JP6119960B2 - 肥満を治療するための薬理学的シャペロン - Google Patents

Description

本発明は、正常なメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）活性を促進する方法、及びＭＣ４Ｒのタンパク質の折畳み及び／又はプロセッシングに影響する１又は複数の変異を有するＭＣ４Ｒの活性の促進に関する。本発明は、細胞表面のＭＣ４Ｒの活性増加が有益である状態（例えば、肥満のような）である個体を、ＭＣ４Ｒに対して有効な量の薬理学的シャペロンの投与によって治療する方法を提供する。本発明は、ＭＣ４Ｒの活性を促進するＭＣ４Ｒ薬理学的シャペロンを供給する。本発明は、細胞表面でＭＣ４Ｒの活性を促進するために、小胞体（ＥＲ）におけるＭＣ４Ｒの折畳みを促進する薬理学的シャペロンを同定するためのスクリーニング方法をさらに提供する。

［関連優先権の相互参照］
本出願は、２００５年６月３日に出願された米国特許出願第６０／６８７，６４８号、２００６年５月１２日に出願された同第６０／７９９，９６８号、そして２００６年６月２日に出願され、まだ割り当てられていない他の１つからの優先権を主張し、各々その全体は参照により本明細書において援用される。

肥満
肥満は体重の障害の中で最も一般的なものを表わし、西欧諸国において最も重要な栄養障害であり、推定罹患率は中年集団の３０％〜５０％にわたる。太り過ぎ及び肥満のアメリカ人の数は１９６０年以来、速度を落とすことなく、増加し続けた。今日、成人アメリカ人の６４．５パーセント（約１億２７００万人）は、太り過ぎ又は肥満として分類される。毎年、肥満により米国において少なくとも３００，０００人が死亡し、肥満によるアメリカの成人医療費は総計およそ１０００億ドルまでになる（米国肥満学会）。

肥満は、高血圧、糖尿病（２型）、高脂血症、心臓疾患、高血圧症、卒中、胆嚢疾患、乳癌、前立腺癌及び結腸癌のような状態を発症するの個人のリスクを増加させる（例えば、Nishina, P. M. et al, 1994, Metab. 43: 554-558;Grundy, S. M. &Barnett, J. P., 1990, Dis. Mon. 36: 641-731を参照）。米国において、太り過ぎ又は肥満の発生が、カフカス系アメリカ人と比較して、アフリカ系アメリカ人及びスペイン系アメリカ人ような人種／民族的マイノリティー集団中でより高い比率で生じる。女性及びマイノリティー集団内の社会経済的地位の低い人は、特に太り過ぎ及び肥満の影響を受けやすいようである。この傾向は成人に限定されない。子ども（６〜１１才）のおよそ３０．３パーセントは太り過ぎであり、１５．３パーセントは肥満である。若者（１２〜１９才）に関しては、３０．４パーセントは太り過ぎであり、１５．５パーセントは肥満である。成人の間で一般的な糖尿病、高血圧症及び他の肥満関連の成人病は、今や子ども及び若年層においてよりありふれたものになった。貧弱な食習慣及び不活動性は、青少年における肥満の増加に寄与すると報告されている。

さらに、小児肥満症を発症するためのリスクファクターは、太り過ぎの親を持つこと、又は子どもの体重に無関心な親、多大な供給量によるエネルギー摂取量の増加、座ってばかりいるライフスタイルの増加及び移動に関する活動（学校又はバス停留所へ歩いて行くこと）の低下、高レベルの怒り／フラストレーションを伴う気質を有していること（そのことによって、親は、子供のかんしゃくを鎮めるために追加の食物及びカロリーを与えてしまう）；ダウン症候群であること、母親の妊娠肥満度指数（ＢＭＩ）、及び長子の地位（肥満率を増加させる）を含む。

成人における肥満の診断に使用された１つの手法は、個人のＢＭＩ（身長に対する体重の測定）の計算である（Garrow and Webster, International Journal of Obesity 1985; 9:147-153）。ＢＭＩが２５〜２９．９の個人は太り過ぎであるが、ＢＭＩが３０以上は肥満の指標となる。子どもについては、ＢＭＩは性特異的及び年齢特異的である（Pietrobelli et al, Journal of Pediatrics 1998; 132:204-210）。

成人期における肥満の発症についてのリスクファクターは、貧弱な食餌（高カロリー、低栄養素）；身体活動の欠如；様々なシフトでの労働；禁煙、まれな遺伝病のような或る特定の病状の発症、及びホルモン失調（甲状腺機能低下、クッシング病及び多嚢胞性卵巣症候群ような）；或る特定の薬剤（ステロイド及びいくつかの抗うつ薬）；人種又は民族的マイノリティー（特に女性のマイノリティー）であること；社会経済的地位の低さ；年齢（２０〜５５才でリスクが増加）、妊娠；及び退職（スケジュール変更のため）を含む。

メラノコルチン４受容体及び肥満
メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）は、体重の調節に関わっている（Graham et al, Nat. Genetics 1997; 17: 273-4）。ＭＣ４Ｒは食物摂取量に影響を及ぼす視床下部を含む脳で発現している。ＭＣ４Ｒ活性に影響する多数の変異が発見され、多数が早発（幼年期）肥満を含む肥満に関係している（Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:22939-45; Branson et al.,New Eng. J. Med. 2003, 348:1096-1103; Gu et al., Diabetes 1999, 48:635-39;Farooqi et al., New Eng. J. Med 2003, 348:1085-95; Tao et al., Endocrinology2003, 144:4544-51）。

最新の治療
最新の抗肥満薬は、限定的な有効性及び多数の副作用を有する（Crowley, V. E., Yeo, G. S. & O'Rahilly, S., Nat. Rev. DrugDiscov. 2002; 1, 276-86）。肥満の世界規模での蔓延にともない、この領域では十分な治療法の開発に対する差し迫った必要性がある。近年、食欲、身体エネルギー消費、及び脂肪量蓄積の調節に関するホルモン及びニューロペプチドが、潜在的な抗肥満薬として現れた（McMinn, J. E., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W., Obes Rev 2000;1:37-46; Drazen, D. L. & Woods, S. C, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2003;6:621-629）。しかしながら、現在のところ、これらのペプチドは非経口的投与を必要とする。肥満を制御するための、長期間にわたる毎日の注射の可能性（肥満は慢性症状なので）はあまり望ましくなく、これらの薬剤の使用は限定される。

分子シャペロンは適切なタンパク質の折畳みを安定化する
タンパク質は細胞質で合成され、新規合成タンパク質は大部分は折畳まれていない状態で小胞体（ＥＲ）の内腔へ分泌される。一般に、タンパク質の折畳みは、自己集合の原則によって支配される。新しく合成されたポリペプチドは、アミノ酸配列に基づいたこれらの未変性コンフォメーションへと折畳まれる（Anfinsen et al., Adv. Protein Chem. 1975; 29:205- 300）。周囲温度及び高タンパク濃度の組合せが凝集の過程を刺激し、通常は疎水性コアに埋没したアミノ酸が、隣接するアミノ酸と非特異的に相互作用するので、ｉｎ ｖｉｖｏではタンパク質の折畳みは複雑である。この問題を回避するために、タンパク質の折畳みは、シャペロンと呼ばれる特殊なタンパク質群によって通常は促進され、シャペロンは折畳まれていないタンパク質が未変性コンフォメーションへと再び折畳まれるように、このタンパク質に結合することによって新生ポリペプチド鎖が凝集するのを防ぐ（Hartl, Nature 1996; 381:571-580）。

内在性の分子シャペロンは、実質的にはすべての型の細胞及びほとんどの細胞内コンパートメントに存在する。いくつかは、タンパク質の輸送に関与し、熱ショック及びグルコース飢餓のようなストレス下で細胞が生存することを可能にする（Gething et al., Nature 1992; 355:33-45; Caplan, Trends Cell. Biol.1999; 9:262-268; Lin et al., Mol. Biol. Cell. 1993; 4:109-1119; Bergeron etal., Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128）。内在性のシャペロンの中で、ＢｉＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、Ｇｒｐ７８）は、最も特徴が明らかにされたＥＲのシャペロンである（Haas, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1991; 167:71-82）。他のシャペロンのように、ＢｉＰは、成熟を通じてＥＲ中の多くの分泌タンパク質及び膜タンパク質と相互作用する。新生タンパク質の折畳みが円滑に進む場合、この相互作用は通常は弱く一時的である。一旦、天然タンパク質コンフォメーションが達成されれば、分子シャペロンはもはやタンパク質と相互作用しない。折畳まれないタンパク質、集合しないタンパク質、又は適切に糖鎖が付加しないタンパク質へのＢｉＰ結合は安定するようになり、通常ＥＲ関連分解経路によってタンパク質の分解がもたらされる。この過程は、適切に折畳まれ集合したタンパク質のみがさらなる成熟のためにＥＲから輸送されることを保証して、ＥＲにおける「品質管理」システムとして役立ち、不適切に折畳まれたタンパク質は、後の分解のために保存される（Hurtley et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 1989; 5:277-307）。熱力学的タンパク質の折畳み過程及びＥＲの品質管理システムの非効率的な共同作用のために、新生（変異してない）タンパク質のごく一部分のみが機能的なコンフォメーションへ折畳まれるようになり、うまくＥＲから放出される。

特異的な酵素阻害因子に由来した薬理学的シャペロンは変異酵素を助け、野生型酵素を促進する
リソゾーム貯蔵障害（ＬＳＤ）関連酵素の低分子阻害因子は、変異酵素の折畳み及び活性の両方を助けることができ、野生型酵素の折畳み及び活性を促進することができることが、以前に示されている（米国特許番号６，２７４，５９７；同第６，５８３，１５８号；同第６，５８９，９６４号；同第６，５９９，９１９号；及び同第６，９１６，８２９号を参照、すべて参照により本明細書において組み入れられる）。特に、ＬＳＤ関連変異酵素の特異的な拮抗的阻害因子であるグルコース及びガラクトースの低分子誘導体の投与は、変異酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの安定性を効果的に増加させ、変異酵素活性を促進することが発見された。この戦略を支持する元の理論は以下のとおりである：変異酵素タンパク質はＥＲ中で誤って折畳まれるので（Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815）、酵素タンパク質は、正常な輸送経路（ＥＲ→ゴルジ体→エンドソーム→リゾソーム）中で滞り、急速に分解される。したがって、変異タンパク質がＥＲの品質管理システムから円滑に脱け出すことを促進するために、変異タンパク質の正確な折畳みを安定化する化合物は、活性部位に特異的なシャペロンとして役立つだろう。酵素阻害因子は触媒中心をふさぎ、培養細胞及び動物において酵素コンフォメーションの安定化をもたらす。酵素の活性部位に結合するので、これらの特異的なシャペロンは「活性部位特異的なシャペロン（ＡＳＳＣ）」と呼ばれた。

変異酵素を助けることに加えて、ＡＳＳＣは、組換体の野生型酵素のＥＲ分泌及び活性を促進する。ＡＳＳＣは、過剰発現された野生型酵素の折畳みを促進し、さもなくば、酵素の過剰発現及び過剰生産がＥＲの能力を上回り、タンパク質の凝集及び分解をもたらすので、ＥＲの品質管理システムで滞る。したがって、ＥＲから抜け出すのに適切なコンフォメーションの酵素を安定化するために、折畳みの間に安定した酵素の分子コンフォメーションを誘導する化合物は、「シャペロン」として役立つ。上に言及されたように、酵素については、１つのそのような化合物は、酵素の拮抗阻害剤であると予想外に判明した。

シャペロンによる他のタンパク質の促進
ＬＳＤに加えて、多くの種々の疾患は、今や非天然タンパク質コンフォメーションを採ることによって引き起こされる「コンフォメーション的な疾患」として認識され、ＥＲ中のタンパク質の停滞及びタンパク質の最終分解をもたらすかもしれない（Kuznetsov et al., N. Engl. J. Med. 1998; 339:1688-1695; Thomas etal., Trends Biochem. Sci 1995; 20:456-459; Bychkova et al., FEBS Lett. 1995;359:6-8; Brooks, FEBS Lett. 1997; 409:115-120）。

例えば、低分子合成化合物は腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３の変異型のＤＮＡ結合ドメインを安定化し、それによって、タンパク質が活性のあるコンフォメーションを維持することを可能にすることが発見された（Foster et al., Science 1999; 286:2507-10）。受容体の合成は、低分子受容体アンタゴニスト及びリガンドによって助けられることが示された（Morello et al., J Clin. Invest. 2000; 105: 887-95; Petaja-Repoet al., EMBO J. 2002; 21 :1628-37）。膜チャンネルタンパク質及び他の細胞膜トランスポーターの薬理学的補助（rescue）でさえチャンネル遮断薬又は基質を使用して実証された（Rajamani etal., Circulation 2002; 105:2830-5; Zhou et al., J Biol. Chem. 1999;274:31123-26; Loo et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 709-12; Pedemonte et al.,J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71）。

当該技術分野において、特に、ＭＣ４Ｒ変異に関連及び非関連の両方のＭＣ４Ｒタンパク質機能の欠損に取り組む必要性が残る。

本明細書において記述されるように、本発明は、メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）をコードする遺伝子に折畳み変異を有する被験体において、又は野生型ＭＣ４Ｒ活性の増加が有益な被験体において、ＭＣ４Ｒの活性を促進する（例えば肥満の治療のための）方法を提供する。

１つの実施の形態では、本発明は、ＭＣ４Ｒ発現細胞を有効量の薬理学的シャペロンに接触させることによって、細胞内におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの折畳みを、機能的なコンフォメーションへと促進する方法を提供する。ＭＣ４Ｒの細胞内における折畳みの促進は、例えば視床下部のニューロンの細胞表面上での発現増強をもたらし、摂食衝動を減少させ、したがって、過食症のような過食障害の治療に有用である。

１つの実施の形態では、ＭＣ４Ｒポリペプチドは野生型ＭＣ４Ｒポリペプチドであり、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に示される配列がある。

別の実施の形態では、ＭＣ４Ｒポリペプチドは変異ＭＣ４Ｒポリペプチドである。この実施の形態では、変異ポリペプチドは、細胞内におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの折畳みの減少又は不適切な折畳みをもたらす１つ又は複数の変異を含む。例示的な変異は、以下のとおりである：Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ、Ｒ１６５Ｗ、Ｉ１２５Ｋ、Ｃ２７１Ｙ、Ｔ１１Ａ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ３１６Ｌ、Ｉ３１６Ｓ、Ｉ３１７Ｔ、Ｎ９７Ｄ、Ｇ９８Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｃ２７１Ｒ、Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ９７Ｄ、Ｙ１５７Ｓ、Ｉ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｐ、Ｌ２５０Ｑ、Ｙ２８７Ｘ、Ｐ２９９Ｈ、Ｓ５８Ｃ、コドン２１１でのＣＴＣＴ、及びコドン２４４でのＴＧＡＴ挿入。

１つの実施の形態では、薬理学的シャペロンはＭＣ４Ｒアンタゴニストである。他の実施の形態では、薬理学的シャペロンはＭＣ４Ｒアゴニストである。他の実施の形態では、薬理学的シャペロンはＭＣ４Ｒ部分アゴニスト及び／又はインバースアゴニストである。

本発明は、ＭＣ４Ｒポリペプチドの細胞表面の発現を促進する方法も提供する。この方法は、ＭＣ４Ｒ発現細胞を有効量の薬理学的シャペロンと接触させることを含む。本発明のこの実施の形態は、野生型ＭＣ４Ｒポリペプチド及び変異ＭＣ４Ｒポリペプチドの両方に関し、薬理学的シャペロンはＭＣ４Ｒポリペプチドの細胞内の折畳みを促進する方法について上記されている。

本発明はまた、ＭＣ４Ｒポリペプチドのためのシャペロンを同定するスクリーニング方法であって、ＭＣ４Ｒポリペプチドを発現する細胞を含む反応混合物へ試験化合物を接触させること、試験化合物の存在下で、反応混合物中のＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面の局在性を検出すること、並びに上記試験化合物の存在下におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面の局在性を、上記試験化合物の非存在下におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面の局在性と比較することによって、ＭＣ４Ｒポリペプチドのためのシャペロンを同定するスクリーニング方法を提供し、ここで試験化合物の非存在下と比較して、試験化合物の存在下において、促進された安定性、活性及び／又は細胞表面の局在性の検出により、試験化合物がＭＣ４Ｒポリペプチドのためのシャペロンであることが示される。

このスクリーニング方法の１つの実施の形態では、ＭＣ４Ｒポリペプチドは、配列番号２、４、６及び８から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。

このスクリーニング方法の別の実施の形態では、ＭＣ４Ｒポリペプチドは、ＭＣ４Ｒポリペプチドの誤った折畳みに関連した変異を含む。具体的な実施の形態では、誤った折畳みの変異は、Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ又はＲ１６５Ｗ、Ｉ１２５Ｋ、Ｃ２７１Ｙ、Ｔ１１Ａ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ３１６Ｌ、Ｉ３１６Ｓ、Ｉ３１７Ｔ、Ｎ９７Ｄ、Ｇ９８Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｃ２７１Ｒ、Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ９７Ｄ、Ｙ１５７Ｓ、Ｉ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｐ、Ｌ２５０Ｑ、Ｙ２８７Ｘ、Ｐ２９９Ｈ、Ｓ５８Ｃ、コドン２１１でのＣＴＣＴ又はコドン２４４でのＴＧＡＴ挿入の１つ又は複数の変化である。

１つの実施の形態では、反応混合物は細胞に基づく。他の実施の形態では、反応混合物は無細胞系である。

１つの実施の形態では、このスクリーニング方法は、例えば細胞表面上のＭＣ４Ｒポリペプチドの活性を検出することをさらに含む。他の実施の形態では、このスクリーニング方法は、ｃＡＭＰ活性化によって測定される。

