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JP6817944B2 - 最適化治療用分子を製造する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、第1のリード免疫グロブリンに基づく標的最適化のために、免疫グロブリンライブラリー、好ましくは抗体ライブラリーを設計する方法に関する。本発明の態様は更に、本方法によって設計された免疫グロブリンライブラリー及びライブラリーから選択される免疫グロブリンに関する。
結合親和性、Kd又は免疫原性の欠如等の所望の特性を選択するために、初期リード抗体を最適化することによって、抗体療法が頻繁に設計されている。しばしば、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウス等の動物中で生成される。
リード候補抗体の生成及び単離後、抗体を種々の方法で最適化することができる。典型的には、リード抗体を配列決定し、配列を使用して更なるスクリーニングのための変異体の抗体ライブラリーを作製する。変異体は、縮重をコード領域(例えば、CDRの1つ又は複数をコードする領域)に導入するためにオリゴヌクレオチドを用いて構築することができる。オリゴヌクレオチドを、抗体をコードする核酸の領域のPCR増幅に使用することができる。これにより、典型的には、リード中の各アミノ酸残基が多くの潜在的な置換で置き換えられた多くの変異体を含む大きなライブラリーが作製される。次いで、抗体自体を生成するために、ライブラリーを発現ベクターにクローニングすることができる。リボソーム、ファージ又は酵母ディスプレイシステム等のディスプレイシステムを使用することができる。次いで、それによって生成された抗体を、所望の特性の改善についてスクリーニングすることができる。
これらの公知の方法の欠点は、望ましい特性を示すよりも潜在的にはるかに多い変異体が生成されることである。これにより、ライブラリーを作製し、所望の特性を有する変異体抗体を選択するために必要な時間及び資源が増加する。更に、完全ヒト抗体の重鎖と軽鎖の両方を最適化することによって、必要な仕事量が増加すると同時に、特に組み立てた場合に重免疫グロブリン鎖と軽免疫グロブリン鎖の両方を有する抗体についての、抗体の特性に関して更なる不確実性が導入される。
国際公開第2003/000737号 国際公開第2004/076618号
Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989)) Kabat等、Sequences of Immunological Interest、第5版、U.S. Dept. Health & Human Services、Washington, D.C.(1991) Kabat等(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382〜391 Kabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No.93-3242 Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual、Academic Press;第1版(1996年10月28日) Brian K. Kay、Jill Winter、John McCafferty Ren等、Genomics、84、686、2004 Zou等、J. Immunol.、170、1354、2003 Bruschi, C.V.及びGjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes、Encyclopaedia of Life Sciences、2002、Macmillan Publishers Ltd.、Nature Publishing Group/www.els.net Antibody Engineering、編者Benny Lo、第8章、161〜176頁、2004
本発明は、これらの欠点の少なくともいくつかに対処し、免疫グロブリンライブラリーを作製する追加の方法を提供することを意図している。これは、一部は体細胞超変異の過程による免疫化動物自体による一定の変異体の有効な予備選択を通して達成される。天然抗体の生成中、B細胞の増殖は、必要な抗体多様性を生み出すB細胞受容体遺伝子座中の極めて高い体細胞超変異率を伴う。突然変異は主にある体細胞超変異ホットスポットで濃縮される。本発明は、免疫グロブリンライブラリーの設計に情報を用いるためにこの多様性の自然発生を利用する。
本発明は、第1のリード免疫グロブリンの生物学的特性を最適化するために免疫グロブリンライブラリーを設計する方法であって、
a)第1のリード免疫グロブリンに関連している1つ又は複数の関連免疫グロブリンを同定する工程であって、各免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的抗原による免疫化によって標的抗原に対して産生される工程と;
b)第1のリード免疫グロブリンと1つ又は複数の関連免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較する工程と;
c)配列比較に基づいて、
(i)第1のリード免疫グロブリンと1つ若しくは複数の関連免疫グロブリンの間、及び/又は
(ii)1つ若しくは複数の関連免疫グロブリンが複数の免疫グロブリンである場合、複数の免疫グロブリンの間
に変異アミノ酸残基が存在する1つ又は複数の部位を同定する工程であって、
変異アミノ酸残基が存在する1つ又は複数の部位が第1のリード免疫グロブリンの修飾のための潜在的な部位を含む工程と;
d)配列比較に基づいて、第1のリード免疫グロブリンのアミノ酸を関連免疫グロブリンの1つ又は複数の対応する変異アミノ酸で置き換えるために、修飾のための1つ又は複数の部位を選択する工程と;
e)修飾のための選択された部位のうちの1つ又は複数で修飾された、第1のリード免疫グロブリンの配列に基づくライブラリーのための免疫グロブリン配列を生成する工程と
を含む方法を提供する。
好ましくは、免疫グロブリンがCDR3を含む。免疫グロブリンはCDR:CDR1、CDR2及びCDR3のセット、好ましくは重鎖CDR:HCDR1、HCDR2及びHCDR3のセットを含み得る。免疫グロブリンは、重鎖のみの抗体からなる又はそれらを含み得る。免疫グロブリンはVHドメインからなる又はそれらを含み得る。
好ましくは、1つ又は複数の関連免疫グロブリンが共通の系列であり、好ましくはリード免疫グロブリンと比較すると、少なくとも1つのCDR領域における少なくとも70%、80%、85%、90%又は少なくとも95%の相同性で、第1のリード免疫グロブリンと同じ標的抗原に結合する。
共通の系列によって、免疫グロブリンが同じ生殖系列配列に由来する、例えば、免疫グロブリンを、特に標的抗原による非ヒト哺乳動物の免疫化後に、非ヒト哺乳動物の生殖系列配列の体細胞超変異によって得ることができることが意味される。リード免疫グロブリン配列、例えば、リードVH配列を、同じ系列の他の免疫グロブリン配列、例えばVH配列と整列させることによって、免疫反応中に標的化される体細胞超変異ホットスポットを同定することができる。
1つ又は複数の関連免疫グロブリンは、一般的にリード免疫グロブリンに対してCDR3における少なくとも70%の相同性、好ましくはリード免疫グロブリンに対してCDR3における少なくとも70%、80%、85%、90%又は少なくとも95%の相同性を有する。
1つ又は複数の関連免疫グロブリンは、一般的にリード免疫グロブリンに対してCDR1及び/又はCDR2における少なくとも70%の相同性、好ましくはリード免疫グロブリンに対してCDR1及び/又はCDR2における少なくとも70%、80%、85%、90%又は少なくとも95%の相同性を有する。
1つ又は複数の関連免疫グロブリンは、一般的にリード免疫グロブリンに対してフレームワーク領域における少なくとも70%の相同性、好ましくはリード免疫グロブリンに対してフレームワーク領域における少なくとも70%、80%、85%、90%又は少なくとも95%の相同性を有する。
1つ又は複数の関連免疫グロブリンは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20又は25個の免疫グロブリンを含む複数の関連免疫グロブリンを含み得る。
工程c)は、免疫グロブリン配列のCDR中の修飾のための部位を同定する工程を含み、変異アミノ酸残基が関連免疫グロブリンのうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ又は5つの中に存在する場合、CDR中の部位は修飾のための部位とみなされる。
