ES2710675T3 - Chaperonas farmacológicas para el tratamiento de la obesidad - Google Patents

Abstract

Una chaperona farmacológica del receptor de melanocortina 4 (MC4R) para su uso en el tratamiento de la obesidad o la prevención de la obesidad en un paciente que posee un polipéptido MC4R mutante, siendo la chaperona farmacológica el compuesto 23:**Fórmula** y en el que el polipéptido MC4R mutante comprende una mutación asociada con el plegamiento incorrecto del polipéptido MC4R.

Description

DESCRIPCION

Chaperonas farmacologicas para el tratamiento de la obesidad

Campo de la invencion

La invencion se refiere a procedimientos para potenciar la actividad normal del receptor de melanocortina-4 (MC4R), y a potenciar la actividad de un MC4R que tiene una mutacion o mutaciones que afectan al plegamiento de protemas y/o al procesamiento del MC4R. La invencion proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece una afeccion en la que un aumento en la actividad de un MC4R en la superficie celular sena beneficioso, tal como en la obesidad, mediante la administracion de una cantidad eficaz de una chaperona farmacologica para el MC4R. La invencion proporciona chaperonas farmacologicas para el MC4R que potencian la actividad del MC4R. La invencion proporciona ademas un procedimiento de cribado para identificar chaperonas farmacologicas que mejoran el plegamiento de un MC4R en el retmulo endoplasmatico (RE), a fin de potenciar la actividad del MC4R en la superficie celular.

Antecedentes de la invencion

Obesidad

La obesidad representa el trastorno de peso corporal mas frecuente, y es el trastorno nutricional mas importante en el mundo occidental, estimandose que su prevalencia vana entre el 30% y el 50% de la poblacion de mediana edad. Las cifras de estadounidenses con sobrepeso y obesos han seguido aumentando desde 1960, una tendencia que no se esta ralentizando. Actualmente, el 64,5 por ciento de los adultos estadounidenses (aproximadamente 127 millones) se clasifican como obesos o con sobrepeso. Cada ano, la obesidad causa al menos 300.000 muertes en Estados Unidos, y los costes sanitarios de adultos estadounidenses con obesidad ascienden a aproximadamente 100 mil millones de dolares (American Obesity Association).

La obesidad aumenta el riesgo de un individuo de desarrollar afecciones tales como hipertension arterial, diabetes (tipo 2), hiperlipidemia, cardiopatfa, hipertension, apoplejfa, enfermedad de la vesmula biliar y cancer de mama, de prostata y de colon (vease, por ejemplo, Nishina, P. M. et al., 1994, Metab. 43: 554-558; Grundy, S. M. y Barnett, J. P., 1990, Dis. Mon. 36: 641-731). En los Estados Unidos, la incidencia de sobrepeso u obesidad se produce en tasas mas elevadas en poblaciones de minonas raciales/etnicas, tales como los afroamericanos y los hispanos, en comparacion con los estadounidenses de raza blanca. Las mujeres y las personas de bajo estatus socioeconomico dentro de poblaciones minoritarias parecen verse particularmente afectadas por el exceso de peso y la obesidad. Esta tendencia no se limita a los adultos. Aproximadamente el 30,3 por ciento de los ninos (de 6 a 11 anos) tienen sobrepeso y el 15,3 por ciento son obesos. Para los adolescentes (de 12 a 19 anos), el 30,4 por ciento tiene sobrepeso y el 15,5 por ciento es obeso. La diabetes, la hipertension y otras enfermedades cronicas relacionadas con la obesidad que estan generalizadas entre adultos se han vuelto ahora mas comunes en ninos y adultos jovenes. Se ha informado que los malos habitos alimenticios y la inactividad contribuyen al aumento de la obesidad en los jovenes.

Ademas, los factores de riesgo para el desarrollo de obesidad infantil incluyen tener padres con sobrepeso, o padres despreocupados por el peso de sus hijos, una mayor ingesta de energfa debido al mayor tamano de las porciones, un estilo de vida mas sedentario y una menor actividad relacionada con el transporte (caminar a la escuela o a la parada de autobus), tener un temperamento con altos niveles de enfado/frustracion (lo que puede hacer que los padres den a sus hijos alimentos y calonas adicionales para disminuir las rabietas); padecer smdrome de Down, el mdice de masa corporal (IMC) durante el embarazo de la madre y ser el primogenito (mayor prevalencia de obesidad).

Una herramienta utilizada para diagnosticar obesidad en adultos es calcular el IMC de una persona, que es una medida del peso corporal con respecto a la altura (Garrow y Webster, International Journal of Obesity 1985; 9: 147­ 153). Un IMC de 25 a 29,9 indica que una persona tiene sobrepeso, mientras que un IMC de 30 o mas es indicativo de obesidad. Para los ninos, el IMC es espedfico del sexo y de la edad (Pietrobelli et al., Journal of Pediatrics 1998; 132: 204-210).

Los factores de riesgo para desarrollar obesidad en la edad adulta incluyen una dieta deficiente (alta en calonas y baja en nutrientes); falta de actividad ffsica; trabajar en turnos variados; dejar de fumar, padecer determinadas afecciones medicas tales como enfermedades hereditarias raras y desequilibrios hormonales (como hipotiroidismo, enfermedad de Cushing y smdrome del ovario poliqmstico); determinados medicamentos (esteroides y algunos antidepresivos); pertenecer a una minona racial o etnica (especialmente una minona femenina); bajo estatus socioeconomico; edad (aumento del riesgo de 20 a 55 anos), embarazo; y jubilacion (debido a la alteracion del horario).

Receptor de melanocortina 4 y obesidad

El receptor de melanocortina 4 (MC4R) se ha implicado en la regulacion del peso corporal (Graham et al., Nat. Genetics 1997; 17: 273-4). El MC4R se expresa en el cerebro, incluido el hipotalamo, lo que influye en la ingesta de alimentos. Se han encontrado numerosas mutaciones que afectan a la actividad de MC4R y muchas estan asociadas con la obesidad, incluida la obesidad de aparicion temprana (infancia) (Nijenhuis et al., J. Biol. Chem.

2003, 278: 22939-45; Branson et al., New Eng. J. Med. 2003, 348: 1096-1103; Gu et al., Diabetes 1999, 48: 635-39.; Farooqi et al., New Eng. J. Med. 2003, 348: 1085-95; Tao et al., Endocrinology 2003, 144: 4544-51).

Tratamientos actuales

Los farmacos actuales contra la obesidad tienen una eficacia limitada y numerosos efectos secundarios (Crowley, V. E., Yeo, G. S. y O'Rahilly, S., Nat. Rev. Drug Discov. 2002; 1, 276-86). Con la obesidad alcanzando proporciones epidemicas a lo largo del mundo, existe la necesidad apremiante de desarrollar productos terapeuticos adecuados en este campo. En los ultimos anos, han surgido hormonas y neuropeptidos implicados en la regulacion del apetito, el gasto de energfa corporal y la acumulacion de masa grasa como farmacos potenciales contra la obesidad (McMinn, J. E., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W., Obes Rev 2000; 1: 37-46; Drazen, D. L. y Woods, S. C., Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2003; 6: 621-629). En la actualidad, no obstante, estos peptidos requieren administracion parenteral. La perspectiva de inyecciones diarias para controlar la obesidad durante largos penodos de tiempo (ya que la obesidad es una afeccion cronica) no es muy alentadora y limita el uso de estos farmacos.

Las chaperonas moleculares estabilizan el plegamiento apropiado de protemas

Las protemas se sintetizan en el citoplasma y las protemas recien sintetizadas se secretan en el lumen del retmulo endoplasmatico (RE) en un estado en gran parte desplegado. En general, el plegamiento de protemas se rige por el principio de autoensamblaje. Los polipeptidos recien sintetizados se pliegan en su conformacion nativa basandose en sus secuencias de aminoacidos (Anfinsen y otros, Adv. Protein Chem. 1975; 29: 205-300). El plegamiento de protemas in vivo es complicado, debido a que la combinacion de temperatura ambiente y una concentracion elevada de protemas estimula el proceso de agregacion, en el que los aminoacidos, normalmente enterrados en el nucleo hidrofobo, interactuan de forma no espedfica con sus vecinos. Para evitar este problema, el plegamiento de protemas viene generalmente facilitado por un grupo especial de protemas denominadas chaperonas, que evitan que las cadenas polipeptfdicas emergentes formen agregados uniendose a la protema desplegada de forma que la protema se vuelva a plegar en la conformacion nativa (Hartl, Nature 1996; 381: 571-580).

En practicamente todos los tipos de celulas y en la mayor parte de los compartimentos celulares hay presencia de chaperonas moleculares endogenas. Algunas estan implicadas en el transporte de protemas y permiten que las celulas sobrevivan bajo tensiones tales como choque termico y carencia de glucosa (Gething et al., Nature 1992; 355: 33-45; Caplan, Trends Cell. Biol. 1999; 9: 262-268; Lin et al., Mol. Biol. Cell. 1993; 4: 109-1119; Bergeron et al., Trends Biochem. Sci. 1994; 19: 124-128). Entre las chaperonas endogenas, la BiP (protema de union a la cadena pesada de inmunoglobulina, Grp78) es la chaperona mejor caracterizada del RE (Haas, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1991; 167: 71-82). Al igual que otras chaperonas, la BiP interactua con muchas protemas secretoras y de membrana dentro del RE a lo largo de su maduracion. Cuando el plegamiento de protemas incipiente se produce sin problemas, esta interaccion es normalmente debil y de corta duracion. Una vez que se logra la conformacion de protema nativa, la chaperona molecular ya no interactua con la protema. La union de BiP a una protema que no se pliega, no se ensambla o no esta adecuadamente glicosilada se vuelve estable, y generalmente conduce a la degradacion de la protema mediante la ruta de degradacion asociada al RE. Este proceso sirve como un sistema de "control de calidad" en el RE, asegurando que solo las protemas plegadas y ensambladas se transporten fuera del RE para una posterior maduracion, y las protemas incorrectamente plegadas se retengan para su posterior degradacion (Hurtley et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 1989; 5: 277-307). Debido a las acciones combinadas de ineficacia del proceso de plegamiento de la protema termodinamico y del sistema de control de calidad del RE, solo una fraccion de las protemas emergentes (no mutadas) se pliegan en una conformacion funcional y abandonan exitosamente el RE.

Las chaperonas farmacologicas derivadas de inhibidores de enzimas espedficos rescatan enzimas mutantes y mejoran enzimas de tipo silvestre

Se ha demostrado previamente que los inhibidores de molecula pequena de enzimas asociadas con trastornos de almacenamiento lisosomal (LSD) pueden rescatar el plegamiento y la actividad de la enzima mutante, y mejorar el plegamiento y la actividad de la enzima de tipo silvestre (veanse las patentes de Estados Unidos N° 6.274.597, 6.583.158, 6.589.964, 6.599.919 y 6.916.829, que se incorporan todas al presente documento por referencia). En particular, se descubrio que la administracion de derivados de molecula pequena de glucosa y galactosa, que eran inhibidores competitivos espedficos de enzimas mutantes asociadas con LSD, aumentaba eficazmente la estabilidad in vitro e in vivo de las enzimas mutantes y potenciaba la actividad de las enzimas mutante. La teona original detras de esta estrategia es la siguiente: dado que la protema enzimatica mutante se pliega incorrectamente en el RE (Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), la protema enzimatica se retrasa en la ruta de transporte normal (RE ^ aparato de Golgi ^ endosoma ^ lisosoma) y se degrada rapidamente. Por lo tanto, un compuesto que estabiliza el plegamiento correcto de una protema mutante servira como una chaperona espedfica del sitio activo para promover que la protema mutante escape sin problemas del sistema de control de calidad del RE. Los inhibidores de la enzima ocupan el centro catalttico, lo que tiene como resultado la estabilizacion de la conformacion de la enzima en celulas en cultivo y en animales. Estas chaperonas espedficas se denominaron "chaperonas espedficas del sitio activo (ASSC)", ya que se unen al sitio activo de la enzima.

Ademas de rescatar las enzimas mutantes, las ASSC potencian la secrecion del RE y la actividad de las enzimas de tipo silvestre recombinantes. Una ASSC facilita el plegamiento de la enzima de tipo silvestre sobreexpresada, que de otra manera se retrasana en el sistema de control de calidad del RE debido a que la sobreexpresion y la produccion excesiva de la enzima excede la capacidad del RE y conduce a la agregacion y degradacion de protemas. Por lo tanto, un compuesto que induce una conformacion molecular estable de una enzima durante el plegamiento sirve como "chaperona" para estabilizar la enzima en una conformacion adecuada para abandonar el ^r E. Tal como se ha indicado anteriormente, para enzimas, uno de dichos compuestos resulto ser inesperadamente un inhibidor competitivo de la enzima.

Mejora de otras protemas con chaperonas

Ademas de los LSD, una serie amplia y diversas de enfermedades se reconocen actualmente como "enfermedades conformacionales" que estan provocadas por la adopcion de conformaciones de protema no nativa, lo que puede llevar a un retraso de la protema en el RE y a una degradacion final de las protemas. (Kuznetsov et al., N. Engl. J. Med. 1998; 339: 1688-l695; Thomas et al., Trends Biochem. Sci. 1995; 20: 456-459; Bychkova et al., FEBS Lett.

1995; 359: 6-8; Brooks, FEBS Lett. 1997; 409: 115-120).

Por ejemplo, se ha descubierto que algunos compuestos sinteticos pequenos estabilizan el dominio de union al ADN de formas mutantes de la protema p53 supresora de tumores, lo que permite a la protema mantener una conformacion activa (Foster et al., Science 1999; 286: 2507-10). Se ha demostrado que la smtesis de receptores esta rescatada por antagonistas y ligandos de receptores de molecula pequena (Morello y otros, J. Clin. Invest.

2000; 105: 887-95; Petaja-Repo et al., EMBO J. 2002; 21: 1628-37). Incluso se ha demostrado el rescate farmacologico de protemas de canal de membrana y otros transportadores de la membrana plasmatica mediante el uso de farmacos o sustratos bloquedadores de canales (Rajamani et al., Circulation 2002; 105: 2830-5; Zhou et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 31123-26; Loo et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 709-12; Pedemonte et al., J. Clin. Inves.

2005; 115: 2564-71).

Sigue existiendo en la tecnica la necesidad particular de abordar las deficiencias en la funcion de la protema MC4R que estan relacionadas y no relacionadas con una mutacion de MC4R.

Sumario de la invencion

Tal como se describe en el presente documento, la presente invencion proporciona una chaperona farmacologica para el receptor de melanocortina 4 (MC4R) para su uso en el tratamiento de la obesidad o la prevencion de la obesidad en un paciente que posee un polipeptido MC4R mutante, en el que la chaperona farmacologica es el compuesto 23:

y en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion asociada con el plegamiento incorrecto del polipeptido MC4R.

Preferentemente, la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante para

i. aumentar la actividad de MC4R mutante;

ii. aumentar la expresion en la superficie celular de MC4R mutante y/o

iii. aumentar la estabilidad.

De forma mas preferida, el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion seleccionada del grupo que consiste en P78L, R165Q, R165W, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, I97D, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, Y157S, I102S, L106P, L250Q y Y287X en comparacion con la SEQ ID NO: 2.

De forma aun mas preferida, el polipeptido MC4R mutante comprende la mutacion C271Y, R165Q, R165W, S58C o N62S en comparacion con la SEQ ID No : 2.

Preferentemente, la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante cuando se esta plegando en una conformacion funcional.

Preferentemente, la actividad potenciada por la chaperona farmacologica es la activacion de la adenilil ciclasa. Preferentemente, la chaperona farmacologica aumenta el transporte del polipeptido MC4R mutante a la membrana celular.

Preferentemente, la chaperona debe administrarse a un individuo que comprende una mutacion en un gen de MC4R que se ha asociado con la obesidad.

Preferentemente, la chaperona farmacologica debe administrarse en un vehmulo farmacologicamente aceptable. Preferentemente, la chaperona se administra en una cantidad de 1 a 100 mg/kg de peso corporal por dfa.

La presente invencion se entendera adicionalmente mediante referencia a la Descripcion detallada y a los Ejemplos. Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Un agonista de los receptores de melanocortina-4 de rata y humanos, segun se informa por Sebhat, 2002, J Med Chem, 45, 4589-4593 (compuesto 1).

Figura 2. Un agonista del MC4R humano, segun se informa por Richardson, 2004, J Med Chem 47, 744-755 (compuesto 2).

Figura 3. Esquema de smtesis para el compuesto 1.

Figura 4. Esquema de smtesis para el compuesto 2.

Figura 5. Un antagonista de MC4R, segun se informa por Arasasingham, 2003, J Med Chem 46, 9-11 (compuesto 3).

Figura 6. Un antagonista de MC4R (compuesto 4); de la actividad biologica de este compuesto se informa en el documento WO 02/062766 utilizando un ensayo de proximidad de centelleo.

Figura 7. Esquema de smtesis para el compuesto 3.

Figura 8. Esquema de smtesis para el compuesto 4.