本発明は、詳細な記述及び実施例への参照によって、さらに理解されるだろう。

［詳細な記述］
本発明は、小分子が変異ＭＣ４Ｒポリペプチド及び野生型ＭＣ４Ｒポリペプチドのタンパク質の折畳み及びプロセッシングを助け、ニューロンの細胞表面上のタンパク質安定性を促進し、そして空腹及び過食を減少させることが確認される発見に関する。薬理学的シャペロンは、ＭＣ４Ｒタンパク質に特異的に結合し、変異ＭＣ４Ｒ又は野生型ＭＣ４Ｒの機能的なコンフォメーションを誘導又は安定化させる。したがって本発明は、細胞表面の野生型ＭＣ４Ｒの発現増強と同様に、変異ＭＣ４Ｒを特異的に助けることができる。したがって、ＭＣ４Ｒの補助又はＭＣ４Ｒの安定性若しくは活性の増加が望ましいような障害の治療に、例えば太り過ぎ又は肥満に、ＭＣ４Ｒに対する薬理学的シャペロンは使用することができる。

本発明は、ヒトへの薬理学的シャペロンの投与が、野生型タンパク質の活性レベルの意味のある増加をもたらしたという発見に一部分基づいている。この発見は、ＥＲにおける適切なタンパク質の折畳みを促進する薬理学的シャペロンの能力についての理解と組み合わせて、正確なタンパク質輸送及び有意に増加したタンパク質活性を導き、特にヒト被験体において、疾患、障害又は症状を、転換又は改善するのに十分なタンパク質活性を達成する能力を有利に提供する。この現象は、「化学的なシャペロン」と呼ばれる、すべてのタンパク質の発現を増加させるように通常は働く化合物を使用する方法とは対照的に、特定の薬理学的シャペロンによって特異的に結合されたタンパク質に高度に特異的である。

特定の実験結果は本発明の基礎となる：薬理学的シャペロンは、薬理学的シャペロンの投与後に、低用量ではヒトにおける内在性の野生型タンパク質活性を正常の約１２０％、正常の１３０％、及び正常の１４５％、並びに高用量では正常の１５０％、及び１８５％に増加させた（実施例７及び図１２を参照）。ｉｎ ｖｉｖｏにおける増加のこのレベルは、薬理学的シャペロンに曝露され続ける組織培養物中の細胞による結果からは、予測できなかった。例えば、米国特許第６，２７４，５９７号には、薬理学的シャペロンのデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された正常リンパ芽球のα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）活性が、３０％増加したことが記述されている。生理的な除去過程が正常なタンパク質に対する薬理学的シャペロンの効果をｉｎ ｖｉｖｏで弱めると予想されるだろうという予想を考えると、薬理学的シャペロンが野生型タンパク質活性の有意な増加をもたらすであろうことは予想されなかった。米国特許第６，２７４，５９７号の実施例１０には、薬理学的シャペロンで１週間治療されたトランスジェニックマウスにおける変異酵素の活性の増加が記述されている。しかしながら、これらの実験は、助けられたタンパク質の野生型でない変異型に関するものであり、マウスで行なわれたので、結果はヒトにおける野生型タンパク質に対して観察された結果の予測又は示唆ではなかった。

薬理学的シャペロンが、ｉｎ ｖｉｖｏにおける野生型タンパク質の活性レベルを少なくとも２０〜２５％まで、すなわち、特に少なくとも約５０％まで（１．５倍、正常の１５０％）ではなく、少なくとも正常の１．２倍又は１２０％、又は３０％まで（１．３倍、正常の１３０％）、及び４０％まで（１．４倍、正常の１４０％）増加させるかもしれないと予想する根拠はなかった。さらに、本明細書において例示されるように、被験体へのＤＧＪの投与はα−Ｇａｌ Ａの用量依存的な増加をもたらした。この特別な効果は薬理学的シャペロンの力価測定に起因し、開示された活性増加又は野生型タンパク質増加の達成のため、既にタンパク質の変異型を助ける既存の技術に従って実証されている。したがって、本発明は、野生型タンパク質の活性レベルを増加させる変異タンパク質の活性を助けるために発見された、薬理学的シャペロンの用量を規定量で力価測定することを提供する。

定義
本発明の文脈内、及び各々の用語が使用される場合での具体的な文脈中での、本明細書において通常使用される用語は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物及び方法、並びにそれらの作成法及び使用法を記述する際に当業者に追加指導を提供するために、或る特定の用語は、以下で又は本明細書の他の部分で検討される。

本明細書において使用されるように、用語「薬理学的シャペロン」、又は時には「特異的な薬理学的シャペロン」（「ＳＰＣ」）は、ＭＣ４Ｒと特異的に結合し、１つ又は複数の以下の効果を有する分子を指す：（ｉ）タンパク質の安定した分子コンフォメーションの形成の促進；（ｉｉ）ＥＲから他の細胞位置、好ましくは本来の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送の促進、すなわちタンパク質のＥＲ関連分解の防止；（ｉｉｉ）コンフォメーション的に不安定な、すなわち誤って折畳まれるタンパク質の凝集の防止；（ｉｖ）タンパク質の、少なくとも部分的な野生型の機能、安定性、及び／又は活性を修復又は促進；及び／又は（ｖ）ＭＣ４Ｒを有する細胞の表現型又は機能の改善。したがって、ＭＣ４Ｒに対する薬理学的シャペロンは、ＭＣ４Ｒの適切な折畳み、輸送、非凝集及び活性をもたらす、ＭＣ４Ｒと結合する分子である。本明細書において使用されるように、この用語は、ＢｉＰのような内在性シャペロン、又はグリセロール、ＤＭＳＯ、若しくは重水（すなわち化学的シャペロン）のような、様々なタンパク質に対する非特異的シャペロン活性が実証された非特異的薬剤を指さない（Welch et al., Cell Stress and Chaperones 1996; 1（2）: 109-115; Welch et al., Journal ofBioenergetics and Biomembranes 1997; 29（5） :491-502；米国特許第５，９００，３６０号；米国特許第６，２７０，９５４号；及び米国特許第６，５４１，１９５号を参照）。それには、特異的結合分子、例えば特異的な薬理学的シャペロン（上に説明された）、阻害剤又はアンタゴニスト、及びアゴニストが含まれる。

本明細書において使用されるように、用語「特異的に結合する」は、ＭＣ４Ｒとの薬理学的シャペロンの相互作用、具体的には、薬理学的シャペロンとの接触に直接関与するＭＣ４Ｒのアミノ酸残基による相互作用を指す。関連タンパク質又は非関連タンパク質の総括的な群に対してではなく、ＭＣ４Ｒに対してシャペロン効果を発揮するために、薬理学的シャペロンは、標的タンパク質（ここではＭＣ４Ｒ）に特異的に結合する。任意の所定のＭＣ４Ｒ薬理学的シャペロンと相互作用するＭＣ４Ｒのアミノ酸残基は、ＭＣ４Ｒリガンド結合ドメイン（すなわち天然リガンドＭＳＨを結合するドメイン）、又は任意の他のＭＣ４Ｒ「活性部位」（例えばＧタンパク質結合ドメイン）内にあってもよいし、又はなくてもよい。特異的結合は、ルーチンの結合分析又は構造研究（例えば共結晶化、ＮＭＲ等）によって評価することができる。ＭＣ４ＲのＭＳＨリガンド結合ドメインのアミノ酸の例は、Ｐｈｅ２８４及びＴｙｒ２６８（例えば、配列番号２を参照配列として使用）を含むが、これらに限定しない。

１つの非限定実施形態では、薬理学的シャペロンはＭＣ４Ｒの阻害剤又はアンタゴニストである。他の非限定実施形態では、薬理学的シャペロンはＭＣ４Ｒのアゴニストである。さらに他の実施形態では、薬理学的シャペロンは混合アゴニスト／アンタゴニストである。本明細書において使用されるように、用語「アンタゴニスト」はタンパク質と結合し、ＭＣ４Ｒの活性を部分的に又は完全に遮断、阻害、減少、又は中和する任意の分子を指す。用語「アゴニスト」は、タンパク質と結合し、ＭＣ４Ｒの活性を少なくとも部分的に増加、促進、修復、又は模倣する任意の分子を指す。以下で説明されるように、そのような分子がＭＣ４Ｒでは知られている。

本明細書において使用されるように、用語「ＭＣ４Ｒのコンフォメーション的な安定性を促進する」又は「ＭＣ４Ｒのコンフォメーション的な安定性を増加する」は、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触しない細胞（好ましくは同一の細胞型、又は例えば初期の同一の細胞）におけるＭＣ４Ｒに比べて、ＭＣ４Ｒに対する特異的な薬理学的シャペロンと接触した細胞において、機能的なコンフォメーションを取り入れたＭＣ４Ｒの量又は比率が増加することを指す。１つの実施形態では、細胞はコンフォメーション的な変異ＭＣ４Ｒを発現しない。他の実施形態では、細胞は、例えばコンフォメーション的な変異ＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする、変異ＭＣ４Ｒポリヌクレオチドを発現する。

本明細書において使用されるように、用語「ＭＣ４Ｒの輸送を促進する」又は「ＭＣ４Ｒの輸送を増加する」は、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触しない細胞（好ましくは同一の細胞型、又は例えば初期の同一の細胞）におけるＭＣ４Ｒの輸送効率に比べて、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触した細胞において、ＭＣ４Ｒの細胞膜への輸送効率が増加することを指す。

本明細書において使用されるように、用語「ＭＣ４Ｒの活性を促進する」又は「ＭＣ４Ｒの活性を増加する」は、本明細書において記述されるように、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触しない細胞（好ましくは同一の細胞型、又は例えば初期の同一の細胞）におけるＭＣ４Ｒの活性に比べて、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触した細胞において、ＭＣ４Ｒの活性が増加することを指す。

本明細書において使用されるように、用語「ＭＣ４Ｒレベルを促進する」又は「ＭＣ４Ｒレベルを増加する」は、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触しない細胞（好ましくは同一の細胞型、又は例えば初期の同一の細胞）中のＭＣ４Ｒのレベルに比べて、ＭＣ４Ｒに特異的な薬理学的シャペロンと接触した細胞中のＭＣ４Ｒのレベルが増加することを指す。

用語「適切なコンフォメーションを安定化する」は、ＭＣ４Ｒの薬理学的シャペロンが野生型ＭＣ４Ｒタンパク質のコンフォメーションと機能的に同一の変異ＭＣ４Ｒタンパク質のコンフォメーションを誘導又は安定化する能力を指す。用語「機能的に同一の」は、コンフォメーションにおける小さな変化があってもよい（ほとんどすべてのタンパク質は、生理的な状態でいくつかのコンフォメーション的な柔軟性を示す）が、コンフォメーション的な柔軟性は、野生型タンパク質のものよりも多い又は少ない程度に、（１）タンパク質凝集、（２）小胞体に関連する分解経路を介した除去、（３）タンパク質機能、例えばリガンドの結合能及び／又はアデニリルシクラーゼ活性の活性化能の損傷、及び／又は（４）細胞内の不適当な輸送、例えば細胞膜への局在性をもたらさないことを意味する。

用語「安定した分子コンフォメーション」は、薬理学的シャペロンにより誘導された、少なくとも部分的な、細胞における野生型の機能を提供するタンパク質（すなわちＭＣ４Ｒ）のコンフォメーションを指す。例えば、変異ＭＣ４Ｒの安定した分子コンフォメーションは、ＭＣ４Ｒが誤って折畳まれ、分解される代わりに、野生型ＭＣ４ＲのようにＥＲから脱出し、細胞膜に輸送されるものである。さらに、変異したＭＣ４Ｒの安定した分子コンフォメーションは、完全又は部分的なＭＣ４Ｒ活性、例えば、同種の生理的なＧタンパク質によって促進されたｃＡＭＰ産出のためのアデニリルシクラーゼ活性化活性も有してもよい。しかしながら、安定した分子コンフォメーションは、野生型タンパク質の機能的属性をすべて有する必要はない。

用語「ＭＣ４Ｒ活性」は、細胞中の野生型ＭＣ４Ｒの正常な生理機能を指す。例えば、アゴニストによる結合の際に、ＭＣ４Ｒは、Ｇタンパク質のＧαｓとの相互作用、及びアデニル酸シクラーゼの活性化を通してシグナル伝達を行なう（例えば、VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40を参照）。これは、ｃＡＭＰの細胞内蓄積及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化をもたらす。そのような機能性は当該技術分野において既知の任意の方法によって検査することができる。例えば、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳＨリガンド、若しくはＭＣ４Ｒに対する１２５Ｉ −［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］α−ＭＳＨアゴニストの結合分析、又はアデニリルシクラーゼ活性化分析の使用若しくはルシフェラーゼレポーター遺伝子分析を、細胞内ｃＡＭＰの増加を測定するために使用することができる。環状ＡＭＰ蓄積分析は当該技術分野において既知である（例えば、VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40を参照）。

「ＭＣ４Ｒ」は、配列番号１（ヒト；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０６９１７２）；配列番号３（ヒト；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５９１２）；配列番号５（ラット；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３０９９）；又は配列番号７（マウス；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６９７７）の、いずれか１つの中に示される配列があるヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを指す。

「ＭＣ４Ｒポリペプチド」は、配列番号２（ヒト；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ０１８０３）；配列番号４（ヒト；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５９１２）；配列番号６（ラット；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３０９９）；又は配列番号８（マウス；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２０１６６２）に示されるアミノ酸配列、及び配列番号２、４、６又は８のいずれか１つと同一の機能及びリガンド結合親和性があるＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする任意の他のアミノ酸配列を指す。

用語「野生型ＭＣ４Ｒ」は、ＭＣ４Ｒをコードするヌクレオチド（配列番号１、３、５及び７）配列、及び上述のヌクレオチド配列（ヒトＭＣ４Ｒ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ０１８０３；ヒトＭＣ４Ｒ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５９１２；ラットＭＣ４Ｒ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３０９９；及びマウスＭＣ４Ｒ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２０１６６２）によってコードされたポリペプチド（配列番号２、４、６及び８）配列、並びに正常な個体における対立遺伝子変異のような、ＥＲ中の機能的なコンフォメーションを達成する能力、細胞内の適切な局在性を達成する能力、及び野生型の活性を示す能力（例えばｃＡＭＰ蓄積のＭＣ４Ｒ刺激）を有するＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする任意の他のヌクレオチド配列（上述のポリペプチド配列と同一の機能特性及び結合親和性を有する）を指す。

本明細書において使用されるように、用語「変異ＭＣ４Ｒ」は、変化したＭＣ４Ｒアミノ酸配列をもたらす遺伝的変異を含む遺伝子から翻訳されたＭＣ４Ｒポリペプチドを指す。１つの実施形態では、変異は、野生型ＭＣ４Ｒと比較した場合に、ＥＲに通常は存在する条件下では未変性コンフォメーションをとらないか、又は野生型ＭＣ４Ｒと比較して、安定性若しくは活性の減少を示すＭＣ４Ｒタンパク質をもたらす。この種の変異は、本明細書において「コンフォメーション的な変異」と呼ばれ、そのような変異を有するタンパク質は、「コンフォメーション的な変異体」と呼ばれる。このコンフォメーションをとらないと、ＭＣ４Ｒタンパク質は、タンパク質輸送系の正常経路により細胞中又は細胞外環境の本来の位置へ輸送されるのではなく、分解又は凝集がもたらされる。いくつかの態様において、変異は、タンパク質の非効率的発現をもたらすように、ＭＣ４Ｒコード遺伝子の非コード部分に生じてもよい（例えば転写効率、スプライシング効率、ｍＲＮＡの安定性等に影響する変異）。野生型の発現レベルを促進することによって、ＭＣ４Ｒの薬理学的シャペロンの投与は、ＭＣ４Ｒのコンフォメーション的な変異体の変種と同様に、そのような非効率的なタンパク質発現に起因する障害を改善することができる。

例示的な変異体（参照として配列番号２のポリペプチドを使用する）としては、Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ、及びＲ１６５Ｗが挙げられる。他のＭＣ４Ｒ変異体としては、Ｉ１２５Ｋ、Ｃ２７１Ｙ、Ｔ１１Ａ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ３１６Ｌ、Ｉ３１６Ｓ、Ｉ３１７Ｔ、Ｎ９７Ｄ、Ｇ９８Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｃ２７１Ｒ、Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ９７Ｄ、Ｙ１５７Ｓ、Ｉ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｐ、Ｌ２５０Ｑ、Ｙ２８７Ｘ、Ｐ２９９Ｈ、Ｓ５８Ｃ、コドン２１１でのＣＴＣＴ、及びコドン２４４でのＴＧＡＴ挿入が挙げられる。さらに、他のＭＣ４Ｒ変異体（参照として再び配列番号２を使用する）としては、以下の表１に記載されるものが挙げられる。

或る特定の検査は、タンパク質の属性（実際のｉｎ ｖｉｖｏの活性に相当するか、又は相当しなくてもよい）を評価してもよく、しかしそれにもかかわらず、タンパク質機能性の適切な代理であり、そのような検査における野生型の挙動は、本発明のタンパク質の折畳みの補助又は促進技法を支持する証拠を実証する。本発明に従うそのような１つの活性は、小胞体から細胞膜までの機能的なＭＣ４Ｒの適切な輸送である。