工程c)は、免疫グロブリン配列のCDR以外の修飾のための部位を同定する工程を更に含み、変異アミノ酸残基が関連免疫グロブリンのうちの少なくとも20%中に存在する場合、CDR以外の部位は修飾のための部位とみなされる。
他の場合なら修飾のための潜在的な部位、特に修飾のための部位として同定されたはずであるCDR以外の修飾部位のための潜在的な部位は、その修飾が (i)不対システイン、(ii)酸化部位(遊離メチオニン)、(iii)グリコシル化部位、(iv)脱アミド部位及び(v)異性化部位の特徴のうちの1つ又は複数の修飾免疫グロブリンへの導入をもたらす場合、修飾のための部位として同定されない。
工程d)で選択される部位は、修飾のための部位における修飾のそれぞれの可能な組み合わせを反映する変異配列を含み得る。
修飾のための選択された部位での修飾は、保存的アミノ酸置換のみを含み得る。
変異免疫グロブリンは、修飾のための選択された部位以外の修飾を含み得ない。
工程e)は追加の変異免疫グロブリンの配列を生成する工程を更に含み得、配列は、保存的アミノ酸置換によって、第1のリード免疫グロブリンのアミノ酸を、対応する変異アミノ酸に置き換えるように、修飾のための選択された部位のうちの1つ又は複数で更に修飾される。
工程e)は追加の変異免疫グロブリンの配列を生成する工程を更に含み得、配列は、第1のリード免疫グロブリンのアミノ酸を、関連免疫グロブリンの対応する残基で見られないアミノ酸で置き換えるように、修飾のための選択された部位のうちの1つ又は複数で更に修飾される。
本明細書に記載される方法は、工程e)で生成された配列を有する免疫グロブリンを含む免疫グロブリンライブラリーを作成する工程f)を更に含み得る。
ライブラリーは当分野で慣用的な種々の方法を用いて作製され得る。
本発明の方法は、所望の生物学的特性を有する1つ又は複数の免疫グロブリンを同定するために免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングする工程g)を更に含み得る。
所望の生物学的特性には、それだけに限らないが、結合親和性、IC50、良好な発現特性、溶解度、安定性、免疫原性/抗薬物抗体(ADA)の産生の可能性の欠如が含まれる。
本発明の方法は、工程a)の前に、第1のリード免疫グロブリン及び1つ又は複数の関連免疫グロブリンを含む複数の免疫グロブリンを生成及び配列決定する工程α)を含み得る。
複数の免疫グロブリンは、ヒト以外の哺乳動物、好ましくはマウス又はラット、好ましくはヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しているトランスジェニックマウス又はラットを標的抗原で免疫化することによって生成され得る。
本発明の方法は、工程a)の前に、第1のリード免疫グロブリンを同定する工程β)を含み得る。
第1のリード免疫グロブリンは、それだけに限らないが、標的抗原に対する適度に高い結合親和性、標的抗原に対する特異性、標的抗原に対する選択性、標的抗原の効果を中和する能力、他の種の対応する標的抗原との所望の交差反応性、IC50、良好な発現特性、溶解度、安定性、免疫原性/ADAの可能性の欠如を含む、1つ又は複数の所望の生物学的特性に基づいて選択され得る。
本発明の方法では、免疫グロブリンが抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであり得る。
免疫グロブリンは、重鎖のみの抗体を含む又はからなり得る。
免疫グロブリンは、抗体のVHドメインを含む又はからなり得る。
本発明は、リード免疫グロブリンを最適化する方法であって、
a)上記本発明の方法を行う工程と;
b)最適化免疫グロブリンの所望の生物学的特性に基づいて、ライブラリーから1つ又は複数の最適化免疫グロブリンを選択する工程と
を含む方法を提供する。
本発明は、複数の免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドのライブラリーであって、複数の免疫グロブリンの配列が上記本発明の方法により設計されるライブラリーを提供する。
本発明は、複数の免疫グロブリンを含むライブラリーであって、複数の免疫グロブリンの配列が上記本発明の方法により設計されるライブラリーを提供する。
本発明は、上記本発明の方法により設計又は選択された単離された免疫グロブリンを提供する。
本発明は、本発明の免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
本発明は、本発明の免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドライブラリーを含む複数のベクターを提供する。
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
宿主細胞は細菌、例えば、大腸菌(E.coli)、酵母、単離された哺乳動物細胞又は細胞株、例えば、CHO又はNS0細胞株であり得る。
本発明は、本発明の免疫グロブリンを得る方法であって、本発明による宿主細胞を用意する工程と;宿主細胞に、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされる免疫グロブリンを発現させる工程と;免疫グロブリンを精製する工程とを含む方法を提供する。
本方法は、得られた免疫グロブリンを含む医薬製剤等の組成物を調製する工程を更に含み得る。
本発明は、本発明の免疫グロブリンを含むキメラ又は融合ポリペプチドを提供する。
本発明は、追加の部分と結合若しくは融合した本発明の免疫グロブリン又は本発明のキメラ若しくは融合ポリペプチドを含むコンジュゲート(conjugate)を提供する。
追加の部分は、同じ又は異なる標的抗原、細胞毒、放射性核種、半減期延長部分、例えば、HSA若しくはその変異体、Fc、PEG又は例えば、抗HSA VHドメインを含む抗HSA結合分子に特異的な1つ又は複数のVHドメイン、好ましくはヒトVHドメインを含み得る。
本発明は、本発明の免疫グロブリン、本発明のキメラポリペプチド又は本発明のコンジュゲートを含む医薬製剤等の組成物を提供する。
関連抗体のものと合わせて、リード重鎖のみの抗体候補のVHドメインの配列を有する抗IL-17Aクローン1.1 VHファミリー、クローン1.1(最上行)を示す図である。CDR部分を網掛けにしている。 標的ヒトIL-17A及びIL-17RAそれぞれに対して産生された(a)クローン1.1及び(b)クローン2.1 VHの結合速度論を示すBIAcoreデータを示す図である。 マーカー(M)Fermentas社1K+ラダーに対して泳動したクローン1.1に基づく変異ライブラリーの構築物についての核酸セグメントのPCR産物のアガロースゲル分析を示す図である。 関連抗体のものと合わせて、リード重鎖のみの抗体候補のVHドメインの配列、クローン2.1(最上行)を示す図である。CDR部分を網掛けにしている。 マーカー(M)generuler 100bpラダー(Thermo社SM0243)に対して泳動したクローン2.1に基づく変異ライブラリーの構築物についての核酸セグメントのPCR産物のアガロースゲル分析を示す図である。 クローン1.1及びクローン2.1VHの最適化変異体の結合速度論を示すBIAcoreデータを示す図である:(a)親VH 1.1、最適化VHクローン1.10及び1.6;(b)親VH 2.1及び最適化VH2.2。
本発明をここで、具体的な実施形態を参照して更に説明する。これらの実施形態は単に本発明を説明するものであること、及び本発明は特許請求の範囲で定義される通りであることが理解されるだろう。更に、記載される実施形態の修正及び変形が当業者に思い浮かぶだろう。
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、及びそれらの技術は当分野で周知であり、一般的に使用されるものである。本開示の方法及び技術は一般的に、特に指示しない限り、当分野で周知の従来方法に従って、及び本明細書の全体にわたって引用され、論じられる種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989))を参照されたい。酵素反応及び精製技術は、当分野で一般的に達成される又は本明細書で記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験室手順及び技術は当分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術が化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、及び送達、及び患者の治療に使用される。
