領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンVLコード核酸配列と、DT40 VL偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得る、組成物。 - 組成物であって、
(1)請求項5〜8のいずれか1項に記載の組成物;ならびに
(2)複数の標的遺伝子を、複数のニワトリ免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座へ組みこむための1つまたは複数の組換えポリヌクレオチドベクターであって、該ベクターの各々は、
(a)ニワトリ免疫グロブリンVL遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された、再構成されたニワトリ免疫グロブリンVL−JL遺伝子を含む第2の標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJL遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、ここで該第2の標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座へ組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンVL領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンVLコード核酸配列と、DT40 VL偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得、そして
ここで該再構成されたニワトリ免疫グロブリンVL−JL遺伝子は、ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団由来の複数の単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンVL−JL遺伝子から得られる、
組成物。 - 前記第2の標的遺伝子は、第2のマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項9または10に記載の組成物。
- 前記第2のマーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)から選択される、請求項11に記載の組成物。
- 前記体細胞超変異は、免疫グロブリンVL相補性決定領域コード配列および免疫グロブリンVLフレームワーク領域コード配列のうちのいずれかもしくはその両方で起こる、請求項9または10のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のベクター、または請求項5〜8および9〜13のいずれか1項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
- 前記細胞は、細菌細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記細胞は、ニワトリ細胞に由来する、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記細胞は、ニワトリ嚢リンパ腫細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記細胞は、DT40細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞における免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座は、重合ラクトースオペレーターを含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞における免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座は、重合ラクトースオペレーターを含む、請求項16〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 請求項14〜20のいずれか1項に記載の宿主細胞のライブラリー。
- 標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこむための方法であって、該方法は、
(a)ニワトリB細胞を請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトするか、またはニワトリB細胞を請求項5〜8のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトする工程;および
(b)該標的遺伝子が該免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組みこまれたニワトリB細胞を同定する工程、
を包含する、方法。 - 第1の標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組み込み、第2の標的遺伝子を免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に組みこむための方法であって、該方法は、
(a)1または複数のニワトリB細胞を、請求項9〜13のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトして、1または複数のトランスフェクトしたB細胞を得る工程;ならびに
(b)再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子を含む該標的遺伝子が該免疫グロブリン遺伝子重鎖遺伝子座に組みこまれ、該第2の標的遺伝子が該免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座に組みこまれた、トランスフェクトされたニワトリB細胞を(a)から同定する工程、
を包含する、方法。 - 再構成されたニワトリ免疫グロブリンVH−D−JH遺伝子を含む標的遺伝子によってコードされる標的ポリペプチドの、ニワトリ免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列改変体のレパートリーを生成するための方法であって、該方法は、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクターを含むニワトリB細胞を、複数のB細胞が得られるまで、該B細胞の増殖を可能にする条件下で培養する工程であって、ここで該B細胞は、(i)免疫グロブリンVH相補性決定領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンVHコード核酸配列と、VH偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方が可能であり、そしてそれによって、該標的ポリペプチドのニワトリ免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列改変体のレパートリーを生成し得る、工程、
を包含する、方法。 - 請求項24に記載の方法であって、前記ニワトリB細胞は、第2の標的遺伝子をニワトリ免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座に組みこむための第2のベクターをさらに含み、該第2のベクターは、
(a)ニワトリ免疫グロブリンVL遺伝子上流核酸配列領域;
(b)ニワトリファブリキウス嚢細胞の集団から単離された再構成されたニワトリ免疫グロブリンVL−JL遺伝子を含む第2の標的遺伝子;および
(c)ニワトリ免疫グロブリンJL遺伝子下流核酸配列領域、
を含み、ここで該第2の標的遺伝子は、DT40細胞の該ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座へと組みこまれる際に、(i)免疫グロブリンVL相補性決定領域コード配列における体細胞超変異、および(ii)再構成されたニワトリ免疫グロブリンVLコード核酸配列と、DT40 VL偽遺伝子核酸配列との間の遺伝子変換のうちのいずれかもしくはその両方を受け得る、
方法。 - 前記ニワトリ免疫グロブリン遺伝子軽鎖遺伝子座は、重合ラクトースオペレーターを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記ニワトリ細胞は、DT40およびDTLacOから選択される、請求項22〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原への結合について前記複数のニワトリB細胞をスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項25または26に記載の方法。
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