用語「内在性の発現」及び「内在的に発現された」は、ＭＣ４Ｒ欠損に関連した疾患又は障害を有していないか若しくは有する疑いのない、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現がないか、又は変えてしまう（例えば発現、活性又は安定性を阻害する）ＭＣ４Ｒ核酸配列中又はＭＣ４Ｒポリペプチド配列中の変異のような他の欠損（例えば肥満）のない個体の細胞中のＭＣ４Ｒの正常な生理的な発現を指す。この用語は、健康な個体で通常は発現される細胞又は細胞型中のＭＣ４Ｒの発現も指し、健康な個体ではＭＣ４Ｒが発現されない細胞又は細胞型（例えば腫瘍細胞）におけるＭＣ４Ｒの発現は含まない。

本明細書において使用されるように、用語「輸送の効率」は、変異タンパク質が小胞体から細胞内、細胞膜、又は細胞外環境の本来の位置へ輸送される能力を指す。

用語「治療上の有効な用量」及び「有効な量」は、適切な細胞位置で既に発現されているタンパク質の阻害をせずに（アンタゴニストの場合）、又は適切な細胞部位からのタンパク質のリガンドを介した受容体の内部移行の誘導をせずに（アゴニストの場合）、ＥＲにおけるタンパク質プロセシングを促進し（機能的なコンフォメーションを可能にする）、標的タンパク質の活性を促進して、被験体における治療反応をもたらすのに十分な量を指す。治療反応は、使用者（例えば臨床医）が、上述の症状及び代用臨床マーカーを含む、治療に対する有効な反応として認識する任意の反応であってもよい。したがって一般に、治療反応は、疾患又は障害、例えば肥満又は過食症の１つ又は複数の症状の、改良又は抑制となるだろう。

語句「薬学的に許容可能な」は、ヒトに投与された場合、生理的許容性があり、典型的には有害反応を起こさない分子的実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書において使用されるように、用語「薬学的に許容可能な」は、動物及びより詳細にはヒトでの使用のために、連邦又は州政府の監督官庁によって承認された、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識された薬局方でリストされたことを意味する。用語「キャリア」は、化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような薬学的キャリアは水及び油のような無菌の液体になり得る。水又は水性の食塩水並びに水性のデキストロース及びグリセロール溶液は、好ましくはキャリアとして、特に注射溶液用に用いられる。適切な薬学的キャリアは、E. W. Martinによる「レミントンの薬学（Remington'sPharmaceutical Sciences）」の第１８版又は他の版に記述されている。

用語「約」及び「ほぼ」は、測定の本質又は精度が与えられて測定された、量に対して許容できる程度の誤差を一般には意味する。誤差の典型的で例示的な程度は、規定の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、及びより好ましくは５％以内にある。或いは、特に生物学的システムにおいて、用語「約」及び「ほぼ」は、規定の値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、及びより好ましくは２倍以内にある値を意味してもよい。本明細書において、特に明記しない限り、与えられた数量は近似であり、はっきりと明言されない場合、用語「約」又は「ほぼ」が暗示されることを意味する。

本明細書において使用されるように、用語「単離された」は、参照された物質が、それが通常発見される環境から摘出されることを意味する。したがって、単離された生体試料は、細胞成分（すなわち、物質が発見又は生産される細胞の構成要素）のない状態でありえる。核酸分子の場合には、単離された核酸は、ＰＣＲ産物、ゲル上のｍＲＮＡのバンド、ｃＤＮＡ、又は制限断片を含んでいる。他の実施形態では、単離された核酸は、好ましくは発見されるであろう染色体から切り出され、より好ましくは染色体に発見された場合は、単離された核酸分子に含まれる遺伝子の上流又は下流に位置する非調節性領域、非コード領域、又は他の遺伝子には結合していない。さらに他の実施形態では、単離された核酸は１つ又は複数のイントロンを欠失している。単離された核酸は、プラスミド、コスミド、人工染色体等に挿入された配列を含む。したがって、具体的な実施形態では、組換核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、他のタンパク質若しくは核酸、又は両方に結合してもよく、それが膜に結合するタンパク質である場合は、細胞中で又は細胞膜と結合する。単離された細胞器官、細胞又は組織は、それが生物中に発見される解剖学上の部位から摘出される。単離された材料は精製されてもよいが、精製される必要はない。

本明細書において使用されるように、用語「精製された」は、無関係な材料（すなわち汚染物）を減少又は除去する条件下で単離された、ＭＣ４Ｒ核酸又はポリペプチドのような物質を指す。例えば、精製されたタンパク質には、好ましくは実質的に細胞中で結合している他のタンパク質又は核酸はない。本明細書において使用されるように、用語「実質的にない」は、物質の分析試験の文脈において、操作上使用される。好ましくは、実質的に混入物のない精製された物質は、少なくとも５０％純粋、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、及びさらにより好ましくは、少なくとも９９％純粋である。純度は、従来の手段（例えばクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、イムノアッセイ、組成分析、生物学的検定法、及び当該技術分野において既知の他の方法）によって評価することができる。

用語「Ｍｅ」はメチルを意味し、用語「Ｅｔ」はエチルを意味し、用語「Ａｃ」はアセチルを意味する。

特に示されていなければ、用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。好ましいハロ基は、フルオロ、クロロ及びブロモである。

特に示されていなければ、用語「アルキル」は、直鎖、分岐鎖、若しくは環状部分（縮合及び架橋した二環式及びスピロ環式部分を含む）、又は当該部分の組合せを有する飽和した一価の炭化水素ラジカルを含む。アルキル基が環状部分を有するためには、この基が少なくとも３つの炭素原子を有している必要がある。

特に示されていなければ、用語「シクロアルキル」は、アルキルが上記のようなものである環状アルキル部分を含む。用語「シクロアルキル」の使用は、「アルキル」という用語を非環状部分に限定するものとして構築されるものではない。

特に示されていなければ、用語「アルケニル」は、アルキルが上記のようなものであり、上記アルケニル部分のＥ異性体及びＺ異性体が含まれる少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するアルキル部分が含まれる。

特に示されていなければ、用語「アルキニル」は、アルキルが上記のようなものである少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有するアルキル部分を含む。

特に示されていなければ、用語「アルコキシ」は、アルキルが上記のようなものであるＯ−アルキル基である。

特に示されていなければ、用語「アリール」は、１つの水素の除去による、芳香族炭化水素由来の有機ラジカル（例えば、フェニル又はナフチル）を含む。

特に示されていなければ、用語「４〜１０員環の複素環」は、複素環基がその環系において４〜１０個の原子を有し、それぞれＯ、Ｓ及びＮから選択された１〜４つのヘテロ原子を含む芳香族基及び非芳香族基を含むが、但し当該基の環が２つの隣接するＯ又はＳ原子を含まない。非芳香族複素環基は、その環系において４つの原子だけを有する基を含むが、芳香族複素環基は、その環系において少なくとも５つの原子を有する必要がある。複素環基はベンゾ縮合環系を含む。４員環の複素環基の例はアゼチジニル（アゼチジンに由来）。５員環の複素環基の例はチアゾリルであり、１０員環の複素環基の例はキノリニルである。非芳香族複素環基の例は、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリル及びキノリジニルである。芳香族複素環基の例は、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。スピロ部分も本定義の範囲内に含まれ、これは１−オキサ−６−アザ−スピロ［２．５］オクト−６−イルを含む。上記に列挙された群に由来するような上述の基は、そのようなものが可能である場合、Ｃ結合又はＮ結合であり得る。例えば、ピロール由来の基は、ピロール−１−イル（Ｎ結合）又はピロール−３−イル（Ｃ結合）であり得る。さらに、イミダゾール由来の基は、イミダゾール−１−イル（Ｎ結合）又はイミダゾール−３−イル（Ｃ結合）であり得る。

特に示されていなければ、語句「薬学的に許容可能な塩（複数可）」は、本発明の方法に使用した化合物に存在し得る酸性基又は塩基性基の塩を含む。自然状態で塩基性である化合物は、様々な無機酸及び有機酸により、多種多様な塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するのに使用することができる酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち薬学的に許容可能な陰イオンを含む塩、例えば酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、ディスリエート（dislyate）、エストレート、エシレート、エチルコハク酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩（gluceptate）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ムシン酸塩（mucate）、ナプシル酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボネート（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクトウロン酸塩（polygalacturonate）、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩（subacetate）、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩（teoclate）、トシル酸塩、トリエトヨウ化物（triethiodode）、及び吉草酸塩等を形成するものである。単一化合物が、２つ以上の酸性部分又は塩基性部分を含み得るので、そのような化合物は単一化合物におけるモノ、ジ、又はトリ塩を含み得る。

メラノコルチン４受容体
メラノコルチン（ＭＣ）受容体は、二次メッセンジャーの環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生を活性化する、７回膜貫通ドメインＧタンパク質共役型受容体スーパーファミリーの一員である。現在までに、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ及びＭＣ５Ｒの単離された５つのＭＣ受容体がある。ＭＣ２Ｒは、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）のための受容体である。ヒトＭＣ４Ｒは、３３２アミノ酸長である。

メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）は、体重の調節に関与している（Graham et al, Nat. Genetics 1997; 17: 273-4）。ＭＣ４Ｒは食物摂取量に影響を及ぼす視床下部を含む脳において発現している。ＭＣ４Ｒを介するシグナル伝達は、食欲不振誘発性神経経路を刺激する。ＭＣ４Ｒ欠損マウスは、高血糖及び高インスリン血症を伴う遅発性肥満を発症する。１つのＭＣ４Ｒ対立遺伝子を欠損するマウス（ヘテロ接合体）は、野生型マウス及びホモ接合体欠損マウスの間の体重である。ヒトにおいては、ＭＣ４Ｒの欠損は肥満の最も一般的な単一遺伝子性の形態である（Farooqi et al., New Engl. J. Med. 2003; 348: 1085-95）。内在性のＭＣ４Ｒのアンタゴニストであるアグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）を過剰発現するトランスジェニックマウスは、非トランスジェニックの同腹子と比較して、体重増加、飼料消費の増加及び体長の増加を示した（Ollman et al., Science 1997; 278: 135-37）。

ヒトＭＣ４Ｒ遺伝子において、大半は肥満の個体に発見される多数の変異が同定され、フレームシフト、ナンセンス及びミスセンス突然変異を含んでいた（Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-45）。少なくとも２つの研究者のグループが、ＭＣ４Ｒが肥満の個体の約５％において変異していることを確認した。ＭＣ４Ｒ変異キャリアは、過食症及び高インスリン血症であり、平均以上の骨ミネラル密度を有し、適正なＢＭＩの対照被験体よりも速く直線的に成長することが実証された。Farooqi et al.は、変異ＭＣ４Ｒ受容体のシグナル伝達特性も肥満の重症度と関連することを見出した。

数人の著者は、早発型肥満のＭＣ４Ｒの遺伝学に対する理解についての最近の進歩の総説をまとめた（例えばFarooqi IS, O'Rahilly S, Int J Obes （Lond）, 2005 Oct, 29（10）,1149-52; Govaerts C, Srinivasan S, Shapiro A, Zhang S, Picard F, Clement K,Lubrano-Berthelier C, Vaisse C, Peptides, 2005 Oct, 26（10）, 1909-19; Tao YX, Mol Cell Endocrinol, 2005 Jul 15, 239（1-2）, 1-14; Farooqi IS, O'Rahilly S, AnnuRev Med, 2005, 56, 443-58を参照）。例えば、重症の早発型肥満である１人の患者において、受容体二量体化によって引き起こされるドミナントネガティブ効果に起因して、ＭＣ４Ｒ変異の常染色体の優性遺伝様式が発見された（Biebermann H, Krude H, Elsner A, Chubanov V, Gudermann T, Gruters A,Diabetes, 2003 Dec, 52（12）,2984-8）。

現在までに同定されたほとんどの変異が非保存的なアミノ酸置換であるので、いくつかの変異を有するＭＣ４Ｒに対して機能喪失が期待される。このことは、肥満個体において発見されたいくつかのＭＣ４Ｒに対して実証された。さらに、多くの変異は細胞表面でのＭＣ４Ｒ発現の減少に関連している（Gu et al., Diabetes 1999, 48: 635-39; Nijenhuis et al.,上記参照）。例えば、１１個のＭＣ４Ｒミスセンス突然変異のスクリーンニングにおいて、それらは肥満の個体においてのみ発見され、ＭＣ４ＲのＮ末端領域の外側に位置する（それはリガンド結合に関与しない）ものであり、１０個のＭＣ４Ｒミスセンス突然変異は、野生型ＭＣ４Ｒと比較して、標識されたα−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）のリガンドである１２５Ｉ−［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］α−ＭＳＨへの、細胞表面での、より低い特異的結合を示した（Nijenhuis et al.,上記参照、ページ２２９４１において）。表１中で以下に示されるように、変異体中でリガンドへの親和性は、大部分は野生型受容体と同様だったので、特異的結合の減少は細胞表面の発現の低下を反映するとことがわかった（ｎＭ＋／−標準誤差でのＩＣ５０値）。

より高い結合親和性を有する２つの変異（Ｌ２５０Ｑ及びＴ１１２Ｍ）でさえ、飽和結合実験によれば、より低い細胞表面の発現を実証した。さらに、α−ＭＳＨ結合に際して、全ての変異は、減少した最大反応（アデニリルシクラーゼ分析を使用して測定される受容体活性化）を実証した。特に、Nijenhuis et al.は、免疫細胞化学的なデータの結果から、Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ及びＲ１６５Ｗ変異体は発現されるが、細胞内に留まると結論を下した。

追加研究によって、Ｉ１２５Ｋ；Ｃ２７１Ｙ；Ｔ１１Ａ（Ａ４３４Ｇ）；Ａ１７５Ｔ；Ｉ３１６Ｌ；Ｎ９７Ｄ；Ｎ６２Ｓ；及びＣ２７１ＲのＭＣ４Ｒ変異が同定された（Farooqi et al., New Eng. J. Med. 2003; 348; 1085-95）。ｃＡＭＰと反応するルシフェラーゼレポーター遺伝子分析を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価で、これらの変異のすべては、活性の減少又は無活性を示した。しかしながら、このグループは、３つの変種のＶ１０３Ｉ；Ｉ２５１Ｌ；及びＴ１１２Ｍは、ＭＣ４Ｒシグナル伝達に対して効果がないことを発見した。幼年期に関連した変異、すなわち早発型肥満は、Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｙ１５７Ｓ、Ｃ２７１Ｙ、Ｐ７８Ｌ、Ｇ９８Ｒであり、リガンド結合の減少（Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｙ１５７Ｓ、Ｃ２７１Ｙ）、又はリガンド非結合（Ｐ７８Ｌ、Ｇ９８Ｒ）のいずれかをもたらし、［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］α−ＭＳＨに刺激されたｃＡＭＰ生産において比例した悪化も実証された（Tao et al., Endocrinology 2003; 144（10）: 4544-51）。

最終的な研究で、ＭＣ４Ｒ；Ｉ２５１Ｌ（Ａ１１４４Ｃ）；Ｆ５１Ｌ（Ｔ５４４Ｃ）；Ｍ２００Ｖ（Ａ９９１Ｇ）；Ｔ５Ｔ（Ｃ４０８Ｔ）における変異体が同定された（Branson et al., New Eng. J. Med. 2003; 348: 1096-1103）。

肥満に加えて、ＭＣ４Ｒは過食症にも関与する。精神障害の診断及び統計マニュアル−編集（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders- Text Revision）（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ（商標）、第４版）によれば、過食症は、異常に大量の食物の摂取し、行動に対するコントロール欠如感を抱く再発性の症状を意味する。４６９人の白人の肥満被験体についての１つの研究において、肥満被験体のうちのわずかな割合のみが過食症と診察されたが、ＭＣ４Ｒ変異を有する肥満被験体がすべて過食症と診察されたことが明らかになった（Branson et al.,上記参照）。

ＭＣ４Ｒの構造及びリガンド結合
内在性のメラノコルチンアゴニストは配列Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐを含み、メラノコルチン受容体分子の認識及び刺激にとって重要である。ＭＣ４Ｒリガンド結合の分子的な決定因子が、リガンドの大規模なアレイの使用による１つの研究において決定された（Nickolls et al., Pharmacol Exp Ther 2003; 304（3）:1217-27）。膜貫通（ＴＭ）ドメイン７（ＴＭ７）におけるリガンド相互作用の可能性のある部位としてのＰｈｅ２８４を同定するために、受容体の分子モデリングが使用された。Ｐｈｅ２８４のアラニンへの変異は、Ｌ−Ｐｈｅを含むペプチドの結合親和性及び結合能力を最大７１倍まで減少させたが、Ｄ−Ｐｈｅを含む直鎖状ペプチドの結合には影響しなかった。このデータは、α−ＭＳＨのＰｈｅ７とＰｈｅ２８４との間の疎水的相互作用と一致していた。次に、上記されたような肥満と関連づけられる、ＴＭ３（Ｉ１３７Ｔ）における天然に存在する変異の効果が検討された。この変異は、環状で堅いペプチドの親和性及び能力を減少させたが、より柔軟なペプチドでは減少させず、受容体の三次構造上の変異の間接的な効果と一致している。ＭＣ３Ｒに対するＭＣ４Ｒへのリガンド選択性を支持する残基も決定された。ＭＣ３Ｒ（フェニルアラニン）に相当する残基へのＭＣ４ＲのＩｌｅ１２５（ＴＭ３）の変異は、ＭＣ４Ｒ選択的リガンドの親和性及び効能を選択的に減少させた。この効果は、逆のＭＣ３Ｒの変異のＦ１５７Ｉにより正確に反映された。この効果の大きさは、この遺伝子座が主に重要ではないことを示す。しかしながら、イソロイシン／フェニルアラニン変異がＡｓｐ１２２の配向性に影響し得ることが提案され、リガンド結合親和性の主要決定因子であると同定された。