「抗体」という用語は、広義に、4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖で構成される任意の免疫グロブリン(Ig)分子若しくはその抗原結合部分、又はIg分子の必須のエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的断片、突然変異体、変異体若しくは誘導体を指す。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体フォーマットは当分野で公知である。全長抗体では、各重鎖が重鎖可変領域(本明細書でHCVR又はVHと略される)及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3で構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書でLCVR又はVLと略される)及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は1つのドメイン、CLで構成される。VH及びVL領域は、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が点在している相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。各VH及びVLは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された3つのCDR及び4つのFRで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫グロブリン分子は任意の種類(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであり得る。
本明細書に記載される抗体はまた、VH免疫グロブリンドメインである単一ドメイン抗体を含む又はからなり得る。よって、抗体は、1つ又は複数のVHドメインを有するが、VLドメインがない免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体(sVD、sdAb又はISV)を含む又はからなり得る。単一ドメイン抗体は当分野で記載されている;これらはその相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。好ましくは、1つ又は複数のVHドメインがヒトVHドメインである。
本明細書で使用される場合、VH又は「可変重ドメイン」という用語は、Kabat等、Sequences of Immunological Interest、第5版、U.S. Dept. Health & Human Services、Washington, D.C.(1991)によって定義されるような免疫グロブリン可変重ドメインを指す。可変ドメイン内のCDRアミノ酸残基の番号付け及び位置決めは、周知のKabat番号付け慣習による。
本明細書に記載される抗体は、アミノ酸配列を含み、その好ましい配列及び/又は部分、例えば、CDRが本明細書に定義される。
「CDR」という用語は、抗体可変配列中の相補性決定領域を指す。可変領域のそれぞれについて、CDR1、CDR2及びCDR3と示される重鎖(及び存在する場合は軽鎖)の可変領域の各々の中の3つのCDRが存在する。「CDRセット」という用語は、抗原に結合することができる単一可変領域中に生じる3つのCDRのグループを指す。これらのCDRの正確な境界は、異なるシステムによって異なって定義されている。Kabatによって記載されるシステムが好ましい。「Kabat番号付け」、「Kabat定義」及び「Kabat標識」という用語は、本明細書で互換的に使用される。当分野で認識されているこれらの用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりも可変性(すなわち、超可変性)であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す(Kabat等(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382〜391及びKabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No.93-3242)。
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの比較に関する「相同性」は、一般的に配列を整列させた後、いくつかの実施形態では、必要に応じてギャップを導入して最大相同性%を達成した後、対応する第2のポリペプチド(又はポリヌクレオチド)の残基と同一である第1の配列中のアミノ酸(又はヌクレオチド)残基の割合を指し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。N又はC末端の伸長も挿入も同一性又は相同性を減少させると解釈しないものとする。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは当分野で周知である。「保存的アミノ酸置換」は以下の表で注記されるものである:
「Kd」という用語は、「平衡解離定数」を指し、平衡での滴定測定で、又は解離速度定数(Koff)を会合速度定数(Kon)で割ることによって得られる値を指す。「KA」は親和定数を指す。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。会合及び解離速度定数を決定する方法は当分野で周知である。蛍光ベースの技術を用いると、平衡での生理的緩衝液中の試料を試験するための高い感度及び能力が提供される。BIAcore(登録商標)(生体分子相互作用分析)アッセイ等の他の実験手法及び機器を使用することができる。
免疫グロブリンを製造する方法は、アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が与えられれば、当業者に公知であるだろう。一定の技術を使用して製造した免疫グロブリン又は免疫グロブリンライブラリーのスクリーニングを容易にすることができ;例えば、アミノ酸配列のライブラリーをファージ、ファージミド、リボソーム又は適当な微生物(酵母等)にディスプレイして、例えば、スクリーニングを容易にすることができる。アミノ酸配列(のセット、コレクション又はライブラリー)をディスプレイ及びスクリーニングするのに適した方法、技術及び宿主生物は当業者に明らかであるだろう(例えば、Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual、Academic Press;第1版(1996年10月28日) Brian K. Kay、Jill Winter、John McCafferty参照)。
本明細書で言及される免疫グロブリンは、トランスジェニック齧歯動物で発現することができる。トランスジェニック齧歯動物、例えば、マウスは、内在性抗体遺伝子を発現する能力が低い。一実施形態では、齧歯動物が、内在性軽及び/又は重鎖抗体遺伝子を発現する能力が低い。そのため、齧歯動物は、機能的内在性軽及び/重鎖が産生されないように、内在性軽及び/又は重鎖抗体遺伝子の発現を妨害するための追加の修飾を含むことができる。
齧歯動物はマウスであり得る。マウスは、非機能的λ軽鎖遺伝子座を含み得る。よって、マウスは機能的内在性λ軽鎖を生成しない。λ軽鎖遺伝子座が部分的若しくは完全に欠失され、又は挿入を通して非機能的にされ得る。例えば、少なくとも定常領域遺伝子C1、C2及びC3を欠失させる又は挿入を通して非機能的にすることができる。マウスが機能的λ軽鎖を生成しないように、遺伝子座を機能的にサイレンシングすることができる。更に、マウスは、非機能的κ軽鎖遺伝子座を含み得る。よって、マウスは機能的内在性κ軽鎖を生成しない。κ軽鎖遺伝子座が部分的若しくは完全に欠失され、又は挿入を通して非機能的にされ得る。
機能的にサイレンシングされた内在性λ及びκL鎖遺伝子座を有するマウスは、例えば、これにより全体が参照により組み込まれる国際公開第2003/000737号に開示されるように作製することができる。
更に、マウスは非機能的重鎖遺伝子座を含み得る。よって、マウスは機能的内在性重鎖を生成しない。例えば、(これにより全体が参照により組み込まれる)国際公開第2004/076618号に記載されるように、全8つの内在性重鎖定常領域免疫グロブリン遺伝子(μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε及びα)がマウス中に存在しない、若しくはこれらが非機能的となる程度に部分的に存在しない、又は遺伝子δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b及びεが存在せず、隣接遺伝子μ及びαが、これらが非機能的となる程度に部分的に存在しない、又は遺伝子μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b及びεが存在せず、αが、これが非機能的となる程度に部分的に存在しない、又はδ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε及びαが存在せず、μが、これが非機能的となる程度に部分的に存在しない。欠失とは、一部は、例えば、挿入によって、機能的内在性遺伝子産物が遺伝子座によってコードされない、すなわち、機能的産物が遺伝子座から発現されない程度に、内在性遺伝子座遺伝子配列が欠失又は破壊されていることを意味する。別の実施形態では、遺伝子座が機能的にサイレンシングされている。