Figura 9. Un compuesto de bisaminotiazol descrito por Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (compuesto 5).

Figura 10A-D. Compuestos 6-25 descritos mas adelante.

FIG 11. Ensayo de senalizacion de MC4R en mutantes de MC4R tratados con agonista de ligando y con y sin chaperonas antagonistas.

Figura 12. Actividad media de a-galactosidasa A en leucocitos de voluntarios sanos y normales que recibieron 50 mg de 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) dos veces al dfa (triangulos), 150 mg de DGJ dos veces al dfa (cuadrados) o placebo (drculos sin relleno).

Figura 13. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 1, 2, 6, 7 y 12-17.

Figura 14. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 3, 9, 10, 11 y 21.

Figura 15. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 4, 8, 24 y 25.

Figura 16. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 18-20.

Descripcion detallada

La presente invencion se refiere al descubrimiento de que pueden identificarse moleculas pequenas para rescatar el plegamiento y el procesamiento de protemas de los polipeptidos MC4R mutantes y de tipo silvestre y mejorar la estabilidad de las protemas en la superficie celular de neuronas, lo que a su vez disminuye el apetito y la sobrealimentacion. Las chaperonas farmacologicas se unen espedficamente a la protema MC4R e inducen o estabilizan una conformacion funcional del MC4R mutante o de tipo silvestre. Por lo tanto, la invencion permite el rescate espedfico de MC4R mutante, asf como la expresion potenciada de MC4R de tipo silvestre en la superficie celular. En consecuencia, las chaperonas farmacologicas para MC4R pueden usarse para el tratamiento de trastornos en los que se desea el rescate, o el aumento de la estabilidad o de la actividad, de MC4R, por ejemplo, el trastorno de padecer sobrepeso u obesidad.

La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que la administracion de una chaperona farmacologica a un ser humano dio como resultado un aumento significativo en el nivel de actividad de una protema de tipo silvestre. Este descubrimiento, combinado con un entendimiento de la capacidad de una chaperona farmacologica para promover el plegamiento apropiado de protemas en el RE, lo que conduce a un transporte correcto de protemas y a un aumento significativo de la actividad proteica, proporciona la capacidad de lograr una actividad proteica suficiente como para revertir o mejorar una enfermedad, un trastorno o una afeccion, en particular en un sujeto humano. Este fenomeno es altamente espedfico con respecto a la protema unida espedficamente por la chaperona farmacologica particular, a diferencia de los procedimientos que utilizan compuestos que operan generalmente aumentando la expresion de todas las protemas, denominados "chaperonas qmmicas".

La presente invencion se fundamenta en determinados resultados experimentales: las chaperonas farmacologicas aumentaron la actividad de protema de tipo silvestre endogena en humanos a aproximadamente el 120% de lo normal, 130% de lo normal y 145% de lo normal a una dosis mas baja, y al 150% y el 185% de lo normal a una dosis mas elevada despues de la administracion de una chaperona farmacologica (veanse el ejemplo 7 y figura 12). Este nivel de aumento in vivo no era predecible a partir de los resultados con celulas en cultivo tisular que permanecen expuestas a la chaperona farmacologica. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.274.597 describe un aumento del 30% de la actividad de a-galactosidasa A (a-Gal A) en linfoblastos normales cultivados in vitro con desoxigalactonojirimicina (DGJ), una chaperona farmacologica. Dada la expectativa de que se esperana que los procesos de depuracion fisiologicos redujeran los efectos de chaperonas farmacologicas sobre protemas normales in vivo, no se esperaba que una chaperona farmacologica produjera un aumento significativo en la actividad de las protemas de tipo silvestre. El ejemplo 10 de la patente de Estados Unidos N° 6.274.597 describe un aumento en la actividad de una enzima mutante en ratones transgenicos tratados durante una semana con una chaperona farmacologica. No obstante, estos experimentos involucraron formas mutantes de la protema rescatada, no de tipo silvestre, y se realizaron en ratones, por lo que los resultados no predijeron ni sugirieron los resultados observados para protema de tipo silvestre en seres humanos.

No habfa ninguna base para esperar que una chaperona farmacologica pudiera aumentar el nivel de actividad de una protema de tipo silvestre in vivo en al menos el 20-25%, es decir, en al menos 1,2 veces o el 120% de lo normal, o el 30% (1,3 veces, el 130% de lo normal), el 40% (1,4 veces, el 140% de lo normal), y en particular no en al menos aproximadamente el 50% (1,5 veces, el 150% de lo normal). Sin embargo, como se ejemplifica en el presente documento, la administracion de DGJ a sujetos dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en a-Gal A. Este efecto extraordinario es consecuencia de la titulacion de la chaperona farmacologica que ya se ha demostrado segun la tecnologfa existente en el rescate de una forma mutante de la protema para lograr el aumento de actividad de una protema de tipo silvestre. Por consiguiente, la invencion se refiere a la titulacion de una dosis de una chaperona farmacologica que se ha encontrado que rescata la actividad de una protema mutante para aumentar el nivel de actividad de una protema de tipo silvestre en una cantidad definida.

Definiciones

Los terminos que se usan en la presente memoria descriptiva tienen generalmente sus significados ordinarios en la tecnica, dentro del contexto de la presente invencion y en el contexto espedfico en el que se usa cada termino. Determinados terminos se describen a continuacion, o en otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar una grna adicional al profesional en la descripcion de las composiciones de la invencion y como producirlas y usarlas.

Tal como se usa en el presente documento, la locucion "chaperona farmacologica" o, a veces, "chaperona farmacologica espedfica" ("SPC"), se refiere a una molecula que se une espedficamente a MC4R y que tiene uno o mas de los siguientes efectos: (i) mejora la formacion de una conformacion molecular estable de la protema; (ii) mejora el transporte adecuado de la protema desde el RE a otra ubicacion celular, preferentemente una ubicacion celular nativa, es decir, previene la degradacion asociada al RE de la protema; (iii) evita la agregacion de protemas conformacionalmente inestables, es decir, plegadas incorrectamente; (iv) restaura o mejora al menos parcialmente la funcion, la estabilidad y/o la actividad de tipo silvestre de la protema; y/o (v) mejora el fenotipo o la funcion de la celula que alberga MC4R. Por lo tanto, una chaperona farmacologica para MC4R es una molecula que se une a MC4R, lo que da como resultado un plegamiento adecuado, un transporte adecuado, la no agregacion y la actividad adecuada de MC4R. Tal como se utiliza en el presente documento, esta locucion no se refiere a chaperonas endogenas, tales como BiP, o a agentes no espedficos que han demostrado actividad de chaperona no espedfica contra diversas protemas, tales como glicerol, DMSO o agua deuterada, es decir, chaperonas quimicas (veanse Welch et al., Cell Stress and Chaperones 1996; 1 (2): 109-115; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29 (5): 491-502; la patente de Estados Unidos N° 5.900.360; la patente de Estados Unidos N° 6.270.954 y la patente de Estados Unidos N° 6.541.195). Incluye moleculas de union espedficas, por ejemplo, chaperonas farmacologicas espedficas (descritas anteriormente), inhibidores o antagonistas, y agonistas.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "se une espedficamente" se refiere a la interaccion de una chaperona farmacologica con MC4R, espedficamente, una interaccion con residuos de aminoacidos de MC4R que participan directamente en la puesta en contacto con la chaperona farmacologica. Una chaperona farmacologica se une espedficamente a una protema diana, en el presente documento MC4R, para ejercer un efecto de chaperona sobre el MC4R, y no sobre un grupo generico de protemas relacionadas o no relacionadas. Los residuos de aminoacidos de MC4R que interaction con cualquier chaperona farmacologica de MC4R pueden estar o no dentro del dominio de union al ligando de MC4R, es decir, el dominio que se une al ligando natural MSH, o cualquier otro "sitio activo" de MC4R, por ejemplo el dominio de union a la protema G. La union espedfica puede evaluarse mediante ensayos de union rutinarios o mediante estudios estructurales, por ejemplo, cocristalizacion, RMN y similares. Los ejemplos de aminoacidos en el dominio de union al ligando MSH de MC4R incluyen, pero sin limitacion, Phe284 y Tyr268 (usando, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 como secuencia de referencia).

En una forma de realizacion no limitante, la chaperona farmacologica es un inhibidor o antagonista de MC4R. En otra forma de realizacion no limitante, la chaperona farmacologica es un agonista de MC4R. En otra forma de realizacion mas, la chaperona farmacologica es un agonista/antagonista mixto. Tal como se usa en el presente documento, el termino "antagonista" se refiere a cualquier molecula que se une a una protema y bloquea, inhibe, reduce o neutraliza parcialmente o completamente una actividad del MC4R. El termino "agonista" se refiere a cualquier molecula que se une a una protema y, al menos parcialmente, aumenta, mejora, restaura o imita una actividad del MC4R. Tal como se discute mas adelante, dichas moleculas son conocidas para el MC4R.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "mejoran la estabilidad conformacional de MC4R" o "aumentan la estabilidad conformacional de MC4R" se refieren al aumento de la cantidad o la proporcion de MC4R que adopta una conformacion funcional en una celula en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R con respecto al MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) que no esta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4r . En un caso, las celulas no expresan un mutante conformacional de MC4R. En otro caso, las celulas expresan un polinucleotido MC4R mutante que codifica un polipeptido, por ejemplo, un mutante conformacional de MC4R.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "mejoran el transporte de MC4R" o "aumentan el transporte de MC4R" se refieren a aumentar la eficacia del transporte de MC4R a la membrana plasmatica en una celula en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R con respecto a la eficacia de transporte del MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) que no esta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "mejoran la actividad de MC4R" o "aumentan la actividad de MC4R" se refieren a aumentar la actividad de MC4R, tal como se describe en el presente documento, en una celula en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R con respecto a la actividad del MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) que no esta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "mejoran el nivel de MC4R" o "aumentan el nivel de MC4R" se refieren a aumentar el nivel de MC4R en una celula en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R con respecto al nivel de MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) que no esta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R.

La expresion "estabilizan una conformacion apropiada" se refiere a la capacidad de una chaperona farmacologica de MC4R para inducir o estabilizar una conformacion de una protema MC4R mutada que es funcionalmente identica a la conformacion de la protema MC4R de tipo silvestre. La expresion "funcionalmente identica" significa que aunque pueden existir pequenas variaciones en la conformacion (casi todas las protemas presentan alguna flexibilidad conformacional en su estado fisiologico), la flexibilidad conformacional no produce (1) agregacion de protemas, (2) eliminacion a traves de la ruta de degradacion asociada al retfculo endoplasmatico, (3) deterioro de la funcion de la protema, por ejemplo, la capacidad de unirse al ligando y/o de activar la actividad de la adenilil ciclasa y/o (4) un transporte inapropiado dentro de la celula, por ejemplo, una localizacion en la membrana plasmatica en mayor o menor grado que la de la protema de tipo silvestre.

La expresion "conformacion molecular estable" se refiere a la conformacion de una protema, es decir, MC4R, inducida por una chaperona farmacologica que proporciona una funcion de tipo silvestre al menos parcial en la celula. Por ejemplo, una conformacion molecular estable de un MC4R mutante sena aquella en la que el MC4R abandona el RE y se envfa a la membrana celular como un MC4R de tipo silvestre, en lugar de plegarse incorrectamente y degradarse. Ademas, una conformacion molecular estable de un MC4R mutado tambien puede poseer actividad de MC4R total o parcial, por ejemplo, actividad activadora de la adenilil ciclasa para mejorar la generacion de AMPc a traves de su protema G fisiologica cognada. Sin embargo, no es necesario que la conformacion molecular estable tenga todos los atributos funcionales de la protema de tipo silvestre.

La expresion "actividad de MC4R" se refiere a la funcion fisiologica normal de un MC4R de tipo silvestre en una celula. Por ejemplo, tras la union de un agonista, el MC4R senala la via de interaccion con una protema G, Gas, y la activacion de adenilato ciclasa (vease, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40). Esto da como resultado la acumulacion intracelular de AMPc y la activacion de la protema quinasa A (PKA). Dicha funcionalidad se puede evaluar mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Por ejemplo, los ensayos de union del ligando a-, p- o ^y-MSH, o el agonista 125I-[Nle4,D-Phe7]a-MSH a MC4R, o el uso de ensayos de activacion de la adenilil ciclasa, o ensayos del gen indicador de luciferasa, se pueden usar para determinar aumentos en el AMPc intracelular. Los ensayos de acumulacion de AMP dclico son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40).

"MC4R" se refiere a un polipeptido codificado por una secuencia de nucleotidos que tiene la secuencia representada en una cualquiera de: la s Eq ID NO: 1 (humana; N° de acceso de GenBank BC069172); 3 (humana; N° de acceso de GenBank NM_005912); 5 (de rata; N° de acceso de GenBank NM_013099); o 7 (murina; N° de acceso de GenBank NM_016977).

Un "polipeptido MC4R" tambien se refiere a una secuencia de aminoacidos tal como se representa en las SEQ ID NO: 2 (humana; N° de acceso de GenBank AAI01803); 4 (humana; N° de acceso de GenBank NM_005912); 6 (de rata; N° de acceso de GenBank NM_013099); u 8 (murina; N° de acceso de GenBank AF201662), y cualquier otra secuencia de aminoacidos que codifique un polipeptido MC4R que tenga la misma funcion y afinidad de union al ligando que cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.

La expresion "MC4R de tipo silvestre" se refiere a las secuencias de nucleotidos (SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7) que codifican MC4R y a las secuencias polipeptfdicas (SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8) codificadas por las secuencias de nucleotidos mencionadas anteriormente (MC4R humano-N° de acceso de GenBank AAI01803; MC4R humano-N° de acceso de GenBank NM_005912; MC4R de rata-N° de acceso de GenBank NM_013099; MC4R de raton-N° de acceso de GenBank AF201662); y a cualquier otra secuencia de nucleotidos que codifique el polipeptido MC4R (que tenga las mismas propiedades funcionales y afinidades de union que las secuencias polipeptfdicas mencionadas anteriormente), tal como variantes alelicas en individuos normales, que tienen la capacidad de lograr una conformacion funcional en el RE, lograr una ubicacion adecuada dentro de la celula y mostrar actividad de tipo silvestre (por ejemplo, la estimulacion por MC4R de la acumulacion de AMPc).

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "MC4R mutante" se refiere a un polipeptido MC4R traducido por un gen que contiene una mutacion genetica que da como resultado una secuencia de aminoacidos de MC4R alterada. En un caso, la mutacion da como resultado una protema MC4R que no consigue obtener una conformacion nativa en las condiciones normalmente presentes en el RE, en comparacion con el MC4R de tipo silvestre, o muestra una disminucion de la estabilidad o la actividad en comparacion con el MC4R de tipo silvestre. Este tipo de mutacion se denomina en el presente documento una "mutacion conformacional", y la protema que posee dicha mutacion se denomina "mutante conformacional". La no consecucion de esta conformacion tiene como consecuencia que la protema MC4R se degrade o forme agregados, en lugar de ser transportada a traves de una ruta normal en el sistema de transporte de protemas a su ubicacion nativa en la celula o al entorno extracelular. En algunos casos, puede producirse una mutacion en una parte no codificante del gen que codifica MC4R que da como resultado una expresion menos eficaz de la protema, por ejemplo una mutacion que afecta a la eficacia de la transcripcion, la eficacia del corte y empalme, la estabilidad del ARNm y similares. Al aumentar el nivel de expresion de las variantes de tipo natural, asf como variantes mutantes conformacionales de MC4R, la administracion de una chaperona farmacologica MC4R puede mejorar el deficit resultante de dicha expresion de protema ineficaz.

Las mutaciones ejemplares (utilizando el polipeptido de SEQ ID NO: 2 como referencia) incluyen P78L, R165Q y R165W. Otros mutantes de MC4R incluyen I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211 y la insercion TGAT en el codon 244. Ademas, otras mutaciones de MC4R (de nuevo utilizando la SEQ ID NO: 2 como referencia) incluyen las descritas en la tabla 1, mas adelante.

Determinados ensayos pueden evaluar los atributos de una protema que pueden o no corresponder a su actividad real in vivo, pero que, no obstante, son sustitutos apropiados de la funcionalidad de la protema, y el comportamiento de tipo silvestre en dichos ensayos muestra evidencias que apoyan las tecnicas de rescate o de mejora del plegamiento de protemas de la invencion. Una de dichas actividades segun la invencion es el transporte apropiado de un MC4R funcional desde el retmulo endoplasmatico a la membrana celular.

Las locuciones "expresion endogena" y "expresados de forma endogena" se refieren a la expresion fisiologica normal de MC4R en celulas en un individuo que no padezca ni se sospeche que padece una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de MC4R, la sobreexpresion de un mutante negativo dominante u otro defecto, por ejemplo, obesidad, tal como una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos o de polipeptidos de MC4R que altera, por ejemplo, inhibe su expresion, actividad, o estabilidad. Estas locuciones tambien se refieren a la expresion de MC4R en celulas o tipos de celulas en los que normalmente se expresa en individuos sanos, y no incluye la expresion de MC4R en celulas o tipos de celulas, por ejemplo, celulas tumorales, en las que MC4R no se expresa en individuos sanos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "eficacia de transporte" se refiere a la capacidad de una protema mutante para ser transportada fuera del retmulo endoplasmatico a su ubicacion nativa dentro de la celula, la membrana celular o al entorno extracelular.