他の研究者は、別のＭＣ４Ｒアゴニストの選択性だけではなく、内在性のＭＣ４Ｒアンタゴニストのアグーチタンパク質との選択的な相互作用にＴｙｒ２６８が必要であると決定した（Oosterom et al., J Biol. Chem. 2001; 276（2）:931-6）。アグーチタンパク質は、通常は皮膚において発現されるＭＣ４Ｒの天然アンタゴニストである（Kiefer et al., Biochemistry 1997; 36: 2084-2090）。

ＭＣ４Ｒアゴニスト及びＭＣ４Ｒアンタゴニスト
本発明によれば、ＭＣ４Ｒアゴニスト及びＭＣ４Ｒアンタゴニストは、本明細書における図１〜図８及び図１０に示された化合物を含んでおり、さらに実施例３及び実施例４で以下に記述した。

ＭＣ４Ｒの天然アゴニスト（リガンド）は、α−ＭＳＨ、ＡＣＴＨ、β−ＭＳＨ、及びγ−ＭＳＨを含む（最高の親和性から最低の親和性の順に）。現在までに記述されたアゴニスト及びアンタゴニストを含む他のＭＣ４Ｒリガンドは、主にペプチド（米国特許第６，０６０，５８９号）及び環状ペプチドアナログ（Mazur et al.による米国特許第６，６１３，８７４号）である。一連のＭＣ４Ｒペプチドアゴニストも設計された（Sun et al., Bioorg Med Chem 2004; 12（10）:2671-7）。さらに、Nijenhuis et al.（Peptides 2003; 24（2）:271-80）は、ＭＣ４Ｒに対して選択的なメラノコルチンアンタゴニスト化合物の開発及び評価を記述した。Ａｃ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ（２）（配列番号９）と規定された１つの化合物は、ＭＣ３Ｒ及びＭＣ５Ｒと比較して、ＭＣ４Ｒに対する選択性がそれぞれ９０倍及び１１０倍であり、最も選択的なＭＣ４Ｒ化合物であることが発見された。その後の修飾により、３４倍のＭＣ４Ｒ／ＭＣ３Ｒ選択性及び１０９倍のＭＣ４Ｒ／ＭＣ５Ｒ選択性を有する選択的なＭＣ４Ｒアンタゴニストである化合物Ａｃ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ（２）（配列番号１０）を得た。両方の化合物はｉｎ ｖｉｖｏで活性があり、血液脳関門を通過した。さらに、米国特許第６，０５４，５５６号及び同第５，７３１，４０８号は、環状構造を有するラクタムヘプタペプチドである、ＭＣ４Ｒに対するアゴニスト及びアンタゴニストのファミリーを記述する。

他の高親和性のＭＣ４Ｒアンタゴニストは、Grieco et al.（J Med Chem 2002; 24:5287-94）に記述されている。これらの環状アンタゴニストは、既知の高親和性アンタゴニストＳＨＵ９１１９（Ａｃ−Ｎｌｅ４−［Ａｓｐ５−Ｈｉｓ６−ＤＮａｌ（２’）７−Ａｒｇ８−Ｔｒｐ９−Ｌｙｓ１０］−ＮＨ（２））（配列番号１１）に基づいて設計された。ＳＨＵ９１１９アナログは、非従来のアミノ酸により位置６（Ｈｉｓ）で修飾された。位置６でＣｈｅ置換を含む１つの化合物は、ＭＣ３Ｒに対して１００倍の選択性の高親和性ＭＣ４Ｒアンタゴニスト（ＩＣ５０＝０．４８ｎＭ）である。位置６でＣｐｅ置換を伴う別の化合物は、さらにＭＣ３Ｒを超える２００倍の選択性の高親和性ＭＣ４Ｒアンタゴニスト（ＩＣ５０＝０．５１ｎＭ）であった。コンフォメーション的に制限されたアミノ酸を有する位置６で修飾される環状ペプチドのコンフォメーション的な特性を検討するために、分子モデリングを使用した。さらにGrieco et al., Peptides 2006; 27（2）:472-81を参照。

いくつかの非ペプチドＭＣ４Ｒリガンドは、米国で公表されたDyck et al.による特許出願第２００３／０１５８２０９号、及びBriner etal.による同第２００４／０８２５９０号で開示された。さらに、Renhowe et al.による米国特許第６，６３８，９２７号には、小低分子量グアニドベンズアミドが特異的なＭＣ４Ｒアゴニストと記述した。Richardson et al.は、ＭＣ４Ｒのアゴニストである新規アリルピペリジンを記述した（J Med Chem 2004; 47（3）:744-55）。Yu et al.による米国特許番号６，９７９，６９１号及びMaguireによる同第６，６９９，８７３号は、さらにＭＣ４Ｒと選択的に結合する非ペプチド化合物を記述する。

Basu et al.による国際公開特許第ＷＯ９９／５５６７９号は、ＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒへの低（マイクロモル）親和性、アラキドン酸により誘導された皮膚炎症の減少、並びに体重及び食物摂取量の減少を示すイソキノリン誘導体（低分子非ペプチド化合物）を開示する。

Nargund et al.による国際公開特許第ＷＯ９９／６４００２号は、さらに、肥満、糖尿病及び性機能不全のような疾患及び障害の治療に有用なメラノコルチン受容体アゴニストとして、スピロピペリジン誘導体を開示する。

他の非ペプチドＭＣ４Ｒアンタゴニストが記述されている。したがって、米国で公表されたEisingerによる特許出願第２００３／０１７６４２５号及び同第２００３／０１６２８１９号は、ＭＣ４Ｒアンタゴニスト又はＭＣ４Ｒアゴニストとして、それぞれ新規の１，２，４−チアジアゾール及び１，２，４−チアジアゾリウム誘導体を開示する。これらの出願は、肥満を治療するためのこれらの化合物の使用も開示する。

メラノコルチン受容体のいくつかのアンタゴニストは、競合的なアンタゴニストであること、すなわちリガンドとの結合を競合することが実証された。例えば、メラノコルチンのアンタゴニストであるアグーチシグナル伝達タンパク質（ＡＳＩＰ）は、ｈＭＣ１Ｒで観察された競合的な拮抗作用と一致する特性、及び他の受容体で観察されたより複雑な挙動を有することが示された（Yang et al., Mol. Endocrinology 1997; 11（3）: 274-280）。同様に、ＡＣＴＨ（ＭＣ２Ｒに対する天然リガンド）はα−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、又はγ−ＭＳＨによる結合に対して優位となることができない（Abdel-Malek et al., Cell. Mol. Life Sci. 2001; 48: 434-41）。

他のＭＣ４Ｒ結合化合物は、以下に記載される：Bednarek and Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwallaet al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005;15（18）:4023-8; 国際公開特許第ＷＯ０３／０７９４９号（Merck）; 国際公開特許第ＷＯ０３／６１６６０号（Eli Lilly）; 国際公開特許第ＷＯ０３／０９８４７号（Amgen）; 国際公開特許第ＷＯ０３／０９８５０号（Amgen）; 国際公開特許第ＷＯ０３／３１４１０号（Neurocrine Biosciences）; 国際公開特許第ＷＯ０３／９４９１８号（Neurocrine Biosciences）; 国際公開特許第ＷＯ０３／６８７３８号（Neurocrine Biosciences）; 国際公開特許第ＷＯ０３／９２６９０号（Procter and Gamble）; 国際公開特許第ＷＯ０３／９３２３４号（Procter and Gamble）; 国際公開特許第ＷＯ０３／７２０５６号（Chiron）; 国際公開特許第ＷＯ０３／６６５９７号（Chiron）; 国際公開特許第ＷＯ０３／６６５８７号（Chiron）; 国際公開特許第ＷＯ０３／６６５８７号（Chiron）; 国際公開特許第ＷＯ０２／６７８６９号（Merck）; 国際公開特許第ＷＯ０２／６８３８７号（Merck）; 国際公開特許第ＷＯ０２／００２５９号（Taisho）; 国際公開特許第ＷＯ０２／９２５６６号（Taisho）; Tran et al, Bioorg Med Chem Lett. 2006 （印刷より前の電子出版）; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005;15（23）:5237-40; Pontillo et al., Bioorg MedChem Lett. 2005;15（10）:2541-6;Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004;14（22）:5605-9; Cheung et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15（24）:5504-8; Yan et al., Bioorg Med ChemLett. 2004; 15（20）: 4611-4;Hsiung et al., Endocrinology. 2005 Dec;146（12）:5257-66; 及びTodorovic et al., Peptides. 2005Oct;26（10）:2026-36。

本発明で特許請求された方法における使用のために検討される特定のＭＣ４Ｒ非ペプチドアゴニスト又はアンタゴニストが、Sebhat et al., J Med Chem 2002; 45: 4589 （化合物１及び６）; Richardson et al., J Med Chem. 2004; 47: 744 （化合物２）; Arasasingham et al., J Med Chem. 2003; 46: 9 （化合物３）; Millennium Pharmaceuticalsによる国際公開特許第ＷＯ０２／０６２７６６号（化合物４）; Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71（化合物５）; Tran et al., Bioorg Med Chem Lett.. 2005; 15: 3434-38（化合物７）; Xi et al., Bioorg Med Chem Lett.. 2004; 14: 377-81（化合物８）; Vos et al., J Med Chem. 2004; 47: 1602-04（化合物９）; Pan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 11: 185（化合物１０）; Marsilje et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004. 14: 3721（化合物１１）; Ujjainwalla et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 133: 4431（化合物１２）; Nickolls et al., J Pharmacol Exp Therap. 2005; 313: 1281-1288（化合物１３〜１７）; Schioth et al., Biophys Biochem Res Comm. 2003; 399-405（化合物１８）; Benoit et al., J. Neurosci. 2000; 20: 3442-48（化合物１９及び２０）; Vos et al., Bioorg Med Chem Lett. 2006; 15: 2302（化合物２１）; Tucci et al., Bioorg Med Chem Lett 2005; 15: 4389（化合物２２）; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 4615-18（化合物２３）; Chaki et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 304: 818（化合物２４）; Chaki et al., Pharmacol Biochem Behav. 2005; 82: 621（化合物２５）に記載されている。

上記された化合物１、２、５、６、８、１０、１２、１３〜１７、及び１９はＭＣ４Ｒアゴニストであり、化合物３、４、７、９、１１、１８、及び２０はＭＣ４Ｒアンタゴニストである。

本発明で特許請求された方法における使用のために検討される特定のＭＣ４Ｒペプチドアンタゴニストは、Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｄ−（２’）Ｎａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＮＨ（２）（配列番号１２）、Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｎｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−（２’）Ｎａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ（２）（配列番号１３）、Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ（３,４−ジ−Ｃｌ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＮＨ（２）（配列番号１４）、Ａｃ−Ｎｌｅ−ｃ［Ａｓｐ−Ｃｈｅ−ＤＮａｌ（２’）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ（２）（配列番号１５）、Ａｃ−Ｎｌｅ−ｃ［Ａｓｐ−Ｃｐｅ−ＤＮａｌ（２’）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ（２）（配列番号１６）、シクロ（１−６）−ｓｕｃ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ（２）（配列番号１７）、及びＡｃ−ＤＡｒｇ［Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ］−ＮＨ（２）（配列番号１８）である。

天然に存在しない側鎖及びペプチド模倣分子を有する、ペプチドに基づいたアゴニスト及びアンタゴニストが検討される。例えば米国特許第５，６５０，４８９号を参照；さらに、米国特許第６，０９０，９１２号、特にセクション５．５を参照。例えば、化合物１８〜２０の側鎖及び図１６で示された化合物クラスの側鎖は天然に存在しない。

ＭＣ４Ｒは、リガンドを介した受容体の内部移行を行うことが示された（Gao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307（3）:870-7）。内在性のＭＣ４Ｒを発現するＧＴ１−７細胞を、アゴニストのα−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）へ前曝露すると、α−ＭＳＨの２回目の曝露に対してはｃＡＭＰ形成障害をもたらした（Shinyama et al., Endocrinology 2003; 144（4）:1301-14）。これはアンタゴニストの投与では見られなかった。リガンドに誘導された内部移行は、Ｃ末端セグメントと３番目の細胞内ループとの間にある、セリン残基又はスレオニン残基のリン酸化がきっかけとなって、Ｇタンパク質共役型受容体で起きる。リン酸化はβアレスチンの結合を促進し、リゾソームによる内部移行及び分解のための受容体を標的とする。最近のデータは、アトラクチン様タンパク質（ＡＬＰ）の細胞質尾部がＭＣ４ＲのＣ末端ドメインと結合することを実証している（Yeo et al., Biochem. J. 2003; 376）。したがって、細胞表面上のＭＣ４Ｒの安定性を増加させるシャペロンは、表面上の受容体の半減期が短いと、特に有益である。

ＥＲにおけるＭＣ４Ｒポリペプチドと可逆的に結合するアゴニストであるシャペロンは、受容体の内部移行を誘導しないであろうことがさらに予想される。同様に、シャペロン化合物がアンタゴニストである場合、一旦受容体が細胞表面に存在すれば、シャペロン化合物は受容体活性を抑制しないであろうことが予想される。

治療法
本発明は、肥満、又は肥満の発症に対してリスクファクターを有するような、ＭＣ４Ｒ安定性の減少に関連した症状を治療する方法であって、ＭＣ４Ｒの安定性及び／又は活性を促進するシャペロンをそのような治療を必要とする被験体へ投与することによる方法、をさらに提供する。治療される個体は、ＭＣ４Ｒの折畳み及びプロセッシングに影響するＭＣ４Ｒの変異を示さないが、例えばニューロンにおけるＭＣ４Ｒ安定性の増加により利益を得るような個体となり得る。治療される個体は、ＭＣ４Ｒタンパク質の折畳み及びプロセッシングに影響し、ニューロンにおけるＭＣ４Ｒ安定性の減少を示すＭＣ４Ｒの変異を有することもできる。

製剤、用量及び投与
ＭＣ４Ｒに対する特異的な薬理学的シャペロン（すなわち、上記されるような、又は以下で示されるような本発明のスクリーニング方法によって同定されるような、ＭＣ４Ｒアゴニスト、ＭＣ４Ｒアンタゴニスト、若しくは他のＭＣ４Ｒを結合する化合物）は、薬学的に許容可能なキャリアと共に医薬組成物に有利に製剤化される。シャペロンは、ＭＣ４Ｒ細胞表面の発現若しくは細胞表面への輸送の減少に関する肥満、又は他の障害の治療に対する有効成分又は治療剤として規定されてもよい。

以下で説明されるように、有効成分（薬理学的シャペロン）の濃度は、望ましい用量及び投与レジメンに依存する。有効成分の例示的な用量範囲は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重；１日当たり約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；又は１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇである。

治療上有効な化合物は、標準製剤化で被験体へ提供することができ、賦形剤、滑沢剤、希釈剤、香味料、着色剤、緩衝剤及び崩壊剤のような任意の薬学的に許容可能な添加剤も含んでいてもよい。標準製剤は当該技術分野において既知である。例えば、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（第２０版，MackPublishing Company， 2000）を参照。この製剤は、治療用シャペロンの血液脳関門の通過を可能にする任意の経路による投与に有用な用量単位で生産されてもよい。例示的な経路は、経口経路、非経口経路、口腔粘膜経路、鼻腔内経路、吸入経路、又は経皮的経路を含む。非経口経路は、静脈内投与、細動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、鞘内投与、及び頭蓋内投与を含む。

１つの実施形態では、ＭＣ４Ｒの薬理学的シャペロン、特に本明細書の図１〜図８及び図１０において示されたものは、固形の経口投薬形式で製剤化される。経口投与のために（例えば低分子に対して）、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような、薬学的に許容可能な賦形剤を伴う従来の手段によって調製された、錠剤又はカプセルの形式を採用してもよい。錠剤は、当該技術分野において既知の方法によってコーティングされていてもよい。経口投与のための液状製剤は、例えば溶液、シロップ剤又は懸濁液の形式を採用してもよく、又は、それらは使用前に構成のための乾燥製品として水又は他の適切なビヒクルと共に提供されてもよい。そのような液状製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用脂）；乳化剤（例えばレシチン又はアラビアゴム）；非水性のビヒクル（例えばアーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコール又は分留植物油）；及び防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、又はソルビン酸）のような薬学的に許容可能な添加剤を伴う従来の手段によって調製されていてもよい。上記製剤は、さらに必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色剤及び甘味剤を含んでもよい。

別の実施形態では、ＭＣ４Ｒシャペロンは非経口的投与のために製剤化される。シャペロンは注入によって（例えばボーラス注射又は連続的な注入によって）非経口的投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、追加防腐剤を伴う単位用量形式、例えばアンプル又は多用量容器で提供されてもよい。組成物は、油性ビヒクル又は水性ビヒクルにおいて、懸濁液、溶液又はエマルジョンとしての形式をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤のような調合薬剤を含んてもよい。或いは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば滅菌発熱性物質除去水）による構成のための粉末形式であってもよい。

以前に記述された製剤に加えて、シャペロンは持効性製剤としても製剤化されてもよい。そのような長期作用性製剤は、移植（例えば皮下に又は筋肉内に）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば化合物は、適切な高分子材料又は疎水性材料（例えば許容できる油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂で、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩類として、製剤化されてもよい。

別の実施形態では、シャペロンは小胞、特にリポソーム中で送達することができる。

別の実施形態では、シャペロンは制御された放出方法で送達することができる。例えば、治療剤は、ポリ−乳酸／グルタミン酸（ＰＬＧＡ）のようなポリマーマトリックス中でポンプによる継続的な静脈内注入を用いて、コレステロールと有効成分（シラスティックＲ（SilasticR）（商標）；Dow Corning（ミシガン州ミッドランド）；米国特許第５，５５４，６０１号を参照）との混合物を含むペレット中で、皮下移植又は経皮貼布によって、投与することができる。