一実施形態では、マウスが非機能的重鎖遺伝子座、非機能的λ軽鎖遺伝子座及び非機能的κ軽鎖遺伝子座を含む。そのため、マウスはいかなる機能的内在性軽鎖も重鎖も生成しない。よって、マウスはトリプルノックアウト(TKO)マウスである。
トランスジェニックマウスは、異種重鎖遺伝子座をコード及び発現するためのベクターを含む。YACは酵母で極めて大きなDNAインサートをクローニングするために使用され得るベクターである。天然酵母染色体のようにふるまうのに必須である全3つのシス作用性構造要素(自律複製配列(ARS)、セントロメア(CEN)及び2つのテロメア(TEL))を含むのはもちろん、大きなDNAインサートを受け入れる能力により、これらが、染色体のように安定になり、酵母細胞中で忠実に伝達されるのに必要な最小サイズ(150kb)に達することが可能である。YACの構築及び使用は当分野で周知である(例えば、Bruschi, C.V.及びGjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopaedia of Life Sciences 2002 Macmillan Publishers Ltd、Nature Publishing Group)。
トランスジェニックマウスは、標準的な技術により作製することができる。トランスジェニックマウスを作製するための2つの最も一般的な特徴づけられた経路は、遺伝物質の新たに受精した卵母細胞への前核微量注入法を介する、又は安定にトランスフェクトした胚性幹細胞の桑実胚若しくは胚盤胞段階の胚への導入を介する。遺伝物質をどのように導入するかにかかわらず、操作された胚が偽妊娠雌レシピエントに移され、妊娠が継続し、候補トランスジェニックの子が生まれる。これらの広範な方法間の主な差異は、トランスジェニック動物を作製するために使用する前に、ESクローンを広くスクリーニングすることができるということである。対照的に、前核微量注入法は、導入後の宿主ゲノムへの遺伝物質組み込みに依拠し、一般的に言えば、導入遺伝子の組み込み成功を子が生まれた後まで確認することができない。
導入遺伝子の取り込みが成功するのを助けるとともに、成功したかどうかを判定するための多くの方法が当分野で公知である。構築物のゲノムへのランダム組み込み、部位特異的組み込み又は相同組換えを含む複数の手段によってトランスジェニック動物を作製することができる。組換えの効率を改善するための薬物耐性マーカー(正の選択)、リコンビナーゼ、組換え媒介カセット交換、負の選択技術及びヌクレアーゼの使用を含む、導入遺伝子組み込み及びその後の修飾を駆動するとともに選択するために使用することができる種々のツール及び技術が存在する。これらの方法のほとんどがES細胞の修飾に一般的に使用されている。しかしながら、これらの技術のいくつかは、前核注入を介して媒介される遺伝子組換えを増強するための有用性を有し得る。
所望の背景内でトランスジェニック系列をより効率的に作製するためにさらなる精密化を用いることができる。上記のように、好ましい実施形態では、内在性マウス免疫グロブリン発現をサイレンシングして、創薬のために活用され得る重鎖のみのレパートリーを発現するための導入された導入遺伝子の単独使用を可能にする。遺伝子操作マウス、例えば、全ての内在性免疫グロブリン遺伝子座(マウス重鎖、マウスκ鎖及びマウスλ鎖)についてサイレンシングされたTKOマウスを上記のように使用することができる。導入された導入遺伝子のこのTKO背景移入は、交配(従来の又は過程の効率的なスケーリングを得るためのIVF工程を含めたもの)を介して達成することができる。しかしながら、遺伝子組換え手順中にTKO背景を含めることも可能である。例えば、微量注入法については、卵母細胞をTKOドナーから得てもよい。同様に、TKO胚からのES細胞を遺伝子組換えに使用するために得ることができる。
本明細書に記載される免疫グロブリンを別の部分に結合することができる。この部分は毒素、酵素又は放射性同位体;又は半減期延長部分(HSA若しくはPEG等)又は抗HSA Ig、例えば、抗HSA VHから選択され得る。この部分は細胞毒性分子(化学療法薬、細菌及び植物毒素等)及び放射性核種から選択され得る。結合分子と腫瘍細胞が結合し、薬物部分の細胞毒性活性剤が放出及び/又は活性化すると、腫瘍細胞死滅が起こる。薬物コンジュゲートによって与えられる選択性によって正常細胞に対する毒性が最小化され、それによって、患者における薬物療法の耐容性が増強される。
免疫グロブリンを含む組成物、例えば、医薬組成物が本明細書に記載される。医薬組成物は、典型的には1種又は複数の活性剤(この場合、免疫グロブリン)と、薬学的に許容される担体とを含む。組成物を所望の投与経路に応じて製剤化することができる。投与経路の例としては、限定されないが、皮膚に対する若しくは皮膚を介した経皮投与、皮下又は静脈内投与を含む局所、経口、局所、非経口、舌下、直腸内、膣内、眼内及び鼻腔内投与が挙げられる。非経口投与は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術を含む。組成物は単回又は複数回投与単位の形態をとることができる。当業者であれば、医薬製剤を調製する適切な方法を認識するだろう。
薬学的に許容される担体は、組成物が、例えば、錠剤又は散剤形態である、例えば、使用前に復元するために凍結乾燥されるように、粒子状であってもよい。担体は、組成物が例えば、注射液である場合、液体であってもよい。更に、担体は、例えば、吸入投与に有用なエアゾール組成物を提供するようガス状であってもよい。「担体」という用語は、それと共に組成物の活性剤が投与される希釈剤、補助剤又は賦形剤を指す。このような医薬担体は液体であり得、本明細書に記載される医薬組成物を静脈内投与する場合、水又は生理食塩水が好ましい担体である。食塩水溶液及びブドウ糖水溶液及びグリセロール溶液も特に注射液のための液体担体として使用することができる。組成物は、所望であれば、微量の湿潤若しくは乳化剤、pH緩衝剤、又は製剤の安定性及び溶解度を増強する剤を含有することもできる。
組成物は液体、例えば、溶液、エマルジョン又は懸濁液の形態であり得る。液体は注射又は静脈内注入による送達に有用となり得る。皮膚への局所投与又は注射若しくは注入のための組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤及び等張剤の1つ又は複数を含めることもできる。
本明細書に記載される液体組成物は、それが溶液、懸濁液又は他の同様の形態のいずれであれ、以下の1つ又は複数を含むこともできる:滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、不揮発性油、例えば、合成モノ若しくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン又は他の溶媒;抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン;及び張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース。非経口組成物を、ガラス、プラスチック又は他の材料でできたアンプル、使い捨て注射器又は複数回用量バイアルに封入することができる。
特定の障害又は状態の治療に有効/活性である本明細書に記載される免疫グロブリンの量は、障害又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。更に、インビトロ又はインビボアッセイを場合により使用して最適な投与量範囲を同定することができる。組成物に使用するための正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の重篤度にも依存し、専門家の判断及び各患者の状況により決定すべきである。正確な投与量はまた、特定の配合、施用様式及びその特定の部位、受容者及び治療している疾患により変化するだろう。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排泄率、受容者の状態、薬物組み合わせ、反応感受性及び疾患の重症度等の他の因子も考慮すべきである。投与は、最大耐容用量内で連続的又は周期的に行うことができる。