Las expresiones "dosis terapeuticamente efectiva" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para mejorar el procesamiento de protemas en el RE (permitiendo una conformacion funcional), sin inhibir la protema ya expresada en la ubicacion celular apropiada (en el caso de un antagonista), o sin inducir la internalizacion del receptor mediada por ligando de la protema desde la ubicacion celular apropiada (en el caso de un agonista), y aumentar la actividad de la protema diana, dando como resultado, de esta forma, una respuesta terapeutica en un sujeto. Una respuesta terapeutica puede ser cualquier respuesta que un facultativo (por ejemplo, un medico) reconocera como una respuesta eficaz al tratamiento, incluidos los smtomas anteriores y los marcadores clmicos sustitutos. Por lo tanto, una respuesta terapeutica generalmente sera la mejora o la inhibicion de uno o mas smtomas de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, obesidad o apetito desenfrenado.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y no producen tfpicamente reacciones adversas cuando se administran a un ser humano. Preferentemente, tal como se usa en el presente documento, la expresion "farmaceuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "vehmulo" se refiere a un diluyente, un coadyuvante, un excipiente o una compuesto transportador con el que se administra el compuesto. Dichos vehmulos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites. El agua o las soluciones salinas acuosas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferentemente como vehmulos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehmulos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin, edicion 18, u otras ediciones.

La expresion "alrededor de" y el termino "aproximadamente" generalmente significaran un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o la precision de las mediciones. Los grados de error tfpicos ejemplares se encuentran dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y de forma mas preferida dentro del 5% de un valor o intervalo de valores dado. Alternativamente, y particularmente en sistemas biologicos, los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que se encuentran dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y de forma mas preferida dentro de 2 veces a partir de un valor dado. Las cantidades numericas indicadas en el presente documento son aproximadas a menos que se indique lo contrario, lo que significa que la expresion "alrededor de" o el termino "aproximadamente" se puede inferir cuando no se indica expresamente.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "aislado" significa que el material de referencia se ha retirado del entorno en el que normalmente se encuentra. Por lo tanto, un material biologico aislado puede estar exento de componentes celulares, es decir, componentes de las celulas en las que se encuentra o se produce el material. En el caso de moleculas de acido nucleico, un acido nucleico aislado incluye un producto de PCR, una banda de ARNm en un gel, un ADNc o un fragmento de restriccion. En otro caso, un acido nucleico aislado se ha escindido preferentemente del cromosoma en el que puede encontrarse, y de forma mas preferida ya no esta unido a regiones no reguladoras no codificantes, o a otros genes, ubicados cadena arriba o cadena abajo del gen contenido por la molecula de acido nucleico aislada cuando se encuentra en el cromosoma. En otro caso mas, el acido nucleico aislado carece de uno o mas intrones. Los acidos nucleicos aislados incluyen secuencias insertadas en plasmidos, cosmidos, cromosomas artificiales y similares. Asf, en un caso espedfico, un acido nucleico recombinante es un acido nucleico aislado. Una protema aislada puede asociarse con otras protemas o acidos nucleicos, o ambos, con los que se asocia en la celula, o con membranas celulares si es una protema asociada a la membrana. Un organulo, celula o tejido aislado esta extrafdo del sitio anatomico en el que se encuentra en un organismo. Un material aislado puede estar, pero no necesita estar, purificado.

El termino "purificado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material, tal como un acido nucleico o polipeptido MC4R, que se ha aislado en condiciones que reducen o eliminan materiales no relacionados, es decir, contaminantes. Por ejemplo, una protema purificada carece preferentemente sustancialmente de otras protemas o acidos nucleicos con los que esta asociada en una celula. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "carece sustancialmente" se usa operativamente, en el contexto de ensayos analfticos del material. Preferentemente, el material purificado que carece sustancialmente de contaminantes es al menos el 50% puro; de forma mas preferida, al menos el 90% puro, y de forma aun mas preferida al menos el 99% puro. La pureza puede evaluarse utilizando medios convencionales, por ejemplo, cromatograffa, electroforesis en gel, inmunoensayo, analisis de composicion, ensayo biologico y otros procedimientos conocidos en la tecnica.

El termino "Me" significa metilo, "Et" significa etilo y "Ac" significa acetilo.

El termino "halo", a menos que se indique lo contrario, significa fluor, cloro, bromo o yodo. Los grupos halo preferidos son fluor, cloro y bromo.

El termino "alquilo", a menos que se indique lo contrario, incluye radicales hidrocarburo monovalentes saturados que tienen restos lineales, ramificados o dclicos (incluyendo restos bidclicos y espirodclicos fusionados y unidos con puentes), o una combinacion de los restos anteriores. Para que un grupo alquilo tenga restos dclicos, el grupo debe tener al menos tres atomos de carbono.

El termino "cicloalquilo", a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo dclicos en los que el alquilo es tal como se ha definido anteriormente. El uso del termino "cicloalquilo" no debe interpretarse como una limitacion del termino "alquilo" con respecto a restos no dclicos.

El termino "alquenilo", a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo que tienen al menos un enlace doble carbono-carbono en los que el alquilo es tal como se ha definido anteriormente e incluye los isomeros E y Z de dicho resto alquenilo.

El termino "alquinilo", a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo que tienen al menos un enlace triple carbono-carbono en los que alquilo es tal como se ha definido anteriormente.

El termino "alcoxi", a menos que se indique lo contrario, incluye grupos O-alquilo en los que el alquilo es tal como se ha definido anteriormente.

El termino "arilo", a menos que se indique lo contrario, incluye un radical organico derivado de un hidrocarburo aromatico mediante la eliminacion de un hidrogeno, tal como fenilo o naftilo.

La expresion "heterodclico de 4 a 10 miembros", a menos que se indique lo contrario, incluye grupos heterodclicos aromaticos y no aromaticos que contienen de uno a cuatro heteroatomos, cada uno seleccionado de entre O, S y N, en los que cada grupo heterodclico tiene de 4 a 10 atomos en su sistema de anillo, y con la condicion de que el anillo de dicho grupo no contenga dos atomos O o S adyacentes. Los grupos heterodclicos no aromaticos incluyen grupos que tienen solo 4 atomos en su sistema de anillo, pero los grupos heterodclicos aromaticos deben tener al menos 5 atomos en su sistema de anillo. Los grupos heterodclicos incluyen sistemas de anillos benzo-fusionados. Un ejemplo de un grupo heterodclico de 4 miembros es azetidinilo (derivado de azetidina). Un ejemplo de un grupo heterodclico de 5 miembros es tiazolilo y un ejemplo de un grupo heterodclico de 10 miembros es quinolinilo. Ejemplos de grupos heterodclicos no aromaticos son pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanilo, azabiciclo[2.2.2]hexanilo, 3H-indolilo y quinolizinilo. Ejemplos de grupos heterodclicos aromaticos son piridinilo, imidazolilo, pirimidinilo, pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo y furopiridinilo. Los restos espiro tambien se incluyen dentro del ambito de esta definicion, incluido 1-oxa-6-aza-espiro[2.5]oct-6-ilo. Los grupos precedentes, derivados de los grupos enumerados anteriormente, pueden estar unidos a C o a N si es posible. Por ejemplo, un grupo derivado de pirrol puede ser pirrol-1-ilo (unido a N) o pirrol-3-ilo (unido a C). Ademas, un grupo derivado de imidazol puede ser imidazol-1-ilo (unido a N) o imidazol-3-ilo (unido a C).

La expresion "sal o sales farmaceuticamente aceptables", a menos que se indique lo contrario, incluye sales de grupos acidos o basicos que pueden estar presentes en un compuesto de la invencion. Los compuestos que son de naturaleza basica son capaces de formar una amplia variedad de sales con diversos acidos inorganicos y organicos. Los acidos que pueden usarse para preparar sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos basicos son aquellos que forman sales de adicion de acido no toxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacologicamente aceptables, tales como sales de acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, calcio-edetato, camsilato, carbonato, cloruro, clavulanato, citrato, diclorhidrato, edetato, disilato, estolato, esilato, etilsuccinato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, oleato, oxalato, pamoate (embonato), palmitato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, tannato, tartrato, teoclato, tosilato, trietiododo y valerato. Dado que un unico compuesto puede incluir mas de un resto acido o basico, dicho compuesto puede incluir mono, di o tri-sales en un unico compuesto.

Receptor de melanocortina 4

Los receptores de melanocortina (MC) son miembros de la superfamilia del receptor acoplado a la protema G de siete dominios transmembrana que activan la generacion del AMP dclico (AMPc) del segundo mensajero. Existen cinco receptores MC aislados hasta la fecha: MC1R, MC2R, MC3R, MC4R y MC5R. El MC2R es el receptor de la hormona adrenocorticotropica (ACTH). El MC4R humano tiene 332 aminoacidos de longitud.

El receptor de melanocortina 4 (MC4R) se ha implicado en la regulacion del peso corporal (Graham et al., Nat. Genetics 1997; 17: 273-4). El MC4R se expresa en el cerebro, incluido el hipotalamo, que influye en la ingesta de alimentos. La senalizacion a traves de MC4R estimula las rutas neuronales anorexigenicas. Los ratones nulos en MC4R desarrollan obesidad de aparicion tardfa con hiperglucemia e hiperinsulinemia. Los ratones que carecen de un alelo de MC4R (heterocigotos) tienen un peso corporal intermedio entre ratones nulos homocigotos y de tipo silvestre. En los seres humanos, la deficiencia de MC4R es la forma monogenica mas comun de obesidad (Farooqi et al., New Engl. J. Med. 2003; 348: 1085-95). Los ratones transgenicos que sobreexpresan un antagonista endogeno de MC4R, una protema relacionada con agouti (AgRP), mostraron un aumento de peso, un consumo de alimentos y una longitud corporal incrementados en comparacion con companeros de camada no transgenicos (Ollman et al., Science 1997; 278: 135-37).

Se han identificado numerosas mutaciones, que se encuentran principalmente en individuos obesos, en el gen MC4R humano, incluidas mutaciones de cambio de marco, sin sentido y en sentido incorrecto (Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-45). Al menos dos grupos de investigadores han confirmado que el MC4R esta mutado en aproximadamente el 5% de los individuos obesos. Los portadores de mutaciones de MC4R mostraron hiperfagia e hiperinsulinemia, teman una densidad mineral osea superior a la media y un crecimiento lineal mas rapido que los sujetos control emparejados por el IMC. Farooqi et al. tambien han observado que las propiedades de senalizacion de los receptores MC4R mutantes se correlacionan con la gravedad de la obesidad.

Varios autores han revisado actualmente los avances recientes en nuestra comprension de la genetica del MC4R en la obesidad de aparicion temprana (vease, por ejemplo, Farooqi IS, O'Rahilly S, Int J Obes (Lond), oct. 2005, 29 (10), 1149-52; Govaerts C, Srinivasan S, Shapiro A, Zhang S, Picard F, Clement K, Lubrano-Berthelier C, Vaisse C, Peptides, oct. 2005, 26 (10), 1909-19; Tao YX, Mol Cell Endocrinol, 15 de jul., 2005, 239 (1-2), 1-14; Farooqi IS, O'Rahilly S, Annu Rev Med, 2005, 56, 443-58). Por ejemplo, en un paciente con obesidad grave de aparicion temprana, se ha encontrado que un modo de herencia autosomico dominante de una mutacion MC4R se debe a un efecto negativo dominante causado por la dimerizacion del receptor (Biebermann H, Krude H, Elsner A, Chubanov V, Gudermann T, Gruters A, Diabetes, dic. 2003, 52 (12), 2984-8).

Se espera una perdida de funcion para MC4R con algunas mutaciones, dado que la mayor parte de las mutaciones identificadas hasta la fecha son sustituciones de aminoacidos no conservativas. Esto se ha demostrado para varios MC4R encontrados en individuos obesos. Ademas, varias mutaciones se han asociado con una expresion reducida de MC4R en la superficie celular (Gu et al., Diabetes 1999, 48: 635-39.; Nijenhuis et al., anteriormente). Por ejemplo, en un cribado de once mutaciones de sentido incorrecto de MC4R que solo se encontraron en individuos obesos, y que se ubicaron fuera de la region N-terminal de MC4R (que no esta involucrada en la union del ligando), diez mostraron una union espedfica mas baja en la superficie celular al ligando de la hormona estimulante de melanocitos a (a-MSH) 125I-[Nle4,D-Phe7]a-MSH, en comparacion con el MC4R de tipo silvestre. Nijenhuis et al., anteriormente, en 22941. Se determino que la disminucion de la union espedfica reflejaba una expresion en la superficie celular mas reducida, dado que la afinidad por el ligando entre los mutantes fue muy similar al receptor de tipo silvestre, como se muestra en la tabla 1 a continuacion (valores de CI50 en nM /- S.E.):

Tabla 1:

Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-22945, en 22942.

Incluso dos mutantes con mayor afinidad de union (L250Q y T112M) mostraron una menor expresion en la superficie celular segun los experimentos de union de saturacion. Ademas, todos los mutantes mostraron una respuesta maxima reducida (activacion del receptor medida con un ensayo de adenilil ciclasa) tras la union a a-MSH. En particular, Nijenhuis et al. concluyeron a partir de los resultados de los datos inmunocitoqmmicos que los mutantes P78L, R165Q y R165W se expresan, pero se retienen intracelularmente.

Un estudio adicional identifico las siguientes mutaciones de MC4R: I125K; C271Y; T11A (A434G); A175T; I316L; N97D; N62S; y C271R (Farooqi et al., New Eng. J. Med. 2003; 348; 1085-95). De estas mutaciones, todas mostraron una actividad reducida, o ninguna actividad, in vitro evaluada utilizando un ensayo de gen reportero de luciferasa que responde al AMPc. Sin embargo, este grupo encontro que tres variantes V103I; I251L; y T112M no tienen ningun efecto sobre la senalizacion de MC4R. Mutaciones asociadas a la infancia, es decir, la obesidad de aparicion temprana fueron S58C, N62S, Y157S, C271Y, P78L, G98R que dieron como resultado una disminucion en la union al ligando (S58C, N62S, Y157S, C271Y) o ninguna union al ligando (P78L, G98R), tambien mostraron deficiencias proporcionales en la produccion de cAMP estimulada por [Nle,D-Phe7]a-MSH (Tao et al., Endocrinology 2003; 144 (10): 4544-51).

Un estudio final identifico los siguientes mutantes en MC4R; I251L (A1144C); F51L (T544C); M200V (A991G); T5T (C408T) (Branson et al., New Eng. J. Med. 2003; 348: 1096-1103).

Ademas de en la obesidad, el MC4R se ha implicado en el apetito desenfrenado. Segun el Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Text Revision (DSM-IV-TR™, cuarta edicion), el apetito desenfrenado implica episodios recurrentes de ingerir una cantidad anormalmente grande de alimentos y experimentar sentimientos de falta de control sobre el comportamiento. En un estudio de 469 sujetos obesos blancos, se encontro que aunque solo se diagnostico apetito desenfrenado a un pequeno porcentaje de sujetos obesos, a todos los sujetos obesos con mutaciones de MC4R se les diagnostico apetito desenfrenado (Branson et al., anteriormente).

Estructura y union a ligandos de MC4R

Los agonistas endogenos de la melanocortina contienen la secuencia His-Phe-Arg-Trp, que es importante para el reconocimiento molecular y la estimulacion del receptor de melanocortina. Los determinantes moleculares de la union al ligando de MC4R se determinaron en un estudio empleando una amplia serie de ligandos (Nickolls et al., Pharmacol Exp Ther 2003; 304 (3): 1217-27). El modelado molecular del receptor se utilizo para identificar Phe284, en el dominio transmembrana (TM) 7 (TM7), como un sitio potencial de interaccion del ligando. La mutacion de Phe284 a alanina redujo la afinidad de union y la potencia de los peptidos que contienen L-Phe hasta 71 veces, pero no afecto a la union de los peptidos lineales que contienen D-Phe. Estos datos fueron coherentes con una interaccion hidrofoba entre el Phe7 de a-MSH y Phe284. En segundo lugar, se examino el efecto de una mutacion natural en TM3 (I137T), que, tal como se ha descrito anteriormente, esta relacionada con la obesidad. Esta mutacion redujo la afinidad y la potencia de peptidos ngidos dclicos, pero no de peptidos mas flexibles, lo que es coherente con un efecto indirecto de la mutacion sobre la estructura terciaria del receptor. Tambien se determinaron los residuos que fomentan la selectividad de ligando para el MC4R con respecto al MC3R. La mutacion de Ile125 (TM3) del MC4R al residuo equivalente del MC3R (fenilalanina) redujo selectivamente la afinidad y la potencia de los ligandos selectivos del MC4R. Este efecto se reflejo mediante la mutacion redproca de MC3R F157I. La magnitud de este efecto indica que este locus no es de mayor importancia. Sin embargo, se propuso que una mutacion de isoleucina/fenilalanina podna afectar a la orientacion de Asp122, que se ha identificado como un determinante principal de la afinidad de union al ligando.