併用療法。医薬組成物は、さらに候補化合物と組み合わせて他の生物活性物質を含んでいてもよい。実施例は、シブトラミン、オルリスタット（ゼニカル（Xenical）（登録商標））、レプチン、神経ペプチドＹ、コレシストキニン又はＧＬＰ−１含むが、これらに限定しない。

ＭＣ４Ｒ薬理学的シャペロンのためのスクリーニング分析
本発明は、ＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面の局在性を調節する候補シャペロン化合物を同定する方法をさらに提供する。１つの実施形態では、本発明は、ＭＣ４Ｒタンパク質に対するシャペロンを同定する方法を提供し、その方法は、ＭＣ４Ｒタンパク質又はその断片に、標識又は無標識の試験化合物を接触させること、及びＭＣ４Ｒタンパク質又はその断片に結合した試験化合物量を測定することを含む。このことは、例えば、
（ａ）細胞が試験化合物との接触に対して反応することを可能にするのに十分な期間で、第１の細胞を試験化合物と接触させること、
（ｂ）工程（ａ）で接触した細胞中で（又は細胞表面上で）、ＭＣ４Ｒポリペプチド（又はリガンド結合ドメインを含むその断片）のコンフォメーション的な安定性、活性、及び／又は細胞表面局在性を決定すること、及び
（ｃ）工程（ｂ）において決定されたＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面の局在性を、試験化合物と接触していない対照細胞におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面局在性と比較すること
により達成することができ、試験化合物との接触に反応した第１の細胞におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性、活性、及び／又は細胞表面の局在性の検出可能な変化と、試験化合物と接触していない対照細胞におけるＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性レベルとの比較は、試験化合物が、ＭＣ４Ｒポリペプチドの安定性を調節し、ＭＣ４Ｒの安定性又は活性の減少に関連した障害の治療のための候補化合物であることを示す。

この細胞は、非内在性の野生型ＭＣ４Ｒ若しくは変異ＭＣ４Ｒで形質転換された宿主細胞、又は変異ＭＣ４Ｒ及び野生型ＭＣ４Ｒを含む、内在的なＭＣ４Ｒを発現する細胞のいずれかであり得る。そのような細胞は、上記された内在的にＭＣ４Ｒを発現する、ＧＴ１−７細胞のような「肥満ニューロン」（これらはMacKenzie et al., Current Medicinal Chemistry - Immunology,Endocrine & Metabolic Agents 2004; 4: 113-117に記述されている）、又はBlondet et al., J Biochem 2004; 135: 541-546及び以下の実施例で記述されるＨＥＫ２９３細胞のような、タグを付けた正常ＭＣ４Ｒ又は変異ＭＣ４Ｒを発現する形質転換細胞を含む。

別の実施形態では、本発明は、ＭＣ４Ｒタンパク質に対するシャペロンを同定する方法を提供し、その方法は、ＭＣ４Ｒタンパク質を含む細胞又は細胞膜画分に標識試験化合物を接触させること、及び細胞又は細胞膜画分へ結合した標識試験化合物量の測定を含む。

多数のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法は、多くの（例えば何百、何千、何万の）試験化合物をＭＣ４Ｒへの結合について同時にスクリーニングするために使用することができる。試験化合物は、低分子の有機分子又は無機分子（好ましくは）、ペプチド又はポリペプチド（抗体、抗体フラグメント又は他の免疫特異的な分子を含む）、オリゴヌクレオチド分子（アプタマーのような）、ポリヌクレオチド分子、又はキメラ若しくはその誘導体であり得るが、これらに限定しない。ＭＣ４Ｒポリペプチドに特異的に結合する候補シャペロンである試験化合物を、細胞に基づいた分析及び／又は無細胞分析を用いて、同定することができる。近年開発されている自動化分析のいくつかの方法は、短期間で何万もの化合物の試験を可能にする（例えば米国特許第５，５８５，２７７号、同第５，６７９，５８２号及び同第６，０２０，１４１号を参照）。例えば、１つのグループは、非ぺプチジルＧタンパク質共役型受容体にバイアスのかかったライブラリの反復指向性スクリーニングを介して、ＭＣ４Ｒアゴニストの１つのアリールピペラジンの同定を報告した（Richardson et al., J Med Chem 2004; 47（3）:744-55）。そのようなＨＴＳ法は、例えばマイクロアレイにおいて、特に有用である。

スクリーニングについては、同定され得る精製化合物のクラスは、低分子（すなわち分子量で約２キロダルトン（ｋＤ）未満、及びより好ましくは分子量で約１ｋＤ未満である有機分子又は無機分子）を含むが、これらに限定されない。これらは化合物ライブラリの構成要素である。

本明細書において用いられるように、用語「リード化合物」は、ＭＣ４Ｒアンタゴニスト若しくはＭＣ４Ｒアゴニストの主要なスクリーンニングから選択された、野生型ＭＣ４Ｒタンパク質若しくは変異ＭＣ４Ｒタンパク質自体のタンパク質コンフォメーションの安定化に有効であるかもしれない、又は適切な医薬化合物を生成するためにさらなる開発によって修飾されてもよい分子的実体を指す。

化合物ライブラリ。十分に立証された薬理活性がある高純度の低分子有機リガンド及びペプチドアゴニストのライブラリは、シグマアルドリッチから入手可能である（ＬＯＰＡＣ ＬＩＢＲＡＲＹ（商標）及びＬＩＧＡＮＤ−ＳＥＴＳ（商標））。さらに、シグマアルドリッチから入手可能なものはレアケミカルズ（Rare Chemicals）のアルドリッチライブラリであり、植物抽出物及び微生物培養抽出物を含む、１００，０００超の低分子化合物の多様なライブラリである。他の化合物ライブラリは、トライポス（Tripos）（ＬｅａｄＱｕｅｓｔ（登録商標））及びティム・テック（TimTech）（キナーゼ修飾因子を標的としたライブラリを含む）から入手可能である。

本発明に従ってスクリーニングするのに適した種類の化合物ライブラリを提供するか、又は提供している他の企業は以下のものである：3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.; Advanced ChemTech; AbinitioPharmaSciences; Albany Molecular; Aramed Inc.; Annovis, Inc. （旧Bearsden Bio, Inc.）; ASINEX; AVANTImmunotherapeutics; AXYS Pharmaceuticals; Bachem; Bentley Pharmaceuticals;Bicoll Group; Biofor Inc.; BioProspect Australia Limited; Biosepra Inc.; CadusPharmaceutical Corp.; Cambridge Research Biochemicals; Cetek Corporation;Charybdis Technologies, Inc.; ChemBridge Corporation; ChemDiv, Inc.; ChemGenicsPharmaceuticals Inc.; ChemOvation Ltd.; ChemStar, Ltd.; Chrysalon; ComGenex,Inc.; Compugen Inc.; Cytokinetics; Dextra Laboratories Ltd.; Discovery PartnersInternational Inc.; Discovery Technologies Ltd.; Diversa Corporation; DovetailTechnologies, Inc.; Drug Discovery Ltd.; ECM Pharma; Galilaeus Oy; JanssenPharmaceutica; Jerini Bio Tools; J-Star Research; KOSAN Biosciences, Inc.; KPPharmaceutical Technology, Inc.; Lexicon Genetics Inc.; Libris Discovery;MicroBotanica, Inc.; MicroChemistry Ltd.; MicroSource Discovery Systems, Inc.;Midwest Bio-tech Inc.; Molecular Design & Discovery; MorphoSys AG; Nanosyn,Inc.; Ontogen Corporation; Organix, Inc.; Pharmacopeia, Inc.; PherinPharmaceuticals; Phytera, Inc.; PTRL East, Inc.; REPLICor Inc.; RSP Amino AcidAnalogues, Inc.; Sanofi-Synthelab（現Sanofi-Aventis）Pharmaceuticals; Sequitur, Inc.; Signature BioScience Inc.; SpectrumInfo Ltd.; Talon Cheminformatics Inc.; Telik, Inc.; Tera BiotechnologyCorporation; Tocris Cookson; Torrey Pines Institute for Molecular Studies;Trega Biosciences, Inc.; 及びWorldMolecules/MMD。

さらに、ハーバードメディカルスクールによって管理されている化学及び細胞生物学学会（the Institute of Chemistry and Cell Biology）（ＩＣＣＢ）が、スクリーニングのための天然産物ライブラリを含む以下の化学ライブラリを提供している：Ｃｈｅｍ Ｂｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔ Ｅ（１６，３２０個の化合物）、バイオネット（Bionet）１（４，８００個の化合物）、セレップ（CEREP）（４，８００個の化合物）、メイブリッジ（Maybridge）１（８，８００個の化合物）、メイブリッジ２（７０４個の化合物）、ピークデール（Peakdale）１（２，８１６個の化合物）、ピークデール２（３５２個の化合物）、ＣｈｅｍＤｉｖ Ｃｏｍｂｉｌａｂ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２８，８６４個の化合物）、混合商業用プレート（Mixed Commercial Plate）１（３５２個の化合物）、混合商業用プレート２（３２０個の化合物）、混合商業用プレート３（２５１個の化合物）、混合商業用プレート４（３３１個の化合物）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅマイクロフォーマット（５０，０００個の化合物）、商業用多様性セット（Commercial Diversity Set）１（５，０５６個の化合物）、ＮＣＩコレクション：構造的多様性セット（Structural Diversity Set）、バージョン２（１，９００個の化合物）、機構的多様性セット（Mechanistic Diversity Set）（８７９個の化合物）、オープンコレクション１（９０，０００個の化合物）、オープンコレクション２（１０，２４０個の化合物）、既知の生物活性コレクション：ＮＩＮＤＳカスタムコレクション（１，０４０個の化合物）、ＩＣＣＢ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ １（４８９個の化合物）、ＳｐｅｃＰｌｕｓコレクション（９６０個の化合物）、ＩＣＣＢ Ｄｉｓｃｒｅｔｅｓコレクション。以下のＩＣＣＢ化合物が、ＩＣＣＢ（Harvard）及び他の共同研究機関の化学者から個別に回収された：ＩＣＣＢ１（１９０個の化合物）、ＩＣＣＢ２（３５２個の化合物）、ＩＣＣＢ３（３５２個の化合物）、ＩＣＣＢ４（３５２個の化合物）。天然産物の抽出物：ＮＣＩ海洋性抽出物（３５２個のウェル）、有機分画−ＮＣＩ植物抽出物及び菌抽出物（１，４０８個のウェル）、フィリピンの植物抽出物１（２００個のウェル）、ＩＣＣＢ−ＩＣＧ多様性指向合成（ＤＯＳ）コレクション、ＤＤＳ１（ＤＯＳ多様性セット）（９６００個のウェル）。

広く多様な化合物ライブラリよりむしろより集中的な化合物ライブラリを生成するのに利用可能な数多くの技法が存在する。Chemical Computing Group, Inc.（モントリオール）がハイスループット薬剤設計への新たなアプローチを有するソフトウェアを開発した。この企業の方法は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の実験データを使用して、確率論的なＱＳＡＲ（定量的構造活性相関）モデルを作製し、これを仮想コンビナトリアルライブラリにおける構成ブロックを選択するのに使用する。これは、標準的な回帰分析の代わりの統計評価に基づいている。

さらに、ArQule, Inc.（マサチューセッツ州ウォバーン）は、化学化合物のハイスループットで自動化された生成を実行するため、及びリード化合物の最適化（lead optimization）に十分な量で、既知の構造を有し高純度のこれらの化合物を送達するための技術も統合した。この企業のＡＭＡＰ（商標）（自動化分子アセンブリプラント）は、化合物発見のそれぞれの段階でハイスループットな化学合成を行う。

同様の化合物が、化合物の選択的な「チェリーピッキング」のために、オンラインデータベース上又はＣＤ−ＲＯＭ上に提供されることが多い。例えば、AbInitio PharmaSciences; ActiMol; Aral Biosynthetics; ASDIBiosciences; Biotechnology Corporation of America; Chembridge; ChemDiv; FloridaCenter-Heterocyclic Compounds; Microsource /MSDI; NorthStar; Peakdale; TexasRetaining Group; Zelinsky Institute; Advanced ChemTech; Ambinter; AnalytiConDiscovery; Aurora Fine Chemicals; Biofocus; Bionet /Key; Comgenex; KeyOrganics; LaboTest; Polyphor; SPECS and Biospecs; 及びBharaviLaboratoriesを参照されたい。

マイクロアレイ
１つの実施形態では、ＭＣ４Ｒシャペロンに対するＨＴＳスクリーニングは、マイクロアレイを使用する。

タンパク質アレイ。タンパク質アレイは、例えば、ガラス、膜、マイクロタイターウェル、マススペクトロメータープレート、及びビーズ又は他の粒子から選択される、様々な表面上で固定化されたタンパク質を用いる、固相の結合分析システムである。これらのアレイを用いる結合分析は、非常にパラレルであり、しばしば小型化される。それらの利点は、迅速であり、自動化することができ、高感度であり、試薬の使用において経済的であり、単一の実験から豊富なデータを提供するということである。

自動化マルチウェルフォーマットは最も高度に発展したＨＴＳシステムである。自動化９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートに基づいたスクリーニングシステムが、最も広く用いられるものである。プレートに基づいたスクリーニングシステムにおける最新の傾向は、反応ウェルの容量をより一層減少させ、１枚のプレート当たりのウェルの密度を増加させること（１枚のプレート当たり、９６ウェルから３８４ウェルへ、１，５３６ウェルへ）である。この傾向は、スループットの増加、スクリーニングされる化合物当たりのバイオ試薬コストの劇的な減少、及び自動化により制御される必要のあるプレート数の減少をもたらす。ＨＴＳのために用いることができるタンパク質アレイの説明については、例えば、米国特許第６，４７５，８０９号；同第６，４０６，９２１号；及び同第６，１９７，５９９号；及び国際公開特許第ＷＯ００／０４３８９号及び国際公開特許第ＷＯ００／０７０２４号を参照。

アレイの構築については、ＭＣ４Ｒ又はその断片のソースは、野生型又は変異型にかかわらず、組換型タンパク質のための細胞に基づいた発現系、天然ソースからの精製、無細胞翻訳系によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの生産、及びＭＣ４Ｒペプチドを作るための合成法を含むことができる。捕獲アレイ及びタンパク質機能分析については、多くの場合、ＭＣ４Ｒポリペプチドは正確に折畳まれ機能的であるということである。例えば、組換型タンパク質が細菌から変性条件下で抽出される場合、常に前記の状態であるとは限らず、他の方法（天然タンパク質の単離、無細胞合成）では、一般に機能性を保持する。しかしながら、変性タンパク質のアレイは、タンパク質が適切なコンフォメーションへ折畳まれないにもかかわらず、シャペロンは恐らく変異タンパク質に結合するので、シャペロンをスクリーニングするのにそれでもなお有用となり得る。

使用される固定化法は、異なる特性のＭＣ４Ｒポリペプチド（例えば、野生型、変異型、全長、部分長の断片、親水性、疎水性等）に好ましくは適用可能であり、ハイスループット及び自動化に受け入れ可能であり、通常はシャペロン結合能力の保持と両立する。ＭＣ４Ｒタンパク質固定化については、共有結合法又は非共有結合法の両方を使用することができる。共有結合のための基板は、例えばアミノ基含有シラン試薬又はアルデヒド基含有シラン試薬（テレケム（Telechem））でコートされたスライドグラスを含む。Ｖｅｒｓａｌｉｎｘ（商標）システム（プロリンクス（Prolinx））では、可逆的な共有結合カップリングは、フェニルジボロン酸で誘導体化されたタンパク質と支持体表面上で固定化されたサリチルヒドロキサム酸との間の相互作用によって達成される。安定した結合を提供する共有結合カップリングの方法は、一連のタンパク質に適用することができる。未修飾のタンパク質の非共有結合は、三次元のポリアクリルアミドゲルに基づいたＨｙｄｒｏＧｅｌ（商標）（パーキンエルマー（PerkinElmer））のような多孔質構造内に生じる。

細胞に基づいたアレイ。細胞に基づいたアレイは、対象となるサンプルにおける試験化合物への細胞応答の測定のための流体装置の使用と合わせた細胞培養の技法、培養された細胞で望ましい効果を誘導する分子の同定ためのサンプルのスクリーニング、及び新規であり望ましい特性を伴う細胞集団の選択及び同定を組み合わせる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、固定された細胞上で、蛍光標識抗体、生物学的リガンド又は候補シャペロン及び／又は核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して、又は生細胞上で、マルチカラーの蛍光指示薬及びバイオセンサーを使用して行なうことができる。固定細胞又は生細胞スクリーニングの選択は、必要とされる特異的な細胞に基づく分析に依存する。

当該技術分野において既知である、単一細胞及び複数細胞に基づいた多数のアレイ技術がある。マイクロパターン化アレイ（例えば、ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ９７／４５７３０号及びＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ９８／３８４９０号に記述される）、及びマイクロ流体アレイのような、最近開発された技法は、細胞に基づいた比較分析のための有益な手法を提供する。トランスフェクトされた細胞のマイクロアレイは、定義されたｃＤＮＡを過剰発現する細胞のクラスターを含むアレイであることを特徴とする、相補的な技術である。発現ベクターにクローニングされた相補的なＤＮＡは、顕微鏡用スライドに対してプリントされ、脂質トランスフェクション試薬及び接着哺乳動物細胞の追加後に使用可能なアレイになる（Bailey et al., Drug Discov. Today 2002; 7（18Suppl）: S113-8）。細胞に基づいたアレイは、例えば、Beske, Drug Discov. Today 2002; 7（18 Suppl）: S131-5; Sundberg et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2000; 11: 47-53;Johnston et al., Drug Discov. Today 2002; 7: 353-63；米国特許第６，４０６，８４０号及び同第６，１０３，４７９号、及び、米国で公表された特許出願第２００２／０１９７６５６号に詳細に記述される。リガンド依存性イオンチャネルの調節因子のためのスクリーニングに特異的に使用される、細胞に基づいた分析については、Mattheakis et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 1: 124-34;及び Baxter et al., J. Biomol. Screen. 2002; 7: 79-85を参照。