VHを含む重鎖のみの抗体を、内在性重及び軽鎖産生についてサイレンシングされているが、外来性ヒト重鎖を発現するトランスジェニックトリプルノックアウトマウスで抗原IL-17A及びIL-17RAに対して産生させた。2つのリード抗体、クローン1.1及びクローン2.1を得て、その後の最適化工程に使用した。以下の材料及び方法の節は、使用したマウスプラットホーム及びリード抗体の生成の簡潔な詳細を与える。最適化工程及び分析を実施例で説明する。
材料及び方法
免疫化のためのTg/TKOマウス
内在性重及び軽鎖抗体発現についてサイレンシングされた(トリプルノックアウト又はTKO)背景内の生殖系列配置の重鎖抗体トランスジェニック遺伝子座を有するマウスを、前記(国際公開第2004/076618号及び国際公開第2003/000737号、Ren等、Genomics、84、686、2004;Zou等、J. Immunol.、170、1354、2003)のように作製した。
CH1ドメインを欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウスエンハンサー及び調節領域と組み合わせて過剰のヒトVH、D及びJ遺伝子を含む酵母人工染色体(YAC)を新たに受精した卵母細胞に前核微量注入した後、トランスジェニック(Tg)マウスを得た。酵母人工染色体(YAC)は酵母で極めて大きなDNAインサートをクローニングするために使用され得るベクターである。天然酵母染色体のようにふるまうのに必須である全3つのシス作用性構造要素(自律複製配列(ARS)、セントロメア(CEN)及び2つのテロメア(TEL))を含むのはもちろん、大きなDNAインサートを受け入れる能力により、これらが、染色体のように安定になり、酵母細胞中で忠実に伝達されるのに必要な最小サイズ(150kb)に達することが可能である。YACの構築及び使用は当分野で周知である(例えば、Bruschi, C.V.及びGjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes、Encyclopedia of Life Sciences、2002、Macmillan Publishers Ltd.、Nature Publishing Group/www.els.net)。
使用するYACは、その天然配置の10個又は23個のヒト重鎖V遺伝子、ヒト重鎖D及びJ遺伝子、マウスCγ1遺伝子及びマウス3'エンハンサー遺伝子を含む約340kb又は572kbとした。これはCH1エクソンを欠いていた。
トランスジェニックファウンダーマウスを、内在性免疫グロブリン発現を欠いた動物と戻し交雑して、記載される免疫化試験に使用するTg/TKO系列を作製した。
免疫化のための抗原
免疫化は組換え精製タンパク質を使用した。組換えヒトIL-17AをPeprotech社から購入した(Peprotech社、カタログ番号AF-200-17)。組換えヒトIL-17Aも使用した。他の免疫原を使用することもでき、これらにはDNA、粗タンパク質及びトランスフェクト細胞等の材料が含まれる。
免疫化プロトコル
組換えタンパク質をTg/TKOに投与した。手短に言えば、それぞれ8〜12週齢のマウスに、完全フロイントアジュバント中で乳化した組換えタンパク質合計10μgを受けさせ、皮下送達し、引き続いて不完全フロイントアジュバント中で乳化した組換えタンパク質1〜10μgのブーストも皮下投与し、初期プライミング後、種々の間隔で与えた。最終用量の抗原を、アジュバントの非存在下、リン酸緩衝生理食塩中で、腹腔内投与した。
代替の免疫化経路及び手順を使用することもできる。例えば、フロイントアジュバントの代わりに、異なるアジュバント又は免疫強化手順を使用することができる。DNA免疫化は通常、筋肉内又は遺伝子銃を介して送達する。トランスフェクト細胞又はこのような細胞からの膜調製物は通常、排他的ではないが、腹腔内投与する。
免疫化マウスからのライブラリー作製及び抗体VHのクローニング
a)組織の処理、RNA抽出及びcDNA製造
脾臓、鼠径及び上腕リンパ節を各免疫化動物からRNAlater(商標)に回収した。各動物について、脾臓の1/3及び4つのリンパ節を別々に処理した。最初に、組織をホモジナイズした;組織をLysingマトリックスDビーズチューブ(MP Bio社カタログ番号116913100)に移した後、β-メルカプトエタノールを含有するRLT緩衝液600μL (Qiagen社製、RNeasyキットカタログ番号74104)を添加した後、6m/s 40秒サイクルを用いてMP Bio社Fastprepホモジナイザー(カタログ番号116004500)でホモジナイゼーションを行った。ホモジナイズした組織を含有するチューブを氷に移し、細片を10gで5分間微量遠心分離によってペレット化した。上清400μlの試料を取り出し、RT-PCRに使用した。
最初に、製造業者の指示に従って、Qiagen社RNeasyキットカタログ番号74104を用いてRNAを抽出した。次いで、各RNA試料を使用して、Superscript III RT-PCR高忠実度キット(Invitrogen社カタログ番号12574-035)を用いてcDNAを作製した。各脾臓及びLN RNA試料について、それぞれVH1、VH2、VH3、VH4又はVH6ファミリー用のプライマーと組み合わせてVH_J/F(長)プライマーを用いて、5回のRT-PCR反応を行った。プライマーの詳細は以下である。
以下のチューブ反応成分に基づいて、RT-PCR反応のためにマスターミックスを調製した。
12.5μl 2×反応ミックス
0.5μl 順方向プライマー(10μM)
0.5μl 逆方向プライマー(10μM)
0.5μl 酵素ミックス
500ng〜1μg RNA
25μlまでの水
以下の条件を用いて、サーマルサイクラーでRT-PCR反応を行った:
50℃20分
94℃2分
35サイクルの94℃ 15秒
58℃30秒
68℃30秒
68℃5分
4℃で維持
370bpの範囲の産物をゲル電気泳動によって確認した。
次いで、各マウスについて、1/3脾臓及び4つのリンパ節の各々から所与のファミリーについて増幅したVH産物を、産物を水50μlに溶出する、Thermo/Fermentas社のGeneJet PCR精製キット(カタログ番号K0702)(製造業者の指示に従って使用した)を用いた精製のためにプールした。
b.ファージミドベクターへのクローニング
ファージミドベクター、pUCG3をこれらの試験に使用した。示されるように、NcoI及びXhoIによる制限酵素消化、ライゲーション及び形質転換を含む従来法を用いて、VHをpUCG3にクローニングすることができる。或いは、PCRに基づく方法を使用してVHファージミドライブラリーを構築することができる。これらの手順の両方を使用して増幅VH配列からライブラリーを作製した。前者の方法が当分野で広く使用されており、詳細を見出すことができる。PCRに基づく方法について、以下の手順を使用した:
PCRを用いてpUCG3の線状版を作製した:
プライマー:
pUCG3-F3 CTCGAGGGTGGCGGTAGCCATCACCACCATC (配列番号65)
pUCG3-R3 TCCATGGCCATCGCCGGCTGGGCCGCGAG (配列番号66)
以下の試薬を含むPCR反応にGC緩衝液(カタログ番号F532L、NEB)を含むPhusion High fidelity PCRマスターミックスを使用した;
Phusion GC 2×ミックス 25μl
pUCG3 5〜10ng
プライマー(10μM) それぞれ1.25μl
DMSO 1.5μl
ヌクレアーゼフリーH2O 50μlの最終体積まで
使用したサイクリング条件は、
98℃30秒
10サイクルの
98℃10秒
58℃20秒
68℃2分30秒
20サイクルの
98℃10秒
58℃20秒
68℃3分
68℃5分
4℃維持
PCR産物(3152bp)を、溶出緩衝液40μlに最終溶出して、製造業者の指示により、Fermentas社のGeneJetゲル精製キット(カタログ番号K0691)を用いてゲル精製した。
以下の反応に基づき、精製したVH RT-PCR産物を線状pUCG3と共にメガプライマーとして使用して、形質転換及びライブラリー作製のためのファージミド産物を得た:
Phusion GC 2×ミックス 25μl
線状pUCG3 700ng
VHPCR産物 250ng
DMSO 1.5μl
ヌクレアーゼフリーH2O 50μlの最終体積まで
PCRを以下の通り行った;
98℃30秒
10サイクルの:98℃10秒
58℃20秒
72℃2分
72℃5分
10℃で維持
PCR産物を1%アガロースゲル上で分析した。