Otros han determinado que se requirio Tyr268 para la interaccion selectiva con la protema Agouti antagonista de MC4R endogena, asf como para la selectividad de otro agonista de MC4R (Oosterom et al., J. Biol. Chem. 2001; 276 (2): 931-6). La protema Agouti se expresa normalmente en la piel y es un antagonista natural del MC4R (Kiefer et al., Biochemistry 1997; 36: 2084-2090).

Agonistas y antagonistas de MC4R

Los agonistas y antagonistas de MC4R incluyen los compuestos representados en las figuras 1-8 y 10 del presente documento, y se describen adicionalmente en los ejemplos 3 y 4 a continuacion.

Los agonistas (ligandos) naturales de MC4R incluyen a-MSH, ACTH, p-MSH y y-MSH (en orden de mayor a menor afinidad). Otros ligandos de MC4R, incluidos agonistas y antagonistas, que se han descrito hasta la fecha son predominantemente peptidos (patente de Estados Unidos N° 6.060.589) y analogos de peptidos dclicos (patente de Estados Unidos N° 6.613.874 de Mazur et al.). Tambien se han disenado una serie de agonistas de peptidos MC4R (Sun et al., Bioorg Med Chem 2004; 12 (10): 2671-7). Ademas, Nijenhuis et al. (Peptides 2003; 24 (2): 271-80) han descrito el desarrollo y la evaluacion de compuestos antagonistas de melanocortina que eran selectivos para el MC4R. Se encontro que un compuesto, denominado Ac-Nle-Gly-Lys-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH(2) (SEQ ID NO: 9), es el compuesto MC4R mas selectivo, con una selectividad 90 y 110 veces superior para el MC4R en comparacion con el MC3R y el MC5R, respectivamente. Unaa modificacion subsiguiente proporciono el compuesto Ac-Nle-Gly-Lys-D-Nal (2)-Arg-Trp-Gly-NH(2) (SEQ ID NO: 10), un antagonista selectivo de MC4R con una salectividad MC4R/MC3R 34 veces superior y una selectividad MC4R/MC5R 119 veces superior. Ambos compuestos fueron activos in vivo, y cruzaron la barrera hematoencefalica. Ademas, las patentes de Estados Unidos N° 6.054.556 y 5.731.408 describen familias de agonistas y antagonistas para MC4R que son heptapeptidos de lactama que tienen una estructura dclica.

Otros antagonistas de MC4R de alta afinidad se describen por Grieco et al. (J Med Chem 2002; 24: 5287-94). Estos antagonistas dclicos se disenaron basandose en el conocido antagonista de alta afinidad SHU9119 (Ac-Nle4-[Asp5-His6-DNaI(2')7-Arg8-Trp9-Lys10]-NH(2)) (SEQ ID NO: 11). Los analogos de SHU9119 se modificaron en la posicion 6 (His) con aminoacidos no convencionales. Un compuesto que contiene una sustitucion de Che en la posicion 6 es un antagonista de MC4R de alta afinidad (CI50 = 0,48 nM) con una selectividad 100 veces superior con respecto a MC3R. Otro compuesto con una sustitucion de Cpe en la posicion 6 era tambien un antagonista de MC4R de alta afinidad (CI50 = 0,51 nM) con una selectividad 200 veces superior con respecto a MC3R. Se uso un modelado molecular para examinar las propiedades conformacionales de los peptidos dclicos modificados en la posicion 6 con aminoacidos conformacionalmente restringidos. Vease tambien Grieco et al., Peptides 2006; 27 (2): 472-81.

En las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas 2003/0158209 de Dyck et al. y 2004/082590 de Briner et al. se han divulgado varios ligandos no peptfdicos de MC4R. Ademas, la patente de Estados Unidos N° 6.638.927 de Renhowe et al. describe guanidobenzamidas pequenas de bajo peso molecular como agonistas espedficos de MC4R. Richardson et al. han descrito nuevas arilpiperizinas que son agonistas de MC4R (J Med Chem 2004; 47 (3): 744-55). Las patentes de Estados Unidos N° 6.979.691 de Yu et al. y 6.699.873 de Maguire tambien describen compuestos no peptfdicos que se unen selectivamente a MC4R.

El documento WO 99/55679 de Basu et al. divulga derivados de isoquinolina, compuestos no peptfdicos de molecula pequena, que muestran bajas afinidades (micromolares) para el MC1R y el MC4R, reduccion de la inflamacion dermica inducida por acidos araquidonicos y reduccion del peso corporal y la ingesta de alimentos.

El documento WO 99/64002 de Nargund et al. tambien divulga derivados de espiropiperidina como agonistas del receptor de melanocortina, utiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos tales como la obesidad, la diabetes y la disfuncion sexual.

Se han descrito otros antagonistas de MC4R no peptfdicos. Asf, las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas 2003/0176425 y 2003/0162819 de Eisinger divulgan derivados de 1,2,4-tiadiazol y 1,2,4-tiadiazolio novedosos, respectivamente, como antagonistas o agonistas de MC4R. Estas solicitudes tambien divulgan la utilizacion de estos compuestos para tratar la obesidad.

Varios antagonistas de los receptores de melanocortina han demostrado ser antagonistas competitivos, es dedr, que compiten por la union con un ligando. Por ejemplo, la protema de senalizacion agouti antagonista de la melanocortina (ASIP) demostro tener caractensticas coherentes con el antagonismo competitivo observado en el hMC1R, y un comportamiento mas complejo observado en los otros receptores (Yang et al., Mol. Endocrinology 1997; 11 (3): 274-280). De forma similar, ACTH, el ligando natural para MC2R, no puede ser superado por la union de a, p o y-MSH (Abdel-Malek et al., Cell. Mol. Life Sci. 2001; 48: 434-41.

Otros compuestos de union a MC4R se describen a continuacion: Bednarek y Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005;15(18):4023-8; documento WO 03/07949 (Merck); documento WO 03/61660 (Eli Lilly); documento WO 03/09847 (Amgen); documento WO 03/09850 (Amgen); documento WO 03/31410 (Neurocrine Biosciences); documento WO 03/94918 (Neurocrine Biosciences); documento WO 03/68738 (Neurocrine Biosciences); documento WO 03/92690 (Procter and Gamble); documento W^o 03/93234 (Procter and Gamble); documento WO 03/72056 (Chiron); documento WO 03/66597 (Chiron); documento WO 03/66587 (Chiron); documento WO 03/66587 (Chiron); documento WO 02/67869 (Merck); documento WO 02/68387 (Merck); documento WO 02/00259 (Taisho); documento WO 02/92566 (Taisho); Tran et al., Bioorg Med Chem Lett.

2006 [publicacion electronica antes de la publicacion impresa]; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett.

2005;15(23):5237-40; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005;15(10):2541-6; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004;14(22):5605-9; Cheung et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15(24):5504-8; Yan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004; 15(20): 4611-4; Hsiung et al., Endocrinology. Diciembre de 2005;146(12):5257-66; y Todorovic et al., Peptides. Octubre de 2005;26(10):2026-36.

Los agonistas o antagonistas no peptfdicos de MC4R espedficos contemplados para su uso en los procedimientos reivindicados en el presente documento se describen por Sebhat et al., J Med Chem 2002; 45: 4589 (compuestos 1 y 6); Richardson et al., J Med Chem. 2004; 47: 744 (compuesto 2); Arasasingham et al., J Med Chem. 2003; 46: 9 (compuesto 3); documento WO 02/062766 de Millennium Pharmaceuticals (compuesto 4); Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (compuesto 5); Tran et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 3434-38 (compuesto 7); Xi et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004; 14: 377-81 (compuesto 8); Vos et al., J Med Chem. 2004; 47: 1602-04 (compuesto 9); Pan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 11: 185 (compuesto 10); Marsilje et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004. 14: 3721 (compuesto 11); Ujjainwalla et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 133: 4431 (compuesto 12); Nickolls et al., J Pharmacol Exp Therap. 2005; 313: 1281-1288 (compuestos 13-17); Schioth et al., Biophys Biochem Res Comm.

2003; 399-405 (compuesto 18); Benoit et al., J. Neurosci. 2000; 20: 3442-48 (compuestos 19 y 20); Vos et al., Bioorg Med Chem Lett. 2006; 15: 2302 (compuesto 21); Tucci et al., Bioorg Med Chem Lett 2005; 15: 4389 (compuesto 22); Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 4615-18 (compuesto 23); Chaki et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 304: 818 (compuesto 24); Chaki et al., Pharmacol Biochem Behav. 2005; 82: 621 (compuesto 25).

Los compuestos 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 13-17 y 19 descritos anteriormente son agonistas de MC4R, mientras que los compuestos 3, 4, 7, 9, 11, 18 y 20 son antagonistas.

Los antagonistas peptfdicos de MC4R espedficos contemplados para su uso en los procedimientos reivindicados en el presente documento son Ac-Cys-Glu-His-D-(2')Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2) (SEQ ID NO: 12); Ac-Cys-Nle-Arg-His-D-(2')Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-NH(2) (SEQ ID NO: 13); Ac-Cys-Glu-His-D-Phe (3,4-di-Cl)-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2) (SEQ ID NO: 14), Ac-Nle-c[Asp-Che-DNaI(2')-Arg-Trp-Lys-NH(2) (SEQ ID NO: 15); Ac-Nle-c[Asp-Cpe-DNaI(2')-Arg-Trp-Lys-NH(2) (SEQ ID NO: 16); cyclo(1-6)-suc-His-DPhe-Arg-Trp-Lys-NH(2) (SEQ ID NO: 17); y Ac-DArg[Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys]-NH(2) (SEQ ID NO: 18).

Se contemplan agonistas y antagonistas basados en peptidos con cadenas laterales no naturales y peptidomimeticos. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.650.489; vease tambien la patente de Estados Unidos N° 6.090.912, especialmente en la seccion 5.5. Por ejemplo, las cadenas laterales de los compuestos 18-20 y las cadenas laterales en la clase de compuestos representada en la figura 16 pueden no ser naturales.

Se ha demostrado que el MC4R experimenta una internalizacion del receptor mediada por ligando (Gao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307 (3): 870-7). La exposicion previa de celulas GT1-7 que expresan MC4R endogeno al agonista de la hormona estimulante de melanocitos a (a-MSH), dio como resultado una formacion de AMPc alterada para una segunda provocacion con a-MSH (Shinyama et al., Endocrinology 2003; 144 (4): 1301-14). Esto no se observo con la administracion de un antagonista. La internalizacion inducida por ligando se desencadena en receptores acoplados a protema G por fosforilacion de residuos de serina o treonina entre el segmento C-terminal y el tercer bucle intracelular. La fosforilacion promueve la union de beta-arrestinas, que se dirigen a los receptores para la internalizacion y degradacion de lisosomas. Datos recientes demuestran que la cola citosolica de una protema similar a la atractina (ALP) se une al dominio C-terminal de MC4R (Yeo et al., Biochem. J. 2003; 376). Por lo tanto, una chaperona que aumenta la estabilidad de MC4R en la superficie celular sera especialmente beneficiosa dada la corta semivida del receptor en la superficie.

Se espera, ademas, que la chaperona que es un agonista que se unira reversiblemente a un polipeptido MC4R en el RE no inducira la internalizacion del receptor. De forma similar, cuando el compuesto chaperona es un antagonista, se espera que no inhiba la actividad del receptor una vez que el receptor se encuentre en la superficie celular.

Procedimientos de tratamiento

Se divulga un procedimiento para tratar una afeccion asociada con la estabilidad reducida de MC4R, tal como la obesidad, o que tiene factores de riesgo para desarrollar obesidad, mediante la administracion a un sujeto que necesita dicho tratamiento de una chaperona para mejorar la estabilidad y/o la actividad de MC4R. El individuo que se va a tratar puede ser un individuo que no muestre una mutacion en MC4R que afecte al plegamiento y al procesamiento de MC4R, pero que se beneficiana de una mayor estabilidad de MC4R en, por ejemplo, las neuronas. El individuo que se va a tratar tambien puede tener una mutacion en MC4R que afecta al plegamiento y al procesamiento de la protema MC4R, y muestra una estabilidad reducida de MC4R en neuronas.

Formulacion, dosificacion y administracion

Una chaperona farmacologica espedfica para MC4R, es decir, un agonista o antagonista de MC4R u otro compuesto de union a MC4R tal como se ha descrito anteriormente, o tal como se identifica a traves de los procedimientos de cribado tal como se exponen a continuacion, se formula ventajosamente en una composicion farmaceutica junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La chaperona puede designarse como un ingrediente activo o agente terapeutico para el tratamiento de obesidad u otro trastorno que implique una expresion reducida en la superficie celular de MC4R o el transporte a la superficie celular.

La concentracion del ingrediente activo (chaperona farmacologica) depende de la dosis deseada y del regimen de administracion, tal como se explica a continuacion. Los intervalos de dosificacion ejemplares del ingrediente activo son de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal por dfa; de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dfa; o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 75 mg/kg por dfa.

Los compuestos terapeuticamente eficaces pueden proporcionarse a un sujeto en formulaciones estandar, y pueden incluir cualquier aditivo farmaceuticamente aceptable, tal como excipientes, lubricantes, diluyentes, aromatizantes, colorantes, tampones y disgregantes. Las formulaciones estandar son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edicion, Mack Publishing Company, 2000. La formulacion puede producirse en unidades de dosificacion utiles para la administracion por cualquier via que permita que la chaperona terapeutica atraviese la barrera hematoencefalica. Las vfas ejemplares incluyen las vfas oral, parenteral, transmucosa, intranasal, inhalatoria o transdermica. Las vfas parenterales incluyen la administracion intravenosa, intraarteriolar, intramuscular, intradermica, subcutanea, intraperitoneal, intraventricular, intratecal e intracraneal. En una forma de realizacion, una chaperona farmacologica de MC4R, particularmente el compuesto 23 representado en la figura 10D del presente documento, se formula en una forma de dosificacion oral solida. Para la administracion oral, por ejemplo, para una molecula pequena, la composicion farmaceutica puede adquirir la forma de un comprimido o una capsula preparados por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); materiales de carga (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o almidon-glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas para administracion oral pueden adquirir la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitucion con agua u otro vehmulo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones ifquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables, tales como agentes de suspension (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehmulos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos, alcohol etflico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener sales tampon, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes, segun corresponda.

En otra forma de realizacion, se formula una chaperona de MC4R para administracion parenteral. La chaperona puede formularse para administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion en embolada o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden adquirir formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehmulos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvo para su constitucion con un vehmulo adecuado, por ejemplo, agua esteril exenta de pirogenos, antes de su uso.

Ademas de las formulaciones descritas anteriormente, la chaperona tambien puede formularse como una preparacion de accion prolongada. Dichas formulaciones de accion prolongada pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, por via subcutanea o intramuscular) o por inyeccion intramuscular. Asf, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

En otra forma de realizacion, la chaperona puede administrarse en una vesmula, particularmente un liposoma.

En otra forma de realizacion, la chaperona puede administrarse en una forma de liberacion controlada. Por ejemplo, un agente terapeutico se puede administrar mediante infusion intravenosa con una bomba que opera en continuo, en una matriz polimerica tal como poli(acido lactico/glutamico) (PLGA), en un granulo que contiene una mezcla de colesterol y el ingrediente activo (SilasticR™; Dow Corning, Midland, MI; vease la patente de Estados Unidos N° 5.554.601), por implante subcutaneo, o mediante un parche transdermico.

Politerapia. La composicion farmaceutica tambien puede incluir otras sustancias biologicamente activas en combinacion con el compuesto candidato. Los ejemplos incluyen, entre otros, sibutramina, orlistat (Xenical®), leptina, neuropeptido Y, colecistoquinina o GLP-1.

Ensayos de cribado de chaperonas farmacologicas MC4R

La presente memoria descriptiva divulga ademas un procedimiento para identificar un compuesto chaperona candidato que modula la estabilidad, la actividad y/o la localizacion en la superficie celular de un polipeptido MC4R. En un ejemplo, la presente memoria descriptiva divulga un procedimiento para identificar una chaperona para la protema MC4R, que comprende poner un compuesto de ensayo marcado o no marcado en contacto con la protema MC4R o un fragmento de la misma y medir la cantidad del compuesto de ensayo unido a la protema MC4R o al fragmento de la misma. Esto se puede lograr, por ejemplo, de la forma siguiente:

(a) poniendo en contacto una primera celula con un compuesto de ensayo durante un penodo de tiempo suficiente para permitir que la celula responda a dicho contacto con el compuesto de ensayo;

(b) determinando la estabilidad conformacional, la actividad y/o la localizacion en la superficie celular de un polipeptido MC4R (o un fragmento del mismo que comprende un dominio de union a ligando) en la celula (o en la superficie celular) con la que se ha puesto en contacto en la etapa (a); y

(c) comparando la estabilidad, la actividad y/o la localizacion en la superficie celular del polipeptido MC4R determinada en la etapa (b) con la de un polipeptido MC4R en una celula de control que no se ha puesto en contacto con el compuesto de ensayo;

en el que un cambio detectable en la estabilidad, la actividad y/o la localizacion en la superficie celular del polipeptido MC4R en la primera celula en respuesta a la puesta en contacto con el compuesto de ensayo en comparacion con el nivel de estabilidad del polipeptido MC4R en la celula de control que no se ha puesto en contacto con el compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo modula la estabilidad del polipeptido MC4R y es un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno asociado con la estabilidad o la actividad reducida de MC4R.