検出可能な標識。スクリーニング分析を使用して候補ＭＣ４Ｒシャペロンのような分子を検出するために、本明細書の他の部分において記述されるように、機能分析を未標識分子の追跡に使用することができる。対象となる分子（例えば、低分子、抗体、又はポリヌクレオチドプローブ）、又は対象となる分子のライブラリも、物理的性質又は化学的性質により、対象となる分子の存在を示す役目をする原子（例えば、放射性核種）、検出可能な分子（例えば、フルオレセイン）、又は複合体により、検出可能なように標識することができる。分子が、検出可能な産物を生産するように基質に作用する「レポーター」分子（例えば、酵素のような生体分子）に共有結合される場合、検出可能なように標識することもできる。本発明での使用に適切である検出可能な標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的的手段、化学的手段によって検出可能な任意の組成物も含む。本発明に有用な標識は、標識されたアビジン又はストレプトアビジン結合物による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ダイナビーズ（Dynabeads）（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、リサミン（lissamine）、フィコエリトリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、AmershamからのＦｌｕｏｒＸ、Molecular ProbesからのＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ及びＩＩ等）、放射性同位元素標識物（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、酵素（例えば、加水分解酵素、特にアルカリフォスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼのようなホスファターゼ、又は酸化還元酵素、特に西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ等）、基質、コファクター、阻害剤、化学発光基、色原体剤、及びコロイド金ビーズ又は色ガラスビーズ又はプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような比色定量標識を含むが、これらに限定されない。そのような標識の使用を記述する特許の例は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；及び同第４，３６６，２４１号を含む。

そのような標識を検出する手段は、当業者に既知である。例えば、放射標識物及び化学発光標識物は、感光性フィルム又はシンチレーションカウンターを使用して検出することができる。蛍光マーカーは、放出された光（例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）におけるように）を検出する光検知器を使用して検出することができる、酵素による標識は、酵素に基質を提供すること、及び例えば、基質に対しての酵素の作用によって産生された有色の反応産物を検出することによって検出することができる。

安定性、局在性及び活性分析
以前に示されたように、ＭＣ４Ｒの促進された安定性は、細胞のＭＣ４Ｒポリペプチドの増加の測定によって、又は細胞表面への輸送の増加の決定によって、例えば、細胞表面の発現の増加で決定されたように、又はＭＣ４Ｒ活性の増加の決定によって決定することができる。上述の各々を評価するための非限定的な例示的な方法が以下に述べられる。

ＭＣ４Ｒ細胞内安定性の決定。細胞内のＭＣ４Ｒタンパク質レベルを決定する方法は、当該技術分野において既知である。そのような方法は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降後のウェスタンブロッティング（ＩＰウェスタン）、又はタグを付けたＭＣ４Ｒタンパク質を使用する免疫蛍光法を含む。

ＭＣ４Ｒ輸送の決定。生合成経路によってタンパク質の輸送を評価することは、例えば、グリコシダーゼと共に３５Ｓで標識された受容体タンパク質によるパルス−チェイス実験を使用することで、又は輸送中にタンパク質の修飾を決定する間接免疫蛍光法又は直接免疫蛍光法によって達成される。これらの方法及び他の方法は、例えば、「細胞生物学の最新のプロトコル（Current Protocols in Cell Biology）」（2001;John Wiley & Sons）に記述される。

タンパク質の輸送の低下を検出する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、ゴルジ体中のＮ型糖鎖が付加したタンパク質及び／又はＯ型糖鎖が付加したタンパク質のために、グリコシダーゼ処理及び免疫沈降を組み合わせた放射標識タンパク質を使用するパルス−チェイス代謝標識は、タンパク質がゴルジ中で十分な糖鎖付加を受けているかどうか、又はタンパク質ががさらなる糖鎖付加のためのゴルジへの輸送の代わりにＥＲに保持されているかどうか検出するために、使用することができる。

視覚的に細胞の局在を検出する高感度な方法は、蛍光タンパク質又は蛍光抗体を使用する蛍光顕微鏡も含む。例えば、対象となるＭＣ４Ｒタンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質でタグを付けることができ、固定細胞及び生細胞のこれらのタンパク質の運命（fate）を検討するために、その後マルチカラー低速度撮影顕微鏡検査及び電子顕微鏡法を行なう。タンパク質輸送における蛍光画像化の使用の総説については、Watson et al, Adv Drug Deliv Rev 2005; 57（1）:43-61を参照。タンパク質の細胞内の共局在性のための共焦点顕微鏡の使用の説明については、Miyashita et al., Methods Mol Biol. 2004; 261:399-410を参照。

蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、単一分子解像及びリアルタイム解像が可能な、超高感度及び非侵襲性の検出方法である（Vukojevic et al., Cell Mol Life Sci 2005; 62（5）: 535-50）。ＳＰＦＩ（単一粒子蛍光画像化）は、小さな蛍光性の粒子で選択的に標識された個々の分子を可視化するために、蛍光の高感度性を使用する（Cherry et al., Biochem Soc Trans 2003; 31（Pt5）: 1028-31）。脂質ラフト内のタンパク質の局在性については、Latif et al., Endocrinology 2003; 144（11）: 4725-8を参照。生細胞画像化の総説については、Hariguchi（Cell Struct Funct 2002; 27（5）:333-4）を参照。

蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）顕微鏡も生理学的条件下でタンパク質の構造及び局在性を研究するために使用される（Periasamy, J Biomed Opt 2001; 6（3）: 287-91）。

細胞膜に存在するタンパク質については、それらが膜上に存在するかどうかを検出するために、それほど高感度でない分析を使用することができる。そのような方法は、固定細胞の免疫組織化学、又は放射性同位元素で標識されたリガンド（例えば１２５Ｉ）を使用した全細胞の標識を含む。

ＭＣ４Ｒ細胞表面の発現の決定。一旦候補化合物が同定されたならば、次の工程は、候補化合物が、細胞表面に輸送されるＭＣ４Ｒ量を促進することができるかどうかを決定することである。多数の分析は、細胞表面の受容体発現を定量的に評価するために使用することができる。例えば、放射性リガンド結合分析（例えば１２５Ｉ−ＭＳＨを使用）は、ＭＣ４Ｒを発現する全細胞又は細胞膜画分への結合のいずれかを決定するために使用することができる。１つの例示的な方法の説明については、米国で公表された出願第２００３／０１７６４２５号を参照；Chhajlani, Peptides. 1996;17（2）:349-51も参照。さらに、標識抗体又は標識されたＭＣ４Ｒ（例えばＦＬＡＧタグを付けたＭＣ４Ｒ）のいずれかを使用する蛍光抗体染色法も使用されてもよい。他の既知の方法は蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）であり、細胞表面マーカーに対する標識抗体を使用して、細胞の集団を選別又は識別する。さらに、Nijenhuis et al.,（上記参照）を参照。

ＭＣ４Ｒ活性の増加の決定。ＭＣ４Ｒ活性は、例えば、ｃＡＭＰ活性化／蓄積分析を使用して（例えば、VanLeeuwen et al., J Biol Chem 2003; 18: 15935-40を参照）、又はｃＡＭＰによって活性化された１つ又は複数の遺伝子の転写の増加の測定によって、又はルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子をｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）へ操作可能なように結合することでレポーター遺伝子の発現を測定することによって（例えば、Lee et al., Eur J Biochem 2001; 268（3）:582-91を参照）、決定することができる。さらに、ＭＣ４Ｒがメラニン保有細胞におけるＴＮＦ−α分泌を刺激することも知られている。したがって、候補化合物に対するＭＣ４Ｒ活性は、ＴＮＦ−α分泌の測定で評価することができる（例えば、Ignar et al., Peptides 2003 May;24（5）:709- 16を参照）。

最後に、メラニン保有細胞は、メラノコルチンアゴニスト及びメラノコルチンアンタゴニストに対して迅速で高感度なバイオアッセイを提供する。この方法は、吸光度の変化により決定された、α−ＭＳＨによって誘導された色素果粒の分散の測定に基づく（Quillan et al., PNAS U.S.A. 1995; 92: 2894;及びPotenza et al., Pigment Cell Res 1992; 5: 372）。

分子生物学的定義
本発明に従って、当該技術分野内での、従来の分子生物学、微生物学及び組換型ＤＮＡ技法の利用があってもよい。通常これらの技法は、スクリーニング分析で使用される野生型ＭＣ４Ｒ又は変異ＭＣ４Ｒを発現する組換え細胞の生産に有用である。そのような技法は、文献中で完全に説明される。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis著「分子クローニング：実験手引き書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版（1989） Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York（本明細書において「Sambrook et al.,1989」）；「ＤＮＡクローニング：実際的なアプローチ（DNA Cloning: A PracticalApproach）」Volumes I and II（D.N.Glover ed. 1985）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（M.J. Gait ed. 1984）；「核酸ハイブリダイぜーション（NucleicAcid Hybridization）」（B.D. Hames & S.J. Higgins eds.（1985））；「転写及び翻訳（TranscriptionAnd Translation）」（B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. （1984））；「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）」（R.I. Freshney, ed. （1986））；「固定化された細胞及び酵素（Immobilized Cells And Enzymes）」（IRL Press, （1986））；B. Perbal著「分子クローニングの実際的な手引書（A Practical Guide To Molecular Cloning）」（1984）；F.M. Ausubel et al. （eds.）「分子生物学の最新の手順（Current Protocols in Molecular Biology）」JohnWiley & Sons, Inc. （1994）；及び入手可能な場合には、それぞれの最新版を参照。

用語「宿主細胞」は、任意の方法で、選択、修飾、形質転換、成長、使用、又は操作した、細胞による望ましい物質の生産（例えば遺伝子、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質又は酵素の細胞による発現）のための、任意の生物の任意の細胞を意味する。本発明によれば、宿主細胞は、変異ＭＣ４Ｒ又は野生型ＭＣ４Ｒ核酸及びＭＣ４Ｒポリペプチドを発現するために修飾される。宿主細胞は、さらにスクリーニング又は他の分析のために使用することができる。本発明で使用される例示的な宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、及びＣＨＯ細胞である。

「組換ＤＮＡ分子」は分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。

本明細書におけるＭＣ４Ｒポリヌクレオチドは、天然調節（発現制御）配列により隣接されてもよいし、又はプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード領域、３’非コード領域等を含む異種配列を結合させてもよい。核酸も、当該技術分野において既知の多くの手段により修飾されてもよい。そのような修飾の非限定的な例は、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つ又は複数のアナログへの置換、並びに例えば荷電していない結合（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバミン酸等）及び荷電した結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）のようなヌクレオチド間の修飾を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート化剤（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属等）、及びアルキル化剤ような１つ又は複数の追加の共有結合する部分を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、メチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合、又はアルキルホスホロアミド化結合の形成により誘導体化されてもよい。さらに、本明細書におけるポリヌクレオチドも、検出可能なシグナルを提供することができる標識により直接的又は間接的に修飾されてもよい。例示的な標識は、放射性同位元素、蛍光性分子、ビオチン等を含んでいる。核酸も、例えばこの分子の使用に関連した分子生物学的操作を促進するために、部位特異的変異誘発によって、１つ又は複数の塩基で変えられてもよい。

ＭＣ４Ｒ ＲＮＡ又はＭＣ４Ｒポリペプチドような、「コード配列」又は発現産物を「コードする」配列は、発現された場合、ＲＮＡ又はポリペプチドの生産をもたらすヌクレオチド配列であり、例えば、ＭＣ４Ｒヌクレオチド配列は、ＭＣ４Ｒポリペプチド（タンパク質）のためのアミノ酸配列をコードする。タンパク質のためのコード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）及び終止コドンを含んでもよい。

用語「遺伝子」（「構造遺伝子」とも呼ばれる）は、１つ又は複数のＭＣ４Ｒタンパク質のすべて又は一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするか又はこの配列に相当するＤＮＡ塩基配列を意味し、例えばＭＣ４Ｒ遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列のような調節性のＤＮＡ配列を含んでもよいし、又は含んでなくてもよい。

用語「発現する」及び「発現」は、核酸配列からのアミノ酸配列産生の文脈に使用された場合、ＭＣ４Ｒ遺伝子又はＭＣ４ＲのＤＮＡ配列における情報が現れるようになることを可能にするか、又は引き起こすことを意味し、例えば、対応するＭＣ４Ｒ遺伝子又はＭＣ４ＲのＤＮＡ配列の転写及び翻訳に関与する細胞機能の活性化によって、ＭＣ４Ｒタンパク質を生産することが明らかになる。ＭＣ４Ｒタンパク質のような「発現産物」を形成するために、ＤＮＡ配列は、細胞中で、又は細胞により発現される。発現産物自体、例えば結果として生じるタンパク質も、細胞によって「発現された」と表現されてもよい。発現産物は、細胞内、細胞外、又は分泌されるものとしてと特徴づけることができる。本発明によれば、ＭＣ４Ｒはニューロンの細胞表面で発現される。

用語「細胞内」は、細胞の内部にあるものを意味する。用語「細胞外」は、細胞の外部にあるものを意味する。細胞上又は細胞内部のどこかから、物質が細胞の外部で有意な測定値に現われる場合、この物質は細胞で「分泌される」。

用語「異種の」は、一緒に天然に存在しないエレメントの組合せを指す。例えば、異種のＤＮＡは、細胞中又は細胞の染色体部位に天然にはないＤＮＡを指す。好ましくは、異種のＤＮＡは細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種の発現調節エレメントは、天然において操作可能なように結合したエレメントというよりも、異なる遺伝子に操作可能なように結合させたエレメントである。本発明の文脈では、対象となるタンパク質をコードする遺伝子は、クローニング又は発現のために挿入されるベクターＤＮＡに対して異種であり、発現されるそのようなベクター（例えば大腸菌細胞）を含む宿主細胞に対して異種である。

用語「形質転換」は、ＤＮＡ（すなわち、ＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする核酸）が周囲の培地から宿主細胞へ導入される過程を指す。

用語「形質導入」は、原核生物の宿主細胞（例えば、細菌ウイルス又はバクテリオファージ経由で、原核生物の宿主細胞）への、ＤＮＡ（すなわち、ＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする核酸）の導入を指す。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り発現する、原核生物又は真核生物の宿主細胞は、「形質転換した」又は「形質導入された」ものであり、「形質転換体」又は「クローン」である。宿主細胞へ導入されるＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同一の属若しくは種の細胞、又は異なる属若しくは種の細胞、又は合成配列を含む、任意のソースから入手することができる。

用語「組換えにより操作された細胞」は、対象となる核酸、すなわちＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする核酸を、トランスフェクション、形質転換又は形質導入を含む任意の適切な方法によって、発現又は過剰発現するように操作された任意の原核生物又は真核生物の細胞を指す。この用語は、通常はその遺伝子産物を発現しない細胞、又は最適水準以下で遺伝子産物を発現する細胞中の核酸の内在性の活性化も含む。

用語「トランスフェクション」は、細胞の中への外来の（すなわち、外部又は細胞外の）核酸の導入を意味する。「外来の」核酸は、宿主細胞に対する遺伝子、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ配列を含んでおり、その結果、宿主細胞はＤＮＡを複製し、望ましい物質（典型的には導入された遺伝子又は配列によってコードされたタンパク質又は酵素）を生産するために導入された遺伝子又は配列を発現する。導入された遺伝子（すなわちＭＣ４Ｒポリペプチドをコードする核酸）又は配列も、「クローン化」遺伝子又は配列と呼んでもよいし、細胞の遺伝的機構によって使用される開始配列、終止配列、プロモーター配列、シグナル配列、分泌配列又は他の配列ような調節又は制御の配列を含んでもよい。遺伝子又は配列は、機能を持たない配列又は未知の機能の配列を含んでもよい。ＤＮＡは、導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞に、染色体外のエレメントとして、又は染色体の組み込みによってのいずれかで導入されてもよい。

使用される宿主細胞に依存して、形質転換又はトランスフェクションは、そのような細胞に適切な標準技術を使用して行われる。Sambrook et al., 1989（上記参照）のセクション１．８２中に記述されているように、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含んでいる細菌細胞に通常は使用される。Chung及びMiller（NucleicAcids Res. 1988, 16:3580）に記述されているように、形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。さらに別の方法はエレクトロポレーションと呼ばれる技術の使用である。或いは、ウイルスベクターが使用される場合、宿主細胞は対象となる遺伝子を含むウイルスで感染する場合がある。

用語「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、ＭＣ４Ｒ遺伝子）を宿主細胞へ導入することができるビヒクルを意味する。ベクターはプラスミド、ファージ、ウイルス等を含み、それらは当該技術分野において既知である。

「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼの結合及び下流（３’方向）のコード配列の転写開始を可能にするＤＮＡ制御領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列は、転写開始部位により３’末端で結合し、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基又はエレメントの最少数を含む上流（５’方向）へと及ぶ。プロモーター配列内では、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）に加えて転写開始部位も見られる。

ＲＮＡポリメラーゼがｍＲＮＡへコード配列を転写する場合、コード配列は、細胞の転写調節配列及び翻訳調節配列に「制御下で」、又は「操作可能なように結合」し、その後トランスＲＮＡスプライシングされ（それがイントロンを含んでいる場合）、コード配列によりコードされたタンパク質に翻訳される。