種々のファミリーのVH/ファージミド産物を、最終溶出をH2O25μl中にして、製造業者の指示により、FermentをPCR精製キット(カタログ番号K0702)として使用して精製し、BioRad 10×1mmキュベット(BioRadカタログ番号165-2089)、Eppendorf Eporator及び予熱回収培地(Lucigen社、専売ミックス)を用いる電気穿孔によるTG1大腸菌(Lucigen社、カタログ:60502-2)の形質転換に使用した。精製した産物2μlを電気穿孔のために細胞25μlに添加し、最大10回の電気穿孔を1800Vで各VH/ファージミド産物について行った。電気穿孔した細胞を50ml Falconチューブにプール及び回収し、150rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。形質転換物の一定分量の10倍希釈系列を行い、2%(w/v)グルコース及び100μg/mlアンピシリンを補足した2×TY寒天を含有するペトリ皿に蒔いた。これらの皿上に得られたコロニーを使用してライブラリーサイズを推定した。形質転換の残りを、2%(w/v)グルコース及び100μg/mlアンピシリンを補足した2×TY寒天を含有する大型フォーマットBioassay板に蒔いた。全ての寒天平板を30℃で一晩インキュベートした。2×TYブロス10mlを大型フォーマットバイオアッセイ板に添加し、コロニーをこすり取り、OD600を測定した(OD1.0=5×108個細胞/ml)。一定分量を、50%v/vグリセロール溶液(50%)を添加した後に冷結保存バイアル中-80℃で保存した、又はファージ選択工程に直接使用した。
抗体の選択
いくつかの重鎖のみの抗体を免疫化マウスから得て、標準的な技術を用いて、結合ELISA生化学的阻害アッセイ、細胞ベースの阻害アッセイ及びBIAcore(登録商標)アッセイの組み合わせによって、免疫原(IL-17A又はIL-17RA)に対する結合親和性、IL-17A/IL-17RA相互作用を阻害する能力及び結合速度論についてスクリーニングした。これらのスクリーニングから、2つの抗体を、リード抗体-IL-17Aに対して産生されたクローン1.1及びIL-17RAに対して産生されたクローン2.1として選択した。
BIAcoreアッセイ
VH抗体の結合速度論をBIAcore T200機器で測定した。標的(組換えIL-17A又はIL-17RAのいずれか)を酢酸緩衝液、pH5.5(BIAcore社、カタログ番号BR-100-52)に1μg/mlまで希釈し、アミンカップリング化学(NHS-EDCアミンカップリングキット、カタログ番号BR-1000-50)及びBIAcore社固定化Wizardソフトウェアを用いてCM5 Series Sチップ(カタログ番号BR-1006-68)にカップリングした。このようにして、標的の100RUを固定化し、ブランク表面(標的無し)も基準減算用に調製した。
VH抗体の結合速度論を単一サイクル速度論によって決定した。VH抗体を希釈系列(典型的には最高濃度の100nM VHで始まる1:3希釈系列)で調製し、次いで、最低濃度のVHで始めて、抗原コーティング表面及びブランク表面上にも注射し、次いで、最高濃度まで漸進的に作業した。次いで、VH結合速度論を、1:1結合モデル及びBIA評価ソフトウェアを用いて(ブランク減算)センサーグラムトレースから決定した。
(実施例1)
体細胞超変異の組み合わせを含む突然変異誘発VHの生成
a.体細胞超変異の組み合わせを含むクローン1.1 VH(抗IL-17A VH)変異体の生成
新規な最適化戦略を使用して免疫化マウスから単離したVHの結合親和性を増加させた。リードVHを同じ系列の他のメンバーと整列して、免疫反応中に標的化した体細胞突然変異ホットスポットを同定した(図1)。これらの位置のアミノ酸の選択が新たな組換えライブラリー手法の基礎を形成し、各突然変異ホットスポットで最適なアミノ酸を有する高親和性VHを選択することを目指した新たなライブラリーの設計をもたらした。
IL-17Aの例として、クローン1.1を免疫化Tg/TKOマウスから上記のように直接単離した。このVHは高い親和性でIL-17Aと結合することが示された(図2)。VHクローン1.1と同じ系列の他のメンバーを整列すると、免疫反応中に突然変異したいくつかのアミノ酸位置が同定され、VH-CDRとVH-フレームワーク領域の両方が影響を受けた(図1)。次いで、この情報を利用して、VHクローン1.1の高親和性変異体を同定することを目的とした新たなクローン1.1組換えライブラリーを設計した。
HF緩衝液を含むPhusion High FidelityPCRマスターミックス(カタログ番号F531L、Thermo社)を、以下の通り各プライマー対形成のために設定したPCR反応に使用した:
Phusion HF 2×ミックス 25μl
プライマー(10μM) それぞれ1.25μl(表のように対形成)
クローン1.1プラスミドDNA(34ng/μl) 0.5μl
ヌクレアーゼフリーH2O 50μlの最終体積まで
PCRを以下の通り行った;
98℃30秒
31サイクル:98℃10秒
58℃20秒
72℃20秒
72℃10分
10℃で維持
各PCR産物を1%アガロースゲルで分析した(図3(a))。次いで、各産物を、Fermentas社のPCR精製キット(K0701)を用いて40μl溶出緩衝液中で精製した。次いで、アセンブリPCRを設定して全VH配列を再構成した:
Phusion HF 2×ミックス 25μl
精製PCR産物1 5μl
精製PCR産物2 5μl
精製PCR産物3 5μl
精製PCR産物4 5μl
精製PCR産物5 5μl
PCRを以下の通り行った;
98℃30秒
5サイクル:98℃10秒
58℃20秒
72℃20秒
プライマーV3/peIB(長)及びVH_J/F(長)(共に10μM)0.5μlを反応物に添加し、次いで、上記条件で更に10PCRサイクル続けた。PCR産物を1%アガロースゲルで分析し(図3(b))、Fermentas社のPCR精製キットを用いて溶出緩衝液40μl中で精製した。次いで、PCR産物を実施例2に記載されるようにライブラリー構築のためのメガプライマーとして使用した。
b.体細胞超変異の組み合わせを含むクローン2.1 VH(抗IL-17RA)変異体の生成
同様の組換えライブラリー手法をVHクローン2.1によって率いられる抗IL-17RA系列にも使用した。このVHは高い親和性でIL-17RAに結合することが示された(図2)。クローン2.1を同じ系列の他のメンバーと整列させると、免疫反応中に突然変異したいくつかのアミノ酸位置が同定された(図4)。次いで、この情報を利用して、クローン2.1のより高い親和性変異体を同定する目的で、新たなクローン2.1組換えライブラリーを設計した。
Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ(カタログ番号F518、Thermo社)を、以下の通り各プライマー対形成について設定したPCR反応に使用した:
Phusion HF 5×緩衝液 10μl
25mM dNTP(カタログ番号R0182、Thermo社) 1μl
プライマー(10μM) それぞれ1μl(表のように対形成)
クローン2.1プラスミドDNA 20ng
ヌクレアーゼフリーH2O 50μl最終体積まで
PCRを以下の通り行った;
94℃60秒
30サイクル:94℃30秒
58℃30秒
72℃30秒
72℃5分
10℃で維持
各PCRの産物を、1%アガロースゲル上で分析した(図5(a))。次いで、各産物をFermentas社のPCR精製キット(K0701)を用いて精製した。次いで、アセンブリPCRを設定して完全VH配列を再構築した:
Phusion HF 5×緩衝液 10μl
25mM dNTP(カタログ番号R0182、Thermo社) 1μl
pUCG3-VH-Fプライマー(10μM) 1μl
pUCG3-VH-Rプライマー(10μM) 1μl
精製PCR産物1 5μl
精製PCR産物2 5μl
精製PCR産物3 5μl
精製PCR産物4 5μl
ヌクレアーゼフリーH2O 50μl最終体積まで
94℃60秒
30サイクル:94℃30秒
58℃30秒
72℃30秒
72℃5分
10℃で維持
PCR産物を、1%アガロースゲル上で分析し(図5(b))、Fermentas社のPCR精製キットを用いて40μl溶出緩衝液中で精製した。次いで、PCR産物を実施例2に記載されるライブラリー構築用のメガプライマーとして使用した。
(実施例2)
突然変異誘発クローン1.1及びクローン2.1 VHのファージディスプレイライブラリーの作製
PCRベースの方法を使用して、クローン1.1及びクローン2.1突然変異誘発配列を含むVHファージミドライブラリーを構築した。以下の反応に基づいて、精製VHアセンブリPCR産物(実施例1から)を線状pUCG3ファージミドベクターと共にメガプライマーとして使用して、形質転換及びライブラリー作製用産物を得た;