La celula puede ser o bien una celula huesped transformada con un MC4R de tipo silvestre o mutante no endogeno, o bien una celula que expresa MC4R de forma endogena, incluidos MC4R mutantes y de tipo silvestre. Dichas celulas incluyen las "neuronas de la obesidad", tales como las celulas GT1-7, descritas anteriormente, las descritas por MacKenzie et al., Current Medicinal Chemistry - Immunology, Endocrine & Metabolic Agents 2004; 4: 113-117, que expresan de forma endogena MC4R, o celulas transformadas que expresan MC4R normal o mutado, marcado, tales como las celulas HEK293 descritas por Blondet et al., J Biochem 2004; 135: 541-546 y mas adelante en los ejemplos.

En otro ejemplo, la presente memoria descriptiva divulga un procedimiento para identificar una chaperona para la protema MC4R que comprende poner un compuesto de ensayo marcado en contacto con celulas o una fraccion de membrana celular que contiene la protema MC4R, y medir la cantidad del compuesto de ensayo marcado unido a las celulas o a la fraccion de membrana celular.

Se pueden emplear numerosos procedimientos de cribado de alto rendimiento (HTS) para cribar grandes cifras (por ejemplo, cientos, miles, decenas de miles) de compuestos de ensayo simultaneamente por su union a un MC4R. Un compuesto de ensayo puede ser, sin limitacion, una pequena molecula organica o inorganica (preferida), un peptido o un polipeptido (incluido un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra molecula inmunoespedfica), una molecula de oligonucleotido (tal como un aptamero), una molecula de polinucleotido, o una quimera o derivado de la misma. Los compuestos de ensayo que son chaperonas candidatas que se unen espedficamente a un polipeptido MC4R pueden identificarse usando ensayos basados en celulas y/o que no utilizan celulas. Diversos procedimientos de ensayos automatizados que se han desarrollado en los ultimos anos permiten el cribado de decenas de miles de compuestos en un corto penodo de tiempo (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.585.277, 5.679.582 y 6.020.141). Por ejemplo, un grupo informo de la identificacion de un agonista de MC4R de arilpiperazina por medio de un cribado dirigido iterativo de bibliotecas sesgadas de receptores acoplados a protemas no peptidflicos (Richardson et al., J Med Chem 2004; 47 (3): 744-55). Dichos procedimientos HTS son particularmente utiles, por ejemplo, en micromatrices.

Para el cribado, las clases purificadas de compuestos que pueden identificarse incluyen, pero sin limitacion, moleculas pequenas (es decir, moleculas organicas o inorganicas que tienen menos de aproximadamente 2 kilodaltons (kD) de peso molecular y, de forma mas preferida, menos de aproximadamente 1 kD de peso molecular). Estos son componentes de bibliotecas de compuestos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "compuesto lfder" se refiere a una entidad molecular seleccionada a partir de un cribado primario de antagonistas o agonistas de MC4R que puede ser eficaz por sf mismo para estabilizar la conformacion proteica de la protema MC4R de tipo silvestre o mutante, o que puede modificarse mediante un desarrollo adicional para generar un compuesto farmaceutico apropiado.

Bibliotecas de compuestos. Las bibliotecas de ligandos organicos y agonistas peptfdicos pequenos de alta pureza que tienen actividades farmacologicas bien documentadas estan disponibles en Sigma-Aldrich (LOPAC LIBRARY™ y LIGAND-SETS™). Tambien disponible en Sigma-Aldrich se encuentra la Aldrich Library of Rare Chemicals, que es una biblioteca diversa de mas de 100.000 compuestos de moleculas pequenas, incluidos extractos de plantas y extractos de cultivos microbianos. Otras bibliotecas de compuestos estan disponibles en Tripos (LeadQuest®) y TimTech (incluidas bibliotecas espedficas para moduladores de quinasa).

Otras empresas que suministran o han suministrado bibliotecas de compuestos del tipo adecuado para cribado incluyen las siguientes: 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.; Advanced ChemTech; Abinitio PharmaSciences; Albany Molecular; Aramed Inc.; Annovis, Inc. (anteriormente Bearsden Bio, Inc.); ASINEX; AVANT Immunotherapeutics; AXYS Pharmaceuticals; Bachem; Bentley Pharmaceuticals; Bicoll Group; Biofor Inc.; BioProspect Australia Limited; Biosepra Inc.; Cadus Pharmaceutical Corp.; Cambridge Research Biochemicals; Cetek Corporation; Charybdis Technologies, Inc.; ChemBridge Corporation; ChemDiv, Inc.; ChemGenics Pharmaceuticals Inc.; ChemOvation Ltd.; ChemStar, Ltd.; Chrysalon; ComGenex, Inc.; Compugen Inc.; Cytokinetics; Dextra Laboratories Ltd.; Discovery Partners International Inc.; Discovery Technologies Ltd.; Diversa Corporation; Dovetail Technologies, Inc.; Drug Discovery Ltd.; ECM Pharma; Galilaeus Oy; Janssen Pharmaceutica; Jerini Bio Tools; J-Star Research; KOSAN Biosciences, Inc.; KP Pharmaceutical Technology, Inc.; Lexicon Genetics Inc.; Libris Discovery; MicroBotanica, Inc.; MicroChemistry Ltd.; MicroSource Discovery Systems, Inc.; Midwest Bio-tech Inc.; Molecular Design & Discovery; MorphoSys AG; Nanosyn, Inc.; Ontogen Corporation; Organix, Inc.; Pharmacopeia, Inc.; Pherin Pharmaceuticals; Phytera, Inc.; PTRL East, Inc.; REPLICor Inc.; RSP Amino Acid Analogues, Inc.; Sanofi- Synthelab (actualmente Sanofi-Aventis) Pharmaceuticals; Sequitur, Inc.; Signature BioScience Inc.; Spectrum Info Ltd.; Talon Cheminformatics Inc.; Telik, Inc.; Tera Biotechnology Corporation; Tocris Cookson; Torrey Pines Institute for Molecular Studies; Trega Biosciences, Inc. y WorldMolecules/MMD.

Ademas, el Institute of Chemistry and Cell Biology (ICCB), mantenido por la Harvard Medical School, proporciona las siguientes bibliotecas de compuestos qmmicos, incluidas bibliotecas de productos naturales, para cribado: Chem Bridge DiverSet E (16.320 compuestos); Bionet 1 (4.800 compuestos); CEREP (4.800 compuestos); Maybridge 1 (8.800 compuestos); Maybridge 2 (704 compuestos); Peakdale 1 (2.816 compuestos); Peakdale 2 (352 compuestos); ChemDiv Combilab and International (28.864 compuestos); Mixed Commercial Plate 1 (352 compuestos); Mixed Commercial Plate 2 (320 compuestos); Mixed Commercial Plate 3 (251 compuestos); Mixed Commercial Plate 4 (331 compuestos); ChemBridge Microformat (50.000 compuestos); Commercial Diversity Set 1 (5.056 compuestos); Colecciones NCI: Structural Diversity Set. version 2 (1.900 compuestos); Mechanistic Diversity Set (879 compuestos); Open Collection 1 (90.000 compuestos); Open Collection 2 (10.240 compuestos);

Colecciones bioactivas conocidas: NINDS Custom Collection (1.040 compuestos); ICCB Bioactives 1 (489 compuestos); SpecPlus Collection (960 compuestos); ICCB Discretes Collections. Los compuestos ICCB se recogieron individualmente de qmmicos en el ICCB, Harvard, y otras instituciones colaboradoras: ICCB1 (190 compuestos); ICCB2 (352 compuestos); ICCB3 (352 compuestos); ICCB4 (352 compuestos). Extractos de productos naturales: NCI Marine Extracts (352 pocillos); Organic fractions - NCI Plant and Fungal Extracts (1.408 pocillos); Philippines Plant Extracts 1 (200 pocillos); ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis (DOS) Collections; DDS1 (DOS Diversity Set) (9600 pocillos).

Existen numerosas tecnicas disponibles para crear bibliotecas de compuestos mas enfocadas en lugar de bibliotecas grandes y diversas. Chemical Computing Group, Inc. (Montreal) ha desarrollado un programa informatico con un enfoque novedoso para el diseno de farmacos de alto rendimiento. El procedimiento de la empresa utiliza datos experimentales de cribado de alto rendimiento (HTS) para crear un modelo probabilfstico QSAR (relacion de actividad de estructura cuantitativa), que posteriormente se utiliza para seleccionar bloques de construccion en una biblioteca virtual combinatoria. Se basa en la estimacion estadfstica en lugar de en un analisis de regresion estandar. Ademas, ArQule, Inc. (Woburn, MA) tambien posee tecnologfas integradas para realizar una produccion automatizada de alto rendimiento de compuestos qmmicos y para suministrar estos compuestos de estructura conocida y alta pureza en cantidades suficientes para llevar a cabo una optimizacion. Su AMAP™ (planta de ensamblaje molecular automatizada) realiza smtesis qmmicas de alto rendimiento para cada fase del descubrimiento de compuestos.

Compuestos similares a menudo se proporcionan en bases de datos en lmea o en CD-ROM para la eleccion selectiva de compuestos. Vease, por ejemplo, Ablnitio PharmaSciences; ActiMol; Aral Biosynthetics; ASDI Biosciences; Biotechnology Corporation of America; Chembridge; ChemDiv; Florida Center - Heterocyclic Compounds; Microsource /MSDI; NorthStar; Peakdale; Texas Retaining Group; Zelinsky Institute; Advanced ChemTech; Ambinter; AnalytiCon Discovery; Aurora Fine Chemicals; Biofocus; Bionet /Key; Comgenex; Key Organics; LaboTest; Polyphor; SPECS and Biospecs; y Bharavi Laboratories.

Micromatrices

En un caso, el cribado HTS para chaperonas de MC4R emplea micromatrices.

Matrices de protemas. Las matrices de protemas son sistemas de ensayo de union en fase solida que utilizan protemas inmovilizadas en diversas superficies que se seleccionan, por ejemplo, de entre vidrio, membranas, pocillos de microtitulacion, placas de espectrometro de masas y perlas u otras paiimulas. Los ensayos de union que utilizan estas matrices son altamente paralelos y, a menudo, miniaturizados. Sus ventajas son que son rapidos, se pueden automatizar, son capaces de lograr una alta sensibilidad, son economicos en su uso de reactivos y proporcionan una gran cantidad de datos a partir de un unico experimento.

Los formatos automatizados de multiples pozos son los sistemas HTS mejor desarrollados. Los sistemas de cribado automatizados basados en placas de 96 o 384 pocillos son los mas utilizados. La tendencia actual en los sistemas de cribado basados en placas es reducir aun mas el volumen de los pocillos de reaccion y aumentar la densidad de pocillos por placa (de 96 pocillos a 384 pocillos a 1.536 pocillos por placa). La tendencia se traduce en un aumento del rendimiento, una disminucion drastica de los costes de biorreactivos por compuesto cribado y una disminucion en el numero de placas que deben gestionarse mediante automatizacion. Para una descripcion de las matrices de protemas que se pueden utilizar para HTS veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 6.475.809; 6.406.921 y 6.197.599; y las publicaciones internacionales N° WO 00/04389 y WO 00/07024.

Para la construccion de matrices, las fuentes de MC4R o fragmentos del mismo, ya sea en forma silvestre o mutante, pueden incluir sistemas de expresion basados en celulas para protemas recombinantes, la purificacion de fuentes naturales, la produccion in vitro mediante sistemas de traduccion que no utilizan celulas y procedimientos sinteticos para producir peptidos MC4R. Para la captura de matrices y el analisis de la funcion de las protemas, a menudo se presenta el caso en el que los polipeptidos MC4R estan plegados correctamente y son funcionales. Este no es siempre el caso, por ejemplo, en el que las protemas recombinantes se extraen de bacterias en condiciones de desnaturalizacion; otros procedimientos (aislamiento de protemas naturales, smtesis libre de celulas) generalmente conservan la funcionalidad. Sin embargo, las matrices de protemas desnaturalizadas aun pueden ser utiles en el cribado de chaperonas, ya que la chaperona probablemente se unira a la protema mutada aunque no este plegada en su conformacion apropiada.

El procedimiento de inmovilizacion usado se puede aplicar preferentemente a polipeptidos MC4R de diferentes propiedades (por ejemplo, de tipo silvestre, mutantes, de longitud completa, fragmentos de longitud parcial, hidrofilos, hidrofobos, etc.), susceptibles de alto rendimiento y automatizacion, y generalmente compatibles con la retencion de la capacidad de union a la chaperona. Se pueden utilizar procedimientos tanto covalentes como no covalentes de inmovilizacion de protemas MC4R. Los sustratos para la union covalente incluyen, por ejemplo, portaobjetos de vidrio recubiertos con reactivos de silano que contienen amino o aldetudo (Telechem). En el sistema Versalinx™ (Prolinx), el acoplamiento covalente reversible se logra mediante la interaccion entre la protema derivada con acido fenildiboronico y acido salicilhidroxamico inmovilizado en la superficie de soporte. Los procedimientos de acoplamiento covalente que proporcionan un enlace estable se pueden aplicar a una serie de protemas. La union no covalente de la protema no modificada se produce dentro de estructuras porosas tales como HydroGel™ (PerkinElmer), basado en un gel de poliacrilamida tridimensional.

Matrices basadas en celulas. Las matrices basadas en celulas combinan la tecnica de cultivo celular junto con el uso de dispositivos fluidicos para medir la respuesta celular a los compuestos de ensayo en una muestra de interes, el cribado de muestras para identificar moleculas que inducen un efecto deseado en celulas cultivadas, y la seleccion y la identificacion de poblaciones celulares con caractensticas novedosas y deseadas. El cribado de alto rendimiento (HTS) se puede realizar sobre celulas fijadas utilizando anticuerpos marcados de forma fluorescente, ligandos biologicos o chaperonas candidatas y/o sondas de hibridacion de acido nucleico, o en celulas vivas usando indicadores fluorescentes multicolores y biosensores. La eleccion de cribados de celulas fijadas o vivas depende del ensayo espedfico basado en celulas requerido.

Existen numerosas tecnicas de matrices basadas en una y multiples celulas conocidas en la tecnica. Tecnicas desarrolladas recientemente, tales como matrices con micropatrones (descritas, por ejemplo, en las publicaciones PCT internacionales WO 97/45730 y WO 98/38490) y matrices microfluidicas proporcionan herramientas valiosas para el analisis comparativo basado en celulas. Las micromatrices de celulas transfectadas son una tecnica complementaria en la que las caractensticas de la matriz comprenden agrupaciones de celulas que sobreexpresan ADNc definidos. Los ADN complementarios clonados en vectores de expresion se imprimen en portaobjetos de microscopio, que se convierten en matrices vivas despues de la adicion de un reactivo de transfeccion de lfpidos y celulas de marnfferos adherentes (Bailey et al., Drug Discov. Today 2002; 7 (supl. 18): S113-8). Las matrices basadas en celulas se describen en detalle por, por ejemplo, Beske, Drug Discov. Today 2002; 7 (supl. 18): S131-5; Sundberg et al., Curr. Opin. Biotecnol. 2000; 1l: 47-53; Johnston et al., Drug Discov. Today 2002; 7: 353-63; patentes de Estados Unidos N° 6.406.840 y 6.103.479 y la solicitud de patente de Estados Unidos publicada N° 2002/0197656. Para ensayos basados en celulas espedficamente utilizados para cribar moduladores de canales ionicos activados por ligando, veanse Mattheakis et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 1: 124-34; y Baxter et al., J. Biomol. Screen 2002; 7: 79-85.