１つ又は複数の上記で列挙された構成要素を含む適切なベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は切断され、調整され、必要とされるプラスミドを生成するのに望ましい形式で再ライゲーションされる。

構築されたプラスミド中での正確な配列を確認するための分析について、ライゲーション混合物はバクテリア菌株を形質転換するために使用され、適切な場合に、成功した形質転換体はアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からのプラスミドは調製され、制限酵素消化によって分析され、及び／又はSanger et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA1977, 74:5463-5467）又はMessing et al.（Nucleic Acids Res. 1981, 9:309）の方法、又はMaxamet al.（Methods in Enzymology 1980, 65:499）の方法によってシークエンスされる。宿主細胞は本発明の上記の発現ベクターにより形質転換され、利用されるプロモーターに対して適切に修飾された従来の培養液において培養される。

本発明は、以下に提示された実施例によってさらに記述される。そのような実施例の使用は例示のみであり、本発明又は任意の例示された用語の範囲及び意味を全く限定しない。同様に、本発明は、本明細書において記述された任意の特定の好ましい実施形態についても限定しない。実際は、本発明の多くの修飾及び変更は、本明細書を読む際に当業者に明らかになり、その精神及び範囲から逸脱せずに行うことができる。したがって、本発明は、請求項に対し権利が与えられる相当物の十分な範囲と共に添付された特許請求の範囲の用語によってのみ限定するものである。

実施例１：ＭＣ４Ｒ折畳み変異体を発現する細胞株の生成
いくつかのＭＣ４Ｒ変異体がＭＣ４Ｒのコンフォメーション的な欠損をもたらすかどうか決定するために、様々な変異体を含むＭＣ４Ｒ核酸を、ＨＥＫ−２９３Ｔ及びＣＯＳ−７細胞へトランスフェクトし、それらの細胞表面の発現及び活性を評価した。細胞表面の発現の減少又は消失が観察される細胞株は、ＭＣ４Ｒポリペプチドの細胞内での存在及び／又は細胞内の位置を決定するために、さらに評価される。

方法
ＭＣ４Ｒ変異体の発生。野生型のＭＣ４ＲをコードするｃＤＮＡ（例えば、配列番号１を参照）が当該技術分野で既知の技法（例えば、ＰＣＲ、部位特異的な変異誘発）を使用して修飾され、ヌクレオチド変化を含む変異体ＭＣ４ＲのｃＤＮＡが生じ、これにより例えば、以下のＭＣ４Ｒ変異ポリペプチドの１つが得られる：Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ、Ｒ１６５Ｗ、Ｉ１２５Ｋ、Ｃ２７１Ｙ、Ｔ１１Ａ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ３１６Ｌ、Ｉ３１６Ｓ、Ｉ３１７Ｔ、Ｎ９７Ｄ、Ｇ９８Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｃ２７１Ｒ、Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ９７Ｄ、Ｙ１５７Ｓ、Ｉ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｐ、Ｌ２５０Ｑ、Ｙ２８７Ｘ、Ｐ２９９Ｈ、Ｓ５８Ｃ、コドン２１１でのＣＴＣＴ、及び／又はコドン２４４でのＴＧＡＴ挿入。そのような変異体は、Blondet et al.（J Biochem （Tokyo） 2004; 135（4）:541-6）に記載されるようにＧＦＰ等の蛍光タグと融合させるか、又はVanLeeuwenet al.（J. Biol. Chem. 2003; 278: 15935-15940）に記載されるようにＦＬＡＧでタグ付けさせるか、又はルシフェラーゼ等の酵素でタグ付けさせてもよい。

細胞培養及びトランスフェクション
そのような変異ＭＣ４Ｒ核酸は、製造者の説明書に従って、適切な発現ベクター（例えば、ｐＣＤＮＡ３．１）（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバード）にクローニングされる。細胞のトランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Invitrogen）を使用して遂行され、安定的にトランスフェクションされたクローン細胞株は、ネオマイシンアナログのＧ４１８に対する耐性によって選択される。

簡潔には、ＨＥＫ−２９３Ｔ及びＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Invitrogen）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（グルタミン含有；Invitrogen）中で維持する。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿空気中で３７℃でインキュベートする。細胞は通常、トランスフェクションした日で７０〜８０％の密集度である。

ＧＦＰタグが付けられたＭＣ４Ｒ。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡは、BD Biosciences（カリフォルニア州サンホセ）又はClontech（カリフォルニア州パロアルト）から入手可能である。ＧＦＰを、製造者の説明書に従って、Ｃ末端の終止コドンを除去したヒトＭＣ４ＲのＣ末端にインフレームで融合する。その後、ＭＣ４Ｒ−ＧＦＰキメラ融合タンパク質構築物は上記のようにトランスフェクトされる。ルシフェラーゼ構築物が、同様に用いられる。

ＭＣ４Ｒ変異体の局在性の検出。細胞表面局在性を決定する結合実験は、以前に記述された条件を使用して行なわれる（Yang et al., J Biol Chem 1997; 272: 23000-23010）。簡潔には、２×１０５ｃｐｍの１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨ（Amersham Biosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を、放射性同位元素で標識されていないリガンドのＮＤＰ−ＭＳＨ、ＡｇＲＰ ８７−１３２、又はＡｇＲＰ １１０−１１７と組み合わせて使用する。結合反応は、培地を除去し０．２％ウシ血清アルブミンを含む最小必須培地で細胞を２度洗浄することで終了させる。その後、細胞を０．２Ｎの水酸化ナトリウムで溶解し、溶解物中の放射能を分析計数器で定量する。非特異的結合は、１０−６Ｍの非標識リガンドの存在下で、結合した１２５Ｉ標識量の測定によって決定される。さらに、実施例４中に以下で記述されているように、ＦＡＣＳを使用することができる。特異的結合は、結合した放射能の合計から非特異的に結合した放射能を引いて計算する。最大結合（Ｂｍａｘ）は、式Ｂｍａｘ＝［ＮＤＰ−ＭＳＨ特異的結合］／（［ＮＤＰ−ＭＳＨ］／（Ｋｄ＋［ＮＤＰ−ＭＳＨ］））を使用して計算することができる。Ｋｉ＝ＩＣ５０／１＋リガンド濃度／Ｋｄ。

ＭＣ４Ｒ変異体に蛍光性のタグを付ける場合、共焦点顕微鏡はタグを付けたＭＣ４Ｒの細胞内移動をモニタリングするために使用される（Blondet et al., J Biochem 2004;135: 541-546;又はGao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307（3）:870-7）。簡潔には、細胞は実験前に２４〜４８時間チャンバーカバーグラス中で増殖させる。適切な処理の後に、細胞を冷ＰＢＳにより洗浄し、２０分間ホルマリン中で固定し、ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡレーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss、ニューヨーク州ソーンウッド）で観察した。ＧＦＰの蛍光は、４８８ｎｍのアルゴン／クリプトンレーザーを使用して励起し、５００〜５５０ｎｍのバンドパスフィルターで検出した。赤色のシグナルは、５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーで励起し、蛍光は５６５〜６１５のバンドパスフィルターで検出される。

デジタルで得た画像を、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０２を使用して定量する。元の緑色蛍光共焦点画像はグレイスケールに変換され、中央値フィルターリングが行なわれる。各々のピクセルは、０（黒色）〜２５５（白色）にわたる強度値が割り当てられる。細胞表面の蛍光強度及び合計の細胞蛍光強度は、手動で対応する領域を選択した後に測定される。ＭＣ４Ｒ−ＧＦＰの細胞内分布は、細胞表面の蛍光強度と合計の細胞蛍光強度の比率として表現される。比率の減少は受容体の内部移行を示す。

これらの方法を使用して、シャペロンを介した補助の候補となる、ＭＣ４Ｒの折畳み変異体が同定される。

実施例２：ＭＣ４Ｒアゴニスト及びＭＣ４Ｒアンタゴニストの構造
可能性のあるＭＣ４Ｒアゴニスト及びＭＣ４Ｒアンタゴニストは、公表された特許参照及び参照文献の総説に基づいて選択された（特に、Bednarek及びFong, Exp. Opn. TherapeuticPatents 2004; 14（3）: 327-326及び国際公開特許第ＷＯ０２／０６２７６６号）。本明細書において記述された化合物を選択するのに使用される基準は、入手可能であれば、公表されたＩＣ５０データ、ｉｎ ｖｉｖｏの動物データ、及び生体利用率データ（例えば、薬物動態学）を含む。

ａ） 図１のアゴニストの合成（化合物１）
ＴＨＩＱとして知られる、この化合物の選択は、以下のデータに基づいた。

この分子の合成（１１工程）は、図３中で示されたスキームに基づいて行なわれた。

ｂ） 図２のアゴニストの合成（化合物２）
化合物２と呼ばれる、この既知の化合物の選択は、以下のデータに基づいた。

この分子の合成（１１工程）は、図４中で示されたスキームに基づいて行なわれた。

ｃ） 図５のアンタゴニストの合成（化合物３）
この化合物は、Arasasingham（J Med Chem 2003, 46: 9-11）によって報告されたαＭＳＨ／ＭＣ４Ｒデータに基づいて選択された。この化合物の合成は図７中に要約され、そこに記述された方法に従って行なわれた。

ｄ） 図６のアンタゴニストの合成（化合物４）
この化合物は、Millennium PharmaceuticalsによるＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ０２／０６２７６６号中に記述されるデータ及び合成法に基づいて、選択及び合成され、合成スキームは図８中に要約される。この化合物の生物活性は、シンチレーション近接解析を使用して、国際公開特許第ＷＯ０２／０６２７６６号中に報告されている。

簡潔には、合成は以下の方法を使用して達成された。１，３−ジアミノプロパン（Acros、２７．７ｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）を、１，２−ジクロロベンゼン（Acros、２００ｍｌ）中のチオサリチル酸（Acros、２０ｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）に加え、この混合物を４時間１７０℃まで加熱する。６０℃への冷却に際して、メタノール（５０ｍｌ）を加え、反応物は室温で一晩撹拌し、生成した黄色の結晶性固体を回収しエーテルで洗浄し、９ｇの純生成物を得た。

２−メトキシ−５−ニトロベンジルブロマイド（Fluka、１．８６ｇ、７．５５９ｍｍｏｌ）を、室温でメタノール（６０ｍｌ）中の２−（１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）ベンゼンチオール（１ｇ、５．２０１ｍｍｏｌ）へ加え、濃縮のため１２時間維持し、エーテル（１０ｍｌ）を加え、生成した淡黄色の針状物を回収し、エーテルで洗浄し、１．２８ｇの純生成物を得た。

実施例３：低温又は化学的なシャペロンの使用による、誤って折畳まれたＭＣ４Ｒの補助
低温（熱による補助）及びＤＭＳＯのような一般的な化学的シャペロンの両方が変異タンパク質の折畳みを修復することが知られているので、野生型ＭＣ４Ｒ及び様々なＭＣ４Ｒの折畳み変異体の細胞表面の発現が、ＷＴ ＭＣ４Ｒ及び変異ＭＣ４Ｒを有する細胞で評価され、それらの細胞は３０℃で又は１％ＤＭＳＯと共に培養された。

方法
細胞及びトランスフェクション。ＨＥＫ２９３細胞を、３ＨＡ及びＶｅｎｕｓ（増強黄色緑色蛍光タンパク質；ＥＹＦＰ）の二重タグを付けた、野生型（ＷＴ）ｈＭＣ４Ｒ又はＳ５８Ｃ；Ｎ６２Ｓ；Ｒ１６５Ｗ；Ｒ１６５Ｑ、及びＰ２９９ＨのｈＭＣ４Ｒ変異体で一時的にトランスフェクションした。

低温分析。ＷＴ細胞及びトランスフェクションされた細胞を、ＭＣ４Ｒ細胞表面の発現評価の前に、１２時間、３０℃又は３７℃でインキュベートした。増加は以下を使用して決定した：
増加＝［（３０℃での表面の発現％−３７℃での表面の発現％）／３７℃での表面の発現％］×１００。

化学的シャペロン分析：ＷＴ細胞及び一時的にトランスフェクションされた細胞を、ＭＣ４Ｒ細胞表面の発現評価の前に、１２時間、１％ＤＭＳＯが存在するか又は存在しない状態でインキュベートした。

ＦＡＣＳ分析。ＦＡＣＳ分析は、抗ＨＡ．１１一次抗体（マウス、１：１０００の希釈）、及びＡｌｅｘａ６４７を結合した二次抗体（ヤギ抗マウス、１：１０００希釈）希釈物により細胞を蛍光標識した後に行なった。生細胞（ヨウ化プロピディウム陰性）を、以下の関連する２つの集団へ選別した。
Ｐ４：ＹＦＰ陽性細胞の合計（ＭＣ４Ｒ発現の合計の代表）
Ｐ５：ＹＦＰ及びＡｌｅｘａ６４７の両方に対して陽性の細胞のパーセント（Ａｌｅｘａ及びＹＦＰ陽性細胞）／（ＹＦＰ陽性細胞＋Ａｌｅｘａ及びＹＦＰ陽性細胞）（細胞表面の発現の代表）

結果
ＭＣ４Ｒの細胞表面の発現。ＷＴ細胞の表面の発現のうちの基礎的な表面の発現は９０％に達する。変異体のどれも、１２５Ｉ標識ＮＤＰ−α−ＭＳＨの結合によって検出されるような細胞表面上のＭＣ４Ｒを発現しなかった（データ示さず）。ＦＡＣＳによって分析した場合、ＷＴ ＭＣ４Ｒでトランスフェクションした細胞と比較すると、すべての変異体は表面の発現の有意な減少を示した（データ示さず）。ＷＴ ３ＨＡ−ｈＭＣ４Ｒ−Ｖｅｎｕｓ細胞の約９０％は、ＭＣ４Ｒ（Ｐ５）の表面の発現を示したが、変異体での基礎的な表面の発現は、Ｎ６２Ｓ、Ｒ１６５Ｗ、Ｒ１６５Ｑ、及びＰ２９９Ｈについては１２％〜１８％の間であった。Ｓ５８Ｃは約４０％の表面の発現を示す。

熱による補助。５つの変異体はすべて、表２において以下のように、ＭＣ４Ｒ（Ｐ５）の細胞表面の発現の増加を示した。

化学的なシャペロン：細胞表面の発現の有意な促進は、１％のＤＭＳＯの存在下では検出されなかった。

実施例４：ＭＣ４Ｒ薬理学的シャペロンの使用による、誤って折畳まれたＭＣ４Ｒの補助
図５（化合物３）及び図６（ＨＢｒ塩；化合物４）中にそれぞれ示されたＭＣ４Ｒアンタゴニスト化合物は、Ｓ５８Ｃ；Ｎ６２Ｓ；Ｒ１６５Ｑ；Ｒｌ６５Ｗ；及びＰ２９９ＨのＭＣ４Ｒ変異体を有する細胞でのシャペロン活性について評価された。

方法
薬理学的シャペロン分析。簡潔には、上記の各々のＭＣ４Ｒ変異体（実施例３中に記述されているようにトランスフェクションされた）を持つ細胞を、１．０μＭ及び１０μＭの濃度でアンタゴニスト化合物の各々と共に１２時間培養し、上記されるような蛍光励起細胞分取分析を使用して、ＭＣ４Ｒの細胞表面の発現について評価した。細胞表面の発現レベルは、処理及び基礎的条件で比較される。増加パーセントは以下に従って決定される：増加＝［（表面の発現（処理有り）％−表面の発現（処理無し）％）／表面の発現（処理無し）％］×１００。

ＭＣ４Ｒ活性の分析。Molecular Devices（全細胞分析；カタログ番号Ｒ８０４４）からのＣａｔｃｈ Ｐｏｉｎｔ ｃＡＭＰ蛍光分析キットを使用して、各々のアンタゴニストの存在下又は非存在下で、ｃＡＭＰの蓄積を、ＭＣ４ＲアゴニストのＮＤＰ−ＭＳＨ（１０−７Ｍ）による処理に対するＭＣ４Ｒ変異体のＳ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｒ１６５Ｗ、及びＰ２９９Ｈについて評価した。対照は、未処理のもの又はＮＤＰ−ＭＳＨのみを処理されたものであった。

結果
薬理学的シャペロンによる補助。下記表３において示されるように、両方のアンタゴニストは、用量依存効果により、１．０μＭ及び１０μＭ濃度の両方で、ＭＣ４Ｒ変異体のＲ１６５Ｗ、Ｓ５８Ｃ、及びＲ１６５Ｑの表面の発現を増加させることができた。上に示されるように、変異体における基礎的な表面の発現は、Ｎ６２Ｓ、Ｒ１６５Ｗ、Ｒ１６５Ｑ、及びＰ２９９Ｈについては１２％〜１８％の間であった。Ｓ５８Ｃは約４０％の表面の発現を示す。予想外に、１０μＭの各々の化合物の処理により、野生型ＭＣ４Ｒを発現する細胞と同一のレベルまで、ＭＣ４Ｒ Ｒ１６５Ｗの細胞表面の発現を戻すことができた。

変異体のＮ６２Ｓについては、変異ＭＣ４Ｒの細胞表面の発現における有意なパーセント増加は、１０μＭ濃度の両方の化合物で観察されたが、１．０μＭではいずれの化合物でも効果は見られなかった。図５において示された化合物はより効力があり、すなわち、図６において示される化合物でよりも、多くの細胞表面の発現が観察された。

変異体のＰ２９９Ｈについては、図６において示される化合物は、１．０μＭ又は１０μＭのいずれも変異受容体の細胞表面の発現の回復に効果がなく、図５において示される化合物１０μＭで、わずかな効果のみが観察された。