Phusion GC 2×ミックス 25μl
線状pUCG3 700ng
VH PCR産物 250ng
DMSO 1.5μl
ヌクレアーゼフリーH2O 50μl最終体積まで
PCRを以下の通り行った;
98℃30秒
10サイクル:98℃10秒
58℃20秒
72℃2分
72℃5分
10℃で維持
VH/ファージミドPCR産物を、最終溶出をH2O 25μl中にして、製造業者の指示により、Fermentas社のPCR精製キット(カタログ番号K0702)を用いて精製した。精製VH/ファージミドPCR産物を、BioRad 10×1mmキュベット(BioRad社カタログ番号165-2089)、Eppendorf Eporator及び予熱回復培地(Lucigen社、専売ミックス)を用いる電気穿孔によるTG1大腸菌(Lucigen社、カタログ:60502-2)の形質転換に使用した。精製した産物2μlを電気穿孔のために細胞25μlに添加し、最大10回の電気穿孔を1800Vで各VH/ファージミドに産物ついて行った。電気穿孔した細胞を50ml Falconチューブにプール及び回収し、150rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。形質転換物の一定分量の10倍希釈系列を行い、2%(w/v)グルコース及び100μg/mlアンピシリンを補足した2×TY寒天を含有するペトリ皿に蒔いた。これらの皿上に得られたコロニーを使用してライブラリーサイズを推定した。形質転換の残りを、2%(w/v)グルコース及び100μg/mlアンピシリンを補足した2×TY寒天を含有する大型フォーマットBioassay板に蒔いた。全ての寒天平板を30℃で一晩インキュベートした。2×TYブロス10mlを大型フォーマットバイオアッセイ板に添加し、コロニーをこすり取り、OD600を測定した(OD1.0=5×108個細胞/ml)。一定分量を、50%v/vグリセロール溶液(50%)を添加した後に冷結保存バイアル中-80℃で保存した、又はファージ選択工程に直接使用した。
いくつかの例では、クローンを直接選抜し、配列を決定してライブラリーの多様性を推定した。クローン1.1とクローン2.1の両方について、変異原性PCR反応によって生成されたVH多様性を完全に反映するために、1e8(1×108)超の組換え体を含むファージディスプレイライブラリーを構築した。
(実施例3)
突然変異誘発クローン1.1及びクローン2.1VHライブラリーのファージディスプレイ選択
ライブラリーファージストックの調製及びファージディスプレイ選択を公開されている方法(Antibody Engineering、編者Benny Lo、第8章、161〜176頁、2004)に従って行った。ほとんどの場合で、パンニング手法と組み合わせたファージディスプレイを用いて結合VHドメインを単離した。しかしながら、可溶性選択、ストレス(例えば、熱)下で行う選択及び競合的選択(過剰な抗原又は抗原反応性VHドメインを競合として添加して高親和性VHドメインの回収を促進する又は特定のエピトープから離れた選択をそらす)を含む、種々の異なる選択法が当分野でよく記載されている。
クローン1.1とクローン2.1の両方の組換えライブラリーについて、1ラウンドのパニング選択を行い(抗原をPBS中10μg/mlの50μl体積でmaxisorbプレート(Nunc社443404)に固定した)、引き続いて連続した選択ラウンドで減少する量の抗原を用いて2〜3ラウンドの可溶性選択を行った(1nmから100pMのビオチン化抗原まで)。
(実施例4)
結合親和性が改善したVHの同定
異なる選択からのVHを、BIAcore社のT200機器を用いてスクリーニングして、結合親和性が改善したVHを同定した。
組換えIL-17A(Peprotech社AF-200-17)を酢酸緩衝液、pH5.5(BIAcore社、カタログ番号BR-100-52)に1μg/mlまで希釈し、アミンカップリング化学(NHS-EDCアミンカップリングキット、カタログ番号BR-1000-50)及びBIAcore社固定化Wizardソフトウェアを用いてCM5 Series Sチップ(カタログ番号BR-1006-68)にカップリングした。このようにして、100RUのIL-17Aを固定化し、ブランク表面(IL-17A無し)も基準減算のために調製した。IL-17RAについて、最初にタンパク質Gを酢酸緩衝液、pH4(BIAcore社、カタログ番号BR-100-49)に20μg/mlまで希釈することによってタンパク質Gチップを調製し、次いで、アミンカップリング化学反応を用いて1200RUをCM5 Series Sチップにカップリングした。次いで、この表面を使用して溶液からIL-17RA Fc融合タンパク質を捕捉した:HBS中10μg/mlのIL-17RAを30μl/分流量で10秒間注射すると、タンパク質G表面上に約100〜150RUのIL-17RAが捕捉されるだろう。
最適化クローン1.1(抗IL-17A)及びクローン2.1(抗IL-17RA)VHの結合速度論を、単一サイクル速度論によって決定した。VHを希釈系列(典型的には最高濃度100nM VHで始まる1:3希釈系列)で調製し、次いで、抗原コーティング表面及びブランク表面上にも最低濃度のVHで始めて、次いで、最高濃度まで徐々に進めて注射した。次いで、1:1結合モデル及びBIAevaluationソフトウェアを用いて、(ブランクを減算した)センサーグラムトレースからVH結合速度論を決定した。
BIAcore分析後、IL-17Aに対して最大10倍親和性が改善したクローン1.1の変異体を組換えライブラリーから単離した(例えば、クローン1.10及びクローン1.6のクローン、図6(a))。同様に、クローン2.1について、IL-17RAに対する親和性が5倍改善した新たな変異体(クローン2.2)を単離した(図6(b))。
配列列挙情報
VH核酸配列
1.1
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTCGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCCACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(配列番号9)

1.6 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCAAGATGGAAGTGAGCAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号10)

1.10
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATCGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAGAACAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA(配列番号11)

2.1
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACCCCTTCACCAGTTATGATATCAATTGGGTGCGACAGGCCACAGGACAAAGCCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTAACAGTGGTGACACAGTCTATGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGAATACCTCCATAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTTTTGTGCGAGAGGCAGAAGGGATGACTGGAAGAACAATTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(配列番号12)

2.2 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACCCCTTCACCAGTTATGATATCAATTGGGTGCGACAGGCCACAGGACGAAGCCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTACCAATGGTAACACAGTCTATGCACAGAAATTCCAGGACAGAGTCACCATGACCAGGAATACCTCCATAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTTTTGTGCGAGAGGCAGAAGGGATGACTGGAAGAACAATTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(配列番号13)

Claims (23)