Marcas detectables. Para la deteccion de moleculas tales como las chaperonas de MC4R candidatas utilizando ensayos de seleccion, se puede usar un ensayo funcional para realizar un seguimiento de las moleculas sin marcar tal como se describe en otra parte en el presente documento. Una molecula de interes (por ejemplo, una molecula pequena, un anticuerpo o una sonda polinucleotidica) o una biblioteca de la misma tambien se pueden marcar de forma detectable con un atomo (por ejemplo, un radionuclido), una molecula detectable (por ejemplo, fluorescema), o un complejo que, debido a una propiedad ffsica o qmmica, sirva para indicar la presencia de la molecula de interes. Una molecula tambien se puede marcar de forma detectable cuando esta unida covalentemente a una molecula "reportera" (por ejemplo, una biomolecula tal como una enzima) que actua sobre un sustrato para producir un producto detectable. Las marcas detectables adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, electricos, opticos o qmmicos. Las marcas utiles en la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, biotina para la tincion con avidina marcada o perlas magneticas conjugadas a estreptavidina (por ejemplo, Dynabeads™), tintes fluorescentes (por ejemplo, fluorescema, fluorescema-isotiocianato (FITC), rojo de Texas, rodamina, protema verde fluorescente, protema verde fluorescente mejorada, lisamina, ficoeritrina, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy5, Cy7, FluorX de Amersham, SyBR Verde I y II de Molecular Probes, y similares), radiomarcas (por ejemplo, 3H 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, hidrolasas, particularmente fosfatasas tales como fosfatasa alcalina, esterasas y glicosidasas u oxidorreductasas, particularmente peroxidasas tales como la peroxidasa de rabano picante y similares), sustratos, cofactores, inhibidores, grupos quimioluminiscentes, agentes cromogenicos y marcas colorimetricas tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plastico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, latex, etc.) coloreadas. Los ejemplos de patentes que describen el uso de dichas marcas incluyen las patentes de Estados Unidos N° 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 y 4.366.241.

Los medios para detectar dichas marcas son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las radiomarcas y las marcas quimioluminiscentes se pueden detectar utilizando una pelmula fotografica o contadores de centelleo; los marcadores fluorescentes se pueden detectar utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida (por ejemplo, tal como en la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, FACS); y las marcas enzimaticos se pueden detectar proporcionando la enzima con un sustrato y detectando, por ejemplo, un producto de reaccion coloreado producido por la accion de la enzima sobre el sustrato.

Ensayos de estabilidad, localizacion y actividad

Tal como se ha indicado anteriormente, la estabilidad mejorada de MC4R se puede determinar midiendo un aumento en el polipeptido MC4R celular, determinando un aumento en el transporte a la superficie celular, por ejemplo, segun se determina por el aumento de la expresion en la superficie celular, o mediante la determinacion de una mayor actividad de MC4R. Los procedimientos ejemplares no limitantes para evaluar cada uno de los anteriores se describen a continuacion.

Determinacion de la estabilidad intracelular de MC4R. Los procedimientos para determinar los niveles de protema MC4R intracelular son bien conocidos en la tecnica. Dichos procedimientos incluyen inmunotransferencia Western, inmunoprecipitacion seguida de inmunotransferencia Western (IP Western), o inmunofluorescencia utilizando una protema MC4R marcada.

Determinacion del transporte de MC4R. La evaluacion del transporte de protemas a traves de la ruta biosintetica se puede realizar por ejemplo, usando experimentos de pulso-persecucion con protema receptora marcada con 35S, junto con glicosidasas; o mediante inmunofluorescencia directa o indirecta para determinar la modificacion de protemas durante el transporte. Estos y otros procedimientos se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Cell Biology 2001; John Wiley & Sons.

Los procedimientos para detectar el transporte alterado de protemas son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, para protemas que estan N- y/u O-glicosiladas en el aparato de Golgi, se puede usar el marcado metabolico por pulso-persecucion usando protemas marcadas radiactivamente, combinado con tratamiento con glucosidasa e inmunoprecipitacion, para detectar si las protemas estan experimentando una glucosilacion completa en el aparato de Golgi, o si se estan reteniendo en el RE en lugar de ser transportadas al aparato de Golgi para una glicosilacion posterior.

Los procedimientos sensibles para detectar visualmente la localizacion celular tambien incluyen microscopfa fluorescente utilizando protemas fluorescentes o anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, las protemas MC4R de interes se pueden marcas con, por ejemplo, protema fluorescente verde (GFP), protema fluorescente cian, protema fluorescente amarilla y protema fluorescente roja, operacion seguida de microscopfa multicolor y de lapso de tiempo y microscopfa electronica para estudiar el destino de estas protemas en celulas fijadas y en celulas vivas. Para una revision del uso de la toma de imagenes fluorescentes en el transporte de protemas, vease Watson et al., Adv Drug Deliv Rev 2005; 57 (1): 43-61. Para una descripcion del uso de microscopfa confocal para la colocalizacion intracelular de protemas, vease Miyashita et al., Methods Mol Biol. 2004; 261: 399-410.

La espectroscopia de correlacion de fluorescencia (FCS) es un procedimiento de deteccion ultrasensible y no invasivo capaz de resolucion de una unica molecula y en tiempo real (Vukojevic et al., Cell Mol Life Sci 2005; 62 (5): 535-50). La SPFI (toma de imagenes de fluorescencia de una unica partmula) utiliza la elevada sensibilidad de la fluorescencia para visualizar moleculas individuales que se han marcado selectivamente con pequenas partmulas fluorescentes (Cherry et al., Biochem Soc Trans 2003; 31 (Pt 5): 1028-31). Para la localizacion de protemas dentro de balsas lipfdicas, vease Latif et al., Endocrinology 2003; 144 (11): 4725-8). Para una revision de la toma de imagenes de celulas vivas, vease Hariguchi, Cell Struct Funct 2002; 27 (5): 333-4).

La microscopfa de transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) tambien se utiliza para estudiar la estructura y la localizacion de protemas en condiciones fisiologicas (Periasamy, J Biomed Opt 2001; 6 (3): 287­ 91).

Para las protemas residentes de la membrana plasmatica, se pueden utilizar ensayos menos sensibles para detectar si estan presentes en la membrana. Dichos procedimientos incluyen inmunohistoqmmica de celulas fijadas, o marcado de celulas completas utilizando un ligando radiomarcado (por ejemplo, 125I).

Determinacion de la expresion en la superficie celular de MC4R. Una vez que se ha identificado un compuesto candidato, la siguiente etapa consiste en determinar si el compuesto candidato puede aumentar la cantidad de MC4R transportado a la superficie celular. Se pueden utilizar numerosos ensayos para evaluar cuantitativamente la expresion del receptor en la superficie celular. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de union de ligandos radiactivos, utilizando, por ejemplo, 125I-MSH, para determinar la union a celulas completas que expresan MC4R o a fracciones de membrana celular. Vease la solicitud publicada de Estados Unidos 2003/0176425 para una descripcion de un procedimiento ejemplar; vease tambien Chhajlani, Peptides. 1996; 17 (2): 349-51. Ademas, tambien se puede utilizar una tincion de inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos marcados o MC4R marcado (por ejemplo, MC4R marcado con FLAG). Otro procedimiento bien conocido es la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), que clasifica o distingue poblaciones de celulas utilizando anticuerpos marcados contra marcadores de la superficie celular. Vease tambien, Nijenhuis et al., anteriormente.

Determinacion de un aumento en la actividad de MC4R. La actividad de MC4R se puede determinar usando, por ejemplo, ensayos de activacion/acumulacion de AMPc (vese, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J Biol Chem 2003; 18: 15935-40) o midiendo un aumento en la transcripcion de uno o mas genes activados por AMPc, o midiendo la expresion del gen reportero enlazando de forma operativa un gen reportero tal como la luciferasa a un elemento de respuesta de AMPc (CRE) (vease, por ejemplo, Lee et al., Eur J Biochem 2001; 268 (3): 582-91). Ademas, tambien se sabe que el MC4R estimula la secrecion de TNF-a en melanoforos. Por lo tanto, la actividad de MC4R en respuesta a un compuesto candidato puede evaluarse midiendo la secrecion de TNF-a (vease, por ejemplo, Ignar et al., Peptides, mayo de 2003; 24 (5): 709-16).

Por ultimo, los melanoforos proporcionan un bioensayo rapido y sensible para agonistas y antagonistas de melanocortina. Este procedimiento se basa en la medicion de la dispersion de granulos de pigmento inducida por a-MSH, determinada mediante cambios en la densidad optica (Quillan et al., PNAS U.S.A. 1995; 92: 2894; y Potenza et al., Pigment Cell Res 1992; 5: 372).

Definiciones de biologfa molecular

Segun la presente descripcion, se pueden emplear tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa y ADN recombinante dentro de los conocimientos de la tecnica. Estas tecnicas son generalmente utiles para la produccion de celulas recombinantes que expresan MC4R de tipo silvestre o mutantes para su uso en ensayos de cribado. Dichas tecnicas se explican completamente en la literatura. Veanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en el presente documento "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); y ediciones posteriores de cada uno, cuando esten disponibles.

La expresion "celula huesped" significa cualquier celula de cualquier organismo que se seleccione, modifique, transforme, desarrolle, use o manipule de cualquier forma para la produccion de una sustancia deseada por la celula, por ejemplo, la expresion por la celula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una protema o una enzima. Segun la presente divulgacion, la celula huesped se modifica para expresar un acido nucleico y un polipeptido MC4R mutante o de tipo silvestre. Las celulas huesped pueden utilizarse ademas para cribado u otros ensayos. Celulas huesped ejemplares son celulas HEK293, celulas COS y celulas CHO.

Una "molecula de ADN recombinante" es una molecula de ADN que se ha sometido a manipulacion por biologfa molecular.

Los polinucleotidos MC4R, en el presente documento, pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras naturales (control de la expresion), o pueden estar asociados a secuencias heterologas, incluidos promotores, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES) y otras secuencias del sitio de union al ribosoma, potenciadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias de senal, secuencias de poliadenilacion, intrones, regiones no codificantes 5' y 3', y similares. Los acidos nucleicos tambien pueden modificarse por muchos medios conocidos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones incluyen: metilacion, "encapsulado", sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales por un analogo, y modificaciones internucleotidicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriesteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleotidos pueden contener uno o mas restos adicionales unidos covalentemente, tales como, por ejemplo, protemas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidativos, etc.) y alquiladores. Los polinucleotidos pueden derivarse mediante la formacion de un fosfotriester metilico o etflico o un enlace de fosforamidato de alquilo. Ademas, los polinucleotidos, en el presente documento, tambien pueden modificarse con una marca capaz de proporcionar una senal detectable, directa o indirectamente. Las marcas ejemplares incluyen radioisotopos, moleculas fluorescentes, biotina y similares. Los acidos nucleicos tambien pueden alterarse en una o mas bases, por ejemplo, mediante mutagenesis dirigida al sitio para facilitar la biologfa molecular asociada con el uso de las moleculas.

Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresion, tal como un ARN o un polipeptido de MC4R, es una secuencia de nucleotidos que, cuando se expresa, da como resultado la produccion de ese ARN o ese polipeptido, por ejemplo, la secuencia de nucleotidos de MC4R codifica una secuencia de aminoacidos de un polipeptido (protema) de MC4R. Una secuencia codificante para la protema puede incluir un codon de inicio (generalmente ATG) y un codon de detencion.

El termino "gen", tambien denominado "gen estructural", significa una secuencia de ADN que codifica o corresponde a una secuencia particular de aminoacidos que comprende la totalidad o parte de una o mas protemas MC4R, y pueden incluir o no secuencias reguladoras de ADN, tales como secuencias promotoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen MC4R.

Los terminos "expresa" y "expresion", cuando se usan en el contexto de la produccion de una secuencia de aminoacidos a partir de una secuencia de acidos nucleicos, significan permitir o provocar que la informacion de un gen MC4R o secuencia de ADN se manifieste, por ejemplo produciendo una protema MC4R mediante la activacion de las funciones celulares implicadas en la transcripcion y la traduccion del gen MC4R o la secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en, o por, una celula para formar un "producto de expresion", tal como una protema MC4R. Tambien se puede decir que el producto de expresion en sf, por ejemplo, la protema resultante, se "expresa" por la celula. Un producto de expresion puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. Segun la presente divulgacion, el MC4R se expresa en la superficie celular de las neuronas.

El termino "intracelular" significa algo que esta en el interior de una celula. El termino "extracelular" significa algo que esta en el exterior de una celula. Una sustancia es "secretada" por una celula si aparece en una medida significativa en el exterior de la celula, desde algun lugar sobre la celula o desde el interior de la misma.

El termino "heterologo" se refiere a una combinacion de elementos que no se producen en combinacion de forma natural. Por ejemplo, el ADN heterologo se refiere al ADN que no se encuentra de forma natural en la celula o en un sitio cromosomico de la celula. Preferentemente, el ADN heterologo incluye un gen extrano a la celula. Un elemento regulador de la expresion heterologa es un elemento asociado operativamente con un gen diferente al que esta asociado operativamente en la naturaleza. En el contexto de la presente invencion, un gen que codifica una protema de interes es heterologo con respecto al vector de ADN en el que se inserta para clonacion o expresion, y es heterologo con respecto a una celula huesped que contiene dicho vector en el que se expresa, por ejemplo una celula de E. coli.

El termino "transformacion" se refiere al proceso por el que el ADN, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, se introduce desde el medio circundante en una celula huesped.

El termino "transduccion" se refiere a la introduccion de ADN, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, en una celula huesped procariota, por ejemplo, en una celula huesped procariota a traves de un virus bacteriano, o bacteriofago. Una celula huesped procariota o eucariota que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha "transformado" o "transducido" y es un "transformante" o un "clon". El ADN o ARN introducido en una celula huesped puede provenir de cualquier fuente, incluidas celulas del mismo genero o especie que la celula huesped, o celulas de un genero o especie diferente, o secuencias sinteticas.

La locucion "celula manipulada geneticamente de forma recombinante" se refiere a cualquier celula procariota o eucariota que se ha manipulado para que exprese o sobreexprese el acido nucleico de interes, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, por medio de cualquier procedimiento apropiado, incluidos transfeccion, transformacion o transduccion. Esta locucion tambien incluye la activacion endogena de un acido nucleico en una celula que normalmente no expresa ese producto genetico o que expresa el producto genetico a un nivel inferior al optimo.

El termino "transfeccion" significa la introduccion de un acido nucleico extrano (es decir, extrmseco o extracelular) en una celula. El acido nucleico "extrano" incluye un gen, una secuencia de ADN o ARN en una celula huesped, de forma que la celula huesped replicara el a Dn y expresara el gen o la secuencia introducidos para producir una sustancia deseada, tfpicamente una protema o enzima codificada por el gen introducido o la secuencia introducida. El gen, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, introducido o la secuencia introducida tambien puede denominarse un gen "clonado" o una secuencia "clonada", puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como secuencias de inicio, de detencion, promotoras, de senal, de secrecion u otras secuencias utilizadas por la maquinaria genetica de la celula. El gen o la secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin funcion conocida. El ADN puede introducirse como un elemento extracromosomico o mediante integracion cromosomica en una celula huesped que recibe y expresa el ADN o ARN introducido.

Dependiendo de la celula huesped utilizada, la transformacion o la transfeccion se realiza utilizando tecnicas estandar apropiadas para dichas celulas. El tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en la seccion 1.82 de Sambrook et al. 1989, anteriormente, se usa generalmente para celulas bacterianas que contienen barreras sustanciales de pared celular. Otro procedimiento para la transformacion emplea polietilenglicol/DMSO, tal como se describe por Chung y Miller (Nucleic Acids Res. 1988, 16:3580). Otro procedimiento mas es el uso de la tecnica denominada electroporacion. Alternativamente, cuando se usa un vector vmco, las celulas huesped pueden infectarse por el virus que contiene el gen de interes.

El termino "vector" y las locuciones "vector de clonacion" y "vector de expresion" significan el vehmulo mediante el que una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen MC4R) se puede introducir en una celula huesped, para transformar el huesped y promover la expresion (por ejemplo, la transcripcion y la traduccion) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plasmidos, fagos, virus, etc.; son bien conocidos en la tecnica.

Una "secuencia promotora" es una region reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante cadena abajo (direccion 3'). Para definir la presente invencion, la secuencia promotora esta limitada en su extremo terminal 3' por el sitio de inicio de la transcripcion y se extiende cadena arriba (direccion 5') para incluir el numero mmimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de inicio de la transcripcion, asf como dominios de union a protemas (secuencias de consenso) responsables de la union de la ARN polimerasa.

Una secuencia de codificacion esta "bajo el control de" o "asociada de manera operativa a" las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion en una celula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia de codificacion en el ARNm, que despues se empalma al ARN-trans (si contiene intrones) y se traduce en la protema codificada por la secuencia codificante.

La construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de los componentes enumerados anteriormente emplea tecnicas de ligadura estandar. Los plasmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se vuelven a enlazar en la forma deseada para generar los plasmidos requeridos.

Para un analisis para confirmar las secuencias correctas en los plasmidos construidos, se utilizan mezclas de ligadura para transformar cepas bacterianas, y los transformantes exitosos se seleccionan por su resistencia a la ampicilina o la tetraciclina cuando sea apropiado. Los plasmidos de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestion con endonucleasas de restriccion y/o se secuencian mediante el procedimiento de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74: 5463-5467) o Messing et al. (Nucleic Acids Res. 1981, 9:309), o mediante el procedimiento de Maxam et al. (Methods in Enzymology 1980, 65:499). Las celulas huesped se transforman con los vectores de expresion de la presenta divulgacion descritos anteriormente y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados segun sea apropiado para el promotor utilizado.