これらの結果は、細胞表面の発現を回復させるように薬理学的シャペロンとして作用するＭＣ４Ｒアンタゴニストが低濃度で接触した場合、ＭＣ４Ｒの折畳み変異体を「助ける」ことができることを実証する。

最後に、Pedemonte et al., J Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71に記述されていたビスアミノチアゾール化合物（図９）は、変異体のＳ５８Ｃ（３１．２５％の増加）及びＲ１６５Ｗ（２８．９５％の増加）に対するわずかな効果を実証した。

ＭＣ４Ｒ活性。図１１中に示されるように、ＭＣ４Ｒを介するシグナル伝達の回復は、１０μＭの両方のアンタゴニストによる処理の後に、Ｓ５８Ｃ及びＲ１６５ＷにおいてｈＭＣ４Ｒ ＷＴと同一の程度まで観察された。ＭＣ４Ｒ変異体のＮ６２Ｓにおいても、シグナル伝達能力はより少ない程度に回復した。Ｐ２９９Ｈの変異がＧタンパク質結合に対して必要なドメイン中にあるので、予想通りに、シグナル伝達はＰ２９９Ｈにおいて回復されなかった。

実施例５：変異ＭＣ４Ｒの安定性及び活性を回復させるか、又は野生型ＭＣ４Ｒの安定性を増加させるＭＣ４Ｒシャペロンのためのスクリーニング
本実施例は、ＭＣ４Ｒの誤って折畳まれた変異体若しくは野生型の細胞表面発現及び／又はＭＣ４Ｒの活性の増強ためのＭＣ４Ｒシャペロン化合物に対するスクリーニング方法を記述する。

方法
変異体ＭＣ４Ｒ又は野生型ＭＣ４Ｒのトランスフェクション。実施例１において記述されるように、折畳み／輸送ＭＣ４Ｒ変異体の同定が達成される。そのような折畳みの変異ＭＣ４Ｒ及び／又は野生型ＭＣ４Ｒのトランスフェクションは、上記されるように、又はＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ及びＦＡＣＳ分析を含む、タンパク質の細胞表面の発現検出のための当該技術分野において既知の任意の方法の使用によって達成される。

シャペロン投与。様々な濃度のシャペロン試験化合物をＭＣ４Ｒ野生型発現細胞又は折畳み変異型発現細胞の培養物又はアレイに加える。それから、細胞表面に輸送されるＭＣ４Ｒの活性に加えて、ＭＣ４Ｒの細胞局在を求める。例えば、以下のものに記載されるようなピペラジン系化合物、ピペリジン系化合物、１，４−ジアザパン系化合物、グアニジン系化合物、又は他の試験化合物をスクリーニングする：Bednarek及びFong, Exp Opn Ther Patents 2004;14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003; 13: 4431-4435、国際公開特許第ＷＯ０３／０７９４９号、国際公開特許第ＷＯ０３／６１６６０号、国際公開特許第ＷＯ０３／０９８４７号、国際公開特許第ＷＯ０３／０９８５０号、国際公開特許第ＷＯ０３／３１４１０号、国際公開特許第ＷＯ０３／９４９１８号、国際公開特許第ＷＯ０３／６８７３８号、国際公開特許第ＷＯ０３／９２６９０号、国際公開特許第ＷＯ０３／９３２３４号、国際公開特許第ＷＯ０３／７２０５６号、国際公開特許第ＷＯ０３／６６５９７号、国際公開特許第ＷＯ０３／６６５８７号、国際公開特許第ＷＯ０３／５３９２７号、国際公開特許第ＷＯ０２／６７８６９号、国際公開特許第ＷＯ０２／６８３８７号、国際公開特許第ＷＯ０３／６８７３８号、国際公開特許第ＷＯ０２／００２５９号、国際公開特許第ＷＯ０２／９２５６６号、国際公開特許第ＷＯ０２／８１４４３号、国際公開特許第ＷＯ０２／８１４３０号、及び国際公開特許第ＷＯ０２／８０８９６号。

細胞表面へのＭＣ４Ｒの輸送の検出。化合物で処理したＭＣ４Ｒ発現細胞の細胞における局在性及び／又は細胞表面の局在性の検出が、未処理の細胞と比較して、上記されるように達成される。

ｃＡＭＰ蓄積の測定によるＭＣ４Ｒ活性の検出。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後０．０２％ＥＤＴＡ（Sigma）を含むＰＢＳでプレートから剥がした。剥がした細胞を遠心分離によって採取し、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、２ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（ＩＢＭＸ緩衝液）を含むハンクス平衡塩溶液（Invitrogen）で再懸濁する。ＩＢＭＸの取り込みを可能にする１５分間３７℃のインキュベーション後に、０．４ｍｌの細胞懸濁液（約５×１０５細胞／ｍｌ）を、様々な濃度のアゴニスト（例えば、［Ｎｌｅ４−Ｄ−Ｐｈｅ７］−ＭＳＨ（ＮＤＰ−ＭＳＨ）、α−ＭＳＨ）を含む０．１ｍｌのＩＢＭＸ緩衝液、又は他のシャペロン候補又は１０μＭのホルスコリンに加える。続いて、ｃＡＭＰ蓄積を可能にするために１５分間３７℃で、細胞をインキュベートする。５％トリクロロ酢酸を０．５ｍｌ加えることによって活性を終了させ、溶解細胞から放出されたｃＡＭＰをｃＡＭＰ １２５Ｉシンチレーション近接解析システム（Amersham Biosciences）によって分析する。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（勾配変化のある法面によるシグモイド用量応答曲線を適合させた非線形回帰分析を使用）を使用して、９５％の信頼区間で計算する。

実施例６：α−ガラクトシダーゼＡの酵素活性の安全性、耐容性、薬物動態学及び効果を評価するための単回用量ＤＧＪの投与
本実施例は、健康なボランティアにおけるＤＧＪの安全性、耐容性、薬物動態学、及びα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）の酵素的活性効果を評価するためのＤＧＪの１日２回の経口投与の無作為二重盲検プラセボ対照第Ｉ相試験を記述する。

試験計画及び継続期間。この試験は、経口投与後のＤＧＪの安全性、耐容性、薬物動態学、及びα−Ｇａｌ Ａの酵素的活性効果を評価するための、ヒト初投与単一施設第Ｉ相無作為二重盲検１日２回用量プラセボ対照試験である。この試験は、７日間連続して５０ｍｇ又は１５０ｍｇの用量のＤＧＪ又はプラセボを１日２回、経口で投与された８人の被験体（６人は活性物及び２人はプラセボ）の２つのグループを検査し、７日間の追跡訪問が付随した。被験体を、投薬前１４時間から投薬後２４時間まで処理施設に収容した。食事はスケジュールによって制御され、被験体は薬剤投与４時間後に歩行可能な（abulatory）ままであった。

１日目及び７日目の血漿中のＤＧＪについて、薬物動態パラメーターを計算した。さらに、尿に排泄された（投与の１２時間後）ＤＧＪの累積率を計算した。投薬が始まる前及びさらに試験中の１００時間、１５０時間、３３６時間に、白血球（ＷＢＣ）におけるα−Ｇａｌ Ａ活性を計算した。

試験集団。被験体は、一般社会の構成員から成る１９〜５０歳（包括的）の健康で、特定の組織に属していない、非喫煙男性ボランティアであった。

安全性及び耐容性の評価。安全性は、バイタルサイン、臨床検査パラメーター（血清化学、血液学及び尿検査）、ＥＣＧ、身体検査の評価によって、及び治療期間の間に有害事象を記録することによって決定された。

薬物動態学のサンプリング。投与前、並びに投与０．２５時間後、０．５時間後、０．７５時間後、１時間後、１．５時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後及び１２時間後に、血液サンプル（各々１０ｍＬ）をＥＤＴＡを含む血液採取チューブに回収した。血液サンプルを氷浴で冷却し、できるだけ早く冷却下で遠心分離機にかけた。血漿サンプルを２つの小分けに分割し、分析の間２０±１０℃で保存した。試験終了時に、サンプルはすべて分析のために、ＭＤＳファーマ・サービス（MDS Pharma Services）分析実験室（リンカーン）へ運んだ。ＤＧＪの投与後１日目及び７日目に、最初の１２時間の腎臓クリアランスを決定するために、各々の被験体からＤＧＪ分析用の尿総排出量を集めた。

ＷＢＣのα−ＧＡＬ Ａ酵素活性のサンプリング。投与前並びに投与１００時間、１５０時間、及び３３６時間後に、血液サンプル（各々１０ｍＬ）をＥＤＴＡを含む血液採取チューブに回収し、ＷＢＣを抽出した。上記されるように、サンプルを処理し、ＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ酵素活性レベルを決定した。

統計分析。臨床検査評価、健康診断、有害事象、ＥＣＧモニタリング及びバイタルサイン評価を含む安全性データは、処理グループ及び回収の時点によって要約された。記述的統計（相加平均、標準偏差、中央値、最小及び最大）も、ベースラインに対する差と同様に、定量的安全性データのために計算された。頻度数は質的安全性データの分類のために収集された。

有害事象は、ＭｅｄＤＲＡバージョン７．０ディクショナリーを使用してコードされ、有害事象が報告される被験体数及び報告された有害事象数に対する処理によって要約された。報告者が用いた（verbatim）用語、コードされた用語、処理グループ、重症度、及び処理との関係を含む、被験体による有害事象データのリストが提供された。併用薬及び病歴を処理によりリストした。

薬物動態パラメーターは、記述的統計（相加平均、標準偏差、変動係数、サンプルサイズ、最小、最大及び中央値）を使用して、処理グループにより要約された。

結果
プラセボ処理した被験体では有害事象（ＡＥ）はなく、ＤＧＪ ５０ｍｇを１日２回又はＤＧＪ １５０ｍｇを１日２回を投与された後にＡＥを示した被験体はなかった。用量５０ｍｇを１日２回及び１５０ｍｇを１日２回、健康な男性被験体のこのグループに投与したとき、ＤＧＪは安全であり十分に許容されるように思われた。

投与後に、臨床検査の正常範囲からの偏差が生じたが、どれも臨床的有意であるとは判断されなかった。試験経過を通じて調べられた任意のパラメーターの中に、臨床的に関連する平均データの移行はなかった。臨床的に関連する異常は、いかなるバイタルサイン、ＥＣＧ、又は身体検査パラメーター中にも生じなかった。

薬物動力学的評価。以下の表は、試験の間に得られた薬物動態学のデータを要約する。

ＤＧＪの薬物動態学は、すべての被験体及びすべての用量レベルで十分に特徴付けられた。平均では、ピークの濃度は、すべての用量レベルでおよそ３時間で生じた。用量を５０ｍｇから１５０ｍｇに増加した場合、ＤＧＪのＣｍａｘは用量に比例する様式で増加した。

平均の排出半減期（ｔ１／２）は、１日目に、５０ｍｇ及び１５０ｍｇの用量レベルにおいては同等だった（２．５時間対２．４時間）。

投与後１２時間の間にわたって排泄されたＤＧＪの平均のパーセンテージは、５０ｍｇ及び１５０ｍｇの用量レベルで、１日目にそれぞれ１６％及び４２％であり、７日目にそれぞれ４８％及び６０％まで増加した。

α−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）酵素活性。試験の間に得られたα−Ｇａｌ Ａ酵素活性データを図１中に示す。ＤＧＪは、１日２回の５０ｍｇ又は１日２回の１５０ｍｇの用量で、被験体におけるＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ酵素活性を阻害しなかった。さらに、健康なボランティアにおいて、ＤＧＪはＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ活性の用量依存的な増加傾向を引き起こした。α−Ｇａｌ Ａ酵素活性は、プラセボ、１日２回の５０ｍｇのＤＧＪ、及び１日２回の１５０ｍｇのＤＧＪを投与した被験体のＷＢＣで測定した。プラセボはＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ酵素活性に効果がなかった。プラセボに反応した酵素活性の変化は、臨床的に有意ではなかった。１日２回の５０ｍｇのＤＧＪ及び１日２回の１５０ｍｇのＤＧＪの両方は、正規化されたＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ酵素活性を増加させた。１日２回の５０ｍｇのＤＧＪに応じて、ＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ酵素活性は、投与後１００時間、１５０時間、及び３３６時間で、それぞれ投与前レベルの１２０％、１３０％、及び１４５％まで増加した。１日２回の１５０ｍｇのＤＧＪに応じて、ＷＢＣのα−Ｇａｌ Ａ酵素活性は、投与後１００時間、１５０時間、及び３３６時間で、それぞれ投与前レベルの１５０％、１８５％、及び１８５％まで増加した。

本発明は、本明細書において記述された具体的な実施形態による範囲で限定するものではない。実際は、本明細書において記述されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、上述の説明及び添付の図から当業者に明らかになるだろう。そのような修飾は、添付された請求項の範囲内にあるように意図される。

特許、特許出願、出版物、製品説明、及びプロトコルを、本出願の全体にわたって引用し、すべての目的のために、それらの開示の全体を参照により本明細書において援用する。

Sebhat（2002, J Med Chem, 45, 4589-4593）によって報告された、ラット及びヒトのメラノコルチン４受容体のアゴニスト（化合物１）を示す図である。 Richardson（2004, J Med Chem 47, 744-755）によって報告された、ヒトＭＣ４Ｒのアゴニスト（化合物２）を示す図である。 化合物１の合成スキームを示す図である。 化合物２の合成スキームを示す図である。 Arasasingham（2003, J Med Chem 46, 9-11）によって報告された、ＭＣ４Ｒのアンタゴニスト（化合物３）を示す図である。 ＭＣ４Ｒのアンタゴニスト（化合物４）を示す図である。この化合物の生物活性はシンチレーション近接解析を使用して、国際公開特許第ＷＯ０２／０６２７６６号で報告される。 化合物３の合成スキームを示す図である。 化合物４の合成スキームを示す図である。 Pedemonte et al.（J. Clin. Inves. 2005; 115:2564-71）に記述された、ビスアミノチアゾール化合物（化合物５）を示す図である。 以下に記述される化合物６〜１１を示す図である。 以下に記述される化合物１２〜１６を示す図である。 以下に記述される化合物１７〜２０を示す図である。 以下に記述される化合物２１〜２５を示す図である。 リガンドアゴニストで処理したＭＣ４Ｒ変異体、アンタゴニストシャペロンで処理したＭＣ４Ｒ変異体、及びアンタゴニストシャペロンで処理しなかったＭＣ４Ｒ変異体におけるＭＣ４Ｒシグナル伝達分析を示す図である。 ５０ｍｇの１−デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）を１日２回（三角）、１５０ｍｇのＤＧＪを１日２回（四角）又はプラセボ（白丸）を投与された、正常で健康なボランティアからの白血球における、平均α−ガラクトシダーゼＡ活性を示す図である。 化合物１、２、６、７及び１２〜１７に基づいた化合物クラスの構造を示す図である。 化合物３、９、１０、１１及び２１に基づいた化合物クラスの構造を示す図である。 化合物４、８、２４及び２５に基づいた化合物クラスの構造を示す図である。 化合物１８〜２０に基づいた化合物クラスの構造を示す図である。

Claims (11)

1. 肥満の治療、肥満を発症するリスクがある患者における肥満の予防、又は過食症の治療もしくは予防における使用のためのメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対する薬理学的シャペロンを含む薬剤であって、薬理学的シャペロンが化合物２１及び２３から２５：
   

   

   から選択されるＭＣＲ４アンタゴニストである薬剤。
2. 薬理学的シャペロンが変異体ＭＣ４Ｒポリペプチドに結合し、
   ｉ．該変異体ＭＣ４Ｒ活性を増加させ；
   ｉｉ．変異体ＭＣ４Ｒ細胞表面発現を増加させ；及び／又は
   ｉｉｉ．安定性を増加させる、請求項１に記載の薬剤。
3. 変異体ＭＣ4ＲポリペプチドがＭＣ４Ｒポリペプチドの誤った折畳みと関連した変異を含む、請求項１又は２に記載の薬剤。
4. 変異体ＭＣ４Ｒポリペプチドが、配列番号：２と比較して、Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ、Ｒ１６５Ｗ、Ｉ１２５Ｋ、Ｃ２７１Ｙ、Ｔ１１Ａ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ３１６Ｌ、Ｉ３１６Ｓ、Ｉ３１７Ｔ、Ｎ９７Ｄ、Ｇ９８Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｃ２７１Ｒ、Ｓ５８Ｃ、Ｙ１５７Ｓ、Ｉ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｐ、Ｌ２５０Ｑ及びＹ２８７Ｘからなる群から選択される変異を含む、請求項３に記載の薬剤。
5. 変異体ＭＣ４Ｒポリペプチドが、配列番号：２と比較して、変異Ｒ１６５Ｑ、Ｒ１６５Ｗ、Ｓ５８Ｃ又はＮ６２Ｓを含む、請求項４に記載の薬剤。
6. ＭＣ４Ｒポリペプチドが機能的なコンフォメーションへ折畳まれるように、薬理学的シャペロンが変異体ＭＣ４Ｒポリペプチドに結合する、請求項１に記載の薬剤。
7. 薬理学的シャペロンによって増加される活性が、アデニリルシクラーゼの活性化である、請求項２に記載の薬剤。
8. 薬理学的シャペロンが、変異体ＭＣ４Ｒポリペプチドの細胞膜への輸送を増加させる、請求項２に記載の薬剤。
9. シャペロンが、肥満と関連したＭＣ４Ｒ遺伝子の変異を有する個体に投与される、請求項１から８の何れか一項に記載の薬剤。
10. 薬理学的シャペロンが、薬理学的に許容可能なキャリア中で投与される、請求項１から９の何れか一項に記載の薬剤。
11. シャペロンが、１日当たり１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される、請求項１から１０の何れか一項に記載の薬剤。

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