  1. 第1のリード免疫グロブリンの生物学的特性を最適化するために免疫グロブリンライブラリーを設計する方法であって、
    α)第1のリード免疫グロブリン及び1つ又は複数の関連免疫グロブリンを含む複数の免疫グロブリンを生成及び配列決定する工程であって、前記複数の免疫グロブリンが、非ヒト哺乳動物を標的抗原で免疫化することによって生成される工程と；
    β)第1のリード免疫グロブリンを所望の特性に基づいて同定する工程と；
    a)第1のリード免疫グロブリンに関連しており、前記第1のリード免疫グロブリンと共通の系列であり、前記第1のリード免疫グロブリンと同じ標的抗原に結合する1つ又は複数の関連免疫グロブリンを同定する工程であって、各免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的抗原による免疫化によって標的抗原に対して産生され、前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンが、前記非ヒト哺乳動物の生殖系列配列の体細胞超変異による同じ生殖系列配列に由来する工程と;
    b)前記第1のリード免疫グロブリンと前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較する工程と;
    c)配列比較に基づいて、
    (i)前記第1のリード免疫グロブリンと前記1つ若しくは複数の関連免疫グロブリンの間、及び/又は
    (ii)前記1つ若しくは複数の関連免疫グロブリンが複数の免疫グロブリンである場合、前記複数の免疫グロブリンの間
    に変異アミノ酸残基が存在する1つ又は複数の部位を同定する工程であって、
    変異アミノ酸残基が存在する前記1つ又は複数の部位が前記第1のリード免疫グロブリンの修飾のための潜在的な部位である、免疫反応中に標的化される体細胞超変異ホットスポットを含む工程と;
    d)配列比較に基づいて、前記第1のリード免疫グロブリンのアミノ酸を前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンの対応する変異アミノ酸で置き換えるために、修飾のための1つ又は複数の部位を選択する工程と;
    e)修飾のための選択された部位のうちの1つ又は複数において改変された、前記第1のリード免疫グロブリンの配列に基づくライブラリーのための免疫グロブリン配列を生成する工程と
    を含む方法。
  2. 前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンが、前記リード免疫グロブリンに対して少なくとも1つのCDR領域における少なくとも70%、80%、85%、90%、95%の相同性を有する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンが、前記リード免疫グロブリンに対してCDR3における少なくとも70%の相同性を有する、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンが、前記リード免疫グロブリンに対してCDR1及び/又はCDR2における少なくとも70%の相同性を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記1つ又は複数の関連免疫グロブリンが、前記リード免疫グロブリンに対してフレームワーク領域における少なくとも70%の相同性を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記複数の関連免疫グロブリンが少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20又は25個の免疫グロブリンを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程c)が、前記免疫グロブリン配列のCDR中の修飾のための部位を同定する工程を含み、変異アミノ酸残基が前記関連免疫グロブリンのうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ又は5つの中に存在する場合、前記CDR中の部位が修飾のための部位とみなされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程c)が、前記免疫グロブリン配列のCDR以外の部分の修飾のための部位を同定する工程を更に含み、変異アミノ酸残基が前記関連免疫グロブリンのうちの少なくとも20%中に存在する場合、前記CDR以外の部分の部位が修飾のための部位とみなされる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 修飾のための部位として同定され得る前記CDR以外の部位が、前記部位の改変により(i)不対システイン、(ii)酸化部位(遊離メチオニン)、(iii)グリコシル化部位、(iv)脱アミド部位及び(v)異性化部位の特徴のうちの1つ又は複数が改変された免疫グロブリンへ導入される場合、修飾のための部位として同定されない、請求項8に記載の方法。
  10. 工程d)で選択される配列が、前記修飾のための部位における改変のそれぞれの可能な組み合わせを反映する変異配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記修飾のための部位での前記改変が、保存的アミノ酸置換のみを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記変異免疫グロブリンが、前記修飾のための部位以外での改変を含まない、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 工程e)が追加の変異免疫グロブリンの配列を生成する工程を更に含み、前記配列が、前記第1のリード免疫グロブリンのアミノ酸を対応する変異アミノ酸に対する保存的アミノ酸置換で置き換えるように、修飾のための選択された部位のうちの1つ又は複数で更に改変される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程e)が追加の変異免疫グロブリンの配列を生成する工程を更に含み、前記配列が、前記第1のリード免疫グロブリンのアミノ酸を、前記関連免疫グロブリンの対応する残基で確認されないアミノ酸で置き換えるように、修飾のための選択された部位のうちの1つ又は複数で更に改変される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 工程e)で生成された配列を有する免疫グロブリンを含む免疫グロブリンライブラリーを作製する工程f)を更に含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 所望の生物学的特性を有する1つ又は複数の免疫グロブリンを同定するために前記免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングする工程g)を更に含む、請求項15に記載の方法。
  17. 前記複数の免疫グロブリンが、マウス又はラットを標的抗原で免疫化することによって生成される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記免疫グロブリンが抗体又は抗体の抗原結合フラグメントである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記免疫グロブリンが、重鎖のみの抗体を含む又は重鎖のみの抗体のみからなる、請求項18に記載の方法。
  20. 前記免疫グロブリンが、抗体のVHドメインを含む又は抗体のVHドメインのみからなる、請求項18に記載の方法。
  21. リード免疫グロブリンを最適化する方法であって、
    A)請求項1から20のいずれか一項に記載の方法を行う工程と;
    B)最適化免疫グロブリンの所望の特性に基づいて、前記ライブラリーから1つ又は複数の最適化免疫グロブリンを選択する工程と
    を含む方法。
  22. 免疫グロブリンを得る方法であって、請求項21に記載の方法で免疫グロブリンを設計する工程と、請求項21に記載の方法で選択された免疫グロブリンをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を用意する工程と;前記宿主細胞に、前記ベクターに含まれる核酸分子によってコードされる前記免疫グロブリンを発現させる工程と;前記免疫グロブリンを精製する工程とを含む方法。
  23. 前記免疫グロブリンを含む医薬製剤を調製する工程を更に含む、請求項22に記載の方法。
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