Ejemplos

La presente invencion se describe adicionalmente por medio de los ejemplos, que se presentan a continuacion. El uso de dichos ejemplos es solo ilustrativo y no limita de ninguna manera el alcance y el significado de la invencion o de cualquier termino ejemplificado. Del mismo modo, la invencion no esta limitada a ninguna forma de realizacion preferida particular descrita en el presente documento. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica al leer la presente memoria descriptiva y se pueden realizar sin apartarse del alcance de la invencion tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, la invencion solo estara limitada por los terminos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance completo de los equivalentes a los que estan autorizadas las reivindicaciones.

Ejemplo 1: Generacion de lineas celulares que expresan mutantes de plegamiento MC4R

Con el fin de determinar si algunos mutantes de MC4R dan como resultado defectos conformacionales de MC4R, los acidos nucleicos de MC4R que contienen los diversos mutantes se transfectan en celulas HEK-293T y COS-7 y se evalua su expresion y su actividad en la superficie celular. Aquellas lineas celulares en las que se observa una expresion reducida o la carencia de la misma en la superficie celular se evaluan adicionalmente para determinar la presencia intracelular y/o la localizacion del polipeptido MC4R.

Procedimientos

Generacion de mutantes MC4R. Un ADNc que codifica un MC4R de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) se modifica utilizando tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, PCR, mutagenesis dirigida al sitio) para generar ADNc de MC4R mutantes que contienen alteraciones en los nucleotidos que dan como resultado, por ejemplo, uno de los siguientes polipeptidos mutantes MC4R: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211 y/o insercion de TGAT en el codon 244. Dichos mutantes tambien pueden fusionarse con una marca fluorescente, tal como GFP, tal como se describe por Blondet et al., J Biochem (Tokio) 2004; 135 (4): 541-6, o marcarse con FLAG, tal como se describe por VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 15935-15940 o marcarse con una enzima tal como la luciferasa.

Cultivo de celulas y transfeccion. Dichos acidos nucleicos de MC4R mutantes se clonan en un vector de expresion apropiado, por ejemplo, pCDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), segun las instrucciones del fabricante. La transfeccion de celulas se realiza utilizando LipofectAMINE (Invitrogen), y las lineas celulares clonales transfectadas permanentemente se seleccionan por su resistencia al analogo de neomicina G418.

En resumen, las celulas HEK-293T y COS-7 se mantienen en medio Eagle modificado por Dulbecco (con glutamina; Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Las celulas se incuban a 37 °C en aire humidificado que contiene el 5% de CO2. Las celulas se encuentran generalmente en una confluencia del 70-80% el dfa de la transfeccion.

MC4R marcado con GFP. El ADNc de la protema fluorescente verde (GFP) esta disponible de BD Biosciences (San Jose, CA) o Clontech (Palo Alto, CA). La GFP se fusiona en marco al extremo C-terminal de MC4R humano con el codon de terminacion C-terminal eliminado, segun las instrucciones del fabricante. El constructo de protema de fusion MC4R-GFP quimerica se transfecta entonces como anteriormente. Un constructo de luciferasa se emplea de forma similar.

Deteccion de la localizacion de mutantes de MC4R. Los experimentos de union para determinar la localizacion en la superficie celular se realizan usando las condiciones descritas anteriormente (Yang et al., J Biol Chem 1997; 272: 23000-23010). En resumen, se usan 2 x 105 cpm de 125I-NDP-MSH (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) en combinacion con ligandos NDP-MSH no radiomarcados, AgRP 87-132 o AgRP 110-117. Las reacciones de union se terminan eliminando el medio y lavando las celulas dos veces con medio esencial mmimo que contiene el 0,2% de ^{albumina de suero bovino. A continuacion, las celulas se lisan con NaOH 0,2 N y d d sado se} _{cuantifica en un contador analftico. La union no espedfica se determina midiendo la} J ^{la radioactivida}

_{cantidad de marca} 1^e25^{l li}

_{I unida en} presencia de ligando sin marcar 10'6 M. Ademas, se puede usar FACS tal como se describe a continuacion en el ejemplo 4. La union espedfica se calcula restando la radiactividad unida no espedficamente de la radioactividad unida total. La union maxima (Bmax) se puede calcular utilizando la ecuacion Bmax = [union espedfica de NDP-MSH]/([NDP-MSH]/(Kd [NDP-MSH]). Ki = CI50/1 concentracion de ligando/Kd.

Cuando el mutante MC4R esta marcado de forma fluorescente, se utiliza microscopfa confocal para realizar un seguimiento del transporte intracelular de MC4R marcado (Blondet et al., J Biochem 2004; 135: 541-546; o Gao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307 (3): 870-7). En resumen, las celulas se cultivan en cubres de vidrio de camara de 24 a 48 h antes de los experimentos. Despues de los tratamientos apropiados, las celulas se lavan con PBS frio y se fijan en formalina durante 20 minutos, y se observan en un microscopio de barrido de laser LSM 510 META (Carl Zeiss, Thornwood, NY). La fluorescencia de GFP se excita utilizando un laser de argon/cripton de 488 nm y se detecta con un filtro de paso de banda de 500 a 550 nm. La senal roja se excita con un laser de HeNe a 543 nm y la fluorescencia se detecta con un filtro de paso de 565 a 615.

Las imagenes tomadas digitalmente se cuantifican utilizando un Scion Image Beta 4.02. Las imagenes confocales de fluorescencia verde originales se convierten a escala de grises y se realiza un filtrado de mediana. A cada pixel se le asigna un valor de intensidad que vana de 0 (negro) a 255 (blanco). La superficie celular y la intensidad de fluorescencia celular total se miden despues de seleccionar manualmente el area correspondiente. La distribucion subcelular de MC4R-GFP se expresa como la relacion entre la intensidad de fluorescencia de la superficie celular y la intensidad de fluorescencia celular total. Una disminucion en la proporcion indica la internalizacion del receptor. Utilizando estos procedimientos, se identifican mutantes de plegamiento de MC4R que senan candidatos para el rescate mediado por chaperona.

Ejemplo 2: Estructuras de agonistas y antagonistas de MC4R

Los agonistas y antagonistas potenciales de MC4R se seleccionaron basandose en la revision de referencias de patentes publicadas y referencias de la literatura (en particular, Bednarek y Fong, Exp. Opn Therapeutic Patents 2004; 14 (3): 327-326 y el documento WO 02/062766). Los criterios utilizados para seleccionar los compuestos descritos en el presente documento incluyen los datos de CI50 publicados, datos de animales in vivo y datos de biodisponibilidad (por ejemplo, farmacocinetica), cuando esten disponibles.

a) Smtesis del agonista de la figura 1 (compuesto 1)

La seleccion de este compuesto, conocido como THIQ, se baso en los datos siguientes:

La smtesis de esta molecula (11 etapas) se realizo en base al esquema descrito en la figura 3.

b) Smtesis del agonista de la figura 2 (compuesto 2)

La seleccion de este compuesto conocido, denominado compuesto 2, se baso en los datos siguientes:

La smtesis de esta molecula (11 etapas) se realizo en base al esquema descrito en la figura 4.

c) Smtesis del antagonista de la figura 5 (compuesto 3)

Este compuesto se selecciono en base a los datos de aMSH/MC4R comunicados por Arasasingham (J Med Chem 2003, 46: 9-11). La smtesis de este compuesto se realizo segun el procedimiento descrito en el presente documento, que se resume en la figura 7.

d) Smtesis del antagonista de la figura 6 (compuesto 4)

Este compuesto se selecciono y se sintetizo basandose en los datos y el procedimiento sintetico descrito en la publicacion de patente internacional PCT WO 02/062766 de Millennium Pharmaceuticals; el esquema de smtesis se resume en la figura 8. De la actividad biologica de este compuesto se informa en el documento WO 02/062766 utilizando un ensayo de proximidad de centelleo.

En resumen, la smtesis se realizo mediante el procedimiento siguiente: se anade 1,3-diaminopropano (Acros, 27,7 g, 0,374 mmol) a acido tiosalidlico (Acros, 20 g, 0,130 mmol) en 1,2-diclorobenceno (Acros, 200 ml), esta mezcla se calienta a 170 °C durante 4 horas. Al enfriar a 60 °C, se anade metanol (50 ml), la reaccion se agita a temperatura ambiente durante la noche y el solido cristalino amarillo resultante se recoge y se lava con eter, proporcionando 9 g de producto puro.

Se anade bromuro de 2-metoxi-5-nitrobencilo (Fluka, 1,86 g, 7,559 mmol) a 2-(1,4,5,6-tetrahidropirimidin-2-il)bencenotiol (1 g, 5,201 mmol) en metanol (60 ml) a temperatura ambiente, se mantiene concentrado durante 12 horas y se anade eter (10 ml), las agujas de color amarillo claro resultantes se recogen y se lavan con eter, proporcionando 1,28 g de producto puro.

Ejemplo 3: Rescate de MC4R plegado incorrectamente utilizando baja temperatura o chaperonas quimicas Dado que se sabe que tanto las bajas temperaturas (rescate termico) como las chaperonas qmmicas generales tales como el DMSO restauran el plegamiento de protemas mutantes, se evaluo la expresion en la superficie celular de mutantes de plegamiento de MC4R de tipo silvestre y de diversos MC4R en celulas que albergan MC4R de WT y mutante, y en esas celulas se cultivaron a 30 °C o con DMSO al 1%.

Procedimientos

Celulas y transfecciones. Se transfectaron celulas HEK 293 transitoriamente con mutantes de hMC4R de tipo silvestre (WT) o con los siguientes mutantes de hMC4R doblemente marcados con 3HA y Venus (protema fluorescente verde amarilla aumentada; EYFP): S58C; N62S; R165W; R165Q y P299H.

Ensayo de baja temperatura. Se incubaron celulas WT y transfectadas a 30 °C o 37 °C durante 12 horas antes de la evaluacion de la expresion en la superficie celular de MC4R. La ganancia se determino utilizando lo siguiente: Ganancia = [(% de expresion en la superficie a 30 °C -% de expresion en la superficie a 37 °C)/% de expresion en la superficie a 37 °C] * 100.

Ensayo de chaperona quimica: Se incubaron celulas WT y transfectadas transitoriamente en presencia o ausencia de DMSO al 1% durante 12 horas antes de la evaluacion de la expresion en la superficie de las celulas MC4R. Analisis de FACS. El analisis de FACS se realizo despues de marcar celulas de forma fluorescente con anticuerpo primario anti-HA.11 (raton; dilucion 1:1000) y el anticuerpo secundario acoplado a Alexa 647 (anti-raton de cabra; dilucion 1:1000). Las celulas vivas (negativas a yoduro de propidio) se clasificaron en las siguientes dos poblaciones relevantes:

P4: Total de celulas positivas a YFP (representativas de la expresion total de MC4R)

P5: Porcentaje de celulas positivas tanto a YFP como a Alexa 647 (celulas positivas a Alexa y YFP)/(celulas positivas a YFP celulas positivas a Alexa y YFP) (representativas de la expresion en la superficie celular) Resultados

Expresion en la superficie celular de MC4R. La expresion en la superficie basal de la expresion en la superficie de celulas de WT alcanza el 90%. Ninguno de los mutantes expreso MC4R en la superficie celular tal como se detecto mediante la union de NDP-a-MSH marcado con I125 (datos no mostrados). Cuando se analizaron por FACS, todos los mutantes mostraron una expresion en la superficie significativamente reducida en comparacion con celulas transfectadas con MC4R de WT (datos no mostrados). Aproximadamente el 90% de las celulas 3HA-hMC4R-Venus de WT mostraron expresion en la superficie de MC4R (P5), mientras que la expresion en la superficie basal en los mutantes fue de entre el 12% y el 18% para N62S, R165W, R165Q y P299H. S58C muestra alrededor del 40% de expresion en superficie.

Rescate termico. Los cinco mutantes mostraron la ganancia en la expresion de la superficie celular de MC4R (P5) que se expone en la tabla 2:

Tabla 2

Chaperona quimica: No se detecto una mejora significativa de la expresion en la superficie celular en presencia de DMSO al 1%.

Ejemplo 4: Rescate de MC4R plegado incorrectamente utilizando chaperonas farmacologicas MC4R

Se evaluaron los compuestos antagonistas de MC4R representados en la figura 5 (compuesto 3) y la figura 6 (sal de HBr; compuesto 4), respectivamente, para determinar la actividad de chaperona en celulas que albergan los siguientes mutantes de MC4R: S58C; N62S; R165Q; R165W y P299H.

Procedimientos

Ensayo de chaperona farmacologica. En resumen, las celulas que albergan cada uno de los mutantes MC4R referenciados anteriormente (transfectadas tal como se describe en el ejemplo 3) se cultivaron con cada uno de los compuestos antagonistas a concentraciones de 1,0 pM y 10 pM durante 12 h y se evaluo la expresion en la superficie celular de MC4R utilizando analisis de clasificacion de celulas activadas fluorescentemente tal como se ha descrito anteriormente. Los niveles de expresion en la superficie celular se comparan entre condiciones de tratamiento y basales. El porcentaje de ganancia se determina segun lo siguiente: [Ganancia = [(% de la expresion en la superficie (con tratamiento) - % de la expresion en la superficie (sin tratamiento)) / % de la expresion en la superficie (sin tratamiento)] * 100.

Ensayo de actividad de MC4R. La acumulacion de AMPc se evaluo para los mutantes de MC4R S58C, N62S, R165W y P299H en respuesta al tratamiento con el agonista de MC4R NDP-MSH (10-7 M) en presencia o ausencia de cada uno de los antagonistas utilizando el kit de ensayo fluorescente de AMPc Catch Point de Molecular Devices (ensayo de celulas enteras; N° de cat. R8044). Los controles no se trataron o se trataron solo con NDP-MSH.

Resultados

Rescate con chaperona farmacologica. Tal como se muestra en la tabla 3, a continuacion, ambos antagonistas fueron capaces de aumentar la expresion en superficie de los mutantes de MC4R R165W, S58C y R165Q en concentraciones de 1,0 pM y 10 pM, con un efecto dependiente de la dosis. Tal como se ha indicado anteriormente, la expresion en la superficie basal en los mutantes fue de entre el 12% y el 18% para N62S, R165W, R165Q y P299H. S58C muestra aproximadamente el 40% de expresion en la superficie. Inesperadamente, con el tratamiento con 10 pM de cada compuesto se pudo restaurar la expresion en la superficie celular de MC4R R165W a niveles identicos a las celulas que expresan MC4R de tipo silvestre.

Para el mutante N62S no se observo ningun efecto a 1,0 pM con ninguno de los compuestos, aunque se observo un porcentaje significativo de ganancia en la expresion en la superficie celular del MC4R mutante con ambos compuestos a la concentracion de 10 pM. El compuesto representado en la figura 5 era mas potente, es decir, se observo mas expresion en la superficie celular que con el compuesto que se muestra en la figura 6.

Para el P299H mutante, el compuesto que se muestra en la figura 6 no tuvo ningun efecto de restauracion de la expresion en la superficie celular del receptor mutante tanto a 1,0 j M como a 10 j M, y solo se observo un efecto pequeno con el compuesto mostrado en la figura 5 a 10 ^j M.

Tabla 3

Estos resultados demuestran que los mutantes de plegamiento de MC4R pueden "rescatarse" poniendolos en contacto con concentraciones bajas de antagonistas de MC4R, que actuan como chaperonas farmacologicas para restaurar la expresion en la superficie celular.

Por ultimo, un compuesto de bisaminotiazol descrito por Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (figura 9) mostro un pequeno efecto sobre los mutantes S58C (31,25% de ganancia) y R165W (28,95% de ganancia). Actividad de MC4R. Tal como se muestra en la figura 11, la recuperacion de la senalizacion a traves de MC4R se observo en la misma medida que hMC4R de WT en S58C y R165W despues del tratamiento con ambos antagonistas a 10 j M. La capacidad de senalizacion en el mutante de MC4R N62S tambien se restauro en una menor medida. No se restauro la senalizacion en P299H, tal como se esperaba, dado que en este mutante, esta mutacion se encuentra en un dominio necesario para el acoplamiento de la protema G.

EJEMPLO 5: Cribado de chaperonas de MC4R que restauran la estabilidad y la actividad de MC4R mutante o aumentan la estabilidad de MC4R de tipo silvestre

Este ejemplo describe un procedimiento para cribar compuestos de chaperona de MC4R para mejorar la expresion y/o la actividad en la superficie celular de MC4R mutante o de tipo silvestre plegado incorrectamente.

Procedimientos

Transfeccion de MC4R mutante o de tipo silvestre. La identificacion de mutantes de MC4R de plegamiento/de transporte se realiza tal como se describe en el ejemplo 1. La transfeccion de dichos MC4R mutantes de plegamiento y/o de tipo silvestre se logra tal como se ha descrito anteriormente, o mediante el uso de cualquier procedimiento conocido en la tecnica para detectar la expresion de protemas en la superficie celular, incluidos inmunoensayos tales como ELISA y analisis FACS.

Administracion de chaperonas. A los cultivos o matrices de celulas que expresan MC4R de tipo silvestre o mutantes de plegamiento se anaden diversas concentraciones de compuestos de ensayo de chaperona. Despues se determina la localizacion celular de MC4R, ademas de la actividad del MC4R que se transporta a la superficie de la celula. Por ejemplo, se criban compuestos basados en piperazina, en piperidina, en 1,4-diazapano, en guanidina u otros compuestos de ensayo tal como se describe, por ejemplo, en los siguientes documento: Bednarek y Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003; 13: 4431-4435; documento WO03/07949; documento WO03/61660 documento WO03/09847 documento WO03/09850 documento WO03/31410; documento WO03/94918 documento WO03/68738 documento WO03/92690 documento WO03/93234; documento WO03/72056 documento WO03/66597 documento WO03/66587 documento WO03/53927; documento WO02/67869 documento WO02/68387 documento WO03/68738 documento WO02/00259; documento WO02/92566; documento WO02/81443; documento WO02/81430 y documento WO02/80896.

Deteccion del transporte de MC4R a la superficie celular. La deteccion de la localizacion celular y/o en la superficie celular de celulas que expresan MC4R tratadas con el compuesto en comparacion con las celulas no tratadas se realiza tal como se ha descrito anteriormente.

Deteccion de la actividad de MC4R mediante la medicion de la acumulacion de AMPc. 48 h despues de la transfeccion, las celulas se lavan una vez con PBS y despues se desprenden de la placa con PBS que contiene EDTA al 0,02% (Sigma). Las celulas desprendidas se recogen mediante centrifugacion y se vuelven a suspender en solucion salina equilibrada de Hanks (Invitrogen) que contiene IBMX 0,5 mM, HEPES 2 mM, pH 7,5 (tampon IBMX). Despues de la incubacion a 37 °C durante 15 minutos, para permitir la absorcion de IBMX, se anaden 0,4 ml de suspension celular (aproximadamente 5 x 105 celulas/ml) a 0,1 ml de tampon IBMX que contiene diversas concentraciones de agonistas (por ejemplo, [Nle4-D-Phe7]-MSH(NDP-MSH), a-MSH), u otros candidates chaperonas o forskolina 10 pM. Las celulas se incuban posteriormente a 37 °C durante 15 minutos para permitir la acumulacion de AMPc. La actividad se concluye anadiendo 0,5 ml de acido tricloroacetico al 5%, y el AMPc liberado de las celulas lisadas se analiza mediante el sistema de ensayo de proximidad de centelleo I125 de AMPc (Amersham Biosciences). Los valores de CE50 se calculan con un intervalo de confianza del 95% utilizando el programa informatico GraphPad Prism (utilizando un analisis de regresion no lineal ajustado con una curva de dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable).

Ejemplo 6: Administracion de una monodosis de DGJ para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinetica y los efectos sobre la actividad enzimatica de la a-galactosidasa A

Este ejemplo describe un estudio de fase I aleatorizado, de doble ciego y controlado con placebo de dosis orales de DGJ dos veces al dfa para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinetica y los efectos de la actividad enzimantica de a-galatosidasa A (a -Gal A) de DGJ en voluntarios sanos.

Diseno del estudio y duracion. Este estudio fue el primer estudio en seres humanos, de un unico centro, de fase I, aleatorizado, de doble ciego, de dosis dos veces al dfa, controlado con placebo para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinetica y los efectos de la actividad enzimatica de a-Gal A de DGJ despues de administracion oral. El estudio sometio a ensayo a dos grupos de 8 sujetos (6 activos y 2 de placebo) que recibieron una dosis dos veces al dfa de 50 o 150 mg de DGJ o placebo administrado por via oral durante siete dfas consecutivos, acompanados de una visita de seguimiento a los siete dfas. Los sujetos se alojaron en la instalacion de tratamiento desde 14 horas antes de la administracion hasta 24 horas despues de la administracion. Las comidas se controlaron por medio de una agenda y los sujetos permanecieron ambulatorios durante 4 horas despues de la administracion del farmaco.

Los parametros farmacocineticos se calcularon para DGJ en plasma el dfa 1 y el dfa 7. Ademas, se calculo el porcentaje acumulativo de DGJ excretado (12 horas despues de la dosis) en la orina. La actividad de a-Gal A se calculo en globulos blancos (leucocitos) antes de comenzar la dosificacion, y nuevamente a las 100 horas, 150 horas y 336 horas durante el ensayo.

Poblacion de estudio. Los sujetos eran voluntarios varones sanos, no institucionalizados y no fumadores, de entre 19 y 50 anos de edad (inclusive), integrados por miembros de la comunidad en general.

Evaluaciones de seguridad y tolerabilidad. La seguridad se determino mediante la evaluacion de los signos vitales, los parametros de laboratorio (qmmica del suero, hematologfa y analisis de orina), los ECG, el examen ffsico y el registro de eventos adversos durante el penodo de tratamiento.

Muestreo farmacocinetico. Se recogieron muestras de sangre (10 ml cada una) en tubos de recoleccion de sangre que conteman EDTA antes de la dosificacion y en los momentos posteriores siguientes: 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 horas. Las muestras de sangre se enfriaron en un bano de hielo y se centrifugaron con refrigeracion lo antes posible. Las muestras de plasma se dividieron en dos partes alfcuotas y se almacenaron a 20 ± 10 °C en espera del ensayo. Al final del estudio, todas las muestras se transfirieron a MDS Pharma Services Analytical Laboratories (Lincoln) para su analisis. Se recogio la produccion de orina completa de cada sujeto para el analisis de DGJ para determinar el aclaramiento renal durante las primeras 12 horas despues de la administracion de DGJ los dfas 1 y 7.

Muestreo de actividad enzimatica de a-GAL en leucocitos. Se recogieron muestras de sangre (10 ml cada una) en tubos de recoleccion de sangre que conteman EDTA y leucocitos extrafdos antes de la dosificacion y en los momentos posteriores siguientes: 100 horas, 150 horas y 336 horas. Las muestras se trataron tal como se ha descrito anteriormente, y se determinaron los niveles de actividad enzimatica de a-Gal A de leucocitos.

Analisis estad^stico. Los datos de seguridad que incluyen evaluaciones de laboratorio, examenes ffsicos, eventos adversos, supervision de ECG y evaluaciones de signos vitales se resumieron por grupo de tratamiento y el punto temporal de recogida. Las estadfsticas descriptivas (media aritmetica, desviacion estandar, mediana, minima y maxima) se calcularon para los datos cuantitativos de seguridad, asf como para la diferencia con la lmea base. Los recuentos de frecuencia se compilaron para la clasificacion de datos de seguridad cualitativos.

Los eventos adversos se codificaron utilizando el diccionario MedDRA version 7.0 y se resumieron por tratamiento para la cantidad de sujetos que informaron del evento adverso y la cantidad de eventos adversos de los que se informo. Se proporciono una lista de datos de eventos adversos por sujeto que inclrna el termino literal, el termino codificado, el grupo de tratamiento, la gravedad y la relacion con el tratamiento. Los medicamentos concomitantes y la historia medica se enumeraron por tratamiento.

Los parametros farmacocineticos se resumieron por grupo de tratamiento utilizando estadfsticas descriptivas (medias aritmeticas, desviaciones estandar, coeficientes de variacion, tamano de la muestra, mmimo, maximo y mediana).

Resultados

Ningun sujeto tratado con placebo experimento eventos adversos (EA) y ningun sujeto presento EA despues de recibir 50 mg dos veces al d^ a o 150 mg dos veces al dfa de DGJ. La dGj pareda ser segura y bien tolerada por este grupo de sujetos varones sanos, ya que las dosis se administraron a 50 mg dos veces al dfa y 150 mg dos veces al dfa

Las desviaciones de laboratorio de los intervalos normales se produjeron despues de la dosificacion, pero ninguna se considero clmicamente significativa. No hubo cambios de datos promedio clmicamente relevantes en ningun parametro investigado a lo largo del transcurso del estudio. No se produjo ninguna anomalfa clmicamente relevante en ningun parametro de signo vital, ECG o examen ffsico.

Evaluacion farmacocinetica. La tabla siguiente resume los datos farmacocineticos obtenidos durante el estudio.

Tabla 4

a Porcentaje acumulativo de DGJ excretada a lo largo del penodo de 12 horas posteriores a la dosis.

La farmacocinetica de DGJ estaba bien caracterizada en todos los sujetos y en todos los niveles de dosis. En promedio, las concentraciones maximas se produjeron en aproximadamente 3 horas para todos los niveles de dosis. La Cmax de DGJ aumento de manera proporcional a la dosis cuando las dosis aumentaron de 50 mg a 150 mg. Las semividas de eliminacion medias (t-io) fueron comparables a niveles de dosis de 50 y 150 mg en el dfa 1 (2,5 frente a 2,4 horas).

El porcentaje medio de DGJ excretada durante las 12 horas posteriores a la dosis fue del 16% y el 42% a niveles de dosis de 50 mg y 150 mg, respectivamente, el dfa 1, aumentando al 48% y al 60%, respectivamente, el dfa 7.

Actividad enzimatica de a-galactosidasa A (a-gal A). Los datos de actividad enzimatica de a-Gal A obtenidos durante el estudio se muestran en la figura 1. La DGJ no inhibio la actividad enzimatica de a-Gal A de leucocitos en sujetos a dosis de 50 mg dos veces al dfa o 150 mg dos veces al dfa. Ademas, la DGJ produjo una tendencia dependiente de la dosis de aumento de la actividad de a-Gal A de leucocitos en voluntarios sanos. La actividad enzimatica de a-Gal A se midio en leucocitos de sujetos que recibieron placebo, 50 mg dos veces al dfa y 150 mg dos veces al dfa de DGJ. El placebo no tuvo ningun efecto sobre la actividad enzimatica de a-Gal A de leucocitos. Las variaciones en la actividad enzimatica en respuesta al placebo no fueron clmicamente significativas. Tanto 50 mg dos veces al dfa como 150 mg dos veces al dfa de DGJ aumentaron la actividad enzimatica de a-Gal A de leucocitos normalizada. En respuesta a 50 mg dos veces al dfa de DGJ, la actividad enzimatica de a-Gal A de leucocitos aumento al 120%, 130% y 145% de antes de las dosis a las 100 horas, 150 horas y 336 horas despues de la dosis, respectivamente. En respuesta a 150 mg dos veces al dfa de DGJ la actividad enzimatica de a-Gal A de leucocitos aumento al 150%, 185% y 185% de antes de las dosis a las 100 horas, 150 horas y 336 horas despues de la dosis, respectivamente.

La presente invencion no esta limitada en su alcance por las realizaciones espedficas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invencion, ademas de las descritas en el presente documento, seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior y las figuras adjuntas. Se pretende que dichas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Apartado de ventajas

1. Un procedimiento para mejorar la actividad de un polipeptido MC4R, procedimiento que comprende poner en contacto una celula que expresa MC4R con una chaperona farmacologica que se une al polipeptido MC4R en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de MC4R.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R de tipo silvestre.

3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el polipeptido MC4R tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 8.

4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R mutante.

5. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion asociada con el plegamiento incorrecto del polipeptido MC4R.

6. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion seleccionada del grupo que consiste en P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X y P299H.

7. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el polipeptido MC4R mutante es R165Q, R165W, S58C, N62S o P299H.

8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica es un antagonista de MC4R.

9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que el antagonista de MC4R tiene una estructura tal como se expone en la figura 5 o la figura 6.

10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R cuando se pliega en una conformacion funcional.

11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la actividad potenciada por la chaperona farmacologica es la activacion de la adenilil ciclasa.

12. Un procedimiento para potenciar la expresion en la superficie celular de un polipeptido MC4R, procedimiento que comprende poner en contacto una celula que expresa MC4R con una chaperona farmacologica que se une al polipeptido MC4R en una cantidad eficaz para aumentar la expresion de la superficie celular MC4R.

13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que la chaperona farmacologica se disocia del polipeptido MC4R cuando se pliega en una conformacion funcional.

14. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R de tipo silvestre.

15. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que el polipeptido MC4R tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 8.

16. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R mutante.

17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion asociada con el plegamiento incorrecto del polipeptido MC4R.

18. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion seleccionada del grupo que consiste en P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X y P299H.

19. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que el polipeptido MC4R mutante es R165Q, R165W, S58C, N62S o P299H.

20. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que la chaperona farmacologica es un antagonista de MC4R.

21. El procedimiento de la reivindicacion 20, en el que el antagonista de MC4R tiene una estructura tal como se expone en la figura 5 o la figura 6.

22. Un procedimiento para tratar a un individuo con necesidad de un aumento de la estabilidad de un polipeptido MC4R, procedimiento que comprende administrar al individuo una chaperona farmacologica que se une al polipeptido MC4R en una cantidad eficaz para aumentar la estabilidad.

23. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que la chaperona farmacologica es un antagonista de MC4R que tiene una estructura tal como se expone en la figura 5 o la figura 6.

24. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que la chaperona farmacologica aumenta el transporte del polipeptido MC4R a la membrana celular.

25. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que el individuo es obeso o esta en riesgo de volverse obeso. 26. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que el individuo comprende una mutacion en un gen MC4R que se ha asociado con la obesidad.

27. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que la chaperona farmacologica se administra en un vefnculo farmaceuticamente aceptable.

28. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R de tipo silvestre.

29. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R mutante.

30. Un procedimiento para identificar una chaperona farmacologica para un MC4R, procedimiento que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una mezcla de reaccion que comprende una celula o un extracto celular que expresa un polipeptido MC4R, en el que las condiciones de la mezcla de reaccion permiten la union del compuesto de ensayo al polipeptido MC4R;

(b) detectar la estabilidad, la actividad o la localizacion en la superficie celular del polipeptido MC4R en la mezcla de reaccion en presencia del compuesto de ensayo; y

(c) comparar la estabilidad, la actividad o la localizacion en la superficie celular del polipeptido MC4R en presencia del compuesto de ensayo con la estabilidad, la actividad o la localizacion en la superficie celular del polipeptido MC4R en ausencia del compuesto de ensayo,

en el que la deteccion de la estabilidad, la actividad o la localizacion en la superficie celular mejorada en presencia del compuesto de ensayo en relacion con la ausencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo es una chaperona farmacologica para el MC4R.

31. El procedimiento de la reivindicacion 30, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R de tipo silvestre.

32. El procedimiento de la reivindicacion 31, en el que el polipeptido MC4R comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

33. El procedimiento de la reivindicacion 30, en el que el polipeptido MC4R es un polipeptido MC4R mutante.

34. El procedimiento de la reivindicacion 33, en el que el polipeptido MC4R comprende una mutacion asociada con el plegamiento incorrecto del polipeptido MC4R.

35. El procedimiento de la reivindicacion 34, en el que la mutacion de plegamiento incorrecto de MC4R se selecciona del grupo que consiste en P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H y S58C, con respecto a la secuencia del polipeptido MC4R de tipo silvestre tal como se expone en la SEQ ID NO: 2.

36. El procedimiento de la reivindicacion 30, en el que la mezcla de reaccion esta basada en celulas.

37. El procedimiento de la reivindicacion 30, en el que la mezcla de reaccion esta exenta de celulas.

38. El procedimiento de la reivindicacion 30, que comprende ademas detectar la actividad de un polipeptido MC4R ubicado en la superficie celular.

39. El procedimiento de la reivindicacion 38, en el que la actividad detectada es la activacion de AMPc.

40. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica tiene una estructura tal como se representa en la figura 13.

41. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica tiene una estructura tal como se representa en la figura 14.

42. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica tiene una estructura tal como se representa en la figura 15.

43. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica tiene una estructura tal como se representa en la figura 16.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una chaperona farmacologica del receptor de melanocortina 4 (MC4R) para su uso en el tratamiento de la obesidad o la prevencion de la obesidad en un paciente que posee un polipeptido MC4R mutante, siendo la chaperona farmacologica el compuesto 23:

y en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion asociada con el plegamiento incorrecto del polipeptido MC4R.

2. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante para

i. aumentar la actividad del mutante MC4R;

ii. aumentar la expresion en la superficie celular del mutante MC4R y/o

iii. aumentar la estabilidad del mutante MC4R.

3. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el polipeptido MC4R mutante comprende una mutacion seleccionada del grupo que consiste en P78L, R165Q, R165W, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, Y157S, I102S, L106P, L250Q e Y287X en comparacion con la SEQ ID NO: 2.

4. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 3, en el que el polipeptido MC4R mutante comprende la mutacion C271Y, Rl65Q, R165W, S58C o N62S en comparacion con la SEQ ID NO: 2.

5. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante cuando se pliega dando una conformacion funcional.

6. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 2, en el que la actividad de MC4R mutante potenciada por la chaperona farmacologica es la activacion de la adenilil ciclasa.

7. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 2, en el que la chaperona farmacologica aumenta el transporte del polipeptido MC4R mutante a la membrana celular.

8. La chaperona para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la chaperona se debe administrar a un individuo que comprende una mutacion en un gen MC4R que esta asociado con la obesidad.

9. La chaperona para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la chaperona farmacologica debe administrarse en un vehfculo farmacologicamente aceptable.

10. La chaperona para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la chaperona se administra en una cantidad de 1 a 100 mg/kg de peso corporal por dfa.